IDENTIFICATION DES LIGANDS D'UN RECEPTEUR CAPABLE DE S'INTERNALISER
La présente invention a pour objet un procédé de criblage s applicable à l'identification de ligands potentiels pour un récepteur capable de s' internaliser.
L'invention concerne plus particulièrement, mais non exclusivement les récepteurs appartenant à la famille des récepteurs à 7 io domaines transmembranaires couplés aux protéines G ainsi que ceux de la famille des récepteurs tyrosine kinase à un seul domaine transmembranaire.
A ce jour, environ 800 récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G (GPCR) ont été clonés de différentes espèces eucaryotes. Chez l'homme, 240 GPCRs ont été isolés.
is Pour seulement 140 d'entre eux le ligand endogène est connu, pour les 100 autres restants qui constituent le pool des récepteurs orphelins, ils sont à
identifier.
Parallèlement, plusieurs centaines de nouveaux médicaments agissant sur les GPCRs ont été enregistrés, au cours de ces vingt dernières 2o années.
En conséquence, les récepteurs orphelins nouvellement clonés sont d'un grand intérêt pour la recherche pharmaceutique dans la mesure où ils sont susceptibles de représenter des cibles thérapeutiques potentielles.
Toutefois, leur valorisation sur un plan thérapeutique implique au préalable 2s d'isoler leur ligand endogène et, par tà même, d'élucider leur fonction.
Sur l'ensemble de ces récepteurs orphelins couplés aux protéines G, seuls 5 ligands endogènes ont à ce jour été isolés, tous appartenant à des familles de peptides nouveaux : les orexines / hypocrétines, la nociceptine /
orphanine, le PrRP, peptide libérant la prolactine, l'apeline et le peptide de type 30 leucokinin (leucokinin-like).
Pour les identifier, les auteurs ont criblé dans tous les cas des fractions de tissus purifiées sur différents tests. IDENTIFICATION OF LIGANDS FROM A RECEIVER CAPABLE OF INTERNALIZING
The present invention relates to a screening method s applicable to the identification of potential ligands for a receptor able to internalize.
The invention relates more particularly, but not exclusively receptors belonging to the 7 receptor family io transmembrane domains coupled to G proteins as well as those of family of tyrosine kinase receptors with a single transmembrane domain.
To date, around 800 receivers in 7 domains G protein coupled transmembrane cells (GPCR) were cloned from different eukaryotic species. In humans, 240 GPCRs have been isolated.
is for only 140 of them the endogenous ligand is known, for the 100 other remnants which constitute the pool of orphan receptors, they are at identify.
At the same time, several hundred new drugs acting on the GPCRs have been registered, during the last twenty 2o years.
As a result, the newly cloned orphan receptors are of great interest for pharmaceutical research insofar as they are likely to represent potential therapeutic targets.
However, their valorization on a therapeutic level implies beforehand 2s to isolate their endogenous ligand and, by itself, to elucidate their function.
On all of these orphan receptors coupled to proteins G, only 5 endogenous ligands have so far been isolated, all belonging to families of new peptides: orexins / hypocretins, nociceptin /
orphanine, PrRP, prolactin-releasing peptide, apeline and peptide type 30 leucokinin (leucokinin-like).
To identify them, the authors screened in all cases tissue fractions purified on different tests.
2 Pour le choix des tests, ils ont mis à profit le fait que lorsque l'agoniste se fixe sur son récepteur, il y a formation d'un second messager qui va produire, suivant la voie de signalisation utilisée par le récepteur, différents produits et qui va dans tous les cas aboutir à un changement de pH
s intracellulaire.
Dans le cas de la nociceptine, les auteurs ont mesuré
l'accumulation d'AMPc, résultant de la stimulation de l'adénylate cyclase.
Dans le cas des orexines, les auteurs ont mesuré l'accumulation de Ca2+ intracytoplasmique résultant de la stimulation de la phospholipase C.
lo Dans le cas du PrRP, les auteurs ont mesuré la formation d'acide arachidonique résultant de la stimulation de la phospholipase A2.
Dans le cas de l'apeline, ils ont mesuré les modifications de l'acidification du milieu extracellulaire à l'aide d'un "cytosenseur" .
is Toutefois, l'ensemble de ces voies d'identification n'est pas totalement satisfaisant pour les raisons suivantes La démarche d'identification consistant à évaluer la production de seconds messagers nécessite de connaître la voie de signalisation du récepteur. En présence d'un récepteur orphelin, n'ayant aucune idée de la voie 2o mise en jeu, il s'avère nécessaire de tester l'ensemble des voies de signalisation connues avec l'espoir que le récepteur d'intérét ne soit pas couplé
à une voie encore inconnue. Ceci nécessite donc de disposer d'une quantité
d'échantillon importante. Cette démarche implique également que le récepteur d'intérêt soit couplé à une cascade de seconds messagers dans les systèmes 2s de transfection hétérologues dans lesquels ils sont exprimés, ce qui n'est pas nécessairement le cas.
Quant à l'approche consistant à mesurer l'acidification du milieu extracellulaire, suite à la production de protons par la cellule activée, elle se heurte au problème suivant : si l'on met en présence des banques de peptides 30 ou des fractions purifiées d'extraits de tissus avec un récepteur orphelin exprimé à la surFace d'une cellule, on mesure une modification de pH
extracellulaire qui résulte de la stimulation non seulement du récepteur orphelin 2 For the choice of tests, they took advantage of the fact that when the agonist attaches to his receiver, there is formation of a second messenger who will produce, according to the signaling channel used by the receiver, different products and which will in all cases lead to a change in pH
s intracellular.
In the case of nociceptin, the authors measured the accumulation of cAMP, resulting from the stimulation of adenylate cyclase.
In the case of orexins, the authors measured the accumulation of intracytoplasmic Ca2 + resulting from the stimulation of phospholipase C.
lo In the case of PrRP, the authors measured acid formation arachidonic resulting from the stimulation of phospholipase A2.
In the case of apeline, they measured the changes in acidification of the extracellular medium using a "cytosensor".
is However, all of these identification channels are not totally satisfactory for the following reasons The identification process consisting in evaluating the production of second messengers requires knowing the signaling path of the receiver. In the presence of an orphan receiver, having no idea of the route 2o put into play, it is necessary to test all of the known signaling with the hope that the receiver of interest is not couple to an as yet unknown path. This therefore requires having a quantity important sample. This also implies that the receiver of interest be coupled with a cascade of second messengers in systems 2s of heterologous transfection in which they are expressed, which is not not necessarily the case.
As for the approach consisting in measuring the acidification of the environment extracellular, following the production of protons by the activated cell, it is faces the following problem: if we put in the presence of peptide banks 30 or purified fractions of tissue extracts with an orphan receptor expressed on the surface of a cell, a change in pH is measured extracellular which results from stimulation not only of the receptor orphan
3 mais aussi de tous les récepteurs endogènes présents. On ne peut donc pas délimiter facilement le ligand responsable de l'activation du récepteur orphelin.
La présente invention a précisément pour objet de proposer une s nouvelle méthode pour détecter et/ou identifier les ligands de récepteurs orphelins qui s'avère plus fiable que celles évoquées ci-dessus, réalisable sur des échantillons de faibles volumes et exploitable en présence d'autres récepteurs endogènes et d'un nombre important de ligands, peptidiques ou non peptidiques, pour ces récepteurs endogènes annexes.
lo La méthode développée dans le cadre de la présente invention met à profit les propriétés qu'ont les récepteurs à sept domaines transmembranaires, couplés aux protéines G, ou les récepteurs à tyrosine kinase, de s'internaliser dans les cellules qui les expriment sous l'action de ligands agonistes. L'internalisation est un phénomène assez universel qui is touche un grand nombre de récepteurs. Cette internalisation peut ainsi être visualisée en microscopie confocale, optique ou même électronique lorsque le ligand est marqué avec une molécule fluorescente ou un marqueur épitopique.
Les complexes ligand-récepteurs suivent alors un cheminement intracellulaire caractéristique, qui a déjà été bien étudié. Par exemple, cette technique de 2o marquage fluorescent ou épitopique a déjà été préconisée pour suivre le trafic intracellulaire soit - d'un ligand marqué, complexé à son récepteur respectif, ledit récepteur subissant une internalisation induite par son activation, - d'une protéine impliquée dans la transduction du signal, en 2s l'occurrence la protéine kinase C marquée, - soit encore d'une protéine impliquée dans la désensibilisation d'un récepteur après l'activation de celui-ci, en l'occurrence la (3-arestine marquée.
Toutefois, l'option consistant à marquer soit un ligand soit une 3o protéine impliquée dans la transduction du signal ou encore dans la désensibilisation d'un récepteur après l'activation de celui-ci, comme la f3-arestine 2 marquée n'est pas totalement fiable. II peut en effet demeurer une ambigu'ité sur l'identité du récepteur dont l'internalisation a été suivie. De plus 3 but also of all the endogenous receptors present. So we cannot easily delineate the ligand responsible for activating the receptor orphan.
The object of the present invention is precisely to propose a s new method for detecting and / or identifying receptor ligands orphans which is more reliable than those mentioned above, achievable sure samples of low volumes and exploitable in the presence of others endogenous receptors and a large number of ligands, peptide or not peptide, for these annexed endogenous receptors.
lo The method developed within the framework of the present invention leverages the properties of seven domain receptors transmembrane, coupled to G proteins, or tyrosine receptors kinase, to internalize in the cells which express them under the action of agonist ligands. Internalization is a fairly universal phenomenon which It affects a large number of receptors. This internalization can thus be viewed in confocal, optical or even electronic microscopy when the ligand is labeled with a fluorescent molecule or an epitopic marker.
The ligand-receptor complexes then follow an intracellular path characteristic, which has already been well studied. For example, this technique of 2o fluorescent or epitopic marking has already been recommended to monitor the traffic intracellular either - a labeled ligand, complexed to its respective receptor, said receptor undergoing internalization induced by its activation, - a protein involved in signal transduction, in 2s the occurrence of protein kinase C labeled, - either a protein involved in desensitization a receptor after activation thereof, in this case the (3-arestine marked.
However, the option of marking either a ligand or a 3o protein involved in signal transduction or in the desensitization of a receptor after activation, such as f3-arestine 2 marked is not completely reliable. It can indeed remain a ambiguity on the identity of the receiver whose internalization has been followed. Of more
4 des données récentes suggèrent que des protéines différentes peuvent être impliquées dans les mécanismes d'internalisation et de désensibilisation de divers récepteurs. La ~i-arestine 2, en particulier, ne semble pas jouer un rôle universel.
s Par exemple, lorsque l'on suit la mobilisation de la f3-arestine couplée à l'EGFP, Lors de la stimulation du récepteur orphelin par son ligand, il y a phosphorylation du récepteur qui peut alors fixer la f3-arestine2-GFP
mobilisée du cytoplasme à la membrane. II y a ensuite séquestration du récepteur et internalisation. Or, dans le cas de la recherche d'un ligand io endogène d'un récepteur orphelin surexprimé à la surface de cellules eucaryotes, la mise en contact avec une banque de peptides ou de fractions purifiées de tissu résulte en l'activation non seulement du récepteur orphelin mais aussi de tous les récepteurs endogènes couplés aux protéines G. II en résulte donc une mobilisation de Ia (3-arestine 2-GFP non seulement par le is récepteur orphelin mais aussi par les récepteurs endogènes. Ceci ne permet donc pas d'identifier le ligand responsable de l'activation du récepteur orphelin.
De même, dans le cas d'une banque de peptides ou de fractions de tissus purifiées contenant le ligand endogène recherché, si tous les peptides sont marqués de façon homogène on ne peut pas identifier celui que l'on 2o recherche.
Le procédé de criblage revendiqué a précisément pour avantage de lever cette indétermination.
Plus précisément, la présente invention concerne un procédé utile 2s pour détecter et/ou identifier dans une banque de composés peptidiques, pseudopeptidiques ou non-peptidiques, un extrait biologique et/ou une fraction purifiée d'un extrait de tissus, un ligand d'un récepteur d'intérêt et capable de subir une internalisation induite par la fixation dudit ligand, caractérisé en ce qu' il comprend au moins les étapes consistant à
30 - exprimer ledit récepteur sous une forme marquée à la surface d'une cellule, - mettre en présence ladite cellule avec ladite banque, l'extrait biologique et/ou une fraction purifiée d'un extrait de tissus et contenant au moins un composé peptidique, pseudopeptidique ou non peptidique susceptible d'être un ligand dudit récepteur, dans des conditions suffisantes pour permettre une internalisation cellulaire dudit complexe récepteur-ligand et - visualiser cette internalisation via la détection du marqueur lié
s audit récepteur.
La présente invention implique donc le marquage du récepteur orphelin pour lequel notamment sont recherchés des agonistes potentiels.
Le fait de marquer en soit le récepteur orphelin est nettement lo avantageux au regard des techniques de détection évoquées ci-dessus. En effet, cette approche offre la possibilité de visualiser directement la cible étudiée. Lors de la mise en contact du récepteur avec le ligand endogène, c'est le complexe ligand-récepteur-marqueur qui est internalisé. II n'y a pas d'ambigu'ité sur l'identité du récepteur internalisé.
is De plus, dans le procédé revendiqué, la cellule surexprime constitutivement le récepteur marqué. Le marquage est intracellulaire, sur la queue cytoplasmique du récepteur et a donc pour avantage de ne pas gêner la fixation du ligand.
En ce qui concerne les marqueurs convenant à l'invention, il peut 2o s'agir soit d'une protéine autofluorescente soit d'un marqueur épitopique susceptible d'être détecté par immunohistochimie.
Les protéines fluorescentes pouvant être mises en oeuvre dans le procédé revendiqué appartiennent de préférence à la famille de la protéine fluorescente sauvage GFP et ses mutants (Ex : EGFP, EBFP et EYFP). Wang 2s S. & Halzelrigg T. (1994) Nature, 369:400-403 ; Yang TT et al. (1996) Nucleic Acid Res, 24: 4592-4593 ; Heim R & Tsien RY (1994) Curr. Biol., 6:1, 178-182;
Ormê M et al., (1996) Science, 273:1392-1395.
A titre illustratif des marqueurs non fluorescents susceptibles d'être également mis en oeuvre selon l'invention, on peut tout particulièrement 3o citer l'hémaglutinine, la polyhistidine, les protéines myc et flag et les épitoges viraux. II existe déjà pour tous ces composés fortement immunogènes des anticorps sélectifs hautement affins dans le commerce (ex : anticorps monoclonaux antimyc, Clontech; anticorps antihémaglutinine influenza, Boehringer; anticorps anti-virus de la somatostatite vésiculaire, Clontech;
anticorps anti-polyhistidine, In Vitrogen). Leur détection implique une reconnaissance du groupement antigénique par l'un de ces anticorps (dits primaires), suivi d'une visualisation de l'anticorps primaire par un anticorps s secondaire provenant d'une autre espèce et marqué soit par un fluorophore, soit par la peroxydase du raifort que l'on fera consécutivement réagir avec un substrat approprié.
Ce type de marquage est particulièrement intéressant dans la mesure où il permet une sensibilité de mesure élevée qui se traduit par la lo détection d'une concentration de ligand de l'ordre de 10-8 M c'est-à-dire 100 fmoles dans 10 pl. L'internalisation du complexe est visible en microscopie confocale voire méme optique lorsque le récepteur est fortement exprimé et si le ligand est en concentration suffisante (minimum 10-8 M).
Cette internalisation est de préférence détectée par microscopie Is confocale et/ou optique.
Enfin, avantageusement, les autres récepteurs endogènes, non marqués, présents à la surface des cellules hôtes, méme s'ils sont également internalisés, ne sont pas visibles et n'interfèrent pas au niveau de la mesure. II
n'est donc noté aucun bruit de fond ce qui est particulièrement intéressant au 2o regard de la grande sensibilité de la méthode de mesure.
De manière générale, le procédé revendiqué s'avère posséder une sensibilité suffisante pour permettre la visualisation d'une internalisation d'un conjugué récepteur-ligand au sein de la fraction testée nonobstant la présence d'autres récepteurs endogènes et d'un grand nombre de ligands, 2s peptidiques ou non peptidiques pour ces récepteurs endogènes annexes.
Avantageusement, le procédé de criblage revendiqué s'avère adpaté à l'étude de tout récepteur à condition que celui-ci possède la capacité
de s' internaliser.
3o Selon un mode privilégié de l'invention, le récepteur d'intérêt est couplé à une protéine G.
Le procédé revendiqué est particulièrement intéressant pour caractériser des ligands de récepteurs appartenant à la famille des récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés à la protéine G, les GPCRs, à la famille des récepteurs tyrosine kinase à un seul domaine transmembranaire ou à la famille des récepteurs des cytokines.
Dans le cas des GPCRs, l'étiquetage des récepteurs en C-s terminal présente les avantages suivants - la maturation post-traductionelle du récepteur n'est pas modifiée, - la liaison des agonistes et des antagonistes ainsi que la signalisation intracellulaire sont les mêmes qu'avec le récepteur natif, - l'internalisation des complexes ligand-récepteurs n'est pas lo modifiée et - la méthode de détection de l'expression est rapide et peut étre effectuée sur des cellules vivantes non fixées.
Le récepteur à étudier est couplé à un marqueur puis exprimé à la Is surface d'une cellule-hôte. En ce qui concerne ces deux opérations, à
savoir le marquage et l'expression dudit récepteur au niveau d'une cellule-hôte, elles relèvent bien entendu toutes deux des compétences de l'homme de l'art.
Généralement, on opère de la manière suivante La séquence de la partie codante du récepteur d'intérét est 2o insérée en phase, dans un vecteur d'expression, en amont ou en aval de la séquence codante de la protéine fluorescente (GFP, EGFP, EBFP, EYFP) ou d'un marqueur épitopique. Ces vecteurs d'expression (de type pGFP-N1 ou pGFP-C1, N1 ou C1 indiquent la position du récepteur par rapport à la protéine soit en N-terminal, soit en C-terminal) contiennent déjà la séquence de ces 2s marqueurs. Les cellules sont transfectées par une méthode classique (tels que la méthode des liposomes, phosphate de calcium), puis sélectionnées pour leur résistance à un antibiotique. Dans le cas des protéines de la famille GFP, il est possible d'effectuer un tri des cellules exprimant le récepteur couplé à la protéine fluorescente par cytométrie de flux.
30 En ce qui concerne les cellules transformées il s'agit de cellules eucaryotes comme par exemple les cellules épithéliales de reins de singe COS-7 ; d'ovaires de hamster : CHO ; et les cellules humaines embryonnaires de rein : HEK 293).
Dans une variante du procédé revendiqué, on peut envisager d'exprimer à la surface d'une cellule, deux ou plusieurs récepteurs distincts marqués respectivement par des marqueurs différents. Les deux récepteurs sont bien entendu capables de s' internaliser. Cette option offre ainsi la s possibilité de cribler sur un même échantillon et simultanément des ligands potentiels pour plusieurs récepteurs.
Conformément au procédé revendiqué, les cellules hôtes sont mises en présence d'un ligand potentiel. Pour ce faire, on met donc en contact lesdites cellules avec soit une banque de composés peptidiques, pseudo-lo peptidiques ou non-peptidiques, un extrait biologique ou encore des fractions purifiées d'un extrait de tissus.
Cette mise en contact est effectuée dans des conditions suffisantes pour permettre l'internalisation cellulaire du ou des complexes récepteur-marqueur-ligand. Ces conditions suffisantes sont bien entendu is appréciées par l'homme du métier, en termes de température, de durée et de concentration. II peut également être nécessaire de procéder à des expériences répétées.
En règle générale, l'internalisation de complexes ligand-récepteur dans les cellules des mammifères est optimale à 37°C. La demi-vie moyenne 2o du processus d'internalisation (temps requis pour que 50 % des récepteurs de surface occupés soient internalisés) est de l'ordre de 10 minutes. Ainsi, des expositions au ligand de 20 à 40 minutes sont habituellement optimales pour le repérage des récepteurs internalisés, les concentrations de ligand optimales sont de l'ordre de 10 à 20 fois l'affinité du ligand pour son récepteur (Kd).
2s On suit par microscopie confocale ou dans le cas d'une forte expression de ce récepteur marqué, par microscopie optique, l'internalisation du complexe ligand-récepteur qui se concrétise par le déplacement du marquage (fluorescent ou immunohistochimique) de la membrane de la cellule (dont l'intensité de marquage diminue) vers l'intérieur de celle-ci sous forme de 3o vésicules.
Dans le cas d'un récepteur marqué avec une étiquette fluorescente, la visualisation s'effectue directement en observant le déplacement de la fluorescence.
Dans le cas où le récepteur est marqué avec un antigène non-fluorescent, l'internalisation est visualisée en microscopie confocale après fixation des cellules et détection des épitoges antigéniques par des anticorps secondaires couplés à un fluorophore. Alternativement, les épitoges s antigéniques peuvent être révélés par une réaction enzymatique, ou à l'aide d'un anticorps radioactif qui se concrétise dans les deux cas par l'accumulation de dépôts opaques visibles aussi bien en microscopie photonique qu'électronique.
lo Comme évoqué précédemment, l' internalisation peut être visualisée sur une dizaine de cellules et pour un volume d'incubation très faible à savoir de l'ordre du NI. Ces deux qualités sont particulièrement précieuses lorsque l'on ne dispose que d'une très faible quantité d'échantillon.
ls En conséquence, le procédé revendiqué s'avère tout particulièrement avantageux pour détecter et/ou identifier le ou les ligands endogènes d'un récepteur orphelin ou encore identifier de nouveaux agonistes ou antagonistes pour un récepteur connu, c'est-à-dire dont on connaît le ligand endogène.
2o Etant basé sur l'observation directe d'un phénomène biologique qui touche la plupart des récepteurs GPCR ou tyrosine kinase, à savoir l'internalisation, cette méthode s'avère particulièrement utile pour la recherche des ligands des récepteurs orphelins et plus particulièrement des récepteurs des peptides, en utilisant des préparations biologiques telles que des extraits 2s de tissu.
On peut également envisager d'utiliser le procédé revendiqué
avec un récepteur marqué, déjà identifié et caractérisé, comme un "biosenseur", qui permettrait de détecter dans un liquide biologique la présence même à l'état de traces d'une substance toxique ou non capable de 3o se lier sur ce récepteur.
La présente invention s'étend également à tout ligand d'un récepteur d'intérêt, identifié à l'aide du procédé revendiqué.
Les exemples et figures soumis ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de la présente invention.
FIGURES
s Figures 1 figure 1a : Visualisation par microscopie confocale du récepteur de la neurotensine de type 1 couplé à la protéine fluorescente EGFP (NTR1-EGFP) à la surface de cellules CHO, incubées avec du tampon seul ou avec une concentration faible (1 nM) de neurotensine de rat ou de grenouille lo n'induisant pas d'internalisation.
figure 1 b : Visualisation de l'internalisation du récepteur NTR1-EGFP caractérisée par la formation de nombreuses vésicules fluorescentes cytoplasmique de 0,6 pm de diamètre à l'intérieur de cellules CHO incubées avec des concentrations de neurotensine de 10 et 100 nM.
ls Figures 2: Visualisation de l'internalisation du récepteur NTR1-EGFP avec ou sans lavage acide, en présence de : 10 nM de neurotensine (figure 2a) ou d'une fraction purifiée d'extrait de cerveaux de grenouille (figure 2b). Les conditions sont les mémes qu'en figure 1, et comprennent en outre un lavage acide du ligand endogène encore lié à la surface des cellules à la fin de la période de charge.
Figure 3 : Internalisation du récepteur NTR1-EGFP en présence de 10 fractions prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille.
Figure 4 : Dosage radioimmunologique des fractions prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille en utilisant un anticorps dirigé contre la as région conservée de la neurotensine:
Matériels et méthodes 1) Construction du récepteur NTR1-EGFP
s La séquence codante entière du récepteur NT1 (K. Tanaka, M.
Masu and S. Nakanishi (1990) Structure and functional expression of the cloned rat neurotensin receptor. Neuron 4: 847-54) a été amplifiée par PCR en utilisant deux amorces dirigées contre les extrémités 5' et 3' de la séquence codante de cet ADNc et contenant également des sites de restriction Hindlll ou lo BamH1 5'-CTT AAG CTT ATG CAC CTC AAC AGC TCC GTG-3' (SEQ ID
N°1 ) et 5'-TTT GGA TCC GCG TAC AGG GTC TCC CGG GT-3' (SEQ ID
N°2).
Après digestion par les enzymes Hindlll et BamH1 et purification, la séquence amplifiée a été insérée dans le vecteur d'expression pEGFP-N1 (Clontech) au niveau des sites Hindlll et BamH1. La construction a été vérifiée sur un ls séquenceur automatique AbiPrism 377 (Perkin-Elmer) en utilisant des ddNTP
fluorescents.
2) Transfection stable dans les cellules CHO
Les cellules CHO-K1 (American Type Culture Collection : ATCC) 20 ont été cultivées en atmosphère humide à C02 5%, dans du milieu F12 supplémenté avec 7,5% de sérum de veau foetal, 1 mM de glutamine, 100 unitésiml de pénicilline et 100 unitésiml de streptomycine (Boehringer Mannheim). Pour établir la lignée stable exprimant ce récepteur, les cellules CHO-K1 (environ 2,6x106 cellules) ont été transfectées avec 8 Ng de plasmide 2s en utilisant des liposomes cationiques (Dosper, Boehringer). Les cellules transfectées sont sélectionnées pour leur résistance à la généticine. Les clones obtenus ont été triés en utilisant la cytométrie en flux qui prend en compte l'intensité de la fluorescence de chaque cellule. Une deuxième sélection a été
effectuée à l'aide d'un microscope à fluorescence, en observant le niveau de 30 l'expression du récepteur NTR1-EGFP fluorescent, localisée à la surface membranaire des cellules de chacun des clones.
3) Prépurification de l'extrait de cerveaux de grenouille - Collection des tissus 2541 cerveaux de grenouille verte mâle (espèce Rana ridibunda), s correspondant à un poids de tissu frais de 215 g, ont été collectés au laboratoire sur des animaux fraichement sacrifiés. Les cerveaux ont été
congelés sur de la carboglace immédiatement après avoir été prélevés et conservés à -80°C.
lo - Extraction des tissus Les cerveaux ont été plongés pendant 15 min dans l'acide acétique bouillant 0,5 M (2 litres), puis homogénéisés au mixeur. L'homogénat a été centrifugé à 4000 x g pendant 30 min à 4°C. Le surnageant a ensuite été
préfiltré sur un assemblage de 10 colonnes de Sep-Pak C18 (Waters ls Associates, Milford, MA) montées en série à un débit de 2 ml/min. Le matériel fixé sur les colonnes de Sep-Pak a été élué avec 20 ml d'une solution d'acétonitrile à 70%. Cette opération a été répétée 2 fois.
- Purification de l'extrait de cerveaux de Grenouille par HPLC semi-2o préa~arative Le matériel élué des colonnes de Sep-Pak a été partiellement évaporé afin d'éliminer l'acétonitrile, puis centrifugé à 13000 x g pendant 5 min.
Le surnageant a été prélevé et divisé en 2. Chacun des 2 pools a ensuite été
injecté sur une colonne semi-préparative Vydac C18 218TP1010 (1 x 25 cm) 2s (The Separations Group, Hesperia, CA) équilibrée avec une solution d'eaulacide trifluoroacétique (99,9:0,1; vol:vol) à un débit de 2 ml/min. Le matériel peptidique fixé à la matrice a été élué en utilisant un gradient d'acétonitrile s'élevant de 14 à 42% en 40 min à un débit de 2 ml/min, puis montant de 42 à 56 % pendant 60 min à un débit de 1 ml/min. L'éluat a été
3o collecté par fraction de 1 min et l'absorbance mesurée à 215 et 280 nm. Les fractions d'élution ont été conservées à -20°C. Avant les expériences d'internalisation, chacune des fractions a été diluée avec de l'eau, partiellement évaporée afin d'éliminer l'acétonitrile, et complétée à un volume final de 50 NI.
4)Internalisation s Les cellules sont distribuées (50 % de confluence, 20 000 cellules par puit) puis cultivées pour la nuit sur des lames multi-puits (LabTek, Nunc) prétraitées avec de la polyallylamine (0,1 mg/ml, Aldrich). Sur ces lames, le volume des incubations (sauf pour la période de charge) et des lavages est de 250 pl par puits. 90 min avant le début de l'expérience, le milieu des cellules lo est changé pour un milieu supplémenté avec de la cycloheximide (70 pM, Sigma). Les cellules sont ensuite préincubées pendant 15 min sur la glace dans du tampon Earle's froid (pH 7,4, contenant 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 1,8 mM CaCl2, 3;6 mM MgCl2, 0,1 % albumine sérique bovine, 0,01 % glucose et 0,8 mM 1,10-phénanthroline). Puis les cellules sont incubées pendant ls 30 min avec le ligand dilué dans 50 pl du tampon Earle's à 4°C
(période de charge). A ce stade, un lot de cellules est soumis à un lavage acide hypertonique (0,2 M d'acide acétique et 0,5 mM de NaCI dans le tampon Earle's, pH 4 pendant 2 min à 4°C) afin de dissocier le ligand de ses récepteurs de surface. L'internalisation est provoquée par remplacement du milieu par du zo tampon Earle's à 37°C et incubation des lames à 37°C pendant 20 à 30 min (période de chasse). A la fin de l'incubation, les cellules sont rincées avec du tampon Earle's froid, fixées avec du paraformaldéhyde 4 % dissout dans du tampon phosphate 0,1 M à pH 7,4, rincées de nouveau dans du tampon Earle's froid puis montées en utilisant du Vectashield (Vector).
2s 4 recent data suggests that different proteins may be involved in the internalization and desensitization mechanisms of various receivers. The ~ i-arestine 2, in particular, doesn't seem to play a role universal.
s For example, when monitoring the mobilization of f3-arestine coupled to EGFP, When the orphan receptor is stimulated by its ligand, he there is phosphorylation of the receptor which can then fix the f3-arestine2-GFP
mobilized from the cytoplasm to the membrane. Then there is the sequestration of the receiver and internalization. Now, in the case of the search for a ligand endogenous io of an orphan receptor overexpressed on the surface of cells eukaryotes, contact with a library of peptides or fractions purified tissue results in activation of not only the orphan receptor but also of all the endogenous receptors coupled to proteins G. II in therefore results in mobilization of Ia (3-arestine 2-GFP not only by the is an orphan receptor but also by endogenous receptors. This does not allow therefore not identify the ligand responsible for the activation of the receptor orphan.
Similarly, in the case of a bank of peptides or fractions purified tissues containing the endogenous ligand sought, if all peptides are homogeneously marked we cannot identify which one we 2o research.
The claimed screening process has precisely the advantage to lift this indeterminacy.
More specifically, the present invention relates to a useful method 2s to detect and / or identify in a library of peptide compounds, pseudopeptides or non-peptides, a biological extract and / or a fraction purified from a tissue extract, a receptor ligand of interest and capable of undergo internalization induced by the fixation of said ligand, characterized in this that it comprises at least the steps consisting in 30 - expressing said receptor in a form marked on the surface of a cell, - bringing said cell into contact with said bank, the extract biological and / or a purified fraction of a tissue extract and containing minus a peptide, pseudopeptide or non-peptide compound capable of to be a ligand of said receptor, under conditions sufficient to to permit cellular internalization of said receptor-ligand complex and - visualize this internalization via the detection of the linked marker s audit receiver.
The present invention therefore involves labeling the receptor an orphan for whom in particular potential agonists are sought.
The fact of marking in itself the orphan receiver is clearly lo advantageous with regard to the detection techniques mentioned above. In indeed, this approach offers the possibility of directly viewing the target studied. When the receptor comes into contact with the endogenous ligand, it is the ligand-receptor-marker complex which is internalized. There is no of ambiguity on the identity of the internalized receiver.
is further, in the claimed process, the cell overexpresses constitutively the labeled receptor. The labeling is intracellular, on the cytoplasmic tail of the receptor and therefore has the advantage of not interfering with the ligand fixation.
As regards the markers suitable for the invention, it may 2o be either an autofluorescent protein or an epitopic marker likely to be detected by immunohistochemistry.
The fluorescent proteins which can be used in the claimed process preferably belong to the protein family wild fluorescent GFP and its mutants (Ex: EGFP, EBFP and EYFP). Wang 2s S. & Halzelrigg T. (1994) Nature, 369: 400-403; Yang TT et al. (1996) Nucleic Acid Res, 24: 4592-4593; Heim R & Tsien RY (1994) Curr. Biol., 6: 1, 178-182;
Ormê M et al., (1996) Science, 273: 1392-1395.
By way of illustration of non-fluorescent markers capable to also be implemented according to the invention, it is possible particularly 3o cite hemaglutinin, polyhistidine, myc and flag proteins and epitoges viral. There already exists for all these highly immunogenic compounds commercially highly selective antibodies (e.g. antibody monoclonal antimyc, Clontech; influenza hemaglutinin antibody, Boehringer; anti-vesicular somatostatitis virus antibody, Clontech;
anti-polyhistidine antibody, In Vitrogen). Their detection implies a recognition of the antigenic group by one of these antibodies (called primary), followed by visualization of the primary antibody by an antibody s secondary from another species and marked either by a fluorophore, either by horseradish peroxidase which will be reacted consecutively with a suitable substrate.
This type of marking is particularly interesting in the measurement where it allows for a high measurement sensitivity which results in the lo detection of a ligand concentration of the order of 10-8 M, that is to say 100 fmoles in 10 pl. The internalization of the complex is visible in microscopy confocal or even optical when the receiver is strongly expressed and if the ligand is in sufficient concentration (minimum 10-8 M).
This internalization is preferably detected by microscopy Is confocal and / or optical.
Finally, advantageously, the other endogenous receptors, not marked, present on the surface of host cells, even if they are also internalized, are not visible and do not interfere with the measured. II
no background noise is therefore noted, which is particularly interesting in 2o look at the great sensitivity of the measurement method.
In general, the claimed process turns out to have sufficient sensitivity to allow viewing of a internalization of a receptor-ligand conjugate within the fraction tested notwithstanding the presence of other endogenous receptors and a large number of ligands, 2s peptide or non-peptide for these additional endogenous receptors.
Advantageously, the screening method claimed proves to be suitable for the study of any receptor provided that it has the capacity to internalize.
3o According to a preferred mode of the invention, the receiver of interest is coupled to a G protein.
The claimed process is particularly interesting for characterize receptor ligands belonging to the receptor family with 7 transmembrane domains coupled to the G protein, the GPCRs, to the family of tyrosine kinase receptors with a single transmembrane domain or to the family of cytokine receptors.
In the case of GPCRs, labeling of C- receptors s terminal has the following advantages - the post-translational maturation of the receptor is not modified, - the binding of agonists and antagonists as well as the intracellular signaling are the same as with the native receptor, - the internalization of ligand-receptor complexes is not lo modified and - the expression detection method is fast and can be performed on non-fixed living cells.
The receptor to be studied is coupled to a marker and then expressed at the Is the surface of a host cell. With regard to these two operations, know the labeling and expression of said receptor at the level of a host cell, they Both of course fall within the competence of those skilled in the art.
Generally, we operate in the following manner The sequence of the coding part of the receptor of interest is 2o inserted in phase, in an expression vector, upstream or downstream of the coding sequence of the fluorescent protein (GFP, EGFP, EBFP, EYFP) or of an epitopic marker. These expression vectors (of the pGFP-N1 or pGFP-C1, N1 or C1 indicate the position of the receptor relative to the protein either in N-terminal or in C-terminal) already contain the sequence of these 2s markers. The cells are transfected by a conventional method (such than the liposomes, calcium phosphate method), then selected for their antibiotic resistance. In the case of GFP family proteins, it East possible to sort the cells expressing the receptor coupled to the fluorescent protein by flow cytometry.
30 Regarding transformed cells, these are cells eukaryotes such as monkey kidney epithelial cells COS-7; hamster ovaries: CHO; and human embryonic cells kidney: HEK 293).
In a variant of the claimed process, one can envisage to express on the surface of a cell, two or more distinct receptors marked respectively by different markers. The two receivers are of course capable of internalizing. This option thus offers the s possibility of screening on the same sample and simultaneously ligands potentials for several receptors.
According to the claimed process, the host cells are put in the presence of a potential ligand. To do this, we therefore put in contact said cells with either a library of peptide compounds, pseudo-lo peptide or non-peptide, a biological extract or fractions purified from a tissue extract.
This contact is carried out under conditions sufficient to allow cellular internalization of the complex (s) receptor-marker-ligand. These sufficient conditions are of course is appreciated by those skilled in the art, in terms of temperature, duration and concentration. It may also be necessary to carry out repeated experiences.
Typically, the internalization of ligand-receptor complexes in mammalian cells is optimal at 37 ° C. Half-life average 2o of the internalization process (time required for 50% of the receivers of occupied surface are internalized) is around 10 minutes. So, exposures to the ligand for 20 to 40 minutes are usually optimal for the identification of internalized receptors, optimal ligand concentrations are of the order of 10 to 20 times the affinity of the ligand for its receptor (Kd).
2s We follow by confocal microscopy or in the case of a strong expression of this labeled receptor, by light microscopy, internalization of the ligand-receptor complex which results in the displacement of the labeling (fluorescent or immunohistochemical) of the cell membrane (whose marking intensity decreases) towards the interior thereof of 3o vesicles.
In the case of a receiver marked with a label fluorescent, visualization is carried out directly by observing the displacement of fluorescence.
In the case where the receptor is labeled with a non-antigen fluorescent, internalization is visualized by confocal microscopy after binding of cells and detection of antigenic epitoges by antibodies secondary coupled to a fluorophore. Alternatively, the epitoges s antigenics can be revealed by an enzymatic reaction, or using of a radioactive antibody which is concretized in both cases by the accumulation opaque deposits visible both in light microscopy than electronics.
lo As mentioned above, internalization can be visualized on a dozen cells and for a very incubation volume low namely of the order of NI. These two qualities are particularly precious when there is only a very small amount of sample.
ls Consequently, the claimed process turns out to be quite particularly advantageous for detecting and / or identifying the ligand (s) endogenous to an orphan receptor or to identify new agonists or antagonists for a known receptor, that is to say of which the ligand endogenous.
2o Being based on direct observation of a biological phenomenon which affects most GPCR or tyrosine kinase receptors, namely internalisation, this method is particularly useful for research orphan receptor ligands and more particularly receptors peptides, using biological preparations such as extracts 2s of fabric.
One can also consider using the claimed process with a labeled receptor, already identified and characterized, as a "biosensor", which would detect in a biological fluid the presence even in trace amounts of a toxic substance or not capable of 3o bind on this receiver.
The present invention also extends to any ligand of a receptor of interest, identified using the claimed method.
The examples and figures submitted below are presented for illustrative and not limiting of the present invention.
FIGURES
s Figures 1 Figure 1a: Visualization by confocal microscopy of the receptor neurotensin type 1 coupled to the fluorescent protein EGFP (NTR1-EGFP) on the surface of CHO cells, incubated with buffer alone or with a low concentration (1 nM) of rat or frog neurotensin lo not inducing internalization.
Figure 1b: Visualization of the internalization of the NTR1- receptor EGFP characterized by the formation of numerous fluorescent vesicles 0.6 µm diameter cytoplasm inside incubated CHO cells with neurotensin concentrations of 10 and 100 nM.
ls Figures 2: Visualization of the internalization of the NTR1- receptor EGFP with or without acid wash, in the presence of: 10 nM neurotensin (Figure 2a) or a purified fraction of frog brain extract (figure 2b). The conditions are the same as in FIG. 1, and also include a acid washout of the endogenous ligand still bound to the cell surface at the end of the charging period.
Figure 3: Internalization of the NTR1-EGFP receptor in the presence 10 prepurified fractions of a frog brain extract.
Figure 4: Radioimmunoassay of prepurified fractions frog brain extract using an antibody to the as conserved region of neurotensin:
Materials and methods 1) Construction of the NTR1-EGFP receptor s The entire coding sequence of the NT1 receptor (K. Tanaka, M.
Masu and S. Nakanishi (1990) Structure and functional expression of the cloned rat neurotensin receptor. Neuron 4: 847-54) was amplified by PCR in using two primers directed against the 5 'and 3' ends of the sequence coding for this cDNA and also containing HindIII restriction sites or lo BamH1 5'-CTT AAG CTT ATG CAC CTC AAC AGC TCC GTG-3 '(SEQ ID
N ° 1) and 5'-TTT GGA TCC GCG TAC AGG GTC TCC CGG GT-3 '(SEQ ID
N ° 2).
After digestion with the enzymes Hindlll and BamH1 and purification, the sequence amplified was inserted into the expression vector pEGFP-N1 (Clontech) at level of the Hindlll and BamH1 sites. The construction has been checked on a the AbiPrism 377 automatic sequencer (Perkin-Elmer) using ddNTPs fluorescent.
2) Stable transfection in CHO cells CHO-K1 cells (American Type Culture Collection: ATCC) 20 were cultivated in a humid atmosphere at C02 5%, in medium F12 supplemented with 7.5% fetal calf serum, 1 mM glutamine, 100 iml units of penicillin and 100 iml units of streptomycin (Boehringer Mannheim). To establish the stable line expressing this receptor, the cells CHO-K1 (approximately 2.6x106 cells) were transfected with 8 Ng of plasmid 2s using cationic liposomes (Dosper, Boehringer). Cells transfected are selected for their resistance to geneticin. The clones obtained were sorted using flow cytometry which takes into account the intensity of fluorescence of each cell. A second selection was performed using a fluorescence microscope, observing the level of Expression of the fluorescent NTR1-EGFP receptor localized on the surface membrane of the cells of each of the clones.
3) Pre-purification of frog brain extract - Collection of fabrics 2541 brains of a male green frog (species Rana ridibunda), s corresponding to a weight of fresh tissue of 215 g, were collected at laboratory on freshly sacrificed animals. The brains have been frozen on dry ice immediately after collection and stored at -80 ° C.
lo - Tissue extraction The brains were immersed for 15 min in the acid 0.5 M boiling acetic acid (2 liters), then homogenized in a blender. Homogenate was centrifuged at 4000 xg for 30 min at 4 ° C. The supernatant has then been prefiltered on an assembly of 10 columns of Sep-Pak C18 (Waters ls Associates, Milford, MA) connected in series at a flow rate of 2 ml / min. The equipment fixed on the columns of Sep-Pak was eluted with 20 ml of a solution 70% acetonitrile. This operation was repeated 2 times.
- Purification of Frog extracts by semi-HPLC
2o prea ~ arative The material eluted from the Sep-Pak columns was partially evaporated to remove acetonitrile, then centrifuged at 13,000 xg for 5 min.
The supernatant was removed and divided into 2. Each of the 2 pools was then injected on a Vydac C18 218TP1010 semi-preparative column (1 x 25 cm) 2s (The Separations Group, Hesperia, CA) balanced with a solution of trifluoroacetic acid (99.9: 0.1; vol: vol) at a flow rate of 2 ml / min. The peptide material attached to the matrix was eluted using a gradient of acetonitrile rising from 14 to 42% in 40 min at a flow rate of 2 ml / min, then amount from 42 to 56% for 60 min at a flow rate of 1 ml / min. The eluate was 3o collected by fraction of 1 min and the absorbance measured at 215 and 280 nm. The elution fractions were stored at -20 ° C. Before the experiments internalisation, each of the fractions was diluted with water, partially evaporated to remove acetonitrile, and made up to a final volume of 50 OR.
4) Internalization s Cells are distributed (50% confluence, 20,000 cells per well) then cultivated overnight on multi-well slides (LabTek, Nunc) pretreated with polyallylamine (0.1 mg / ml, Aldrich). On these blades, the volume of incubations (except for the loading period) and washes is 250 pl per well. 90 min before the start of the experiment, the middle of cells lo is changed to a medium supplemented with cycloheximide (70 pM, Sigma). The cells are then preincubated for 15 min on ice in cold Earle's buffer (pH 7.4, containing 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 1.8 mM CaCl2, 3; 6 mM MgCl2, 0.1% bovine serum albumin, 0.01% glucose and 0.8 mM 1,10-phenanthroline). Then the cells are incubated for ls 30 min with the ligand diluted in 50 μl of Earle's buffer at 4 ° C
(period of charge). At this stage, a batch of cells is subjected to an acid wash hypertonic (0.2 M acetic acid and 0.5 mM NaCl in the buffer Earle's, pH 4 for 2 min at 4 ° C) in order to dissociate the ligand from its receivers of surface. Internalization is caused by replacing the medium with z Earle's buffer at 37 ° C and incubation of the slides at 37 ° C for 20 to 30 min (hunting season). At the end of the incubation, the cells are rinsed with of cold Earle's pad, fixed with 4% paraformaldehyde dissolved in 0.1 M phosphate buffer at pH 7.4, rinsed again in Earle's buffer cold and then mounted using Vectashield (Vector).
2s
5) Microscopie confocale Les cellules sont examinées avec un microscope confocal Leica TCS NT configuré avec un microscope inversé (Leica DM IRBE) équipé avec un laser argon/krypton avec des filtres d'excitation et d'émission 3o respectivement de 488 et 530-600 nm. Des images de 1024-1024 pixels de cellules individuelles sont obtenues en utilisant un objectif 63x à immersion à
huile. 5) Confocal microscopy Cells are examined with a Leica confocal microscope TCS NT configured with an inverted microscope (Leica DM IRBE) equipped with an argon / krypton laser with excitation and emission filters 3o of 488 and 530-600 nm respectively. 1024-1024 pixel images of individual cells are obtained using a 63x immersion objective at oil.
6) Dosage radioimmunologique de la neurotensine sur des fractions prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille Un volume de 5 pl de chaque fraction collectée en sortie d'HPLC
semi-préparative est soumis à un dosage radioimmunologique de la s neurotensine. Le dosage de la neurotensine a été effectué à l'aide d'un anticorps dirigé contre le fragment C-terminal de la neurotensine de porc (Marcos et al., Peptides 1996, 17: 139-146).
L'anticorps est utilisé à une dilution finale de 1:50 000, et la sensibilité du dosage est de 10 pg. Le dosage radioimmunologique est effectué
lo à 4°C dans un tampon véronal 0,02 M (pH 8,6) contenant 4% d'albumine sérique bovine et 7000 cpm de (3-[1251] iodotyrosyl) neurotensine (Amersham, Buckingamshire, UK). Les échantillons et l'anticorps ont été incubés à
4°C
pendant 48 h. La séparation de la fraction de traceur liée à l'anticorps a été
réalisée par précipitation en ajoutant à chaque échantillon une solution de ls y-globulines (1 % dans du tampon véronal 0,02 M) et une solution de polyéthylène glycol (20 % dans un tampon véronal 0,02 M contenant 0,1 d'albumine sérique bovine et 0,1 % de triton X-100). Après une incubation de 20 min à température ambiante, les échantillons sont centrifugés (3 000 x g, 30 min) et les culots comptés dans un compteur gamma.
EXEMPLE 1 : Internalisation du récepteur NTR1-EGFP en présence de neurotensine de grenouille ou de rat 1) Caractérisation du récepteur NTR1-EGFP
2s Le récepteur NTR1-EGFP est exprimé de façon stable dans la lignée cellulaire CHO et ses propriétés de liaison et de transmission du signal intracellulaire ont été déterminées. L'affinité de la neurotensine s'est révélée du même ordre (0,3 nM) pour le récepteur NTR1-EGFP et le récepteur NT1 sauvage. De la même façon, le récepteur marqué conduit à la production 3o d'inositols phosphates avec une EC50 (1 nM) identique à celle obtenue pour le récepteur NT1 sauvage (résultats non présentés).
2) Internalisation du récepteur NTR9-EGFP en présence de neurotensine de grenouille ou de rat Les cellules incubées avec du tampon seul ou avec des concentrations faibles (concentrations inférieures à 1 nM) de neurotensine de s rat ou de grenouille présentent une fluorescence marquée du récepteur NTR1-EGFP localisée à la membrane des cellules (Fig. 1 a).
L'incubation des cellules CHO-NTR1-EGFP avec des concentrations croissantes de neurotensine (gamme commençant à 10 nM) entraîne une internalisation des récepteurs NTR1-EGFP, indiquée par une lo diminution du marquage fluorescent membranaire et par la formation de nombreuses vésicules fluorescentes intracytoplasmiques de 0,6 pm de diamètre (Fig. 1 b). Ce type de marquage n'est pas détecté lorsque le ligand est préalablement dissocié des récepteurs de surface suite à un lavage acide effectué à la fin de la période de charge (Fig. 2a). Ces résultats indiquent que ls l'internalisation observée résulte de la fixation de la neurotensine sur les récepteurs membranaires pendant la période de charge.
EXEMPLE 2 : Internalisation du récepteur NTR1-EGFP en présence de fractions prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille Dans une première série d'expériences, 0,5 pl de chacune des 120 fractions d'élution d'un extrait de cerveaux de grenouille (prépurifié sur une colonne semi-préparative) ont été poolées par 10, donnant naissance à 12 pools de 10 fractions, chacun complété à 50 pl avec du tampon d'Earle's. Seul 2s le pool 2 contenant les fractions 11 à 20 entraine l'internalisation du récepteur NTR1-EGFP.
Dans une seconde série d'expériences, les fractions du pool 2, c'est à dire les fractions 11 à 20 (0,5 NI de volume de fraction originale dilué à
50 pl avec du tampon d'Earle's) ont été testées individuellement. Seules les 3o fractions 15,16,17,18 entraînent l'internalisation du récepteur NTR1-EGFP
(Fig.
3). Cette internalisation n'est pas détectée si les cellules sont soumises à
un lavage acide à la fin de la période de charge (Fig. 2b) indiquant que l'internalisation observée est le résultat de la fixation d'un ligand spécifique sur les récepteurs NTR1-EGFP pendant la période de charge.
EXEMPLE 3 : Dosage radioimmunologique de la neurotensine sur les fractions s prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille Le dosage radioimmunologique des fractions prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille utilisant un anticorps dirigé contre la région conservée de la neurotensine montre que le matériel immunoréactif est lo exclusivement contenu dans les fractions 15,16,17,18 (Fig. 4). La quantité
totale apparente de neurotensine mesurée dans les fractions d'élution de l'HPLC semi-préparative est de 894 ng dans 16 ml, ce qui correspond à une valeur de 352 pg de peptide par cerveau de grenouille. Par conséquent, le matériel provoquant l'internalisation du récepteur NTR1-EGFP, contenu dans ls les fractions 15,16,17,18 correspond à la neurotensine endogène du cerveau de grenouille.
En conclusion, le procédé d'internalisation décrit ci-dessus est un moyen direct, simple, spécifique et fiable, permettant de détecter à partir de l'observation d'une seule cellule une quantité de neurotensine aussi faible que 20 500 fmoles dans 50 NI. II apparaît que cette mesure est réalisable aussi bien sur une solution pure de neurotensine que sur une fraction d'extrait de tissu contenant non seulement la neurotensine mais aussi un grand nombre d'autres neuropeptides (le nombre minimum estimé par fraction étant de 50 peptides), avec une sensibilité similaire puisque l'on arrive à détecter, d'après le dosage 2s RIA, environ 250 fmoles.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANTS:
(A) NOM: INSERM
(B) RUE: 101 rue de Tolbiac (C) VILLE: Paris (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 75013 (G) TELEPHONE: 0144236000 (H) TELECOPIE: 0145856856 (A) NOM: UNIVERSITE McGILL
(B) RUE: 3550, rue University (C) VILLE: Montréal (E) PAYS: QUEBEC
(F) CODE POSTAL: H3A 2A7 (G) TELEPHONE: (514)3984200 (H) TELECOPIE: (514)3988479 (ü) TITRE DE L'INVENTION: Procédé de criblage utile pour identifier des ligands potentiels pour un récepteur capable de s'internaliser.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: ADN
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: non pertinent (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEO ID NO: 1:
(2) INFORMATION POUR LA SEO ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü) TYPE DE MOLECULE: ADN
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: non pertinent (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: 6) Radioimmunoassay of neurotensin on prepurified fractions of a frog brain extract A volume of 5 μl of each fraction collected at the output of HPLC
semi-preparative is subjected to a radioimmunoassay of the s neurotensin. The neurotensin assay was performed using a antibody to the C-terminal fragment of porcine neurotensin (Marcos et al., Peptides 1996, 17: 139-146).
The antibody is used at a final dilution of 1:50 000, and the sensitivity of the assay is 10 pg. Radioimmunoassay is performed lo at 4 ° C in 0.02 M veronal buffer (pH 8.6) containing 4% albumin bovine serum and 7000 cpm of (3- [1251] iodotyrosyl) neurotensin (Amersham, Buckingamshire, UK). The samples and the antibody were incubated at 4 ° C
for 48 h. Separation of the tracer fraction bound to the antibody was performed by precipitation by adding to each sample a solution of ls y-globulins (1% in 0.02 M veronal buffer) and a solution of polyethylene glycol (20% in 0.02 M veronal buffer containing 0.1 bovine serum albumin and 0.1% newt X-100). After an incubation of 20 min at room temperature, the samples are centrifuged (3,000 xg, 30 min) and the pellets counted in a gamma counter.
EXAMPLE 1 Internalization of the NTR1-EGFP receptor in the presence of frog or rat neurotensin 1) Characterization of the NTR1-EGFP receptor 2s The NTR1-EGFP receptor is stably expressed in the CHO cell line and its binding and transmission properties of signal intracellular have been determined. The affinity of neurotensin has revealed from same order (0.3 nM) for the NTR1-EGFP receptor and the NT1 receptor wild. Likewise, the labeled receptor leads to production 3o of phosphate inositols with an EC50 (1 nM) identical to that obtained for the wild-type NT1 receptor (results not shown).
2) Internalization of the NTR9-EGFP receptor in the presence of frog or rat neurotensin Cells incubated with buffer alone or with low concentrations (concentrations below 1 nM) of neurotensin s rat or frog show marked fluorescence of the NTR1- receptor EGFP localized to the cell membrane (Fig. 1 a).
Incubation of CHO-NTR1-EGFP cells with increasing neurotensin concentrations (range starting at 10 nM) induces internalization of the NTR1-EGFP receptors, indicated by a lo decrease in fluorescent membrane labeling and by the formation of numerous intracytoplasmic fluorescent vesicles of 0.6 pm diameter (Fig. 1 b). This type of marking is not detected when the ligand East previously dissociated from surface receptors following an acid wash performed at the end of the charging period (Fig. 2a). These results indicate than ls the internalization observed results from the fixation of neurotensin on the membrane receptors during the charge period.
EXAMPLE 2 Internalization of the NTR1-EGFP receptor in the presence of prepurified fractions of a frog brain extract In a first series of experiments, 0.5 μl of each of the 120 fractions of elution of a frog brain extract (prepurified on a semi-preparative column) were pooled by 10, giving birth to 12 pools of 10 fractions, each completed to 50 µl with Earle's buffer. Alone 2s pool 2 containing fractions 11 to 20 causes the internalization of the receiver NTR1-EGFP.
In a second series of experiments, the fractions of pool 2, i.e. fractions 11 to 20 (0.5 NI of original fraction volume diluted to 50 μl with Earle's buffer) were tested individually. Only the 3o fractions 15,16,17,18 lead to the internalization of the NTR1-EGFP receptor (Fig.
3). This internalization is not detected if the cells are subjected to a acid wash at the end of the charging period (Fig. 2b) indicating that the internalization observed is the result of the binding of a ligand specific on NTR1-EGFP receptors during the charging period.
EXAMPLE 3 Radioimmunoassay of Neurotensin on the Fractions s pre-purified from an extract of frog brains The radioimmunoassay of the prepurified fractions of a frog brain extract using an antibody to region conserved neurotensin shows that the immunoreactive material is lo exclusively contained in fractions 15,16,17,18 (Fig. 4). The amount total apparent neurotensin measured in the elution fractions of the semi-preparative HPLC is 894 ng in 16 ml, which corresponds to a 352 pg peptide value per frog brain. Therefore, the material causing the internalization of the NTR1-EGFP receptor, contained in ls the fractions 15,16,17,18 corresponds to the endogenous neurotensin of the brain of frog.
In conclusion, the internalization process described above is a direct, simple, specific and reliable means to detect from the observation of a single cell such a small amount of neurotensin than 20,500 fmoles in 50 NI. It appears that this measure is also feasible well on a pure neurotensin solution than on a fraction of tissue extract containing not only neurotensin but also a large number of other neuropeptides (the minimum estimated number per fraction being 50 peptides), with a similar sensitivity since we can detect, from the dosage 2s RIA, around 250 fmoles.
LIST OF SEQUENCES
(1) GENERAL INFORMATION:
(i) DEPOSITORS:
(A) NAME: INSERM
(B) STREET: 101 rue de Tolbiac (C) CITY: Paris (E) COUNTRY: France (F) POSTAL CODE: 75013 (G) TELEPHONE: 0144236000 (H) FAX: 0145856856 (A) NAME: McGILL UNIVERSITY
(B) STREET: 3550 University Street (C) CITY: Montreal (E) COUNTRY: QUEBEC
(F) POSTAL CODE: H3A 2A7 (G) TELEPHONE: (514) 3984200 (H) FAX: (514) 3988479 (ü) TITLE OF THE INVENTION: Screening method useful for identifying potential ligands for a receiver capable of internalizing.
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 2 (iv) COMPUTER-READABLE FORM:
(A) TYPE OF SUPPORT: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release # 1.0, Version # 1.25 (EPO) (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ü) TYPE OF MOLECULE: DNA
(vi) ORIGIN:
(A) ORGANIZATION: not relevant (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEO ID NO: 1:
(2) INFORMATION FOR SEO ID NO: 2:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ü) TYPE OF MOLECULE: DNA
(vi) ORIGIN:
(A) ORGANIZATION: not relevant (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: