CA2466421A1 - Procede pour generer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un echantillon, le traitement de ladite empreinte et les systemes pour leur mise en oeuvre - Google Patents
Procede pour generer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un echantillon, le traitement de ladite empreinte et les systemes pour leur mise en oeuvre Download PDFInfo
- Publication number
- CA2466421A1 CA2466421A1 CA002466421A CA2466421A CA2466421A1 CA 2466421 A1 CA2466421 A1 CA 2466421A1 CA 002466421 A CA002466421 A CA 002466421A CA 2466421 A CA2466421 A CA 2466421A CA 2466421 A1 CA2466421 A1 CA 2466421A1
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- substrates
- sample
- catalytic
- substrate
- process according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
La présente invention a pour objet un procédé pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, caractérisé en ce qu'il compre nd les étapes suivantes, on met en contact l'échantillon susceptible de posséde r l'activité catalytique avec un ensemble de substrats; on capture de façon le s signaux générés après ladite mise en contact. Avantageusement, après la capture des signaux, on réalise un traitement de ceux-ci consistant à affect er à chaque signal une valeur numérique constituant une composante d'une représentation graphique, par exemple une représentation en couleurs, de l'empreinte idiosyncrasique
Description
PROCEDE POUR GENERER L'EMPREINTE CATALYTIQUE IDIOSYNCRASIQUE
D'UN ECHANITLLON, LE TRAITEMENT DE LADITE EMPREINTE ET LES SYSTEMES
POUR LEUR MISE EN OEUVRE
La présente invention concerne un procédé
permettant de générer l'empreïnte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon. L'invention concerne aussi les systèmés pour la mise, en ouvre d'un tel procédé
et leur utilisation.
Un échantillon peut présenter des caractéristiques catalytiques diverses. Elles s'expriment par exemple par les différentes classes enzymatiques.
On connaît dans l'art antérieur l'utilisation d'un même type de substrats permettant de révéler une enzyme donnée.
On peut citer ceux concernant la détermination du meilleur substrat d'une protéase spécifique (PNAS 97 (14), 7754-7759 et Nature Biotechnology 28, 187-193). Cette technique consiste à tester des banques de plusieurs milliers à plusieurs centaines de milliers de substrats uniquement de type peptide avec une protéase connue. Ceci est limité aux cas des protéases car les substrats protéiques sont synthétisés par chimie combinatoire.
On peut citer aussi la détection de microorganismes (brevet US 4,603,108 ; brevet EP 451 775 ;
J. Clin. Microbiol (1982), 16 (3), 417-21). Ces techniques sont basées sur la détection d'enzymes pour identifier des microorganismes dont on connaît déjà les caractéristiques.
La demande de brevet PCT publiée sous le No.
W001/60986 concerne des estérases possédant une activité
particulière. L'identification de ces estérases se fait par comparaison à des profils d'estérase de référence préalablement réalisés sur des substrats estérase. I1 s'agit de rechercher la meilleure enzyme pour un type de
D'UN ECHANITLLON, LE TRAITEMENT DE LADITE EMPREINTE ET LES SYSTEMES
POUR LEUR MISE EN OEUVRE
La présente invention concerne un procédé
permettant de générer l'empreïnte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon. L'invention concerne aussi les systèmés pour la mise, en ouvre d'un tel procédé
et leur utilisation.
Un échantillon peut présenter des caractéristiques catalytiques diverses. Elles s'expriment par exemple par les différentes classes enzymatiques.
On connaît dans l'art antérieur l'utilisation d'un même type de substrats permettant de révéler une enzyme donnée.
On peut citer ceux concernant la détermination du meilleur substrat d'une protéase spécifique (PNAS 97 (14), 7754-7759 et Nature Biotechnology 28, 187-193). Cette technique consiste à tester des banques de plusieurs milliers à plusieurs centaines de milliers de substrats uniquement de type peptide avec une protéase connue. Ceci est limité aux cas des protéases car les substrats protéiques sont synthétisés par chimie combinatoire.
On peut citer aussi la détection de microorganismes (brevet US 4,603,108 ; brevet EP 451 775 ;
J. Clin. Microbiol (1982), 16 (3), 417-21). Ces techniques sont basées sur la détection d'enzymes pour identifier des microorganismes dont on connaît déjà les caractéristiques.
La demande de brevet PCT publiée sous le No.
W001/60986 concerne des estérases possédant une activité
particulière. L'identification de ces estérases se fait par comparaison à des profils d'estérase de référence préalablement réalisés sur des substrats estérase. I1 s'agit de rechercher la meilleure enzyme pour un type de
2 substrat donné. Ces substrats correspondent uniquement à
des fonctions ester.
La présente invention a pour but de palier les inconvénients des techniques de l'art antérieur en offrant un procédé permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, c'est à dire sa carte d'identité spécifique.
L'invention a donc pour objet un procédé pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes .
a) on met en contact l'échantillon susceptible de posséder l'activité catalytique avec un ensemble de substrats, b) on capture les signaux générés après ladite mise en contact.
Le procédé de l'invention est remarquable en ce que cette empreinte peut être obtenue sans connaître les activités catalytiques de l'échantillon.
A l'étape (a), les substrats peuvent être ordonnés ou sous forme de mélange.
On entend par empreinte catalytique idiosyncrasique selon l'invention l'image ou la carte d'identité, individuelle des activités catalytiques. Cette empreinte est spécifique d'un échantillon. Elle est obtenue après la mise en contact dudit échantillon avec un ensemble de substrats. L'empreinte catalytique idiosyncrasique combine les mesures effectuées sur différents substrats. L'empreinte catalytique idiosyncrasique atteste de l'identité d'un échantillon sous la forme d'une représentation d'un échantillon ayant réagi avec un ensemble de substrats.
des fonctions ester.
La présente invention a pour but de palier les inconvénients des techniques de l'art antérieur en offrant un procédé permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, c'est à dire sa carte d'identité spécifique.
L'invention a donc pour objet un procédé pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes .
a) on met en contact l'échantillon susceptible de posséder l'activité catalytique avec un ensemble de substrats, b) on capture les signaux générés après ladite mise en contact.
Le procédé de l'invention est remarquable en ce que cette empreinte peut être obtenue sans connaître les activités catalytiques de l'échantillon.
A l'étape (a), les substrats peuvent être ordonnés ou sous forme de mélange.
On entend par empreinte catalytique idiosyncrasique selon l'invention l'image ou la carte d'identité, individuelle des activités catalytiques. Cette empreinte est spécifique d'un échantillon. Elle est obtenue après la mise en contact dudit échantillon avec un ensemble de substrats. L'empreinte catalytique idiosyncrasique combine les mesures effectuées sur différents substrats. L'empreinte catalytique idiosyncrasique atteste de l'identité d'un échantillon sous la forme d'une représentation d'un échantillon ayant réagi avec un ensemble de substrats.
3 On entend par idiosyncrasique la capacité
individuelle d'un échantillon à réagir avec un ensemble de substrats.
On entend par activité catalytique toute activité de l'échantillon susceptible de modifier un substrat. Cette activité peut correspondre par exemple à
celle d'une ou plusieurs protéines, molécules d'ADN, molécules d'ARN ou un mélange de celles-ci. Avantageusement cette activité correspond à celle d'une enzyme ou d'un mélange d'enzymes. Ces activités peuvent être aussi celles de produits recombinants obtenus par génie génétique.
Ces activités peuvent correspondre par exemple à des hydrolases, des oxydoréductases, des transférases, des lyases, des isomérases, des ligases.
L'activité catalytique définie au sens de l'invention peut correspondre à un mélange d'activités, elle peut être connue ou inconnue.
L'échantillon peut provenir de différentes origines. I1 peut être par exemple chimique, biologique, microbiologique, animal, végétal, humain. I1 peut provenir de tous types d'environnements et de prélèvements.
L'échantillon peut être simple ou complexe, préparé à partir de techniques classiques d'extraction puis éventuellement purifié ou utilisé tel quel.
Selon une première forme de mise en oeuvre, à
l'étape (a), la mise en contact est réalisée avec un ensemble de substrats ordonnés. Ainsi, dans ce mode de réalisation, la capture des signaux est faite de façon ordonnée conformément à l'ordonnancement de l'ensemble des substrats.
Selon une seconde forme de mise en oeuvre, à
l'étape (b), on capture les signaux de façon ordonnée.
Le procédé de l'invention comprend après la capture des signaux une étape de traitement de ceux-ci consistant à affecter à chaque signal une valeur numérique
individuelle d'un échantillon à réagir avec un ensemble de substrats.
On entend par activité catalytique toute activité de l'échantillon susceptible de modifier un substrat. Cette activité peut correspondre par exemple à
celle d'une ou plusieurs protéines, molécules d'ADN, molécules d'ARN ou un mélange de celles-ci. Avantageusement cette activité correspond à celle d'une enzyme ou d'un mélange d'enzymes. Ces activités peuvent être aussi celles de produits recombinants obtenus par génie génétique.
Ces activités peuvent correspondre par exemple à des hydrolases, des oxydoréductases, des transférases, des lyases, des isomérases, des ligases.
L'activité catalytique définie au sens de l'invention peut correspondre à un mélange d'activités, elle peut être connue ou inconnue.
L'échantillon peut provenir de différentes origines. I1 peut être par exemple chimique, biologique, microbiologique, animal, végétal, humain. I1 peut provenir de tous types d'environnements et de prélèvements.
L'échantillon peut être simple ou complexe, préparé à partir de techniques classiques d'extraction puis éventuellement purifié ou utilisé tel quel.
Selon une première forme de mise en oeuvre, à
l'étape (a), la mise en contact est réalisée avec un ensemble de substrats ordonnés. Ainsi, dans ce mode de réalisation, la capture des signaux est faite de façon ordonnée conformément à l'ordonnancement de l'ensemble des substrats.
Selon une seconde forme de mise en oeuvre, à
l'étape (b), on capture les signaux de façon ordonnée.
Le procédé de l'invention comprend après la capture des signaux une étape de traitement de ceux-ci consistant à affecter à chaque signal une valeur numérique
4 constituant une composante d'une représentation graphique, par exemple une représentation en couleurs, de l'empreinte idiosyncrasique.
Ce traitement peut être appliqué à chaque signal ou à une combinaison de signaux issus d'un même ensemble de substrats ou de plusieurs ensembles de substrats. Il s'agit alors d'affecter à chaque signal une valeur numérique, puis d'associer par groupe d'au moins deux valeurs, les valeurs numériques issues d'un même ensemble de substrats ou de plusieurs ensembles de substrats, et d'affecter à chaque groupe une valeur numérique constituant une composante d'une représentation graphique par exemple une représentation en couleurs, d'une empreinte idiosyncrasique.
Un tel traitement permet par exemple de combiner plusieurs empreintes de façon à génèrer une nouvelle empreinte, et d'obtenir une représentation graphique, tout particulièrement en couleurs facilitant la visualisation, et donc l'exploitation, des caractéristiques cumulées d'un échantillon. Ainsi, le traitement des empreintes peut inclure une représentation en couleur de la nouvelle empreinte du type basé sur le système RVB (Rouge, Vert, Bleu).
Les substrats après la mise en contact avec l'échantillon susceptible de posséder l'activité
catalytique peuvent soit restés intactes ou être transformés en un ou plusieurs produits. Les substrats et/ou produits obtenus après la mise en contact avec l'échantillon peuvent être ordonnés ou sous forme de mélange.
Selon le premier mode de mise en a~uvre ci-dessus, les substrats sont ordonnés sur un support, comme, par exemple sur une plaque de micro-titration ou un microsystème. Ce support, possédant l'ensemble des
Ce traitement peut être appliqué à chaque signal ou à une combinaison de signaux issus d'un même ensemble de substrats ou de plusieurs ensembles de substrats. Il s'agit alors d'affecter à chaque signal une valeur numérique, puis d'associer par groupe d'au moins deux valeurs, les valeurs numériques issues d'un même ensemble de substrats ou de plusieurs ensembles de substrats, et d'affecter à chaque groupe une valeur numérique constituant une composante d'une représentation graphique par exemple une représentation en couleurs, d'une empreinte idiosyncrasique.
Un tel traitement permet par exemple de combiner plusieurs empreintes de façon à génèrer une nouvelle empreinte, et d'obtenir une représentation graphique, tout particulièrement en couleurs facilitant la visualisation, et donc l'exploitation, des caractéristiques cumulées d'un échantillon. Ainsi, le traitement des empreintes peut inclure une représentation en couleur de la nouvelle empreinte du type basé sur le système RVB (Rouge, Vert, Bleu).
Les substrats après la mise en contact avec l'échantillon susceptible de posséder l'activité
catalytique peuvent soit restés intactes ou être transformés en un ou plusieurs produits. Les substrats et/ou produits obtenus après la mise en contact avec l'échantillon peuvent être ordonnés ou sous forme de mélange.
Selon le premier mode de mise en a~uvre ci-dessus, les substrats sont ordonnés sur un support, comme, par exemple sur une plaque de micro-titration ou un microsystème. Ce support, possédant l'ensemble des
5 PCT/FR02/03827 substrats, peut constituer un système mis en ouvre pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique selon le procédé de l'invention. Dans certains cas particuliers, on peut avoir les substrats disposés sur plusieurs supports.
5 Ainsi, l'invention se rapporte à un procédé
pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, comprenant les étapes suivantes .
a) on met en contact l'échantillon susceptible de posséder l'activité catalytique avec un ensemble de substrats ordonnés, b) on capture les signaux générés après ladite mise en contact.
Selon le second mode de mise en ouvre ci-dessus, les substrats sont mélangés et la capture des signaux est réalisée de façon ordonnée.
Les signaux peuvent être ordonnés en utilisant une technique séparative telle que L'HPLC (Chromatographie Liquide à Haute Pression), la CCM (Chromatographie sur Couche Mince) ou la SM (Spectrométrie de Masse).
Ainsi, l'invention se rapporte à un procédé
pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, comprenant les étapes suivantes .
a) on met en contact l'échantillon susceptible de posséder l'activité catalytique avec un ensemble de substrats sous forme de mélange, b) on capture de façon ordonnée les signaux générés après ladite mise en contact. Dans ce mode de réalisation, on capture de façon ordonnée les signaux générés après ladite mise en contact en utilisant une technique séparative telle que l'HPLC
Chaque substrat comporte au moins un groupe fonctionnel sensible à la présence d'une activité
5 Ainsi, l'invention se rapporte à un procédé
pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, comprenant les étapes suivantes .
a) on met en contact l'échantillon susceptible de posséder l'activité catalytique avec un ensemble de substrats ordonnés, b) on capture les signaux générés après ladite mise en contact.
Selon le second mode de mise en ouvre ci-dessus, les substrats sont mélangés et la capture des signaux est réalisée de façon ordonnée.
Les signaux peuvent être ordonnés en utilisant une technique séparative telle que L'HPLC (Chromatographie Liquide à Haute Pression), la CCM (Chromatographie sur Couche Mince) ou la SM (Spectrométrie de Masse).
Ainsi, l'invention se rapporte à un procédé
pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, comprenant les étapes suivantes .
a) on met en contact l'échantillon susceptible de posséder l'activité catalytique avec un ensemble de substrats sous forme de mélange, b) on capture de façon ordonnée les signaux générés après ladite mise en contact. Dans ce mode de réalisation, on capture de façon ordonnée les signaux générés après ladite mise en contact en utilisant une technique séparative telle que l'HPLC
Chaque substrat comporte au moins un groupe fonctionnel sensible à la présence d'une activité
6 catalytique d'un échantillon et permet la génération d'un signal de manière directe ou indirecte.
Un substrat mis en a~uvre dans le procédé de l'invention est toute molécule comportant au moins un groupe fonctionnel sensible à la présence d'une activité
catalytique et permettant la génération d'un signal.
Les groupes fonctionnels correspondent à titre d'exemples non limitatifs .
- groupe ester, adapté aux lipases, estérases, peptidases ;
- groupe carbonate, adapté aux lipases, estérases, peptidases ;
- groupe carbamate, adapté aux peptidases ;
groupe amide, adapté aux peptidases ;
- groupe lactam, adapté aux peptidases, lactamases ;
- groupe époxyde, adapté aux hydrolases, en particulier époxyde hydrolases ;
- groupe phosphate, adapté aux phosphatases, phytases ;
- groupe glycoside, adapté aux glycosidases ;
- groupes éther, alcène, alcane, adaptés aux monoxygenases, hydroxylases ;
- groupe alcool adapté aux alcools déshydrogénases ;
- groupe aldol adapté aux aldolases.
Outre, les groupes fonctionnels ci-dessus définissant des activités catalytiques, chaque substrat peut comprendre un groupement chimique susceptible de lui conférer une spécificité pour une activité définie par le groupe fonctionnel. Dans un mode de réalisation préféré, ces groupements chimiques sont constitués par des variations de substitution. La nature des variations sera préférentiellement d'ordre .
Un substrat mis en a~uvre dans le procédé de l'invention est toute molécule comportant au moins un groupe fonctionnel sensible à la présence d'une activité
catalytique et permettant la génération d'un signal.
Les groupes fonctionnels correspondent à titre d'exemples non limitatifs .
- groupe ester, adapté aux lipases, estérases, peptidases ;
- groupe carbonate, adapté aux lipases, estérases, peptidases ;
- groupe carbamate, adapté aux peptidases ;
groupe amide, adapté aux peptidases ;
- groupe lactam, adapté aux peptidases, lactamases ;
- groupe époxyde, adapté aux hydrolases, en particulier époxyde hydrolases ;
- groupe phosphate, adapté aux phosphatases, phytases ;
- groupe glycoside, adapté aux glycosidases ;
- groupes éther, alcène, alcane, adaptés aux monoxygenases, hydroxylases ;
- groupe alcool adapté aux alcools déshydrogénases ;
- groupe aldol adapté aux aldolases.
Outre, les groupes fonctionnels ci-dessus définissant des activités catalytiques, chaque substrat peut comprendre un groupement chimique susceptible de lui conférer une spécificité pour une activité définie par le groupe fonctionnel. Dans un mode de réalisation préféré, ces groupements chimiques sont constitués par des variations de substitution. La nature des variations sera préférentiellement d'ordre .
7 stérique, comme, par exemple, différents groupements alkyles ou aryles, ou - stéréochimique, ou encore - électronique, comme, par exemple, des groupes électrodonneurs ou électroattracteurs.
Ainsi, des variations d'ordre stéréochimique permettent d'utiliser séparément chaque énantiomère d'une paire d'énantiomères, plus généralement chacun des stéréoisomères d'un groupe de stéréoisomères.
Les substrats permettent en outre la génération d'un signal de manière directe ou indirecte. On entend par un signal direct tous signaux obtenus directement après mise en contact du substrat avec l'échantillon.
On entend par signaux indirects tous signaux obtenus après une ou plusieurs réactions notamment chimiques après mise en contact du substrat avec l'échantillon.
Les signaux émis sont fonction de la nature du substrat et/ou du système de détection choisi ainsi que des conditions de mesure. Ils peuvent être de différents types notamment spectrophotométrique (absorbance ou fluorescence de lumière à une longueur d'onde donnée), électriques ou chimiques. On utilise préférentiellement des substrats de type chromogénique ou fluorogénique. Mais on peut aussi enregistrer le déroulement de la réaction sur un substrat quelconque par des senseurs externes appropriés, tel qu'une sonde thermométrique, un indicateur de pM, un senseur de produit de type protéine (anticorps anti-produit) ou chemosenseur synthétique, ou mesure couplée à des enzymes secondaires. On peut citer comme exemple l'alcool déshydrogénase pour détecter la formation d'éthanol par formation de NAD+ ou par la détection directe du produit après séparation analytique (CE (Electrophorèse capillaire), HPLC, TLC).
Ainsi, des variations d'ordre stéréochimique permettent d'utiliser séparément chaque énantiomère d'une paire d'énantiomères, plus généralement chacun des stéréoisomères d'un groupe de stéréoisomères.
Les substrats permettent en outre la génération d'un signal de manière directe ou indirecte. On entend par un signal direct tous signaux obtenus directement après mise en contact du substrat avec l'échantillon.
On entend par signaux indirects tous signaux obtenus après une ou plusieurs réactions notamment chimiques après mise en contact du substrat avec l'échantillon.
Les signaux émis sont fonction de la nature du substrat et/ou du système de détection choisi ainsi que des conditions de mesure. Ils peuvent être de différents types notamment spectrophotométrique (absorbance ou fluorescence de lumière à une longueur d'onde donnée), électriques ou chimiques. On utilise préférentiellement des substrats de type chromogénique ou fluorogénique. Mais on peut aussi enregistrer le déroulement de la réaction sur un substrat quelconque par des senseurs externes appropriés, tel qu'une sonde thermométrique, un indicateur de pM, un senseur de produit de type protéine (anticorps anti-produit) ou chemosenseur synthétique, ou mesure couplée à des enzymes secondaires. On peut citer comme exemple l'alcool déshydrogénase pour détecter la formation d'éthanol par formation de NAD+ ou par la détection directe du produit après séparation analytique (CE (Electrophorèse capillaire), HPLC, TLC).
8 Les signaux sont mesurés par tous capteurs appropriés capables de mesurer les signaux générés comme par exemple un fluorimètre, un spectrophotomètre, un ampèremètre, un pHmètre, un thermomètre ou une sonde thermographique. L'empreinte catalytique idiosyncrasique générée est recueillie par un analyseur adapté à la reconnaissance des signaux.
Quel que soit le mode de mise en aeuvre de l'invention, les signaux générés après la mise en contact de l'étape (a), peuvent âtre capturés à l'étape (b) en utilisant une technique séparative comme l'HPLC.
Avantageusement, les substrats sont tels que les signaux générés sont du même type.
Ils peuvent être mesurés sur le même type de capteur.
L'empreinte catalytique idiosyncrasique correspondant aux signaux générés peut être interprétée de manière directe ou de manière indirecte après traitement des valeurs brutes. Ce traitement sera envisagé en fonction des signaux analysés.
Les substrats présentent avantageusement la caractéristique de réagir sur un temps de réaction court, par exemple inférieur à 2 heures, préférentiellement inférieur à 20 minutes. Cette caractéristique a l'avantage d'obtenir rapidement l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon. Elle permet aussi une étude de son évolution au cours du temps. Cela facilite notamment les analyses en contrôle qualité.
Les substrats mis en oeuvre dans le procédé de l'invention possèdent avantageusement chacun une réactivité
spécifique pour un type d'activité catalytique donné. Ils sont peu ou pas sensibles à la dégradatïon ou aux activités non-spécifiques. De plus, lorsque des substrats stables
Quel que soit le mode de mise en aeuvre de l'invention, les signaux générés après la mise en contact de l'étape (a), peuvent âtre capturés à l'étape (b) en utilisant une technique séparative comme l'HPLC.
Avantageusement, les substrats sont tels que les signaux générés sont du même type.
Ils peuvent être mesurés sur le même type de capteur.
L'empreinte catalytique idiosyncrasique correspondant aux signaux générés peut être interprétée de manière directe ou de manière indirecte après traitement des valeurs brutes. Ce traitement sera envisagé en fonction des signaux analysés.
Les substrats présentent avantageusement la caractéristique de réagir sur un temps de réaction court, par exemple inférieur à 2 heures, préférentiellement inférieur à 20 minutes. Cette caractéristique a l'avantage d'obtenir rapidement l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon. Elle permet aussi une étude de son évolution au cours du temps. Cela facilite notamment les analyses en contrôle qualité.
Les substrats mis en oeuvre dans le procédé de l'invention possèdent avantageusement chacun une réactivité
spécifique pour un type d'activité catalytique donné. Ils sont peu ou pas sensibles à la dégradatïon ou aux activités non-spécifiques. De plus, lorsque des substrats stables
9 sont utilisés, ils peuvent être conservés pendant de longues périodes.
Le procédé de l'invention permet de suivre un échantillon dans le temps à travers son empreinte catalytique idiosyncrasique en utilisant des substrats à
partir desquels plusieurs mesures pourront être effectuées.
La visualisation de l'effet d'activités catalytiques sur un ensemble de substrats est reproductible.
Les substrats décrits correspondent avantageusement à ceux décrits dans la demande de brevet internationale PCT/FR01/01686 et dans l'article de G. Klein et JL. Reymond, Helvetica Chimica Acta , vol. 82 , 1999.
Ces substrats répondent aux formules (I) à (V) ci-dessous .
Y~ P1 P
X CiDi ~ ~~Di ~~C~ Di p/ ~ C~ ~ Xw / ~ C~ v R3 /Cy R3 / ~ R3 (I) (II) (III) R1 Yi Pl Ci Di R2 ¿a Di / 1 R3 (IV) (V) dans lesquelles .
- la liaison C1-C2 est insensible à une coupure par une réaction d'oxydation chimique.
- Di représente le précurseur d'un produit détectable, - X et Y, identiques ou différents, sont choisis parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, une amine de formule -NRllRlz. R11 est choisi parmi . un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, un groupe aryle, substitués ou non, et R1~ n'est pas un atome d'hydrogène.
- R1 à R3, identiques ou différents sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou 5 non ou un groupement chimique comme défini précédemment.
- P1 et PZ, identiques ou différents sont des groupes fonctionnels comme définis précédemment, et au plus un des groupes P1 et P2 est un atome d'hydrogène.
- P3 est choisi parmi un groupe carbonyle, un
Le procédé de l'invention permet de suivre un échantillon dans le temps à travers son empreinte catalytique idiosyncrasique en utilisant des substrats à
partir desquels plusieurs mesures pourront être effectuées.
La visualisation de l'effet d'activités catalytiques sur un ensemble de substrats est reproductible.
Les substrats décrits correspondent avantageusement à ceux décrits dans la demande de brevet internationale PCT/FR01/01686 et dans l'article de G. Klein et JL. Reymond, Helvetica Chimica Acta , vol. 82 , 1999.
Ces substrats répondent aux formules (I) à (V) ci-dessous .
Y~ P1 P
X CiDi ~ ~~Di ~~C~ Di p/ ~ C~ ~ Xw / ~ C~ v R3 /Cy R3 / ~ R3 (I) (II) (III) R1 Yi Pl Ci Di R2 ¿a Di / 1 R3 (IV) (V) dans lesquelles .
- la liaison C1-C2 est insensible à une coupure par une réaction d'oxydation chimique.
- Di représente le précurseur d'un produit détectable, - X et Y, identiques ou différents, sont choisis parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, une amine de formule -NRllRlz. R11 est choisi parmi . un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, un groupe aryle, substitués ou non, et R1~ n'est pas un atome d'hydrogène.
- R1 à R3, identiques ou différents sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou 5 non ou un groupement chimique comme défini précédemment.
- P1 et PZ, identiques ou différents sont des groupes fonctionnels comme définis précédemment, et au plus un des groupes P1 et P2 est un atome d'hydrogène.
- P3 est choisi parmi un groupe carbonyle, un
10 groupe -P02R11 ou un groupe R11P0-, où R11 présente la mème signification que précédemment, un groupe -SO2, un groupe -CHOR13 où R13 représente un groupe aryle, alkyle ou glycosyle, un groupe SiRl4Rls où R14 et R15, identiques ou différents, représentent un groupe aryle, alkyle, aryloxy ou alcoxy et un groupe AsO2H-.
- G est choisi parmi un atome d'oxygène, un atome de souf re , un groupe amine de formule NR13 où R13 e s t R11 ou R12, Rl~ et R~2 ayant la même signification que précédemment.
Ces substrats sont détectés après leur transformation chimique par un échantillon pour donner des produits qui vont être oxydés de manière chimique pour obtenir de manière directe ou indirecte un composé
détectable correspondant à un ou plusieurs composés susceptibles de présenter seuls ou en combinaison une ou plusieurs variations de leurs propriétés biophysiques, biologiques ou chimiques avant et après l'étape d'oxydation telles que notamment une variation de type spectral ou une variation de solubilité. A titre d'exemple, la figure 2 représente un principe de détection de substrats fluorescents.
Un second exemple de substrats utiles selon le procédé de l' invention comprend des substrats (S) dont la transformation en produit (P) peut être détectée en
- G est choisi parmi un atome d'oxygène, un atome de souf re , un groupe amine de formule NR13 où R13 e s t R11 ou R12, Rl~ et R~2 ayant la même signification que précédemment.
Ces substrats sont détectés après leur transformation chimique par un échantillon pour donner des produits qui vont être oxydés de manière chimique pour obtenir de manière directe ou indirecte un composé
détectable correspondant à un ou plusieurs composés susceptibles de présenter seuls ou en combinaison une ou plusieurs variations de leurs propriétés biophysiques, biologiques ou chimiques avant et après l'étape d'oxydation telles que notamment une variation de type spectral ou une variation de solubilité. A titre d'exemple, la figure 2 représente un principe de détection de substrats fluorescents.
Un second exemple de substrats utiles selon le procédé de l' invention comprend des substrats (S) dont la transformation en produit (P) peut être détectée en
11 mesurant un changement de pM résultant de la différence de pouvoir chélatant du substrat (S) et du produit (P) vis-à-vis d'un ion métallique. De tels substrats sont décrits dans la demande de brevet français No. 01/05574 et dans les articles de Jean-Louis Reymond et al. (G. Klein, D.
Kaufmann, S. Schürch et JL. Reymond, Chem. Commun., 2001, 561-562 ; G. Klein et JL. Reymond, Angew. Chem., 2001, 113, Nr.9). Ces substrats permettent la détection de la transformation d'un substrat (S) en un produit (P) en mesurant le changement des propriétés spectrales d'un détecteur chimique (L), chélateur d'un ion métallique, résultant d'échanges d'ions métalliques selon l'équilibre suivant .
ML ~ (MP et/ou MS) + L
où .
S représente un substrat, qui peut être toute molécule chimique, dont le pouvoir chélatant est différent de celui du produit résultant de la transformation chimique du substrat. I1 s'agit notamment de substrat spécifique comme des protéines entières pour les protéases. Ce substrat peut présenter des propriétés énantiosélectives.
Les substrats n'ont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir une différence de pouvoir chélatant avec les produits correspondants.
P représente le produit issu de la transformation chimique de S et présentant un pouvoir chélateur différent de S. Comme les substrats, les produits n'ont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir une différence de pouvoir chélatant avec les substrats correspondants.
L représente un détecteur chimique, aussi désigné « sensor pM >a, correspondant à tout ligand capable de chélater les ions métalliques en solution tel que la chélation du métal par le détecteur chimique donne un
Kaufmann, S. Schürch et JL. Reymond, Chem. Commun., 2001, 561-562 ; G. Klein et JL. Reymond, Angew. Chem., 2001, 113, Nr.9). Ces substrats permettent la détection de la transformation d'un substrat (S) en un produit (P) en mesurant le changement des propriétés spectrales d'un détecteur chimique (L), chélateur d'un ion métallique, résultant d'échanges d'ions métalliques selon l'équilibre suivant .
ML ~ (MP et/ou MS) + L
où .
S représente un substrat, qui peut être toute molécule chimique, dont le pouvoir chélatant est différent de celui du produit résultant de la transformation chimique du substrat. I1 s'agit notamment de substrat spécifique comme des protéines entières pour les protéases. Ce substrat peut présenter des propriétés énantiosélectives.
Les substrats n'ont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir une différence de pouvoir chélatant avec les produits correspondants.
P représente le produit issu de la transformation chimique de S et présentant un pouvoir chélateur différent de S. Comme les substrats, les produits n'ont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir une différence de pouvoir chélatant avec les substrats correspondants.
L représente un détecteur chimique, aussi désigné « sensor pM >a, correspondant à tout ligand capable de chélater les ions métalliques en solution tel que la chélation du métal par le détecteur chimique donne un
12 changement de pM mesurable par toute méthode appropriée comme par exemple un changement de propriété spectrale du détecteur. Le sensor pM possède un pouvoir chélatant tel qu'il puisse y avoir des échanges d'ions métalliques entre le produit (P) et le ligand (L) ou le substrat (S) et le ligand (L) selon respectivement que le produit (P) ou le substrat (S) possède le pouvoir chélatant le plus fort.
Comme indiqué précédemment, le pouvoir chélatant du détecteur chimique (L) est avantageusement supérieur à
celui du substrat (S) ou du produit (P) de façon à réaliser la méthode de l'invention avec des quantités faibles de détecteurs chimiques. Le détecteur chimique (L) peut correspondre à un dérivé de fluorescéine ou tout autre noyau fluorescent substitué par un groupement chélatant.
ML représente le complexe métal-ligand présentant des propriétés spectrales différentes de L.
MS représente le complexe métal-substrat.
MP représente le complexe métal-produit.
Lesdits complexes ML, MS et MP n'ont pas forcément une stochiométrie de 1/1.
Ces substrats permettent la détection de la transformation d'un substrat (S) en un produit (P) en mesurant le changement des propriétés spectrales d'un détecteur chimique (L), chélateur d'un ion métallique, résultant d'échanges d'ions métalliques .
- entre le produit (P) et le détecteur chimique (L) lorsque le produit (P) présente un pouvoir chélatant supérieur à celui du substrat (S), ou - entre le substrat (S) et le détecteur chimique (L), lorsque le substrat (S) présente un pouvoir chélatant supérieur à celui du produit (P).
Une combinaison de différents substrats pourra être utilisée pour réaliser les empreintes catalytiques idiosyncrasiques.
Comme indiqué précédemment, le pouvoir chélatant du détecteur chimique (L) est avantageusement supérieur à
celui du substrat (S) ou du produit (P) de façon à réaliser la méthode de l'invention avec des quantités faibles de détecteurs chimiques. Le détecteur chimique (L) peut correspondre à un dérivé de fluorescéine ou tout autre noyau fluorescent substitué par un groupement chélatant.
ML représente le complexe métal-ligand présentant des propriétés spectrales différentes de L.
MS représente le complexe métal-substrat.
MP représente le complexe métal-produit.
Lesdits complexes ML, MS et MP n'ont pas forcément une stochiométrie de 1/1.
Ces substrats permettent la détection de la transformation d'un substrat (S) en un produit (P) en mesurant le changement des propriétés spectrales d'un détecteur chimique (L), chélateur d'un ion métallique, résultant d'échanges d'ions métalliques .
- entre le produit (P) et le détecteur chimique (L) lorsque le produit (P) présente un pouvoir chélatant supérieur à celui du substrat (S), ou - entre le substrat (S) et le détecteur chimique (L), lorsque le substrat (S) présente un pouvoir chélatant supérieur à celui du produit (P).
Une combinaison de différents substrats pourra être utilisée pour réaliser les empreintes catalytiques idiosyncrasiques.
13 L'invention a aussi pour objet un ensemble de substrats permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique selon le procédé de l'invention.
Dans une mise en ouvre de l'invention, on choisira des substrats possédant des groupes fonctionnels différents ou des groupements chimiques différents ou une combinaison de ces deux possibilités notamment des substrats possédant des groupements fonctionnels identiques et des groupement chimiques différents.
Dans une autre mise en ouvre, les substrats seront identiques. La mise en contact des substrats avec l'échantillon se fera alors dans des conditions réactionnelles différentes. Les conditions réactionnelles sont à titre d'exemple non limitatif au niveau du pH, de la température, de la durée d'incubation, de la concentration en substrat ou une quantité d'échantillon ou à un mélange de celles-ci. Ces conditions peuvent également correspondre à d'autres paramètres pouvant être pris à la fois de manière individuelle ou en combinaison. Ces conditions peuvent également correspondre à l'addition d'un ou plusieurs réactifs supplémentaires.
Les substrats pourront également correspondre à
une combinaison de substrats différents et identiques.
Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon peut être réalisée en utilisant des substrats capables de révéler différentes sous classes d'au moins une classe d'activité catalytique.
A titre d'exemple, les substrats de type epoxyde, ester, carbonate, amide, cyano, lactame,
Dans une mise en ouvre de l'invention, on choisira des substrats possédant des groupes fonctionnels différents ou des groupements chimiques différents ou une combinaison de ces deux possibilités notamment des substrats possédant des groupements fonctionnels identiques et des groupement chimiques différents.
Dans une autre mise en ouvre, les substrats seront identiques. La mise en contact des substrats avec l'échantillon se fera alors dans des conditions réactionnelles différentes. Les conditions réactionnelles sont à titre d'exemple non limitatif au niveau du pH, de la température, de la durée d'incubation, de la concentration en substrat ou une quantité d'échantillon ou à un mélange de celles-ci. Ces conditions peuvent également correspondre à d'autres paramètres pouvant être pris à la fois de manière individuelle ou en combinaison. Ces conditions peuvent également correspondre à l'addition d'un ou plusieurs réactifs supplémentaires.
Les substrats pourront également correspondre à
une combinaison de substrats différents et identiques.
Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon peut être réalisée en utilisant des substrats capables de révéler différentes sous classes d'au moins une classe d'activité catalytique.
A titre d'exemple, les substrats de type epoxyde, ester, carbonate, amide, cyano, lactame,
14 carbamate, glycoside, halogénure d'alkyle, phosphate mono-et diester, ether d'énol et ether d'alkyle peuvent permettre de révéler l'empreinte catalytique idiosyncrasique hydrolasique d'un êchantillon. De même, les substrats de type éthanol, méthanol, isopropanol, butanol, glycérol, éthylène glycol, acide lactique, acide malique, acide citrique, acide formique, acide acétique, acide propionique, acide benzoique, benzaldéhyde, acétaldéhyde, propionaldéhyde peuvent permettre de révéler une empreinte catalytique idiosyncrasique deshydrogénasïque d'un échantillon.
Le nombre de substrats est avantageusement d'au plus 1000. Il est généralement de l'ordre de 1 à 200.
Les substrats mis en ouvre dans le procédé de l'invention peuvent être ordonnés sur un même support, comme, par exemple sur une plaque de micro-titration ou un microsystème. Ce support possédant des substrats peut constituer un système mis en ouvre pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique selon le procédé de l'invention. La capture des signaux sera réalisée de façon ordonnée grâce à l'agencement ordonné des substrats sur le support.
Les substrats peuvent aussi être mélangés et dans ce cas la capture des signaux sera réalisée de façon ordonnée par exemple grâce à un étalonnage préalable.
Dans une forme de mise en ouvre, les signaux peuvent être capturés de façon ordonnée en utilisant une technique séparative telle que l'HPLC.
La réaction des substrats avec l'échantillon peut être suivie en temps réel ou en point final.
Les empreintes catalytiques idiosyncrasiques obtenues peuvent être stockées de manière à créer des bases de données d'empreintes d'échantillons.
L'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon peut correspondre à la combinaison de plusieurs empreintes obtenues selon différentes formes de mise en oeuvre ou au cours du temps.
5 Le procédé de l'invention peut également comprendre après le recueil d'empreintes catalytiques idiosyncrasiques des signaux générés par un échantillon, une analyse de l'empreinte catalytique idiosyncrasique.
Cette analyse permet de caractériser ou d'effectuer un 10 suivi de l'évolution de l'échantillon. I1 n'est pas nécessaire de connaître exactement toutes les activités pour effectuer cette analyse.
Le signal est fonction de la modification réalisée sur l'activité. Ainsi dans un échantillon, des
Le nombre de substrats est avantageusement d'au plus 1000. Il est généralement de l'ordre de 1 à 200.
Les substrats mis en ouvre dans le procédé de l'invention peuvent être ordonnés sur un même support, comme, par exemple sur une plaque de micro-titration ou un microsystème. Ce support possédant des substrats peut constituer un système mis en ouvre pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique selon le procédé de l'invention. La capture des signaux sera réalisée de façon ordonnée grâce à l'agencement ordonné des substrats sur le support.
Les substrats peuvent aussi être mélangés et dans ce cas la capture des signaux sera réalisée de façon ordonnée par exemple grâce à un étalonnage préalable.
Dans une forme de mise en ouvre, les signaux peuvent être capturés de façon ordonnée en utilisant une technique séparative telle que l'HPLC.
La réaction des substrats avec l'échantillon peut être suivie en temps réel ou en point final.
Les empreintes catalytiques idiosyncrasiques obtenues peuvent être stockées de manière à créer des bases de données d'empreintes d'échantillons.
L'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon peut correspondre à la combinaison de plusieurs empreintes obtenues selon différentes formes de mise en oeuvre ou au cours du temps.
5 Le procédé de l'invention peut également comprendre après le recueil d'empreintes catalytiques idiosyncrasiques des signaux générés par un échantillon, une analyse de l'empreinte catalytique idiosyncrasique.
Cette analyse permet de caractériser ou d'effectuer un 10 suivi de l'évolution de l'échantillon. I1 n'est pas nécessaire de connaître exactement toutes les activités pour effectuer cette analyse.
Le signal est fonction de la modification réalisée sur l'activité. Ainsi dans un échantillon, des
15 activités catalytiques appartenant à une même classe vont pouvoir réagir sur les mêmes substrats avec une vitesse de réaction différente. Le signal généré sera différent.
L'empreinte d'un échantillon est susceptible d'évoluer par exemple parce que l'échantillon a été mis en présence de contaminants ou parce que l'échantillon se dégrade ou s'altère au cours du temps. Pour le suivi d'évolution d'échantillon comme par exemple le contrôle qualité, on peut considérer le résultat obtenu en le comparant avec une empreinte faisant partie d'une base de données ou avec une empreinte effectuée avant ou après l'échantillon analysé.
L'empreinte catalytique idiosyncrasique obtenue peut être superposée à une autre empreinte obtenue à titre d'exemple .
- avec le méme ensemble de substrats en présence d'un mélange d'échantillons ou d'un échantillon de référence.
- avec le. même échantillon mais avec un ensemble de substrats différents.
L'empreinte d'un échantillon est susceptible d'évoluer par exemple parce que l'échantillon a été mis en présence de contaminants ou parce que l'échantillon se dégrade ou s'altère au cours du temps. Pour le suivi d'évolution d'échantillon comme par exemple le contrôle qualité, on peut considérer le résultat obtenu en le comparant avec une empreinte faisant partie d'une base de données ou avec une empreinte effectuée avant ou après l'échantillon analysé.
L'empreinte catalytique idiosyncrasique obtenue peut être superposée à une autre empreinte obtenue à titre d'exemple .
- avec le méme ensemble de substrats en présence d'un mélange d'échantillons ou d'un échantillon de référence.
- avec le. même échantillon mais avec un ensemble de substrats différents.
16 avec le même ensemble de substrats révélés avec le même échantillon à un temps différent.
- avec le même ensemble de substrats révélés avec le même échantillon prélevé à un temps différent.
- avec le même ensemble de substrats révélés dans des conditions réactionnelles différentes.
Cette comparaison d'empreintes catalytiques idiosyncrasiques peut être effectuée par toutes techniques, notamment .
par comparaison visuelle des empreintes catalytiques de modification ou signaux générés obtenus - par analyse graphique informatique.
La modification d'une empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon est l'indicateur d'une variation ou d'une apparition ou d'une disparition d'une ou plusieurs activités catalytiques.
L'utilisation du procédé de l'invention et de la superposition d'empreintes est tout à fait appropriée pour le suivi de procédés ou de produits mettant en oeuvre des activités catalytiques pour faire notamment du contrôle qualité.
Le procédé de l'invention est aussi remarquable en ce qu'il peut être automatisé. En effet, une telle automatisation consiste en le traitement éventuellement informatique des résultats de transformation des substrats pour obtenir l'empreinte numérique catalytique idiosyncrasique caractéristique des signaux et l'interprétation de ladite empreinte idiosyncrasique pour caractériser l'échantillon.
A titre d'exemple d'un tel traitement informatique, on peut citer tout particulièrement celui se rapportant à la combinaison de plusieurs empreintes dont le
- avec le même ensemble de substrats révélés avec le même échantillon prélevé à un temps différent.
- avec le même ensemble de substrats révélés dans des conditions réactionnelles différentes.
Cette comparaison d'empreintes catalytiques idiosyncrasiques peut être effectuée par toutes techniques, notamment .
par comparaison visuelle des empreintes catalytiques de modification ou signaux générés obtenus - par analyse graphique informatique.
La modification d'une empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon est l'indicateur d'une variation ou d'une apparition ou d'une disparition d'une ou plusieurs activités catalytiques.
L'utilisation du procédé de l'invention et de la superposition d'empreintes est tout à fait appropriée pour le suivi de procédés ou de produits mettant en oeuvre des activités catalytiques pour faire notamment du contrôle qualité.
Le procédé de l'invention est aussi remarquable en ce qu'il peut être automatisé. En effet, une telle automatisation consiste en le traitement éventuellement informatique des résultats de transformation des substrats pour obtenir l'empreinte numérique catalytique idiosyncrasique caractéristique des signaux et l'interprétation de ladite empreinte idiosyncrasique pour caractériser l'échantillon.
A titre d'exemple d'un tel traitement informatique, on peut citer tout particulièrement celui se rapportant à la combinaison de plusieurs empreintes dont le
17 traitement génère une nouvelle empreinte graphique en couleurs permettant de visualiser des caractéristiques cumulêes d'un échantillon. Cette méthode de visualisation des résultats permettant de cumuler au moins 2 mesures (2 signaux) pour créer une nouvelle donnée représentée sous forme d'une valeur spécifique. Cette valeur donne l'information sur une caractéristique de l'échantillon d'intérêt. Dans l'exemple 4 ci-après, la valeur obtenue est traduite en une couleur spécifique.
Le traitement des empreintes peut inclure une représentation en couleur de la nouvelle empreinte du type basé sur le système RVB (Rouge, Vert, Bleu).
L'invention a aussi pour objet un système pour la mise en oeuvre d'un procédé décrit précédemment, comprenant un mélange de substrats et un ou plusieurs accessoires suivants .
- un dispositif pour commander la mise en contact de l'échantillon avec au moins un substrat, - des capteurs pour séparer et mesurer les signaux générés à partir de la transformation des substrats par l'échantillon, - un premier analyseur permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, - une mémoire permettant de stocker dans une base de données les empreintes catalytiques idiosyncrasiques originales, - un second analyseur permettant la superposition entre l'empreinte catalytique idiosyncrasique nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées dans la mémoire.
Le traitement des empreintes peut inclure une représentation en couleur de la nouvelle empreinte du type basé sur le système RVB (Rouge, Vert, Bleu).
L'invention a aussi pour objet un système pour la mise en oeuvre d'un procédé décrit précédemment, comprenant un mélange de substrats et un ou plusieurs accessoires suivants .
- un dispositif pour commander la mise en contact de l'échantillon avec au moins un substrat, - des capteurs pour séparer et mesurer les signaux générés à partir de la transformation des substrats par l'échantillon, - un premier analyseur permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, - une mémoire permettant de stocker dans une base de données les empreintes catalytiques idiosyncrasiques originales, - un second analyseur permettant la superposition entre l'empreinte catalytique idiosyncrasique nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées dans la mémoire.
18 L'invention a encore pour objet un système comprenant un support sur lequel sont ordonnés plusieurs substrats tels que définis précédemment, identiques ou différents permettant de mettre en oeuvre le procédé de l'invention. Ce système peut comprendre, outre l'ensemble de substrats, un ou plusieurs accessoires suivants .
- Un dispositif servant à commander la mise en contact de l'échantillon avec au moins un substrat, - Des capteurs pour mesurer les signaux générés à partir de la transformation des substrats par l'échantillon. Ces capteurs peuvent correspondre à titre d'exemple non limitatif à un fluorimètre, un spectrophotomètre, un ampèremètre, un pHmètre.
- Un analyseur permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon.
L'empreinte sera par exemple stockée sous la forme d'une série de bits en échelle de gris ou en utilisant le système RVB.
Une mémoire permettant de stocker dans une base de données les empreintes catalytiques idiosyncrasiques originales.
- Un analyseur permettant la superposition entre l'empreinte catalytique idiosyncrasique nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées dans la mémoire. Cet analyseur sera capable d'effectuer des tests statistiques connus de l'homme de métier permettant d'effectuer des analyses de différences et de similitudes entre l'empreinte nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées dans la mémoire.
Ces tests statistiques peuvent impliquer par exemple des tests de discordance ou de corrélation.
Le système de l'invention peut être utilisé
pour faire le suivi de l'évolution d'un échantillon.
- Un dispositif servant à commander la mise en contact de l'échantillon avec au moins un substrat, - Des capteurs pour mesurer les signaux générés à partir de la transformation des substrats par l'échantillon. Ces capteurs peuvent correspondre à titre d'exemple non limitatif à un fluorimètre, un spectrophotomètre, un ampèremètre, un pHmètre.
- Un analyseur permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon.
L'empreinte sera par exemple stockée sous la forme d'une série de bits en échelle de gris ou en utilisant le système RVB.
Une mémoire permettant de stocker dans une base de données les empreintes catalytiques idiosyncrasiques originales.
- Un analyseur permettant la superposition entre l'empreinte catalytique idiosyncrasique nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées dans la mémoire. Cet analyseur sera capable d'effectuer des tests statistiques connus de l'homme de métier permettant d'effectuer des analyses de différences et de similitudes entre l'empreinte nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées dans la mémoire.
Ces tests statistiques peuvent impliquer par exemple des tests de discordance ou de corrélation.
Le système de l'invention peut être utilisé
pour faire le suivi de l'évolution d'un échantillon.
19 L'invention concerne alors également l'utilisation d'un système tel que défini précédemment pour faire le suivi de l'évolution d'un échantillon caractérisé en ce que .
- on met en contact au moins un échantillon avec un ensemble de substrats ordonnés sur ledit système, comportant chacun au moins un groupe fonctionnel sensible à
la présence d'activité catalytique de l'échantillon, - on capture les signaux générés résultant de ladite mise en contact des substrats avec l'activité
catalytique d'un échantillon.
- On compare l'empreinte pour un échantillon à
une autre empreinte établie.
Le système de l'invention peut être utilisé
pour faire le suivi de l'évolution d'un échantillon.
L'invention concerne alors également l'utilisation d'un système tel que défini précédemment pour faire le suivi de l'évolution d'un échantillon caractérïsé en ce que .
- on met en contact au moins un échantillon avec un ensemble de substrats sous forme de mélange, comportant chacun au moins un groupe fonctionnel sensible à
la présence d'activité catalytique de l'échantillon, - on capture de façon ordonnée, les signaux générés résultant de ladite mise en contact des substrats avec l'activité catalytique d'un échantillon, en utilisant une technique séparative telle que l'HPLC.
- On compare l'empreinte pour un échantillon à
une autre empreinte établie.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent. Ces exemples montrent que le procédé de l'invention permet d'obtenir les empreintes idiosyncrasiques d'un échantillon.
Le mode de réalisation de ces exemples pourra âtre facilement appliqué à tout type d'échantillon.
Dans ces exemples, il sera fait références aux dessins en annexe dans lesquels .
- La figure 1 représente des exemples de formules de substrats fluorogéniques (figure 1a) et 5 chromogéniques (figure 1b) utiles selon l'invention.
- La figure 2 représente un principe de détection des substrats fluorescents.
- La figure 3 représente la cinétique du signal d'absorbante (O D, à ~, - 405 nm) pour l'empreinte 10 catalytique idiosyncrasique des signaux générés par un échantillon avec la grille de substrats chromogènes.
- La figure 4a représente les empreintes catalytiques idiosyncrasiques obtenues avec des substrats fluorescents. La distribution des substrats a été donnée 15 dans la figure 1a. Les différents échantillons testés par empreinte sont indiqués dans le tableau 1 ci-dessous.
- La figure 4b représente les empreintes catalytiques idiosyncrasiques obtenues avec des substrats chromogéniques. La distribution des substrats a été donnée
- on met en contact au moins un échantillon avec un ensemble de substrats ordonnés sur ledit système, comportant chacun au moins un groupe fonctionnel sensible à
la présence d'activité catalytique de l'échantillon, - on capture les signaux générés résultant de ladite mise en contact des substrats avec l'activité
catalytique d'un échantillon.
- On compare l'empreinte pour un échantillon à
une autre empreinte établie.
Le système de l'invention peut être utilisé
pour faire le suivi de l'évolution d'un échantillon.
L'invention concerne alors également l'utilisation d'un système tel que défini précédemment pour faire le suivi de l'évolution d'un échantillon caractérïsé en ce que .
- on met en contact au moins un échantillon avec un ensemble de substrats sous forme de mélange, comportant chacun au moins un groupe fonctionnel sensible à
la présence d'activité catalytique de l'échantillon, - on capture de façon ordonnée, les signaux générés résultant de ladite mise en contact des substrats avec l'activité catalytique d'un échantillon, en utilisant une technique séparative telle que l'HPLC.
- On compare l'empreinte pour un échantillon à
une autre empreinte établie.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent. Ces exemples montrent que le procédé de l'invention permet d'obtenir les empreintes idiosyncrasiques d'un échantillon.
Le mode de réalisation de ces exemples pourra âtre facilement appliqué à tout type d'échantillon.
Dans ces exemples, il sera fait références aux dessins en annexe dans lesquels .
- La figure 1 représente des exemples de formules de substrats fluorogéniques (figure 1a) et 5 chromogéniques (figure 1b) utiles selon l'invention.
- La figure 2 représente un principe de détection des substrats fluorescents.
- La figure 3 représente la cinétique du signal d'absorbante (O D, à ~, - 405 nm) pour l'empreinte 10 catalytique idiosyncrasique des signaux générés par un échantillon avec la grille de substrats chromogènes.
- La figure 4a représente les empreintes catalytiques idiosyncrasiques obtenues avec des substrats fluorescents. La distribution des substrats a été donnée 15 dans la figure 1a. Les différents échantillons testés par empreinte sont indiqués dans le tableau 1 ci-dessous.
- La figure 4b représente les empreintes catalytiques idiosyncrasiques obtenues avec des substrats chromogéniques. La distribution des substrats a été donnée
20 dans la figure 1b. Les différents échantillons testés par empreinte sont indiqués dans le tableau 1 ci-après.
m..l.'1 ....,..
1 A = Aspergillus niger lipase (ANL), B - Aspergillus niger lipase (ANL) lU/mg, C - Aspergillus oryzae lipase (AOL), D = Candida antarctica lipase (CAL), E =
Candi da cylindracea lipase (CCL) , F - Candida lipolytica lipase (CLL), G - hog pancreatic lipase (HPL), H = Mucor javanicus lipase (MJL) 2 A - Mucor miehei lipase (MML) , B - Penicillium roqueforts lipase (PRL), C - Pseudomonas cepacia lipase (PCL) 40U/mg, D - Pseudomonas cepacia lipase (PCL) 50U/mg, E - Pseudomonas fluorescens lipase (PFL) , F - Rhizomucor miehei lipase (RML) , G
Rhizopus arrhizus lipase (RAL), H - Rhizopus niveus lipase (RNL) 3 A = wheat germ lipase (WGL), B = Bacillus sp. esterase (BSE), C - Bacillus stearothermophilus esterase (BStE), D - Bacillus thermoglucosidasius esterase
m..l.'1 ....,..
1 A = Aspergillus niger lipase (ANL), B - Aspergillus niger lipase (ANL) lU/mg, C - Aspergillus oryzae lipase (AOL), D = Candida antarctica lipase (CAL), E =
Candi da cylindracea lipase (CCL) , F - Candida lipolytica lipase (CLL), G - hog pancreatic lipase (HPL), H = Mucor javanicus lipase (MJL) 2 A - Mucor miehei lipase (MML) , B - Penicillium roqueforts lipase (PRL), C - Pseudomonas cepacia lipase (PCL) 40U/mg, D - Pseudomonas cepacia lipase (PCL) 50U/mg, E - Pseudomonas fluorescens lipase (PFL) , F - Rhizomucor miehei lipase (RML) , G
Rhizopus arrhizus lipase (RAL), H - Rhizopus niveus lipase (RNL) 3 A = wheat germ lipase (WGL), B = Bacillus sp. esterase (BSE), C - Bacillus stearothermophilus esterase (BStE), D - Bacillus thermoglucosidasius esterase
21 (BTE), E = Candida lipolytica esterase (CLE), F = hog liver esterase (HLE) 100~,g/ml, G = hog liver esterase (HLE) 10~.g/ml, H = horse liver esterase (HrLE) 4 A - Aspergillus niger epoxide hydrolase (AEH) 100~.1,g/ml, B - Chromobacterium viscosum lipoprotein lipase (CVL), C = Pseudomonas sp. lipoprotein lipase (PSL) 1500U/mg, D = Pseudomonas sp. lipoprotein lipase (PSL) 50000U/mg, E - Pseudomonas sp. Type B
lipoprotein lipase (PSBL), F = Mucor miehei esterase (MME), G = Saccharomyces cerevisiae esterase (SCE), H
Thermoanaerobium brockii esterase (TBE) A = Aspergillus niger epoxide hydrolase (AEH) 10~.g/ml, B - Aspergillus melleus acylase I (AMA), C
Eseherichia soli penicillin G acylase (PGA), D
Bacillus thermoproteolyticus thermolysin (The), E
porcine stomach mucosa pepsin (Pep), F - Clostrdium histolytcum clostripain (Clos), G - Papaya latex papain (Pap) , H - Electrophorus electricus acetylcholine esterase (AChE) 6 A = Rhodotorula glutinis epoxide hydrolase (REH), B
hog kidney acylase I (HKA), C = Bacilles licheniformis subtilisin (Sub), D - hog pancreas trypsin (Try), E
=
porcine pancreatic elastase (Ela), F - bovine pancreatic a-chymotrypsin (Chy) 37U/mg, G - bovine pancreatic a-chymotrypsin (Chy) 70U/mg, H = blank - La figure 5 représente la liste des substrats testés.
La figure ~ représente les étapes du 5 traitement des valeurs pour former une empreinte en couleur d'une activité catalytique. Figure 6A . traitement des données pour l'obtention des valeurs relatives. Figure 6B .
sauvegarde des valeurs dans un fichier csv. Figure 6C .
création du fichier ppm. Figure 6D . Image d'une empreinte (fichier bmp) .
- La figure 7 représente l'exemple du système RVB de codage des couleurs (disponible dans chaque logiciel du Pack Office de Microsoft).
- La figure 8 représente la clé des couleurs obtenues conformément à l'exemple 3, et indique la proportionnalité de la teinte avec la sélectivité et de l'intensité avec la vitesse de réaction.
lipoprotein lipase (PSBL), F = Mucor miehei esterase (MME), G = Saccharomyces cerevisiae esterase (SCE), H
Thermoanaerobium brockii esterase (TBE) A = Aspergillus niger epoxide hydrolase (AEH) 10~.g/ml, B - Aspergillus melleus acylase I (AMA), C
Eseherichia soli penicillin G acylase (PGA), D
Bacillus thermoproteolyticus thermolysin (The), E
porcine stomach mucosa pepsin (Pep), F - Clostrdium histolytcum clostripain (Clos), G - Papaya latex papain (Pap) , H - Electrophorus electricus acetylcholine esterase (AChE) 6 A = Rhodotorula glutinis epoxide hydrolase (REH), B
hog kidney acylase I (HKA), C = Bacilles licheniformis subtilisin (Sub), D - hog pancreas trypsin (Try), E
=
porcine pancreatic elastase (Ela), F - bovine pancreatic a-chymotrypsin (Chy) 37U/mg, G - bovine pancreatic a-chymotrypsin (Chy) 70U/mg, H = blank - La figure 5 représente la liste des substrats testés.
La figure ~ représente les étapes du 5 traitement des valeurs pour former une empreinte en couleur d'une activité catalytique. Figure 6A . traitement des données pour l'obtention des valeurs relatives. Figure 6B .
sauvegarde des valeurs dans un fichier csv. Figure 6C .
création du fichier ppm. Figure 6D . Image d'une empreinte (fichier bmp) .
- La figure 7 représente l'exemple du système RVB de codage des couleurs (disponible dans chaque logiciel du Pack Office de Microsoft).
- La figure 8 représente la clé des couleurs obtenues conformément à l'exemple 3, et indique la proportionnalité de la teinte avec la sélectivité et de l'intensité avec la vitesse de réaction.
22 - La fïgure 9 représente les empreintes obtenues à l'exemple 5 par combinaison des résultats cités dans l'exemple 1.
La figure 10 représente différents substrats f luorogéniques et chromogéniques.
- La figure 11 représente les empreintes idiosyncrasiques obtenues à l'exemple 6, ainsi que les pourcentages de conversion maximale.
- La figure 12 représente une série de substrats chromophores mis en oeuvre à l'exemple 7 dans les conditions expérimentales de capture des signaux identiques â celles décrites dans l'exemple 1.
- La figure 13 représente les empreintes ïdiosyncrasiques de l'activité catalytique en fonction de la dilution du catalyseur obtenues à l'exemple 7.
- La figure 14 représente le code de couleur établi selon l'exemple 4, pour chaque substrat de l'exemple 7.
- La figure 15 représente la visualisation de l'activité catalytique de l'échantillon de l'exemple 7 en fonction de sa dilution, en tenant compte uniquement de la vitesse maximale obtenue sur l'ensemble des mesures effectuées avec cet échantillon.
- La figure 16 représente le même traitement qu'à la figure 15 de l'exemple 7 mais en tronquant les résultats obtenus pour les meilleurs substrats en écrasant les valeurs supérieures à 25000 pM/s, qui sont ramenées à
la couleur noire.
- La figure 17 représente une série de 1,2-diols de structures diverses et analysables par HPLC.
- La figure 18 représente un exemple de la trace HPLC d'une série de 1,2-diols de structure diverse.
- La figure 19 représente une série d~acétates pseudo-énantiomériques qui peuvent être mélangés par paires
La figure 10 représente différents substrats f luorogéniques et chromogéniques.
- La figure 11 représente les empreintes idiosyncrasiques obtenues à l'exemple 6, ainsi que les pourcentages de conversion maximale.
- La figure 12 représente une série de substrats chromophores mis en oeuvre à l'exemple 7 dans les conditions expérimentales de capture des signaux identiques â celles décrites dans l'exemple 1.
- La figure 13 représente les empreintes ïdiosyncrasiques de l'activité catalytique en fonction de la dilution du catalyseur obtenues à l'exemple 7.
- La figure 14 représente le code de couleur établi selon l'exemple 4, pour chaque substrat de l'exemple 7.
- La figure 15 représente la visualisation de l'activité catalytique de l'échantillon de l'exemple 7 en fonction de sa dilution, en tenant compte uniquement de la vitesse maximale obtenue sur l'ensemble des mesures effectuées avec cet échantillon.
- La figure 16 représente le même traitement qu'à la figure 15 de l'exemple 7 mais en tronquant les résultats obtenus pour les meilleurs substrats en écrasant les valeurs supérieures à 25000 pM/s, qui sont ramenées à
la couleur noire.
- La figure 17 représente une série de 1,2-diols de structures diverses et analysables par HPLC.
- La figure 18 représente un exemple de la trace HPLC d'une série de 1,2-diols de structure diverse.
- La figure 19 représente une série d~acétates pseudo-énantiomériques qui peuvent être mélangés par paires
23 de façon à réaliser une empreinte simple d'activité
estérasique sur des acétates.
- La figure 20 représente une série de 10 substrats esters/carbonates qui peuvent être utilisés en mélange équimolaire pour mesurer l'empreinte estérasique d'un échantillon.
- La figure 21 représente une série de produits présentant une variété de groupes fonctionnels pour une analyse par HPLC d'un mélange de ceux-ci.
- La figure 22 représente la structure des quatre substrats esters utilisés pour générer l'empreinte d'activité catalytique idiosyncrasique d'enzymes de type lipase/esterase.
- La figure 23 représente les traces HPLC (UV
295 nm) donnant l'empreinte idiosyncrasique de l'estérase de Mucor Miehei (gauche) et de la lipase de Pseudomonas Fluorescens (droite).
- La figure 24 représente les empreintes idiosyncrasiques de l'estérase de Mucor Miehei (1) et de la lipase de Pseudomonas Fluoreseens (2). Chaque carré de la grille correspond à la surface du pic de l'un des quatre produits obtenus après activité enzymatique.
Exemple 1 Empreintes catalytiques idios ncrasiques d'échantillons.
1) Les différents substrats fluorescents et chromogéniques sont disposés dans les puits de plaques de microtitration respectivement selon la disposition de la figure 1a et 1b, sous forme de 5 microlitres d'une solution stock à 2 mM dans un mélange DMF/eau 50/50. La grille comprend des solutions des produits de référence qui serviront de contrôle positif dans la mesure.
2) On ajoute ensuite dans chaque puits une solution d'un échantillon prédiluée dans un tampon contenant l'agent révélateur (NaI04 1 mM, BSA 2mg/mL), et
estérasique sur des acétates.
- La figure 20 représente une série de 10 substrats esters/carbonates qui peuvent être utilisés en mélange équimolaire pour mesurer l'empreinte estérasique d'un échantillon.
- La figure 21 représente une série de produits présentant une variété de groupes fonctionnels pour une analyse par HPLC d'un mélange de ceux-ci.
- La figure 22 représente la structure des quatre substrats esters utilisés pour générer l'empreinte d'activité catalytique idiosyncrasique d'enzymes de type lipase/esterase.
- La figure 23 représente les traces HPLC (UV
295 nm) donnant l'empreinte idiosyncrasique de l'estérase de Mucor Miehei (gauche) et de la lipase de Pseudomonas Fluorescens (droite).
- La figure 24 représente les empreintes idiosyncrasiques de l'estérase de Mucor Miehei (1) et de la lipase de Pseudomonas Fluoreseens (2). Chaque carré de la grille correspond à la surface du pic de l'un des quatre produits obtenus après activité enzymatique.
Exemple 1 Empreintes catalytiques idios ncrasiques d'échantillons.
1) Les différents substrats fluorescents et chromogéniques sont disposés dans les puits de plaques de microtitration respectivement selon la disposition de la figure 1a et 1b, sous forme de 5 microlitres d'une solution stock à 2 mM dans un mélange DMF/eau 50/50. La grille comprend des solutions des produits de référence qui serviront de contrôle positif dans la mesure.
2) On ajoute ensuite dans chaque puits une solution d'un échantillon prédiluée dans un tampon contenant l'agent révélateur (NaI04 1 mM, BSA 2mg/mL), et
24 on suit la réaction en fonction du temps pendant 2 heures.
La liste des échantillons testés est représentée dans le tableau 1. Seules les données des 30 premières minutes sont nécessaires pour le calcul ultérieur des signaux générés pour réaliser les empreintes catalytiques idiosyncrasiques correspondantes.
3) Les empreintes sont obtenues de la manière suivante .
a) Conversion des données de fluorescence ou d'absorbante à 405 nm en concentration d'umbelliférone ou nitrophénol selon des courbes de calibrage. Une empreinte de réaction typique est exemplifiée à la figure 3.
Conditions . 0.1 mg/mL d'échantillon enzymatique, 100 ~..t,M
substrat, 20 mM aq. borate pH 8.8, 2.5% v/v DMF, 26°C, 2 mg.mL-1 BSA, 1 mM NaI04. Les vitesses déterminées à partir de ces courbes sont les suivantes . 17 209' 300 pM. s-1, 16 130' 800 pM. s-l, (S) -12a 31' 800 pM. s-1, (S) -12b 25' 500 pM. s-l, (R) -12a 25' 000 pM. s-1, (R) -12b 22' 000 pM. s-1, 15 4' 000 pM. s-l, (R) -10 2' 600 pM. s-1, (S) -10 2' 300 pM. s-l, 14 1' 600 pM. s-1, (S) -13 l' 400 pM. s-1, (R) -13 1' 300 pM. s-l .
b) Détermination des vitesses maximum apparentes à partir de la pente maximum apparente dans l'empreinte de vitesse, qui se situe toujours avant 30 minutes de réaction (figure 3).
c) Soustraction des vitesses enregistrées pour la mesure de référence sans échantillon dans les mêmes conditions.
d) Division de toutes les vitesses par la vitesse maximum observée dans la grille pour un échantillon donné.
e) Coloration de la case correspondant au substrat en échelle de gris en proportion de la vitesse relative. 0 = blanc. Maximum = noir.
La représentation de l'empreinte analysée, qui est nécessaire pour l'analyse visuelle, peut avantageusement prendre la forme d'une grille carrée ou rectangulaire où chaque carré de la grille est teinté en échelle de gris en proportion de la valeur attribuée à un substrat donné de la série, variant de blanc (pas 5 d'activité) à noir (activité maximum).
L'empreinte catalytique idiosyncrasique des signaux générés est ensuite affichée ainsi que la valeur de la vitesse maximum apparente en pM/s.
Nous avons vérifié que ces mesures sont 10 reproductibles, à savoir que le même échantillon donne la même empreinte catalytique idiosyncrasique lorsque la mesure est répétée dans les mêmes conditions. 0.1 mg/mL
d'échantillon, 2 mg/mL BSA (albumine de sérum bovin), 20 mM
tampon borate pH 8.8, 0.1 mM de chaque substrat, 1 mM NaI~4 15 incubation 26 °C.
Pour les figures 4a et 4b, 47 échantillons donnés dans le tableau 1 ci-dessus ont été testés.
Les empreintes idiosyncrasiques correspondantes ont été obtenues (figures 4a et 4b) . Elles illustrent la 20 capacité individuelle de chaque échantillon à réagir avec un ensemble de substrats.
Exemple 2 Combinaison de substrats pouvant être utilisée our générer l'em ceinte catal tiaue
La liste des échantillons testés est représentée dans le tableau 1. Seules les données des 30 premières minutes sont nécessaires pour le calcul ultérieur des signaux générés pour réaliser les empreintes catalytiques idiosyncrasiques correspondantes.
3) Les empreintes sont obtenues de la manière suivante .
a) Conversion des données de fluorescence ou d'absorbante à 405 nm en concentration d'umbelliférone ou nitrophénol selon des courbes de calibrage. Une empreinte de réaction typique est exemplifiée à la figure 3.
Conditions . 0.1 mg/mL d'échantillon enzymatique, 100 ~..t,M
substrat, 20 mM aq. borate pH 8.8, 2.5% v/v DMF, 26°C, 2 mg.mL-1 BSA, 1 mM NaI04. Les vitesses déterminées à partir de ces courbes sont les suivantes . 17 209' 300 pM. s-1, 16 130' 800 pM. s-l, (S) -12a 31' 800 pM. s-1, (S) -12b 25' 500 pM. s-l, (R) -12a 25' 000 pM. s-1, (R) -12b 22' 000 pM. s-1, 15 4' 000 pM. s-l, (R) -10 2' 600 pM. s-1, (S) -10 2' 300 pM. s-l, 14 1' 600 pM. s-1, (S) -13 l' 400 pM. s-1, (R) -13 1' 300 pM. s-l .
b) Détermination des vitesses maximum apparentes à partir de la pente maximum apparente dans l'empreinte de vitesse, qui se situe toujours avant 30 minutes de réaction (figure 3).
c) Soustraction des vitesses enregistrées pour la mesure de référence sans échantillon dans les mêmes conditions.
d) Division de toutes les vitesses par la vitesse maximum observée dans la grille pour un échantillon donné.
e) Coloration de la case correspondant au substrat en échelle de gris en proportion de la vitesse relative. 0 = blanc. Maximum = noir.
La représentation de l'empreinte analysée, qui est nécessaire pour l'analyse visuelle, peut avantageusement prendre la forme d'une grille carrée ou rectangulaire où chaque carré de la grille est teinté en échelle de gris en proportion de la valeur attribuée à un substrat donné de la série, variant de blanc (pas 5 d'activité) à noir (activité maximum).
L'empreinte catalytique idiosyncrasique des signaux générés est ensuite affichée ainsi que la valeur de la vitesse maximum apparente en pM/s.
Nous avons vérifié que ces mesures sont 10 reproductibles, à savoir que le même échantillon donne la même empreinte catalytique idiosyncrasique lorsque la mesure est répétée dans les mêmes conditions. 0.1 mg/mL
d'échantillon, 2 mg/mL BSA (albumine de sérum bovin), 20 mM
tampon borate pH 8.8, 0.1 mM de chaque substrat, 1 mM NaI~4 15 incubation 26 °C.
Pour les figures 4a et 4b, 47 échantillons donnés dans le tableau 1 ci-dessus ont été testés.
Les empreintes idiosyncrasiques correspondantes ont été obtenues (figures 4a et 4b) . Elles illustrent la 20 capacité individuelle de chaque échantillon à réagir avec un ensemble de substrats.
Exemple 2 Combinaison de substrats pouvant être utilisée our générer l'em ceinte catal tiaue
25 idiosyncrasique d'un échantillon.
Les 148 substrats et 4 substrats témoins, dont les formules sont données dans la figures 5, ont été
utilisés.
Tous les substrats sont testés à la concentration de 0,1 mM, à pH 7,4, dans deux types de conditions .
1) en temps direct . échantillon (0.1 mg/mL), BSA (2 mg/mL), un tampon inorganique (phosphate, borate,ammonium carbonate) aqueux (10-100 mM) avec 7 < pH <
11. Température entre 15 et 45 °C .
Les 148 substrats et 4 substrats témoins, dont les formules sont données dans la figures 5, ont été
utilisés.
Tous les substrats sont testés à la concentration de 0,1 mM, à pH 7,4, dans deux types de conditions .
1) en temps direct . échantillon (0.1 mg/mL), BSA (2 mg/mL), un tampon inorganique (phosphate, borate,ammonium carbonate) aqueux (10-100 mM) avec 7 < pH <
11. Température entre 15 et 45 °C .
26 2) en point final . a) incubation de l'échantillon (0.1 mg/mL) à un pH/température donné en tampon inorganique ; b) ajout de tampon stabilisateur pour obtenir un pH final entre 7 et 9, BSA (2 mg/mL), puis enregistrement du signal soit directement, soit après 20 minutes.
Substrats A-F et contrôles K: ajout de NaI04 (1 mM ) .
Substrats G: ajout de NAD+ (1 mM) et NADP+ (1 mM).
Les signaux générés après la mise en contact de cet ensemble de substrats avec un échantillon seront fluorescents.
Ces différents substrats permettent de révéler les classes d'enzymes suïvantes .
Lipases, estérases, protéases et amidases: A1-A22, B1-B22, C1-C22, Dl-D22, E1-E4 - Phosphatases: A23 - D23 - Sulfatases: A24-D24 - Uréases: A25-D25 - Argininases: A26-D26 - Déhalogénases: A27-D27 - Aldolases: A28-D28 sans NaI04 - Bayer-villigerases: A28-D28 avec lipase et NaI04 - Ether-hydrolases: A29-D29, A30-D30 - Epoxyde hydrolases: F1-F4 - Alcool déshydrogénases: G1-G4 sans NaI04 avec NAD+/NADP+
- hydroxylases: H1-H8 sans NaI04 - Glycosidases: J1-J8 sans NaI04 Dans une autre forme de mise en oeuvre, on réalisera la même grille de substrats avec le para-nitrophenol remplaçant la coumarine(Coum) comme groupe
Substrats A-F et contrôles K: ajout de NaI04 (1 mM ) .
Substrats G: ajout de NAD+ (1 mM) et NADP+ (1 mM).
Les signaux générés après la mise en contact de cet ensemble de substrats avec un échantillon seront fluorescents.
Ces différents substrats permettent de révéler les classes d'enzymes suïvantes .
Lipases, estérases, protéases et amidases: A1-A22, B1-B22, C1-C22, Dl-D22, E1-E4 - Phosphatases: A23 - D23 - Sulfatases: A24-D24 - Uréases: A25-D25 - Argininases: A26-D26 - Déhalogénases: A27-D27 - Aldolases: A28-D28 sans NaI04 - Bayer-villigerases: A28-D28 avec lipase et NaI04 - Ether-hydrolases: A29-D29, A30-D30 - Epoxyde hydrolases: F1-F4 - Alcool déshydrogénases: G1-G4 sans NaI04 avec NAD+/NADP+
- hydroxylases: H1-H8 sans NaI04 - Glycosidases: J1-J8 sans NaI04 Dans une autre forme de mise en oeuvre, on réalisera la même grille de substrats avec le para-nitrophenol remplaçant la coumarine(Coum) comme groupe
27 partant . Les signaux mesurés après la mise en contact des substrats avec l'échantillon seront chromogéniques.
Exemple 3 Empreinte idiosyncrasique en utilisant des substrats nécessitant la présence d'un senseur.
L'empreinte idiosyncrasique d'un échantillon peut être réalisé par une grille de substrats non-chromogéniques ou non-fluorogéniques si la réaction peut être suivie de manière indirecte, par exemple à l'aide d'un senseur, tel qu'une sonde thermographique, ou un senseur pH
ou pM. A titre d'exemple, on utilisera une grille composée d'esters pour obtenir l'empreinte d'échantillons de lipases et estérases en utilisant un indicateur pH pour la mesure.
Une série de dérivés d'acides aminés tels que les N-acyl acides aminés (20 N-acétyl acide aminés L naturels + 20 N
acétyl acide aminés D correspondants) servira avantageusement pour obtenir l'idiosyncrasique d'échantillon contenant des acylases en suivant la réaction à l'aide d'un senseur pM.
Exemple 4 Génération d'une empreinte à partir de plusieurs empreintes et sa représentation graphique en couleur.
Les exemples 5, 6 et 7 se rapportent à la combinaison de plusieurs empreintes dont le traitement génère une nouvelle empreinte graphique en couleurs permettant de visualiser des caractéristiques cumulées d'un échantillon. Cette méthode de visualisation des résultats permettant de cumuler au moins 2 mesures (2 signaux) pour créer une nouvelle donnée représentée sous forme d'une valeur spécifique. Cette valeur donne l'information sur une caractéristique de l'échantillon d'intérêt. Dans les exemples décrits, la valeur obtenue est traduite en une couleur spécifique.
Exemple 3 Empreinte idiosyncrasique en utilisant des substrats nécessitant la présence d'un senseur.
L'empreinte idiosyncrasique d'un échantillon peut être réalisé par une grille de substrats non-chromogéniques ou non-fluorogéniques si la réaction peut être suivie de manière indirecte, par exemple à l'aide d'un senseur, tel qu'une sonde thermographique, ou un senseur pH
ou pM. A titre d'exemple, on utilisera une grille composée d'esters pour obtenir l'empreinte d'échantillons de lipases et estérases en utilisant un indicateur pH pour la mesure.
Une série de dérivés d'acides aminés tels que les N-acyl acides aminés (20 N-acétyl acide aminés L naturels + 20 N
acétyl acide aminés D correspondants) servira avantageusement pour obtenir l'idiosyncrasique d'échantillon contenant des acylases en suivant la réaction à l'aide d'un senseur pM.
Exemple 4 Génération d'une empreinte à partir de plusieurs empreintes et sa représentation graphique en couleur.
Les exemples 5, 6 et 7 se rapportent à la combinaison de plusieurs empreintes dont le traitement génère une nouvelle empreinte graphique en couleurs permettant de visualiser des caractéristiques cumulées d'un échantillon. Cette méthode de visualisation des résultats permettant de cumuler au moins 2 mesures (2 signaux) pour créer une nouvelle donnée représentée sous forme d'une valeur spécifique. Cette valeur donne l'information sur une caractéristique de l'échantillon d'intérêt. Dans les exemples décrits, la valeur obtenue est traduite en une couleur spécifique.
28 Ainsi, il est possible d'apprécier la sélectivité d'un échantillon incluant sa stéréosélectivité, son énantiosélectivité, son activité en fonction du pH, son activité en fonction de la concentration de l'échantillon etc.... Le traitement des empreintes inclut une représentation en couleur de la nouvelle empreinte, qui, dans les exemples ci-après utilise le système RVB (Rouge, Vert, Bleu). Ainsi, dans l'exemple 5, pour l'énantiosélectivité d'un échantillon, on cumule les résultats obtenus de cet échantillon sur sa réaction avec les deux énantiomères (R) et (S) séparément. Dans l'exemple 5, on attribue la couleur verte à la sélectivité de l'échantillon pour l'énantiomère S et la couleur rouge pour l'énantiomère R.
Dans ces exemples, on associe à un triplet de valeurs une caractéristique représentée sous forme de couleur. Cependant, on peut imaginer un autre arrangement de valeurs auquel on associerait une caractéristique.
De manière générale, les empreintes sont obtenues à partir des valeurs de vitesse brutes diminuées du bruit de fond correspondant, et réduites à des valeurs entières comprises entre 0 (pas d'activité catalytique) et 255 (qui correspond à la valeur de vitesse maxïmale dans chaque empreinte, étape A représentée à la figure 6A). Ces entiers sont alors inversés entre 255 (luminosité maximale dans l'échelle des 256 couleurs) et 0 (luminosité
minimale), distribués dans les positions voulues et convertis en un fichier csv (coma separated values) dans Microsoft Excel (étape B représentée à la figure 6B) . Le fichier csv est transformé en un fichier ppm (portable pixel map) grâce au logiciel Bloc-Notes de Windows (étape C
représentée à la figure 6C) où chaque triplet de valeurs est converti en un carré de 1 pixel avec la couleur correspondante, et l'image obtenue ainsi est sauvée en tant que fichier bitmap en utilisant l'éditeur d'images JASC
Dans ces exemples, on associe à un triplet de valeurs une caractéristique représentée sous forme de couleur. Cependant, on peut imaginer un autre arrangement de valeurs auquel on associerait une caractéristique.
De manière générale, les empreintes sont obtenues à partir des valeurs de vitesse brutes diminuées du bruit de fond correspondant, et réduites à des valeurs entières comprises entre 0 (pas d'activité catalytique) et 255 (qui correspond à la valeur de vitesse maxïmale dans chaque empreinte, étape A représentée à la figure 6A). Ces entiers sont alors inversés entre 255 (luminosité maximale dans l'échelle des 256 couleurs) et 0 (luminosité
minimale), distribués dans les positions voulues et convertis en un fichier csv (coma separated values) dans Microsoft Excel (étape B représentée à la figure 6B) . Le fichier csv est transformé en un fichier ppm (portable pixel map) grâce au logiciel Bloc-Notes de Windows (étape C
représentée à la figure 6C) où chaque triplet de valeurs est converti en un carré de 1 pixel avec la couleur correspondante, et l'image obtenue ainsi est sauvée en tant que fichier bitmap en utilisant l'éditeur d'images JASC
29 Paint Shop Pro (étape D représentée à la figure 6D).
L'empreinte, étant composée de carrés de 1 pixel seulement, est donc non seulement de haute qualité, mais aussi très facile à exploitée dans un traitement informatique. Un exemple de traduction d'un triplet de valeurs en une couleur est présenté dans la figure 7, dans le cas du carré
en bas à gauche de l'empreinte.
La mise en a~uvre de ce traitement dans le cas de mesures catalytiques comprend .
1) Pour une caractéristique . la valeur est rapportée entre 0 et 255 par rapport à la valeur maximale obtenue, et répétée pour chaque paramètre du système RVB
(exemple 1).
2) Pour deux caractéristiques . chaque valeur peut être rapportée entre 0 et 255 par rapport au maximum de toutes les valeurs, ou chaque valeur d'une caractéristique normée par rapport à la valeur maximale de cette caractéristique ; les valeurs obtenues peuvent alors être distribuées dans l'un ou l'autre des paramètres du système RVB, le troisième paramètre étant obtenu par combinaison des deux autres (moyenne mathématique, maximum, minimum, etc...) (voir exemple 4 ) .
3) Pour trois caractéristiques . chaque valeur correspondant à une caractéristique est affectée à un paramètre du système RVB. Le choix de la correspondance n'aura un effet que sur les couleurs obtenues dans l'empreinte finale (composante majeure dans le rouge, le vert ou le bleu par exemple) (exemple 6).
4) Pour plus de trois caractéristiques, les valeurs obtenues devront être combinées mathématiquement afin de les réduire à au plus trois caractéristiques différentes dans le cas d'une représentation utilisant le système RVB.
5) Le traitement informatique des données brutes expérimentales permettant l'obtention de nombres entiers entre 0 et 255 peut se faire selon n'importe quelle formule mathématique. Le traitement le plus simple reste cependant la normation des valeurs brutes entre 0 et 1, l'extrapolation à un intervalle 0-255, puis l'arrondi des 5 valeurs en nombres entiers.
La normation entre 0 et 1 peut se faire en rapportant les valeurs brutes à un même nombre de référence (à leur valeur maximale par exemple), de manière générale sur les trois paramètres du système RVB. Elle peut aussi se 10 faire en modifiant le traitement mathématique selon le paramètre rouge, vert ou bleu, soit en changeant de nombre de référence, soit en distinguant les valeurs décimales des données brutes (les valeurs entre 0 et 10 pour le rouge, entre 10 et 100 pour le vert et entre 100 et 1000 pour le 15 bleu, par exemple), soit en distinguant les ordres de grandeur par une fonction logarithmique par exemple.
Exemple 5: Empreintes d'activités catalytiques idiosyncrasiques énantio- et stéréosélectives.
20 Les propriétés de stéréo- et d'énantiosélectivité des enzymes étant importantes dans les applications synthétiques, les signaux enregistrés dans l'exemple 1 sont combinés pour former une échelle de coloration du vert au rouge représentant la sélectivité de 25 l'échantillon.
Dans cette représentation, les paires énantiomériques et stéréoisomériques de substrats sont combinées en une seule position. Ces empreintes de sélectivité sont générées par combinaison des vitesses
L'empreinte, étant composée de carrés de 1 pixel seulement, est donc non seulement de haute qualité, mais aussi très facile à exploitée dans un traitement informatique. Un exemple de traduction d'un triplet de valeurs en une couleur est présenté dans la figure 7, dans le cas du carré
en bas à gauche de l'empreinte.
La mise en a~uvre de ce traitement dans le cas de mesures catalytiques comprend .
1) Pour une caractéristique . la valeur est rapportée entre 0 et 255 par rapport à la valeur maximale obtenue, et répétée pour chaque paramètre du système RVB
(exemple 1).
2) Pour deux caractéristiques . chaque valeur peut être rapportée entre 0 et 255 par rapport au maximum de toutes les valeurs, ou chaque valeur d'une caractéristique normée par rapport à la valeur maximale de cette caractéristique ; les valeurs obtenues peuvent alors être distribuées dans l'un ou l'autre des paramètres du système RVB, le troisième paramètre étant obtenu par combinaison des deux autres (moyenne mathématique, maximum, minimum, etc...) (voir exemple 4 ) .
3) Pour trois caractéristiques . chaque valeur correspondant à une caractéristique est affectée à un paramètre du système RVB. Le choix de la correspondance n'aura un effet que sur les couleurs obtenues dans l'empreinte finale (composante majeure dans le rouge, le vert ou le bleu par exemple) (exemple 6).
4) Pour plus de trois caractéristiques, les valeurs obtenues devront être combinées mathématiquement afin de les réduire à au plus trois caractéristiques différentes dans le cas d'une représentation utilisant le système RVB.
5) Le traitement informatique des données brutes expérimentales permettant l'obtention de nombres entiers entre 0 et 255 peut se faire selon n'importe quelle formule mathématique. Le traitement le plus simple reste cependant la normation des valeurs brutes entre 0 et 1, l'extrapolation à un intervalle 0-255, puis l'arrondi des 5 valeurs en nombres entiers.
La normation entre 0 et 1 peut se faire en rapportant les valeurs brutes à un même nombre de référence (à leur valeur maximale par exemple), de manière générale sur les trois paramètres du système RVB. Elle peut aussi se 10 faire en modifiant le traitement mathématique selon le paramètre rouge, vert ou bleu, soit en changeant de nombre de référence, soit en distinguant les valeurs décimales des données brutes (les valeurs entre 0 et 10 pour le rouge, entre 10 et 100 pour le vert et entre 100 et 1000 pour le 15 bleu, par exemple), soit en distinguant les ordres de grandeur par une fonction logarithmique par exemple.
Exemple 5: Empreintes d'activités catalytiques idiosyncrasiques énantio- et stéréosélectives.
20 Les propriétés de stéréo- et d'énantiosélectivité des enzymes étant importantes dans les applications synthétiques, les signaux enregistrés dans l'exemple 1 sont combinés pour former une échelle de coloration du vert au rouge représentant la sélectivité de 25 l'échantillon.
Dans cette représentation, les paires énantiomériques et stéréoisomériques de substrats sont combinées en une seule position. Ces empreintes de sélectivité sont générées par combinaison des vitesses
30 obtenues pour les substrats chromogéniques et fluorogéniques . dans le cas d'une paire énantiomérique, la vitesse obtenue pour l'énantiomère R est définie comme la valeur correspondant à la composante rouge du système RVB
(Rouge, Vert, Bleu) pour la définition informatique des couleurs, tandis que la vitesse obtenue pour l'énantiomère
(Rouge, Vert, Bleu) pour la définition informatique des couleurs, tandis que la vitesse obtenue pour l'énantiomère
31 S correspond à la composante verte. La composante bleue du système RVB est alors simplement définie comme la moyenne mathématique des deux autres composantes.
Les substrats racémiques et achiraux sont aussi représentés, mais en échelle de gris comme décrit dans l'exemple 1, afin d'obtenir une grille de substrats rassemblant tous les substrats décrits dans l'exemple 1.
Les substrats sont disposés sous la forme du tableau 2 ci-dessous de 5 lignes et 6 colonnes, où la numérotation se réfère aux figures 1a et 1b.
m-1-1 ..__ n A B C D E F
1 A1 B1 B'3 C1 D1 B'4 2 A2/A3 A'1/A'2 E2/E3 C2/C3 E1/F1 G2 3 B2/B3 B'1/B'2 F2/F3 D2/D3 G1 C'1/C'2 A4/A5 A'3/A'4 G4/G5 B4/B5 H1/H2 G3 5 C4/C5 D4/D5 E4 E5/F4 H3/H4 Ref La clé des couleurs, représentée figure 8, indique la proportionnalité de la teinte avec la sélectivité, et de l'intensité avec la vitesse de réaction.
L'empreinte catalytique idiosyncrasique de sélectivité des signaux générés est ensuite affichée ainsi que la valeur de la vitesse maximum apparente en pM/s.
Les empreintes obtenues par combinaison des résultats cités dans l'exemple 1 sont représentées figure 9. Les codes des différents échantillons testés par empreinte sont décrits dans le tableau 1.
Ces différentes empreintes permettent de mettre en évidence, par une simple analyse visuelle, les propriétés de stéréo- et/ou d'énantiosélectivité des différents échantillons. Par exemple, les échantillons notés PFL et WGL, qui présentent des empreintes d'activité
similaires, montrent des empreintes de sélectivité
opposées. La sélectivité d'un échantillon peut varier aussi
Les substrats racémiques et achiraux sont aussi représentés, mais en échelle de gris comme décrit dans l'exemple 1, afin d'obtenir une grille de substrats rassemblant tous les substrats décrits dans l'exemple 1.
Les substrats sont disposés sous la forme du tableau 2 ci-dessous de 5 lignes et 6 colonnes, où la numérotation se réfère aux figures 1a et 1b.
m-1-1 ..__ n A B C D E F
1 A1 B1 B'3 C1 D1 B'4 2 A2/A3 A'1/A'2 E2/E3 C2/C3 E1/F1 G2 3 B2/B3 B'1/B'2 F2/F3 D2/D3 G1 C'1/C'2 A4/A5 A'3/A'4 G4/G5 B4/B5 H1/H2 G3 5 C4/C5 D4/D5 E4 E5/F4 H3/H4 Ref La clé des couleurs, représentée figure 8, indique la proportionnalité de la teinte avec la sélectivité, et de l'intensité avec la vitesse de réaction.
L'empreinte catalytique idiosyncrasique de sélectivité des signaux générés est ensuite affichée ainsi que la valeur de la vitesse maximum apparente en pM/s.
Les empreintes obtenues par combinaison des résultats cités dans l'exemple 1 sont représentées figure 9. Les codes des différents échantillons testés par empreinte sont décrits dans le tableau 1.
Ces différentes empreintes permettent de mettre en évidence, par une simple analyse visuelle, les propriétés de stéréo- et/ou d'énantiosélectivité des différents échantillons. Par exemple, les échantillons notés PFL et WGL, qui présentent des empreintes d'activité
similaires, montrent des empreintes de sélectivité
opposées. La sélectivité d'un échantillon peut varier aussi
32 d'un substrat à un autre, comme dans le cas de l'échantillon PRL où les résultats sont opposés pour les substrats situés en positions C2 et C3 du tableau 2.
Exemple 6: Empreintes d'activités catalytiques idiosyncrasiques à différents pH.
Des empreintes d'activités catalytiques idiosyncrasiques traduisant différentes conditions expérimentales de capture des signaux peuvent être générées par exemple en combinant les mesures effectuées à
différentes valeurs de pH sur une même grille de substrats phosphatases.
1) Les différents substrats fluorogéniques, représentés sur la figure 10, sont testés séparément dans des puits de plaques de microtitration, en présence de 4 phosphatases différentes décrites dans le tableau 3, aux pH
2.5, 4.5, 5.5 et 6.5, dans les conditions décrites dans l'exemple 1.
2) Le pH de la solution de mesure est ensuite ajusté à 9, l'agent révélateur est ajouté (NaI04 1 mM, BSA
2 mg/ml), et les résultats enregistrés après 1 heure.
3) Les valeurs de fluorescence ou d'absorbance sont ensuite converties en concentrations de produit formé
(umbelliférone ou 4-nitrophénol), et ces valeurs de conversion sont rapportées à des niveaux de gris allant du blanc (pas de conversion) au noir (conversion maximale pour un échantillon sur l'ensemble des mesures effectuées).
Les empreintes idiosyncrasiques obtenues, ainsi que les pourcentages de conversion maximale, sont représentées sur la figure 11. Dans ce cas, l'activité de l'échantillon, qui dépend du pH, donne des résultats différents selon le substrat et le pH. La combinaison de toutes les données permet alors d'obtenir une empreinte spécifique de l'échantillon selon son activité à
différentes valeurs de pH.
Exemple 6: Empreintes d'activités catalytiques idiosyncrasiques à différents pH.
Des empreintes d'activités catalytiques idiosyncrasiques traduisant différentes conditions expérimentales de capture des signaux peuvent être générées par exemple en combinant les mesures effectuées à
différentes valeurs de pH sur une même grille de substrats phosphatases.
1) Les différents substrats fluorogéniques, représentés sur la figure 10, sont testés séparément dans des puits de plaques de microtitration, en présence de 4 phosphatases différentes décrites dans le tableau 3, aux pH
2.5, 4.5, 5.5 et 6.5, dans les conditions décrites dans l'exemple 1.
2) Le pH de la solution de mesure est ensuite ajusté à 9, l'agent révélateur est ajouté (NaI04 1 mM, BSA
2 mg/ml), et les résultats enregistrés après 1 heure.
3) Les valeurs de fluorescence ou d'absorbance sont ensuite converties en concentrations de produit formé
(umbelliférone ou 4-nitrophénol), et ces valeurs de conversion sont rapportées à des niveaux de gris allant du blanc (pas de conversion) au noir (conversion maximale pour un échantillon sur l'ensemble des mesures effectuées).
Les empreintes idiosyncrasiques obtenues, ainsi que les pourcentages de conversion maximale, sont représentées sur la figure 11. Dans ce cas, l'activité de l'échantillon, qui dépend du pH, donne des résultats différents selon le substrat et le pH. La combinaison de toutes les données permet alors d'obtenir une empreinte spécifique de l'échantillon selon son activité à
différentes valeurs de pH.
33 m..'L.'1 ..-, ....
CIAP Phosphatase alcaline de muqueuse 1.4 U/mg intestinale de veau A. f. Phytase d'Aspergillus ficuum 3.5 U/mg Novo Phytase Novo -Natuphos Phytase Natuphos -Exemple 7: Empreintes d'activités catalvtiaues idiosyncrasiques à différentes concentrations d'échantillon.
Des empreintes d'activités catalytiques idiosyncrasiques combinant les activités de l'échantillon à
différentes concentrations peuvent de même être générées en combinant par exemple les mesures d'activités lipasiques de plusieurs échantillons sur une même grille de substrats, pour 3 concentrations différentes de l'échantillon.
Les conditions expérimentales de capture des signaux sont les mêmes que celles décrites dans l'exemple 1, pour une série de substrats chromophores (figure 12).
Simplement la concentration de l'échantillon ajouté à la solution est modifiée, de telle sorte que dans l'exemple présent, la concentration finale de l'échantillon est de 100, 10 ou 1 microg/ml.
Les substrats sont disposés dans les puits de plaques de microtitration, selon l'agencement illustré
figure 12. Les vitesses de réaction obtenues dans chaque cas sont enregistrées, puis distribuées selon l'ordre suivant .
1) les vitesses obtenues pour une concentration de 100 microg/ml sont définies comme la composante rouge du système RVB, la vitesse maximale obtenue pour l'échantillon sur la grille entière correspondant à l'intensité maximale de rouge, 2) les vitesses obtenues pour une concentration de 10 microg/ml sont définies comme la composante verte du
CIAP Phosphatase alcaline de muqueuse 1.4 U/mg intestinale de veau A. f. Phytase d'Aspergillus ficuum 3.5 U/mg Novo Phytase Novo -Natuphos Phytase Natuphos -Exemple 7: Empreintes d'activités catalvtiaues idiosyncrasiques à différentes concentrations d'échantillon.
Des empreintes d'activités catalytiques idiosyncrasiques combinant les activités de l'échantillon à
différentes concentrations peuvent de même être générées en combinant par exemple les mesures d'activités lipasiques de plusieurs échantillons sur une même grille de substrats, pour 3 concentrations différentes de l'échantillon.
Les conditions expérimentales de capture des signaux sont les mêmes que celles décrites dans l'exemple 1, pour une série de substrats chromophores (figure 12).
Simplement la concentration de l'échantillon ajouté à la solution est modifiée, de telle sorte que dans l'exemple présent, la concentration finale de l'échantillon est de 100, 10 ou 1 microg/ml.
Les substrats sont disposés dans les puits de plaques de microtitration, selon l'agencement illustré
figure 12. Les vitesses de réaction obtenues dans chaque cas sont enregistrées, puis distribuées selon l'ordre suivant .
1) les vitesses obtenues pour une concentration de 100 microg/ml sont définies comme la composante rouge du système RVB, la vitesse maximale obtenue pour l'échantillon sur la grille entière correspondant à l'intensité maximale de rouge, 2) les vitesses obtenues pour une concentration de 10 microg/ml sont définies comme la composante verte du
34 système RVB, la vitesse maximale obtenue pour l'échantillon sur la grille entière correspondant à l'intensité maximale de vert, 3) les vitesses obtenues pour une concentration de 1 microg/ml sont définies comme la composante bleue du système RVB, la vitesse maximale obtenue pour l'échantillon sur la grille entière correspondant à l'intensité maximale de bleu.
Les empreintes idiosyncrasiques obtenues sont représentées sur la figure 13. Sous chaque empreinte sont aussi reportées les valeurs des vitesses maximales obtenues sur la grille de substrats, à chaque concentration, et dans l'ordre suivant . 100, 10 et 1 microg/ml.
Les résultats obtenus selon ce traitement permettent de mettre en évidence l'activité de chaque échantillon selon sa concentration, par rapport à une même grille de substrats.
De manière visuelle, ces empreintes montrent la tendance de l'activité catalytique en fonction de la dilution du catalyseur, selon le code de couleur représenté
sur la figure 14 établi selon l'exemple 4, pour chaque substrat. Par ailleurs ces mêmes empreintes donnent une idée de l'ordre de grandeur de l'activité catalytique selon l'intensité de la couleur obtenue.
Une autre solution consiste à vouloir obtenir une visualisation de l'activité catalytique de l'échantillon en fonction de sa dilution, mais d'une manière générale sur toute la grille, en tenant compte uniquement de la vitesse maximale obtenue sur l'ensemble des mesures effectuées avec cet échantillon. Les empreintes obtenues ainsi (figure 15) permettent toujours de visualiser la tendance de l'activité en fonction de la concentration, mais en focalisant la perception sur les substrats les plus actifs.
Enfin ce même traitement peut être effectué, mais en tronquant les résultats obtenus pour les meilleurs substrats en écrasant les valeurs supérieures à 25000 pM/s, qui sont ramenées à la couleur noire (figure 16). Ainsi les 5 observations sont identiques que dans le cas de la figure 15, mais en élargissant l'échelle de.graduation des couleurs pour les faibles vitesses (de 0 à 25000 au lieu de 0 à Vmax).
10 Exemple 8 Réalisation d'empreinte d'activités catalytiques idiosyncrasiques à partir d'un mélange de c"~,c+-r~~-c On peut également réaliser une empreinte en mesurant la réaction de chaque substrat dans une série de 15 substrats différents qu'on met en contact avec l'échantillon sous forme de mélange. On analyse ensuite la réaction par HPLC après un temps de conversion donné.
L'analyse est particulièrement simple si tous les produits formés par la réaction des différents substrats sont 20 facilement séparable et visualisable par HPLC. Par exemple, la plupart des dérivés 1,2-diol ou 1,2-aminoalcohol sont facilement séparables par HPLC, et tous ces dérivés produisent un signal intense et spécifique, soit la fluorescence à 440 nm, soit l'absorbance W 325 nm, ce qui 25 facilite leur détection par HPLC. Le schéma 1 montre une série possible de diols. Le schéma 2 montre la séparation des cinq diols par RP-HPLC (Reverse phase HPLC). La réaction testée est la formation de ces produits à partir de divers substrats, qui sont choisis pour apparaître à des 30 temps de rétention différents sur l'analyse HPLC.
La figure 17 donne un exemple d'une série de 1,2-diols de structure diverse et analysable par HPLC.
La figure 18 représente la trace HPLC d'un mélange de cinq diols dans les conditions isocratiques
Les empreintes idiosyncrasiques obtenues sont représentées sur la figure 13. Sous chaque empreinte sont aussi reportées les valeurs des vitesses maximales obtenues sur la grille de substrats, à chaque concentration, et dans l'ordre suivant . 100, 10 et 1 microg/ml.
Les résultats obtenus selon ce traitement permettent de mettre en évidence l'activité de chaque échantillon selon sa concentration, par rapport à une même grille de substrats.
De manière visuelle, ces empreintes montrent la tendance de l'activité catalytique en fonction de la dilution du catalyseur, selon le code de couleur représenté
sur la figure 14 établi selon l'exemple 4, pour chaque substrat. Par ailleurs ces mêmes empreintes donnent une idée de l'ordre de grandeur de l'activité catalytique selon l'intensité de la couleur obtenue.
Une autre solution consiste à vouloir obtenir une visualisation de l'activité catalytique de l'échantillon en fonction de sa dilution, mais d'une manière générale sur toute la grille, en tenant compte uniquement de la vitesse maximale obtenue sur l'ensemble des mesures effectuées avec cet échantillon. Les empreintes obtenues ainsi (figure 15) permettent toujours de visualiser la tendance de l'activité en fonction de la concentration, mais en focalisant la perception sur les substrats les plus actifs.
Enfin ce même traitement peut être effectué, mais en tronquant les résultats obtenus pour les meilleurs substrats en écrasant les valeurs supérieures à 25000 pM/s, qui sont ramenées à la couleur noire (figure 16). Ainsi les 5 observations sont identiques que dans le cas de la figure 15, mais en élargissant l'échelle de.graduation des couleurs pour les faibles vitesses (de 0 à 25000 au lieu de 0 à Vmax).
10 Exemple 8 Réalisation d'empreinte d'activités catalytiques idiosyncrasiques à partir d'un mélange de c"~,c+-r~~-c On peut également réaliser une empreinte en mesurant la réaction de chaque substrat dans une série de 15 substrats différents qu'on met en contact avec l'échantillon sous forme de mélange. On analyse ensuite la réaction par HPLC après un temps de conversion donné.
L'analyse est particulièrement simple si tous les produits formés par la réaction des différents substrats sont 20 facilement séparable et visualisable par HPLC. Par exemple, la plupart des dérivés 1,2-diol ou 1,2-aminoalcohol sont facilement séparables par HPLC, et tous ces dérivés produisent un signal intense et spécifique, soit la fluorescence à 440 nm, soit l'absorbance W 325 nm, ce qui 25 facilite leur détection par HPLC. Le schéma 1 montre une série possible de diols. Le schéma 2 montre la séparation des cinq diols par RP-HPLC (Reverse phase HPLC). La réaction testée est la formation de ces produits à partir de divers substrats, qui sont choisis pour apparaître à des 30 temps de rétention différents sur l'analyse HPLC.
La figure 17 donne un exemple d'une série de 1,2-diols de structure diverse et analysable par HPLC.
La figure 18 représente la trace HPLC d'un mélange de cinq diols dans les conditions isocratiques
35 suivantes . 60% (CH3CN/H~O 1 : 1) / 40% (0, 1% TFA DANS H20) .
36 L'empreinte par mélange se fait par analyse de la réaction d'au moins un mélange de substrats avec l'échantillon de la manière suivante:
- on met l'échantillon en contact avec le mélange des substrats;
- après un temps de réaction donné, on analyse la quantité de chaque produit formé par intégration des pics HPLC des produits;
- on compose l'empreinte à partir des quantités de produits formés.
Les mélanges de substrats comportent entre deux et une centaine de substrats, voir un millier de substrats.
Chaque substrat est présent dans une concentration comprise entre 10 et 200 microM, tout particulièrement 20-50 microM.
On peut par exemple utiliser le mélange de trois paires d'acétates pseudo-énantiomériques 10/11, 12/13, et 14/15 représentés à la figure 19. La réaction du mélange donne lieu à la formation ou non de six produits de type 1,2-diol qui donnent chacun un pic HPLC différent. On réalise ainsi une empreinte simple d'activité d'estérase sur des acétates.
Dans une seconde mise en oeuvre, on peut s'intéresser à l'activité estérolytique en fonction de la nature de la partie acide carboxylique ET de la partie alcohol. Par exemple, la série des 10 substrats esters/carbonates 16-25 représentés à la figures 20 peut être utilisée en mélange équimolaire pour mesurer l'empreinte estérasique d'un échantillon. Chaque substrat engagé donne par hydrolyse un produit de type diol identifiable dans le mélange par analyse HPLC.
Le concept peut être utilisé de manière générale en utilisant une variété de groupes fonctionnels.
Les variétés structurales sur le produit qu'on analyse par HPLC sont multiples, comme par exemple avec les produits 26-31 représentés à la figure 21. On peut réaliser un
- on met l'échantillon en contact avec le mélange des substrats;
- après un temps de réaction donné, on analyse la quantité de chaque produit formé par intégration des pics HPLC des produits;
- on compose l'empreinte à partir des quantités de produits formés.
Les mélanges de substrats comportent entre deux et une centaine de substrats, voir un millier de substrats.
Chaque substrat est présent dans une concentration comprise entre 10 et 200 microM, tout particulièrement 20-50 microM.
On peut par exemple utiliser le mélange de trois paires d'acétates pseudo-énantiomériques 10/11, 12/13, et 14/15 représentés à la figure 19. La réaction du mélange donne lieu à la formation ou non de six produits de type 1,2-diol qui donnent chacun un pic HPLC différent. On réalise ainsi une empreinte simple d'activité d'estérase sur des acétates.
Dans une seconde mise en oeuvre, on peut s'intéresser à l'activité estérolytique en fonction de la nature de la partie acide carboxylique ET de la partie alcohol. Par exemple, la série des 10 substrats esters/carbonates 16-25 représentés à la figures 20 peut être utilisée en mélange équimolaire pour mesurer l'empreinte estérasique d'un échantillon. Chaque substrat engagé donne par hydrolyse un produit de type diol identifiable dans le mélange par analyse HPLC.
Le concept peut être utilisé de manière générale en utilisant une variété de groupes fonctionnels.
Les variétés structurales sur le produit qu'on analyse par HPLC sont multiples, comme par exemple avec les produits 26-31 représentés à la figure 21. On peut réaliser un
37 mélange de substrats avec des groupements divers, tel que amide, époxide, ester, carbonate, phosphate, sulfate, époxide, oléfine, etc.
De manière générale, on peut appliquer la méthode pour toute série de substrats qui donnent en correspondance unique une série de produits correspondants analysables par séparation analytique (GC (chromatographie gaz, HPLC, MS, RMN (résonance magnétique nucléaure)).
Exemple 9 Empreintes d'activités catalytiques idiosyncrasiaues obtenues après analyse HPLC.
Une série de quatre substrats de type acétate ester, 1, 3, 5 et 7 (Figure 22) est utilisée en mélange équimolaire à une concentration de 0.1 mM de chaque substrat. L'enzyme (0,05 mg/ml) est incubé avec le mélange de substrats à 25°C pendant une heure dans du tampon phosphate pH 7.4 contenant 1 mg/ml de BSA. Les produits de type diol 2, 4, 6, 8 formés par la réaction d'hydrolyse enzymatique sont analysés et quantifiés par RP-HPLC
(Reversed-phase HPLC. C18, Vydac 218-TP54, 0.5 x 22 cm, 1.5 ml/min, gradient eau/acétonitrile). Les produits de départ ne sont pas visibles dans les conditions d'analyse choisies. Cette analyse permet d'identifier l'enzyme par un spectre unique de concentration relative de produits formés. Les spectres obtenus sont reproductibles et caractéristiques des enzymes utilisés. Les quatres pics représentent donc les concentrations relatives des quatre produits 2, 8, 4 et 6, dans leur ordre d'élution (Figure 23). Les spectres HPLC obtenus sont ensuite représentés sous forme de grille de quatre carrés (Figure 24). Ainsi, la surface du pic obtenu pour chacun des quatre produits est convertie en carré teinté en échelle de gris.
De manière générale, on peut appliquer la méthode pour toute série de substrats qui donnent en correspondance unique une série de produits correspondants analysables par séparation analytique (GC (chromatographie gaz, HPLC, MS, RMN (résonance magnétique nucléaure)).
Exemple 9 Empreintes d'activités catalytiques idiosyncrasiaues obtenues après analyse HPLC.
Une série de quatre substrats de type acétate ester, 1, 3, 5 et 7 (Figure 22) est utilisée en mélange équimolaire à une concentration de 0.1 mM de chaque substrat. L'enzyme (0,05 mg/ml) est incubé avec le mélange de substrats à 25°C pendant une heure dans du tampon phosphate pH 7.4 contenant 1 mg/ml de BSA. Les produits de type diol 2, 4, 6, 8 formés par la réaction d'hydrolyse enzymatique sont analysés et quantifiés par RP-HPLC
(Reversed-phase HPLC. C18, Vydac 218-TP54, 0.5 x 22 cm, 1.5 ml/min, gradient eau/acétonitrile). Les produits de départ ne sont pas visibles dans les conditions d'analyse choisies. Cette analyse permet d'identifier l'enzyme par un spectre unique de concentration relative de produits formés. Les spectres obtenus sont reproductibles et caractéristiques des enzymes utilisés. Les quatres pics représentent donc les concentrations relatives des quatre produits 2, 8, 4 et 6, dans leur ordre d'élution (Figure 23). Les spectres HPLC obtenus sont ensuite représentés sous forme de grille de quatre carrés (Figure 24). Ainsi, la surface du pic obtenu pour chacun des quatre produits est convertie en carré teinté en échelle de gris.
Claims (30)
1) Procédé pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, caractérisé en ce qu'il Comprend les étapes suivantes :
a) on met en contact l'échantillon susceptible de posséder l'activité catalytique avec un ensemble de substrats, b) on capture les signaux générés après ladite mise en contact.
a) on met en contact l'échantillon susceptible de posséder l'activité catalytique avec un ensemble de substrats, b) on capture les signaux générés après ladite mise en contact.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape (a) les substrats sont ordonnés.
3) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape (a) les substrats sont sous forme de mélange.
4) Procédé selon l'une des revendications 1 à
3, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), on capture les signaux de façon ordonnée.
3, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), on capture les signaux de façon ordonnée.
5) Procédé selon l'une des revendications 1 à
4, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), les signaux générés après ladite mise en contact sont capturés en utilisant une technique séparative comme l'HPLC.
4, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), les signaux générés après ladite mise en contact sont capturés en utilisant une technique séparative comme l'HPLC.
6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que chaque substrat comporte au moins un groupe fonctionnel sensible à la présence d'une activité catalytique d'un échantillon et permet la génération d'un signal de manière directe ou indirecte.
7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'après la capture des signaux, on réalise un traitement de ceux-ci consistant à affecter à chaque signal une valeur numérique constituant une composante d'une représentation graphique, par exemple une représentation en couleurs, de l'empreinte idiosyncrasique.
8) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'après la capture des signaux, on réalise un traitement de ceux-ci consistant à affecter à chaque signal une valeur numérique, puis à associer par groupe d'au moins deux valeurs, les valeurs numériques issues d'un même ensemble de substrats ou de plusieurs ensembles de substrats, et d'affecter à chaque groupe une valeur numérique constituant une composante d'une représentation graphique par exemple une représentation en couleurs, d'une empreinte idiosyncrasique.
9) Procédé selon l'une des revendications 6 à
8, caractérisé en ce que chaque substrat comprend un groupement chimique susceptible de lui conférer une spécificité pour une activité définie par le groupe fonctionnel.
8, caractérisé en ce que chaque substrat comprend un groupement chimique susceptible de lui conférer une spécificité pour une activité définie par le groupe fonctionnel.
10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que les groupements chimiques capables de conférer au substrat une spécificité pour une activité
définie par le groupe fonctionnel sont constitués par des variations de substitution.
définie par le groupe fonctionnel sont constitués par des variations de substitution.
11) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les signaux générés par la mise en contact des substrats avec l'échantillon peuvent être mesurés sur le même type de capteur.
12) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les signaux générés par la mise en contact des substrats avec l'échantillon sont de même type.
13) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les substrats sont capables de réagir sur un temps de réaction court, par exemple inférieur à 2 heures, préférentiellement inférieur à 20 minutes.
14) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les substrats sont peu ou pas sensibles à la dégradation ou aux activités non-spécifiques.
15) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les activités catalytiques de l'échantillon sont inconnues.
16) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'activité catalytique de l'échantillon correspond â au moins une enzyme ou un mélange d'enzymes.
17) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que les substrats sont choisis parmi ceux répondant à l'une des formules (I) à (V) suivantes.
dans lesquelles:
- la liaison C1-C2 est insensible à une coupure par une réaction d'oxydation chimique, - Di représente le précurseur d'un produit détectable, - X et Y, identiques ou différents, sont choisis parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, une amine de formule -NR11R12, R11 est choisi parmi : un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, un groupe aryle, substitués ou non, et R12 n'est pas un atome d'hydrogène, - R1 à R3, identiques ou différents sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou non ou un groupement chimique comme défini précédemment, - P1 et P2, identiques ou différents sont des groupes fonctionnels comme définis précédemment, et au plus un des groupes P1 et P2 est un atome d'hydrogène, - P3 est choisi parmi un groupe carbonyle, un groupe -PO2R11 ou un groupe R11PO-, où R11 présente la même signification que précédemment, un groupe -SO2, un groupe -CHOR13 où R13 représente un groupe aryle, alkyle ou glycosyle, un groupe SiR14R15 où R14 et R15, identiques ou différents, représentent un groupe aryle, alkyle, aryloxy ou alcoxy et un groupe AsO2H-, - G est choisi parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, un groupe amine de formule NR13 où R13 est R11 ou R12, Rll et Rl2 ayant la même signification que ci-dessus, et en ce que lesdits substrats de formules (I) à (V) sont transformés par l'échantillon en des produits qui vont être oxydés pour obtenir de manière directe ou indirecte un composé détectable correspondant à un ou plusieurs composés susceptibles de présenter seuls ou en combinaison une ou plusieurs variations de leurs propriétés biophysiques, biologiques ou chimiques avant et après l'étape d'oxydation.
dans lesquelles:
- la liaison C1-C2 est insensible à une coupure par une réaction d'oxydation chimique, - Di représente le précurseur d'un produit détectable, - X et Y, identiques ou différents, sont choisis parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, une amine de formule -NR11R12, R11 est choisi parmi : un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, un groupe aryle, substitués ou non, et R12 n'est pas un atome d'hydrogène, - R1 à R3, identiques ou différents sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou non ou un groupement chimique comme défini précédemment, - P1 et P2, identiques ou différents sont des groupes fonctionnels comme définis précédemment, et au plus un des groupes P1 et P2 est un atome d'hydrogène, - P3 est choisi parmi un groupe carbonyle, un groupe -PO2R11 ou un groupe R11PO-, où R11 présente la même signification que précédemment, un groupe -SO2, un groupe -CHOR13 où R13 représente un groupe aryle, alkyle ou glycosyle, un groupe SiR14R15 où R14 et R15, identiques ou différents, représentent un groupe aryle, alkyle, aryloxy ou alcoxy et un groupe AsO2H-, - G est choisi parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, un groupe amine de formule NR13 où R13 est R11 ou R12, Rll et Rl2 ayant la même signification que ci-dessus, et en ce que lesdits substrats de formules (I) à (V) sont transformés par l'échantillon en des produits qui vont être oxydés pour obtenir de manière directe ou indirecte un composé détectable correspondant à un ou plusieurs composés susceptibles de présenter seuls ou en combinaison une ou plusieurs variations de leurs propriétés biophysiques, biologiques ou chimiques avant et après l'étape d'oxydation.
18) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que les substrats (S) sont choisis parmi ceux dont la transformation en produit (P) peut être détectée en mesurant un changement de pM résultant de la différence de pouvoir chélatant du substrat (S) et du produit (P) vis-à-vis d'un ion métallique, et en ce que la transformation d'un substrat (S) en un produit (P) est effectuée en mesurant le changement des propriétés spectrales d'un détecteur chimique (L), chélateur d'un ion métallique, résultant d'échanges d'ions métalliques selon l'équilibre suivant .
ML~ (MP et/ou MS) + L
où:
S représente un substrat, qui peut être toute molécule chimique, dont le pouvoir chélatant est différent de celui du produit résultant de la transformation chimique du substrat. I1 s'agit notamment de substrat spécifique, comme l'acide phytique pour les phytases ou des protéines entières pour les protéases. Ce substrat peut présenter des propriétés énantiosélectives. Les substrats n'ont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir une différence de pouvoir chélatant avec les produits correspondants.
P représente le produit issu de la transformation chimique de S et présentant un pouvoir chélateur différent de S. Comme les substrats, les produits n'ont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir une différence de pouvoir chélatant avec les substrats correspondants.
L représente un détecteur chimique, aussi désigné « sensor pM », correspondant à tout ligand capable de chélater les ions métalliques en solution tel que la chélation du métal par le détecteur chimique donne un changement de pM mesurable par toute méthode appropriée comme par exemple un changement de propriété spectrale du détecteur. Le sensor pM possède un pouvoir chélatant tel qu'il puisse y avoir des échanges d'ions métalliques entre le produit (P) et le ligand (L) ou le substrat (S) et le ligand (L) selon respectivement que le produit (P) ou le substrat (S) possède le pouvoir chélatant le plus fort.
Comme indiqué précédemment, le pouvoir chélatant du détecteur chimique (L) est avantageusement supérieur à
celui du substrat (S) ou du produit (P) de façon à réaliser la méthode de l'invention avec des quantités faibles de détecteurs chimiques. Le détecteur chimique (L) peut correspondre â un dérivé de fluorescéine ou tout autre noyau fluorescent substitué par un groupement chélatant.
ML représente le complexe métal-ligand présentant des propriétés spectrales différentes de L.
MS représente le complexe métal-substrat.
MP représente le complexe métal-produit.
ML~ (MP et/ou MS) + L
où:
S représente un substrat, qui peut être toute molécule chimique, dont le pouvoir chélatant est différent de celui du produit résultant de la transformation chimique du substrat. I1 s'agit notamment de substrat spécifique, comme l'acide phytique pour les phytases ou des protéines entières pour les protéases. Ce substrat peut présenter des propriétés énantiosélectives. Les substrats n'ont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir une différence de pouvoir chélatant avec les produits correspondants.
P représente le produit issu de la transformation chimique de S et présentant un pouvoir chélateur différent de S. Comme les substrats, les produits n'ont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir une différence de pouvoir chélatant avec les substrats correspondants.
L représente un détecteur chimique, aussi désigné « sensor pM », correspondant à tout ligand capable de chélater les ions métalliques en solution tel que la chélation du métal par le détecteur chimique donne un changement de pM mesurable par toute méthode appropriée comme par exemple un changement de propriété spectrale du détecteur. Le sensor pM possède un pouvoir chélatant tel qu'il puisse y avoir des échanges d'ions métalliques entre le produit (P) et le ligand (L) ou le substrat (S) et le ligand (L) selon respectivement que le produit (P) ou le substrat (S) possède le pouvoir chélatant le plus fort.
Comme indiqué précédemment, le pouvoir chélatant du détecteur chimique (L) est avantageusement supérieur à
celui du substrat (S) ou du produit (P) de façon à réaliser la méthode de l'invention avec des quantités faibles de détecteurs chimiques. Le détecteur chimique (L) peut correspondre â un dérivé de fluorescéine ou tout autre noyau fluorescent substitué par un groupement chélatant.
ML représente le complexe métal-ligand présentant des propriétés spectrales différentes de L.
MS représente le complexe métal-substrat.
MP représente le complexe métal-produit.
19) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le nombre de substrats est avantageusement d'au plus 1000.
20) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le nombre de substrats est de l'ordre de 1 à 200.
21) Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 16, caractérisé en ce que les substrats possèdent des groupes fonctionnels différents.
22) Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 21, caractérisé en ce que les substrats possèdent des groupements chimiques différents.
23) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'après la capture des signaux générés par un échantillon, on effectue une analyse de l'empreinte catalytique idiosyncrasique.
24) Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que ladite analyse consiste à
caractériser ou à effectuer un suivi de l'évolution de l'échantillon.
caractériser ou à effectuer un suivi de l'évolution de l'échantillon.
25) Procédé selon l'une des revendications 23 ou 24, caractérisé en ce que ladite analyse comprend la comparaison de l'empreinte catalytique idiosyncrasique obtenue avec une autre empreinte catalytique idiosyncrasique.
26) Application d'un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes au contrôle qualité.
27) Un ensemble de substrat comme défini dans l'une quelconque des revendications 6 à 22.
28) Un ensemble d'empreintes catalytiques idiosyncrasiques constituant une base de données obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 25.
29) Un système pour la mise en ouvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 25, caractérisé en ce qu'il comprend un support sur lequel sont ordonnés plusieurs substrats et un ou plusieurs accessoires suivants :
- un dispositif pour commander la mise en contact de l'échantillon avec au moins un substrat, - des capteurs pour mesurer les signaux générés à partir de la transformation des substrats par l'échantillon, - un premier analyseur permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, - une mémoire permettant de stocker dans une base de données les empreintes catalytiques idiosyncrasiques originales, - un second analyseur permettant la superposition entre l'empreinte catalytique idiosyncrasique nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées dans la mémoire.
- un dispositif pour commander la mise en contact de l'échantillon avec au moins un substrat, - des capteurs pour mesurer les signaux générés à partir de la transformation des substrats par l'échantillon, - un premier analyseur permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, - une mémoire permettant de stocker dans une base de données les empreintes catalytiques idiosyncrasiques originales, - un second analyseur permettant la superposition entre l'empreinte catalytique idiosyncrasique nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées dans la mémoire.
30) Un système pour la mise en ouvre d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 25, caractérisé en ce qu'il comprend un mélange de substrats et un ou plusieurs accessoires suivants :
- un dispositif pour commander la mise en contact de l'échantillon avec au moins un substrat, - des capteurs pour séparer et mesurer les signaux générés à partir de la transformation des substrats par l'échantillon, - un premier analyseur permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, - une mémoire permettant de stocker dans une base de données les empreintes catalytiques idiosyncrasiques originales, - un second analyseur permettant la superposition entre l'empreinte catalytique idiosyncrasique nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées dans la mémoire.
- un dispositif pour commander la mise en contact de l'échantillon avec au moins un substrat, - des capteurs pour séparer et mesurer les signaux générés à partir de la transformation des substrats par l'échantillon, - un premier analyseur permettant de générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, - une mémoire permettant de stocker dans une base de données les empreintes catalytiques idiosyncrasiques originales, - un second analyseur permettant la superposition entre l'empreinte catalytique idiosyncrasique nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées dans la mémoire.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR01/14462 | 2001-11-08 | ||
| FR0114462A FR2831888A1 (fr) | 2001-11-08 | 2001-11-08 | Procede pour generer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un echantillon et les systemes pour sa mise en oeuvre |
| FR02/08633 | 2002-07-09 | ||
| FR0208633A FR2831889B1 (fr) | 2001-11-08 | 2002-07-09 | Procede pour generer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un echantillon, le traitement de ladite empreinte et les systemes pour leur mise en oeuvre |
| PCT/FR2002/003827 WO2003040405A1 (fr) | 2001-11-08 | 2002-11-07 | Procede pour generer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un echantillon, le traitement de ladite empreinte et les systemes pour leur mise en oeuvre |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2466421A1 true CA2466421A1 (fr) | 2003-05-15 |
Family
ID=26213253
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002466421A Abandoned CA2466421A1 (fr) | 2001-11-08 | 2002-11-07 | Procede pour generer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un echantillon, le traitement de ladite empreinte et les systemes pour leur mise en oeuvre |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7258972B2 (fr) |
| EP (1) | EP1442130A1 (fr) |
| CA (1) | CA2466421A1 (fr) |
| FR (1) | FR2831889B1 (fr) |
| WO (1) | WO2003040405A1 (fr) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2497560A1 (fr) * | 2002-09-20 | 2004-04-01 | Promega Corporation | Procedes fondes sur la luminescence et sondes permettant de mesurer l'activite du cytochrome p450 |
| US20060246699A1 (en) * | 2005-03-18 | 2006-11-02 | Weidman Timothy W | Process for electroless copper deposition on a ruthenium seed |
| EP2778234B1 (fr) * | 2005-05-31 | 2017-09-27 | Promega Corporation | Composés luminogènes et fluorogènes et procédés pour la détection de molécules ou de conditions |
| EP2323996B1 (fr) * | 2008-08-18 | 2014-10-22 | Promega Corporation | Composés luminogènes et procédés de détection des enzymes 3a du cytochrome p450 |
| US9790537B2 (en) | 2014-01-29 | 2017-10-17 | Promega Corporation | Quinone-masked probes as labeling reagents for cell uptake measurements |
| CN107382934A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-11-24 | 福州大学 | 一种巯基功能化香豆素衍生物及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0018825B1 (fr) * | 1979-05-02 | 1985-02-13 | National Research Development Corporation | Procédé pour l'identification de bactéries et trousse de réactifs utilisée dans ce procédé |
| CA2038406C (fr) | 1990-04-12 | 1995-11-21 | Mark L. Sussman | Identification de microorganismes par la mesure de l'activite enzymatique en presence d'agents qui influent sur l'activite enzymatique |
| US5846754A (en) * | 1996-05-28 | 1998-12-08 | Bayer Corporation | Enzyme determination with protease inactivation |
| EP1230380B1 (fr) * | 1999-11-05 | 2004-02-11 | Iconix Pharmaceuticals, Inc. | Substrats pour enzymes et essai par fret intramoleculair |
| AU2001238407A1 (en) | 2000-02-16 | 2001-08-27 | Thermogen, Inc. | Esterase enzymes having selective activity |
| WO2001061041A2 (fr) * | 2000-02-18 | 2001-08-23 | Aclara Biosciences Inc. | Procede et dispositif de reaction sur plusieurs sites |
-
2002
- 2002-07-09 FR FR0208633A patent/FR2831889B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 2002-11-07 CA CA002466421A patent/CA2466421A1/fr not_active Abandoned
- 2002-11-07 WO PCT/FR2002/003827 patent/WO2003040405A1/fr not_active Application Discontinuation
- 2002-11-07 EP EP02793215A patent/EP1442130A1/fr not_active Ceased
-
2004
- 2004-05-10 US US10/841,568 patent/US7258972B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1442130A1 (fr) | 2004-08-04 |
| FR2831889B1 (fr) | 2004-01-16 |
| US20050009098A1 (en) | 2005-01-13 |
| WO2003040405A1 (fr) | 2003-05-15 |
| US7258972B2 (en) | 2007-08-21 |
| FR2831889A1 (fr) | 2003-05-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Goddard et al. | Enzyme assays for high-throughput screening | |
| US5914245A (en) | Solid phase enzyme kinetics screening in microcolonies | |
| Goddard et al. | Recent advances in enzyme assays | |
| Schmidt et al. | High-throughput assays for lipases and esterases | |
| Jessani et al. | The development and application of methods for activity-based protein profiling | |
| Morı́s-Varas et al. | Visualization of enzyme-catalyzed reactions using pH indicators: rapid screening of hydrolase libraries and estimation of the enantioselectivity | |
| Grognux et al. | Classifying enzymes from selectivity fingerprints | |
| CA2466421A1 (fr) | Procede pour generer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un echantillon, le traitement de ladite empreinte et les systemes pour leur mise en oeuvre | |
| EP1051509B1 (fr) | Derives d'indolamine dans la detection de peptidases de micro-organismes | |
| Zadlo et al. | Mixed carbonates as useful substrates for a fluorogenic assay for lipases and esterases | |
| Van Tol et al. | Description of hydrolase-enantioselectivity must be based on the actual kinetic mechanism: Analysis of the kinetic resolution of glycidyl (2, 3-epoxy-1-propyl) butyrate by pig pancreas lipase | |
| FR2831888A1 (fr) | Procede pour generer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un echantillon et les systemes pour sa mise en oeuvre | |
| EP1395673B1 (fr) | Procede de detection pour identifier des hydrolases | |
| Wang et al. | A new high-throughput screening method for determining active and enantioselective hydrolases | |
| Franken et al. | Screening for Enantioselective Enzymes 16 | |
| US20020177180A1 (en) | pH-indicator based assay for selective enzymes | |
| FR2855529A1 (fr) | Procede pour mesurer des profils de reactivite d'echantillons par leur action sur des melanges de composes chimiques, et leur utilisation | |
| WO2003046211A1 (fr) | Methode de detection d'une activite catalytique | |
| Hidalgo et al. | Directed evolution of lipases and esterases for organic synthesis | |
| Schauer et al. | A cross-reactive, class-selective enzymatic array assay | |
| Kazlauskas | Quantitative assay of hydrolases for activity and selectivity using color changes | |
| CA2282042C (fr) | Criblage a l'aide de la cinetique des reactions enzymatiques en phase solide dans des microcolonies | |
| EP1095163A2 (fr) | Visualisation de reactions catalysees par des enzymes utilisant des indicateurs de ph: criblage rapide de bibliotheques d'hydrolases pour detecter des enzymes enantioselectives | |
| Miller | Advances in fluorescence enzyme detection methods | |
| JP2004513601A (ja) | 選択性酵素のためのｐＨ指示薬に基づくアッセイ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZDE | Discontinued |