CA2274012A1 - Compositions pesticides, plus particulierement insecticides, a base de diterpenes de la famille des daphnanes - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne des compositions pesticides, plus particulièrement insecticides, comprenant comme substance active au moins un diterpène de la famille des daphnanes ou un extrait de plante contenant au moins un diterpène de la famille des daphnanes.
Description
COMPOSITIONS PESTICIDES, PLUS
PARTICULI~REMENT INSECTICIDES, Ä BASE DE DITERP~NES DE
LA FAMILLE DES DAPHNANES.
La présente invention concerne de nouvelles compositions pesticides, plus particulièrement insecticides, comprenant comme substance active un diterpène de la famille des daphnanes. L'invention concerne également la préparation de ces diterpènes soit par synthèse chimique, soit à partir d'extrait de plantes.
L'utilisation intensive des insecticides de synthè~.c favorise le développement de résistances (1) et justifie la recherche de nouveaux insecticides.
Les plantes produisent, selon un même schéma de bio~5~nthèse, des métabolites secondaires les protégeant de l'attaque de divers herbivores (2). Ceux-ci con~t:tuent une source très importante de substances biologiquement actives et biodégradables mais dont peu présent er.t des caractéristiques leur permettant de concuT:E-~ncer les composés agrochimiques synthétiques.
Cep substances peuvent être utilisées comme modèlt~= t~uz la préparation d'analogues susceptibles de pré~~E.~::~ ~ : U~~s avantages par rapport au composé original (3).
Lue:.- travaux ayant conduit à la présente invf>.-w. i ~ :. ter. t e té réalisés dans le cadre d' un programme de c: . i. ï n«t tie~ plantes sauvages du Soudan visant à
ident:'.:c~r cive nouveaux composés chimiques présentant des activetE~:. agronomiques intéressantes. Parmi les matérieàs analysés durant ce programme, l'exploitation d'un extrait méthanolique de racines de Lasiosiphon kraussianus (Meisn. ) (Thymelaeceae) a permis de caractériser deux terpènes de la famille des daphnanes, connus sous les noms de Excoecariatoxine et Wikstrotoxine D et répondant à la formule développée ci-dessous .
O
~~4, I 5 12 ~'~ 16 1811m(I(~O~I~~) 14 O III II i" H
4 6 "~ ~~~
~ I OH ~
O OH OH
5 dans laquelle le groupement R représente, - un groupe (E,E)-nona-1,3-diényle, dans le cas de l'Excoecariatoxine, et - un groupe nonanyle, dans le cas de la Wikstrotoxine D.
LO
La plante Lasiosiphon kraussianus est largement distribuée en Afrique (9), notamment à Darfour à l'ouest du Soudan, où elle est connue sous le nom de "Komma" ou "Mahjiria". Les racines sur lesquelles a été
l5 effectuée l'étude ayant conduit à l'invention ont été
collectées au Soudan dans le Jebel Marra, situé à Wadi mertagello à 1160 mètres au dessus du niveau de la mer, par K. Uhlig et A. A. Adam du Jebel Marra Forest Circle, Golol au Soudan, où des spécimens sont conservés.
20 Une description détaillée de Lasiosiphon kraussianus a déjà été réalisée (10) et les études pharmacologiques effectuées à partir d'extraits de ses racines ont permis d'obtenir des résultats intéressants contre des types de leucémie (4, 5), mais aucune activité insecticide n'a été décrite jusqu'à ce jour.
La présence d'Excoecariatoxine dans les racines de Lasiosiphon kraussianus (6) et dans d'autres T ~ __.____~ ~_... __.__. _. _..
WO 98!24318 - PCT/FR97/02194 plantes comme Excoecaria agalloa (Euphorbiaceae) (6) et Gnidia lamprantha (Thymelaeceae) (7) a déjà été décrite dans l'art antérieur. La présence de la Wikstrotoxine D
dans des plantes, comme Wikstroemi monticola S (Thymelaeceae) (8) a également déjà été rapportée mais jamais dans Lasiosiphon kraussianus.
Les travaux effectués par les Inventeurs sur un extrait méthanolique de racines de Lasiosiphon kraussianus (Meisn. ) et sur les deux composés diterpéniques de type daphnane qui en ont été isolés ont maintenant permis de mettre en évidence d'intéressantes propriétés qui permettent leur utilisation dans la lutte contre certains insectes nuisibles.
IS I1 peut s' agir de parasites de végétaux ou de parties de végétaux, du sol, des locaux domestiques ou publics et d'animaux à sang chaud. Parmi-ceux-ci, on peut citer les pucerons et les diptères, parasites importants en agriculture et en santé et hygiène vétérinaire et humaine.
En conséquence, l'invention concerne ies compositions pesticides, plus particulièrement insecticides) comprenant comme substance active au moins un diterpène de la famille des daphnanes ou un extrait de plante contenant au moins un diterpène de la famille des daphnanes.
Par famille des daphnanes, on entend selon l'invention également les produits apparentés aux daphnanes, tels que les ingénanes.
Plus particulièrement l'invention concerne les compositions insecticides comprenant comme substance active au moins un composé de formule (I) ci-après ou un ' extrait de plante contenant le(s)dits composés) .
~+
R, ~ R 1 ..
~2 ( I) R~ R11 ?- R10 dans laquelle .
- les groupements R1, R2 et R3 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un groupe alkyle, alkényle, aryle) linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou les groupements R1 et R2 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et
PARTICULI~REMENT INSECTICIDES, Ä BASE DE DITERP~NES DE
LA FAMILLE DES DAPHNANES.
La présente invention concerne de nouvelles compositions pesticides, plus particulièrement insecticides, comprenant comme substance active un diterpène de la famille des daphnanes. L'invention concerne également la préparation de ces diterpènes soit par synthèse chimique, soit à partir d'extrait de plantes.
L'utilisation intensive des insecticides de synthè~.c favorise le développement de résistances (1) et justifie la recherche de nouveaux insecticides.
Les plantes produisent, selon un même schéma de bio~5~nthèse, des métabolites secondaires les protégeant de l'attaque de divers herbivores (2). Ceux-ci con~t:tuent une source très importante de substances biologiquement actives et biodégradables mais dont peu présent er.t des caractéristiques leur permettant de concuT:E-~ncer les composés agrochimiques synthétiques.
Cep substances peuvent être utilisées comme modèlt~= t~uz la préparation d'analogues susceptibles de pré~~E.~::~ ~ : U~~s avantages par rapport au composé original (3).
Lue:.- travaux ayant conduit à la présente invf>.-w. i ~ :. ter. t e té réalisés dans le cadre d' un programme de c: . i. ï n«t tie~ plantes sauvages du Soudan visant à
ident:'.:c~r cive nouveaux composés chimiques présentant des activetE~:. agronomiques intéressantes. Parmi les matérieàs analysés durant ce programme, l'exploitation d'un extrait méthanolique de racines de Lasiosiphon kraussianus (Meisn. ) (Thymelaeceae) a permis de caractériser deux terpènes de la famille des daphnanes, connus sous les noms de Excoecariatoxine et Wikstrotoxine D et répondant à la formule développée ci-dessous .
O
~~4, I 5 12 ~'~ 16 1811m(I(~O~I~~) 14 O III II i" H
4 6 "~ ~~~
~ I OH ~
O OH OH
5 dans laquelle le groupement R représente, - un groupe (E,E)-nona-1,3-diényle, dans le cas de l'Excoecariatoxine, et - un groupe nonanyle, dans le cas de la Wikstrotoxine D.
LO
La plante Lasiosiphon kraussianus est largement distribuée en Afrique (9), notamment à Darfour à l'ouest du Soudan, où elle est connue sous le nom de "Komma" ou "Mahjiria". Les racines sur lesquelles a été
l5 effectuée l'étude ayant conduit à l'invention ont été
collectées au Soudan dans le Jebel Marra, situé à Wadi mertagello à 1160 mètres au dessus du niveau de la mer, par K. Uhlig et A. A. Adam du Jebel Marra Forest Circle, Golol au Soudan, où des spécimens sont conservés.
20 Une description détaillée de Lasiosiphon kraussianus a déjà été réalisée (10) et les études pharmacologiques effectuées à partir d'extraits de ses racines ont permis d'obtenir des résultats intéressants contre des types de leucémie (4, 5), mais aucune activité insecticide n'a été décrite jusqu'à ce jour.
La présence d'Excoecariatoxine dans les racines de Lasiosiphon kraussianus (6) et dans d'autres T ~ __.____~ ~_... __.__. _. _..
WO 98!24318 - PCT/FR97/02194 plantes comme Excoecaria agalloa (Euphorbiaceae) (6) et Gnidia lamprantha (Thymelaeceae) (7) a déjà été décrite dans l'art antérieur. La présence de la Wikstrotoxine D
dans des plantes, comme Wikstroemi monticola S (Thymelaeceae) (8) a également déjà été rapportée mais jamais dans Lasiosiphon kraussianus.
Les travaux effectués par les Inventeurs sur un extrait méthanolique de racines de Lasiosiphon kraussianus (Meisn. ) et sur les deux composés diterpéniques de type daphnane qui en ont été isolés ont maintenant permis de mettre en évidence d'intéressantes propriétés qui permettent leur utilisation dans la lutte contre certains insectes nuisibles.
IS I1 peut s' agir de parasites de végétaux ou de parties de végétaux, du sol, des locaux domestiques ou publics et d'animaux à sang chaud. Parmi-ceux-ci, on peut citer les pucerons et les diptères, parasites importants en agriculture et en santé et hygiène vétérinaire et humaine.
En conséquence, l'invention concerne ies compositions pesticides, plus particulièrement insecticides) comprenant comme substance active au moins un diterpène de la famille des daphnanes ou un extrait de plante contenant au moins un diterpène de la famille des daphnanes.
Par famille des daphnanes, on entend selon l'invention également les produits apparentés aux daphnanes, tels que les ingénanes.
Plus particulièrement l'invention concerne les compositions insecticides comprenant comme substance active au moins un composé de formule (I) ci-après ou un ' extrait de plante contenant le(s)dits composés) .
~+
R, ~ R 1 ..
~2 ( I) R~ R11 ?- R10 dans laquelle .
- les groupements R1, R2 et R3 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un groupe alkyle, alkényle, aryle) linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou les groupements R1 et R2 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et
(2), ou encore les groupements R1, R2 et R3 représentent ensemble un groupe de fornnule .
Oi (~) R1~~0_(14) (II) 0~
(9) dans laquelle le groupement R1~ représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou encore le groupe R1~ est cyclisé sur le carbone (1) pour former des daphnanes macrocyliques;
- les groupements R11 et R12 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une T
WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment, ou encore R11 et R12 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (6) et (7) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (6) et (7);
- les groupements R6 et R~ sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées) un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment, ou encore R6 et R~ représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (1) et (2) ;
- le groupement Rg est choisi parmi un atome d'hydrogène, une fonction cétone de formule =O ou un dérivé de cétone de type oxime, acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- les groupements Rlp, R13 et R~q sont choisis parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- le groupement R15 est choisi parmi un atome d'hydrogène, une cétone de formule =O ou un dérivé
de cétone de type acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- le groupement R5 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment ;
- le groupement Rg représente un atome d' hydrogène ou une liaison entre les carbones ( 10 ) et (11) se substituant à la liaison entre les carbones (9) IS et (11) pour donner au composé de formule (I) une structure de type ingénane;
- le groupement Rq est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées.
Parmi les composés de formule (I) ci-dessous, l'invention envisage plus particulièrement ceux dans lesquels .
- les groupements R1, R2 et R3 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un groupe alkyle, alkényle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées; ou les groupements R1 et R2 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2); ou encore les groupements R1, R2 et R3 représentent ensemble un groupe de formule .
_~._ .._ _._..... T __~_ _._.:. .~.._m...
WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 Oi (13) R17~ (II) 0-(14) 0~
(9) dans laquelle le groupement R17 représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou encore le groupe R1~ est cyclisé sur le carbone (1) pour former des daphnanes macroçyliques;
- les groupements R11 et R12 sont des atomes d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison l0 entre les carbones (6) et (7) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (6) et (7);
- les groupements R6 et R~ sont des atomes d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (1) et (2);
- le groupement Rg est un atome d'hydrogène ou une fonction cétone de formule =O ou un dérivé de cétone de type oxime, acétal) hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, ou représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- les groupements Rip, R13 et R14 représentent un atome d'hydrogène ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- le groupement R15 est un atome d'hydrogène;
le groupement R5 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, linéaire, - 30 ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées;
WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 - le groupement Rg représente un atome d'hydrogène;
le groupement R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle) alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées.
Parmi les composés ci-dessus, on peut citer !0 tout particulièrement l'Excoecariatoxine, la Wikstrotoxine D ou un extrait de plante, comme Lasiosiphon kraussianus, les contenant.
Les composés de formule (I), constituant la LS substance active des compositions pesticides de l'invention, peuvent être synthétiques, hémisynthétiques ou naturels.
Les composés naturels, comme l'Excoecariatoxine la Wikstrotoxine D, peuvent être 20 obtenu< <~ partir de plantes, notamment comme décrit dans les ex~,r;F~les ci-après à partir d'un extrait méthanolique de rac_¿IE'f. dF Lasiosiphon kraussianus.
La Wikstrotoxine D n'ayant jamais été décrit dan: ..a.-: c~; iphon kraussianus, l' invention envisage 25 spéc~~:quc~ment l'obtention de la Wikstrotoxine D à
partir c:~ rmcines Lasiosiphon kraussianus. Un procédé
d' oh; E-r:' :c,:: àe Wikstrotoxine D à partir de racines La: :~~_ :y:: :. j::-aussianus consiste par exemple à
- extraire les principes actifs à partir 30 d' c~: c~~s:.~~_ v~<~~m~taux par exemple à l' aide de solvants;
- purifier les substances recherchées toute opér at i <~:: cic~ purification appropriée.
Ues opérations de purification susceptibles d'être- e~;p:oyées sont par exemple les opérations 35 suivantes . partage avec des solvants non miscibles, chromatographie d'adsorption en phase polaire et en T ~._~_ WO 98124318 ~ PCT1FR97/02194 phase inverse, gel filtration; opérations qui sont tout d'abord effectuées à une échelle préparative, puis en HPLC pour obtenir les produits purs.
Ces composés, ainsi que leurs analogues et _5 dérivés peuvent aussi être obtenus par synthèse ou hémisynthèse.
Outre la substance active, les compositions de l'invention peuvent contenir un ou plusieurs véhicules habituels des pesticides et insecticides, tels que des solvants, des mouillants, des dispersants, etc....
Ces compositions peuvent se présenter sous forme de poudres, granulés, suspensions, émulsions, solutions, ou autres formulations traditionnellement employées dans ce domaine et permettant divers modes d'applications comme l'épandage, la pulvérisation, etc...
La dose à appliquer varie àvec le composé
mis en oeuvre, le type de composition utilisée et son mode d'application, et dépend en outre de la nature du parasite à combattre ainsi que de l'espèce végétale ou du lieu à protéger, mais en général les compositions de l'invention peuvent contenir de 5 à 80 ~ en poids de substance active.
L'invention concerne bien entendu aussi l'utilisation des composés de formule (I) comme pesticides, plus particulièrement comme insecticides, dans la protection des cultures ou pour le traitement des lieux de stockage des produits desdites cultures ou des locaux domestiques ou publics.
- D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront au cours de la description qui suit et qui se réfère à des exemples de préparation des composés de formule (I) et de leur utilisation comme pesticides, étant entendu que ces exemples ne sauraient constituer une limitation quelconque de l'objet de l'invention.
Dans ces exemples, il est fait référence aux 5 dessins en annexe, dans lesquels .
- La figure 1 représente le chromatogramme d'HPLC préparative en phase inverse sur fraction brute de l'extrait étudié.
- La figure 2 représente le chromatogramme 10 d'HPLC analytique en phase inverse sur l'Excoecariatoxine après la collecte.
I - MATÉRIEL ET MÉTHODES.
IS 1) Matériel véaétal.
Les racines ont d'abord été découpées puis séchées pendant deux semaines avant d'être transportées en France, où elles ont été étendues et stockées à la température ambiante (20°C). Elles ont ensuite été
broyées pour être utilisées sous forme de poudre.
a) Extraction.
700 g de de la poudre de racine ont été
placés dans un flacon conique de 2 litres. 1200 ml de méthanol ont été ajoutés et le flacon a été agité
pendant deux heures puis laissé une nuit au réfrigérateur. Après filtration sous vide, une extraction supplémentaire a été pratiquée avec 600 ml de méthanol sur le culot solide séché. Les deux filtrats ont été rassemblés et évaporés avec un évaporateur rotatif (40°C) sous vide partiel. L'extrait concentré a été finalement dissous dans 25 ml de méthanol, dont 5 ml ont été utilisés pour les essais biologiques grossiers.
b) Fractionnement.
L'extrait méthanolique (20 ml) a été
suspendu dans 40 ml d'eau et partagé dans du T -_._~~~_.. -._____ WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 dichlorométhane (2 fois 60 ml). La fraction non polaire, où l'activité a été mise en évidence, a ensuite été
chromatographiée sur une colonne de gel de silice (40 cm x 2,5 cm). 80 g de gel de silice, dont les particules ont une taille comprise entre 0,063 et 0,125 mm (120-130 mesh ATSM), ont été. conditionnées dans du dichlorométhane. Pour l'élution, la fraction a été
soumise à une chromatographie avec un gradient de dichlorométhane jusqu'à un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle/méthanol (0/60/40, v/v), à un débit de 3 ml/mn (Matériel Waters . formeur de gradient modèle 600). Soixante tubes (18 mm x 180 mm) contenant 16 ml chacun, ont été collectés. Tous les tubes ont été soumis à un contrôle par une chromatographie en couche mince (CCM) (Polygram sil G/UV
254, épaisseur de couche 0,25 mm, Macherey-Nagel), élués avec un mélange héxane/acétate d'éthyle (30/70, v/v), et observés sous lumière UV à 254 nm puis rassemblés en 11 fractions. L'activité insecticide à été montrée dans les fractions No. 3, 4, 9 et 10.
Les fractions 9 et 10 ont été rassemblées et rechromatographiées par gel filtration (Colonne . 1,3 m x 2,5 cm. Support . Sephadex LH 20 Pharmacia, particules de taille entre 25-100 ~.un, conditionné dans du méthanol.
Phase mobile . méthanol délivré à 2 ml/mn par une pompe Gilson 301. Détection . détecteur UVICORD LKB, longueur d'onde = 254 nm. Collecteur de fractions . Foxy, isco).
Cinquante six tubes (13 mm x 100 mm) de 7 ml chacun ont été collectés. Après contrôle en CCM, tous les tubes ont été rassemblés en 6 fractions. L'activité biologique a - été mise en évidence dans la fraction 4, qui a alors été
soumise à une HPLC préparative en phase inverse (Waters - 600, mufti solvent delivery system; Injector U6K;
Detector Waters 990, photodiode array detector; Colonne . ~.-BONDAPAK C 18 Water ' s ( 3 0 cm x 7 , 5 mm; tai l le des particules . 10 Nzn; température de la colonne . 45°C);
WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 Computer . NEC, APCIII; Plotter . Waters 990). Les conditions isocratiques étaient de . débit de 3,7 ml/mn;
phase mobile MeOH/H20 (74/26, v/v}. Chaque pic a été
collecté manuellement.
2) Insectes et acariens.
Tous les insectes (Aphis gossypii (Glov), Myzus persicae (Sulz), Drosophila melanogaster (Meig), Spodoptera littorales (Boisd), Sitophilus granarius L.
et l'acarien Tetranychus urticae (Koch) sont des souches sensibles. Ils sont élevées dans des conditions contrôlées (20 ~ 2°C, 60 ~ 10 ~ R.H. et 8 h/16 h de nuit/lumière}. A. gossypii a été élevé sur des plantules de concombre, M. persicae sur des fèves, IS Drosophila sur un milieu semi-synthétique, S. granarius sur du blé, S. littorales sur un régime semi-synthétique et T. urticae sur des haricots.
Oi (~) R1~~0_(14) (II) 0~
(9) dans laquelle le groupement R1~ représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou encore le groupe R1~ est cyclisé sur le carbone (1) pour former des daphnanes macrocyliques;
- les groupements R11 et R12 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une T
WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment, ou encore R11 et R12 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (6) et (7) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (6) et (7);
- les groupements R6 et R~ sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées) un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment, ou encore R6 et R~ représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (1) et (2) ;
- le groupement Rg est choisi parmi un atome d'hydrogène, une fonction cétone de formule =O ou un dérivé de cétone de type oxime, acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- les groupements Rlp, R13 et R~q sont choisis parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- le groupement R15 est choisi parmi un atome d'hydrogène, une cétone de formule =O ou un dérivé
de cétone de type acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- le groupement R5 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment ;
- le groupement Rg représente un atome d' hydrogène ou une liaison entre les carbones ( 10 ) et (11) se substituant à la liaison entre les carbones (9) IS et (11) pour donner au composé de formule (I) une structure de type ingénane;
- le groupement Rq est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées.
Parmi les composés de formule (I) ci-dessous, l'invention envisage plus particulièrement ceux dans lesquels .
- les groupements R1, R2 et R3 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un groupe alkyle, alkényle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées; ou les groupements R1 et R2 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2); ou encore les groupements R1, R2 et R3 représentent ensemble un groupe de formule .
_~._ .._ _._..... T __~_ _._.:. .~.._m...
WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 Oi (13) R17~ (II) 0-(14) 0~
(9) dans laquelle le groupement R17 représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou encore le groupe R1~ est cyclisé sur le carbone (1) pour former des daphnanes macroçyliques;
- les groupements R11 et R12 sont des atomes d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison l0 entre les carbones (6) et (7) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (6) et (7);
- les groupements R6 et R~ sont des atomes d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (1) et (2);
- le groupement Rg est un atome d'hydrogène ou une fonction cétone de formule =O ou un dérivé de cétone de type oxime, acétal) hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, ou représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- les groupements Rip, R13 et R14 représentent un atome d'hydrogène ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- le groupement R15 est un atome d'hydrogène;
le groupement R5 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, linéaire, - 30 ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées;
WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 - le groupement Rg représente un atome d'hydrogène;
le groupement R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle) alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées.
Parmi les composés ci-dessus, on peut citer !0 tout particulièrement l'Excoecariatoxine, la Wikstrotoxine D ou un extrait de plante, comme Lasiosiphon kraussianus, les contenant.
Les composés de formule (I), constituant la LS substance active des compositions pesticides de l'invention, peuvent être synthétiques, hémisynthétiques ou naturels.
Les composés naturels, comme l'Excoecariatoxine la Wikstrotoxine D, peuvent être 20 obtenu< <~ partir de plantes, notamment comme décrit dans les ex~,r;F~les ci-après à partir d'un extrait méthanolique de rac_¿IE'f. dF Lasiosiphon kraussianus.
La Wikstrotoxine D n'ayant jamais été décrit dan: ..a.-: c~; iphon kraussianus, l' invention envisage 25 spéc~~:quc~ment l'obtention de la Wikstrotoxine D à
partir c:~ rmcines Lasiosiphon kraussianus. Un procédé
d' oh; E-r:' :c,:: àe Wikstrotoxine D à partir de racines La: :~~_ :y:: :. j::-aussianus consiste par exemple à
- extraire les principes actifs à partir 30 d' c~: c~~s:.~~_ v~<~~m~taux par exemple à l' aide de solvants;
- purifier les substances recherchées toute opér at i <~:: cic~ purification appropriée.
Ues opérations de purification susceptibles d'être- e~;p:oyées sont par exemple les opérations 35 suivantes . partage avec des solvants non miscibles, chromatographie d'adsorption en phase polaire et en T ~._~_ WO 98124318 ~ PCT1FR97/02194 phase inverse, gel filtration; opérations qui sont tout d'abord effectuées à une échelle préparative, puis en HPLC pour obtenir les produits purs.
Ces composés, ainsi que leurs analogues et _5 dérivés peuvent aussi être obtenus par synthèse ou hémisynthèse.
Outre la substance active, les compositions de l'invention peuvent contenir un ou plusieurs véhicules habituels des pesticides et insecticides, tels que des solvants, des mouillants, des dispersants, etc....
Ces compositions peuvent se présenter sous forme de poudres, granulés, suspensions, émulsions, solutions, ou autres formulations traditionnellement employées dans ce domaine et permettant divers modes d'applications comme l'épandage, la pulvérisation, etc...
La dose à appliquer varie àvec le composé
mis en oeuvre, le type de composition utilisée et son mode d'application, et dépend en outre de la nature du parasite à combattre ainsi que de l'espèce végétale ou du lieu à protéger, mais en général les compositions de l'invention peuvent contenir de 5 à 80 ~ en poids de substance active.
L'invention concerne bien entendu aussi l'utilisation des composés de formule (I) comme pesticides, plus particulièrement comme insecticides, dans la protection des cultures ou pour le traitement des lieux de stockage des produits desdites cultures ou des locaux domestiques ou publics.
- D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront au cours de la description qui suit et qui se réfère à des exemples de préparation des composés de formule (I) et de leur utilisation comme pesticides, étant entendu que ces exemples ne sauraient constituer une limitation quelconque de l'objet de l'invention.
Dans ces exemples, il est fait référence aux 5 dessins en annexe, dans lesquels .
- La figure 1 représente le chromatogramme d'HPLC préparative en phase inverse sur fraction brute de l'extrait étudié.
- La figure 2 représente le chromatogramme 10 d'HPLC analytique en phase inverse sur l'Excoecariatoxine après la collecte.
I - MATÉRIEL ET MÉTHODES.
IS 1) Matériel véaétal.
Les racines ont d'abord été découpées puis séchées pendant deux semaines avant d'être transportées en France, où elles ont été étendues et stockées à la température ambiante (20°C). Elles ont ensuite été
broyées pour être utilisées sous forme de poudre.
a) Extraction.
700 g de de la poudre de racine ont été
placés dans un flacon conique de 2 litres. 1200 ml de méthanol ont été ajoutés et le flacon a été agité
pendant deux heures puis laissé une nuit au réfrigérateur. Après filtration sous vide, une extraction supplémentaire a été pratiquée avec 600 ml de méthanol sur le culot solide séché. Les deux filtrats ont été rassemblés et évaporés avec un évaporateur rotatif (40°C) sous vide partiel. L'extrait concentré a été finalement dissous dans 25 ml de méthanol, dont 5 ml ont été utilisés pour les essais biologiques grossiers.
b) Fractionnement.
L'extrait méthanolique (20 ml) a été
suspendu dans 40 ml d'eau et partagé dans du T -_._~~~_.. -._____ WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 dichlorométhane (2 fois 60 ml). La fraction non polaire, où l'activité a été mise en évidence, a ensuite été
chromatographiée sur une colonne de gel de silice (40 cm x 2,5 cm). 80 g de gel de silice, dont les particules ont une taille comprise entre 0,063 et 0,125 mm (120-130 mesh ATSM), ont été. conditionnées dans du dichlorométhane. Pour l'élution, la fraction a été
soumise à une chromatographie avec un gradient de dichlorométhane jusqu'à un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle/méthanol (0/60/40, v/v), à un débit de 3 ml/mn (Matériel Waters . formeur de gradient modèle 600). Soixante tubes (18 mm x 180 mm) contenant 16 ml chacun, ont été collectés. Tous les tubes ont été soumis à un contrôle par une chromatographie en couche mince (CCM) (Polygram sil G/UV
254, épaisseur de couche 0,25 mm, Macherey-Nagel), élués avec un mélange héxane/acétate d'éthyle (30/70, v/v), et observés sous lumière UV à 254 nm puis rassemblés en 11 fractions. L'activité insecticide à été montrée dans les fractions No. 3, 4, 9 et 10.
Les fractions 9 et 10 ont été rassemblées et rechromatographiées par gel filtration (Colonne . 1,3 m x 2,5 cm. Support . Sephadex LH 20 Pharmacia, particules de taille entre 25-100 ~.un, conditionné dans du méthanol.
Phase mobile . méthanol délivré à 2 ml/mn par une pompe Gilson 301. Détection . détecteur UVICORD LKB, longueur d'onde = 254 nm. Collecteur de fractions . Foxy, isco).
Cinquante six tubes (13 mm x 100 mm) de 7 ml chacun ont été collectés. Après contrôle en CCM, tous les tubes ont été rassemblés en 6 fractions. L'activité biologique a - été mise en évidence dans la fraction 4, qui a alors été
soumise à une HPLC préparative en phase inverse (Waters - 600, mufti solvent delivery system; Injector U6K;
Detector Waters 990, photodiode array detector; Colonne . ~.-BONDAPAK C 18 Water ' s ( 3 0 cm x 7 , 5 mm; tai l le des particules . 10 Nzn; température de la colonne . 45°C);
WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 Computer . NEC, APCIII; Plotter . Waters 990). Les conditions isocratiques étaient de . débit de 3,7 ml/mn;
phase mobile MeOH/H20 (74/26, v/v}. Chaque pic a été
collecté manuellement.
2) Insectes et acariens.
Tous les insectes (Aphis gossypii (Glov), Myzus persicae (Sulz), Drosophila melanogaster (Meig), Spodoptera littorales (Boisd), Sitophilus granarius L.
et l'acarien Tetranychus urticae (Koch) sont des souches sensibles. Ils sont élevées dans des conditions contrôlées (20 ~ 2°C, 60 ~ 10 ~ R.H. et 8 h/16 h de nuit/lumière}. A. gossypii a été élevé sur des plantules de concombre, M. persicae sur des fèves, IS Drosophila sur un milieu semi-synthétique, S. granarius sur du blé, S. littorales sur un régime semi-synthétique et T. urticae sur des haricots.
3 ) Tests biolocrigues.
a) Activité contre A. ossypii et M.
Persicae.
Ces tests ont été effectués dans des boîtes de 2,7 cm de diamètre. Ces boîtes ont été remplies d'un gel semi-solide agar-agar. Des disques de feuilles de concombre (de fève dans le cas de M. persicae) ont été
placés sur l'agar. Deux à trois heures avant le traitement, quinze aptères adultes ont été placés dans chaque boîte pour s'adapter. Deux boîtes ont été
utilisées pour chaque dose. De l'eau déionisée et de l'acétone (80/20, v/v) ont été utilisés pour la préparation de cinq dilutions (en progression géométrique) pour chaque produit. 0,5 ml de chaque dose a été directement pulvérisé sur les deux boîtes en utilisant un micropulvérisateur (acétone/eau dans le cas .__._~ _._._._____ T ____.~.__ _. __- __ WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 du contrôle), puis les boîtes ont été placées dans les conditions contrôlées décrites précédemment.
Les pucerons morts ont été comptés après 24 heures (A. gossypii) ou 48 heures (M. persicae) après l'application. Les insectes ont été considérés morts si ils se présentaient sur le côté ou sur le dos, avaient leurs pattes repliées sur la surface ventrale, montraient des signes de dessiccation, et/ou ne répondaient pas à un coup de pinceau (11). Les pourcentages de mortalité, y compris dans les tests ci-dessous, ont été corrigés par la formule d'Abbott et les valeurs CL5o ont été calculées par la méthode d'analyse des probits (12) en utilisant un logiciel spécial (13).
IS b) Activité contre la Drosophile.
- Incorporation au milieu.
Le test de toxicité globale a été effectué
dans de petits flacons de 7 cm de hauteur et 4,2 cm de diamètre. 35 grammes de milieu semi-synthétique ?0 (2,2 1 de son; 260 mi de sucre; 130 ml de levure de bière ; 70 ml de vinaigre ; 20 ml de nipagine; 580 ml d'eau) ont été placés et pressés dans chaque flacon.
Chaque traitement a été effectué en double. Dans chaque flacon, 1 ml de chaque concentration a été incorporé
25 dans le milieu (acétone et eau dans le cas du contr8le).
Deux à trois heures après le traitement (temps d'évaporation de l'acétone), 15 adultes de 0 à 3 jours (10 femelles. et 5 mâles) ont été placés dans chaque flacon. Les flacons ont été bouchés avec un coton et 30 remis dans les conditions de culture. Les adultes ont - été enlevés des flacons lorsque dans le témoin quelques larves se sont transformées en pupes (environ après 13 jours). Le nombre d'adultes a été compté tous les deux jours pendant deux semaines (7 lectures). Le pourcentage 35 d'émergence a été calculé par rapport au témoin et les valeurs CL5o ont été calculées par la méthode indiquée précédemment .
- Test tot~icrue.
Des boîtes de petri de 9 cm de diamètre ont d'abord été lavées avec de l'éther éthylique. De petits cubes de gel d'agar (10 g d'agar/1 et une petite quantité de miel) ont été placés dans chaque boîte de Petri. Les insectes ont été refroidis pendant 2,5 minutes. 0,3 ~.,ll de chaque concentration (méthanol dans le cas du contrôle) ont été appliqués sur le thorax en utilisant un micro-applicateur automatique (Burkard manufacturing co. ltd., UK). Dix insectes ont été
utilisés dans chaque traitement avec trois répétitions.
Après le traitement, les insectes du test sont remis l~ dans leurs conditions de culture. La mortalité a été
mesurée après 1, 2, 4, 6, 24 et 48 heures.
- Application par contact.
Des boîtes de petri de 9 cm de diamètre avec ou sans papiers filtres ont été utilisées. Dans les deux cas, 1 ml de chaque concentration (méthanol pour le contrôle) a été placé dans chaque boîte. Après évaporation du solvant, les petits cubes alimentaires cités précédemment et 30 insectes ont été placés dans les boîtes. Chaque traitement a été répété 3 fois et la mortalité a été mesurée après 1, 2, 4, 6, 24 et 48 heures.
c) Activité contre Spodo~tera littoralis.
- Application topique.
Des larves de troisième stade (35 ~ 10 mg) ont été utilisées. 0,5 ~l de chaque concentration (méthanol pour le contrôle) ont été appliqués topiquement sur le thorax de chaque larve. Chaque larve traitée a été placée dans une boîte séparée de 2,7 cm de diamètre) approvisionnée en milieu non traité puis replacée dans les conditions de culture. Chaque ..... _ T.. . .__~..___ ._.___ .._ m . __._ traitement incluant dix larves et un témoin a été
effectué en double. La mortalité a été mesurée après 24 et 48 heures. L'effet sur la croissance et le développement a été quantifié chez les insectes par l'apparition de nouveaux adultes.
- Application orale.
Les insectes (troisième stade larvaire) ont été privés de nourriture pendant 24 heures . A chaque petit cube de régime semi-synthétique (3,2 1 d'eau, 80 g I() agar-agar, 300 g de farine de maïs, 126 g de germes de blé, 134 g de levure de bière, 200 g de feuilles de chou, 18 g d'acide ascorbique, 4,2 g d'acide benzoïque, 7,2 g de nipagine, 10 g d'un mélange de sel, 30 g de vitamines, 5 g de fumidil, 1,5 ml de formaldehyde, 8 ml I> d'huile de lin), 0,25 E1.1 de chaque concentration (méthanol pour le contrôle) ont été appliqués. Après évaporation du solvant, un cube traité a été placé par boîte de 2,7 cm de diamètre. Les larves ont été soumises à une alimentation avec le milieu traité (dix larves pour chaque concentration). Une alimentation non traitée leur a été donnée après 24 heures. La mortalité a été
déterminée 24 et 48 heures après le traitement. Les insectes ont été observés jusqu'à l'apparition de nouveaux adultes pour enregistrer l'effet sur la croissance et le développement.
d) Activité contre Sitot~hilus aranarius.
- Application tooiaue.
Des adultes de 15 jours ont été utilisés dans ce test. 0,5 ~.~.1 de chaque concentration (méthanol pour le contrôle) ont été appliqués topiquement sur le thorax de chaque insecte en utilisant un micro applicateur. Pour chaque traitement, 25 insectes traités ont été placés dans de petits flacons de 7 cm de hauteur et 4,2 de diamètre avec une petite quantité de blé et WO 98/24318 . PCT/FR97l02194 les bouteilles ont été fermées avec une gaze. Chaque traitement y compris le contrôle a été répété deux fois.
Pour la toxicité aiguë, les mesures de mortalité ont été effectuées après 24, 48 et 72 heures.
Pour les effets sur le développement, les adultes ont été retirés des bouteilles après deux semaines et le nombre d'insectes nouvellement apparus a été compté
pendant huit semaines. Le nombre total d'insectes nouvellement émergés a été comparé à ceux du témoin comme décrit précédemment.
e) Activité contre Tetranychus urticae.
- Activité contre les adultes.
La méthode adoptée dans ce test est lï sensiblement identique à celle utilisée pour les pucerons. Des boîtes de 2,7 cm de hauteur et 4,5 cm de diamètre ont été remplies avec un gel semi-solide d'agar-agar supportant un disque de feuille de haricot.
Trente adultes ont été placés dans chaque boîte pendant trois heures avant le traitement pour s'adapter. Deux boîtes ont été utilisées pour chaque concentration.
0,5 ml de chaque concentration (méthanol pour le témoin) ont été directement pulvérisés sur les deux boîtes. Dans tous les cas, les boîtes ont été remises dans les conditions de culture. La mortalité a été mesurée après 24 et 48 heures.
- Activité contre les neufs.
Vingt adultes ont été placés dans les boîtes décrites ci-dessus pendant 48 heures. Les adultes ont ensuite été retirés et les neufs comptés. Deux boîtes ont été utilisées pour chaque concentration. 0,5 ml de chaque concentration (méthanol pour le contrôle) ont été
directement pulvérisés sur les deux boîtes. Dans tous les cas) les boîtes ont été remises dans les conditions de culture. Le nombre d'oeufs non-éclos et de larves mortes a été compté pendant 7 jours.
.. _...__ _. ~ _. _ _._ WO 98/24318 . PCTIFR97/02194
a) Activité contre A. ossypii et M.
Persicae.
Ces tests ont été effectués dans des boîtes de 2,7 cm de diamètre. Ces boîtes ont été remplies d'un gel semi-solide agar-agar. Des disques de feuilles de concombre (de fève dans le cas de M. persicae) ont été
placés sur l'agar. Deux à trois heures avant le traitement, quinze aptères adultes ont été placés dans chaque boîte pour s'adapter. Deux boîtes ont été
utilisées pour chaque dose. De l'eau déionisée et de l'acétone (80/20, v/v) ont été utilisés pour la préparation de cinq dilutions (en progression géométrique) pour chaque produit. 0,5 ml de chaque dose a été directement pulvérisé sur les deux boîtes en utilisant un micropulvérisateur (acétone/eau dans le cas .__._~ _._._._____ T ____.~.__ _. __- __ WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 du contrôle), puis les boîtes ont été placées dans les conditions contrôlées décrites précédemment.
Les pucerons morts ont été comptés après 24 heures (A. gossypii) ou 48 heures (M. persicae) après l'application. Les insectes ont été considérés morts si ils se présentaient sur le côté ou sur le dos, avaient leurs pattes repliées sur la surface ventrale, montraient des signes de dessiccation, et/ou ne répondaient pas à un coup de pinceau (11). Les pourcentages de mortalité, y compris dans les tests ci-dessous, ont été corrigés par la formule d'Abbott et les valeurs CL5o ont été calculées par la méthode d'analyse des probits (12) en utilisant un logiciel spécial (13).
IS b) Activité contre la Drosophile.
- Incorporation au milieu.
Le test de toxicité globale a été effectué
dans de petits flacons de 7 cm de hauteur et 4,2 cm de diamètre. 35 grammes de milieu semi-synthétique ?0 (2,2 1 de son; 260 mi de sucre; 130 ml de levure de bière ; 70 ml de vinaigre ; 20 ml de nipagine; 580 ml d'eau) ont été placés et pressés dans chaque flacon.
Chaque traitement a été effectué en double. Dans chaque flacon, 1 ml de chaque concentration a été incorporé
25 dans le milieu (acétone et eau dans le cas du contr8le).
Deux à trois heures après le traitement (temps d'évaporation de l'acétone), 15 adultes de 0 à 3 jours (10 femelles. et 5 mâles) ont été placés dans chaque flacon. Les flacons ont été bouchés avec un coton et 30 remis dans les conditions de culture. Les adultes ont - été enlevés des flacons lorsque dans le témoin quelques larves se sont transformées en pupes (environ après 13 jours). Le nombre d'adultes a été compté tous les deux jours pendant deux semaines (7 lectures). Le pourcentage 35 d'émergence a été calculé par rapport au témoin et les valeurs CL5o ont été calculées par la méthode indiquée précédemment .
- Test tot~icrue.
Des boîtes de petri de 9 cm de diamètre ont d'abord été lavées avec de l'éther éthylique. De petits cubes de gel d'agar (10 g d'agar/1 et une petite quantité de miel) ont été placés dans chaque boîte de Petri. Les insectes ont été refroidis pendant 2,5 minutes. 0,3 ~.,ll de chaque concentration (méthanol dans le cas du contrôle) ont été appliqués sur le thorax en utilisant un micro-applicateur automatique (Burkard manufacturing co. ltd., UK). Dix insectes ont été
utilisés dans chaque traitement avec trois répétitions.
Après le traitement, les insectes du test sont remis l~ dans leurs conditions de culture. La mortalité a été
mesurée après 1, 2, 4, 6, 24 et 48 heures.
- Application par contact.
Des boîtes de petri de 9 cm de diamètre avec ou sans papiers filtres ont été utilisées. Dans les deux cas, 1 ml de chaque concentration (méthanol pour le contrôle) a été placé dans chaque boîte. Après évaporation du solvant, les petits cubes alimentaires cités précédemment et 30 insectes ont été placés dans les boîtes. Chaque traitement a été répété 3 fois et la mortalité a été mesurée après 1, 2, 4, 6, 24 et 48 heures.
c) Activité contre Spodo~tera littoralis.
- Application topique.
Des larves de troisième stade (35 ~ 10 mg) ont été utilisées. 0,5 ~l de chaque concentration (méthanol pour le contrôle) ont été appliqués topiquement sur le thorax de chaque larve. Chaque larve traitée a été placée dans une boîte séparée de 2,7 cm de diamètre) approvisionnée en milieu non traité puis replacée dans les conditions de culture. Chaque ..... _ T.. . .__~..___ ._.___ .._ m . __._ traitement incluant dix larves et un témoin a été
effectué en double. La mortalité a été mesurée après 24 et 48 heures. L'effet sur la croissance et le développement a été quantifié chez les insectes par l'apparition de nouveaux adultes.
- Application orale.
Les insectes (troisième stade larvaire) ont été privés de nourriture pendant 24 heures . A chaque petit cube de régime semi-synthétique (3,2 1 d'eau, 80 g I() agar-agar, 300 g de farine de maïs, 126 g de germes de blé, 134 g de levure de bière, 200 g de feuilles de chou, 18 g d'acide ascorbique, 4,2 g d'acide benzoïque, 7,2 g de nipagine, 10 g d'un mélange de sel, 30 g de vitamines, 5 g de fumidil, 1,5 ml de formaldehyde, 8 ml I> d'huile de lin), 0,25 E1.1 de chaque concentration (méthanol pour le contrôle) ont été appliqués. Après évaporation du solvant, un cube traité a été placé par boîte de 2,7 cm de diamètre. Les larves ont été soumises à une alimentation avec le milieu traité (dix larves pour chaque concentration). Une alimentation non traitée leur a été donnée après 24 heures. La mortalité a été
déterminée 24 et 48 heures après le traitement. Les insectes ont été observés jusqu'à l'apparition de nouveaux adultes pour enregistrer l'effet sur la croissance et le développement.
d) Activité contre Sitot~hilus aranarius.
- Application tooiaue.
Des adultes de 15 jours ont été utilisés dans ce test. 0,5 ~.~.1 de chaque concentration (méthanol pour le contrôle) ont été appliqués topiquement sur le thorax de chaque insecte en utilisant un micro applicateur. Pour chaque traitement, 25 insectes traités ont été placés dans de petits flacons de 7 cm de hauteur et 4,2 de diamètre avec une petite quantité de blé et WO 98/24318 . PCT/FR97l02194 les bouteilles ont été fermées avec une gaze. Chaque traitement y compris le contrôle a été répété deux fois.
Pour la toxicité aiguë, les mesures de mortalité ont été effectuées après 24, 48 et 72 heures.
Pour les effets sur le développement, les adultes ont été retirés des bouteilles après deux semaines et le nombre d'insectes nouvellement apparus a été compté
pendant huit semaines. Le nombre total d'insectes nouvellement émergés a été comparé à ceux du témoin comme décrit précédemment.
e) Activité contre Tetranychus urticae.
- Activité contre les adultes.
La méthode adoptée dans ce test est lï sensiblement identique à celle utilisée pour les pucerons. Des boîtes de 2,7 cm de hauteur et 4,5 cm de diamètre ont été remplies avec un gel semi-solide d'agar-agar supportant un disque de feuille de haricot.
Trente adultes ont été placés dans chaque boîte pendant trois heures avant le traitement pour s'adapter. Deux boîtes ont été utilisées pour chaque concentration.
0,5 ml de chaque concentration (méthanol pour le témoin) ont été directement pulvérisés sur les deux boîtes. Dans tous les cas, les boîtes ont été remises dans les conditions de culture. La mortalité a été mesurée après 24 et 48 heures.
- Activité contre les neufs.
Vingt adultes ont été placés dans les boîtes décrites ci-dessus pendant 48 heures. Les adultes ont ensuite été retirés et les neufs comptés. Deux boîtes ont été utilisées pour chaque concentration. 0,5 ml de chaque concentration (méthanol pour le contrôle) ont été
directement pulvérisés sur les deux boîtes. Dans tous les cas) les boîtes ont été remises dans les conditions de culture. Le nombre d'oeufs non-éclos et de larves mortes a été compté pendant 7 jours.
.. _...__ _. ~ _. _ _._ WO 98/24318 . PCTIFR97/02194
4) Analyse spectroscopiaue.
a) Spectrométrie de masse.
Les spectres conventionnels (MS) ou d'ions-descendants (MS-MS) ont été obtenus avec un triple quadrupole Nermag R30-10 (Quad Service, Poissy, France).
Les conditions suivantes de la source ont été adoptées .
température de 130°C; courant dans le filament de 50 ).1,A;
énergie des électrons de 95 eV; NH3 et ND3 comme gaz réactif et la pression dans 1e compartiment source a été
fixée à 10'4 Torr. Les spectres d'ions-descendants ont été obtenus avec une énergie de collision de 20 eV et de l'argon à 7 x 10-2 Torr comme gaz de collision dans le second quadripole. L'introduction des échantillons a été
IS réalisée par désorption-ionisation chimique (DCI) en modes positif ou négatif.
b) Résonance maanétique nucléaire.
Les deux composés, Excoecariatoxine et Wikstrotoxine D, ont été soumis à une analyse RMN H1 (Varian Gemini, 300 Mhz) dans une solution de CDC13 en utilisant le signal CHC13 comme référence interne (7,27 pPm) II - RÉSULTATS.
1) Activité de l'extrait brut.
Les travaux réalisés à partir de l'extrait méthanolique de racine de Lasiosiphon kraussianus (Meisn) (Thymelaeaceae) décrit ci-dessus ont permis d'étudier l'activité insecticide sur cinq types d'insectes et un acarien avec différents modes d'application. La concentration utilisée dans les tests de pulvérisation a été de 24 ~L1 d' extrait mélangés à
576 ~,.t,l d'eau distillée, et 0,5 ml de cette solution ont été directement pulvérisés sur ces insectes. Dans les WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 1~
autres tests décrits précédemment, l'incorporation au milieu alimentaire, le contact, les applications topiques et les tests acaricides) l'extrait concentré a été utilisé directement sans dilution.
Le tableau I ci-dessous montre l'effet de l'extrait brut sur quelques insectes et un acarien.
Tableau I
Insectes A lication Mortalit (~) A. oss ii ulvrisation 83,3 Contact 93 D. melanogaster Topique 0 Milieu 100 S. ranarius to i e 0 S. littoralis topique 0 Milieu 0 T. urticae Adulte 0 Oeufs 41,7 L'extrait brut présente une efficacité
importante contre Aphis gossypii auquel il cause une mortalité de 83,3 ~ après 24 heures, contre Drosophila melan ogaster avec 100 ~ de mortalité lorsqu'il est incorporé au milieu et 93 ~ par contact, ainsi que vis-IS à-vis des neufs de T. urticae avec un pourcentage de 41,7 ~. Aucun effet n'a été observé contre S. Iittoralis et S. granarius.
2) Activité de fractions de l'extrait brut.
L'extrait a été fractionné et l'activité a été identifiée dans une fraction non polaire chromatographiée sur un gel de silice. Pour les tests biologiques, chaque fraction a été reprise dans 2 ml d'acétone et 24 ~.~.1 de celle-ci ont été ajoutés à
576 E1,1 d'eau distillée. 0,5 ml de cette solution ont été
pulvérisés sur A.gossypii. Plusieurs fractions _._______.._._ ___. . T. _._ .~~._.~_. _ _ . _~. ____ _.__ _._____.
(fractions 3, 4, 9 et 10) présentant des activités insecticides significatives ont été obtenues. Après chromatographie sur une colonne sephadex LH-20, une activité a été mise en évidence dans la traction 4.
î Cette fraction a alors été soumise à une HPLC
préparative en phase inverse dont le chromatogramme est représenté à la figure 1. Chaque pic a été collecté
manuellement, concentré puis repris dans 2 ml de solvant. Les pics actifs sont ceux dont les temps de rétention sont de 28,84 et 53,90 minutes. Les deux fractions ont alors été soumises à une identification et des test:: d'activité plus précis contre trois insectes .
A. Boss}fie _ , M. persicae et D. melanogaster.
3) Identification et caractérisation de 1 ' EXCOEeCc~iz~Loxine et de la Wikstrotoxine D.
L'analyse par spectrométrie de masse (MS et MS-MS) <~t spectrométrie RMN a révélé que ces deux compos«:- ~~.-;. i f s sont des diterpènes avec un squelette de type da~-~:::,n:ic~ répondant à la formule ci-dessous ~ u ~ 'i.
4 6 ,. W O
~~a:~r laquelle le groupement R représente, sn groupe (E,E)-nona-1,3-diényle) dans le cas a~ : ~ E.~c~~~-cariatoxine {[a]D+61, 0 (c=0, 190 CH2C12) } , et - un groupe nonanyle, dans le cas de la Wikstrotox.ine D {(OC]D+17, 3 (c=0) 643 CH2C12) } .
O ~ d1 Q-I
La masse moléculaire de ces composés, considérée de 528 pour l'Excoecariatoxine et de 532 pour la Wikstrotoxine D, selon l'analyse NH3-DCI-MS (les ions à m/z 529 et 533 étant les espèces MH+ en mode positif S et les ions à m/z 528 et 532 correspondant à M-° en mode négatif). Le spectre ND3-DCI dans le mode positif contenant des ions à m/z 533 et 537 a confirmé ces masses moléculaires et indiqué en outre la présence de trois atomes d'hydrogène échangeables dans les deux 10 composés.
Afin de disposer d'information et de preuves supplémentaires sur les structures supposées de ces composés) les spectres d'ions-descendants des ions MH+
ou des ions M-° ont été réalisés. En mode positif, par 15 exemple, la décomposition sous collision des espèces MH+
s'effectue principalement selon deux voies conduisant d'une part à l'ion m/z 151 (Excoecariatoxine) ou 155 (Wikstrotoxine D) correspondant à une structure RCO+
avec R représentant la chaîne latérale, et d'autre part, 20 pour les deux composés, à l'ion m/z 361 après élimination d'une molécule RC02H.
Les spectres de RMN H1 ont été enregistrés et ont conduit à des données spectroscopiques identiques à celles rapportées dans la littérature (8) .
Excoecariatoxine {b(ppm), J(Hz)}
7, 64 (bs, H-1) ; 6, 71 (dd, 15, 8, H-23) ; 6, 04 (dd, 15, 8, H-24); 5,83 (dt, 15, 7, H-25); 5,72 (d, 15, H-22);5,04 , 4,92 (2bs, H-16); 4,42 (d, 2, H-14); 4,25 (bs, H-5); 3,85 (2m, H-20); 3,44 (bs, H-7); 2,83 (d, 2, H-8); 2,48 (m, H-11); 2,05-2,2 (m, H-12); 1,78 (bs, 6H, H-17, H-19); 1,22 (d, H-18); 0,91 (t, H-30).
Wikstrotoxine D {S(ppm), J(Hz)}
7,62 (bs, H-1); 5,04 , 4,92 (2bs, H-16);
4,38 (d, 2, H-14); 4,26 (bs, H-5); 3,83 (2m, H-20); 3,43 (bs, H-7); 2,91 (d, 2, H-8); 2,45 (m, H-11); 2,2 (3, H
.._ .. j ._.__. ~._. ___~ _.
WO 98!24318 . PCT/FR97/02194 12); 1,78 (bs, 6H, H-17, H-19); 1,16 (d, H-18); 0,89 (t, H-30).
4) Essais comparatifs.
.5 L'Excoecariatoxine et la Wikstrotoxine D ont été comparés à deux insecticides bien connus, la deltaméthrine et le méthomyl, deux composés présentant un profil dose-dépendant vis-à-vis de Aphis gossypii et Drosophila melanogaster. Le tableau 2 ci-dessous IO rapporte les valeurs CLSO (~g/ml) de l'Excoecariatoxine, la Wikstrotoxine D, la deltaméthrine et le méthomyl.
Tableau 2 A. oss ii M. ersicae D. melano aster Excoecariatoxine 18,7 89,8 18,7 Wikstrotoxine 17,0 53,1 22,6 D
Mthom 1 2,03 7,87 38,9 Deltamthrine 0,0570 0,0316 1,42 Les deux composés naturels présentent une 15 activité similaire sur A. gossypii. Avec des CL5o respectivement de 2,03 , 18,7 et 17,0 ~,~.g/ml, le méthomyl est environ 9 fois plus actif que l'Excoecariatoxine et la Wikstrotoxine D. L'activité des deux composés naturels et du méthomyl sur M. persicae est inférieure à
20 celle contre A. gossypii. Le méthomyl est environ 7 fois plus actif que la Wikstrotoxine D et 11 fois plus que l'Excoecariatoxine.
Les deux composés naturels présentent également une activité similaire vis-à-vis de 25 D. melanogaster (incorporation au milieu), et sont environ 2 fois plus actifs que le méthomyl. Cette activité montre une persistance favorable des deux composés.
Les insectes examinés ont été sélectionnés 30 aléatoirement afin de démontrer les diverses activités susceptibles de se produire et de démontrer les WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 différences d'activité entre les deux composés naturels et d'autres composés du commerce. Les essais biologiques montrent que les deux composés présentent une activité
variable selon les insectes. Ils sont actifs sur A. gossypii) M. persicae et D. melanogaster mais aucune activité n'a été mesurée sur S. littorales et S. granarius. Ceci pourrait indiquer que les diterpènes de type daphnane présentent une certaine spécificité et donc pourraient réduire les risques vis-à-vis I~ d'organismes favorables qui semblent avoir un rôle éventuel dans les programmes de protection intégrée d'insectc~~. Ceci pourrait être attesté par le fait que les dei:>: composés sont des produits naturels et, en conséquence, pourraient être dégradés plus rapidement IS dans ?'environnement que d'autres pesticides conventionnels.
Les études déjà réalisées avec l'extrait méthane: ique de cette racine de plante ont permis de montre:- une activité contre les leucémies lymphocytaire 20 p-38f~ ~~i et d'autres maladies (14). La toxicité de cet extra~~ ~~ ot~- examinée chez la souris, le rat, le lapin, le chm~:~. c>c l'iléum ou le coeur isolé de lapin (14) .
Les au:c~u:~~ ayant rapportés ces études de toxicité aiguë
che_~. 1 ~-:-. souris ont estimé la valeur de la DL5 o 25 respc~~~. : :~e~mer.t à 27, 1 et 330 mg/kg après des ad:r -:.1 ~ v r a v : or.:~ orale et intrapéritonéale . Dans les étudE~: c:~ -_-~r.:cité chronique réalisées chez des rats al ime::- ~~: r~~,~e~c cet extrait pendant 6 mois, ils n' ont ob:~w ~.~~ :,... .... :signe clinique de toxicité et aucune grave 30 lés _ c~:. r. ~~ r ~ F détectée lors des examens postmortem, ce qui F~~~: n:~ t c~E~ conclure que cet extrait à une dose de 2 mg r. c: ;~t~: oç n'est pas toxique chez les souris, les rats f': lE~: i~pins. Ces résultats supportent l'intérêt des co:r:po:;E~:- de l' invention, car il est nécessaire de 35 disposez de nouveaux insecticides ciblés, biodégradables et tolérés par l'environnement.
___. _. __...__ 1 _. __._ LISTE DES RÉFÉRENCES
1 - METCALF, R.L. 1989. Insect resistance to insecticides. Pestic. Sci 26, 333-358 2 - MAVITUNA, F. 1992. Application of plant biotechnology in industry and agriculture. In Recente advances in biotechnology. Klumer Academic publishers, Netherland. pp.209-226.
3 - BENNER, J.P. 1993. Pesticidal compounds from higher plants. Pestic. Sci 39, 95-102.
4 - BORRIS, R.P. 1982. Antileukemic l5 principles of Gnidia Kraussiana Meisn. and chemical and microbial transformations of uleine. Dissertation Abstracts International 42 (9),3684.
a) Spectrométrie de masse.
Les spectres conventionnels (MS) ou d'ions-descendants (MS-MS) ont été obtenus avec un triple quadrupole Nermag R30-10 (Quad Service, Poissy, France).
Les conditions suivantes de la source ont été adoptées .
température de 130°C; courant dans le filament de 50 ).1,A;
énergie des électrons de 95 eV; NH3 et ND3 comme gaz réactif et la pression dans 1e compartiment source a été
fixée à 10'4 Torr. Les spectres d'ions-descendants ont été obtenus avec une énergie de collision de 20 eV et de l'argon à 7 x 10-2 Torr comme gaz de collision dans le second quadripole. L'introduction des échantillons a été
IS réalisée par désorption-ionisation chimique (DCI) en modes positif ou négatif.
b) Résonance maanétique nucléaire.
Les deux composés, Excoecariatoxine et Wikstrotoxine D, ont été soumis à une analyse RMN H1 (Varian Gemini, 300 Mhz) dans une solution de CDC13 en utilisant le signal CHC13 comme référence interne (7,27 pPm) II - RÉSULTATS.
1) Activité de l'extrait brut.
Les travaux réalisés à partir de l'extrait méthanolique de racine de Lasiosiphon kraussianus (Meisn) (Thymelaeaceae) décrit ci-dessus ont permis d'étudier l'activité insecticide sur cinq types d'insectes et un acarien avec différents modes d'application. La concentration utilisée dans les tests de pulvérisation a été de 24 ~L1 d' extrait mélangés à
576 ~,.t,l d'eau distillée, et 0,5 ml de cette solution ont été directement pulvérisés sur ces insectes. Dans les WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 1~
autres tests décrits précédemment, l'incorporation au milieu alimentaire, le contact, les applications topiques et les tests acaricides) l'extrait concentré a été utilisé directement sans dilution.
Le tableau I ci-dessous montre l'effet de l'extrait brut sur quelques insectes et un acarien.
Tableau I
Insectes A lication Mortalit (~) A. oss ii ulvrisation 83,3 Contact 93 D. melanogaster Topique 0 Milieu 100 S. ranarius to i e 0 S. littoralis topique 0 Milieu 0 T. urticae Adulte 0 Oeufs 41,7 L'extrait brut présente une efficacité
importante contre Aphis gossypii auquel il cause une mortalité de 83,3 ~ après 24 heures, contre Drosophila melan ogaster avec 100 ~ de mortalité lorsqu'il est incorporé au milieu et 93 ~ par contact, ainsi que vis-IS à-vis des neufs de T. urticae avec un pourcentage de 41,7 ~. Aucun effet n'a été observé contre S. Iittoralis et S. granarius.
2) Activité de fractions de l'extrait brut.
L'extrait a été fractionné et l'activité a été identifiée dans une fraction non polaire chromatographiée sur un gel de silice. Pour les tests biologiques, chaque fraction a été reprise dans 2 ml d'acétone et 24 ~.~.1 de celle-ci ont été ajoutés à
576 E1,1 d'eau distillée. 0,5 ml de cette solution ont été
pulvérisés sur A.gossypii. Plusieurs fractions _._______.._._ ___. . T. _._ .~~._.~_. _ _ . _~. ____ _.__ _._____.
(fractions 3, 4, 9 et 10) présentant des activités insecticides significatives ont été obtenues. Après chromatographie sur une colonne sephadex LH-20, une activité a été mise en évidence dans la traction 4.
î Cette fraction a alors été soumise à une HPLC
préparative en phase inverse dont le chromatogramme est représenté à la figure 1. Chaque pic a été collecté
manuellement, concentré puis repris dans 2 ml de solvant. Les pics actifs sont ceux dont les temps de rétention sont de 28,84 et 53,90 minutes. Les deux fractions ont alors été soumises à une identification et des test:: d'activité plus précis contre trois insectes .
A. Boss}fie _ , M. persicae et D. melanogaster.
3) Identification et caractérisation de 1 ' EXCOEeCc~iz~Loxine et de la Wikstrotoxine D.
L'analyse par spectrométrie de masse (MS et MS-MS) <~t spectrométrie RMN a révélé que ces deux compos«:- ~~.-;. i f s sont des diterpènes avec un squelette de type da~-~:::,n:ic~ répondant à la formule ci-dessous ~ u ~ 'i.
4 6 ,. W O
~~a:~r laquelle le groupement R représente, sn groupe (E,E)-nona-1,3-diényle) dans le cas a~ : ~ E.~c~~~-cariatoxine {[a]D+61, 0 (c=0, 190 CH2C12) } , et - un groupe nonanyle, dans le cas de la Wikstrotox.ine D {(OC]D+17, 3 (c=0) 643 CH2C12) } .
O ~ d1 Q-I
La masse moléculaire de ces composés, considérée de 528 pour l'Excoecariatoxine et de 532 pour la Wikstrotoxine D, selon l'analyse NH3-DCI-MS (les ions à m/z 529 et 533 étant les espèces MH+ en mode positif S et les ions à m/z 528 et 532 correspondant à M-° en mode négatif). Le spectre ND3-DCI dans le mode positif contenant des ions à m/z 533 et 537 a confirmé ces masses moléculaires et indiqué en outre la présence de trois atomes d'hydrogène échangeables dans les deux 10 composés.
Afin de disposer d'information et de preuves supplémentaires sur les structures supposées de ces composés) les spectres d'ions-descendants des ions MH+
ou des ions M-° ont été réalisés. En mode positif, par 15 exemple, la décomposition sous collision des espèces MH+
s'effectue principalement selon deux voies conduisant d'une part à l'ion m/z 151 (Excoecariatoxine) ou 155 (Wikstrotoxine D) correspondant à une structure RCO+
avec R représentant la chaîne latérale, et d'autre part, 20 pour les deux composés, à l'ion m/z 361 après élimination d'une molécule RC02H.
Les spectres de RMN H1 ont été enregistrés et ont conduit à des données spectroscopiques identiques à celles rapportées dans la littérature (8) .
Excoecariatoxine {b(ppm), J(Hz)}
7, 64 (bs, H-1) ; 6, 71 (dd, 15, 8, H-23) ; 6, 04 (dd, 15, 8, H-24); 5,83 (dt, 15, 7, H-25); 5,72 (d, 15, H-22);5,04 , 4,92 (2bs, H-16); 4,42 (d, 2, H-14); 4,25 (bs, H-5); 3,85 (2m, H-20); 3,44 (bs, H-7); 2,83 (d, 2, H-8); 2,48 (m, H-11); 2,05-2,2 (m, H-12); 1,78 (bs, 6H, H-17, H-19); 1,22 (d, H-18); 0,91 (t, H-30).
Wikstrotoxine D {S(ppm), J(Hz)}
7,62 (bs, H-1); 5,04 , 4,92 (2bs, H-16);
4,38 (d, 2, H-14); 4,26 (bs, H-5); 3,83 (2m, H-20); 3,43 (bs, H-7); 2,91 (d, 2, H-8); 2,45 (m, H-11); 2,2 (3, H
.._ .. j ._.__. ~._. ___~ _.
WO 98!24318 . PCT/FR97/02194 12); 1,78 (bs, 6H, H-17, H-19); 1,16 (d, H-18); 0,89 (t, H-30).
4) Essais comparatifs.
.5 L'Excoecariatoxine et la Wikstrotoxine D ont été comparés à deux insecticides bien connus, la deltaméthrine et le méthomyl, deux composés présentant un profil dose-dépendant vis-à-vis de Aphis gossypii et Drosophila melanogaster. Le tableau 2 ci-dessous IO rapporte les valeurs CLSO (~g/ml) de l'Excoecariatoxine, la Wikstrotoxine D, la deltaméthrine et le méthomyl.
Tableau 2 A. oss ii M. ersicae D. melano aster Excoecariatoxine 18,7 89,8 18,7 Wikstrotoxine 17,0 53,1 22,6 D
Mthom 1 2,03 7,87 38,9 Deltamthrine 0,0570 0,0316 1,42 Les deux composés naturels présentent une 15 activité similaire sur A. gossypii. Avec des CL5o respectivement de 2,03 , 18,7 et 17,0 ~,~.g/ml, le méthomyl est environ 9 fois plus actif que l'Excoecariatoxine et la Wikstrotoxine D. L'activité des deux composés naturels et du méthomyl sur M. persicae est inférieure à
20 celle contre A. gossypii. Le méthomyl est environ 7 fois plus actif que la Wikstrotoxine D et 11 fois plus que l'Excoecariatoxine.
Les deux composés naturels présentent également une activité similaire vis-à-vis de 25 D. melanogaster (incorporation au milieu), et sont environ 2 fois plus actifs que le méthomyl. Cette activité montre une persistance favorable des deux composés.
Les insectes examinés ont été sélectionnés 30 aléatoirement afin de démontrer les diverses activités susceptibles de se produire et de démontrer les WO 98/24318 . PCT/FR97/02194 différences d'activité entre les deux composés naturels et d'autres composés du commerce. Les essais biologiques montrent que les deux composés présentent une activité
variable selon les insectes. Ils sont actifs sur A. gossypii) M. persicae et D. melanogaster mais aucune activité n'a été mesurée sur S. littorales et S. granarius. Ceci pourrait indiquer que les diterpènes de type daphnane présentent une certaine spécificité et donc pourraient réduire les risques vis-à-vis I~ d'organismes favorables qui semblent avoir un rôle éventuel dans les programmes de protection intégrée d'insectc~~. Ceci pourrait être attesté par le fait que les dei:>: composés sont des produits naturels et, en conséquence, pourraient être dégradés plus rapidement IS dans ?'environnement que d'autres pesticides conventionnels.
Les études déjà réalisées avec l'extrait méthane: ique de cette racine de plante ont permis de montre:- une activité contre les leucémies lymphocytaire 20 p-38f~ ~~i et d'autres maladies (14). La toxicité de cet extra~~ ~~ ot~- examinée chez la souris, le rat, le lapin, le chm~:~. c>c l'iléum ou le coeur isolé de lapin (14) .
Les au:c~u:~~ ayant rapportés ces études de toxicité aiguë
che_~. 1 ~-:-. souris ont estimé la valeur de la DL5 o 25 respc~~~. : :~e~mer.t à 27, 1 et 330 mg/kg après des ad:r -:.1 ~ v r a v : or.:~ orale et intrapéritonéale . Dans les étudE~: c:~ -_-~r.:cité chronique réalisées chez des rats al ime::- ~~: r~~,~e~c cet extrait pendant 6 mois, ils n' ont ob:~w ~.~~ :,... .... :signe clinique de toxicité et aucune grave 30 lés _ c~:. r. ~~ r ~ F détectée lors des examens postmortem, ce qui F~~~: n:~ t c~E~ conclure que cet extrait à une dose de 2 mg r. c: ;~t~: oç n'est pas toxique chez les souris, les rats f': lE~: i~pins. Ces résultats supportent l'intérêt des co:r:po:;E~:- de l' invention, car il est nécessaire de 35 disposez de nouveaux insecticides ciblés, biodégradables et tolérés par l'environnement.
___. _. __...__ 1 _. __._ LISTE DES RÉFÉRENCES
1 - METCALF, R.L. 1989. Insect resistance to insecticides. Pestic. Sci 26, 333-358 2 - MAVITUNA, F. 1992. Application of plant biotechnology in industry and agriculture. In Recente advances in biotechnology. Klumer Academic publishers, Netherland. pp.209-226.
3 - BENNER, J.P. 1993. Pesticidal compounds from higher plants. Pestic. Sci 39, 95-102.
4 - BORRIS, R.P. 1982. Antileukemic l5 principles of Gnidia Kraussiana Meisn. and chemical and microbial transformations of uleine. Dissertation Abstracts International 42 (9),3684.
5 - BORRIS, R.P. and CORDELL G.A. 1984.
Studies of the Thymelaeaceae. II. Antineoplastic principles of Gnidia kraussiana.J.Nat. Prod. 47(2), 270-278.
Studies of the Thymelaeaceae. II. Antineoplastic principles of Gnidia kraussiana.J.Nat. Prod. 47(2), 270-278.
6 - OHIGASHI, H. KATSUMATA) K.KAWAZU, K.KOSHIMIZU and T. MITSUI.1974. A priscidal constituent of excoecarcia agallocha. Agr. Bio. Chem. 38(5), 1093-1095.
7 - KUPCHAN, S. M., J.G. SWEENY, R.L.
BAXTER, T. MURAE, V.A. ZIMMERLY and B.R. SICKLES. 1975.
Gnididin, Gniditrin, and Gnidicin, novel potent antileukemic diterpenoid esters from Gnidia lamprantha.
J. Am. Chem. Soc. 97, 672-673.
WO 98124318 ~ PCT/FR97102194
BAXTER, T. MURAE, V.A. ZIMMERLY and B.R. SICKLES. 1975.
Gnididin, Gniditrin, and Gnidicin, novel potent antileukemic diterpenoid esters from Gnidia lamprantha.
J. Am. Chem. Soc. 97, 672-673.
WO 98124318 ~ PCT/FR97102194
8 - JOLAD, S.D., J.J. HOFFMANN, B.N.
TIMMERMANN, K.H. SCHRAM, J.R. COLE, R.B.BATES, R.E.
KLENCK and M.S. TEMPESTA. 1983. Daphnane diterpenes from Wikstroemia monticola . Wikstrotoxins A-D) huratoxin, and excoecariatoxin. J. Nat. Prod.46(5),675-680.
TIMMERMANN, K.H. SCHRAM, J.R. COLE, R.B.BATES, R.E.
KLENCK and M.S. TEMPESTA. 1983. Daphnane diterpenes from Wikstroemia monticola . Wikstrotoxins A-D) huratoxin, and excoecariatoxin. J. Nat. Prod.46(5),675-680.
9 - WICKENS, G.E.1976. Thymelaeaceae. In The flora of jebel Marra (Sudan Republic) and it's geographical affinities. Her Majestiy's Stationary Office publishers, London.pp.95.
10 - ANDREWS, F.W. 1950. Thymelaeaceae. In The flowering plants of the Anglo-Egyptian Sudan. T.
BUNCLE and Co. Ltd publisher, Arbroath, Scotland.pp.150.
IS
BUNCLE and Co. Ltd publisher, Arbroath, Scotland.pp.150.
IS
11- GUBRAN, E.M.E.; R. DELORME, D. AUGE, and J.P. MOREAU.1992. Insecticide resistance in cotton aphid Aphis gossypii (glov). in the Sudan Gezira. Pstic. Sci., 35(2), 101-107.
12 - FINNEY, D.J. 1980 Probit analysis.
Cambridge University Press) pp.33.
Cambridge University Press) pp.33.
13 GINER, M. Analyse de la dose létale 50, présentation du module d'analyse et du gestionnaire de base de données. In Atelier d'entomologie appliquée .
Lutte intégrée contre les ravageurs des cultures, 1993, CIRAD-CA, Montpellier. pp.149-155.
Lutte intégrée contre les ravageurs des cultures, 1993, CIRAD-CA, Montpellier. pp.149-155.
14 - EBONG, O.O., and N. NWUDE. 1981.
Toxicity of methanol extract of Lasiosiphon kraussianus root. Planta medica., 41, 267-273.
__ T ._.._~z__..._ .-..~. . _.
Toxicity of methanol extract of Lasiosiphon kraussianus root. Planta medica., 41, 267-273.
__ T ._.._~z__..._ .-..~. . _.
Claims (8)
1) Composition pesticide, plus particulièrement insecticide, comprenant comme substance active au moins un diterpène de la famille des daphnanes ou un extrait de plante contenant au moins un diterpène de la famille des daphnanes.
2) Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend comme substance active au moins un composé de formule (I) ci-après ou un extrait de plante contenant le(s)dit(s) composés:
dans laquelle:
- les groupements R1, R2 et R3 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un groupe alkyle, alkényle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou les groupements R1 et R2 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2), ou encore les groupements R1, R2 et R3 représentent ensemble un groupe de formule:
dans laquelle le groupement R17 représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou encore le groupe R17 est cyclisé sur le carbone (1) pour former des daphnanes macrocyliques;
- les groupements R11 et R12 sent choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment, ou encore R11 et R12 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (6) et (7) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (6) et (7);
- les groupements R6 et R7 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment, ou encore R6 et R7 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (1) et (2);
- le groupement R9 est choisi parmi un atome d'hydrogène, une fonction cétone de formule =O ou un dérivé de cétone de type oxime, acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe OR16 dans lequel R26 a la même signification que précédemment;
- les groupements R10, R13 et R14 sont choisis parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- le groupement R15 est choisi parmi un atome d'hydrogène, une cétone de formule =O ou un dérivé
de cétone de type acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- le groupement R5 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment ;
- le groupement R8 représente un atome d'hydrogène ou une liaison entre les carbones (10) et (11) se substituant à la liaison entre les carbones (9) et (11) pour donner au composé de formule (I) une structure de type ingénane;
- le groupement R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées.
dans laquelle:
- les groupements R1, R2 et R3 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un groupe alkyle, alkényle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou les groupements R1 et R2 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2), ou encore les groupements R1, R2 et R3 représentent ensemble un groupe de formule:
dans laquelle le groupement R17 représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou encore le groupe R17 est cyclisé sur le carbone (1) pour former des daphnanes macrocyliques;
- les groupements R11 et R12 sent choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment, ou encore R11 et R12 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (6) et (7) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (6) et (7);
- les groupements R6 et R7 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment, ou encore R6 et R7 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (1) et (2);
- le groupement R9 est choisi parmi un atome d'hydrogène, une fonction cétone de formule =O ou un dérivé de cétone de type oxime, acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe OR16 dans lequel R26 a la même signification que précédemment;
- les groupements R10, R13 et R14 sont choisis parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- le groupement R15 est choisi parmi un atome d'hydrogène, une cétone de formule =O ou un dérivé
de cétone de type acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- le groupement R5 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment ;
- le groupement R8 représente un atome d'hydrogène ou une liaison entre les carbones (10) et (11) se substituant à la liaison entre les carbones (9) et (11) pour donner au composé de formule (I) une structure de type ingénane;
- le groupement R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées.
3) Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend comme substance active au moins un composé de formule (I) ou un extrait de plante contenant le(s)dit(s) composés de formule (I) dans laquelle:
- les groupements R1, R2 et R3 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un groupe alkyle, alkényle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées; ou les groupements R1 et R2 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2); ou encore les groupements R1, R2 et R3 représentent ensemble un groupe de formule :
dans laquelle le groupement R17 représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou encore le groupe R17 est cyclisé sur le carbone (1) pour former des daphnanes macrocyliques;
- les groupements R11 et R12 sont des atomes;
d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison entre les carbones (6) et (7) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (6) et (7);
- les groupements R6 et R7 sont des atomes d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (1) et (2);
- le groupement R9 est un atome d'hydrogène ou une fonction cétone de formule =O ou un dérivé de cétone de type oxime, acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, ou représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- les groupements R10 , R13 et R14 représentent un atome d'hydrogène ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment ;
- le groupement R15 est un atome d'hydrogène;
- le groupement R5 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées;
- le groupement R8 représente un atome d'hydrogène;
- le groupement R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées.
- les groupements R1, R2 et R3 sont choisis parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, un groupe -OR16 dans lequel R16 représente un groupe alkyle, alkényle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées; ou les groupements R1 et R2 représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2); ou encore les groupements R1, R2 et R3 représentent ensemble un groupe de formule :
dans laquelle le groupement R17 représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonction oxygénées ou halogénées, ou encore le groupe R17 est cyclisé sur le carbone (1) pour former des daphnanes macrocyliques;
- les groupements R11 et R12 sont des atomes;
d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison entre les carbones (6) et (7) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (6) et (7);
- les groupements R6 et R7 sont des atomes d'hydrogène ou représentent ensemble une double liaison entre les carbones (1) et (2) ou une fonction époxyde de formule -O- entre lesdits carbones (1) et (2);
- le groupement R9 est un atome d'hydrogène ou une fonction cétone de formule =O ou un dérivé de cétone de type oxime, acétal, hémiacétal, hydrazone, imine, aminal ou thioacétal, ou représente un groupe alkyle, alkènyle, aryle, ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment;
- les groupements R10 , R13 et R14 représentent un atome d'hydrogène ou un groupe -OR16 dans lequel R16 a la même signification que précédemment ;
- le groupement R15 est un atome d'hydrogène;
- le groupement R5 est choisi parmi un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, alkènyle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées;
- le groupement R8 représente un atome d'hydrogène;
- le groupement R4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, alkènyle, aryle, linéaire, ramifié ou cyclique comprenant éventuellement une ou plusieurs doubles liaisons et une ou plusieurs fonctions oxygénées ou halogénées.
4) Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle comprend comme substance active au moins un des composés choisis parmi l'Excoecariatoxine et la Wikstrotoxine D, ou un extrait de plante les contenant.
5) Composition selon l'une quelconque des revendications des revendications précédentes, caractérisée en ce que la substance active est un extrait de Lasiosiphon kraussianus.
6) Composition selon l'une quelconque des revendications des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle contient en outre un ou plusieurs véhicules habituels des pesticides.
7) Utilisation des diterpènes de la famille des daphnanes ou d'un extrait de plante contenant au moins un diterpène de la famille des daphnanes et des composés de formule (I) définis aux revendications 2 ou 3, comme pesticide, plus particulièrement comme insecticide, dans la protection des cultures ou pour le traitement des lieux de stockage des produits desdites cultures ou des locaux domestiques ou publics.
8) Wikstrotoxine D substantiellement pure obtenue à partir de racines de Lasiosiphon kraussianus.
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| FR9614893A FR2756463A1 (fr) | 1996-12-04 | 1996-12-04 | Compositions pesticides, plus particulierement insecticides, a base de diterpenes de la famille des daphnanes |
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