CA2448843A1

CA2448843A1 - Effets de differents surnageants de bacteries lactiques de bio-k plus sur des lignees cellulaires endotheliales

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Publication number: CA2448843A1
Application number: CA002448843A
Authority: CA
Inventors: Unknown
Original assignee: Bio K Plus International Inc
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-11-13
Filing date: 2003-11-13
Publication date: 2005-05-13
Also published as: EP1689418A1; WO2005046703A1; US20070086991A1; US20110159131A1; US7862809B2; EP1689418A4; CA2544506A1

Description

Application number ! numéro de demande: c~
Fi<rures:~ ~r' Sc~ ~ ~ S m- 9 A-Pages: 1 ~i~ 1 °?, J $, l ~. ~ ~. :~ ~. ~~c!', 3f~, 3 I , 3,~, 3 3, Unscannable items received with this application tRequest original documents in File Prep. Section on the lClh rloor) Documents reçu avec cette demande ne pouvant être balayés (Commander les documents originaux dans la section de préparation des dossiers au l4ème étage) Effets de différents surnageants de bactéries lactiques de Bio-K Plus sur des lignées cellulaires endothéliales.
Introduction La recherche sur le cancer vise à découvrir les moyens par lesquels la croissance agressive des tumeurs solides et de leurs métastases peut être abolie de façon spécifique sans engendrer de résistance au traitement, ni provoquer de toxicité excessive chez les patients traités. Ce défi est de taille puisque Ia transformation des cellules normales en cellules tumorales est associée à
l'acquisition d'une importante résistance à la plupart des agents cytotoxiques actuellement utilisés èn thérapie. Plusieurs études réalisées au cours des dernï.ères années ont démontré que les cellules tumorales ne représentent pas le seul déterminant responsable de la croissance des tumeurs. Les vaisseaux sanguins présents au sein de ces tumeurs y jouent également un rôle crucial. Il a été clairement établi que ces vaisseaux sanguins, formés par le processus d'angiogenèse, sont essentiels à Ia croissance agressive des tumeurs et de leurs métastases. Cette angiogenèse est due à Ia capacité des cellules tumorales à sécréter un certain nombre de facteurs angiogéniques, tels les facteurs de croissance de I'endothélium vasculaire (VEGF) et fibroblastique (FGF), liant avec une haute affinité Ia surface des cellules endothéliales. La stimulation de ces cellules endothéliales par ces facteurs résulte non seulement en une hausse de la sécrétion d'enzymes dëgradant tes composantes de la matrice extracellulaire, mais également ën une stimulation de la migration et de la prolifération de ces cellules. Les cellules ainsi stimulées envahissent la matrice entourant les tumeurs, formant un réseau de capillaires qui assure la croissance des cellules tumorales en leur fournissant les nutriments et l'oxygène nécessaires à leur développement. L'inhibition de !'apport sanguin auY tumeurs constitue donc une cible de choix pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques antic~encéreuses ciblant spécifiquement l'un?iogenèse pour restreindre ou éliminer ta progression tumorale.

On estime que les habitudes de vie et L'alimentation sont responsables de plus d~u tiers des nouveaux cas de cancers diagnostiqués. Par conséquent, la prévention (nutra-prévention) suscite grésenternent un immense intérêt et i1 est estimé qu'au cours des prochaines années, elle entrainera des réductions des taux de mortalité reliés au cancer plus grandes que celles atteintes par les traitements actuellement disponibles. Il est donc d'actualité et fort intéressant de caractériser Le potentiel antiangiogénique des bactéries lactiques des produits alimentaires Bio-K
Plus.
Objectif de cette étude Notre intention est de déterminer et de caractériser les propriétés antiangiogéniques des produits alimentaires Bio-K Plccs (avec et sans produit Laitier).
Hypothèse proposée Les bactéries lactiques composant Ies produits alinnentaires Bio-K Plus sécrètent des molécules actives qui ont une activité antiangiogênique.
Approches expérimentaies utilisées 1- Effet sur Ia formation des réseaux de capüia,ires sanguins:
?- Effet. sur ia migration des cellules endothélinles à travers Ie vaisseau sanguin vers Ia tumeur;
3- Effet sur La prolifération des cellules endothéüales vers la tumeur.

Conclusion générale suite auY résultats obtenus Ä la lueur de l'ensemble des résultats obtenus dans cette partie de l'étude, les bactéries lactiques contenues dans les produits Bia-K Plus semblent sécréter des molécules actives qui ont un potentiel d'activité antiangiogénique. Ainsi, ces moiécules actives ont Ia capacité d'inhiber Ia croissance de nouveaux capillaires qui soutient la progression de diverses maladies tels Ies rétinopathies, les hémangiomes infantiles, l'arthrite rhumatoïde, Ie psoriasis, les ulcères duodénaux, la resténose post-angioplastie et ia croissance tumorale.
,.

Etude : caractérisation des propriétés antiangiogéniques des bactéries lactiques composant le produit alimentaire de Bio-K Pdus sur les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) et les cellules endothéliales de l'aorte bovine (B AECs).
1.0 Préparation du matériel d'étude Dans la présente étude, nous avons caractérisé l'action de divers surnageants grovenant~
des bactéries lactiques (mili.eu sécrété par les bactéries) et des produits alimentaires Bio-K Plus.
,.
1.1 Srrrnageatzts de bactéries lactiques Les bactéries ont été reçues dans 9 ml de milieu complexe MRS et 100 p.l de cette suspension a été multipliée dans 100 ml du même milieu. Après 18 heures d'incubation â 37°C
(agitation à une vitesse de 250 RPM), des aliquots de 1,2 ml ont été prélevés et répartis dans des tubes eppendorfs stériles auxquels nous avons rajouté préalablement 0,4 ml de glycérol à 80%.
Ces tubes ont été congelés à -80°C.
Afin d'obtenir les surnageants de bactëries lactiques, un volume de I00 ~tl de suspension bactérienne provenant d'un tube congelé à été prélevé et cette suspension a été multipliée dans 100 ml de milieu MRS (selon Ia même procédure que décrite précédemment). Après 18 heures d'incubation, un repiquage a été effectué : 1 mI de suspension bactérienne dans 100 ml de milieu KIRS (dilution de I/100). Ce milieu a. été incubé à 37°C -jusqu'à
l'atteinte de sa phase de croissance « log » correspondant à une densité mesurée à 0,5 à Agi,. Par ia suite, le surnZgeant a été obtenu parcentrifugation (I 000 x g, l~ min) et filtré deux fois (un filtre de 0,~.~ym suivi d'un filtre de 0,'?3 itm), Une pzrtie de cc surnageant a été aliquoté dans des tubes eppendorfs stériles et COII'~I~ à-80°C. L'.mtre partie dLl surnageant a cté concentré IOX à
l'aide do tubes Ultrafree-:# (> ~ 000 kDa) par ccntrifu;Tation (s 000 r g. 30 min). Ainsi, nous avons obtenu deux types de ,, surnageants : un surnageant concentré i0~~ contenant des molécules dont la taille est plus grande que S 000 kDa et un filtrat contenant des molécules dont la taille moléculaire est plus petite ou égale à 5 000 kDa. Par la suite, ces surnageants ont été aliquotés et congelés à -80°C.
1.2 Surnageants de produits alimentaires Bio-K Plus Dans la présente étude, des surnageants ont été obtenus de deux types de produits aliméntaires Bio-K Plus : un composë avec produit laitier (les protéines du lait sont fermentées) et l'autre sans produit laitier (les protéines du soya sont fermentées). Ces surnageants de ces,.
produits ont été obtenus suite à deux centrifugations (une à 6 000 x g , 15 min, 4°C et une autre à
20 000 RP1VI, 30 min, 4°C}. Par la suite, ils ont été filtrés sur deux filtres (un filtre de 0,45pm suivi d'ur~ filtre de 0,22 p.m) dans Ie but d'obtenir des surnageants sans bactéries et stériles afin de pouvoir traiter les lignées cellulaires endothéliales. Les surnageants ont été
conservés â -80°C
jusqu' à utilisation.

2.4 Résultats 2.1 Caractérisation ira vitro des surnageants de bactéries lactiqices et des produits alimentaires Bio-K .Plus sur la formation de strrcctrcres capillaires par les ~1 UVECs Dans un premier temps, nous avons vérifié si les surnageants de bactéries lactiques perturbaient Ia formation de structures capillaires sur I~Iatrigel par tes HUVECs. Les cellules ont été ensemencées sur une matrice contenant un mélange hétérogène de facteurs de croissance (bFGF, TGF-j3, VEGF, HGF) ainsi que de plusieurs protéines de Ia matrice extracellulaïre (collagène, larninine, fibrine} et de protéases {vIi4~IPs, uPA, tPA), recréant artificiellement Ie support matriciel retrouvé üt viuo. Une incubation de 6 heures en présence des différents surna~tants {dilution ll4) à 37°C a permis d'observer un effet inhibiteur (variant de I8,2~1o à
27,s~~ inhibition; n=?) des surnzgeants de bactéries lactiques concentrés IOX
(Figures 1r1, 1B).

De plus, on observe que les réseaux formés sont incomplets et non structurés comparativement au contrôle.
Dans un deuxième temps, nous avons vérifié si les surnageants de Bio-K Plus perturbaient également la formation des structures par tes HL3VECs (Figures 2A, 2B). Les résultats semblent démontré que leurs effets ne sont pas significatifs. De plus, mentionnons que le pH des surnageants de Bio-K Plus ne semble pas affecter la formation des réseaux.
2.2 Caractérisation in vitro des surnageants de bactéries lactiques et des produits alimentaires Bio-K Plus sur le potentiel migratoire des BAECs et des HUVECs La migration des cellules endothéliales a êté mesurée à l'aide des chambres de culture de ,.
type Boyden. II s'agit de deux chambres contenant des puits de 6,5 mm séparées par une membrane de polycarbonate ayant des pores de 8,0 ~Cm et préalablement induite de gélatine.
Cette membrane constitue la barnère artificielle. Les cellules endothéliales en croissance ont été
récoltées avec de la trypsine, comptées, centrifugées et resuspendues à une densité de 1,0 X 10a celluleslml dans un tampon de migration approprié. Les cellules ont été
ajoutées aux puits de ta partie supérieure de la membrane et incubées à 37°C. Après 30 min d'adhésion, les différents surnageants ont été ajoutés dans tes puits supêrieur et inférieur de la chambre. Après 2 heures, le VEGF a été ajouté comme chemoattractant dans les puits inférieurs. Après 3 heures, tes cellules présentes à Ia surface interne de la membrane, donc celtes qui ont envahi la barrière, seront fixées, colorées et comptées à l'aide d'un microscope à haute résolution.
L'activité inhibitrice de chacun des surnageants a été analysée en fonction de ta présence ou non du VEGF.
Dans un premier temps, une dilution de i/4 de chacun des surnageants à tester dans le milieu de culture cellulaire approprié a été utilisée afïn de déterminer lequel des surnageants a un effet potentiel sur la migration. Les résultats chez les cellules BAECs démontrent que tous les surnageants ont un effet inhibiteur sur la stimulation de Ia migration induite par le VEGF
(Figures 3:~, 3B). De plus, on remarque que pour le surnageant de bactéries lactiques concentré, son inhibition est complète. En ce qui concerne les HUVECs, tous Ies surnageants inhibent la stïmulation induite par le VEGF, ainsi que le niveau de migration basal (Figures 4A, 4B}.
L'effet inhibiteur semble plus important pour les surnageants de Bio-K Plus (Figure 4B).
Par Ia suite, nous avons analysé plus en détail l'effet inhibiteur des surnageants en fonction de la dilution. Les résultats obtenus pour les surnageants de Bio-K
Plats (avec produit laitier) semblent démontrer que l'effet inhibiteur sur la stimulation induite par Ie VEGF est fonction de la dilution et que Ia dilution Ia plus faïble (1/7) a un effet ïnhibiteur également sur le niveau basal de migration (Figure SA). Des résultats similaires ont été
obtenus pour ies surnageants de Bio-K Plus (sans produit laitier) (Figure SB). On remarque cependant que Ia migration des cellules BAECs semblent plus sensibles aux dilutions 1.120 et 1/10, surtout au niveau basal.
2.3 Caractérisation in vitro des surnageants des produits ali»zentaires Bio-I~' Plus sur la .
prolifêration des HITVECs Le test utilisé pour l'étude de Ia prolifêration cellulaire est Ie WST-l, une technique qui mesure l'activité mitochondriale des cellules. Pour ce faire, les HWECs ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits ~ une densité de 4 000 cellules/puit. Après 24 heures d'incubation, les diffêrents surnageants ont été ajoutés séparément dans chacun des puits.
Après 30 min d'incubation, du bFGF a été ajouté. Une solution de WST-1 d'un kit de Boehringer a été ajoutée dans chacun des puits après différents temps d'incubation (0 h, 24 h, 48 h et 72 h) et l'activité
métabolique a été quantifiée ~ 4S0 nm. L'activité inhibitrice de chacun des surnageants a été
analysêe en fonction de la présence ou non du bFGF.
Les différents surnageants de Bio-K Phcs ne semblent pas inhiber ta prolifération des HUVECs comparativement au temps 0 (Figures 6A, 6B}. De plus, si on compare l'effet de différentes dilutions de surnajeant de Bia-K Plus (avec produit laitier) et Bio-K Plus (sans produit laitier), en absence (Figures CA, 6B) et en présence de bFGF (Figures 'iA, 7B}, on constate que la prolifération des cellules est augmentée en présence du facteur de croissance, mais que cette ,, stimulation semble dimihuer et atteindre les niveaux du temps 0, aux dilutions 1110 et I!7 (Figure 7B} vers 4$ et 72 heures pour les surnageants de Bio-K Plrxs (sans produit laitier).

3.0 Conclusions L'ensemble des résultats obtenus semble démontrer que les bactéries tactiques du Bio-K
Plats relarguent dans ie surnageant des moiêcutes actives qui ont une activitê
antiangiogénique.
Les principales conctusians des résultats obtenus sont les suivantes I-) La fermentation des protéines du lait ne semble pas étre responsable de l'action inhïbitrice du Bio-K Plus puisque lors de la migration, Ie produit contenant des protéines ,.
de soya fermentées inhibe également la stimulation induite par le VEGF;
2-) Les molécules actives semblent être d'un poids moléculaire plus grand que 5 000 kDa;
3-) Pour observer un effet antiangiogênique sur la formation de structures capillaires par les cellules endothéüales, ü faut que ie surnageant de bactéries en culture soit concentré
fois, ceci pourrait expliquer pourquoi on ne retrouve pas cet effet avec les surnageants des produits alimentaires Bio-KPlus.

4.0 Prospectives Les résultats obtenus supportent clairement Ia présence d'une activité
antiangiogénique par les bactéries constituant Ie Bio-K Plces. Il nous apparaît donc très important de poursuivre la caractérisation de ces propriétés afin de mieux comprendre les mécanismes par lesquels le produit

5 ,.

pourrait agir comme agent anticancéreux. Dans cette optique, nous prévoyons réalïser les expériences suivantes 1-) Déterminer Ie nombre de bactëries tactiques présentes dans Ia suspension bactérienne avant centrifugation et le comparer au nombre de bactéries retrouvêes dans le produit alimentaire; ceci nous permettra d'êvaluer, à dilution égale, la concentration équivalente de bactéries retrouvée dans Ies surnageants;
2-) Poursuivre les études de prolifération et de migration avec les surnageants de bactéries lactiques en fonction de leur dilution;
3-} Avec les surnageants qui démontrent une activitë antiangiogénique, étudier leurs effets sur d'autres événements cellulaires rattachés à l'angiogenèse comme: a} l'état de ,.
phosphorylation de certains récepteurs spécifiques aux cellules endothëliales suite à Ia stimulation aux facteurs de croissance; b) Ies nïveaux d'expression des métalIoproëtases, famille d'enzymes impliquées dans la dégradation de la matrice extracellulaire, sécrétées par les cellules endothéliales et c} l'induction de l'apoptose dans les cellules endothéliales suite aux traitements.

Effets des bactêries lactiques de Bio-K Plus sur des lignées cellulaires endothéliales et cancéreuses Objectif : caractériser les mêcanismes moléculaires du Bio-K Placs dans diverses lignées endothéliales et cancéreuses humaines.
1.I Approches expérimentales B. Caractérisation ira vitro des propriétés antiangiogéniques du Bio-K Plus sur les cellules endothéliaies de veine ombilicale humaine (HUVECs).
1- Effet sur la prolifération cellulaire;
2- Effet sur le potentiel migratoire des cellules;
3- Effet sur la formation de structures de capillaires sur Matrigel.
C. Caractérisation ira vitro des propriétés anticancéreuses du Bio-K Plus sur la prolifération de 6 lignées de cellules tumorales.
1- MCF-7 (adénocarcinome du sein);
2- Panc-1 (carcinome épithéloïde du pancréas);
3- PC-3 (carcinome de la prostate);
4- Daoy {médulloblastome du cerveau);
5- U-87 (glioblastome-astrocytome du cerveau);

6- 3urkat {lymphocytes de la leucémie).
Ces études permettront de mieux caractériser et d'identifier de nouvelles cibles moléculaires dans les cellules endothéliaies et cancéreuses modulées par le Bio-K Plus.

1.2 Préparation du matériel d'étude Dans la présente étude, nous avons caractérisé l'action des surnageants de bactéries lactiques irradiées â 3 kGy (S3), 6 kGy (S6) et 9 kGy (S9). Ces surnageants ont été obtenus suite à deux centrifugations (une à f> 000g , IS min , 4°C et une autre à 10 OOOg, 20 min, 4°C). Par la suite, ils ont été filtrés sur deux filtres {un filtre de 0,45~m suivi d'un filtre de 0,22 ~tm) dans Ie but d'obtenir des surnageants sans bactéries et stériles afin de pouvoir traiter les diverses lignées cellulaires. Les surnageants ont été conservés à -80°C jusqu'à
utilisation.
Pour nos études, nous avons utilisé une concentration de surnageants équivalente à 10$
bactéries, puisque selon le mémoire de maîtrise de Cindy Baldwin, c'est à
cette concentration que l'effet inhibiteur est maximal.
1.3 Résultats 1.3.2 Caractérisation in vitro des propriétés antiangiogéniques du Bio-1~ Plus sur tes cellules endothéIiales de veine ombilicale humaine {HUVECs).
Nous avons vérifié si les surnageants de bactéries avaient un effet sur les cellules endothéliales. La technique du WST-l, qui mesure l'activité mitochandriale des cellules, nous a permis d'étudier la prolifération des cellules HUVECs. Les surnageants ne semblent pas avoir d'effet inhibiteur sur la prolifération de ces cellules (Figures 4-â; n = ?).
Nous avons par ta suite évaluë le potentiel migratoire des ceilules en présence de surnageants de bactéries et les résultats se sont avérés positifs. Nous avons ~~érifié si tes surnageants inhibent la stimulation de la migration des HUVECs sur gélatine induite par te VEGF, le mitogène ie plus souvent associé au phénomène d'angiogenèse. Les surnageants inhibent complètement la migration par le VEGF
mais également le niveau de migration basale, à environ 50%v (Figure b).
L'effet inhibiteur des surnageants ne semblent donc pas spécifique au VEGF. Les essais de formation de tubes sur Matrigel (une matrice riche en Iaminine, reconstituant la membrane basale et qui permet la différenciation des cellules endothéliales en des structures simïlaires aux capillaires des vaisseaux sanguins) démontrent que les surnageants de bactéries inhibent de façon significative Ia formation des tubes par rapport au témoin chez les I-iUVECs (Figures ZA-~B; n = 2).
L'ensemble de ces résultats indiquent que tes surnageants de bactéries contiennent des molécules qui ont un potentiel antiangiogénique.
i.4 Conclusion L'ensemble des résultats~obtenus dans ce projet semblent démontrer qu'il y a, dans les surnageants provenant de bactéries lactiques contenus dans Ies produits de Bio-K Plccs, des molécules relarguées par les bactéries qui semblent avoir une activité
antiangiogénique.
En résumé, les principales conclusions de ce projet sont les suivantes Un effet inhibiteur des surnageants de bactéries a été observé sur la migration des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) et sur la formation de structures de capillaires par ces cellules;

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