CA2518981A1

CA2518981A1 - Composition de fixation tissulaire

Info

Publication number: CA2518981A1
Application number: CA002518981A
Authority: CA
Inventors: Philippe Rochaix
Original assignee: Institut Claudius Regaud; Philippe Rochaix
Current assignee: INSTITUT CLAUDIUS REGAUD
Priority date: 2003-03-12
Filing date: 2004-03-12
Publication date: 2004-09-30
Also published as: FR2852392A1; EP1601950A2; WO2004083369A2; AU2004221625A1; US20070072167A1; AU2004221625B2; WO2004083369A3; FR2852392B1; NZ542908A

Abstract

Composition de fixation tissulaire caractérisée en ce qu'elle comprend : - d u tréhalose à une concentration comprise entre 40 g/l et 80 g/l, de préférence d'environ 60 g/l, - de l'éthanol en une quantité comprise entre 40 % et 80 % (v/v), de préférence environ 70 % (v/v), - de l'acide acétique en une quanti té comprise entre 0 % et 5 % (v/v), de préférence environ 1 % (v/v), et - de l'eau en une quantité comprise entre 20 % et 60 % (v/v), de préférence envir on 29 % (v/v).

Description

COMPOSITION DE FIXATION TISSULAIRE
La présente invention concerne le domaine de la préservation d'écha_ntillons tissulaires dans des conditions optimales, de façon à pouvoir ultérieurement procéder à des analyses en biologie moléculaire notamment à partir des tissus ainsi préservés àvdes fins de diagnostic ou de thérapie.
La présente invention a pour objet une composition de fixation tissulaire permettant la préservation, au sein du tissu ainsi fixé, des protéines et acides nucléiques de façon à permettre leur analyse in situ ou leur extraction ultérieure du tissu en question à des fms d' analyse.
En matière de pathologie tumorale, l'analyse quantitative et qualitative de l'expression génique dans des échantillons tissulaires peut fournir des informations importantes relatives aux mécanismes physiopathologiques tels que la réponse inflammatoire, la croissance ou la différenciation cellulaire. Les progrès dans la connaissance de tels phénomènes sont à l'origine d'avancées tant en matière de diagnostic que de traitement. Si la congélation des prélèvements tissulaires (à une température inférieure ou égale à - ~0°C) reste la technique de référence pour l'analyse en biologie moléculaire, son caractère contraignant est reconnu par tous.
En effet, cette technique nécessite non seulement des installations appropriées pour procéder au stockage des tissus congelés, mais également impose des conditions drastiques de transport desdits tissus afin de ne pas rompre la chaîne du froid.
En effet, si pour le diagnostic anatomo-pathologique courant, la fixation et l'inclusion en paraffine des échantillons tissulaires sont largement utilisées car de maniement aisé, notamment pour la conservation des prélèvements, il est à
souligner que dans un contexte diagnostique, la congélation demeure cependant indispensable pour certaines analyses, telles que l'histoenzymologie musculaire ou la recherche de transcrits de fusion. Certains anticorps monoclonaux utilisés en immunohistochimie à des fins diagnostiques ne sont également utilisables que sur coupes tissulaires congelées.

2 Dans cet objectif, la mise au point de nouvelles techniques de fixation et traitement des échantillons tissulaires permettant non seulement une préservation intégrale des protéines, mais aussi de la principale cible pour l'analyse en biologie moléculaire des échantillons tissulaires -à savoir les acides nucléiques (ADN
ou A1N)- pourrait remédier aux inconvénients de l'art antérieur.
L'avènement d'une nouvelle technique de fixation préservant les protéines et acides nucléiques de tissus inclus en paraffine offrirait donc de multiples applications, telles que par exemple l'analyse de populations cellulaires définies par microdissection (Fend 1999).
Dans l'état actuel de la technique, trois familles de produits sont utilisées pour la fixation des tissus biologiques - les aldéhydes (formol, paraformaldehyde, glutaraldehyde...) qui forment avec les molécules biologiques des liaisons covalentes les stabilisant et inhibant les activités enzymatiques, - les alcools (éthanol, méthanol) qui déshydratent les tissus, et - les acides, en particulier l'acide acétique, qui diminuent les phénomènes de rétraction dus aux alcools et qui précipitent les protéines.
De nombreux mélanges f:~ateurs sont utilisables : formol seul, AFA (alcool + formol + acide acétique), liquide de Bouin (formol + acide picrique + acide acétique) liquide de Duboscq-Brazil (alcool + formol + acide picrique), etc...
Comme indiqué précédemment, il est important de pouvoir conserver, avec ou sans stockage, des prélèvements de tissus, notamment animaux et en particulier humain, de façon à préserver, dans un état aussi proche que possible de leur état naturel, les éléments desdits tissus dont l'analyse sera réalisée ultérieurement.
De telles analyses seront réalisées sur des protéines et/ou des acides nucléiques extraits des tissus fixés et conservés à des ims diagnostiques ou thérapeutiques, voire à des fins d'études de certains tissus tels que les tumeurs. Ces analyses nécessitent donc qu'il soit procédé à l'extraction des éléments à
analyser selon des rendements convenables et en l'absence de contaminant.

3 La problématique est toutefois quelque peu différente selon que l'on cherche à extraire à partir des tissus fixés et conservés et à des fins d'analyse, des acides nucléiques ou des protéines.
Trois conditions essentielles sont requises pour l'analyse de l'ARN sur tissus fixés et inclus en paraffine : 1) un bon rendement de l'extraction de l'ARN, 2) une bonne qualité de l'ARN extrait, et 3) l'absence de contamination par l'ADN
génomique (Shibutani 2000). A ce jour, l'extraction et l'analyse de l'ARN
total à
partir de tissus fixés au formol et inclus en paraffine ont été
essentiellement appliquées pour la détection des ARN viraux, dans le cadre de l'hépatite C par lo exemple (bries 1999 ; Ciuerrero 1997).
Cependant, une dégradation de l'ARN et une extraction insuffisante gênent considérablement l'analyse, quantitative notamment, des échantillons tissulaires fixés au formol et inclus en paraffine (Rupp 1988 ; Stanta 1991 ; Finke 1993).
De plus, la contamination par de l'ADN génomique est un problème fréquemment IS rencontré (Foss 1994), l'utilisation secondaire de traitements par la DNase après une extraction en phénol/chloroforme et une précipitation à l'éthanol des échantillons d'ARN extraits peut réduire considérablement la quantité d'ARN final.
D'une manière générale, plusieurs études de faisabilité de RT-PCR ont montré que les fixateurs non pontants tels que l'acétone ou le Methacarn (méthanol, 20 chloroforme, acide acétique) sont supérieurs en terme d'efficacité
d'amplification des produits par rapport aux fixateurs formaldéhydiques (Koopmans 1993 ;
Tyrrell 1995). La fixation à l'acétone (Sato 1991 ; Sato 1992) donne d'excellents rendements d'extraction de l'ARN, mais, autre le caractère contraignant de cette technique (fixation à - 80°C), le niveau de contamination par l'ADN
génomique 25 peut être élevé (Shibutani 2000).
C'est dans ce contexte que sont apparus de nouveaux fixateurs basés sur la précipitation protéique tels que le methacarn (Puchtler 1970 ; Mitchell 1985 ;
Shibutani 2000) qui préser~rent l'ARN et les protéines intacts, mais qui ne sont pas dénués d'une certaine toxicité limitant leur usage courant. En ce qui concerne

4 l'inclusion en paraffine, l'un des principaux écueils rencontrés est l'obtention d'ARN de grande taille. Par ailleurs, la contamination des extraits par l'~,DN
génomique est da'7antage rapportée pour les tissus fia~és et inclus en paraffine que pour les tissus congelés (Rupp 1988 ;lien-Erra 1991 ;Son ~ei~sâcker 1991 ;
Foss 1994). Oependant, il semblerait que cet inconvênient soit évité avec les nouveaux fixateurs (methacarn par exemple) (Shibutani 2000).
A l'opposé de l'analyse des acides nucléiques, trés peu d'études ont porté
sur la possibilité d'extraire les protéines à partir de tissus fixés et inclus en paraffine (Hara 1993 ; Ikeda 1998). Cette méconnaissance s'explique vraisemblablement par le fait que les fixateurs formaldéhydiques, qui sont les plus largement utilisés, créent des liaisons inter protéiques. Là encore, les fixateurs non pontants (acétone, éthanol, methacarn) ouvrent de nouvelles perspectives (Rognum 1980 ; Orstavik 1981 ;
Mitchell 1985 ; Conti 1988). Les fixateurs de type acétone n'affectent pas la qualité
des protéines, mais les contraintes méthodologiques sont importantes sans offrir d'avantage majeur par rapport à la traditionnelle congélation.
Le methacarn a montré son efficacité (Shibutani 2000), mais le principal désavantage de ce nouveau fixateur est l'importante toxicité de ses constituants. Par ailleurs, les étapes d'inclusion en paraffine et de déparaffinage ne semblent pas influer de façon majeure la qualité de l'extraction protéique lorsque les tissus ont été
fixés à l'aide de fixateurs non pontants (Shibutani 2000).
La présente invention se propose de remédier aux inconvénients de l'art antérieur en proposant notamment une nouvelle composition de fixation tissulaire basée sur des composés chimiques non toxiques préservant les structures cellulaires et tissulaires. De plus, la composition de fixation tissulaire de l'invention présente un maniement aisé car elle permet la conservation des échantillons tissulaires en bloc de paraffine ou sous forme déshydratée notamment.
La particularité de la composition de fixation tissulaire de l'invention repose sur le fait qu'elle comprend du tréhalose associé à d'auires composés.
Plus particulièrement, cette composition comprend - du tréhalose à une concentration comprise entre 40 et 80 g/1, de préférence entre 40 et 70 g/1 et plus préférentiellement encore environ 60 g/l, - de l'éthanol en une quantité comprise entre 4~0 °/~ et 80 °/~
(v/v), de préférence entre 55 °/~ et 75 °/~ (v/v) et plus préférentiellement encore

5 environ 70 % (v/v), - de l'acide acétique en une quantité comprise entre 0 °/~ et 5 °/~ (v/v), de préférence entre 095 °/~ et 3 % (v/v) et plus préférentiellement encore environ 1 °/~ (v/v), et - de l'eau en une quantité comprise entre 20 % et 60 °/~ (v/v), de préférence entre 25 % et 50 %(v/v) et plus préférentiellement encore environ 29 (vlv).
Les Inventeurs ont par ailleurs mis en évidence que la préparation de la susdite composition de fixation tissulaire pouvait être réalisée de façon optimale en deux étapes. Il s'agit tout d'abord de préparer un mélange avec seulement 45 d'éthanol (stable à 0°C) et d'ajouter de l'éthanol pur (stable également à 0°C) au moment de la préparation de la composition finale en quantité suffisante pour obtenir la composition de fixation tissulaire de l'invention telle que ci-dessus précisée. Ceci permet notamment de stabiliser les produits de préparation de ladite composition et de les stocker en milieu froid afin donc de les utiliser déjà
refroidis dès le début de la fixation.
A titre d'exemple, afin de préparer un litre de la composition de fixation tissulaire de l'invention, il est possible de préparer dans une première étape, un mélange comprenant 60 g de tréhalose, 10 ml d'acide acétique, 300 ml d'eau et 250 ml d'éthanol, étant entendu qu'il sera ensuite nécessaire d'y ajouter 450 ml d' éthanol pur.
Dans une seconde étape, le susdit mélange et l'éthanol pur doivent être mélangés juste avant l'utilisation de la composition finale, à raison de 5,5 parties du mélange et 4,5 parties d'éthanol. Ainsi, la composition de fixation tissulaire finale

6 comprend : 60 g de tréhalose, 10 ml d'acide acétique, 300 ml d'eau et 700 ml (250 +
450) d'éthanol, ce qui correspond bien à la composition ci-dessus indiquée.
homme démontré ci-aprés au moyen des analyses comparatives réalisées dans le cadre de diverses expérimentations mettant en oeuvre d'une part la composition de fixation de l'invention et d'autre part le fixateur usuel qu'est l'AFA, il est clair que les résultats obtenus présentent de bien meilleurs résultats lorsque ceux-ci sont réalisés sur des tissus ayant au préalable été fixés par la composition de fixation de l'invention. Ceci apparaît notamment au niveau du tableau 1 rapportant une sensibilité accrue de la détection des sites antigéniques à partir des tissus fixés par la composition de fixation de l'invention mais également au niveau des rendements d'extraction obtenus à partir de tels tissus.
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, la susdite composition de fixation tissulaire comprend de plus du glycérol en une quantité
comprise entre 0 % et 10 % (v/v), de préférence entre 3 % et 8 % (v/v) et plus IS préférentiellement encore environ 6 %.
A titre d'exemple, la composition de l'invention peut comprendre dans ce cas 40 g/1 de tréhalose, 70 % d'éthanol (v/v), 6 % de glycérol (v/v) 1 %
d'acide acétique (v/v) et 23 % d'eau (v/v).
Le glycérol n'est en fait ajouté à la composition de fixation tissulaire de l'invention que dans les cas où une concentration alcoolique plus important est nécessaire, en particulier dans le but de conserver des acides nucléiques de très bonne qualité.
La composition de fixation tissulaire de l'invention comprenant du glycérol permet notamment, par l'action osmotique du glycérol, de réduire la quantité
de tréhalose utilisée et d'éviter sa précipitation dans un milieu de concentration alcoolique plus élevé.
La présente invention a également pour obj et un procédé de fixation tissulaire consistant à immerger les échantillons tissulaires frais dans la composition de fixation tissulaire de l'invention, à une température comprise entre 0 et 6°C, de

7 préférence entre 0° et 4°C et plus préférentiellement encore à
une température d'environ 1 °C et ce, pendant au moins 12 heures, de préférence au moins 1 ~ heures et plus préférentiellement encore pendant environ 20 heures, en fonction de l'épaisseur du tissu.
s Par ee échantillon tissulaire frais a>, on entend tout échantillon tissulaire résultant notamment d'un prélèvement animal, y compris l'humain, réalisé dans des conditions standards bien connues de l'homme du métier, étant entendu que la fixation doit survenir le plus rapidement possible après dévascularisation tissulaire afin de préserver au mieux la qualité des acides nucléiques et en particulier de l'ARN.
En fait, non seulement les inventeurs ont démontré que l'utilisation de la composition de fixation tissulaire de l'invention permettait de procéder à une analyse plus fine et donnant lieu à de meilleurs résultats et/ou rendements que ceux obtenus par l'utilisation d'un fixateur de l'art antérieur, mais ils ont encore amélioré
is le procédé de traitement d'un échantillon tissulaire, dans le but d'améliorer encore la qualité des analyses biologiques ultérieures.
Ainsi, les Inventeurs ont mis en évidence qu'un échantillon tissulaire fixé à
des fins d'analyses ultérieures peut être préparé dans le cadre de la présente invention selon un procédé de traitement comprenant les étapes de a) fixation de l'échantillon au moyen de la composition de fixation tissulaire de l'invention, b) déshydratation de l'échantillon obtenu en a), c) conservation de l'échantillon obtenu en b), i) à l'état déshydraté, ü) au sein d'une résine, ou iii) par inclusion en paraffine.
Ire façon tout à fait surprenante, les Inventeurs ont mis en évidence que la conservation dudit échantillon sous forme déshydratée après sa fixation au moyen de la composition de l'invention permettait non seulement de procéder à des analyses in

8 situ de qualité au moins équivalente à celle des autres techniques connues mais permettait également de procéder à des extractions d'acides nucléiques de bien meilleure qualité et de façon plus aisée que par la mise en ouvre desdites techniques de l'art antérieur. G'est en fait la combinaison de la mise en ouvre de la composition â de fixation tissulaire de l'invention et de la conservation de l'échantillon ainsi fixé à
l'état déshydraté qui a permis d'obtenir de tels résultats.
En effet, la déshydratation et le maintien dans cet état d'un échantillon tissulaire fixé au préalable par la composition de fixation de l'invention comprenant notamment du tr~halose permet de préserver non seulement la morphologie l0 cellulaire et tissulaire de l'échantillon mais également les fonctions cellulaires telles que les fonctions enzymatiques. Les Inventeurs ont d'ailleurs mis en évidence, comme indiqué ci-après, que des ARN extraits d'échantillons tissulaires fixés par la composition de l'invention et conservés déshydratés présentent une meilleure qualité
que lorsque lesdits échantillons, même fixés avec la composition de fixation IS tissulaire de l'invention, ont été inclus dans la paraffine.
Par ailleurs, les Inventeurs ont également mis en évidence que les procédés dits « classiques » d'inclusion d'échantillons en paraffine pouvaient également être améliorés dans le cadre de la présente invention. Ainsi, un échantillon tissulaire peut être préparé conformément à un procédé de traitement comprenant les étapes de 20 a) fixation de l'échantillon au moyen de la composition de fixation tissulaire de l'invention, b) déshydratation de l'échantillon obtenu en a), c) imbibition de paraffine de l'échantillon obtenu en b), d) inclusion dans la paraffine de l'échantillon obtenu en c), 25 e) obtention de « coupes » à partir du bloc d'inclusion obtenu en d) (par découpage du bloc d'inclusion en « tranches » extrêmement fines, de quelques microns d'épaisseur), étalement d'une coupe obtenue en e) sur une lame de verre et collage de cette coupe,

9 PCT/FR2004/000608 g) déparaffinage de la coupe ainsi collée, h) coloration de ladite coupe.
Les analyses biologiques sont ensuite réalisées à partir de cette coupe tant du point de vue de la visualisation de certains éléments constitutifs du tissu ainsi â préparé que de l'extraction des acides nucléiques ou des protéines.
A l'issue de l'étape f) ci-dessus, c'est-à-dire après étalement et collage d'une coupe obtenue après découpage du bloc d'inclusion de paraffine, la lame est dite « lame blanche » car non colorée.
Classiquement, le déparaffinage de la coupe est réalisé à l'aide de bains successifs de xylène. L'échantillon tissulaire est ensuite réhydraté
progressivement à
l'aide de bains successifs d'alcool à 100°C, ~0°C puis 50°C, et enfin dans l'eau.
Après cette étape de réhydratation, l'échantillon tissulaire est coloré.
Les inventeurs ont déterminé de façon surprenante qu'il était possible d'obtenir de meilleurs résultats encore au niveau de la préservation de la IS morphologie de l'échantillon tissulaire si la lame blanche, avant l'étape de déparaffinage, était plongée dans un bain comprenant 75 % (v/v) d'alcool, 2 %
(v/v) de formol, 5 % (v/v) d'acide acétique, 1 % (v/v) de Tween 20~ et 17 % (v/v) d'eau, et ce, pendant environ 5 minutes à température ambiante.
En effet, un tel traitement additionnel permet de préserver une bonne morphologie cellulaire, particulièrement utile dans certains cas comme l'analyse des sous populations lymphoïdes par exemple.
La présente invention concerne tout type d'échantillon tissulaire à fixer et/ou à traiter, en particulier des échantillons tissulaires animaux, y compris humains, pathologiques ou non. L'invention s'applique par exemple à la fixation et/ou le traitement de tissus tumoraux, notamment dans le cadre de la constitution d'une tumorothèque.
Les résultats d'expérimentations ci-après permettront de mieux comprendre l'invention. Ils ne sont cependant mentionnés qu'à titre purement illusiratif.

EXEMPLE 1 : Echantillons inclus dans la paraffine ~. ~I'raitearaent des t-is~u~
a) ~ongélat-ion:
Les échantillons tissulaires frais sont mis dans des cryotubes et plongés 5 directement dans de fayote liquide (-196°C) puis sont conservés dans un congélateur à -80°C.
b) Fixation et inche~ion Les échantillons tissulaires frais sont immergés dans la composition de fixation tissulaire de l'invention à environ + 1 °C pendant au moins 12 heures. Ils

10 sont ensuite déshydratés dans 3 ou 4 bains successifs d'alcool absolu d'une heure chacun à une température entre 0 et 4°C puis dans un bain d'acétone d'environ 1 h à
environ 4°C dans 2 bains d'acétone d'environ 1 h chacun à température ambiante.
Les échantillons déshydratés sont incubés dans de la paraffine liquide à
58°C pendant 10 à 15 heures, de préférence 12 heures et inclus en cassette IS (technique anatomo-pathologique standard).
c) Déparaffinage Les échantillons sont coupés en ruban au microtome puis sont déparaffinés par 2 bains successifs de xylène et 2 bains d'éthanol absolu.
2. Analyse des protéines a) Extraction et dosage Première méthode d' extraction L'extraction utilise un tampon de lyse (Tris HCl 100mM pH 7,4, SDS
2 %, protease inhibitorTM Sigma) à 95°C pendant 5 minutes puis une sonification.
Seconde méthode d'extraction L'extraction utilise un tampon de lyse (Tris HCl SOmM pH 7,5, NaCI 150 mM, Nonidet P40 1 %, protease inhibitorTM Sigma) à 4°C et un broyage.
Le dosage protéique ne pouvant être réalisé selon la technique de Bradford en raison du fort taux de SDS, une procédure de dosage basée sur l'acide bicinchoninique et le sulfate de cuivre a été utilisée.

11 b) Analyse:
Les échantillons protéiques sont résolus sur un gel de polyacrylamide à 10 °/~ et transférés sur membrane PVDF°.
Si seul le profil protéique global est recherché, la membrane est colorée par incubation d'une heure dans une solution d'AIè~I~2(?)3LACI~T~ (0,1 °/~
AIe~IID~I~LACI~T~ Sigma, 45 % éthanol, 10 % acide acétique).
Si une immuno-détection est souhaitée, la membrane est incubée avec un anticorps primaire, puis un anticorps secondaire, puis est révélée par chimiluminescence (ECL+T~ Pierce) selon les recommandations du fabriquant.
3. Extraction de l'ADN
Il s'agit d'une extraction phénol/chloroforme classique après déparaffinage ou coupe des prélèvements congelés.
4. Extraction de l'ARN
Jl s'agit d'une extraction TrizolTM classique aprës déparaffinage ou coupe IS des prélèvements congelés.
RÉSULTATS
1. Morphologie Des coupes tissulaires de 5 ~,m d'épaisseur ont été réalisées, étalées sur lames, déparaffmées puis colorées à l'hémalun-éosine pour une étude morphologique. Les inventeurs ont obtenu une morphologie histologique et cytologique de très bonne qualité, tant au niveau des constituants épithéliaux que conjonctifs, comparable à celle observée en technique courante. Afin d'augmenter la reproductibilité de la qualité des colorations obtenues, une étape de post-fixation (facultative) peut étre réalisée : après étalement des coupes sur lames, les lames sont plongées avant déparaffinage 5 minutes dans de l'AFA additionné de 1 % de Tween 20, puis rincées à l'eau.

12 2. Etude immunohistochimicrue La qualité de préservation des sites antigéniques a été évaluée par étude immunohistochimique ~, l'aide d'une large batterie d'anticorps monoclonaux (Tableau 1). dette étude a été réalisée sur coupes en paraffine, étalées sur lames et déparaffinées, sans réactivation des sites antigéniques (pas de micro-ondes, ni de digestion enzymatique), même si celle-ci était recommandée par le fournisseur de l'anticorps. La révélation de l'activité peroxydase a été effectuée ë, l'aide du kit LS?~ (l~ako). Pour chaque anticorps, le marquage obtenu sur un même type tissulaire a été analysé de façon comparative entre le fixateur usuel (AF,A) et la l0 composition de fixation de l'invention (Tableau 1).
Tableau 1 : Etude immunohistochimique comparative.

Intensit marquageIntensit marquage Anticorps Dilution Composition Fixateur usuel Prtraitement de recommand fixation de (AFA) l'invention ACE # 1/6 Non -H-I- +

(Dako) Collagne 1/50 Protinase -I-I-+ +
IV # I~

(Dako) CKS/6 # Non -H--1- 0 (Dalro) CK19 # 11100Non +-1-1- +

(Dalco) Bcl2 1150 Micro-ondes-I-+-I- +

(Dako) Calcitonine1110 Non -H-+ +

(Dako) nombreuses cellulesrares cellules C C

'Tableau 1 (suite) TTF-1 1/50 Micro-ondes+I-+ 0 (lificrotn)

13 CD3 1/200 Micro-ondes -~-~-~- +

(Dako) CD15 ~ 1!50 Non -~-~-+ ++

(it~anau~otech) CD30 1/2 Micro-ondes +++ ++

(Dako) nombreuses cellules quelques cellules CI~20 * 1/100 Micro-ondes +++ '-m-(Dako) 100 /~ cellules 50 /~ cellules 1~-67 $ 1150 Micro-ondes h-t-r- 0 (DaJzo) .

PCNA $ Non ++ 0 (Dako) P53 $ 1/50 Micro-ondes ++ 0 (Dako) #ractivit tudie sur le sein, +++=marquage intense, ractivit tudie sur la thyrode,++=marquage modr, ractivit tudie sur un ganglion,+=marquage faible, * ractivit tudie sur le colon,0=absence de marquage.

$ ractivit tudie sur un sarcome, Ainsi, il apparaît que l'immunoréactivité observée avec la composition de fixation tissulaire de l'invention est supérieure à celle observée avec le fixateur usuel (AFA) pour l'ensemble des anticorps testés. Pour l'étude immunohistochimique, l'utilisation de la composition de l'invention permet de supprimer le pré-traitement, destiné à démasquer les sites antigéniques, même si celui-ci est recormnandé
par le laboratoire fournisseur. De plus, si l'on compare l'immunoréactivité obtenue avec la composition de l'invention sans pré-traitement, et celle obtenue avec le fixateur usuel en suivant les recommandations habituelles (micro-ondes), on observe encore un marquage plus intense avec l'utilisation de la composition de fixation de l'invention.

14 3. Analvse protéiaue Les rendements d'extraction diffèrent selon le type de tampon d'extraction et le fixateur utilisés.
~ableaea 2 : Extraction protéique d9un léioanyoa~m utérin huanain 'Tampon ee hTP40 >a Tampon « SDS >a Congélation 200 ,~g prot /mg de tissu 310 ,~g prot /mg de tissu Composition de fixation de 125 /~g prot /mg de tissu 207 ,ug prot /mg de tissu l'invention AFA 2,5 ,ug rot /mg de tissu 5,77 g rot /mg de tissu La composition de l'invention garde toujours des rendements inférieurs à
ceux de la congélation mais donne des meilleurs résultats que l'AFA.
Les profils protéiques obtenus à partir de tissus fixés par la composition de l'invention diffèrent aussi en fonction du tampon d'extraction utilisé : il manque de nombreuses bandes sur les gels faits à partir des extractions par tampon NP40 alors que ceux faits à partir d'extraction par tampon SDS sont relativement semblables à
ceux de la congélation (données non montrées).
IS Les protéines provenant de l'extraction par le tampon SDS ont été
reconnues, à la taille attendue, en immunotransfert par des anticorps spécifiques de protéines cytosoliques (actine et desmine), nucléaire (Récepteur des Estrogènes =RE) et mitochondriale (Bcl2). Alors que l'intensité du marquage est identique pour la congélation et la composition de l'invention, elle diminue pour les protéines de poids moléculaire élevé tel que RE pour l'AFA (données non montrées).

ADN
Des tests d'extraction d'ADN ont été effectués sur des échantillons tissulaires fixés selon la technique de l'invention, faxés dans l'AF'A ou congelés, quelques jours après la fixation des prélèvements puis répétés un an plus tard.
5 La quantitê d'ADN extrait des tissus fixés par la composition de l'invention était similaire à celle des tissus congelés, très supérieure à celle des tissus fixés en AF'A (Tableau 3).
Tableau ~ : Rendement d'extraction d'ADl~I sur plusieurs types de 10 tissus fixés par la composition de l'invention Tissu Rendement Ovaire 7,46 /~g ADN /mg de tissu Mélanome 18,41 ,ug ADN /mg de tissu Lymphome 6 ,ug ADN lmg de tissu Les ADN extraits au cours de ces manipulations étaient de très hauts poids moléculaires. Les Inventeurs ont pu amplifier par PCR une séquence de IS 2 800 pb du gène BRCA-1. La technique de fixation tissulaire de l'invention est donc compatible avec l'extraction et l'analyse de l'ADN à partir de tissus ainsi fixés et inclus en parafFne. La migration de l'ADN total sur gel d'agarose à
0,8 % confirme la grande taille des fragments d'ADN obtenus (données non montrées).
ARN
Des tests d'extraction d'ARN ont été effectués sur des échantillons tissulaires fixés selon la technique de l'invention, fixés dans l'AFA ou congelés, quelques jours après la fixation des prélèvements puis répétés un an plus tard.

La quantité d'AIRN extrait des tissus fixés par la composition de l'invention est similaire à celle des tissus congelés, très supérieure à celle des tissus fixés en AFA (Tableau 4.~.
Tablca~a ~~ : P'~cndcxncnt d'extraction d'A~1~'~T dc foic dc ~~uri~
Fixateur Rendement C~ngélation 1,3 ~ 0,4 ~Cg ARN /mg de tissu Composition de fixation de l,l ~ 0,2 ,ug ARN /mg de tissu l'invention AFA 0,017 ~ 0,010 ~,g ARN /mg de tissu Les bandes correspondant aux ARN ribosomaux 2,85 et 18S sont visibles, témoignant d'une bonne préservation des ARN. L'utilisation de la composition de fixation de l'invention a permis d'obtenir le même profil d'ÄRN que celui obtenu par congélation, avant inclusion en paraffine.
La qualité de l'ARN obtenue et l'absence d'ADN contaminant ont été
évaluées par amplification du gène Raf par RT-PCR.
lâ EXEMPLE 2 : Extraction comparative d'ARN
Des échantillons tissulaires ont été fixés au moyen de la composition de fixation tissulaire de l'invention puis déshydratés.
Ces échantillons ont été ensuite répartis en deux groupes équivalents, l'un des groupes a fait l'objet d'inclusion en paraffine, l'autre a fait l'objet d'une 2o conservation sous forme déshydratée dans un récipient hermétique comporiant un dessicateur.
Les ARN ont ensuite été extraits de ces différents échantillons, résolus sur gel d'agarose à 0,8 % et comparés à ceux extraits de prélèvements congelés.

Il s'avère que les ARN extraits des blocs de paraffine donnent lieu à une atténuation des bandes correspondant aux A1ZN ribosomaux et l'apparition d'un léger e< smear ~> évocateur d'une dégradation partielle et/ou d'une contamination par de l'ADN. Des résultats identiques sont obtenus après un an de conservation des prélèvements. ~r, les AFIN extraits des prélèverr~ents conservés sous forum déshydratée présentent une meilleure qualité en cè sens qu'ils apparaissent notamment plus nettement sur le gel (donnée non montrée).
Ainsi, il semble que l'inclusion des prélèvements en paraffine s'accompagne d'une dégradation partielle des A»T messagers et d'une possible contamination par de l'ADN génômique. Donc, lorsque l'étude des acides nucléiques est primordial, il apparaît préférable de conserver les prélèvements fixés sous forme déshydratée dans un milieu anhydre, sans les inclure en paraff'me.
EXEMPLE 3 : Mise en évidence de l'effet_protecteur spécifigue du tréhalose lors de la déshydratation des protéines, comparaison avec le saccharose Afin d'évaluer la protection fonctionnelle des protéines conférée par le tréhalose, l'activité d'un enzyme hépatique (TGO) a été mesurée et comparée dans 2o des extraits de protéines provenant de tissus fixés avec différentes compositions de fixation tissulaire.
La formule de la composition de fixation tissulaire de l'invention comporte du tréhalose, de l'éthanol, de l'acide acétique et de l'eau (appelée T6 A7 A01) et peut-être déclinée sous deux formes, l'une comportant du glycérol mais pas d'acide acétique (appelée T4 G6 A7) et l'autre dénuée d'acide acétique (appelée T6 A7).
Six compositions de fixation ont été préparées comme indiqué ci-après ~ trois compositions de fixation de l'invention comprenant du tréhalose 1. '~6 A7 A01 : tréhalose 60 g/1; acide acétique 1 °J~ (~lél) ; éthanol 70 % (é~/V) ; eau 29 % (éjléj), 2. T4 G6 A7 : tréhalose 40 g/1; glycérol 6 % (V/V) ; éthanol 70 (éTl'V) ; eau 24 % (éT/V), 3. 1~C~ A7 : tréhalose 60 g/l ; éthanol 70 % (5j/é~) ; eau 30 °/~
(5~/~).
~ trois autres compositions de fixation de méme formulation mais dont le tréhalose a été remplacé par un autre diose : le saccharose 4. SC~ A7 AOIL : saccharose 60 g/l ; acide acétique 1 °/~ (V/é7) ;
éthanol 70 °/~ (~V/~ ; eau 29 °/~ (é~/él), 5. S4 G6 A7 : saccharose 40 g/1; glycérol 6 °/~ (V/V) ; éthanol 70 %
(é1/V) ; eau 24 % (é,/ë~), 6. S6 A7 : saccharose 60 g/1; éthanol 70 % (V/V) ; eau 30 °/~ (V/V).
Un foie frais de souris nude a été disséqué en six fragments équivalents et chacun d'eux a été fixé dans l'une des susdites six compositions de fixation selon le protocole rapporté dans la description ci-dessus. Les prélèvements ont été
IS déshydratés et stockés à 4°C.
Ce protocole a été réalisé quatre fois, à des jours différents, à partir de foies de souris différentes.
Les protéines ont été extraites à l'aide d'un tampon d'extraction faiblement dénaturant (Tris HCl 50 mM pH 7.5, NaCI 150 mM, NonIdet P40 1 %, protease inhibitorTM Sigma) à 4°C et dosées selon la technique de Bradford.
La mesure de l'activité enzymatique des TGO a été réalisée par un automate Konelab 5Ø5. Les résultats ont été pondérés par la quantité de protéines et rapportés sous forme d'unité internationale/microgramme de protéine (UI/~g de protéines).
Ces résultats ont été comparés deux à deux (trois binômes) selon la présence de tréhalose ou de saccharose dans la composition de fixation tissulaire testée, toutes choses égales par ailleurs - T6 A7 X101 versus S6 A7 A01, - T4 C16 A7 versus S4 G6 A7, et - T6 A7 versus S6 A7.

Les résultats ont été comparés selon la méthode de Dunnett de comparaison de moyenne après analyse de variance.
Les résultats obtenus sont rapportés dans les tableaux ci-après et sont illustrés par les figures correspondantes.
Tableau 1 / Figure 1 I~~'~El'~~ DE~IATI~1'~T

FIfi~ATE h~T~1F~E CAS
(I/~g prot.) STAT~D

S6 A7 A01 3,25 1,50 4 T6 A7 A01 7,75 1,7078 4 Test d'égalité de variance : F = 1,3 avec (3,3) D.F. p = 0,836 (two-tail) Hypothèse : il existe une différence entre les deux groupes Variance égale : t = - 3,96 avec 6 D.F. p = 0,007 (two-tait) Tableau 2 / Figure 2 MOYENNE DEVIATION

FIXATEUR NOMBRE CAS

(~~g prot.) STANDARD

S4 G6 A7 61,50 17,0196 4 T4 G6 A7 145,25 25,7601 4 Test d'égalité de variance : F = 2,29 avec (3,3) D.F. p = 0,514 (two-tail) IS Hypothèse : il existe une différence entre les deux groupes Variance égale : t = - 5,43 avec 6 D.F. p = 0,002 (two-tait) Tableau 3 / Figure 3 ~I~II~TE ~~ATI~~i~

AT~~ 1'~~I~~~~

(t~TYU~g tarot.)~~CAI'~

S6 A7 ~ 1,50 5,4467 4~

T6 A7 115,25 5,1235 4 'Test d'égalité de variance : F = 1,13 avec (3,3) I~.F. p = 0,9~~ (iv~o-tait) Hypothése : il existe une différence entre les deux groupes 5 é~ariance égale : t = 9,03 avec 6 I~.F. p = 0~00~1 (iWO-tait) Conclusion Quelque soit la composition de fixation tissulaire testée, la présence de tréhalose permet d'obtenir de bien meilleurs résultats quant à la préservation de 10 l'activité enzymatique des TGO de foie de souris que ne le fait le saccharose.

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Claims

1. Composition de fixation tissulaire caractérisée en ce qu'elle comprend:

- du tréhalose à une concentration comprise entre 40 g/l et 80 g/l, de préférence d'environ 60 g/l, - de l'éthanol en une quantité comprise entre 40 % et 80 % (v/v), de préférence environ 70 % (v/v), - de l'acide acétique en une quantité comprise entre 0 % et 5 % (v/v), de préférence environ 1 % (v/v), et - de l'eau en une quantité comprise entre 20 % et 60 % (v/v), de préférence environ 29 % (v/v).

2. Composition de fixation tissulaire selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend de plus du glycérol en une quantité comprise entre 0 % et 10 %
(v/v), de préférence environ 6 % (v/v).

3. Procédé de fixation tissulaire consistant à immerger les échantillons tissulaires frais dans une composition de fixation tissulaire selon l'une des revendications 1 et 2, à une température comprise entre 0 et 6°C, et de préférence d'environ 1°C, pendant au moins 12 heures, de préférence environ 20 heures.

4. Procédé de traitement d'un échantillon tissulaire comprenant les étapes de:

a) fixation dudit échantillon au moyen de la composition de fixation tissulaire selon la revendication 1 ou 2, b) déshydratation de l'échantillon obtenu en a), c) conservation de l'échantillon obtenu en b), a) à l' état déshydraté, ii) au sein d'une résine, ou iii) par inclusion en paraffine.

5. Procédé de traitement d'un échantillon tissulaire selon la revendication 4, dans lequel la conservation de l'échantillon obtenu en b) est réalise par inclusion en paraffine comprenant les étapes suivantes:

- imbibition de paraffine de l'échantillon, - inclusion dans la paraffine de l'échantillon imbibé
- obtention de coupes à partir du bloc d'inclusion, - étalement d'une coupe sur une lame de verre et collage, - déparaffinage de la coupe ainsi fixée, - coloration de ladite coupe, caractérisé en ce que l'étape de déparaffinage de la coupe est précédée d'une étape de traitement de la coupe collée sur la lame de verre consistant à
plonger l'ensemble lame-coupe dans un bain comprenant 75 % (v/v) d'alcool, 2 % (v/v) de formol, 5 % (v/v) d'acide acétique, 1 % (v/v) de Tween 20® et 17 %
(v/v) d'eau.

6. Procédé de traitement d'un échantillon tissulaire selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'étape de fixation de l'échantillon est réalisée conformément au procédé de la revendication 3.

7. Composition ou procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé(e) en ce que le tissu est un tissu normal ou pathologique.