CA2542928A1 - Use of metallic cations to improve functional activity of antibodies - Google Patents
Use of metallic cations to improve functional activity of antibodies Download PDFInfo
- Publication number
- CA2542928A1 CA2542928A1 CA002542928A CA2542928A CA2542928A1 CA 2542928 A1 CA2542928 A1 CA 2542928A1 CA 002542928 A CA002542928 A CA 002542928A CA 2542928 A CA2542928 A CA 2542928A CA 2542928 A1 CA2542928 A1 CA 2542928A1
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- zinc
- antibody
- antibodies
- residues
- cation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 title claims description 20
- 150000001457 metallic cations Chemical class 0.000 title description 5
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 79
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 52
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 52
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims abstract description 48
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims abstract description 48
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 47
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 33
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 29
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 23
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 20
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 claims description 18
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 15
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 13
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 12
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 12
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 claims description 9
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- UAYWVJHJZHQCIE-UHFFFAOYSA-L zinc iodide Chemical compound I[Zn]I UAYWVJHJZHQCIE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 6
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 6
- VNDYJBBGRKZCSX-UHFFFAOYSA-L zinc bromide Chemical compound Br[Zn]Br VNDYJBBGRKZCSX-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 claims description 5
- 206010006500 Brucellosis Diseases 0.000 claims description 5
- 206010069748 Burkholderia pseudomallei infection Diseases 0.000 claims description 5
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims description 5
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 claims description 5
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 claims description 5
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 claims description 5
- 208000001203 Smallpox Diseases 0.000 claims description 5
- 208000034784 Tularaemia Diseases 0.000 claims description 5
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 5
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 201000006266 variola major Diseases 0.000 claims description 5
- 241000712891 Arenavirus Species 0.000 claims description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 claims description 4
- NKCVNYJQLIWBHK-UHFFFAOYSA-N carbonodiperoxoic acid Chemical compound OOC(=O)OO NKCVNYJQLIWBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 4
- 201000004015 melioidosis Diseases 0.000 claims description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 4
- XOOUIPVCVHRTMJ-UHFFFAOYSA-L zinc stearate Chemical compound [Zn+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O XOOUIPVCVHRTMJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 claims description 4
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- ZJVTYKZWDWVIFD-UHFFFAOYSA-N zinc;hydrochloride Chemical compound Cl.[Zn] ZJVTYKZWDWVIFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 claims description 3
- 108050004280 Epsilon toxin Proteins 0.000 claims description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241001115401 Marburgvirus Species 0.000 claims description 3
- 208000028227 Viral hemorrhagic fever Diseases 0.000 claims description 3
- WHMDKBIGKVEYHS-IYEMJOQQSA-L Zinc gluconate Chemical compound [Zn+2].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O WHMDKBIGKVEYHS-IYEMJOQQSA-L 0.000 claims description 3
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 claims description 3
- WGIWBXUNRXCYRA-UHFFFAOYSA-H trizinc;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [Zn+2].[Zn+2].[Zn+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O WGIWBXUNRXCYRA-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 3
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 claims description 3
- 229940102001 zinc bromide Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011670 zinc gluconate Substances 0.000 claims description 3
- 235000011478 zinc gluconate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960000306 zinc gluconate Drugs 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 claims description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 2
- CANRESZKMUPMAE-CEOVSRFSSA-L zinc;(2s)-2-hydroxypropanoate Chemical compound [Zn+2].C[C@H](O)C([O-])=O.C[C@H](O)C([O-])=O CANRESZKMUPMAE-CEOVSRFSSA-L 0.000 claims description 2
- 241000589562 Brucella Species 0.000 claims 2
- 241000722910 Burkholderia mallei Species 0.000 claims 2
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 claims 2
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 claims 2
- 229940074375 burkholderia mallei Drugs 0.000 claims 2
- 229940118764 francisella tularensis Drugs 0.000 claims 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 claims 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 claims 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 claims 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 abstract description 15
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 abstract description 15
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 abstract description 15
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 abstract description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 abstract description 4
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 57
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 31
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 31
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 26
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 21
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 21
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 21
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 16
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 14
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 14
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 12
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 10
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 8
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 5
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 5
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N Gallium Chemical compound [Ga] GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 3
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 229910052733 gallium Inorganic materials 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 3
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- GWUDZEJIEQLLHN-CEOVSRFSSA-N (2s)-2-hydroxypropanoic acid;zinc Chemical compound [Zn].C[C@H](O)C(O)=O.C[C@H](O)C(O)=O GWUDZEJIEQLLHN-CEOVSRFSSA-N 0.000 description 2
- 241001502050 Acis Species 0.000 description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000985214 Mus musculus 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L cadmium dichloride Chemical compound Cl[Cd]Cl YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 229950003063 mitumomab Drugs 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- -1 tr ~ ptophane Chemical compound 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001939 zinc chloride Drugs 0.000 description 2
- 239000011746 zinc citrate Substances 0.000 description 2
- 235000006076 zinc citrate Nutrition 0.000 description 2
- 229940068475 zinc citrate Drugs 0.000 description 2
- ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N zinc nitrate Chemical compound [Zn+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ONDPHDOFVYQSGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZSKINHGFQOKUDM-IYEMJOQQSA-N (2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoic acid;zinc Chemical compound [Zn].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O ZSKINHGFQOKUDM-IYEMJOQQSA-N 0.000 description 1
- RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 2-[[(2s)-2-[bis(carboxymethyl)amino]-3-[4-(methylcarbamoylamino)phenyl]propyl]-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl]amino]acetic acid Chemical compound CNC(=O)NC1=CC=C(C[C@@H](CN(CC(C)N(CC(O)=O)CC(O)=O)CC(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)C=C1 RTQWWZBSTRGEAV-PKHIMPSTSA-N 0.000 description 1
- SNCJAJRILVFXAE-UHFFFAOYSA-N 9h-fluorene-2,7-diamine Chemical compound NC1=CC=C2C3=CC=C(N)C=C3CC2=C1 SNCJAJRILVFXAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100067974 Arabidopsis thaliana POP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102100025698 Cytosolic carboxypeptidase 4 Human genes 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000237537 Ensis Species 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910003317 GdCl3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000932590 Homo sapiens Cytosolic carboxypeptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101100118549 Homo sapiens EGFR gene Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101001033003 Mus musculus Granzyme F Proteins 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102100025067 Potassium voltage-gated channel subfamily H member 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710163352 Potassium voltage-gated channel subfamily H member 4 Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 235000003846 Ricinus Nutrition 0.000 description 1
- 241000322381 Ricinus <louse> Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100123851 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HER1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108700011201 Streptococcus IgG Fc-binding Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 206010043561 Thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- IYTNZMHHMAPTKA-UHFFFAOYSA-N [Zn++].[Zn++].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O Chemical compound [Zn++].[Zn++].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O IYTNZMHHMAPTKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 229960000548 alemtuzumab Drugs 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002096 anti-tetanic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940112129 campath Drugs 0.000 description 1
- 101150039352 can gene Proteins 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000011281 clinical therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000011549 crystallization solution Substances 0.000 description 1
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229950000006 ecromeximab Drugs 0.000 description 1
- 229960001776 edrecolomab Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229950009760 epratuzumab Drugs 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- DWYMPOCYEZONEA-UHFFFAOYSA-L fluoridophosphate Chemical compound [O-]P([O-])(F)=O DWYMPOCYEZONEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- MEANOSLIBWSCIT-UHFFFAOYSA-K gadolinium trichloride Chemical compound Cl[Gd](Cl)Cl MEANOSLIBWSCIT-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001001 ibritumomab tiuxetan Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950007283 oregovomab Drugs 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000402 palivizumab Drugs 0.000 description 1
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960000999 sodium citrate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940036185 synagis Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 229940053819 winrho Drugs 0.000 description 1
- DJWUNCQRNNEAKC-UHFFFAOYSA-L zinc acetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O DJWUNCQRNNEAKC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940006486 zinc cation Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/02—Antidotes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/34—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood group antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
La présente invention concerne l'utilisation de cations métalliques, notamment du Zinc, pour cristalliser le fragment Fc d~un anticorps anti Rhésus D.
Mutagnèse dirigée des histidines situées aux residus 310 et 435. The present invention relates to the use of metal cations, in particular Zinc, to crystallize the Fc fragment of an anti Rhesus D.
Directed mutagenesis of histidines at residues 310 and 435.
Description
DEMANDES OU BREVETS VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE I)E CETTE DEMANDE OU CE BREVETS
COMPRI~:ND PLUS D'UN TOME.
CECI EST ~.E TOME 1 DE 2 NOTE: Pour les tomes additionels, veillez contacter le Bureau Canadien des Brevets.
JUMBO APPLICATIONS / PATENTS
THIS SECTION OF THE APPLICATION / PATENT CONTAINS MORE
THAN ONE VOLUME.
NOTE: For additional vohxmes please contact the Canadian Patent Oi~ice.
UTILISATION DE CATIONS MÉTALLIQUES POUR L'AMÉLIORATION
.
DE L'ACTIVITÉ FONCTIONNELLE DES ANTICORPS
La présente invention concerne l'utilisation de cations métalliques, notamment divalents ou trivalents, et plus particulièrement de Zinc, de Cuivre, de Cadmium ou de Fer, pour améliorer l'activité fonctionnelle d'anticorps. Plus particulièrement, l'invention a pour objet des compositions pharmaceutiques d'anticorps comprenant des cations métalliques divalents ou trivalents.
Introduction et art antérieur L'immunothérapie passive, très répandue, est fondée sur l'administration d'anticorps, par exemple des anticorps monoclonaux dirigés contre une cellule ou une substance donnée. L'immunothérapie passive au moyen d'anticorps monoclonaux a donné des résultats encoûrageants. Toutefois, si l'utilisation d'anticorps monoclonaux possède plusieurs avantages, comme par exemple une assurance de sécurité du produit quant à
l'absence de contamination infectieusë, il peut en revanche s'avérer difficile d'obtenir un anticorps monoclonal efficace.
En effet, le risque est de développer un anticorps monoclonal qui s'avère peu efficace et pour lequel on observe des effets secondaires incompatibles avec une utilisation en thérapie clinique. Ces deux aspects sont étroitement liés sachant que des anticorps peu actifs sont administrés à fortes doses pour compenser leur faible activité et obtenir une réponse thérapeutique. L'administration de fortes doses non seulement induit des effets secondaires mais est économiquement peu rentable.
Cés problèmes sont majeurs dans le développement industriel des anticorps monoclonaux, chimériques, humanisés ou humains. A titre d'exemple, la société VOLUMINOUS REQUESTS OR PATENTS
THIS PART I) THIS APPLICATION OR PATENTS
COMPRI ~: ND MORE THAN A TOME.
THIS IS ~ .E TOME 1 OF 2 NOTE: For additional volumes, please contact the Canadian Bureau of Patents.
JUMBO APPLICATIONS / PATENTS
THIS SECTION OF THE APPLICATION / PATENT CONTAINS MORE
THAN ONE VOLUME.
NOTE: For additional vohxmes please contact the Canadian Patent Office.
USE OF METALLIC CATIONS FOR IMPROVEMENT
.
FUNCTIONAL ACTIVITY OF ANTIBODIES
The present invention relates to the use of metal cations, in particular divalent or trivalent, and more particularly Zinc, Copper, Cadmium or Iron, to improve the functional activity of antibodies. More particularly, The subject of the invention is pharmaceutical compositions of antibodies including divalent or trivalent metal cations.
Introduction and prior art Passive immunotherapy, which is widely used, is based on administration antibodies, for example monoclonal antibodies directed against a cell or a substance given. Passive immunotherapy with monoclonal antibodies has resulted in inconclusive results. However, if the use of monoclonal antibodies possesses several benefits, such as product safety assurance as for the absence of infectious contamination, it can however be difficult get an effective monoclonal antibody.
Indeed, the risk is to develop a monoclonal antibody which proves to be effective and for which side effects are observed which are incompatible with a use in clinical therapy. These two aspects are closely linked, knowing that little antibody active ingredients are given in large doses to compensate for their low activity and get a therapeutic response. The administration of high doses not only induced effects but is economically unprofitable.
These problems are major in the industrial development of antibodies monoclonal, chimeric, humanized or human. For example, the company
2 Protein Design Labs a suspendu les essais cliniques en phase I/II du Remitogen0, qui est un anticorps anti-HLA-DR pouvant être utilisé pour traiter les cancers de cellules MHC dë classe II positives, notamment les leucémies des. lymphocytes B et T.
Ainsi, un des objets de l'invention est de fournir de nouveaux produits ou procédés permettant de pallier les inconvénients rencontrés lors du développement industriel d'anticorps, à savoir leur faible efficacité et leur coût élevé. ..
Aujourd'hui, la recherche est orientée sur la région Fc de l'immunoglobuline (Ig) afin d'améliorer les propriétés fonctionnelles des anticorps. A terme, cela devrait permettre l'obtention d'anticorps qui se lient et activent les récepteurs des cellules effectrices (monocytes /macrophages, lymphocytes B, cellules NK et dendritiques) de manière plus efficace. La région Fc des IgG est constituée de 2 domaines globulaires nommés CH2 et CH3. Les 2 chaînes lourdes interagissent étroitement au niveau des domaines CH3 tandis qu'au niveau des domaines CH2, la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un oligosaccharide lié à l'Asn 297 (numérotation de Kabat) contribue à
l'écartement des 2 domaines CH2. Par ailleurs, les domaines CH2 et CH3 d'une même chaîne sont séparés par une région flexible définissant une interface entre les 2 domaines.
L'interface entre les domaines CH2-CH3 a été décrite comme étant un site commun de fixation de nombreuses (glyco)protéines comme le FcRn, les facteurs rhumatoïdes (Corper et al., 1997) et certaines protéines bactériennes et virales, pare exemple la protéine A de Staplzylococcus aic~~eus (Deisenhofer, 1981), la protéine G de Stf~eptococcus de groupe G (Sauer-Eriksson et al., 1995), le complexe gE-gI du virus Herpes simplex 1 (Chapman et al., 1999) ) et la protéine « tore » du virus de l'hépatite C (Maillard et al., 2004).
Par ailleurs, il a été démontré qué certains résidus d'acides aminés, localisés au niveau de cette interface dans le domaine CH2 ou le domaine CH3, étaient impliqués dans la fixation au FcRn, à la protéine A, etë. Ainsi, les IgG1 humaines mutées au niveau du 2 Protein Design Labs has suspended clinical trials in Phase I / II of Remitogen0, who is an anti-HLA-DR antibody that can be used to treat cancer cell MHC class II positive, including leukemias. B and T lymphocytes Thus, one of the objects of the invention is to provide new products or processes to overcome the disadvantages encountered during the development industrial antibodies, namely their low efficiency and high cost. ..
Today, research is focused on the Fc region of immunoglobulin (Ig) so to improve the functional properties of the antibodies. Ultimately, this should to permit Obtaining antibodies that bind and activate cell receptors effector (monocytes / macrophages, B cells, NK cells and dendritics) of way more efficient. The Fc region of IgG consists of 2 globular domains appointed CH2 and CH3. The 2 heavy chains interact closely at the level of areas CH3 whereas at the level of the domains CH2, the presence, on each of the 2 chains, of an oligosaccharide linked to Asn 297 (Kabat numbering) contributes to spacing of the 2 CH2 domains. Moreover, the domains CH2 and CH3 of the same chain are separated by a flexible region defining an interface between the two areas.
The interface between the CH2-CH3 domains has been described as a site common fixing many (glyco) proteins like FcRn, the factors rheumatoid (Corper et al., 1997) and some bacterial and viral proteins, example the Staplzylococcus aic protein A (Deisenhofer, 1981), G protein Stf ~ eptococcus group G (Sauer-Eriksson et al., 1995), the gE-gI complex of virus Herpes simplex 1 (Chapman et al., 1999)) and the protein "torus" of the hepatitis C (Maillard et al., 2004).
In addition, it has been shown that certain amino acid residues, located at the level of this interface in the CH2 domain or the CH3 domain, were involved in the binding to FcRn, protein A, ete. Thus, human IgG1 mutated at level of
3 résidu d'histidine 435 (His 435, numérotation de Kabat) perdent leur capacité
à fixer le FcRn et la. protéine A mais conservent leur capacité à fixer le FcyRIII.
(Firam et..r~l,~
2001 ; Shields et a1.,~2001).
Par contre, aucune des études notifiant, des modifications de l'interface CH2-d'IgG humaines ou marines, ne montre une relation quelconque entre la structure de cette partie de la molécule d'IgG et les capacités effectrices de ces IgG via les récepteurs FcyR (FcyRI, FcyRII, FcyRIII).
Dans le cadre de l'invention, nous avons déterminé la structure tridimensionnelle des régions Fc de différents anticorps monoclonaux présentant des activités fonctionnelles différentes; notamment l'activité ADCC et l'induction de la production de cytokines.
Nous avons découvert la présence d'un ion zinc situé entre les domaines CH2 et CH3, plus précisément, lié à des , résidûs localisés . à l'interface des doniairies 1 S impliquée dans la reconnaissance de la région Fc de l'anticorps par le récepteur FcRn ainsi que dans la fixation de la protéine A, issue de la paroi bactérienne de Staplaylococcus auf°eus.
De part sa localisation à l'interface des domaines CH2 et CH3, cet atome de zinc joue un rôle impôrtant dans la conformation générale du Fc, et par là même permet l'amélioration de la liaison du Fc à ses récepteurs FcyRs.
Nos études de la structure tridimensionnelle de la région Fc de ces anticorps ont révélé
que la présence dé cations métalliques tels que le Zinc, le Cuivre, le Cadmium ou le Fer, dans la solution de cristallisation était toujours associée à la conformation dite ouverte de la région Fc des IgG (Radaev et al., 2001). Cette conformation ouverte favorise ~la fixation aux récepteurs FcyR, notamment au FcyRIII. Ainsi, il est désormais pbssible ~ de potentialiser l'activité fonctionnelle des anticorps monoclonaux ou polycloriaux au moyen de cations métalliques. A l'opposé, l'abolitiôn de la fixation de cations métalliques tels qne le zinc, le cuivre, le cadmium ou le fer aux anticorps, plus particulièrement à l'.intexface CH2-CH3, par utilisation de mutants de la séquence peptidique oû de.substances chimiqûes appropriées, conduit à l'obtentiôn d'anticôrps aux propriétés fonctionnelles abrogées ou fortement diminuées.
Ainsi, (invention apporte une solution économique et universelle pour résoudre les problèmes liés à la faible efficacité des anticorps monoclonaux disponibles ou en cours de développement par (utilisation de cations métalliques qui améliorent l'activité
fonctionnelle d'anticorps. A cet effet, nous proposons une méthode pour potentialiser l'activité fonctionnelle des anticorps au moyen de cations métalliques. Enfin, par la modification du site de liaison aux cations métalliques, l'invention fournit également des anticorps de classe IgGl possédant une capacité d'activation du récepteur FcyRIII
diminuée, ainsi que des anticorps de classe IgG3 possédant artificiellement un site de fixation pour un cation métallique.
Description Ainsi, un premier objet de l'invention est l'utilisation de cations métalliques divalents ou trivalents pour améliorer l'activité fonctionnelle d'anticorps.
Nos études tridimensionnelles de la région Fc des anticorps ont révélé que la présence de cations métalliques tels que le Zinc, le Fer, le Cuivre ou le Cadmium, était toujours associée à la conformation dite ouverte de la région Fc des IgG. Cette conformation ouverte favorise la fixation des anticorps aux récepteurs FcyR, notamment au FcyRIII.
Ainsi, il est désormais possible de potentialiser l'activité fonctionnelle des anticorps monoclonaux ou polyclonaux au moyen de tels cations métalliques.
De manière préférentielle, le cation métallique utilisé est le zinc. En effet;
nos analyses ont permis de mettre en évidence la présence d'un ion zinc lié aux résidus d'histidine 310 et d'histidine 435 (dans la présente demande, la numérotation~est celle de Kabat, Kabat database, http://immuno.bme.nwu.edu): ~ ~ .
De part sa localisation sur la région Fc, cet atome de zinc joue un rôle important dans la conformation générale de la région Fc, et par là même permet l'axilélioration de la 5 liaison de la région Fc à ses récepteurs.
Ainsi, de manière avantageuse, on utilise ces cations pour interragir avec la région Fc des anticorps afin de participer à la stâbilisation de cette région.
Plus particulièrement, on les utilise afin dé participer au contrôle de l'ouverture de la région Fc des anticorps et ainsi de favoriser le maintien de la conformation dite « ouverte » des anticorps, c'est-à-dire le maintien d'un certain écartement entre les domaines CH2 favorisant lâ fixation de la région Fc sur ses récepteurs. La présence des cations métalliques permet d'induire une ouverture de la région Fc, même si le cation métallique ne se maintient pas dans sori site.
Ainsi, de manière avantageuse, cés cations métalliques favorisént la fixation des anticôrps aux récepteurs FcyR, notamment au récepteur Fc~yRIII.
De plus, le cation métallique peut, dans un autre aspect de l'invention, favoriser le rapprochement de plusieurs régions Fc d'anticorps, via un deuxième site de fixation impliquant les résidus d'histidine 268 et 285 (numérotation de Kabat), facilitant l' activation des FcyRs, plus particulièrement des FcyRIII et la transduction des la signalisation par l'intermédiaire de ces récepteurs.
Par « activité fonctionnelle » on entend, de manière non limitative, l'activité ADCC
(Antibody-Dependent Cell-mediatéd ~ Cytotoxicity), l'activité CDC (Complement Dependent Cytotoxicity), l'activité de phagocytose, l'activité d'endocytose ou encore l'induction de, la sécrétion de cytokines. Ainsi, l'utilisation de cations métâlliques tels que décrit dans~l'invention permet d'améliorer l'activité fonctionnelle d'au moins 50%, préférentiellement 60%, ou 70%, 80%, 100%, et préférentiéllement 200% ou 300%.
De plus, on entend par « récepteurs » non seulement les molécules de FcyR, telles que Fc~yRIII, présentes sur les cellules du système immunitaire telles les monôcytes, les macrophages, les lymphocytes B et T, les cellules NR et les cellulés dendritiques mais également le FcRn, les molécules du complément cbmme le C1q et celles des parois bactériennes comme la protéine A.
Par « anticorps », on entend tout anticorps polyclonal ou monoclonal. Si l'anticorps est un anticorps monoclonal, il peut êire chimériquë, humanisé ou humain.
Avantageusement, cet anticorps est une IgG, par exemple une IgGl ou une IgG3, notamment humaine. De plus, le terme anticorps inclut également toute glycoprotéine comportant une région Fc, par exemple humaine, et un ou plusieurs fragments, domaines ou dérivés d'anticorps. On entend par « domaine d'anticorps » l'un quelconque des domaines VL, CL, VH , CH1, CH2, CH3, CH4 ; par « fragment d'anticorps » tout fragment qui contient un site de fixation complet pour un antigène, choisi parmi les fragments Fv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, et par « dérivé
d'anticorps »
tout anticorps pouvant comprendre une ou plusieurs mutations, substitutions, délétions et/ou additions d'un ou plusieurs résidus d' acides aminés, ainsi que les anticorps multi-spécifiques et polyfonctionnels.
Par « cation métallique divalent ou trivalent» ou par « cation métallique » on entend tout cation métalliqué ayant un degré d'oxydation +2 ou +3 et plus parüculièrement le zinc, le fer, le cuivre, le cadmium, le cobalt, le nickel, le manganèse, le gallium, le gadolinium, le sélénium, l'or, le platine ou le palladium ou un analogue.
Préférentiellement, ces cations métalliques sont le zinc, le fer, le cuivre ou le cadmium, et de manière particulièrement avantageuse il s'agit du zinc. Par « analogue »
on entend tout ion libre ou lié susceptible de se lier au niveau de la région Fc des anticorps, et plus particulièrement aux résidus His 310, His 435, les résidus Asn 434 et His (numérotation de Rabat) pouvant également participer à la fixation.
Un deuxième objet de l'invention concerne une méthode pour potentialiser l'activité
. fonctionnelle des anticorps via la région Fc, comprenant une étape consistant à ajouter une quantité appropriée d'au moins ûn cation métallïque dâns le système biologiqûe produisant les anticorps ou dans une solution comprenant des anticorps avant et/ou après purification ou encore dans la solution de conservation ou dans la formulation finale sous la forme d'une solution injectable des anticorps.
De manière avantageuse, ces cations métalliques sont le zznc, le fer, le cuivre ou le cadmium.
On entend par « système biologique » des lignées cellulaires, dés plantes ou animaux transgéniques non humains. Parmi les cellules, on peut choisir des cellules provenant de lignées cellulaires, transfectées à l'aide d'un vecteur comportant le gène codant pour Iedit anticorps, par exemple des cellules eucaryotes ou procaryotes, notamment des çellules de mammifères, d'insectes, de plantes, de bactéries ou de levures.
Plus spécifiquement, on peut utiliser des cellules de myélome de rat telle que YB2/0.
On peut également utiliser des cellules CHO, notamment CHO-K, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO Pro-5, CHO dhfr- ou d'autres lignées cellulaires paxmi Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653, PERCE ou BHK.
De manière préférentielle, on ajoute une concentration molaire en zinc au moins égale à la concentration molaire en anticorps.
Eventuellement, on ajoute une concentration molaire en zinc au moins égale à 2 fois, et préférentiellement à 3 fois ou à 4 fois la concentration molaire en anticorps:
. Alternativement, on ajoute une concentration molaire en cations métalliques permettant d'améliorer l'açtivité fonctionnelle de l'anticorps ~ d'au moins 25%, préférentiellement 50% ou 60%, 70%, 80%, 100%, et préférentiellement 200 ou 300%.
Avantageusement, les. cations rriétalliques existent sous différentes formes.
Dans un aspect particulier de l'inventiona les ions zinc peuvent être sous forme d'acétate de zinc; dé bromure de zinc, de ,chlôrhydrate de zinc, de chlorixre de zinc, de citrate de w zinc, dé gluconate de zinc; d'hydroxycarbonate de zinc, d'iodure de zinc, de L-lactate de zinc, de nitrate de zinc, de stéarate de zinc, ou de sulfate de zinc.
Un autre objet de l'invention se rapporte à des anticorps de classe IgG3, et plus particulièrement les allotypes G3m(b)et G3m(g), possédant un site de fixation pbur un cation métallique comprenant les résidus His 310 et His 435 sur sa région Fc créé par ingénierie moléculaire.
Dans le cadre de l'invention, nous avons mis en évidence que des cations métalliques se fixent sur l'es anticorps de classe IgGl sur un site comprenant les résidus.His 310 et His 435, les résidus His 433 et Asn 434 pouvant eux aussi être impliqués dans cette fixation. Or, les anticorps de clâsse IgG3 d'allotype G3m(b) ou G3m(g) ne comportent pas un tel site de fixation à l'état naturel. En effet, ils possèdent un résidus arginine (Arg) en position 435. Ainsi, dans le cadre de l'invention, nous créons, par mutagenèse dirigée, des anticorps de classe IgG3 présentant une fixation de cations métalliques améliorée par rapport aux anticorps non modifiés, de par la création d'un site de fixation impliquant un résidu His 435 en substitution du résidu Arg 435.
Ainsi, ces anticorps IgG3 comportent un site de fixation pour un cation métallique, notamment le zinc, le fer, le cuivre, le' cadmium, le cobalt, le nickel, le manganèse, le gallium, le sélénium, l'or, le platine ou le palladium, comprenant les résidus His 310 et His 435, et de manière âvantageuse comprenant aussi le résidus Asn 434 ét/ou His 433.
De manière avantageuse, l'un au moins de ces résidus histidine est remplacé
par un au moins des résidus choisis parmi la cystéine, l'acide aspartique et l'acide glutamique.
En effet, ces résidus possèdent aussi la capacité de fixer de tels.cations métalliques.
Préférentiellement, le cation métallique ést le zinc, lé fer, le cuivre ou le cadmium, et de manière préférée le zinc. ~ .
Dans un aspect particulier dé l'invention, l'anticorps possède un cation métallique;.~et plus particulièremént un atone de zinc, lié à un ou plusieurs résidus de la région Fc. v De manière particulièrement avantageuse, cet anticorps IgG3 possède une capacité de fixation au FcyRIII et une activité fonctionnelle améliorées par rapport à
l'anticorps natif.
Un objet de l'invention est ainsi~l'utilisation de l'anticorps IgG3 possédant un site de fixation pour un cation métallique précédemment décrit pour la préparatibn d'un médicament destiné au traitement d'une pathologie comme la maladie hémolytique du nouveau-né, une pathologie virale, bactérienne ou parasitaire, une pathologie liée aux agents pathogènes ou toxines dérivées, listés comme étant particulièrement dangereux dans les cas de bioterrorisme (classification des Centers for Disease Control, CDC), notamment l'anthrax (Bacillus aiathf°acis), le botulisme (Clostridium botulium), la peste (Yef siuia pestis), la variole (Variola major), la tularémie (FYahcisella tula~ehsis), les fièvres hémorragiques virales (liées aux filovirus -Ebola, Marburg et aux arenavirus -Lassa, Machupo), la toxine epsilon de Clost~idiuyrz pef°fi~ingehs, la brucellose (B~~ûcella species), la melioidose (Bm°kholdey°ia mallei), la toxine de ricin (Ricinus com~zuhis).
Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique d'anticorps thérapeutiques comprenant des cations divalents ou trivalents et au moins un excipient.
De manière préférée, ces cations métalliques sont le zinc, le fer, le cuivre ou le cadmium, ou un mélange de plusieurs d'entre eux. De manière particulièrement avantageuse, on choisit le zinc, qui peut être sous forme d'acétate de zinc, de bromure de zinc, de chlorhydrate de zinc, de chlorure de zinc, de citraté de zinc, de gluconate de zinc, d'hydroxycarbonate de zinc, d'iodure de zinc, de L-lactate de zinc,de nitrate de zinc, de stéarate de zinc, ou de sulfate de zinc. .
Dans un aspect particulier,.les ànticorps .contenus dans la composition possèdent un cation métallique selon l'invention lié aux résidus His 310 et His 435, les résidus His 433 et Asn 434 pouvant également.pârticiper à la fixatiôn. .
5 Dans un autre aspect particulier de l'invention, les anticorps de la composition pharmaceutique ont les anticorps de classe IgG3 créés par ingénierie moléculaire décrits précédemment. Dans un autre aspect préféré de l'invention, ce sont des IgG
humaines ou ayant une région Fc humaine.
Ainsi, la présence de tels cations métalliques dans la composition améliore la fixation 10 des anticorps thérapeutiques qu'elle contient à ses récepteurs, notamment les Fc~yRIII, la composition possédant ainsi une meilleure activité thérapeutique.
Un autre objet de l'invention est une composition pharmacéutique dans laquelle au moins 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou encore 99% des anticorps possèdent un cation métallique divalent ou trivalent, notamment un ion zinc, lié à un site se trouvant dans la région Fc. Il peut s'agir de manière préférentielle du site de fixation comprenant les acidés aminés His 310 et His 435, l'acide aminé Asn 434 et/ou His 433 étant susceptibles) de participer à la fixation. Dans un autre aspect de l'invention, .il peut s'agir du site de fixation comprenant les acides aminés His 268 et His 285.
Dans un autre aspect de l'invention, les 2 sites peuvent être occupés par un cation métalliquetel que décrit dans l'invention.
Le cation métallique est de manière préférentielle un de ceux déjà cités précédemment, notamment le zinc, le fer, le cuivre ou le cadmium, ou un mélange de plusieurs d'entre eux, éventuellement sous les formes déjà évoquées.
Un aùtre objet de l'invention est une solution comprenant un anticorps monoclonal ou des anticorps monoclonaux et une quantité appropriéé de cations métalliques divalents ou trivalents, en particulier d'ions zinc au moins égale à la concentration molaire en anticorps, cette solution étant adaptée pour une injection par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire.
Les cations métalliques peuvent . être tbut cation métallique divalent ou trivalent, . notamment du zinc, du fer, du cuivre, du cadmium, du cobalt, du nickel, du manganèse, du gallium, du sélénium, du or, du platine ou du palladium ou un analôgue.
De manière préférée, le cation est un ion zinc ou d'acétate de zinc, de bromure de zinc, de chlorhydrate de zinc, de chlorure de zinc, de citrate de zinc, de gluconate de zinc, d'hydroxycarbonate de zinc, d'iodure de zinc, de L-lactate de zinc,de nitrate.
de zinc, de stéarate de zinc, ou de sulfate de zinc.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'ions zinç pour améliorer la cristallisation d'anticorps thérapeutiques, et plus particulièrement d'IgG
monoclonaux, les ions zinc stabilisant la région Fc des anticorps. L'ajout de cations divalents et plus particulièrement de zinc, augmente significativement la solubilité des Fc des IgGs, en favorisant les contacts cristallins ce qui facilite l'obtention des cristaux nécessaires aux études structurales.
L'invention a également pour objet de fournir un test permettant d'évaluer l'efficacité
d'un anticorps comprenant l'étude de la conformation 3D, notamment du domaine impliquant les résidus His 310, His 435, Hïs 433 et/ou Asn 434 de la région Fc telle que montrée à la figure 1 ou 2 ou encore un dosage de la teneur en zinc desdits anticorps, la présence de zinc étant une indication de l'efficacité de l'anticorps.
Un autre objet de l'invention se rapporte à Lin anticorps possédant l'un au moins de ses résidus His 310 et His 435 modifié.
Dans un aspect particulier de l'invention, la modification de l'anticorps est une mutation, notamment une substitution par un acide aminé possédant une faible affinité
pour les cations métalliques divalents ou trivalents. Par exemple, le résidu His 310 etlou le résidu Iüs 435 peu(ven)t êiré substitués) par un résidu de lysine, d'alanine, de gl~ciné, de valine, de léucine, d'isoleùcine, de proline, de méthionine, de tr~ptophane, de phénylalanine, de sérine ou de thréonine.
De manière parüculièrement avantageuse, les résidus His 310 et His 435 sont substitués tous les deux par des résidus de lysine.
Ces mùtants peuvent être réalisés à partir de tout anticorps possédant , à
l'état « naturel », c'est-à-dire non muté, un site de fixation pour les cations métalliques comprenâr~.t les résidus His 310 et His 435. Il peut s'agir notamment d'IgGl, d'IgG3 allotypes G3m(s) ou G3m(st), IgG2 ou IgG4.
Ces mutants possédent une capacité d'activation du FcyRIII diminuée de façon significative.
Dans un deuxième mode de réalisation, la modification peut être réalisée ~pax le DEPC
(diéthyl pyrocarbonate), un agent modifiant les histidines.
Avantageusement, ces anticorps sont des IgGI, ou en tout état de cause des anticorps possédant à l'état « naturel », c'est-à-dire non muté, un site de fixation pour les cations métalliques comprenant les résidus His 310 et His 435.
Ces anticorps possèdent une activité fonctionnelle diminuée par rapport au même anticorps non modifié. Toutefois, ils conservent leur capâcité à fixer l'antigène et le Fc~yRIII.
Ainsi, l'invention fournit des anticorps possédant une faible activité ADCC, présentant un intérêt particulier en thérapie en remplacement des IgG4, ou pour prévenir les rejets de greffe. On peut encore utiliser les anticorps double mutants selon l'invention comme anti-tétaniques, anti-diphtériques ou dirigés contre des agents pathôgènes ou toxines dérivées, listés comme étant particulièrement dangereux dans les cas de bioterrorisme (classification des Centers for Disease Control, CDC), notamment l'anthrax (Bacillus anth~acis), le botulisme (Clost~~idium botulium), la peste (Yersinia pastis), la variole (Variola major), la tularémié (F~ancisella tularensis), les fièvres hémôrrâgiques virales (liées aux filovirus -Ebola, Marburg et aizx arenavirus -Lassa, Machupb), la toxine epsilon de Clostridium perf~ingerïs, la: brucellose (B~ucella speciës), la melioidose (Bu~kholde~ia mallei), la toxine de ricin (Ricinus communis).
Ainsi, un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'anticorps modifiés comme décrit ci-dessus, et possédant donc une activité fonctionnelle faiblé, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention du rejet de greffe ou au traitement d'une pathologie choisie parmi le tétanos, la diphtérie, ou provoquée par un agent pathogène ou toxine dérivée, listé comme étant particulièrement dangereux dans les cas de bioterrorisme -(classification des Canters for Disease Control, CDC), notamment l'anthrax (Bacillus anthracis), le botulisme (Clostridium botulium), la peste (Yersinia pastis), la variole (Variola major), la tularémie (FYancisella tulaf°ensis), les fièvres hémorragiques virales (liées aux filovirus -Ebola, Marburg et aux arenavirus.-Lâssa, . Machupo), la toxine epsilovi de Closts~idium perf~ingefzs, la brucellose (BYUCeIIa species), la melioidose (BuYkholdeYia mallei), la toxine de ricin (Ricinus communis).
Enfin, des anticorps possédant une activité fonctionnelle altérée comme précédemment décrits sont aussi utilisés pour la préparation d'un médicament en remplacement des IgG4.
A titre d'exemple, les anticorps décrits dans l'invention, notamment les anticorps possédant une activité fonctionnelle améliorée due aux cations métalliques, ou les anticorps modifiés dont l'activité fonctionnelle est altérée, ou encore les compositions ou solutions de l'invention, peuvent être choisis parmi les anti ~Ep-CAM, anti-KIR3DL2, anti-EGFR, anti-VEGFR, anti HERl, anti HER2, anti GD, anti GD2, anti GD3, anti-CD20, anti CD-23, anti CD-25, anti-ÇD30, anti-CD33, ânti-CD38, anti-CD44, anti CD52, anti CA125 et anti PrôteinC, anti-HLA-DR, les anti-viraux:
HBV, HCV, H1V et RSV, et plus particulièrement pai~ni les anticorps du Tableau I ci-après Tableau I : ' Nom et marquSocit cible indication .
commerciale de l'anticorps Edrecolomab Centocor anti Ep-CAMcancer colorectal PANOREX
Rituximab Idec anti CD20 B cell lymphoma RITUXAN ~ Licensi thrombocytopenia purpura Genentech/
Hoffinan la roche Trastuzumab Cienentech anti HER2 cancer ovarien HERCEPTIN Licensi Hoffinari la roche/Immunogn Palivizumab Medimmune . RSV
SYNAGIS Licensi Abott Alemtuzumab BTG anti CD52 leukemia CAMPATH Licensi Schering ibritumomab IDEC anti CD20 NHL
tiuxetan Licensi Schering ZEVALIN
Cetuximab Merck /BMS / anti EGFR cancers IMC-C225 Imclone Bevacizumab Genentech/ anti VEGFR cancers ATjASTIN Hoffinan la roche WO 2005/040216 . PCT/FR2004/002687 Epratuzumab hnmumedicsl anti CD22 cancers:
~
-Amgeri ~ lyinphme non hogkinien Hu M195Mab Protein Design Anti CD33 cancrs Labs MDX-210 Tmmuno-DesignedND cancers Molcules BEC2 Imclone anti GD3 cancers Mitumomab Oregovomab Altarex anti CA125cancer ovarien OYAREX
Ecromeximab Kyowa-Hakko anti GD3 melanome malin ABX-EGF Abgenix EGF cancers MDXOlO Medarex Anti CD4R Cancers XTL 002 XTL ND anti-viral : HCV
biopharmaceuticals H11 SCFV viventia biotechND cancers 4B5 viventia biotechanti GD2 Cancers XTL 001 XTL ND anti-viral : HBV
biopharmaceuticals MDX-070 MEDAREX Anti-PSMA cancer de la Prostate TNX-901 TANOX ariti IgE Allergies IDEC-114 IDEC inhibitionl~nphome non-Hodgkinien ProteinC ~ .
Par exemple, finventiôn porte sur une solution se trouvant sous la forme d'un concentré
à une concentration d'anticorps allant de 0,1 à 50 rrig/mL, ou 1. à 25 mg/mL
qui peut être formulé pour une administration 1V. Le séluté peut contenir à titré
d'exemple : 9,0 mg/mL chlorure de sodium, 7;35 mg/mL citrate de sodium dihydraté, et 0,7 mg/mL
polysorbate-80 dans de Peau stérile. Dans ce soluté ou concentré, on rajoute en outre de 0,1 à 50 mg/mL, .ou l, à 20 mg/mL, d'un cation, la concentration dudit cation étant égale à 1, 2, 3, 4 ou 5 fois la concentration en anticorps soit de 0,1 à 250 mglmL
ou de 1 à.
100 mg/mL. Ce concentré peut être injecté dans une poche de sérum ou de liquide de perfusion de sorte à obtenir la dose que fon souhaite administrer, tout en maintenant la même teneur en cation par rapport à la teneur en anticorps.
L'invention porte également sur une poudre lyophilisée, stérile dans un containeur et qui peut. être reconstituée avec de Peau stérile juste avant injection comprenant la quantité appropriée d'anticorps et la quantité dudit cation selon (invention 1~ 2, 3, 4 ou 5 fois supérieure à celle de (anticorps.
On peût reconstituer cette poudre pour une injection IV ou sous-cutanée. Dans ce dernier. cas, la poudre peut comprendre de 10 à 500 mg d'anticorps et une quantité
dudit cation selon (invention 1, 2, 3, 4 ou 5 fois supérieure à celle de (anticorps, soit par exemple de 10 à 500 mg. On peut rajouter les excipients tels que le sucrose, un acide aminé, du polysorbate:
Il faut comprendre que (invention concerne préférentiellement les compositions décrites ci-dessus dans lesquelles la teneur en cation est au moins égale à la teneur en anticorps, mais vise également toute composition dans laquelle on rajoute une quantité
de cation (zinc, fer, cuivre, cadmium, ou un analogue, ou leur mélange) inférieure à
ladite quantité équimolaire, par exemple de 0,1 à 0,99 molaire (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 ou 0,9 molaire), mais toujours suffisante pour améliorer d'au moins 10%
ou 25%, ou 50% ou encore 100% (efficacité et/~u les propriétés fonctionnelles de (anticorps. . ~ . ..
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les 'exemples qui:
suivent, qui doivent êtré considérés comme illustratifs et ne limitent pas l' étendue de l'invention.
Afin d'acquérir des données nouvelles sur les relations structure-fonction de la région Fc des anticorps, le demandeur a cristallisé les fragments Fc de l'antiçorps monoclonal EMABS, exprimé dans la lignée cellulaire YB2/0, en présence ou en absence de zinc.
Une étude par diffraction des rayons X (RX) des fragments Fc cristallisés a été
entreprise ; une partie de cette étude est présentée dans les exemples 1 et 2 qui suivent.
L'exemple 3 montre l'effet d'une modification chimique des histidines sur l'activité Fc et l' exemple 4 l' effet d'une double mutation des résidus histidine 310 et 43 5 en lysines.
Descripüon des figures Figure 1 : Schéma montrant la position des ions Zn2+ au voisinage du fragment Fc de l'anticorps monoclonal EMABS (21~).
Figure Z : Détail de la carte de densité électronique au voisinage dés résidus d'histidine 310 et 435.
Figure 3: Superposition des structures du fragment Fc de l'anticorps EMABS
bbtenues en absence (gris) et en présence (blanc) d'ion Zn2+.
Figure 4 : Fixation de l'anticorps EMABS modifié par le DEPC au récepteur FcyRQI.
Cette figure présente en abscisse ,la fixation des anticorps sur les hématies ét en ordonnée la fixation du CD 16 (FcyRIII) présent à la surface des cellules Jurkat CD 16.
r.
(~) anticorps témoin AD1 ; (~) EMABS témoin ; (1) EMABS FNR ; (~) EMABS
Flt.
Figure 5 : Activation par l'anticorps EMABS modifié par le DEPC du récepteur FcyRIII présent sur les cellules Jurkat CD 16.
Cette figure représente la quantité, exprimée en pg/ml, d'IL-2 sécrétée par les cellules Jurkat CD16 dont le récepteur CD16 a été activé par l'anticorps EMABS témoin (~) et les fractions séparées sur protéine A après modification de l'anticorps EMABS
par le DEPC : FNR (~), FR (~).
Figure 6 :.Effet de la modification par le DEPC sur l'activité ADCC de l'anticorps monoclonal EMABS.
Cette figure représente . le pourcentage de lyse des hématies Rh(D+) induite par l'anticorps monoclonal EMABS témoin et par les 2 fractions FR et FNR, séparées sur gel de Sépharose-protéine A, de l'anticorps modifié par le DEPC.
Figure 7 : Mésure de la fixation du Fc des antiéorps doublement mutés His310-435Lys au récepteur FcyRIII. Les anticorps 1C7, 2H11, 4G5 et 4H10 sont les anticorps mutés.
Les anticorps 16D11, 1165 et 6H11 ne sont pas mutés. Cette figure présente en abscisse, la fixation des anticorps sur les hématies et en ordonnée la fixaüon du CD16 (FcyRIII) présent à la surface des cellules Jurkat CD 16. La figure regroupe les résultats obtenus avec les surnageants contenant les anticorps doublement mutés (courbes en trait plein) et ceux contenant des anticorps non mutés (courbes en pointillés).
Figure 8 : Etude de la sécrétion d'IL-2 induite par des anticorps monoclonaux anti-Rh(D) mutés ou non. Cétte figure représente le pourcentage d'IL-2 sécrété par des anticorps monoclonaux anti-Rh(D) natifs (n = 3 clones) et portant la double mutation His310-435Lys (n = 4 clones). Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à
un anticorps témoin purifié, EMABS.
Figure 9 : Influence de l'imidazole sur la fixâtion de l'anticorps monoclonal EMABS
au récepteur CD16 (Fc~yRIl1).
Figure 10 : Etude par c~tométrie en flux de la fixation des anticorps portant la double mutation His310-435Lys au récepteur CD16 EXEMPLES
Afin d'acquérir des données nouvelles sur les relations structure-fonction de la région Fc des anticorps, le demandeur a cristallisé les fragments Fc de l'anticorps monoclonal EMABS, exprimé dans la lignée cellulaire YB2/0, en présence ou en absence de zinc.
Une étude par diffraction des rayons X des fragments Fc cristallisés a été
entreprise ;
une partie de cette étude est présentée dans les éxemples 1 et 2 qui suivent.
L'exemple 3 montre l'effet d'une modification' chimique des histidines sur l'activité Fc et l'exemple ~4 l'éffét d'une double.mutatiori des résidus histidine 310 et 435 en lysines. , Anticorps monoclonal EMABS. Il s'agit d'une IgG1(K) humaine, dirigée contre l'antigène Rh(D), produite dans la lignée cellulaire YB2/0 (myélome de rat, lignée ATCC n° CRT., 1662) adaptée à
la culture en milieu sans sérum.
- Purification : EMABS a été purifié par chromatographie d'affinité sur Sépharose-protéine A:
- Analyse glycannique : par HPCE-LIF, il a été montré que la structure majoritaire est un oligosaccharide de type biantenné, contenant environ 25 % de fucose.
- Activité biologique : l'activité ADCC de EMABS est au moins égale à celle de l'anticorps polyclonal anti-Rh(D) de référence, WinRho (Cangène).
Préparation du fragmént Fc = Conditions d'hydrolyse : L'anticorps purifié EMäBS est diàlysé une nuit contre du tampon Tris 50 mM, pH 8,0. La solution d'anticorps, ajustée à 50 mM CaCl2 et 5 mM cystéine, est incubée 30 min. à. 37°C avant d'ajouter la solution de trypsine (1 mg/ml) dans un rapport enzyrne/substrat de 1/25. Après 5 h. d'incubation à
37°C, la réaction est arrêtée par l'addition de düsopropyl fluorophosphate (1 mM
final).
L'hydrolysat est dialysé une nuit contre du tampon flnida.zole 50 mM, pH 7,8.
10 - Purification du fragment Fc : L'hydrolysat dialysé est' mis en contact avec de l'Affarose-protéine L à raison de 1 ml de gel pour. 3,6 mg d'anticorps. Après 3 Histidine residue 435 (His 435, Kabat numbering) loses their capacity to fix the FcRn and the. Protein A but retain their ability to bind FcγRIII.
(Firam and..r ~ l, ~
2001; Shields et al., 2001).
On the other hand, none of the notifying studies, modifications of the CH2-of human or marine IgG, does not show any relation between the structure of this part of the IgG molecule and the effector abilities of these IgGs via the FcγR receptors (FcγRI, FcγRII, FcγRIII).
In the context of the invention, we have determined the structure three-dimensional Fc regions of different monoclonal antibodies with activities functional different; in particular the ADCC activity and the induction of the production of cytokines.
We discovered the presence of a zinc ion located between the CH2 and CH3, more precisely, linked to localized residues. at the interface of doniairies 1 S involved in the recognition of the Fc region of the antibody by the FcRn receiver as well as in the binding of protein A, derived from the bacterial wall of Staplaylococcus auf ° eus.
Because of its location at the interface of the CH2 and CH3 domains, this atom of zinc plays an important role in the general conformation of the Fc, and thereby allows improving the binding of Fc to its FcγRs receptors.
Our studies of the three-dimensional structure of the Fc region of these antibodies have revealed that the presence of metal cations such as Zinc, Copper, Cadmium where the Iron in the crystallization solution was always associated with the so-called conformation open IgG Fc region (Radaev et al., 2001). This conformation opened favors fixation to FcγR receptors, especially to FcγRIII. So, he is from now on able to potentiate the functional activity of monoclonal antibodies or polyclonal by means of metal cations. In contrast, the abolition of fixing of metal cations such as zinc, copper, cadmium or iron antibodies, more particularly in the CH2-CH3 interface, using mutants of the sequence peptide or appropriate chemical substances, leads to obtaining antibody with abrogated or greatly diminished functional properties.
Thus, (invention provides an economical and universal solution to solve the problems related to the low effectiveness of available monoclonal antibodies or In progress development by (use of metal cations which improve the activity functional antibody. For this purpose, we propose a method for potentiate the functional activity of the antibodies by means of metal cations. Finally, over there modification of the binding site to metal cations, the invention provides also IgG1 class antibodies possessing receptor activation capacity RIII
decreased, as well as class IgG3 antibodies artificially site of fixation for a metal cation.
Description Thus, a first object of the invention is the use of cations divalent metal or trivalent to improve the functional activity of antibodies.
Our three-dimensional studies of the Fc region of antibodies revealed that presence metallic cations such as Zinc, Iron, Copper or Cadmium, was always associated with the so-called open conformation of the Fc region of IgG. This conformation The open method favors the binding of antibodies to FcγR receptors, particularly RIII.
Thus, it is now possible to potentiate the functional activity of antibody monoclonal or polyclonal by means of such metal cations.
Preferably, the metal cation used is zinc. Indeed;
our analyzes revealed the presence of a zinc ion bound to residues histidine 310 and histidine 435 (in the present application, the numbering ~ is that of Kabat, Kabat database, http://immuno.bme.nwu.edu): ~ ~.
Due to its location in the Fc region, this zinc atom plays a role important in the general conformation of the Fc region, and thereby allows the improvement of the Linking the Fc region to its receptors.
Thus, advantageously, these cations are used to interact with the region Fc antibodies to participate in the stabilization of this region.
In particular, they are used to participate in the control of the opening of the Fc region of the antibodies and thus to promote the maintenance of the conformation called "Open" antibodies, that is to say, maintaining a certain spacing between the CH2 domains favoring the fixation of the Fc region on its receptors. The presence of metal cations can induce an opening of the Fc region, even if the cation metal does not stay in sori site.
Thus, advantageously, these metal cations favor the fixation of the antibodies to the FcγR receptors, in particular to the FcγRIII receptor.
In addition, the metal cation may, in another aspect of the invention, promote approximation of several Fc antibody regions, via a second site of fixation involving histidine residues 268 and 285 (Kabat numbering), facilitating activation of FcyRs, more particularly FcγRIII and transduction from the signaling via these receivers.
"Functional activity" means, in a non-limiting way, ADCC activity (Antibody-Dependent Cell-mediatéd ~ Cytotoxicity), CDC activity (Complement Dependent Cytotoxicity), phagocytosis activity, endocytosis activity or again induction of secretion of cytokines. So, the use of cations metallic such described in ~ the invention makes it possible to improve the functional activity of minus 50%, preferably 60%, or 70%, 80%, 100%, and preferably 200% or 300%.
In addition, "receptors" are understood to mean not only FcγR molecules, as Fc ~ yRIII, present on the cells of the immune system such as monocytes, macrophages, B and T lymphocytes, NR cells and cells dendritic but also FcRn, complement molecules such as C1q and those of walls bacterial as protein A.
By "antibodies" is meant any polyclonal or monoclonal antibody. Yes the antibody is a monoclonal antibody, it can be chimeric, humanized or human.
Advantageously, this antibody is an IgG, for example an IgG1 or an IgG3, especially human. In addition, the term antibody also includes any glycoprotein having an Fc region, for example human, and one or more fragments, domains or derivatives of antibodies. The term "antibody domain" is understood to mean one any of the VL, CL, VH, CH1, CH2, CH3, CH4 domains; by "fragment any fragment that contains a complete binding site for a particular antigen, selected from the fragments Fv, scFv, Fab, Fab ', F (ab') 2, and by "derivative of antibodies »
any antibody that may include one or more mutations, substitutions, deletions and / or additions of one or more amino acid residues, as well as multi-antibody specific and polyfunctional.
By "divalent or trivalent metal cation" or "metal cation"
hears any metallized cation having a degree of oxidation of +2 or +3 and more parculularly zinc, iron, copper, cadmium, cobalt, nickel, manganese, gallium, the gadolinium, selenium, gold, platinum or palladium or an analogue.
Preferably, these metal cations are zinc, iron, copper or cadmium, and particularly advantageously it is zinc. By "analogous"
we hear any free or bound ion that can bind at the Fc region of the antibodies, and more particularly to the residues His 310, His 435, the residues Asn 434 and His (Rabat numbering) can also participate in fixing.
A second object of the invention relates to a method for potentiating the activity . of the antibodies via the Fc region, comprising a step to add an appropriate amount of at least one metal cation in the system organic producing antibodies or in a solution comprising antibodies before and or after purification or in the preservation solution or in the formulation final in the form of an injectable solution of the antibodies.
Advantageously, these metal cations are zznc, iron, copper or cadmium.
The term "biological system" refers to cell lines, plants or animals non-human transgenic. Among the cells, one can choose cells from of cell lines, transfected with a vector containing the gene coding for Said antibody, for example eukaryotic or prokaryotic cells, in particular of the cells of mammals, insects, plants, bacteria or yeasts.
More specifically, one can use rat myeloma cells such as YB2 / 0.
It is also possible to use CHO cells, in particular CHO-K, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO Pro-5, CHO dhfr- or other paxmi Wil-2 cell lines, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, K6H6, NSO, SP2 / O-Ag 14 and P3X63Ag8.653, PERCE or BHK.
Preferably, a molar concentration of zinc is added to the less equal at the molar concentration of antibodies.
Optionally, a molar concentration of zinc at least equal to 2 is added times, and preferably 3 times or 4 times the molar concentration of antibodies:
. Alternatively, a molar concentration of metal cations is added to improve the functional efficiency of the antibody ~ of at least 25%
preferably 50% or 60%, 70%, 80%, 100%, and preferentially 200 or 300%.
Advantageously, the. There are different forms of metallurgical cations.
In one particular aspect of the invention, the zinc ions can be in the form acetate zinc; zinc bromide, zinc hydrochloride, zinc chloride, citrate of w zinc, zinc gluconate; of zinc hydroxycarbonate, zinc iodide, L-lactate zinc, zinc nitrate, zinc stearate, or zinc sulphate.
Another subject of the invention relates to class IgG3 antibodies, and more particularly the G3m (b) and G3m (g) allotypes, having a binding site pbur a metal cation comprising the residues His 310 and His 435 on its region Fc created by molecular engineering.
In the context of the invention, we have shown that cations metal bind to the IgG1 class antibody at a site comprising the residues.His 310 and His 435, the residues His 433 and Asn 434 may also be involved in this fixation. However, the IgG3 clone antibodies of allotype G3m (b) or G3m (g) do not behave not such a fixation site in the natural state. Indeed, they have a arginine residues (Arg) in position 435. Thus, in the context of the invention, we create, by mutagenesis directed, class IgG3 antibodies with cation binding metal improved compared to unmodified antibodies, by creating a site of binding involving a His 435 residue in substitution for the Arg 435 residue.
Thus, these IgG3 antibodies have a binding site for a cation metallic, zinc, iron, copper, cadmium, cobalt, nickel, manganese, the gallium, selenium, gold, platinum or palladium, including residues His 310 and His 435, and advantageously also including the residues Asn 434 and / or His 433.
Advantageously, at least one of these histidine residues is replaced by a to less residues selected from cysteine, aspartic acid and acid glutamic.
Indeed, these residues also have the capacity to fix such metal.
Preferably, the metal cation is zinc, iron, copper or cadmium, and preferably zinc. ~.
In a particular aspect of the invention, the antibody has a cation metal;. and ~
more particularly a zinc atone, linked to one or more residues of the region Fc. v Particularly advantageously, this IgG3 antibody has a ability to improved FcyRIII binding and functional activity compared to antibody native.
An object of the invention is thus the use of the IgG3 antibody possessing a site of fixation for a metal cation previously described for the preparation a drug for treating a condition such as hemolytic disease of neonate, a viral, bacterial or parasitic pathology, a pathology related to pathogens or toxins derived, listed as being particularly dangerous in the case of bioterrorism (classification of Centers for Disease Control, CDC) including anthrax (Bacillus aiathf ° acis), botulism (Clostridium botulium), the plague (Yef siuia pestis), smallpox (Variola major), tularemia (Fyahcisella tula ~ ehsis), viral haemorrhagic fevers (related to filoviruses -Ebola, Marburg and arenavirus -Lassa, Machupo), the epsilon toxin of Clost ~ idiuyrz pef ° fi ~ ingehs, the brucellosis (B ~~ úcella species), melioidosis (Bm ° kholdey ° ia mallei), castor toxin (Ricinus com ~ zuhis).
Another subject of the invention is a pharmaceutical composition of antibodies therapeutics comprising divalent or trivalent cations and at least one excipient.
Preferably, these metal cations are zinc, iron, copper where the cadmium, or a mixture of several of them. In particular advantageously, zinc is chosen, which may be in the form of zinc acetate, bromide of zinc, zinc hydrochloride, zinc chloride, zinc citrate, zinc gluconate zinc, zinc hydroxycarbonate, zinc iodide, zinc L-lactate, zinc nitrate zinc, zinc stearate, or zinc sulphate. .
In a particular aspect, the .bodies contained in the composition have a metal cation according to the invention linked to the residues His 310 and His 435, the His residues 433 and Asn 434 can also be used for fixation. .
In another particular aspect of the invention, the antibodies of composition pharmaceutical have engineered IgG3 class antibodies molecular previously described. In another preferred aspect of the invention, these are IgG
human or having a human Fc region.
Thus, the presence of such metal cations in the composition improves the fixation Therapeutic antibodies it contains to its receptors, in particular the Fc ~ yRIII, the composition thus having a better therapeutic activity.
Another subject of the invention is a pharmaceutical composition in which at less than 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 99% of antibodies have a cation divalent or trivalent metal, in particular a zinc ion, bound to a site finding in the region Fc. It can be preferentially the fixing site including amino acids His 310 and His 435, the amino acid Asn 434 and / or His 433 being likely to participate in the fixation. In another aspect of the invention, it can this is the binding site comprising amino acids His 268 and His 285.
In one Another aspect of the invention, the two sites may be occupied by a cation métalliquetel described in the invention.
The metal cation is preferably one of those already mentioned previously, zinc, iron, copper or cadmium, or a mixture of several of they, possibly in the forms already mentioned.
Another subject of the invention is a solution comprising an antibody monoclonal or monoclonal antibodies and an appropriate amount of metal cations divalent or trivalents, in particular zinc ions at least equal to the concentration molar in antibody, this solution being adapted for one injection intravenous cutaneous or intramuscular.
Metallic cations can. to be divalent metal cation tbut or trivalent, . zinc, iron, copper, cadmium, cobalt, nickel, manganese, gallium, selenium, gold, platinum or palladium or similar.
Preferably, the cation is a zinc ion or zinc acetate, zinc bromide, zinc hydrochloride, zinc chloride, zinc citrate, gluconate zinc, zinc hydroxycarbonate, zinc iodide, zinc L-lactate, nitrate.
zinc, zinc stearate, or zinc sulphate.
Another object of the invention is the use of zinç ions to improve the crystallization of therapeutic antibodies, and more particularly of IgG
monoclonal, zinc ions stabilizing the Fc region of the antibodies. The addition of cations divalent and more particularly zinc, significantly increases the solubility of Fc IgGs, in favoring crystalline contacts which facilitates obtaining crystals necessary for structural studies.
Another object of the invention is to provide a test for evaluating effectiveness of an antibody comprising the study of the 3D conformation, in particular the domain involving the residues His 310, His 435, 433 and / or Asn 434 of the Fc region such as shown in Figure 1 or 2 or a dosage of the zinc content said antibodies, the presence of zinc being an indication of the efficacy of the antibody.
Another subject of the invention relates to Lin antibody having one to less of his His 310 and His 435 residues modified.
In a particular aspect of the invention, the modification of the antibody is a mutation, in particular a substitution with an amino acid having a weak affinity for divalent or trivalent metal cations. For example, the residue His 310 and / or residue 435 may be substituted with a lysine residue, alanine, glycine, valine, leprin, isoleicin, proline, methionine, tr ~ ptophane, phenylalanine, serine or threonine.
In a particularly advantageous manner, the residues His 310 and His 435 are both substituted with lysine residues.
These mutants can be made from any antibody possessing the state "Natural", that is to say, not mutated, a binding site for cations metal include the residues His 310 and His 435. It can be in particular IgG1, IgG3 allotypes G3m (s) or G3m (st), IgG2 or IgG4.
These mutants possess a decreased activation capacity of FcγRIII.
significant.
In a second embodiment, the modification can be performed ~ pax the DEPC
(diethyl pyrocarbonate), a histidine modifying agent.
Advantageously, these antibodies are IgGI, or in any case antibody possessing in the "natural" state, that is to say not mutated, a fixation site for cations metal comprising the residues His 310 and His 435.
These antibodies have a decreased functional activity compared to even unmodified antibody. However, they retain their capacity to set antigen and Fc ~ yRIII.
Thus, the invention provides antibodies having low ADCC activity, with interest in therapy to replace IgG4, or to prevent the rejects of transplant. The double mutant antibodies can also be used according to the invention as anti-tetanus, anti-diphtheria or against agents pathogenes or derived toxins listed as particularly dangerous in of bioterrorism (Classification of Centers for Disease Control, CDC), anthrax (Bacillus anth ~ acis), botulism (Clost ~~ idium botulium), plague (Yersinia pastis), smallpox (Variola major), tularemia (F ~ ancisella tularensis), fevers viral hemorrhagic diseases (filovirus-related -Ebola, Marburg and aizx arenavirus -Lassa Machupb), the epsilon toxin of Clostridium perf ~ ingeries, the: brucellosis (B ~ ucella speciës), melioidose (Bu ~ kholde ~ ia mallei), castor toxin (Ricinus communis).
Thus, another subject of the invention relates to the use of antibodies modified as described above, and therefore having a weakened functional activity, for the preparation a drug for the prevention of transplant rejection or treatment a pathology selected from tetanus, diphtheria, or caused by an agent pathogenic derived toxin, listed as being particularly dangerous in cases of bioterrorism - (classification of Canters for Disease Control, CDC), especially anthrax (Bacillus anthracis), botulism (Clostridium botulium), plague (Yersinia pastis), smallpox (Variola major), tularemia (FYancisella tulaf ° ensis), fevers viral haemorrhagic infections (related to filoviruses -Ebola, Marburg and arenavirus.-Lassa . Machupo), epsilovi toxin of Closts ~ idium perf ~ ingefzs, brucellosis (BYUCeIIa species), melioidosis (BuYkholdeYia mallei), castor toxin (Ricinus communis).
Finally, antibodies with impaired functional activity such as previously described are also used for the preparation of a medicament replacement of IgG4.
By way of example, the antibodies described in the invention, in particular the antibody possessing improved functional activity due to metal cations, or the modified antibodies whose functional activity is impaired, or compositions or solutions of the invention, may be chosen from anti-Ep-CAM, anti-KIR3DL2, anti-EGFR, anti-VEGFR, anti HER1, anti HER2, anti GD, anti GD2, anti GD3, anti-CD20, anti CD-23, anti CD-25, anti-CD30, anti-CD33, anti-CD38, anti CD44, anti CD52, anti CA125 and anti ProteinC, anti-HLA-DR, anti-virals:
HBV
HCV, H1V and RSV, and more particularly by ~ ni antibodies Table I ci-after Table I:
Name and markerSocit target indication .
commercial of antibody Edrecolomab Centocor anti Colorectal Ep-CAMcancer panorex Rituximab Idec anti CD20 B cell lymphoma RITUXAN ~ Licensi thrombocytopenia purpura Genentech /
Hoffinan rock Trastuzumab Cienentech anti HER2 ovarian cancer HERCEPTIN Licensi Hoffinari the rock / Immunogn Palivizumab Medimmune. RSV
SYNAGIS Licensi Abott Alemtuzumab BTG anti CD52 leukemia CAMPATH Licensi Schering ibritumomab IDEC anti CD20 NHL
tiuxetan Licensi Schering ZEVALIN
Cetuximab Merck / BMS / anti EGFR cancers IMC-C225 Imclone Bevacizumab Genentech / anti VEGFR cancers ATjASTIN Hoffinan the rock WO 2005/040216. PCT / FR2004 / 002687 Epratuzumab hnmumedicsl anti CD22 cancers:
~
-Amgeri ~ non-Hogkinian lyinph Hu M195Mab Design Protein Anti CD33 cancrs Labs MDX-210 Tmmuno-DesignedND Cancers molecules BEC2 Imclone anti GD3 cancers Mitumomab Oregovomab Altarex anti CA125 ovarian cancer OYAREX
Ecromeximab Kyowa-Hakko anti GD3 malignant melanoma ABX-EGF Abgenix EGF cancers MDXOlO Medarex Anti CD4R Cancers XTL 002 XTL ND anti-viral: HCV
biopharmaceuticals H11 SCFV viventia biotechND cancers 4B5 viventia biotechanti GD2 Cancers XTL 001 XTL ND anti-viral: HBV
biopharmaceuticals MDX-070 MEDAREX Anti-PSMA Prostate Cancer TNX-901 TANOX ariti IgE Allergies IDEC-114 IDEC inhibitionl ~ non-Hodgkin's nphoma ProteinC ~.
For example, finventiôn is about a solution in the form of a concentrated at an antibody concentration ranging from 0.1 to 50 μg / ml, or 1. at 25 mg / ml that can be formulated for a 1V administration. The selected can contain titrated example: 9.0 mg / mL sodium chloride, 7; 35 mg / mL sodium citrate dihydrate, and 0.7 mg / mL
polysorbate-80 in sterile water. In this solute or concentrate, we add in addition to 0.1 to 50 mg / ml, or 1 to 20 mg / ml of a cation, the concentration of said cation being equal at 1, 2, 3, 4 or 5 times the antibody concentration is 0.1 to 250 mglmL
or from 1 to.
100 mg / mL. This concentrate can be injected into a pocket of serum or liquid from infusion so as to obtain the desired dose, while now the same cation content relative to the antibody content.
The invention also relates to a freeze-dried powder, sterile in a container and that can. be reconstituted with sterile water just before injection including the appropriate amount of antibody and the amount of said cation according to 1 ~ 2, 3, 4 or 5 times higher than that of (antibodies.
This powder could be reconstituted for IV or subcutaneous injection. In this latest. In this case, the powder may comprise from 10 to 500 mg of antibody and quantity said cation according to (invention 1, 2, 3, 4 or 5 times higher than that of (antibodies, either for example from 10 to 500 mg. We can add the excipients such as sucrose, a amino acid, polysorbate:
It should be understood that (invention relates preferentially to the compositions described above in which the cation content is at least equal to the content antibodies, but also aims at any composition in which we add a quantity cation (zinc, iron, copper, cadmium, or an analogue, or a mixture thereof) lower than said equimolar amount, for example from 0.1 to 0.99 molar (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 or 0.9 molar), but still sufficient to improve from less 10%
or 25%, or 50% or even 100% (efficiency and / ~ u the functional properties of (Antibodies.
Other aspects and advantages of the invention will be described in the examples who:
follow, which should be considered illustrative and do not limit the extent of the invention.
In order to acquire new data on the structure-function relationships of the region Fc antibodies, the applicant crystallized the Fc fragments of the antibody monoclonal EMABS, expressed in the YB2 / 0 cell line, in the presence or absence of zinc.
X-ray diffraction (X-ray) study of the crystallized Fc fragments summer business ; part of this study is presented in examples 1 and 2 that follow.
Example 3 shows the effect of a chemical modification of histidines on Fc activity and Example 4 the effect of a double mutation of histidine residues 310 and 43 5 in lysines.
Description of the figures Figure 1: Schematic showing the position of Zn2 + ions in the vicinity of the fragment Fc of the monoclonal antibody EMABS (21 ~).
Figure Z: Detail of the electronic density map near residues of histidine 310 and 435.
Figure 3: Superimposition of the structures of the Fc fragment of the EMABS antibody in absence (gray) and presence (white) of Zn2 + ion.
Figure 4: Attachment of DEPC-modified EMABS antibody to the receptor FcyRQI.
This figure shows on the abscissa, the fixation of the antibodies on the red blood cells and in ordered the fixation of CD 16 (FcγRIII) present on the surface of the cells Jurkat CD 16.
r.
(~) control antibody AD1; (~) EMABS witness; (1) EMABS FNR; (~) EMABS
Flt.
Figure 5: Activation by EMABS antibody modified by the DEPC of the receptor FcyRIII present on the Jurkat CD 16 cells.
This figure represents the quantity, expressed in μg / ml, of IL-2 secreted by cells Jurkat CD16 whose CD16 receptor was activated by the control EMABS antibody (~) and the separated fractions on protein A after modification of the EMABS antibody speak DEPC: FNR (~), FR (~).
Figure 6: .Effect of the DEPC modification on the ADCC activity of antibody monoclonal EMABS.
This figure represents. the percentage of lysis of Rh (D +) red blood cells induced by the monoclonal antibody EMABS control and by the two fractions FR and FNR, separated sure Protein A Sepharose gel, DEPC modified antibody.
FIG. 7: Measurement of the Fc binding of the double mutated anti-bodies His310-435Lys to the FcyRIII receptor. The antibodies 1C7, 2H11, 4G5 and 4H10 are the antibodies transferred.
The antibodies 16D11, 1165 and 6H11 are not mutated. This figure presents in abscissa, fixation of antibodies on red blood cells and on the ordinate fixation from CD16 (FcyRIII) present on the surface of Jurkat CD 16 cells. The figure groups together the results obtained with the supernatants containing the doubly mutated antibodies (curves in solid line) and those containing non-mutated antibodies ( dotted line).
Figure 8: Study of the IL-2 secretion induced by monoclonal antibodies anti-Rh (D) mutated or not. This figure represents the percentage of IL-2 secreted by of the Native anti-Rh (D) monoclonal antibodies (n = 3 clones) and carrying the double mutation His310-435Lys (n = 4 clones). The results are expressed as a percentage report to a purified control antibody, EMABS.
Figure 9: Influence of Imidazole on the Fixation of the Monoclonal Antibody EMABS
to the CD16 receptor (Fc ~ yRIl1).
Figure 10: Flow cytometry study of antibody binding the double His310-435Lys mutation at the CD16 receptor EXAMPLES
In order to acquire new data on the structure-function relationships of the region Fc antibodies, the applicant crystallized the Fc fragments of the antibody monoclonal EMABS, expressed in the YB2 / 0 cell line, in the presence or absence of zinc.
X-ray diffraction study of crystallized Fc fragments was business ;
part of this study is presented in the following examples 1 and 2.
The example 3 shows the effect of a chemical modification of histidines on Fc activity.
and the example ~ 4 the effect of a double.mutatiori of histidine residues 310 and 435 in lysines. , Monoclonal antibody EMABS. It is a human IgG1 (K), directed against the Rh (D) antigen, produced in the YB2 / 0 cell line (rat myeloma, ATCC line No. CRT., 1662) adapted to culture in serum-free medium.
- Purification: EMABS was purified by affinity chromatography on Sepharose protein A:
- Glycan analysis: by HPCE-LIF, it has been shown that the structure majority is an oligosaccharide of biantenné type, containing about 25% of fucose.
- Biological activity: the ADCC activity of EMABS is at least equal to that of the reference anti-Rh (D) polyclonal antibody, WinRho (Cangene).
Preparation of fragmént Fc = Hydrolysis conditions: The purified antibody EMäBS is diálysé one night against 50 mM Tris buffer, pH 8.0. The antibody solution, adjusted to 50 mM CaCl2 and 5 mM cysteine is incubated 30 min. at. 37 ° C before adding the solution trypsin (1 mg / ml) in an enzyrne / substrate ratio of 1/25. After 5 hours. incubation at 37 ° C, the reaction is stopped by the addition of düsopropyl fluorophosphate (1 mM
final).
The hydrolyzate is dialyzed overnight against 50 mM flnida.zole buffer, pH 7.8.
10 - Purification of the Fc fragment: The dialysed hydrolyzate is brought into contact with Affarose-protein L at a rate of 1 ml of gel for. 3.6 mg of antibody. After
4 h.
d'incubation à température ambiante sous agitation,.le gel est monté en colonne et lavé
par le tampon Imidazole 50 mM, pH 7,8. L'effluent et le tampon de lavage qui contiennent les fragments Fc sont réunis, concentrés pax centrifugation sur Vivaspin 20 15 en utilisant les conditions décrites par le fabricant.
EXEMPLE 1. Présence d'ions zinc liés aux fragments Fc.
Cristallogénése : Après mise au point, les conditions de cristallisation retenues 20 sont les suivantes : la solution de fragments Fc, à 2 mg/ml en tampon imidazole 50 mM, pH 7.8, est amenée à 10% de monométhyl polyéthylène glycol 5 000, 100 mM
cacodylate de sodium, 0.1 mM chlorure de zinc, pH 5,1 par diffusion de vapeur en gouttes assies à 17°C.
Collection des données de diffraction et détermination de la structure : Le cristal obtenu est soumis aux RX à l'ESRF de Grenoble et les informations collectées sont traitées par les programmes DENZO et SCALEPACK (Otwinowski and Minor, 1997).
La~structure est résolue et affinée à 2.3 ~ (Fig.l) en.utilisant la suite des programmes CCP4. . ~ . .
Résultats : Ce cristal du fragment Fc de EMABS appartient au groupe spatial avec un fragment par unité asymétrique, Les paramètres de maille sont les suivants : a =
~. 50.2ä;b= 147,.71; c=75.6t~; a=(3=y=90°.
La structure tridimensionnelle (schématisée à la figure 1) permet de mettre en évidence la présence d'ions zinc (en blanc) près des domaines CH2 et CH3 (en gris). La carte de densité électronique présentée figure 2 montre l'ion zinc lié aux résidus d'histidine 310 (CH2) et 435 (CH3). Un autre ion zinc est lié à l'histidine 268 d'un Fc et à
l'histidine 285 d'un Fc symétrique. Le troisième se trouve près de l'histidine 433.
EXEMPLE 2. Effet des cations métalliques sur la conformation des fragments Fc.
Dans cet exemple, les cristaux obtenus appartiennent tous au groupe d'espace P2(1)2(1)2(1) avec deux châînes par unité asymétrique et on caractérise l'ouverture des Fc par les distances entre les résidus de proline 329 des chaînes A et B et entre les résidus de mannose 4 des chaînes A et B.
Cristallisés en absence d'ion métallique, les fragments Fc de l'anticorps EMABS sont caractérisés par une distance entre prolines 329 de 32,53 ~ et une distance entre mannoses 4 de 17,61 1~. Lorsque l'on ajoute un ion métallique à la solution de cristallisation (voir Tableau I~, ces distances caractéristiques augmentent.
Tableau II : Principales caractéristiques des cristaux du fragment Fc de l'anticorps monoclonal EMABS dans le groûpe d'espaçe P2(1)2(1)2(1).
Code Mtal dans "' ~ D Pro D Man 801.
RsolutionParamtres de maille Cristal. 329 4 (A) (~. ~gles=90~) (A) (A) Fcl Non 48,982 75,498 nat 3,29 ~ 32,53 17,61 ... 145,032 Fcl 0,3mM ZnCl2 49,716 75,516 Zn - 3,2 37,12 20,34 150,298 Fc1-Gd 2mM GdCl3 49,816 76,068 2,7 ~ 37,4 20,75 151,156 Fcl 0,3mM 49,462 74,985 Cu - 3,15 35,87 19,79 Cu++Ac 148,928 Fcl O,imM Fe3+ 49,056 74,937 Fe - 3,475 35,78 19,61 148,148 Fcl 0,2mM CdCl2 49,253 75,079 Cd 2,894 36,18 19,2 147,93 La figure 3 montre la superposition des chaînes principales des structures ôbtenues en absence (en gris) et en présence de zinc (blanc) dans la solution de cristallisation.
L'addition d'un sel métallique à la solution de Fc favorise donc une conformation dite ouverte, conformation proche de celle du Fc lié au récepteur FcyRIII.
EXEMPLE 3 : Modification des résidus histidine par le DEPC
Le diéthylpyrocarbonate (DEPC) est un réactif qui a été très utilisé pour modifier et étudier le rôle des résidus d'histidine présents dans les protéines (Miles, 1977). Firan et al.(2001) ônt montré que des IgG1 humaines iraitées par le DEPC perdaient leur capacité à fixer le récepteur:FcRn qui est impliqué dans le transfert des IgG
maternelles vers le foetus. Le DEPC agit pâr substitûtion d'un ,groupement nitrogène présént sur le cycle imidazole de l'histidine, transformant ainsi le résidu d'histidiné en 3-carboéthôxy histidine.
1. Modification par le DEPC
L'anticorps monoclonal EMABS, dialysé contre du tampon acétate de sodium O,1M, pH 6,0, est mis en contact avec du DEPC à raison de 70 ~.g de DEPC/mg d'IgG.
Après 30 minutes d'incubation à température ambiante, la réaction est arrêtée par l'addition d'imidazole (0,2 rng/ml final).
Après dessalage en tampon phosphate de sodium 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,2, l'anticorps monoclonal modifié est fractionné par chromatographie d'affinité
sur Sépharose-protéine A. Une fraction de l'anticorps monoclonal modifié n'est pas retenue sur le gel d'affinité et constitue la fraction non retenue ou FNR. La fraction retenue sur le gel et appelée FR est éluée par du tampon Glycine-HCl O,1M, pH
2,8.
Les deux fractions ainsi obtenues sont dialysées contre du tampon Phosphate de sodium 20mM, NaCl 50 mM, pH 7,2; concentrées sur Vivaspin selon les recommandations du fabricant et conservées à 4°C pendant 15 jours maximum.
L'anticorps témoin, qui nous sert de référence, a subi le méme traitement hormis le DEPC qui a été remplacé par un volume identique d'éthanol.
2. Mesure de la fixation du Fc des anticorps au récepteur FcyRIII par test CFC.
Afin de vérifier l'intégrité des anticorps traités par le DEPC, les anticorps sont soumis à un test, appelé CFC, qui estime la capacité des anticorps à fixer, dans un premier .
temps, l'antigëne contre lequel ils sont dirigés puis, dans un second temps, le récepteur ~FcyRIII (CD16) exprimé à la surface de la lignée cellulaire Jurkat CD16.
Les puits d'une plaque de microtitratiôn sont recouverts par des hématies Rh(D+) papaïnées. Les antiçorps anti-Rh(D), dilués à des concentrations variant de 7,8 à 500 ng/ml en IMDM + 2,5% sérum de veau foetal (SVF) sont déposés en parallèle sur deux plaques de microtitration préalablement « coatées » par les hématies. Après 90 min.
d'incubatidn à 37°C, les puits sont lavés.
L'une des plaques, utilisée pour détecter les IgG fixées sur les hématies, est incubée en présence d'un anticorps de souris anti-Fcy humain marqué à la phosphatase alkaline (Jackson ZrnmunoResearch Laboratories).
Dans l'autre plaque, les cellules Jurkat CD16, diluées à la concentration de 2 x 106 cellules/ml en IMDM + 1% SVF, sont ajoutées. Après 15 min. de contact à
37°C, la plaque est centrifugée en augmentant progressivement la vitesse et la durée de centrifugation jusqu'à négatives les témoins négatifs. On entend par témoin négatif des anticorps qui se fixent aux hématies immobilisées dans les puits de la plaque de microtitration mais qui ne fixent pas le récepteur FcyRIII présent à la surface des cellules Jurkat CD 16. Dans les puits contenant le témoin négatif, les cellules Jurkat CD16, après centrifugation, forment un amas au centre du puits alors que dans les puits contenant un témoin positif, les cellules Jurkat, CD 16 tapissent le puits.
Après centrifugation, la lecture des puits est effectuée et un score est donné
en fonction de l'étalement de cellules Jurkat CD16 dans le puits.
3. Mesure de l'activation du récepteur FcyRIII
Le test d'activation des cellules Jurkat CD16 mesure la sécrétion de l'interleukine-2 (IL-2) induite par la fixation du Fc des anticorps sur le récepteur FcyRIII
(CD16) après liaison du Fab à son antigène, présent sur la cellule cible. Le taux d'IL,-2 sécrétée par les cellules Jurkat CD 16 est proportionnel à l' activation du récepteur CD
16.
Dans une plaque de microtitration de 96 puits, on dépose successivement 50 ~.1 de dilutions d'anticorps, 50 ~,1 d'une suspension d'hématies à 6.105/ml, 50 ~,1 d'une .suspension de cellules Jurkat CD16 à 1.106/ml et 50 ~1 d'une solution de PMA
à 40 ng/ml. Toutes les dilutions ont été réalisées en milieu de culture I1VIDM
contenant 5%
de SVF.
Après 16 heures d'incubation à 37°C et 7% de C02, la plaque de microtitration est centrifugée et la quantité d'IL-2 contenue dans ,le surnageant est dosée par un kit com~.nerciâ.l (Duoset, R&b). Les taux d'IL-2 sécrétée sont exprimés en pg/ml.
Les résultats sont exprimés en % d'activation CD16, le taux d'IL-2 sécrétée en 4 hrs.
incubation at room temperature with stirring, the gel is mounted in column and washed with the 50 mM Imidazole buffer, pH 7.8. The effluent and wash buffer that contain the Fc fragments are brought together, concentrated pax centrifugation on Vivaspin 20 Using the conditions described by the manufacturer.
EXAMPLE 1 Presence of zinc ions bound to Fc fragments Crystallogenesis: After development, crystallization conditions deductions The following are the following: Fc fragment solution, 2 mg / ml buffer imidazole 50 mM, pH 7.8, is brought to 10% of monomethyl polyethylene glycol 5000, 100 mM
sodium cacodylate, 0.1 mM zinc chloride, pH 5.1 by vapor diffusion in drops at 17 ° C.
Collection of diffraction data and determination of structure: The obtained crystal is submitted to the RX at ESRF Grenoble and the information collected are treated by the DENZO and SCALEPACK programs (Otwinowski and Minor, 1997).
The structure is solved and refined to 2.3 ~ (Fig.l) using the following programs CCP4. . ~. .
Results: This EMABS Fc fragment crystal belongs to the space group with a fragment per asymmetric unit, the mesh parameters are the following:
~. 50.2, b = 147, 71; ~ c = 75.6t; a = (3 = y = 90 °.
The three-dimensional structure (shown schematically in Figure 1) makes it possible to evidence the presence of zinc ions (in white) near the CH2 and CH3 domains (in gray). The card of electron density shown in Figure 2 shows the zinc ion bound to residues histidine 310 (CH2) and 435 (CH3). Another zinc ion is linked to the histidine 268 of an Fc and to histidine 285 of a symmetrical Fc. The third is near histidine 433.
EXAMPLE 2 Effect of Metallic Cations on the Conformation of Fc Fragments In this example, the resulting crystals all belong to the space group P2 (1) 2 (1) 2 (1) with two strings per asymmetric unit and is characterized the opening of Fc by the distances between proline residues 329 of chains A and B and between the mannose residues 4 of chains A and B.
Crystallized in the absence of a metal ion, the Fc fragments of the antibody EMABS are characterized by a distance between prolines 329 of 32.53 ~ and a distance enter mannoses 4 of 17.61 1 ~. When adding a metal ion to the solution of crystallization (see Table I ~, these characteristic distances increase.
Table II: Main characteristics of crystals of the Fc fragment of antibody monoclonal EMABS in the spacing grove P2 (1) 2 (1) 2 (1).
Metal Code in "'~ D Pro D Man 801.
ResolutionParameters of stitch Crystal. 329 4 (A) (~. ~ Gles = 90 ~) (A) (A) Fcl No 48,982 75,498 nat 3.29 ~ 32.53 17.61 ... 145,032 0.3mM Fcl ZnCl2 49.716 75.516 Zn - 3.2 37.12 20.34 150.298 Fc1-Gd 2mM GdCl3 49.816 76.068 2.7 ~ 37.4 20.75 151.156 0.3mM Fcl 49.462 74.985 Cu - 3.15 35.87 19.79 Cu ++ Ac 148.928 Fcl O, imM Fe3 + 49.056 74.937 Fe - 3,475 35.78 19.61 148.148 Fcl 0.2mM CdCl2 49.253 75.079 CD
2,894 36.18 19.2 147,93 Figure 3 shows the superposition of the main strings of the structures held in absence (in gray) and in the presence of zinc (white) in the solution of crystallization.
The addition of a metal salt to the Fc solution therefore promotes a so-called conformation open, conformation close to that of Fc linked to FcγRIII receptor.
EXAMPLE 3 Modification of histidine residues by the DEPC
Diethylpyrocarbonate (DEPC) is a reagent that has been widely used for edit and to study the role of histidine residues in proteins (Miles, 1977). Firan and al (2001) showed that human IgG1 induced by DEPC lost their ability to bind the receptor: FcRn that is involved in IgG transfer nursery to the fetus. DEPC acts as a substitute for a nitrogen group present on the imidazole cycle of histidine, thus transforming the residue of histidine into 3-carboethoxy histidine.
1. Modification by the DEPC
The monoclonal antibody EMABS, dialyzed against 0.1M sodium acetate buffer, pH 6.0, is contacted with DEPC at 70 ~ .g of DEPC / mg of IgG.
After 30 minutes of incubation at room temperature, the reaction is stopped by the bill imidazole (0.2 mg / ml final).
After desalting in 20 mM sodium phosphate buffer, 50 mM NaCl, pH 7.2, the modified monoclonal antibody is fractionated by affinity chromatography sure Protein-Sepharose A. A fraction of the modified monoclonal antibody is not retained on the affinity gel and constitutes the non-retained fraction or FNR. The fraction retained on the gel and called FR is eluted with 0.1 M glycine-HCl buffer, pH
2.8.
The two fractions thus obtained are dialysed against phosphate buffer.
20mM sodium, 50mM NaCl, pH 7.2; concentrated on Vivaspin according to manufacturer's recommendations and stored at 4 ° C for 15 days maximum.
The control antibody, which serves as our reference, has undergone the same treatment except the DEPC which has been replaced by an identical volume of ethanol.
2. Measurement of Fc binding of antibodies to the receptor FcyRIII by CFC test.
In order to verify the integrity of antibodies treated with DEPC, antibodies are subject to a test, called CFC, which estimates the ability of antibodies to bind, in a first.
time, the antigen against which they are directed then, in a second step, the receiver ~ FcγRIII (CD16) expressed on the surface of the Jurkat CD16 cell line.
The wells of a microtitre plate are covered by red blood cells Rh (D +) papain. Anti-Rh (D) antibodies, diluted at concentrations varying from 7.8 to 500 ng / ml in IMDM + 2.5% fetal calf serum (FCS) are deposited in parallel on two microtiter plates previously "coated" with red blood cells. After 90 min.
incubated at 37 ° C, the wells are washed.
One of the plates, used to detect IgG attached to red blood cells, is incubated in presence of a phosphatase-labeled human anti-Fcy mouse antibody alkaline (Jackson ZrmunoResearch Laboratories).
In the other plate, the Jurkat CD16 cells, diluted at a concentration of 2 x 106 cells / ml in IMDM + 1% FCS, are added. After 15 min. from contact to 37 ° C, the plate is centrifuged by gradually increasing the speed and duration of centrifugation until negative the negative controls. Witness negative of antibodies that attach to immobilized red blood cells in plate wells of microtiter but do not fix the FcγRIII receptor present at the surface of Jurkat CD 16 cells. In wells containing the negative control, the Jurkat cells CD16, after centrifugation, form a cluster in the center of the well whereas in the wells containing a positive control, Jurkat cells, CD 16 lined the well.
After centrifugation, the wells are read and a score is given according to spreading Jurkat CD16 cells in the well.
3. Measurement of activation of the FcγRIII receptor The activation test of Jurkat CD16 cells measures the secretion of interleukin-2 (IL-2) induced by binding of Fc antibodies to the FcγRIII receptor (CD16) after Fab binding to its antigen, present on the target cell. IL level, -2 secreted by Jurkat CD 16 cells is proportional to activation of the CD receptor 16.
In a microtiter plate of 96 wells, one successively deposits 50 ~ .1 of Antibody dilutions, 50 ~, 1 of a suspension of red blood cells at 6.105 / ml, 50 ~, 1 a .suspension of Jurkat CD16 cells at 1.106 / ml and 50 ~ 1 of a PMA solution at 40 ng / ml. All dilutions were carried out in I1VIDM culture medium containing 5%
of SVF.
After 16 hours of incubation at 37 ° C. and 7% of CO 2, the microtitration is centrifuged and the amount of IL-2 contained in, the supernatant is assayed by a kit com ~ .nerciâ.l (Duoset, R & b). The levels of secreted IL-2 are expressed in μg / ml.
The results are expressed in% CD16 activation, the level of IL-2 secreted in
5 présence de l'anticorps monoclonal témoin étant considéré égal à 100%.
4. Mesure de l'activité ADCC
La technique ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) permet d'évaluer la capacité des anticorps à induire la lyse des hématies Rh(D+), en présence 10 de cellules efFectrices (cellules mononucléées ou lymphocytes).
Brièvement, les hématies d'un concentré globulaire RhD(+) sont traitées à la papaïne (lmg/ml, 10 min à 37°C) puis lavées en NaCl 0,9%. Les cellules effectrices sont isolées à partir d'un pool d'au moins 3 buffy-coat, par centrifugation sur Ficoll (Amersham Siosciences), suivi d'une étape d'adhérence en présence de 25% de SVF, 15 de façon à obtenir un ratio lymphocytes/monocytes de l'ordre de 9. Dans une plaque de microtitration (96 puits) on dëpose par puits : 100 ~,l d'une dilution d'anticorps anti-Rh(D) purifié (de 9,3 à 150 ng/ml), 25 ~,l d'hématies papa,'inées Rh(D+) à 4 x 10~, 25 ~.l de cellules effectrices à 8 x .10' et 50 ~.l d'IgG polyvalentés (Tégéline, LFB) aux concentrations usuelles de 2 et 10 mg/ml. Les dilutions sont faites en IMDM
contenant 20 0,25% de SVF. Après incubation 1 nuit à 37°C, les plaques sont centrifugées, puis l'hémoglobine libérée dans le surnâgeant est mesurée par l'intermédiaire de son activité peroxydasique en présence d'un substrat chromogénique, le 2,7-diaminofluorène (DAF). Les résultats sont exprimés en pourcentage de lyse, 100%
correspondant à lâ lyse totale des hématies en NH4Cl (témoin 100%) et 0% au mélange 25 réactionnel sans anticorps (témoin 0%). La lyse spécifique est calculée en pourcentage selon la formule suivante (DO échantillon DO témoin 0%) X100 - % ADCC
DO témoin 100% - DO témoin 0%
WO 2005/04021The presence of the control monoclonal antibody being considered equal to 100%.
4. Measurement of ADCC activity The Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity (ADCC) technique to evaluate the ability of antibodies to induce lysis of Rh (D +) red cells, by presence 10 cells efFectrices (mononuclear cells or lymphocytes).
Briefly, red blood cells of RhD (+) globular concentrate are treated at the papain (1 mg / ml, 10 min at 37 ° C.) and then washed with 0.9% NaCl. Cells effector are isolated from a pool of at least 3 buffy-coat, by centrifugation on Ficoll (Amersham Siosciences), followed by an adhesion step in the presence of 25% of FCS, To obtain a lymphocyte / monocyte ratio of the order of 9. In a plate of microtitration (96 wells) is deposited per well: 100 ~, 1 of a dilution anti-antibodies Rh (D) purified (from 9.3 to 150 ng / ml), 25 ~, 1 of red blood cells, Rh (D +) ines at 4 x 10 ~ 25 ~ .l effector cells at 8 x 10 'and 50 ~ .l polyvalent IgG (Tegeline, LFB) usual concentrations of 2 and 10 mg / ml. Dilutions are made in IMDM
containing 0.25% FCS. After incubation overnight at 37 ° C, the plates are centrifuged and then the hemoglobin released in the supernatant is measured via his peroxidase activity in the presence of a chromogenic substrate, the 2,7-diaminofluorene (DAF). The results are expressed as a percentage of lysis, 100%
corresponding to the total lysis of red blood cells to NH4Cl (100% control) and 0%
mixed Reaction without antibody (control 0%). The specific lysis is calculated in percentage according to the following formula (DO sample DO control 0%) X100 -% ADCC
100% control OD - 0% control OD
WO 2005/04021
6 PCT/FR2004/002687 Résultats Après traitement par le DEPC suivant les conditions décrités ci-dessus, environ 20%~
des molécules de l'anticorps monoclonal EMABS, constituant la fraction FNR, perdent leur capacité à se fixer au gel de Sépharose-protéine A. Sachant que l'histidine 435 est wn acide aminé essentiel de la fixation des IgG à la protéine A, il paraît vraisemblable que les IgG de la fraction FNR se différencient de la fraction FR, retenue sur le gel de Sépharose-protéine A, par la môdification du résidu His435.
Dans le test de mesure de la fixation au récepteur CD 16 en présence d' antigène, la fraction FNR présente les mêmes capacités que la fraction FR, capacités qui sont identiques à celles de l'anticorps témoin (Fig. 4). Dé plus, la fixation des différentes fractions de l'anticorps monoclonal EMABS, modifié ou non par le DEPC, est très supérieure à celle de l'anticorps monoclonal ADl, utilisé dans ce test comme témoin négatif. Ainsi, la modification des résidus d'histidine par le DEPC n'induit pas de changement dans la capacité de l'anticorps monoclonal EMABS à se fixer aux hématies Rh(D+) ni au récepteur CD 16 présent à la surface de la lignée cellulaire Jurkat CD 16.
Par contre, l'activité fonctionnelle de l'anticorps monoclonal EMABS modifié
par le DEPC est très diminuée. Ainsi, la sécrétion d'IL-2 de la lignée Jurkat CD16 induite par les fractions FR et FNR de l'anticorps monoclônal EMABS modifié par le DEPC
représente, respectivement, 42,8% et 19.5% de la sécrétion induite par l'anticorps témoin (Fig. 5). Les résultats de l'activité ADCC, exprimés en % de lyse réelle, montrent qué l'activité de la fraction FNR est inférieure à celle de la fraction FR
(Fig.6). D'autre part, la fraction FR présenté une diminution de l'activité
ADCC par rapport à l'anticorps.témoin, lorsque la quantité d'anticorps ajoutée dans le puits est plus faible (< 20 ng/ml) et que la quantité d'IgG polyvalentes est de 2,5 mg/ml.
En conclusion, bien qu'ayant conservé leur capacité à fixer l' antigène et le récepteur FcyRIII (CD16), les fractions d'anticorps rriorloclonal EMABS modifiées par le DEPC
présentent une activité forictionnellé (ADCC, inductiôn de la sécrétion de cytokine) diminuée. Cette diminution d'activité est plus marquée pour la fraction FNR, fraction qui présente vraisemblablement une modification du résidu His435.
Ces résultats montrent donc que la conservation du résidu His435 est.
importante pour la préservation de l'activité fonctionnelle des anticorps de typè IgGl.
EXEMPLE 4 : Activité fonctionnelle 'des anticorps portant la double mutation His310-435Lys La modification des résidus d'histidine pax un agent chimique (DEPC ou autre) ne permet de maîtriser ni le degré, ni la localisation des modifications. Ainsi, les deux résidus d'histidine, His310 et His435, qui jouent un rôle essentiel dans la liaison du cation zinc à l'interface CH2-CH3 des IgGl, sont substituées par des résidus de lysine, par mutagénèse dirigée.
1. Obtention d'un anticorps anti-Rh(D) portant la double ~ mutation His310-43 SLys Le vecteur d'expression contenant le cDNA codant la séquence d'acides aminés de la chaîne lourde de l'anticorps anti-Rh(D) EMABS, a servi de matrice pour la réalisation d'une double mutagénèse dirigée réalisée par PCR (« PCR-based site-directed mutagenesis »). Les quatre substitutions nucléotidiques suivantes ont été
introduites:
- ~ C1229A et C1301G pour le changement du résidu His338 en Lys (position 310 selon la numérotation de Kabat), soit CAC-i AAG;
- C1674A et C1676G pour la mutation du résidu His463 en Lys (position .435 selôn la nuinérotatiôn de Kabat), soit CAC ~
AAG. .
La séquence mutée a été séquencée et les résultats du séquençage sont donnés à
le Tableau III.
Tableau III : Séquences oligonucléotidique et polypeptidique de la chaîne lourde doublement mutée de l'anticorps monoclonal. EMABS
Les résidus His338 et His461 de la chaîne lourde de l'anticorps monoclonal EMABS, qui correspondent aux résidus His310 et His435 selon la numérotation de Kabat, ont été substitués par des résidus de lysine.
Séquence du cDNA du double mutant His310-435Lys (SEQ ID No 1) atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctggtggagtctg ggggag gcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtacagcctctggattcaccttcaaaaactatgctatgcattg ggtcc gccaggctccagccaaggggctggagtgggtggcaactatatcatatgatggaaggaatatacaatatgcagactccgt gaa gggccgatgcaccttctccagagacaattctcaggacaccctgtatctgcaactgaacagcctcagaccggaggacacg gct gtgtattactgtgcgagacccgtaagaagccgatggctgcaattaggtcttgaagatgcttttcatatctggggccagg ggaca atggtcaccgtctcttcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggg gcac agcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagc gg cgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgiggtgaccgtgccctccagcagc ttgg gcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttg tg acaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caa ggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaag ttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtg t ggtcagcgtcctcaccgtcctgaagcaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctc cc agcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgg g atgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcçcagcgacatcgccgtggagtggga ga gcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaa gct , WO 2005/040216 _ _ PCT/FR2004/002687 _ caçcgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaacaagtac ac gcagaagagcctçtccctgtctccgggtâaatag Séquence peptidique du double mutant His310-H435Lys (SEQ ID No 2) S
351 VSNKALPAP~I EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF
1S 451 FSCSVMHEAL HNKYTQKSLS LSPGK*
Les cellules YB2/0, co-transfectées par électroporation avec le vecteur muté
EMABS-H-K338-K463-1 et le vecteur EMABS- dhfr-K- SpeI codant pour la chaine légère de _ l'anticorps EMABS; sont cultivées en milieu RPMI additionné de S% de SVF
dialysé, O,S% de 6418 et 25 nM de Méthotrexate (MTX). Les clones sécrétant les plus forts taux d'IgG humaines sont cultivés en plaques de 24 puits en milieu sans MTX.
Les _ surnageants, récoltés après 7 jours de culture, sont utilisés pour faire les essais décrits ci-dessous.
2S 2. Mesure de la fixation du Fc des anticorps au récepteur FcyRIII (CFC) Ce test est réalisé sur les surnageants de culture, le.taux d'IgG humaines contenu dans les surnageants.étant déterminé par dosage ELISA.
Les puits d'une plaque de microtitration sont recouverts par des. hématies Rh(D+) pâpa.'inées. Les surnageants de culture contenant les anticorps anti-Rh(D).
natifs ou mutés et dilués à des concentrations variant de 7,8 à S00 ng/ml en IIVVIDM +
2,S% SVF.
sont déposés en parallèle sur deux plaques de microtitration préalablement «
coatées »
par les hématies. Après,90, min. d'incubation à 37°C, les puits sont lavés.
L'une des plaques, utilisée pour détecter les IgG fixées sur les hématies, est incubée en présence d'un anticorps de souris anti-Fcy humain marqué à la phosphatâse alkaline 5 (Jackson T_m__munoReaserch Laboratories).
Dans l'autre plaque, les cellules Jurkat CD16 sont ajoutées après 15 min. de contact à
37°C, la plaque est centrifugée en augmentant progressivement la vitesse et la durée de centrifugation jusqu'à négativer les témoins négatifs. Après centrifugation, la lecture des puits est effectuée et un score est donné en fonction de l'étalement de cellules 10 Jurkat CD 16 dans le puits.
3. Mesure de l' activation du récepteur CD 16 Dans une plaque de microtitration de 96 puits, on dépose successivement 50 ~,1 de dilutions de surnageants de culture contenant des anticorps anti-.Rh(D) natifs ou mutés, 15 50 ~,l d'une suspension d'hématies à 6.105/ml, 50 ~,l d'une suspension de cellules Jurkat CD16 à 1.106/ml et 50 ~.1 d'une solution de PMA à 40 ng/ml. Toutes les dilutions ont été réalisées en milieu de culture IMDM contenant 5% de SVF.
Après 16 heures d'incubation à 37°C et 7% de C02, la plaque de microtitration est centrifugée et la quantité d'IL-2 contenûe dans le surnageant est dosée par un kit 20 commercial (Duoset, R&D). Les tain d'IL-2 sécrétés sont exprimés en pg/ml.
Les résultats sont exprimés en % d'activation CD16, le taux d'IL-2 sécrétée en présence de l'anticorps monoclonal témoin étant considéré égal à 100%
Les différents tests ont été réalisés sur les surnageants de culture contenant les 25 anticorps monoclonaux anti-Rh(D) mutés ou non. Les résultats du test CFC
montrent que la double mutation His310-435Lys n'induit pas de modification de la fixation de l'anticorps au récepteur FcyRIII, porté par la lignée cellulaire Jurkat CD16 (Fig.7).
Alôrs que le clone non muté 6H11 (témoin négatif) présente W e fixation au récepteur FcyRIiI diminuée, les clones mutés 1C7, 2H11, 4G5 et 4H10 fixent le récepteur FcyRIII de manière similaire aux clones non mutés 16D 11 et 11 GS (témoins positifs).
L'activation CD16 a été réalisée sur les surnageants de culture~de 4 clones mutés cités ci-dessus et de 3 clones non mutés (16D11, 1165 et 24G9). Les résultats représentent la moyenne (+/- écart-type) des taux d'IL-2 sécrétée par les cellules Jurkat CD16 en présence des clones non mutés (Natif et des clones mutés (His310-435Lys). Les anticorps mutés induisent une sécrétion d'IL-2 très dminuée par rapport à~celle induite par les anticorps natifs (Fig.B). Ainsi, les anticorps mutés présentent une baisse de capacité à activer le récepteur FcyRIll de 50%.
EXEMPLE 5 : Etude de la fixation des anticorps monoclonaux mutés ou non sur le récepteur FcyRIII par cytométrie en flux.
L'influence de l'imidazole ainsi que l'impact des mutations His310-435Lys sur la fixation des anticorps au récepteur FcyRIII (CD 16) présent à la surface des cellules Jurkat CD16 ont été évalués par cytométrie en flux.
1. Effet de l'imidazole 5.105 cellules Jurkat CD16 sont incubées pendant 30 minutes en présence de différentes concentrations de l'anticorps monoclonal EMABS dilué en tampon PBS
contenant 0,5% d'albumine bovine (SAB) ou en tampon PBS-SAB 0,5% supplémenté
à 50 mM en imidazole. Puis les cellules sont lavées en tampon PBS-SAB 0,5% et incubées en présence de F(ab')2 de souris anti-IgG humaine (H+L) marquée au FITC
(Jackson IlnmunoResearch Laboratories). Après 30 minutes d'incubation, les cellules sont lavées comme précédemment et la fixation de l'anticorps EMABS est analysée par cytométrie en flux en utilisant un FACScalibur 4CA et le programme Cell Quest Pro . (Becton Dickinson).
2. Fixâtion dé l'anticorps doublement muté
5.'105 cellules Jurkat CD16 sont incubées pendant 3.0 minutes dans du tampon PBS-SAB 0,5% en présençe de différentes concentrations. d'anticorps monoclonaûx contenus dans des surnageants de culture. Puis les cellules sont lavées en tampon PBS-SAB 0,5% et incubées en présence de F(ab')2 de souris anti-IgG humaine (H+L) marquée au FITC . Après 30 minutes d'incubation, les cellules sont lavées comme précédemment et la fixation dés anticorps est analysée par cytométrie en flux en utilisant un FACScalibur 4CA et le programme Cell Quest Pro (Becton Dickinson).
Les résultats de la fixation de l'anticorps EMABS. sur le récepteur CD16 (FcyRIIl) présent à la surface des cellules Jurkat CD16 en présence ou non d'imidazole sont présentés en Fig.9.
Ainsi, l'addition de 50 mM d'imidazole dans le tâmpon d'incubation de l'anticorps avec les cellules provoque une diminution de fixation de l'anticorps qui se traduit par une baisse significative du pourcentage de cellules marquées ; à la concentration en anticorps de 1,5 ~.g/ml, la présence d'imidazole induit une diminution de 40%
du nombre de cellules marquées.
L'imidazole est un réactif qui a la propriété de fixer les cations. Ainsi, en déprivant le milieu d'incubation des cations s par addition d'imidazole, la fixation de l'anticorps sur le récepteur CD 16 est diminué.
La fixation sur le récepteur FcyRIII des cellules Jurkat CD 16 de 3 anticorps monoclonaux contenus dans des surnageants de culture est présentée à la Fig.lO.
Ainsi, les résultats exprimés en pourcentage de cellules marquées en fonction de la quantité d'anticorps ajoutée, montrent que les anticorps 4G5 et 4H10, qui ont la double mutation His310-435Lys, se fixent significativement moins bién aux cellules Jurkat CD16 que le clone 2469, qui est l'anticorps témoin non muté.
Ces expériences illustrent bien qué la fixation des anticorps au récepteur CD16 est affectée par l'absence de cations: Inversement, la présence de cations devrait améliorer la fiXation de l'anticorps sûr le réceptei~i et de ce faitc améliorer l'activité cytotoxique de l'anticorps.
10 .
REFERENCES
Chaprilan TL, You .I, Joseph IM, Bjorkman ~ PJ, Morrison SL, Raghavan M.
Characterization of the interaction between the herpes simplex virus type I Fc receptor and immunoglobulin G. (1999) J. Biol. Chem. ; 274 : 6911-9.
Corper AL, Sohi MK, Bonagura VR, Steinitz M, Jefferis R, Feinstein A, Beale D, Taussig MJ, Sutton BJ. Structure of human .IgM rheumatoid factor Fab bound to its autoantigen IgG Fc reveals a novel topology of antibody-antigen interaction.
(1997) Nat Struct Biol.; 4 : 374-81.
Deisenhofer J. Crystallographic refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with fragment B of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9-and. .
2.8-A resolution.
(1981) Biochemistry. 20, 2361-70.
Firan M, Bawdon R, Radu C, Ober RJ, Eaken D, Antohe F, Ghetie V; Ward ES. 'The MHC class I-related receptor, FcRn, plays an essentiel role in the maternofetal transfer of gammâ-globulin in humans. (2001) Int. Immunol. 13, 993-1002.
Maillard P, Lavergne JP, Siberil S, Faure G, Roohvand F, Petres S, Teillaud JL, .
Budkowska A. Fcgamma receptor-litre activity of hepatitis C virus core protein. (2004) J. Biol. Chem. 279, 2430-7.
Miles EW. Modification of histidyl residues in proteins by diethylpyrocarbonate.
~, (1977) Methods Enzymol. 47, 431-42.
Otwinowski Z, Minor W. Processing of X-ray diffrâction data collected in oscillation mode._(1997) Methods Enzymol. 276, 307-26.
Sauer-Eriksson AE, Kleywegt GJ, Uhlen M, Jones TA. Crystal structure of the C2 5 fragment of streptococcal protein G in complex with the Fc domain of human IgG.
(1995) Structure. 3, 265-78.
Shields RL, Namenuk AK, Hong I~, Meng .YG, Rae J, Briggs J, Xie D, Lai J, Stadlen A, Li B, Fox JA, Presta LG. High resolution mappirig of the binding site on human 10 IgGl for Fc gamma RI,~Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgGl variants with improved binding to the Fc gamma R. (2001) J Biol Chem. 276, 604).
DEMANDES OU BREVETS VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVETS
COMPRI~:ND PLUS D'UN TOME.
CECI EST L,E TOME 1 DE 2 NOTE: Pour les tomes additionels, veillez contacter le Bureau Canadien des Brevets.
JUMBO APPLICATIONS / PATENTS
TRIS SECTION OF THE APPLICATION / PATENT CONTAINS MORE
THAN ONE VOLUME.
NOTE: For additional valumes please contact the Canadian Patent Office. 6 PCT / FR2004 / 002687 Results After treatment with DEPC following the conditions described above, about 20% ~
molecules of the monoclonal antibody EMABS, constituting the FNR fraction, lose their ability to bind to protein-A Sepharose gel.
histidine 435 is wn essential amino acid from the binding of IgG to protein A, it seems likely that the IgGs of the FNR fraction differ from the FR fraction, retained on the gel of Protein A Sepharose, by the fermentation of the residue His435.
In the test for measuring the attachment to the CD16 receptor in the presence of antigen, the fraction FNR has the same capabilities as the fraction FR, capacities which are identical to those of the control antibody (Fig. 4). Moreover, the fixing of different fractions of the EMABS monoclonal antibody, modified or not by DEPC, is very greater than that of the monoclonal antibody AD1, used in this test as witness negative. Thus, the modification of the histidine residues by the DEPC induces no change in the ability of the EMABS monoclonal antibody to bind to Rh (D +) red blood cells nor to the CD 16 receptor present on the surface of the cellular Jurkat CD 16.
On the other hand, the functional activity of the modified EMABS monoclonal antibody speak DEPC is very diminished. Thus, the secretion of IL-2 from the Jurkat CD16 line induced by the fractions FR and FNR of the DEPC-modified EMCDS monoclonal antibody represents, respectively, 42.8% and 19.5% of the secretion induced by antibody control (Fig. 5). The results of the ADCC activity, expressed as% lysis real show that the activity of the FNR fraction is lower than that of the FR fraction (Fig.6). On the other hand, the fraction FR presented a decrease in activity ADCC by compared to the antibody.Temoin, when the amount of antibody added in the well is lower (<20 ng / ml) and the amount of polyvalent IgG is 2.5 mg / ml.
In conclusion, although having retained their ability to fix antigen and receiver FcγRIII (CD16), the rriorloclonal antibody fractions EMABS modified by the DEPC
have a fornictionnelle activity (ADCC, inductio of the secretion of cytokine) decreased. This decrease in activity is more marked for the FNR fraction, fraction which presumably shows a modification of the His435 residue.
These results therefore show that the conservation of the His435 residue is.
important for preserving the functional activity of IgG1 type antibodies.
EXAMPLE 4: Functional Activity of Antibodies Bearing the Double Mutation His310-435Lys Modification of histidine residues pax a chemical agent (DEPC or other) born allows you to control neither the degree nor the location of the modifications. So, both Histidine residues, His310 and His435, which play a vital role in link from zinc cation at the CH2-CH3 interface of IgG1 are substituted by residues lysine, by directed mutagenesis.
1. Obtaining an anti-Rh (D) antibody carrying the double ~ mutation His310-43 SLys The expression vector containing the cDNA encoding the amino acid sequence of the heavy chain of the anti-Rh (D) antibody EMABS, served as a template for the production of a double directed mutagenesis performed by PCR ("PCR-based site-directed mutagenesis "). The following four nucleotide substitutions were introduced:
- ~ C1229A and C1301G for the change of the residue His338 in Lily (position 310 according to the Kabat numbering), ie CAC-i AAG;
C1674A and C1676G for the mutation of the residue His463 in Lys (position .435 selon the Kabat nuinérotatiôn), or CAC ~
AAG. .
The mutated sequence was sequenced and the results of the sequencing are given at the Table III.
Table III: Oligonucleotide and Polypeptide Chain Sequences heavy doubly mutated monoclonal antibody. EMABS
His338 and His461 residues of the heavy chain of the monoclonal antibody EMABS, which correspond to the residues His310 and His435 according to the Kabat numbering, have have been substituted with lysine residues.
His310-435Lys double mutant cDNA sequence (SEQ ID No 1) atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctggtggagtctg ggggag gcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtacagcctctggattcaccttcaaaaactatgctatgcattg ggtcc gccaggctccagccaaggggctggagtgggtggcaactatatcatatgatggaaggaatatacaatatgcagactccgt gaa gggccgatgcaccttctccagagacaattctcaggacaccctgtatctgcaactgaacagcctcagaccggaggacacg gct gtgtattactgtgcgagacccgtaagaagccgatggctgcaattaggtcttgaagatgcttttcatatctggggccagg ggaca atggtcaccgtctcttcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggg CCGA
agcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagc gg cgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgiggtgaccgtgccctccagcagc ttgg gcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttg tg acaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacc caa ggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaag ttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtg t ggtcagcgtcctcaccgtcctgaagcaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctc CC
agcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgg boy Wut atgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcçcagcgacatcgccgtggagtggga ga gcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaa gct, WO 2005/040216 _ _ PCT / FR2004 / 002687 _ caçcgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaacaagtac ac gcagaagagcctçtccctgtctccgggtâaatag Peptide sequence of His310-H435Lys double mutant (SEQ ID No. 2) S
351 VSNKALPAP ~ I EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF
1S 451 FSCSVMHEAL HNKYTQKSLS LSPGK *
YB2 / 0 cells, co-transfected by electroporation with the mutated vector EMABS-H-K338-K463-1 and the EMABS-dhfr-K-SpeI vector encoding the light chain of the EMABS antibody; are cultured in RPMI medium supplemented with S% FCS
dialysis, 0.5% of 6418 and 25 nM of methotrexate (MTX). Clones secreting the most strong Human IgG levels are grown in 24-well plates in medium without MTX.
The _ supernatants, harvested after 7 days of culture, are used to make the described tests below.
2S 2. Measurement of Fc binding of antibodies to FcγRIII receptor (CFC) This test is carried out on the culture supernatants, the human IgG level.
contained in the supernatants being determined by ELISA assay.
The wells of a microtiter plate are covered by. erythrocytes Rh (D +) pâpa.'inées. Culture supernatants containing anti-Rh (D) antibodies.
native or mutated and diluted at concentrations ranging from 7.8 to 500 ng / ml in IIVVIDM +
2, S% SVF.
are deposited in parallel on two microtiter plates previously "
coated »
by the red blood cells. After, 90, min. incubation at 37 ° C, the wells are washed.
One of the plates, used to detect IgG attached to red blood cells, is incubated in presence of a phosphatase-labeled human anti-Fcy mouse antibody alkaline (Jackson TmmunoReaserch Laboratories).
In the other plate, Jurkat CD16 cells are added after 15 min. of contact to 37 ° C, the plate is centrifuged by progressively increasing the speed and duration of centrifugation until negativer negative controls. After centrifugation, reading wells is performed and a score is given according to the spread of cell 10 Jurkat CD 16 in the well.
3. Measurement of the activation of the CD receiver 16 In a microtiter plate of 96 wells, one successively deposited 50 ~, 1 of dilutions of culture supernatants containing native anti-Rh (D) antibodies or mutated, 50 ~, l of a suspension of red blood cells at 6.105 / ml, 50 ~, l of a suspension of cell Jurkat CD16 at 1.106 / ml and 50 ~ .1 of a PMA solution at 40 ng / ml. All the Dilutions were carried out in an IMDM culture medium containing 5% FCS.
After 16 hours of incubation at 37 ° C. and 7% of CO 2, the microtitration is centrifuged and the amount of IL-2 contained in the supernatant is assayed by a kit 20 commercial (Duoset, R & D). Secreted IL-2 taines are expressed in μg / ml.
The results are expressed in% CD16 activation, the level of IL-2 secreted in presence of the control monoclonal antibody being considered equal to 100%
The different tests were carried out on the culture supernatants containing the 25 monoclonal antibodies against Rh (D) mutated or not. The results of the CFC test show that the His310-435Lys double mutation does not induce a modification of the fixing of the antibody to the FcγRIII receptor carried by the Jurkat CD16 cell line (Fig.7).
Whereas the non-mutated clone 6H11 (negative control) has W e attachment to receiver Decreased FcγRIiI, mutated 1C7, 2H11, 4G5 and 4H10 clones secure the receptor FcγRIII similarly to non-mutated clones 16D 11 and 11 GS (controls positive).
The CD16 activation was carried out on culture supernatants of 4 clones mutated cities above and 3 unmutated clones (16D11, 1165 and 24G9). The results represent the mean (+/- standard deviation) of IL-2 levels secreted by Jurkat cells CD16 in presence of non-mutated clones (Native and mutated clones (His310-435Lys).
mutated antibodies induce IL-2 secretion very at ~ the induced one by native antibodies (Fig.B). Thus, the mutated antibodies have a drop of ability to activate the FcyRIll receptor by 50%.
EXAMPLE 5 Study of the binding of the monoclonal antibodies mutated or not on the FcyRIII receptor by flow cytometry.
The influence of imidazole and the impact of His310-435Lys mutations on the antibodies to the FcγRIII receptor (CD 16) present on the surface of the cell Jurkat CD16 were evaluated by flow cytometry.
1. Effect of imidazole 5.105 Jurkat CD16 cells are incubated for 30 minutes in the presence of different concentrations of the EMABS monoclonal antibody diluted in PBS buffer containing 0.5% bovine albumin (BSA) or 0.5% PBS-BSA buffer supplemented to 50 mM imidazole. The cells are then washed in 0.5% PBS-BSA buffer and incubated in the presence of mouse F (ab ') 2 anti-human IgG (H + L) labeled with FITC
(Jackson IlmunoResearch Laboratories). After 30 minutes of incubation, the cell are washed as before and the binding of the EMABS antibody is analyzed by flow cytometry using a FACScalibur 4CA and the Cell Quest program Pro . (Becton Dickinson) 2. Fixation of the double mutated antibody 5.'105 Jurkat CD16 cells are incubated for 3.0 minutes in buffer PBS
SAB 0.5% in the presence of different concentrations. monoclonal antibodies contained in culture supernatants. Then the cells are washed in PBS buffer 0.5% BSA and incubated in the presence of mouse F (ab ') 2 anti-human IgG (H + L) marked in FITC. After 30 minutes of incubation, the cells are washed as previously and antibody binding is analyzed by flow cytometry in using a FACScalibur 4CA and the Cell Quest Pro program (Becton Dickinson).
The results of the binding of the EMABS antibody. on the CD16 receiver (FcyRIIl) present on the surface of Jurkat CD16 cells with or without imidazole are presented in Fig.9.
Thus, the addition of 50 mM imidazole to the incubation stain of antibody with the cells causes a decrease in binding of the antibody that is translated by a significant decrease in the percentage of labeled cells; to the concentration in antibody of 1.5 ~ .g / ml, the presence of imidazole induces a 40% decrease of number of labeled cells.
Imidazole is a reagent that has the property of fixing the cations. So, in describing the cation incubation medium by addition of imidazole, fixation of antibody on the CD 16 receiver is decreased.
FcγRIII receptor binding of Jurkat CD16 cells of 3 antibodies monoclonals contained in culture supernatants is presented at Fig.lO.
Thus, the results expressed as a percentage of cells labeled according of the amount of antibody added, show that the 4G5 and 4H10 antibodies, which the double His310-435Lys mutation, bind significantly less to cells Jurkat CD16 than clone 2469, which is the unmutated control antibody.
These experiments illustrate that the binding of antibodies to the receptor CD16 is affected by the absence of cations: Conversely, the presence of cations should improve the fiXation of the antibody is safe and therefore better cytotoxic activity of the antibody.
10.
REFERENCES
Chaprilan TL, You .I, Joseph IM, Bjorkman ~ PJ, Morrison SL, Raghavan M.
Characterization of the interaction between the herpes simplex virus type I Fc receptor and immunoglobulin G. (1999) J. Biol. Chem. ; 274: 6911-9.
Corper AL, Sohi MK, Bonagura VR, Steinitz M, Jefferis R, Feinstein A, Beale D, Taussig MJ, Sutton BJ. Structure of human .IgM Rheumatoid factor Fab bound to ict autoantigen IgG Fc reveals a novel topology of antigen-antibody interaction.
(1997) Nat Struct Biol .; 4: 374-81.
Deisenhofer J. Crystallographic refinement and atomic models of a human Fc fragment B of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9-and. .
2.8-A resolution.
(1981) Biochemistry. 20, 2361-70.
Firan M, Bawdon R, Radu C, RJ Ober, Eaken D, Antohe F, Ghetie V; Ward ES. 'Tea MHC class I-related receptor, FcRn, plays an essential role in the maternofetal transfer of gamma-globulin in humans. (2001) Int. Immunol. 13, 993-1002.
Maillard P, Lavergne JP, Siberil S, Faure G, Roohvand F, Petres S, Teillaud JL,.
Budkowska A. Fcgamma receptor-liter activity of hepatitis C virus core protein. (2004) J. Biol. Chem. 279, 2430-7.
Miles EW. Modification of histidyl residues in proteins by diethylpyrocarbonate.
~, (1977) Methods Enzymol. 47, 431-42.
Otwinowski Z, Minor W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. (1997) Methods Enzymol. 276, 307-26.
Sauer-Eriksson AE, Kleywegt GJ, Uhlen M, Jones TA. Crystal structure of the C2 Fragment of streptococcal protein G in complex with the Fc domain of human IgG.
(1995) Structure. 3, 265-78.
Shields RL, Namenuk AK, Hong I ~, Meng .YG, Rae J, Briggs J, Xie D, Lai J, Stadlen A, Li B, JA Fox, Presta LG. High resolution mappirig human IgG1 for Fc gamma R1, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgGl Variants with Fc Gamma R (2001) J. Biol Chem. 276, 604).
VOLUMINOUS REQUESTS OR PATENTS
THIS PART OF THIS APPLICATION OR PATENTS
COMPRI ~: ND MORE THAN A TOME.
THIS IS E, TOME 1 OF 2 NOTE: For additional volumes, please contact the Canadian Bureau of Patents.
JUMBO APPLICATIONS / PATENTS
TRIS SECTION OF THE APPLICATION / PATENT CONTAINS MORE
THAN ONE VOLUME.
NOTE: For additional fees please contact the Canadian Patent Office.
Claims (40)
fonctionnelle d'anticorps. 1. Use of divalent or trivalent metal cations to improve the activity functional antibody.
en ce que ledit site de fixation est créé par substitution de l'Arg 435 par l'His 435. An antibody according to any of claims 11 or 12, characterized in that said binding site is created by substitution of Arg 435 with His 435.
en ce que l'un au moins desdits résidus histidine est remplacé par un au moins des résidus choisis parmi la cystéine, l'acide aspartique et l'acide glutamique. Antibody according to one of Claims 11 to 12, characterized in that at least one of said histidine residues is replaced by at least one of selected residues among cysteine, aspartic acid and glutamic acid.
en ce qu'il possède un cation métallique divalent ou trivalent fixé sur ledit site de fixation. Antibody according to one of Claims 11 to 14, characterized in this that it has a divalent or trivalent metal cation attached to said site of fixation.
en ce que ledit cation est le zinc, le fer, le cuivre ou le cadmium. Antibody according to one of Claims 11 to 15, characterized in that said cation is zinc, iron, copper or cadmium.
en ce que .
l'allotype dudit anticorps est G3m(b) ou G3m(g). Antibody according to one of claims 11 to 16, characterized in that .
the allotype of said antibody is G3m (b) or G3m (g).
en ce qu'il possède une fixation au Fc.gamma.RIII améliorée et une activité
fonctionnelle améliorée par rapport à l'anticorps natif. Antibody according to one of claims 11 to 17, characterized in this that it has an improved Fc.gamma.RIII attachment and an activity improved functional compared to the native antibody.
18 pour la préparation d'un médicament pour le traitement des pathologies comme la maladie hémolytique du nouveau-né, une pathologie virale, bactérienne ou parasitaire, une pathologie liée aux agents pathogènes ou toxines dérivées, listés comme étant particulièrement dangereux dans les cas de bioterrorisme (classification des Centers for Disease Control, CDC), notamment l'anthrax (Bacillus anthracis), le botulisme (Clostridium botulium), la peste (Yersinia pestis), la variole (Variola major), la tularémie (Francisella tularensis), les fièvres hémorragiques virales (liées aux filovirus -Ebola, Marburg et aux arenavirus-Lassa, Machupo), la toxine epsilon de Clostridium perfringens, la brucellose (Brucella species), la melioidose (Burkholderia mallei), la toxine de ricin (Ricinus communis). 19. Use of the antibody according to any one of claims 11 to 18 for the preparation of a medicament for the treatment of pathologies such as sickness haemolytic disease of the newborn, a viral, bacterial or parasitic disease, a Pathology related to pathogens or toxins derived, listed as particularly dangerous in the case of bioterrorism (classification of Centers for Disease Control, CDC), including anthrax (Bacillus anthracis), botulism (Clostridium botulium), plague (Yersinia pestis), smallpox (Variola major), the tularemia (Francisella tularensis), viral haemorrhagic fevers (related filovirus -Ebola, Marburg and arenavirus-Lassa, Machupo), the epsilon toxin of Clostridium perfringens, brucellosis (Brucella species), melioidosis (Burkholderia mallei), the castor toxin (Ricinus communis).
21, caractérisée en ce que lesdits anticorps sont les anticorps des revendications 11 à 18 ou des IgG humaines ou ayant une région Fc humaine. 22. Pharmaceutical composition according to any one of claims 20 to characterized in that said antibodies are the antibodies of the claims 11 to 18 or human IgGs or having a human Fc region.
22, caractérisée en ce que les cations métalliques sont le zinc, le fer, le cuivre ou le cadmium, ou un mélange de plusieurs d'entre eux. 23. Pharmaceutical composition according to any one of claims 20 to characterized in that the metal cations are zinc, iron, copper where the cadmium, or a mixture of several of them.
de l'anticorps. 30. Test to evaluate the efficacy of an antibody comprising the study of the 3D conformation of the domain involving His 310, His 435, His 433 and / or Asn 434 (Kabat numbering) as shown in Figure 1 or 2 or a dosage of the Zinc content of said antibodies, the presence of zinc being an indication of effectiveness of the antibody.
(numérotation de Kabat). 31. Antibodies possessing at least one of His residues His 310 and His 435 amended (Kabat numbering).
en ce que les résidus His 310 et His 435 sont substitués par des résidus lysine. Antibody according to one of claims 32 to 34, characterized in that His 310 and His 435 residues are substituted with lysine residues.
en ce qu'ils appartiennent à la sous-classe des IgG1. 37. Antibody according to any one of claims 31 to 36, characterized in this that they belong to the subclass of IgG1.
en ce qu'ils possèdent une activité fonctionnelle diminuée par rapport au même anticorps non modifié. 38. Antibody according to any one of claims 31 to 37, characterized in this that they have a diminished functional activity compared to the same antibody not modified.
comme étant particulièrement dangereux dans les cas de bioterrorisme (classification des Centers for Disease Control, CDC), notamment l'anthrax (Bacillus anthracis), le botulisme (Clostridium botulium), la peste (Yersinia pestis), la variole (Variola major), la tularémie (Francisella tularensis), les fièvres hémorragiques virales (liées aux filovirus -Ebola, Marburg et aux arenavirus -Lassa, Machupo), la toxine epsilon de Clostridium perfringens, la brucellose (Brucella species), la melioidose (Burkholderia mallei), la toxine de ricin (Ricinus communis).. 39. Use of antibodies 31 to 38 for the preparation of a medicament intended for prevention of transplant rejection or treatment of a selected pathology the tetanus, diphtheria, or caused by a pathogen or derived toxin, listing as particularly dangerous in cases of bioterrorism (classification Centers for Disease Control (CDC), including anthrax (Bacillus anthracis), the botulism (Clostridium botulium), plague (Yersinia pestis), smallpox (Variola major), tularemia (Francisella tularensis), viral haemorrhagic fevers (related to filovirus -Ebola, Marburg and arenavirus -Lassa, Machupo), the toxin epsilon of Clostridium perfringens, brucellosis (Brucella species), melioidosis (Burkholderia mallei), castor toxin (Ricinus communis) ..
38 pour la préparation d'un médicament en remplacement des IgG4. 40. Use of the antibody according to any one of claims 31 to 38 for the preparation of a drug to replace IgG4.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0312228A FR2861079B1 (en) | 2003-10-20 | 2003-10-20 | USE OF DIVALENT METAL CATIONS FOR ENHANCING THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF ANTIBODIES. |
| FR0312228 | 2003-10-20 | ||
| PCT/FR2004/002687 WO2005040216A2 (en) | 2003-10-20 | 2004-10-20 | Use of metallic cations to improve functional activity of antibodies |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2542928A1 true CA2542928A1 (en) | 2005-05-06 |
Family
ID=34385293
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002542928A Abandoned CA2542928A1 (en) | 2003-10-20 | 2004-10-20 | Use of metallic cations to improve functional activity of antibodies |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1689785A2 (en) |
| JP (1) | JP2007537990A (en) |
| AU (1) | AU2004283925A1 (en) |
| BR (1) | BRPI0415620A (en) |
| CA (1) | CA2542928A1 (en) |
| FR (1) | FR2861079B1 (en) |
| IL (1) | IL175026A0 (en) |
| WO (1) | WO2005040216A2 (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2894982A1 (en) * | 2005-12-16 | 2007-06-22 | Lab Francais Du Fractionnement | Preparation of antibodies selective for activating Fc receptors, useful for treatment of tumors and viral or bacterial infections, by replacing specific histidine residues in the Fc region of a monoclonal antibody |
| FR2942799B1 (en) | 2009-03-06 | 2011-02-25 | Lfb Biotechnologies | ANTI-RHESUS MONOCLONAL ANTIBODY |
| EP2787006B1 (en) * | 2013-04-02 | 2018-02-28 | Miltenyi Biotec GmbH | Anti-CD8 antibody which binding is Ca2+ dependent |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0597842A1 (en) * | 1990-05-08 | 1994-05-25 | The Scripps Research Institute | Metal binding proteins |
| US5898067A (en) * | 1997-02-07 | 1999-04-27 | Novo Nordisk A/S | Crystallization of proteins |
| FR2807767B1 (en) * | 2000-04-12 | 2005-01-14 | Lab Francais Du Fractionnement | MONOCLONAL ANTIBODIES ANTI-D |
| FR2894982A1 (en) * | 2005-12-16 | 2007-06-22 | Lab Francais Du Fractionnement | Preparation of antibodies selective for activating Fc receptors, useful for treatment of tumors and viral or bacterial infections, by replacing specific histidine residues in the Fc region of a monoclonal antibody |
-
2003
- 2003-10-20 FR FR0312228A patent/FR2861079B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-10-20 AU AU2004283925A patent/AU2004283925A1/en not_active Abandoned
- 2004-10-20 BR BRPI0415620-0A patent/BRPI0415620A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-10-20 JP JP2006536121A patent/JP2007537990A/en active Pending
- 2004-10-20 EP EP04805251A patent/EP1689785A2/en not_active Withdrawn
- 2004-10-20 CA CA002542928A patent/CA2542928A1/en not_active Abandoned
- 2004-10-20 WO PCT/FR2004/002687 patent/WO2005040216A2/en active Search and Examination
-
2006
- 2006-04-20 IL IL175026A patent/IL175026A0/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1689785A2 (en) | 2006-08-16 |
| FR2861079B1 (en) | 2007-09-28 |
| FR2861079A1 (en) | 2005-04-22 |
| JP2007537990A (en) | 2007-12-27 |
| WO2005040216A3 (en) | 2005-10-20 |
| WO2005040216A2 (en) | 2005-05-06 |
| AU2004283925A1 (en) | 2005-05-06 |
| IL175026A0 (en) | 2006-08-20 |
| BRPI0415620A (en) | 2006-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111410691B (en) | Bispecific antibodies that bind to CD38 and CD3 | |
| US10519242B2 (en) | Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins | |
| TWI564304B (en) | Anti-cd38 antibodies | |
| CN103703024B (en) | The CD3 binding molecules that can be combined with people and inhuman CD3 | |
| CN106432503B (en) | Covalent diabodies and uses thereof | |
| CN110167964A (en) | Combine the bispecific antibody and immune drug for BCMA and CD3 for treating Huppert's disease | |
| JP7148504B2 (en) | Treatment of IgG4-related diseases with anti-CD19 antibodies cross-linked to CD32B | |
| JP7439046B2 (en) | Heavy chain antibody that binds to CD19 | |
| US20190048089A1 (en) | Antagonistic Antibodies Specifically Binding Human CD40 and Methods of Use | |
| CN117024593A (en) | anti-SIRP alpha antibodies | |
| KR20190117489A (en) | Anti-BCMA heavy chain-only antibody | |
| US20090029393A1 (en) | Method for preparing antibodies selective for activating fc receptors | |
| CN107406512A (en) | With reference to CD3 and CD38 heterodimeric antibodies | |
| CN109513003A (en) | T- cell for treating disease redirects bispecific antibody | |
| CN107252485A (en) | For inducing the combination treatment to the immune response of disease | |
| JP2020517699A (en) | Antibody production method that minimizes disulfide bond reduction | |
| JP7049988B2 (en) | Anti-CD154 antibody and method of using it | |
| CA2533918A1 (en) | Use of adcc-optimized antibodies for treating weak patients | |
| EP3922647A1 (en) | Anti-pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof | |
| KR20190121861A (en) | Antibodies to bradykinin b1 receptor ligands | |
| KR20200012920A (en) | Anti-CD40 Antibody, Antigen Binding Fragment thereof and Medical Use thereof | |
| JP2024073580A (en) | BTLA antibody | |
| TW202019473A (en) | Anti-steap1 antigen-binding protein | |
| CN109689870A (en) | For treating the antibody of autoimmune disease | |
| CA2542928A1 (en) | Use of metallic cations to improve functional activity of antibodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EEER | Examination request | ||
| FZDE | Discontinued | ||
| FZDE | Discontinued |
Effective date: 20121022 |