CA2218759A1 - Novel variants of apolipoprotein a-i - Google Patents

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Jean-Charles Fruchart
Harald Funke
Gerard Turpin
Gerd Assmann
Gerald Luc
Eric Bruckert
Patrick Benoit
Patrice Denefle
Nicolas Duverger
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Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Institut Pasteur de Lille
Aventis Pharma SA
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Abstract

The present invention relates to variants of the human apoloprotein A-I comprising a cystein in position 151, the corresponding nucleic acids and the vectors containing them. It also relates to pharmaceutical compositions comprising said elements and their utilization, particularly in genic therapy.

Description

CA 022l87~9 l997-ll-06 W 096/37608 PCTI~h~'00747 NOUVEAUX VARIANTS DE L'APOLIPOPROTEINE A-l La présente invention concerne un nouveau variant de l'apolipoprotéine A-l. Elle concerne aussi tout acide nucléique codant pour ce nouveau variant. Elle concerne également l'utilisation de ces protéine ou 5 acides nucléiques dans un but thérapeutique. Plus particulièrement, I'invention concerne un nouveau variant de l'apolipoprotéine A-l comportant notamment une mutation en position 151.
L'apolipoprotéine A-l (apoA-I) est le constituant majeur des lipoprotéines de haute densité (HDL), qui sont des complexes 10 macromoléculaires composés de cholestérol, phospholipides et de triglycérides. L'apoA-I est une protéine constituée de 243 acides aminés, synthétisée sous la forme d'une préproprotéine de 267 résidus, ayant une masse moléculaire de 28.000 daltons. La forme prépro de l'apoA-I est synthétisée chez l'homme à la fois par le foie et l'intestin. Cette forme de protéine est ensuite clivée en proprotéine qui est sécrétée dans le plasma.
Dans le compartiment vasculaire, la proapoA-I est alors transformée en protéine mature (243 acides aminés) par action d'une protéase calcium dépendante. L'apoA-I a un rôle de structure et un rôle actif dans le métabolisme des lipoprotéines: I'apoA-I est notamment un cofacteur de la lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT), responsable de l'estérification du cholestérol plasmatique.
Le niveau de cholestérol contenu dans la fraction HDL et la concentration plasmatique de l'apoA-I sont des facteurs de risque négatifs pour le développement de l'athérosclérose chez l'homme. Les études épidémiologiques ont en effet démontré une corrélation inverse entre les concentrations de cholestérol HDL et d'apoA-I et l'incidence des maladies cardio-vasculaires (E. G. Miller et al. Lancet, 1977:965-968). En revanche, une longévité serait associée avec un taux de cholestérol HDL élevé.
Récemment, le rôle protecteur de l'apoA-I a été démontré dans un modèle de CA 022187~9 1997-11-06 W 096137608 PCTA~R96/00747 souris transgéniques exprimant l'apolipoprotéine A-l humaine (Rubin et al.
Nature). De même, l'infusion des HDL chez le lapin induit une régression des lésions (Badimon et al. J. Clin. Invest. 85, 1234-41, 1990). Differents mécanismes ont été proposés pour expliquer l'effect protecteur des HDL, et 5 notamment un rôle des HDL dans le transport inverse du cholestérol (Fruchart et al. Circulation, 87: 22-27, 1993) et une action antiioxydant des HDL (Forte T., Current Opinion in Lipidology, 5: 354-364,1994)).
Le gène codant pour l'apoA-I a été cloné et séquencé (Sharpe et al., Nucleic Acids Res. 12(9) (1984) 3917). Ce gène, d'une longueur de 1863 pb, 10 comprend 4 exons et 3 introns. L'ADNc codant pour l'apoA-I a également été
décrit (Law et al., PNAS 81 (1984) 66). Cet ADNc comprend 840 pb (Cf SEQ
ID n~ 1). Outre la forme sauvage de l'apoA-I, différents variants naturels ont été décrits dans l'art antérieur, dont les différences par rapport à la protéinesauvage sont données dans le tableau ci-après.
Variant: Mutation VariantMutation Milano Arg173Cys NorwayGlu136Lys Marburg Lys1070 Pro165Arg Munster2B Ala158Glu Pro3His Giessen Pro143Arg Arg1 OLeu Munster3A Asp103Asn Gly26Arg Munster3B Pro4Arg Asp89Glu Munster3C Pro3Arg Lys107Met Munster3D Asp213Gly Glu139Gly Munster4 Glu198Lys Glu147Val Yame Asp13Tyr Ala158Glu Asp213Gly Glu169Gln Arg177His CA 022l87~9 l997-ll-06 W 096/37608 PCT~R96/00747 La présente invention découle de la mise en évidence d'une nouvelle ~ série de variants de l'apolipoprotéine A-l. Cette série de variant présente en particulier une substitution du résidu arginine en position 151 par un résidu cystéine. Le variant d'apoA-I selon l'invention présente des propriétés thérapeutiques remarquables. En particulier, il possède des propriétés de protection anti-athérogène particulièrement importantes. Ainsi, dans une situation de niveaux extrêmement bas de cholestérol dans la fraction HDL, associée à une hypertriglycéridémie, la présence de ce variant prévient le développement de toute athérosclérose, témoignant d'un rôle protecteur très 10 puissant, spécifique à cette apoA-I mutée. En outre, la présence d'une cystéine sur l'apoA-I selon l'invention entraîne la formation de dimères et d'autres complexes reliés par un pont disulfure. Cette apoA-I se retrouve sous forme libre dans le plasma, liée en dimère à elle-même ou associée avec l'apolipoprotéine A-ll qui est une autre protéine importante associée au HDL et qui possède aussi une cystéine dans sa séquence. Par ailleurs, la perte de la charge liée à l'arginine en position 151 entraîne la visualisation de ce mutant par électroisofocalisation des protéines plasmatiques suivi d'une révélation immunologique de l'apoA-I.
Compte tenu de ses propriétés anti-athérogènes particulièrement remarquables, cette nouvelle protéine selon l'invention offre un avantage thérapeutique important dans le traitement et la prévention des pathologies cardiovascu lalres.
Un premier objet de l'invention concerne donc une série de variants de l'apolipoprotéine A-l humaine comprenant une cystéine en position 151. La séquence d'acides aminés de l'apoA-I de référence est décrite dans la littérature (Cf Law précitée). Cette séquence, incluant la région prepro (résidus 1 à 24), est présentée sur la séquence SEQ ID n~ 1. Une caractéristique des variants selon l'invention réside donc dans la présence d'une cystéine en position 151 de l'apoA-I mature (correspondant à la 30 position 175 sur la séquence SEQ ID n~ 1), en substitution de l'arginine CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA~R96/00747 présente dans la séquence de référence. Un variant préféré selon l'invention comprend la séquence peptidique SEQ ID n~ 2, et, encore plus préférentiellement, la séquence peptidique comprise entre les résidus 68 à
267 de la séquence SEQ ID n~ 1, le résidu 175 étant substitué par une 5 cystéine.
Les variants selon l'invention sont représentés notamment par l'apoA-I
Paris, c'est-à-dire une apoA-I présentant une cystéine en position 151 par rapport à l'apoA-I native. Les variants selon l'invention peuvent également porter d'autres modifications structurales par rapport à l'apolipoprotéine A-l 10 de référence, et notamment d'autres mutations, délétions eVou additions.
Selon un mode particulier, les variants de l'invention comprennent également d'autres mutations conduisant au remplacement de résidus par des cystéines. Ainsi, un autre variant particulier combine les mutation présentes dans le variant apoA-I Paris et apoA-I milano. D'autres mutations peuvent 15 également être présentes affectant des résidus ne modifiant pas de manière significative les propriétés de l'apoA-I. L'activité de ces variants peut être vérifiée notamment par un test d'efflux du cholestérol.
Les variants selon l'invention peuvent être obtenus de différentes facons. Ils peuvent tout d'abord être synthétisés chimiquement, grace aux 20 techniques de l'homme du métier utilisant des synthétiseurs de peptides. Ils peuvent également être obtenus à partir de l'apoA-I de ré~érence, par mutation(s). Avantageusement, il s'agit de protéines recombinantes, c'est-à-dire obtenues par expression dans un hôte cellulaire d'un acide nucléique correspondant comme décrit plus loin.
Comme indiqué plus haut, les variants selon l'invention peuvent se trouver sous forme monomérique ou sous forme de dimère. La présence d'une cystéine au moins dans la séquence des variants de l'invention permet en effet la réalisation de dimères par liaison disulfure. Il peut s'agir d'homodimères, c'est à dire de dimères comprenant deux variants selon -CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCT/~k~Gloo747 I'invention (exemple: diApoA-I Paris); ou d'hétérodimères, c'est à dire de dimères comprenant un variant selon l'invention et une autre molécule possèdant une cystéine libre (exemple :ApoA-I Paris:ApoAII).
Un autre obiet de l'invention réside dans un acide nucléique codant pour un variant d'apolipoprotéine A-l tel que défini ci-avant. L'acide nucléiquede la présente invention peut être un acide désoxyribonucléique (ADN) ou un acide ribonucléique (ARN). Parmi les ADN, il peut s'agir d'un ADN
complémentaire (ADNc), d'un ADN génomique (ADNg), d'une séquence hybride ou d'une séquence synthétique ou semi-synthétique. Il peut en outre 10 s'agir d'un acide nucléique modifié chimiquement, par exemple en vue d'augmenter sa résistance aux nucléases, sa pénétration ou son ciblage cellulaires, son efficacité thérapeutique, etc. Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, synthétique, etc. Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du 15 métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatiqe de séquences obtenues par criblage de banques.
Avantageusement, I'acide nucléique est un ADNc ou un ADNg.
Préférentiellement, I'acide nucléique selon l'invention comprend la séquence SEQ ID n~ 2. Encore plus préférentiellement, il comprend la séquence SEQ ID n~ 10.
L'acide nucléique selon l'invention comprend avantageusement une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule ou l'organisme cible, ainsi qu'une région située en 3', et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de polyadénylation. L'ensemble de ces éléments constitue la cassette d'expression. Concernant la région promotrice, il peut s'agir de la région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène de l'apoA-I ou d'un variant de l'ApoA-I lorsque celle-ci CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCT~R96/00747 est susceptible de fonctionner dans la cellule ou l'organisme concernés. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par 5 exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de facon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. Il peut s'agir en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK, 10 vimentine, a-actine, tubuline, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur Vlll, etc) de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, a-actine du muscle lisse, etc) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones 15 stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc). De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes E1A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, le promoteur du LTR du RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, 20 ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire.
Par ailleurs, I'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle de l'apoA-I, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal 25 fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
L'acide nucléique selon l'invention peut être utilisé pour produire les variants d'ApoA-I recombinants par expression dans une cellule hôte recombinée, ou directement comme médicament dans des applications de thérapie génique ou cellulaire.

CA 022187~9 1997-11-06 W O 96137608 PCT~R96/00747 Pour la production de variants recombinants selon l'invention, I'acide nucléique est avantageusement incorporé à un vecteur plasmidique ou viral, qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Ce vecteur est ensuite utilisé pour transfecter ou infecter une population cellulaire choisie. Les 5 cellules transfectées ou infectées ainsi obtenues sont alors cultivées dans des conditions permettant l'expression de l'acide nucléique, et le variant d'apoA-I recombinant selon l'invention est isolé. Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des variants de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi 10 les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus,ou Streptomyces. Le variant ainsi isolé peut être ensuite conditionné en vue de son utilisation thérapeutique.
Selon un mode particulièrement intéressant, I'acide nucléique selon I'invention est utilisé directement à titre de médicament, dans des applications de thérapie génique ou cellulaire. A cet égard, il peut être utilisé
tel quel, par injection au niveau du site à traiter ou incubation avec des cellules en vue de leur administration. Il a en effet été décrit que les acides nucléiques nus pouvaient pénétrer dans les cellules sans vecteur particulier.
Néanmoins, on préfère dans le cadre de la présente invention utiliser un vecteur d'administration, permettant d'améliorer (i) I'efficacité de la pénétration cellulaire, (ii) le ciblage (iii) la stabilité extra- et intracellulaires.
Selon un mode particulier, la présente invention concerne donc un vecteur comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant.

CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCT~R96/00747 Différents types de vecteurs peuvent être utilisés. Il peut s'agir de vecteurs viraux ou non viraux.
Dans un mode préféré, le vecteur de l'invention est un vecteur viral.
L'utilisation de vecteurs viraux repose sur les propriétés naturelles de 5 transfection des virus. Il est ainsi possible d'utiliser les adénovirus, les herpès virus, les rétrovirus les virus adéno associés ou encore le virus de la vaccine. Ces vecteurs s'avèrent particulièrement performants sur le plan de la transfection.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes, 10 dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés.
Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de Ja présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente 15 invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De préférence, I'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et l'acide nucléique d'intérêt. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de I'invention, la région E1 au moins est non fonctionnelle. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes CA 022187~9 1997-11-06 W O 96/37608 PCTn~R96/00747 considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de - I'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3 (W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649, W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode particulièrement préféré, on utilise dans le cadre de la présente invention un adénovirus recombinant présentant une délétion de tout ou partie des régions E1 et E4. Ce type de vecteur offre en effet des propriétés de sécurité particulièrement avantageuses.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMB0 J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre l'acide nucléique ou la cassette de l'invention. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesditséléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J.
Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). D'autres lignées ont été décrites dans les demandes n~ W0 94/26914 et W095/02697.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.

CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA~R96/00747 Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. lls sont capables d'infecter unlarge spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pasimpliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des MV a été
cloné, séquencé et caractérisé. ll comprend environ 4700 bases, et contient à
chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divis~
10 en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation: la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088;
WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo (directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant l'acide nucléique ou la cassette de l'invention bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques (voir notamment W095/06743).
Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature: voir notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, CA 022l87~9 l997-ll-06 EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, - BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ils constituent donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des 5 rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à
10 partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV
("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants comportant l'acide nucléique ou la cassette de l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et l'acide nucléique ou la cassette est construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRlP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm~12 (WO89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer I'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout 30 particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus W 096/37608 PCT/~h~C100747 recombinant défectif. Ces vecteurs possèdent en effet des propriétés particulièrement intéressantes pour le transfert de gènes codant pour des apolipoprotéines. Les vecteurs adénoviraux selon l'invention sont particulièrement avantageux pour une administration directe in vivo d'une 5 suspension purifiée, ou pour la transformation ex vivo de cellules, notamment autologues, en vue de leur implantation. De plus, les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en outre des avantages importants, tels que notamment leur très haute efficacité d'infection, permettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes de suspension virale.
A cet égard, I'invention concerne préférentiellement un adénovirus recombinant défectif comprenant, inséré dans son génome, un ADN codant pour un variant de l'apolipoprotéine A-l tel que défini ci-avant.
Selon un autre mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre de l'invention, on utilise une lignée productrice de vecteurs rétroviraux 15 contenant la séquence codant pour le variant de l'ApoA-I, pour une implantation in vivo. Les lignées utilisables à cet effet sont notamment les cellules PA317 (US4,861,719), PsiCrip (WO90/02806) et GP+envAm-12 (US5,278,056), modifiées pour permettre la production d'un rétrovirus contenant une séquence nucléique codant pour un variant de l'ApoA-I selon I'invention.
Selon un autre aspect de I'invention, le vecteur utilisé est un vecteur chimique. Le vecteur selon l'invention peut en effet être un agent non viral capable de promouvoir le transfert et l'expression d'acides nucléiques dans des cellules eucaryotes. Les vecteurs chimiques ou biochimiques représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter.

=
CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA~R96/00747 Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter I'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides 5 nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges polycationiques.
Parmi les vecteurs synthétiques développés, les polymères cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, polyéthylène immine et DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants sont les plus 10 avantageux. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc) et différents lipidescationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc). Plus récemment, il a été développé le concept de la transfection ciblée, médiée par un récepteur, 15 qui met à profit le principe de condenser l'ADN grâce au polymère cationique tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des 20 asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit~
L'invention concerne également toute cellule modifiée génétiquement par insertion d'un acide nucléique codant pour un variant de l'apolipoprotéine A-l tel que défini précédemment. Il s'agit avantageusement de cellules mammifères, susceptibles d'être administrées ou implantées in vivo. Il peut 25 s'agir en particulier de fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules endothéliales, épithéliales, gliales, etc. Les cellules sont préférentiellement d'origine humaine. De manière particulièrement avantageuse, il s'agit de cellules autologues, c'est-à-dire prélevée à partir d'un patient, modifiées ex vivo par un acide nucléique selon l'invention en CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA~R96/00747 vue de leur conférer des propriétés thérapeutiques, puis réadministrées au patient.
Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures primaires. Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de 5 I'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agissant plus particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham [Methods Cell.Biol. 21a (1980) 255]. Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'insertion de l'acide nucléique de 10 I'invention (au moyen d'un vecteur viral ou chimique), ou conservées, par exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de banques préétablies (voir par exemple EP 2284~8, EP 289034, EP 400047, EP 456640).
Les cellules en culture peuvent en particulier être infectées par les virus recombinants de l'invention pour leur conférer la capacité de produire un variant de l'apoA-I biologiquement actif. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le 20 type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, I'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection et éventuellement le nombre de cycles d'infection réalisé. Il est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité appropriées lorsque les cellules sont destinées à une administration in vivo. Les doses de virus 25 recombinant utilisées pour l'infection des cellules peuvent être adaptées parl'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci-avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à l'infection in vitro.
Pour l'infection par des rétrovirus, il est également possible de co-cultiver les cellules que l'on désire infecter avec des cellules productrices des rétrovirus CA 022l87~9 l997-ll-06 W O 96/37608 PCTA~R96/00747 recombinants selon l'invention. Ceci permet de s'affranchir de la purification des rétrovirus.
Un autre objet de l'invention concerne un implant comprenant des cellules de mammifères génétiquement modifiées par insertion d'un acide nucléique tel que défini ci-avant, et une matrice extracellulaire.
Préférentiellement, les implants selon l'invention comprennent 105 à 101~
cellules. Plus préférentiellement, ils en comprennent 106 à 108. Les cellules peuvent également être des cellules productrices de virus recombinants contenant inséré dans leur génome un acide nucléique tel que défini ci-10 avant.
Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matriceextracellulaire comprend un composé gélifiant et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules.
Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le collagène, la gélatine, les glycosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du collagène. Il peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus préférenciellement, on utilise du collagène de type 1.
Comme indiqué ci-avant, les compositions selon l'invention comprennent avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules.
Le terme ancrage désigne toute forme d'interaction biologique eVou chimique eVou physique entraînant l'adhésion eVou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux. On préfère utiliser dans le CA 022l87~9 l997-ll-06 W 096/37608 PCT~R96/00747 cadre de l'invention un support solide, non toxique eVou bio-compatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou unsupport d'origine biologique (corail, os, collagène, etc).
Les implants selon l'invention peuvent être implantés en différents 5 sites de l'organisme. En particulier, I'implantation peut être effectuée au niveau de la cavité péritonéale, dans le tissu sous-cutané (région sus-pubienne, fosses iliaques ou inguinales, etc), dans un organe, un muscle, une tumeur, le système nerveux central, ou encore sous une muqueuse. Les implants selon l'invention sont particulièrement avantageux en ce sens qu'ils 10 permettent de contrôler la libération du variant d'apoA-I dans l'organisme:
Celle-ci est tout d'abord déterminée par la multiplicité d'infection et par le nombre de cellules implantées. Ensuite, la libération peut être contrôlée soit par le retrait de l'implant, ce qui arrête définitivement le traitement, soit par l'utilisation de systèmes d'expression régulables, permettant d'induire ou de 15 réprimer l'expression des gènes thérapeutiques.
En raison des propriétés anti-athérogènes particulièrement remarquables des variants de l'invention, les acides nucléiques constituent ainsi un nouveau médicament dans le traitement et la prévention des pathologies cardiovasculaires (athérosclérose, resténose, etc).
L'invention concerne à cet effet tout composition pharmaceutique comprenant un variant de l'apolipoprotéine A-l eVou un acide nucléique eVou un vecteur eVou une cellule génétiquement modifiée tels que décrits ci-avant.
La présente invention offre ainsi un nouveau moyen pour le traitement ou la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, en particulier dans le domaine des affections cardiovasculaires comme l'infarctus du myocarde, I'angor, la mort subite, la resténose, la décompensation cardiaque et les accidents cérébro-vasculaires. Plus généralement, cette approche CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCT~R96/00747 offre un moyen d'intervention thérapeutique très prometteur pour chaque cas où un déficit d'ordre génétique ou métabolique de l'apolipoprotéine A-l peut être corrigé.
La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples 5 qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Liste des figures Fig 1 : Carte de restriction du plasmide PXL2116 Fig 2 : Construction du phage M 13 portant l'exon 4 du patient.
Fig 3: Construction du vecteur portant PXL2116 muté.
Fig 4 : Etudes de turbidimétrie en fonction de la température.
Fig 5: Profils de gel filtration.
Fig 6 : Fluorescence des tryptophanes et concentration en phospholipides par fraction pour les differents complexes.

ExemPles Exemple 1 - Mise en évidence d'un variant ApoAI
Le variant ApoA-I Paris a été identifié et isolé à partir d'un patient sélectionné en raison de son bilan lipidique particulier. Plus précisément, le patient présentait le bilan lipidique suivant (nature du prélévement: sérum).
Normales Cholestérol total 4.59 mmol/l 4.54-6.97 Triglycérides 2.82 mmol/l 0.74-1.71 HDL-cholestérol 0.25 mmol/l 0.88-1.60 LDL-cholestérol 3.06 mmol/l 2.79-4.85 CA 022187~9 1997-11-06 17bis : Liste des ~qures Fig 1 : Carte de restriction du plasmide PXL2116 Fig 2: Construction du phage M 13 portant l'exon 4 du patient.
Fig 3 : Construction du vecteur portant PXL2116 muté.
Fig 4 : Etudes de turbidimétrie en fonction de la température.
4a: turbidimetrie de l'association de différentes ApoAI et de DPMC en absence de GndHCI (~-: témoin; ----: recombinante; -~-: plasmatique; -o-: Paris.).
4b: turbidimetrie de l'association de différentes ApoAI et de DPMC en présence de GndHCI (~-: témoin; ----: recombinante; -~-: plasmatique;
-o-: Paris.).
4c: turbidimetrie de l'association de l'ApoAI Paris et de DPMC (~-:
en absence de GndHCI; -3-: en présence de GndHCI (0.5M)).
4d: turbidimetrie de l'association de l'ApoAI recombinante et de DPMC (~-: en absence de GnHCI; -O-: en présence de GnHCI (0.5M)).
4e: turbidimetrie de l'association de l'ApoAI plasmatique et de DPMC
(~-: en absence de GndHCI; -3-: en présence de GndHCI (0.5M)).
4f: effet de GndHCI (0.5M) sur l'association ApoAI / DPMC (~-: en absence de GndHCI; -~-: en présence de GndHCI) Fig 5: fluorescence relative des fractions de Superose 6 PG.(~-:
POPC/AI Paris; -~-: POPC/AI recombinante; ---- POPC/AI plasmatique.) Fig 6: 6a: Fluorescence des tryptophanes et concentration en phospholipides pour le complexe POPC/AI Paris (~-: fluorescence relative;
-~-: phospholipides).
6b: Fluorescence des tryptophanes et concentration en phospholipides pour le complexe POPC/AI recombinante(~-: fluorescence relative; -_-: phospholipides).

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FEULLE MnnlFlEE

CA 022l87~9 l997-ll-06 W 096/37608 PCTi~h~ 747 Apolipoprotéine A-l 0.50 9/l 1.20-2.15 Apolipoprotéine B 1.38 g/l 0.55-1.30 Phenotype apoE: 3/3 De manière inattendue, ce patient ne présentait aucun signe 5 d'athérosclérose malgré une concentration d'HDL extrêmement faible et une hypertriglycéridémie. Ceci a conduit les demandeurs à rechercher l'origine de cette protection.
Isolement des HDL contenant l'a~oA-I Paris à ~artir du plasma.
Après une nuit à jeun, du sang est prélevé chez les sujets portant le 10 gène de l'apoA-I Paris. Le plasma est préparé par centrifugation lente du sang à 4~C (2000 g, 30 minutes). Les lipoprotéines de haute densité sont préparées par ultracentrifugation séquentielle à la densité de 1.063-1.21 g/ml (Havel, J. Clin. Invest. 34: 1345-54, 1955). La fraction contenant les HDL est ensuite dialysée contre du tampon Tris-HCI 10 mM, azide de sodium 0,01 %, lS au pH 7,4.
Mise en évidence des dimères d'aooA-I Paris.
La fraction HDL dialysée est délipidée dans un mélange diethylether/
ethanol (3/1, v/v) et la contrentration de protéines est estimée par la méthode de Lowry (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193:265-75, 1951). Les protéines de 20 la fration HDL subissent une migration sur un gel de polyacrylamide en présence de SDS en condition non réductrice. Cette migration permet de mettre en évidence la taille des differentes protéines des HDL du patient.
Outre la présence des protéines correspondantes aux apoA-I et apoA-II de tailles normales, cette analyse révèle la présence de protéines de plus hauts 25 poids moléculaires correspondant à des dimères d'apoA-I et des complexes apoA-I et apoA-II. La présence des apoA-I et apoA-II dans ces complexes a été vérifiée par une révélation immunologique spécifique.

CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCT/~h~G~oo747 Mise en évidence de la différence de charge de l'apoA-I mutée La détection de l'apoA-I mutée directement à partir du plasma a été
réalisée selon le protocole suivant (Menzel, H. J., and Utermann, G., Electroforesis, 7: 492-495, 1986): vingt microlitres de plasma sont délipidés 5 toute une nuit avec le mélange éthanol/ether et resuspendu dans un tampon de dépot. Un aliquot de 5 ,ul subit une électrophorèse sur un gel de focusing isoelectrique (pH 4-6,5, Pharmolyte), et les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nylon. Les bandes correspondantes à
l'apoA-I sont détectées par une réaction immunologique à l'aide d'anticorps 10 anti-apoA-I humaine.
La détection de l'apoA-I mutée peut se faire aussi à partir des protéines HDL. La fraction HDL dialysée est délipidée dans un mélange diethylether/ ethanol (3/1, v/v) et la contrentration de protéines est estimée par la méthode de Lowry (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193:265-75, 1951).
15 Environ 100 ,ug de protéines subissent une électrophorèse sur un gel de focusing isoelectrique (pH 4-6,5, Pharmolyte), et les protéines sont ensuite révélées par coloration au bleu de Coomassie. Cette technique permet de mettre en évidence que les isoformes les plus importantes des apoA-I du patient ayant la mutation sont déplacées vers l'anode, ce qui correspond à
20 une différence de charge de -1 par rapport à la charge d'apoA-I normale.
Exemple 2 - Identification du gène et de la mutation L'ADN génomique du patient a été isolé du sang total selon la technique de Madisen et al. (Amer. J. Med. Genet, 27: 379-390, 1987). Le gène de l'apoA-I a ensuite été amplifié par la technique de PCR. A cet effet, 25 les réactions d'amplification ont été réalisées sur 1 1~9 d'ADN génomique purifié introduit dans le mélange suivant:
- 10 ,ul de tampon 10X (100 mM Tris-HCI pH 8,3; 500 mM KCI; 15 mM MgC12; 0,1 % (w/v) gélatine) W 096/37608 PCT~R96/00747 - 10 ~I de dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 2mM
- 20 pmol de chaque amorce CA 022l87 ~ 9 l997-ll-06 W 096/37608 PCTI ~ h ~ '00747 NEW VARIANTS OF APOLIPOPROTEIN Al The present invention relates to a new variant of apolipoprotein A1. It also relates to any nucleic acid encoding this new variant. It also relates to the use of these proteins or 5 nucleic acids for therapeutic purposes. More specifically, The invention relates to a new variant of the apolipoprotein A1 comprising in particular a transfer to position 151.
Apolipoprotein Al (apoA-I) is the major constituent of high density lipoproteins (HDL), which are complexes 10 macromolecular compounds of cholesterol, phospholipids and triglycerides. ApoA-I is a protein made up of 243 amino acids, synthesized as a preproprotein of 267 residues, having a molecular mass of 28,000 daltons. The prepro form of apoA-I is synthesized in humans by both the liver and the gut. This form of protein is then cleaved into proprotein which is secreted in the plasma.
In the vascular compartment, proapoA-I is then transformed into mature protein (243 amino acids) by the action of a calcium protease dependent. ApoA-I has a structural role and an active role in the lipoprotein metabolism: apoA-I is in particular a cofactor of lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT), responsible for esterification plasma cholesterol.
The level of cholesterol in the HDL fraction and the plasma concentrations of apoA-I are negative risk factors for the development of atherosclerosis in humans. The studies epidemiological studies have indeed shown an inverse correlation between HDL and apoA-I cholesterol levels and incidence of disease cardiovascular (EG Miller et al. Lancet, 1977: 965-968). On the other hand, longevity is associated with high HDL cholesterol.
Recently, the protective role of apoA-I has been demonstrated in a model of CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096137608 PCTA ~ R96 / 00747 transgenic mice expressing human apolipoprotein Al (Rubin et al.
Nature). Similarly, the infusion of HDL in rabbits induces a regression of lesions (Badimon et al. J. Clin. Invest. 85, 1234-41, 1990). Different mechanisms have been proposed to explain the protective effect of HDL, and 5 in particular a role of HDL in the reverse transport of cholesterol (Fruchart et al. Circulation, 87: 22-27, 1993) and an antioxidant action of HDL (Forte T., Current Opinion in Lipidology, 5: 354-364,1994)).
The gene encoding apoA-I has been cloned and sequenced (Sharpe et al., Nucleic Acids Res. 12 (9) (1984) 3917). This gene, 1863 bp long, 10 includes 4 exons and 3 introns. The cDNA encoding apoA-I was also described (Law et al., PNAS 81 (1984) 66). This cDNA comprises 840 bp (Cf SEQ
ID n ~ 1). In addition to the wild form of apoA-I, various natural variants have have been described in the prior art, the differences from which are compared to the wild protein are given in the table below.
Variant: Mutation VariantMutation Milano Arg173Cys NorwayGlu136Lys Marburg Lys1070 Pro165Arg Munster2B Ala158Glu Pro3His Giessen Pro143Arg Arg1 OLeu Munster3A Asp103Asn Gly26Arg Munster3B Pro4Arg Asp89Glu Munster3C Pro3Arg Lys107Met Munster3D Asp213Gly Glu139Gly Munster4 Glu198Lys Glu147Val Yame Asp13Tyr Ala158Glu Asp213Gly Glu169Gln Arg177His CA 022l87 ~ 9 l997-ll-06 W 096/37608 PCT ~ R96 / 00747 The present invention follows from the discovery of a new ~ series of variants of the apolipoprotein A1. This series of variant presents in particular a substitution of the arginine residue in position 151 by a residue cysteine. The apoA-I variant according to the invention has properties remarkable therapeutic. In particular, it has properties of particularly important anti-atherogenic protection. So in a situation of extremely low cholesterol levels in the HDL fraction, associated with hypertriglyceridemia, the presence of this variant prevents development of any atherosclerosis, showing a very protective role 10 powerful, specific to this mutated apoA-I. In addition, the presence of a cysteine on apoA-I according to the invention causes the formation of dimers and other complexes linked by a disulfide bridge. This apoA-I is found in free form in plasma, bound in dimer to itself or associated with apolipoprotein A-ll which is another important protein associated with HDL and which also has a cysteine in its sequence. In addition, the pressure drop linked to arginine at position 151 leads to visualization of this mutant by electroisofocusing of plasma proteins followed of an immunological revelation of apoA-I.
Given its particularly anti-atherogenic properties remarkable, this new protein according to the invention offers an advantage important therapeutic in the treatment and prevention of pathologies cardiovascu lalres.
A first object of the invention therefore relates to a series of variants of human apolipoprotein A1 comprising a cysteine at position 151. The reference apoA-I amino acid sequence is described in the literature (Cf Law cited above). This sequence, including the prepro region (residues 1 to 24), is presented on the sequence SEQ ID n ~ 1. A
characteristic of the variants according to the invention therefore resides in the presence of a cysteine at position 151 of mature apoA-I (corresponding to the 30 position 175 on the sequence SEQ ID n ~ 1), in substitution for arginine CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA ~ R96 / 00747 present in the reference sequence. A preferred variant according to the invention includes the peptide sequence SEQ ID n ~ 2, and, even more preferably, the peptide sequence between residues 68 to 267 of the sequence SEQ ID n ~ 1, the residue 175 being substituted with a 5 cysteine.
The variants according to the invention are represented in particular by apoA-I
Paris, i.e. an apoA-I with a cysteine in position 151 by compared to native apoA-I. The variants according to the invention can also carry other structural changes compared to apolipoprotein A1 10 of reference, and in particular of other mutations, deletions eVou additions.
According to a particular mode, the variants of the invention also comprise other mutations leading to the replacement of residues by cysteines. Thus, another particular variant combines the mutations present in the variant apoA-I Paris and apoA-I milano. Other mutations can 15 also be present affecting residues which do not modify so significant properties of apoA-I. The activity of these variants can be verified in particular by a cholesterol efflux test.
The variants according to the invention can be obtained from different manners. They can first of all be chemically synthesized, thanks to 20 techniques of the skilled person using peptide synthesizers. They can also be obtained from apoA-I of re ~ erence, by mutation (s). Advantageously, these are recombinant proteins, that is to say say obtained by expression in a cellular host of a nucleic acid corresponding as described below.
As indicated above, the variants according to the invention can be find in monomeric form or in dimer form. The presence of a cysteine at least in the sequence of the variants of the invention allows indeed the production of dimers by disulfide bond. It could be homodimers, that is to say dimers comprising two variants according to -CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCT / ~ k ~ Gloo747 The invention (example: diApoA-I Paris); or heterodimers, i.e.
dimers comprising a variant according to the invention and another molecule having a free cysteine (example: ApoA-I Paris: ApoAII).
Another object of the invention resides in a nucleic acid encoding for a variant of apolipoprotein A1 as defined above. The nucleic acid of the present invention can be a deoxyribonucleic acid (DNA) or a ribonucleic acid (RNA). Among the DNAs, it may be a DNA
complementary (cDNA), genomic DNA (gDNA), a sequence hybrid or of a synthetic or semi-synthetic sequence. He can also 10 be a chemically modified nucleic acid, for example for increase its resistance to nucleases, its penetration or its targeting cellular, its therapeutic efficacy, etc. These nucleic acids can be of human, animal, plant, bacterial, viral, synthetic origin, etc. They can be obtained by any technique known to those skilled in the art.
15 trade, and in particular by screening of banks, by chemical synthesis, or again by mixed methods including chemical modification or enzymatic sequences obtained by screening libraries.
Advantageously, the nucleic acid is a cDNA or a gDNA.
Preferably, the nucleic acid according to the invention comprises the sequence SEQ ID n ~ 2. Even more preferably, it includes the sequence SEQ ID n ~ 10.
The nucleic acid according to the invention advantageously comprises a promoter region of functional transcription in the cell or the target organism, as well as a region located in 3 ', and which specifies a signal of transcriptional end and a polyadenylation site. All of these elements constitutes the expression cassette. Regarding the promoter region, it may be the promoter region naturally responsible for expression of the apoA-I gene or a variant of ApoA-I when the latter CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCT ~ R96 / 00747 is likely to function in the cell or organism concerned. he may also be regions of different origin (responsible for expression of other proteins, or even synthetic). In particular, it can be promoter sequences of eukaryotic or viral genes. Through 5 example, they may be promoter sequences from the genome of the target cell. Among the eukaryotic promoters, any promoter can be used or derived sequence stimulating or repressing the transcription of a gene for specific way or not, inducible or not, strong or weak. It can be in particular of ubiquitous promoters (promoter of the genes HPRT, PGK, 10 vimentin, a-actin, tubulin, etc.), therapeutic gene promoters (for example the promoter of the MDR, CFTR, Factor VIII, etc. genes) tissue-specific promoters (promoter of the pyruvate kinase gene, villin, intestinal fatty acid binding protein, smooth muscle a-actin, etc.) or promoters responding to a stimulus (hormone receptor 15 steroids, retinoic acid receptor, etc.). Likewise, it can be promoter sequences from the genome of a virus, such as, for example, promoters of the E1A and MLP genes of adenovirus, the early promoter of CMV, the promoter of the RSV LTR, etc. In addition, these promoter regions can be modified by adding activation, regulation sequences, 20 or allowing a tissue-specific or majority expression.
Furthermore, the nucleic acid can also comprise a signal sequence directing the product synthesized in the secretion pathways of the target cell. This signal sequence can be the natural signal sequence apoA-I, but it can also be any other signal sequence 25 functional, or an artificial signal sequence.
The nucleic acid according to the invention can be used to produce the Recombinant ApoA-I variants by expression in a host cell recombinant, or directly as a drug in applications of gene or cell therapy.

CA 022187 ~ 9 1997-11-06 WO 96137608 PCT ~ R96 / 00747 For the production of recombinant variants according to the invention, the acid nucleic acid is advantageously incorporated into a plasmid or viral vector, which can be autonomous or integrative replication. This vector is then used to transfect or infect a selected cell population. The 5 transfected or infected cells thus obtained are then cultured in conditions allowing expression of the nucleic acid, and the variant of recombinant apoA-I according to the invention is isolated. Cellular hosts usable for the production of the variants of the invention by route recombinant are both eukaryotic and prokaryotic hosts. Among 10 suitable eukaryotic hosts include animal cells, yeasts, or fungi. In particular, in the case of yeasts, it is possible to cite yeasts of the genus Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, or Hansenula. In the case of animal cells, we can quote cells COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Among the mushrooms, may more particularly cite Aspergillus ssp. or Trichoderma ssp. As Prokaryotic hosts, it is preferred to use the following bacteria E.coli, Bacillus, or Streptomyces. The variant thus isolated can then be packaged for of its therapeutic use.
According to a particularly interesting mode, the nucleic acid according to The invention is used directly as a medicament, in gene or cell therapy applications. In this regard, it can be used as is, by injection at the site to be treated or incubation with cells for administration. It has indeed been described that the acids naked nuclei could enter cells without a specific vector.
However, it is preferred in the context of the present invention to use a vector of administration, making it possible to improve (i) the effectiveness of the cell penetration, (ii) targeting (iii) extra- and intracellular stability.
According to a particular embodiment, the present invention therefore relates to a vector comprising a nucleic acid as defined above.

CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCT ~ R96 / 00747 Different types of vectors can be used. It could be viral or non-viral vectors.
In a preferred embodiment, the vector of the invention is a viral vector.
The use of viral vectors is based on the natural properties of 5 virus transfection. It is thus possible to use adenoviruses, herpes virus, retroviruses, the associated adeno viruses or the vaccinated. These vectors are particularly effective in terms of transfection.
As regards more particularly adenoviruses, different serotypes, 10, the structure and properties of which vary somewhat, have been characterized.
Among these serotypes, it is preferred to use in the context of Ja present invention human adenoviruses type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenovirus of animal origin (see application WO94 / 26914). From adenovirus of animal origin usable in the context of this 15 invention include adenoviruses of canine, bovine, murine origin, (example: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), sheep, pigs, avian or even simienne (example: after-sales service). Preferably, the original adenovirus animal is a canine adenovirus, more preferably an adenovirus CAV2 [Manhattan strain or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example]. Of preferably, in the context of the invention, adenoviruses of origin are used human or canine or mixed.
Preferably, the defective adenoviruses of the invention comprise ITR, a sequence allowing encapsidation and nucleic acid of interest. Even more preferably, in the adenovirus genome of I'invention, the region E1 at least is non-functional. The viral gene considered can be made non-functional by any known technique of a person skilled in the art, and in particular by total suppression, substitution, partial deletion, or addition of one or more bases in the gene (s) CA 022187 ~ 9 1997-11-06 WO 96/37608 PCTn ~ R96 / 00747 considered. Such modifications can be obtained in vitro (on - isolated DNA) or in situ, for example, using engineering techniques genetics, or by treatment with mutagenic agents. Others regions can also be modified, in particular the E3 region (W095 / 02697), E2 (W094 / 28938), E4 (W094 / 28152, W094 / 12649, W095 / 02697) and L5 (W095 / 02697). According to a particularly preferred mode, a recombinant adenovirus is used in the context of the present invention presenting a deletion of all or part of the regions E1 and E4. This kind of vector indeed offers particularly safety properties advantageous.
The defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185,573; Graham, EMB0 J. 3 (1984) 2917). In in particular, they can be prepared by homologous recombination between a adenovirus and a plasmid carrying, among other things, the nucleic acid or the cassette of the invention. Homologous recombination occurs after co-transfection of said adenovirus and plasmid in an appropriate cell line. The cell line used must preferably (i) be transformable by said elements, and (ii), contain the sequences capable of complementing the part of the defective adenovirus genome, preferably in integrated form to avoid the risk of recombination. As an example of a line, we can mention the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J.
Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome of an Ad5 adenovirus (12%). Other lines have have been described in applications No. W0 94/26914 and W095 / 02697.
Then the multiplied adenoviruses are recovered and purified according to conventional molecular biology techniques, such as illustrated in the examples.

CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA ~ R96 / 00747 Regarding adeno-associated viruses (AAV), these are DNA viruses of relatively small in size, which fit into the genome of the cells they infect, stably and site-specifically. They are capable of infecting a wide spectrum of cells, without inducing an effect on growth, cell morphology or differentiation. Furthermore, they do not seem to be involved in pathologies in humans. The genome of MV has been cloned, sequenced and characterized. lt comprises about 4700 bases, and contains each end an inverted repeat region (ITR) of approximately 145 bases, serving as the replication source for the virus. The rest of the genome is divided ~
10 in 2 essential regions carrying the packaging functions: the part left of the genome, which contains the rep gene involved in replication viral and viral gene expression; the right part of the genome, which contains the cap gene encoding the capsid proteins of the virus.
The use of AAV-derived vectors for gene transfer in in vitro and in vivo has been described in the literature (see in particular WO 91/18088;
WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488,528). These requests describe various constructions derived from AAVs, in which the rep and / or cap genes are deleted and replaced by a gene of interest, and their use to transfer in vitro (to cells in culture) or in vivo (directly in an organism) said gene of interest. Recombinant AAVs defective according to the invention can be prepared by co-transfection, in a cell line infected with a human helper virus (e.g. a adenovirus), a plasmid containing the nucleic acid or the the invention flanked by two inverted repeat regions (ITRs) of AAV, and a plasmid carrying the AAV packaging genes (rep and cap genes). The Recombinant AAV products are then purified by techniques classics (see in particular W095 / 06743).
With regard to herpes viruses and retroviruses, the construction of recombinant vectors has been widely described in the literature: see especially Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, CA 022l87 ~ 9 l997-ll-06 EP178220, Bernstein et al. Broom. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, - BioTechnology 3 (1985) 689, etc. In particular, retroviruses are viruses integrative, selectively infecting dividing cells. They constitute therefore vectors of interest for cancer applications. The genome of 5 retrovirus basically consists of two LTR, a sequence packaging and three coding regions (gag, pol and env). In the vectors recombinants derived from retroviruses, the gag, pol and env genes are generally deleted, in whole or in part, and replaced by a sequence heterologous nucleic acid of interest. These vectors can be made at 10 from different types of retroviruses such as in particular MoMuLV
("murine moloney leukemia virus"; still designated MoMLV), MSV ("murine moloney sarcoma virus "), HaSV (" harvey sarcoma virus "); SNV (" spleen necrosis virus "); RSV (" rous sarcoma virus ") or the Friend virus.
To build recombinant acid retroviruses nucleic acid or the cassette of the invention, a plasmid comprising in particular the LTRs, the packaging sequence and the nucleic acid or the cassette is constructed and then used to transfect a so-called cell line packaging, capable of providing retroviral functions in trans deficient in the plasmid. Generally, the packaging lines are therefore capable of expressing the gag, pol and env genes. Such lines have been described in the prior art, and in particular the line PA317 (US4,861,719); the PsiCRlP line (WO90 / 02806) and the line GP + envAm ~ 12 (WO89 / 07150). In addition, recombinant retroviruses may include LTR changes to remove Transcriptional activity, as well as packaging sequences extended, comprising part of the gag gene (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). The recombinant retroviruses produced are then purified by classical techniques.
For the implementation of the present invention, it is all Particularly advantageous to use an adenovirus or a retrovirus W 096/37608 PCT / ~ h ~ C100747 defective recombinant. These vectors indeed have properties particularly interesting for the transfer of genes coding for apolipoproteins. The adenoviral vectors according to the invention are particularly advantageous for direct in vivo administration of a 5 purified suspension, or for the ex vivo transformation of cells, in particular autologous, for implantation. In addition, adenoviral vectors according to the invention also have significant advantages, such as in particular their very high infection efficiency, making it possible to carry out infections from low volumes of viral suspension.
In this regard, the invention preferably relates to an adenovirus defective recombinant comprising, inserted into its genome, DNA encoding for a variant of the apolipoprotein A1 as defined above.
According to another particularly advantageous mode of implementation of the invention, a line producing retroviral vectors is used 15 containing the sequence coding for the variant of ApoA-I, for a in vivo implantation. The lines usable for this purpose are in particular the PA317 (US4,861,719), PsiCrip (WO90 / 02806) and GP + envAm-12 cells (US5,278,056), modified to allow the production of a retrovirus containing a nucleic sequence coding for a variant of ApoA-I according to The invention.
According to another aspect of the invention, the vector used is a vector chemical. The vector according to the invention can indeed be a non-viral agent capable of promoting the transfer and expression of nucleic acids in eukaryotic cells. Chemical or biochemical vectors represent an interesting alternative to natural viruses in particular for reasons of convenience, security and also by the absence of theoretical limit as regards the size of the DNA to be transfected.

=
CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA ~ R96 / 00747 These synthetic vectors have two main functions, to compact The nucleic acid to be transfected and promote its cellular fixation as well as its passage through the plasma membrane and, where appropriate, both nuclear membranes. To overcome the polyanionic nature of acids 5 nucleic, non-viral vectors all have charges polycationic.
Among the synthetic vectors developed, polymers polylysine type cationics, (LKLK) n, (LKKL) n, immine polyethylene and DEAE dextran or cationic lipids or lipofectants are the most 10 advantageous. They have the property of condensing DNA and promoting its association with the cell membrane. Among these, we can cite lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc.) and various cationic or neutral lipids (DOTMA, DOGS, DOPE, etc.). More recently, it has was developed the concept of targeted transfection, mediated by a receptor, 15 which takes advantage of the principle of condensing DNA thanks to the cationic polymer while directing the attachment of the complex to the membrane by means of coupling chemical between the cationic polymer and the ligand of a receptor membrane, present on the surface of the cell type that we want to graft. The targeting the transferrin, insulin receptor or the 20 asialoglycoproteins of hepatocytes has thus been described ~
The invention also relates to any genetically modified cell.
by insertion of a nucleic acid coding for a variant of apolipoprotein Al as defined above. Advantageously, these are cells mammals, capable of being administered or implanted in vivo. he can 25 in particular fibroblasts, myoblasts, hepatocytes, keratinocytes, endothelial, epithelial, glial cells, etc. The cells are preferably of human origin. Particularly advantageous, these are autologous cells, that is to say taken from of a patient, modified ex vivo with a nucleic acid according to the invention in CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA ~ R96 / 00747 to give them therapeutic properties, then re-administered patient.
The cells according to the invention can come from cultures primary. These can be removed by any known technique of 5 skilled in the art, then cultured under conditions allowing their proliferation. More specifically, fibroblasts, these can be easily obtained from biopsies, for example according to the technique described by Ham [Methods Cell.Biol. 21a (1980) 255]. These cells can be used directly for the insertion of nucleic acid from 10 the invention (by means of a viral or chemical vector), or conserved, by example by freezing, for the establishment of autologous banks, in for future use. The cells according to the invention can also be secondary cultures, obtained for example from pre-established banks (see for example EP 2284 ~ 8, EP 289034, EP 400047, EP 456640).
The cells in culture can in particular be infected by recombinant viruses of the invention to give them the ability to produce a biologically active variant of apoA-I. Infection is carried out in vitro according to techniques known to those skilled in the art. In particular, according to the 20 type of cells used and the number of copies of virus per cell desired, A person skilled in the art can adapt the multiplicity of infection and possibly the number of infection cycles completed. It is understood that these steps should be performed under appropriate sterile conditions when the cells are intended for administration in vivo. Doses of virus 25 recombinant used for infection of cells can be adapted by the skilled person according to the desired purpose. The conditions described above for in vivo administration can be applied to in vitro infection.
For infection with retroviruses, it is also possible to co-cultivate the cells which one wishes to infect with cells producing retroviruses CA 022l87 ~ 9 l997-ll-06 WO 96/37608 PCTA ~ R96 / 00747 recombinants according to the invention. This makes it possible to get rid of the purification retroviruses.
Another subject of the invention relates to an implant comprising mammalian cells genetically modified by insertion of an acid nucleic acid as defined above, and an extracellular matrix.
Preferably, the implants according to the invention comprise 105 to 101 ~
cells. More preferably, they include 106 to 108. The cells may also be recombinant virus producing cells containing inserted into their genome a nucleic acid as defined above 10 before.
More particularly, in the implants of the invention, the extracellular matrix comprises a gelling compound and optionally a support allowing the anchoring of cells.
For the preparation of the implants according to the invention, different types of gelling agents can be used. Gelling agents are used for inclusion cells in a gel-like matrix, and to promote anchoring the cells on the support, if applicable. Different agents cell adhesion can therefore be used as gelling agents, such as especially collagen, gelatin, glycosaminoglycans, fibronectin, lectins, etc. Preferably, one uses within the framework of the present invention of collagen. It can be collagen of human, bovine origin or murine. More preferably, type 1 collagen is used.
As indicated above, the compositions according to the invention advantageously comprise a support allowing the anchoring of the cells.
The term anchoring designates any form of biological eVou chemical interaction eVou physical resulting in adhesion eVou fixing cells on the support. Furthermore, the cells can either cover the support used, or penetrate inside this support, or both. We prefer to use in the CA 022l87 ~ 9 l997-ll-06 W 096/37608 PCT ~ R96 / 00747 framework of the invention a solid, non-toxic eVou bio-compatible support. In in particular, polytetrafluoroethylene (PTFE) fibers or a support of biological origin (coral, bone, collagen, etc.) can be used.
The implants according to the invention can be implanted in different 5 sites of the organization. In particular, the implantation can be carried out at level of the peritoneal cavity, in the subcutaneous tissue (sus-pubic, iliac or inguinal fossa, etc.), in an organ, muscle, a tumor, the central nervous system, or even under a mucous membrane. The implants according to the invention are particularly advantageous in that they 10 are used to control the release of the apoA-I variant in the body:
This is first of all determined by the multiplicity of infection and by the number of cells implanted. Then the release can be controlled either by removing the implant, which definitively stops the treatment, either by the use of regulatable expression systems, making it possible to induce or Repress the expression of therapeutic genes.
Due to the particularly anti-atherogenic properties remarkable variants of the invention, nucleic acids constitute thus a new drug in the treatment and prevention of cardiovascular pathologies (atherosclerosis, restenosis, etc.).
The invention relates for this purpose to any pharmaceutical composition comprising a variant of the apolipoprotein Al eVou an nucleic acid eVou an eV vector or a genetically modified cell as described above before.
The present invention thus provides a new means for treatment or the prevention of pathologies linked to dyslipoproteinemias, in particular in the area of cardiovascular conditions such as heart attack myocardium, angina, sudden death, restenosis, heart decompensation and strokes. More generally, this approach CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCT ~ R96 / 00747 offers a very promising therapeutic intervention for each case where a genetic or metabolic deficit of apolipoprotein Al can be corrected.
The present invention will be described in more detail using the examples 5 which follow, which should be considered as illustrative and not limiting.
List of Figures Fig 1: Restriction map of plasmid PXL2116 Fig 2: Construction of phage M 13 carrying the patient's exon 4.
Fig 3: Construction of the vector carrying mutated PXL2116.
Fig 4: Studies of turbidimetry as a function of temperature.
Fig 5: Gel filtration profiles.
Fig 6: Fluorescence of tryptophans and concentration of phospholipids by fraction for the different complexes.

Examples Example 1 - Demonstration of an ApoAI variant The ApoA-I Paris variant was identified and isolated from a patient selected because of its particular lipid balance. More specifically, the patient presented the following lipid balance (type of sample: serum).
Normal Total cholesterol 4.59 mmol / l 4.54-6.97 Triglycerides 2.82 mmol / l 0.74-1.71 HDL-cholesterol 0.25 mmol / l 0.88-1.60 LDL-cholesterol 3.06 mmol / l 2.79-4.85 CA 022187 ~ 9 1997-11-06 17bis : List of ~ qures Fig 1: Restriction map of plasmid PXL2116 Fig 2: Construction of phage M 13 carrying the patient's exon 4.
Fig 3: Construction of the vector carrying mutated PXL2116.
Fig 4: Studies of turbidimetry as a function of temperature.
4a: turbidimetry of the association of different ApoAI and DPMC in absence of GndHCI (~ -: control; ----: recombinant; - ~ -: plasma; -o-: Paris.).
4b: turbidimetry of the association of different ApoAI and DPMC in presence of GndHCI (~ -: control; ----: recombinant; - ~ -: plasma;
-o-: Paris.).
4c: turbidimetry of the association of ApoAI Paris and DPMC (~ -:
in the absence of GndHCI; -3-: in the presence of GndHCI (0.5M)).
4d: turbidimetry of the association of the recombinant ApoAI and DPMC (~ -: in the absence of GnHCI; -O-: in the presence of GnHCI (0.5M)).
4th: turbidimetry of the association of plasma ApoAI and DPMC
(~ -: in the absence of GndHCI; -3-: in the presence of GndHCI (0.5M)).
4f: effect of GndHCI (0.5M) on the association ApoAI / DPMC (~ -: in absence of GndHCI; - ~ -: in the presence of GndHCI) Fig 5: relative fluorescence of Superose 6 PG fractions (~ -:
POPC / AI Paris; - ~ -: Recombinant POPC / AI; ---- POPC / AI plasma.) Fig 6: 6a: Fluorescence of tryptophans and concentration of phospholipids for the POPC / AI Paris complex (~ -: relative fluorescence;
- ~ -: phospholipids).
6b: Fluorescence of tryptophans and concentration in phospholipids for the recombinant POPC / AI complex (~ -: fluorescence relative; -_-: phospholipids).

_. ~
LEAF MnnlFlEE

CA 022l87 ~ 9 l997-ll-06 W 096/37608 PCTi ~ h ~ 747 Apolipoprotein Al 0.50 9 / l 1.20-2.15 Apolipoprotein B 1.38 g / l 0.55-1.30 ApoE Phenotype: 3/3 Unexpectedly, this patient showed no signs 5 atherosclerosis despite an extremely low HDL concentration and a hypertriglyceridemia. This led the applicants to seek the origin of this protection.
Isolation of HDL containing a ~ oA-I Paris from ~ plasma.
After a night of fasting, blood is drawn from subjects carrying the 10 apoA-I Paris gene. The plasma is prepared by slow centrifugation of the blood at 4 ~ C (2000 g, 30 minutes). High density lipoproteins are prepared by sequential ultracentrifugation at a density of 1.063-1.21 g / ml (Havel, J. Clin. Invest. 34: 1345-54, 1955). The fraction containing HDL is then dialyzed against 10 mM Tris-HCl buffer, 0.01% sodium azide, lS at pH 7.4.
Highlighting the dimers of aooA-I Paris.
The dialyzed HDL fraction is defatted in a diethyl ether /
ethanol (3/1, v / v) and the protein concentration is estimated by the method de Lowry (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193: 265-75, 1951). Proteins 20 the HDL fration migrate on a polyacrylamide gel in presence of SDS in non-reducing condition. This migration allows highlight the size of the patient's different HDL proteins.
In addition to the presence of proteins corresponding to apoA-I and apoA-II of normal sizes, this analysis reveals the presence of higher proteins 25 molecular weights corresponding to apoA-I dimers and complexes apoA-I and apoA-II. The presence of apoA-I and apoA-II in these complexes has has been verified by a specific immunological revelation.

CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCT / ~ h ~ G ~ oo747 Demonstration of the difference in charge of the mutated apoA-I
Detection of mutated apoA-I directly from plasma has been performed according to the following protocol (Menzel, HJ, and Utermann, G., Electroforesis, 7: 492-495, 1986): twenty microliters of plasma are defatted 5 overnight with ethanol / ether mixture and resuspended in buffer deposit. An aliquot of 5, ul is electrophoresed on a focusing gel isoelectric (pH 4-6.5, Pharmolyte), and the proteins are then transferred to a nylon membrane. The bands corresponding to apoA-I are detected by an immunological reaction using antibodies 10 human anti-apoA-I.
Detection of mutated apoA-I can also be done from HDL proteins. The dialyzed HDL fraction is defatted in a mixture diethylether / ethanol (3/1, v / v) and the protein concentration is estimated by the Lowry method (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193: 265-75, 1951).
15 About 100 µg of protein is electrophoresed on a gel.
isoelectric focusing (pH 4-6.5, Pharmolyte), and the proteins are then revealed by coloring with Coomassie blue. This technique allows highlight that the most important isoforms of apoA-I of patient with the mutation are moved to the anode, which corresponds to 20 a charge difference of -1 compared to the normal apoA-I charge.
Example 2 Identification of the gene and the mutation The patient's genomic DNA was isolated from whole blood according to the technique of Madisen et al. (Amer. J. Med. Genet, 27: 379-390, 1987). The the apoA-I gene was then amplified by the PCR technique. To this end, 25 the amplification reactions were carried out on 1 1 ~ 9 of genomic DNA
purified introduced into the following mixture:
- 10 µl of 10X buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3; 500 mM KCI; 15 mM MgC12; 0.1% (w / v) gelatin) W 096/37608 PCT ~ R96 / 00747 - 10 ~ I of dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 2mM
- 20 pmol of each primer

- 2,5 U de Taq polymérase (Perkin-Elmer) - qsp 100 ,ul H20.
Les amorces utilisées pour l'amplification sont les suivantes:
Sq5490: 5'-AAGGCACCCCACTCAGCCAGG-3' (SEQ ID n~ 3) Sq5491: 5'-TTCAACATCATCCCACAGGCCTCT-3' (SEQ ID n~ 4) Sq5492: 5'-CTGATAGGCTGGGGCGCTGG-3' (SEQ ID n~ 5) Sq5493: 5'-CGCCTCACTGGGTGTTGAGC-3' (SEQ ID n~ 6) Les amorces Sq5490 et Sq5491 amplifient un fragment de 508 pb correspondant aux exons 2 et 3 du gène de l'apoA-I et les amorces Sq5492 et Sq5493 amplifient un fragment de 664 pb correspondant à l'exon 4 de ce gène.
Les produits d'amplification (deux fragments PCR de 508 et 664 pb) 15 ont ensuite été séquencés. Pour cela, une première méthode à été utilisée, consistant à séquencer directement en utilisant le kit de séquençage de fragments PCR (Amersham). Les amorces utilisées pour le séquençage sont les amorces PCR, mais il peut également s'agir d'amorces internes aux fragments (Cf amorces S4, S6 et S8 ci-dessous).
Une deuxième technique de séquençage a également été mise en oeuvre qui a consisté à cloner les fragments PCR dans un vecteur M13 mp28. L'ADN double brin du M13 a été clivé par EcoRV puis déphosphorylé.
Ies fragment PCR ont été traités à la Klenow, phosphorylés et ligués au vecteur M13. Les plages blanches ont ensuite été prélevées et l'ADN simple CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA~R96/00747 brin amplifié puis purifié sur le Catalyst (Applied Biosystem) a été séquencé
par une amorce -20 fluorescente (Kit PRISM dye primer et protocole n~
401386, Applied Biosystem) ou par des amorces internes aux fragments après orientations de ceux-ci. La technique des didéoxynucléotides 5 fluorescent est alors utilisée (Kit DyeDeoxyTerminator et protocole n~
401388, Applied Biosystem) S8 5' -TGG GAT CGA GTG AAG GAC CTG- 3' (SEQ ID n~ 7) S4 5' -CGC CAG AAG CTG CAC CAG CTG- 3' (SEQ iD n~ 8) S6 5' -GCG CTG GCG CAG CTC GTC GCT- 3' (SEQ ID n~ 9) Les séquences issues de plusieurs clones ont ensuite été compilées et comparées à la séquence de l'ApoAI. La séquence des acides aminé 148 à 154 de l'ApoAI mature est donnée ci dessous (correspondant aux résidus 172~178 sur la séquence SEQ ID n~ 1).

ATG CGC GAC CGC GCG CGC GCC
Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala Une mutation C->T en premiere base du codon codant pour l'aa 151 qui code alors pour une cystéine (cf séquence SEQ ID n~ 2 ci-dessous) a été
retrouvée dans une partie des clones séquencés. Cette mutation est donc présente à l'état hétérozygote chez le patient sélectionné.
ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC
Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala L'ensemble du cDNA codant pour le variant apoA-I Paris selon l'invention a été séquencé. Une partie de cette séquence est présentée sur la SEQ ID n~ 10.

CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 pCT/~h~l~/00747 Exemple 3: Construction d'un vecteur d'expression plasmidique (pXL21 1 6mute) L'apoAI Paris presente une mutation ponctuelie situee sur la sequence de l'exon 4 du gene de l'apoAI du patient. La strategie de construction du 5 vecteur d'expression consiste a substituer, dans un vecteur d'expression de l'apoAI (le vecteur pXL2116, figure 1) la region correspondant a l'exon 4 provenant du gene du patient. - 2.5 U of Taq polymerase (Perkin-Elmer) - qs 100, ul H20.
The primers used for the amplification are the following:
Sq5490: 5'-AAGGCACCCCACTCAGCCAGG-3 '(SEQ ID n ~ 3) Sq5491: 5'-TTCAACATCATCCCACAGGCCTCT-3 '(SEQ ID n ~ 4) Sq5492: 5'-CTGATAGGCTGGGGCGCTGG-3 '(SEQ ID n ~ 5) Sq5493: 5'-CGCCTCACTGGGTGTTGAGC-3 '(SEQ ID n ~ 6) Primers Sq5490 and Sq5491 amplify a 508 bp fragment corresponding to exons 2 and 3 of the apoA-I gene and the primers Sq5492 and Sq5493 amplify a fragment of 664 bp corresponding to exon 4 of this uncomfortable.
Amplification products (two PCR fragments of 508 and 664 bp) 15 were then sequenced. For this, a first method was used, consisting in direct sequencing using the sequencing kit PCR fragments (Amersham). The primers used for sequencing are PCR primers, but they can also be primers internal to fragments (see primers S4, S6 and S8 below).
A second sequencing technique has also been implemented work which consisted in cloning the PCR fragments into an M13 vector mp28. The double-stranded DNA of M13 was cleaved by EcoRV and then dephosphorylated.
The PCR fragments were treated with Klenow, phosphorylated and ligated to vector M13. The white areas were then removed and the simple DNA

CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA ~ R96 / 00747 strand amplified then purified on the Catalyst (Applied Biosystem) was sequenced by a fluorescent primer -20 (PRISM dye primer kit and protocol n ~
401386, Applied Biosystem) or by primers internal to the fragments after orientation of these. The dideoxynucleotide technique 5 fluorescent is then used (DyeDeoxyTerminator kit and protocol n ~
401388, Applied Biosystem) S8 5 '-TGG GAT CGA GTG AAG GAC CTG- 3' (SEQ ID n ~ 7) S4 5 '-CGC CAG AAG CTG CAC CAG CTG- 3' (SEQ iD n ~ 8) S6 5 '-GCG CTG GCG CAG CTC GTC GCT- 3' (SEQ ID n ~ 9) The sequences from several clones were then compiled and compared to the ApoAI sequence. The amino acid sequence 148 to 154 of the mature ApoAI is given below (corresponding to the residues 172 ~ 178 on the sequence SEQ ID n ~ 1).

ATG CGC GAC CGC GCG CGC GCC
Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala A C-> T mutation at the first base of the codon coding for aa 151 which then codes for a cysteine (see sequence SEQ ID n ~ 2 below) has been found in part of the sequenced clones. This mutation is therefore present in the heterozygous state in the selected patient.
ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC
Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala The entire cDNA coding for the apoA-I Paris variant according to the invention has been sequenced. Part of this sequence is presented on SEQ ID n ~ 10.

CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 pCT / ~ h ~ l ~ / 00747 Example 3 Construction of a Plasmid Expression Vector (pXL21 1 6mute) ApoAI Paris presents a punctual mutation located on the sequence of exo 4 of the patient's apoAI gene. The construction strategy of the Expression vector consists in substituting, in an expression vector for apoAI (vector pXL2116, Figure 1) the region corresponding to exon 4 from the patient's gene.

3.1. Utilisation de l'exon 4 du patient cloné dans M13 L'exon 4 a été produit par PCR à partir de l'ADN purifié des cellules du 10 patient et inséré au niveau du site EcoRV du polylinker du phage M13mp28 (figure 2).
Une mutagénèse par remplacement d'un fragment de l'apo Al par un fragment issu de M13 portant la mutation est envisagée. Il nous reste donc à
choisir les enzymes appropriées aux deux vecteurs de manière à ce qu'elles 15 génèrent des extrémités cohésives pour le vecteur issu de pXL2116 digéré et pour l'insert issu de M13 double brin digéré.
3.2. Choix des enzymes de restriction - Bsu361 possède dans M13 et dans pXL2116 un site unique de restriction en amont de la mutation.
- La digéstion par BamHI, possédant un site de restriction unique à
l'extrémité 3' de l'apo Al du fait de la technique de clonage, et possédant un site de restriction dans le polylinker de M13, nous permet:
1 ) une ligation du vecteur provenant de pXL2116 et de l'insert provenant de M13 CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA~R96/00747 2) et ce en incorporant un fragment de polylinker qui nous sera utile pour vérifier par digestion enzymatique l'insertion du fragment muté
provenant de M13.
Il est à noter que la présence de ce fragment de polylinker n'altère en 5 rien la séquence codante de l'apo Al puisque celui-ci est situé après le codon stop.
Le polypeptide riche en histidine dont la séquence nucléotidique a été
clonée en 5' de l'apo Al sera donc aussi synthétisé.
3.3. Construction du vecteur (figure 3).
- Le M13 rendu double brin est digéré par Bsu361/BamHI et ie produit de la digestion est déposé sur gel. L'insert ainsi généré est récupéré en quantité suffisante et présente bien une taille de 1 Db.
- Le pXL2116 est digéré par les mêmes enzymes mais non purifié.
De façon à éviter la religation des produits de la digestion, une 15 digestion est effectuée par Xhol qui reconnait deux sites de restriction à
l'intérieur du fragment Bsu361/BamHI.
En effet, une déphosphosylation a été d'abord tentée mais a donné de très mauvais résultats sur boîte et aucun clone positif sur 24 testés.
Les quantités de vecteur et d'insert optimales pour la ligation ont été
20 évaluées à 50ng de vecteur pour 1 5ng d'insert.
Les souches DH5a sont transformées avec les produits des trois ligations suivantes:
- vecteur digéré par Bsu361 et BamHI sans ligase (témoin négatif de ligation) CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCT~R96/00747 .

- produit de la digestion + ligase - produit de la digestion + insert + ligase Les cellules compétentes sont aussi transformées avec le pUC19 afin de tester l'efficacité de la transformation.
Les résultats des cellules transformées sur boîte de milieu LB
Chloramphénicol (sélection des souches BL21 ) Ampicilline (sélection des souches ayant intégré le plasmide) sont reproduits ci-dessous.
RESULTATS OBTENUS SUR BOITE DE PETRI
TRANSFORMATION DH5al RESULTATS INTERPRETATION
pUC19 200 clones Témoin detransformation vecteur (+fragment) 0 clone Digestion parfaite, pas de plasmide recircularisé
vecteur (+fragment) + ligase 160 clones Bruit de fond très important: stratégie de digestion supplémentaire peu efficace vecteur (+fragment) + ligase 120 clones ~ Effet de diminution ~ de + insert la ligase souvent constaté.
Les bactéries ne sont pas obligatoirement transformés avec une séquence mutée correcte 48 clones sont réisolés à partir de la boîte 4.
De manière à repérer les clones positifs (c'est-à-dire ayant inséré le fragment mute de M13), I'ADN plasmidique obtenu par purification sur chacun des 48 clones est digéré par l'enzyme Ndel.
Si l'insert provenant de M13 a bien été inséré, on verra sur gel deux fragments: une de 4,5kb et un de 1kb.
Si un autre évènement de ligation s'est produit, on obtiendra soit plusieurs bandes, soit simplement un plasmide linéarisé (cas général).

CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCT~R96/00747 D'après le résultat du gel, les clones 7,8,13,16,26 semblent être corrects. On sélectionne le clone qui donne un résultat net.
De manière à vérifier totalement la séquence du clone sélectionné, on procède à six digestions enzymatiques.
La présence du polylinker donc de l'insert est ainsi vérifiée mais l'évènement de ligation doit être aussi vérifié.
De toute évidence, la ligation est celle attendue puisque la taille du plasmide est correcte, c'est-à-dire égale à celle du pXL2116.
Sauf évènement de mutation très rare, la séquence de l'apoAI
nouvellement clonée devrait être exacte.
Le clone 8 porte donc le plasmide px12116 muté correctement.
Exemple 4: Expression de variants apoAI recombinants Cet exemple decrit un procede de production de variants apoAI
recombinants. Ce procede a ete realise dans une bacterie. D'autres systemes d'expression sont utilisables a cet effet (levures, cellules animales, etc). 3.1. Use of exon 4 of the patient cloned in M13 Exon 4 was produced by PCR from the purified DNA of cells from 10 patient and inserted at the EcoRV site of the phage polylinker M13mp28 (figure 2).
Mutagenesis by replacing a fragment of apo Al with a fragment from M13 carrying the mutation is envisaged. So we have choose the appropriate enzymes for both vectors so that they 15 generate cohesive ends for the vector derived from digested pXL2116 and for the insert from digested double-stranded M13.
3.2. Choice of restriction enzymes - Bsu361 has a unique site in M13 and in pXL2116 restriction before the mutation.
- Digestion with BamHI, having a unique restriction site at the 3 ′ end of apo A1 due to the cloning technique, and having a restriction site in the M13 polylinker, allows us to:
1) a ligation of the vector originating from pXL2116 and the insert from M13 CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA ~ R96 / 00747 2) and this by incorporating a fragment of polylinker which will be useful to us to verify by enzymatic digestion the insertion of the mutated fragment from M13.
It should be noted that the presence of this fragment of polylinker does not alter in 5 nothing the coding sequence of apo Al since it is located after the stop codon.
The histidine-rich polypeptide whose nucleotide sequence has been cloned in 5 'from apo Al will therefore also be synthesized.
3.3. Construction of the vector (Figure 3).
- The M13 rendered double strand is digested with Bsu361 / BamHI and the product digestion is deposited on gel. The insert thus generated is recovered in sufficient quantity and indeed has a size of 1 Db.
- pXL2116 is digested by the same enzymes but not purified.
In order to avoid the religation of the products of digestion, a 15 digestion is carried out by Xhol which recognizes two restriction sites inside the Bsu361 / BamHI fragment.
Indeed, a dephosphosylation was first attempted but gave results very bad results on box and no positive clone on 24 tested.
Optimal vector and insert quantities for ligation have been 20 evaluated at 50ng of vector for 1 5ng of insert.
DH5a strains are transformed with the products of the three following ligations:
- vector digested with Bsu361 and BamHI without ligase (control ligation negative) CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCT ~ R96 / 00747 .

- product of digestion + ligase - digestion product + insert + ligase Competent cells are also transformed with pUC19 to to test the efficiency of the transformation.
Results of cells transformed on LB medium dish Chloramphenicol (selection of BL21 strains) Ampicillin (selection of strains that have integrated the plasmid) are reproduced below.
RESULTS OBTAINED ON PETRI BOX
TRANSFORMATION DH5al INTERPRETATION RESULTS
pUC19 200 clones Transformation indicator vector (+ fragment) 0 clone Perfect digestion, no recircularized plasmid vector (+ fragment) + ligase 160 clones Very background noise important: strategy additional digestion not very effective vector (+ fragment) + ligase 120 clones ~ Decrease effect ~ of + insert the ligase often found.
Bacteria are not necessarily transformed with a correct mutated sequence 48 clones are re-isolated from box 4.
In order to identify the positive clones (i.e. having inserted the mutated fragment of M13), the plasmid DNA obtained by purification on each of the 48 clones is digested with the enzyme NdeI.
If the insert from M13 has been inserted correctly, we will see on gel two fragments: one of 4.5kb and one of 1kb.
If another ligation event has occurred, either several bands, or simply a linearized plasmid (general case).

CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCT ~ R96 / 00747 From the gel result, clones 7,8,13,16,26 appear to be correct. We select the clone which gives a net result.
In order to fully verify the sequence of the selected clone, we performs six enzymatic digestions.
The presence of the polylinker therefore of the insert is thus verified but the ligation event should also be checked.
Obviously, the ligation is that expected since the size of the plasmid is correct, ie equal to that of pXL2116.
Except for very rare mutation events, the apoAI sequence newly cloned should be exact.
Clone 8 therefore carries the correctly mutated px12116 plasmid.
Example 4 Expression of Recombinant ApoAI Variants This example describes a process for producing apoAI variants recombinants. This process was carried out in a bacteria. Others expression systems can be used for this purpose (yeasts, animal cells, etc).

4.1. Principe L'expression du plasmide au sein de la bactérie a été placée sous le contrôle des promoteur et terminateur T7. L'isopropyl-b-thiogalactopyranoside (IPTG), inducteur de l'opéron lactose, induit dans ce système la synthèse de l'ARN polym~rase T7 qui se fixe ensuite spécifiquement sur le promoteur T7 et démarre la transcription du gène de la protéine recombinante. L'ARN polymérase est stoppée par le terminateur T7, ce qui évite que le flux transcriptionnel ne déborde en aval de la séquence d'intérêt.

CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCT~R96100747 La rifampicine est un antibiotique inhibant l'activité ARN polymérase endogène d'E.coli . Elle inhibe donc la synthèse des protéines bactériennes, c'est-à-dire à la fois des protéases, ce qui limite les dégradations de la - protéine d'intérêt; et des protéines bactériennes contaminantes, ce qui amplifie l'expression de la protéine d'intérêt.
4.2. Protocole La souche utilisée pour l'expression est Escherichia coli BL21 DE3 pLys S. L'ADN plasmidique est introduit dans E. coli par transformation selon les techniques classiques. La culture est conservée sous forme de suspension congelée à - 20~C, en présence de 25% de glycérol, et aliquotée par fractions de 500 ,ul.
Une préculture est initiée par l'addition de quelques gouttes de suspension congelée dans 10 ml de milieu M9 ampicilline, puis incubée sur la nuit à 37~C. Les erlens de 1 litre sont ensemencés à partir de la préculture et placés dans un shaker à 37~C jusqu'à obtenir une DO comprise entre 0,5 et 1 à 610 nm. L'IPTG (Bachem ref Q-1280) est alors ajouté à une concentration finale de 1 mM. Après 15 minutes d'incubation à 37~C, la rifampicine (Sigma) est ajoutée à une concentration finale de 100 ,ug/ml.
Puis, après 1 heure de culture, les cellules sont récupérées par centrifugation (15 minutes, 8000 rpm) et l'expression est vérifiée par électrophorèse en conditions dénaturantes sur un gel d'acrylamide à 15% et par immunoblot.
Les resultats obtenus montrent que la proteine mutee s'exprime selon un bon taux d'expression et que celle-ci est effectivement revelee par les - 25 anticorps polyclonaux anti-apoAI.
- Exemple 5: Purification des variants apoAI recombinants CA 022187~9 1997-11-06 WO 96/37608 PCT~R96/00747 Cet exemple decrit une methode efficace permettant de purifier les variants apoAI recombinants selon l'invention. Il est entendu que d'autres procedes peuvent etre utilises.
Les protéines étant exprimées dans le cytoplasme d'E. coli, leur extraction nécessite, dans un premier temps, d'effectuer une Iyse cellulaire suivie d'une élimination des acides nucléiques. 4.1. Principle The expression of the plasmid within the bacterium was placed under the T7 promoter and terminator control. Isopropyl-b-thiogalactopyranoside (IPTG), inducer of the lactose operon, induced in this system synthesis of RNA polym ~ rase T7 which then fixes specifically on the T7 promoter and starts transcription of the gene for recombinant protein. RNA polymerase is stopped by the T7 terminator, which prevents the transcriptional flow from overflowing downstream of the sequence of interest.

CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCT ~ R96100747 Rifampicin is an antibiotic that inhibits RNA polymerase activity endogenous of E. coli. It therefore inhibits the synthesis of bacterial proteins, that is to say both proteases, which limits the degradations of the - protein of interest; and contaminating bacterial proteins, which enhances the expression of the protein of interest.
4.2. Protocol The strain used for the expression is Escherichia coli BL21 DE3 pLys S. Plasmid DNA is introduced into E. coli by transformation according to classical techniques. The culture is preserved in the form of suspension frozen at -20 ~ C, in the presence of 25% glycerol, and aliquoted in fractions of 500, ul.
A preculture is initiated by the addition of a few drops of suspension frozen in 10 ml of M9 ampicillin medium, then incubated on overnight at 37 ~ C. The 1 liter erlens are sown from the preculture and placed in a shaker at 37 ~ C until an OD included between 0.5 and 1 at 610 nm. The IPTG (Bachem ref Q-1280) is then added to a final concentration of 1 mM. After 15 minutes of incubation at 37 ~ C, the rifampicin (Sigma) is added to a final concentration of 100 µg / ml.
Then, after 1 hour of culture, the cells are recovered by centrifugation (15 minutes, 8000 rpm) and the expression is checked by electrophoresis under denaturing conditions on a 15% acrylamide gel and by immunoblot.
The results obtained show that the mutated protein is expressed according to a good rate of expression and that it is effectively revealed by - 25 anti-apoAI polyclonal antibodies.
- Example 5: Purification of the recombinant apoAI variants CA 022187 ~ 9 1997-11-06 WO 96/37608 PCT ~ R96 / 00747 This example describes an effective method for purifying recombinant apoAI variants according to the invention. It is understood that others procedures can be used.
The proteins being expressed in the cytoplasm of E. coli their extraction requires, firstly, to perform a cell Iyse followed by elimination of nucleic acids.

5.1. Lyse bactérienne Après centrifugation de la culture, le culot bactérien est resuspendu sous agitation douce dans du tampon de Iyse en présence d'inhibiteurs de protéases et de ~-mercaptoéthanol.

Le ~mercaptoéthanol est un réducteur clivant les ponts disulfure formés entre deux résidus cystéine. Il ne se forme aucun pont disulfure dans le cytoplasme de E.coli, la présence d'un agent réducteur s'avère toutefois nécessaire une fois les protéines extraites. En effet l'addition de 13 mercaptoéthanol dans le tampon de Iyse permet d'éviter la formation de ponts entre les résidus cystéine des protéines bactériennes et ceux des protéines recombinantes.
La Iyse cellulaire est obtenue par 3 fois 5 minutes de sonication dans la glace (Vibracells sonics material, mode pulsed, output control 5), elle est suivie par une centrifugation à 10000 rpm (1 heure, 4~C sur Beckman J2-21 M/E, rotor JA10) permettant d'éliminer les débris cellulaires. Un dosage protéique est réalisé sur le surnageant par la méthode colorimétrique de Bradford.
5.2. Précipitation des acides nucléiques Elle est réalisée sur le surnageant de Iyse par une solution de sulfate de streptomycine à 10%, à raison de 10 ml pour 10 9 de protéines, sous CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCT~R96/00747 agitation magnétique douce 1 heure à 4~C. Les acides nucléiques sont éliminés par centrifugation à 10000 rpm (1 heure, 4~C sur Beckman J2-21 M/E, rotor JA10), et la concentration en protéines du surnageant est évaluée - par dosage colorimétrique.
A l'issu de ces deux étapes on obtient une solution protéique de concentration connue regroupant l'ensemble des protéines intracellulaires dont la protéine d'intérêt. Celle-ci est purifiée par des techniques chromatographiques.
--> Chromatographie par filtration sur gel --> Chromatographie d'affinité
5.3. Chromatographie par filtration sur gel Le but de cette étape est l'élimination de l'EDTA, molécule interférant avec les conditions requises pour la chromatographie d'affinité. Pour cela le support Tris-acryl GF 05 (Sepracor) a été retenu. Ce gel permet la 15 séparation des molécules dont la Masse Moléculaire (MM) est comprise entre 300 et 2500 daltons, et l'exclusion des molécules de MM supérieure à
2500 daltons, dont les protéines. Ce gel présente d'autre part l'intérêt de posséder une bonne résistance à la pression, ce qui permet de travailler à
débit élevé sans modifier la résolution. La chromatographie du Iysat bactérien est réalisée en tampon phosphate pH8. La concentration protéique dans le volume d'exclusion est déterminée, et éventuellement ajustée à 4 mg/ml par dilution dans le tampon phosphate pH8.
Cette étape peut être remplacée par une dialyse contre 2 X 10 litres de PBS. La solution protéique est ensuite mise en présence d'Hecameg 25 mM, ce détergent favorisant l'étape suivante de purification par diminution des interactions protéine-protéine.
5.4. Chromatographie d'affinité

CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA~R96/00747 Principe La présence de 6 résidus histidine consécutifs associés à la protéine recombinante lui confère une affinité particulièrement élevée pour les ions nickel (Ni2+) (15). Ces ions Ni2+ sont fixés à une matrice d'agarose par 5 I'intermédiaire de l'Acide Nitrilo Acétique (NTA). Entre l'imidazole des histidine et les ions nickel se produit une liaison de chélation métallique;
cette liaison est plus forte qu'une liaison ionique et moins forte qu'une liaison covalente.
Protocole La capacité de fixation du gel NiNTA agarose (Qiagen) est de 2 mg de protéine pour 1 ml de gel. Ce gel est équilibré dans du tampon pH8 additionné d'Hecameg 25 mM. Les protéines bactériennes contaminantes sont non retenues à pH8, ou éliminées à pH6, et la protéine d'intérêt est récupérée à pH5. Ces étapes sont réalisées en présence d'hecameg 25 mM.
Les fractions (2 ml) éluées à pH5 sont additionnées de:
60 1ll de NaOH 1 M (neutralisation) 10 ,ul de PMSF 0,2M
40 ~I d'EDTA 0,1 M
Les fractions sont réunies en fonction de la concentration et de la 20 pureté de la protéine éluée. Ces caractéristiques sont analysées par électrophorèse (PAGE-SDS 15%).
L'élution à pH5 décroche la protéine associée au nickel en agissant sur la liaison Ni2+ - NTA. Il est donc nécessaire de dissocier ce cation de la protéine recombinante. Cette étape est effectuée par compétition grâce à

CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCT~R96/00747 une incubation sous agitation magnétique douce à 4~C pendant 1 heure en présence d'histidine 50 mM.
5.5. Dialyses Elles permettent d'éliminer l'histidine et le nickel. L'échantillon est dialysé (membrane Spectra/Por MWCO 12-14000 daltons) à 4~C pendant 5 heures puis sur la nuit, contre 2 fois 10 litres de tampon PBS EDTA 2 mM.
Un dosage de protéine est finalement effectué.
Ce procede permet d'obtenir la proteine apoAI Paris sous forme purifiee, essentiellement depourvue de proteines contaminantes.
Exemple 6: Propriétés physico-chimiques des apoA-I Paris et apoA-I normale recombinantes. 5.1. Bacterial lysis After centrifugation of the culture, the bacterial pellet is resuspended with gentle agitation in Iyse buffer in the presence of inhibitors proteases and ~ -mercaptoethanol.

~ Mercaptoethanol is a reducing agent cleaving the disulfide bridges formed between two cysteine residues. No disulfide bridge is formed in the cytoplasm of E. coli, the presence of a reducing agent turns out however necessary once the proteins have been extracted. Indeed the addition of 13 mercaptoethanol in Iyse buffer prevents the formation of bridges between the cysteine residues of bacterial proteins and those of recombinant proteins.
The cell lysis is obtained by 3 times 5 minutes of sonication in ice (Vibracells sonics material, pulsed mode, output control 5), it is followed by centrifugation at 10,000 rpm (1 hour, 4 ~ C on Beckman J2-21 M / E, JA10 rotor) to remove cellular debris. A dosage protein is produced on the supernatant by the colorimetric method of Bradford.
5.2. Nucleic acid precipitation It is carried out on the Iyse supernatant with a sulfate solution 10% streptomycin, 10 ml per 10 9 protein, under CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCT ~ R96 / 00747 gentle magnetic stirring for 1 hour at 4 ~ C. Nucleic acids are removed by centrifugation at 10,000 rpm (1 hour, 4 ~ C on Beckman J2-21 M / E, rotor JA10), and the protein concentration of the supernatant is evaluated - by colorimetric dosing.
At the end of these two stages, a protein solution of known concentration of all intracellular proteins including the protein of interest. This is purified by techniques chromatographic.
-> Chromatography by gel filtration -> Affinity chromatography 5.3. Gel filtration chromatography The goal of this step is the elimination of EDTA, an interfering molecule with the conditions required for affinity chromatography. For this the Tris-acryl GF 05 support (Sepracor) was selected. This gel allows the 15 separation of molecules of which the Molecular Mass (MM) is included between 300 and 2500 daltons, and the exclusion of molecules of MM greater than 2500 daltons, including proteins. This gel also has the advantage of have good resistance to pressure, which makes it possible to work on high throughput without changing the resolution. Iysat chromatography bacterial is carried out in pH8 phosphate buffer. Protein concentration in the exclusion volume is determined, and possibly adjusted to 4 mg / ml by dilution in pH8 phosphate buffer.
This stage can be replaced by a dialysis against 2 X 10 liters of PBS. The protein solution is then placed in the presence of Hecameg 25 mM, this detergent promoting the next step of purification by reduction protein-protein interactions.
5.4. Affinity Chromatography CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA ~ R96 / 00747 Principle The presence of 6 consecutive histidine residues associated with the protein recombinant gives it a particularly high affinity for ions nickel (Ni2 +) (15). These Ni2 + ions are attached to an agarose matrix by 5 through Nitrilo Acetic Acid (NTA). Between the imidazole of histidine and nickel ions a metal chelation bond occurs;
this bond is stronger than an ionic bond and weaker than a bond covalent.
Protocol The binding capacity of the agarose NiNTA gel (Qiagen) is 2 mg of protein for 1 ml of gel. This gel is balanced in pH8 buffer added with 25 mM Hecameg. Contaminating bacterial proteins are not retained at pH8, or eliminated at pH6, and the protein of interest is recovered at pH5. These steps are carried out in the presence of 25 mM hecameg.
The fractions (2 ml) eluted at pH5 are added with:
60 μl of 1 M NaOH (neutralization) 10 µl 0.2M PMSF
40 ~ I EDTA 0.1 M
The fractions are combined according to the concentration and the 20 purity of the eluted protein. These characteristics are analyzed by electrophoresis (PAGE-SDS 15%).
Elution at pH5 detaches the protein associated with nickel by acting on the Ni2 + - NTA link. It is therefore necessary to dissociate this cation from the recombinant protein. This stage is carried out by competition thanks to CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCT ~ R96 / 00747 incubation with gentle magnetic shaking at 4 ~ C for 1 hour in presence of 50 mM histidine.
5.5. Dialysis They eliminate histidine and nickel. The sample is dialyzed (Spectra / Por MWCO 12-14000 daltons membrane) at 4 ~ C for 5 hours then overnight, against 2 times 10 liters of 2 mM PBS EDTA buffer.
A protein assay is finally performed.
This process makes it possible to obtain the apoAI Paris protein in the form purified, essentially free of contaminating proteins.
Example 6: Physico-chemical properties of apoA-I Paris and apoA-I normal recombinant.

6.1. Mesures de turbidimètrie 6.1.1. Turbidimétrie en fonction de la température La mesure de l'absorbance des vésicules DMPC à 325 nm en 15 présence d'apoA-I est une mesure de la formation de complexes protéoiipidiques discoïdal de petites tailles. L'analyse de variation de température entre 1 9-28~C nous montre une diminution de l'absorbance autour de la température de transition des phospholipides (23~C), témoin de la formation des complexes. La figure 4 (en présence ou non de GdnHDL
20 pour éviter la formation de dimères) montre la comparaison de la formation de ces complexes avec les apoA-lnormale et apoA-I Paris recombinantes, ainsi que de l'apoA-I native. Ces trois protéines ont des comportements ~ assez proches mais avec pour l'apoA-I Paris, on note une tendance à
s'associer avec elle-même pour former des dimères.
6.1.2. Turbidimétrie en fonction du temps CA 022187~9 1997-11-06 La baisse de turbidimétrie des vésicules de DMPC après incubation des apoA-I a été suivie à température donnée en fonction du temps en présence ou non de GdnHDL. La constante du temps (1/t1/2 qui correspond à 50% de baisse de la turbidimétrie initiaie) est évaluée en fonction de 1/T
5 (température en Kelvin). La vitesse d'association est rapide pour l'apoA-I
native, plus faible pour les apoA-I recombinantes, notamment l'apoA-I Paris.
Par ailleurs, I'addition de GdnHDL augmente l'association protéine -lipides.
Ceci de façon très importante pour les apoA-I recombinantes, notamment l'apoA-I Paris.
6.2. Spectre d'émission de fluorescence des tryptophanes Le spectre d'émission de fluorescence des tryptophanes dans les différentes apoA-I a été mesuré aux longueurs d'ondes entre 300 et 400 nm (excitation à 295 nm). Les maximums d'émission sont indiqués à la Table 1 ci-dessous pour les apoA-I et pour les complexes apoA-I/cholestérol/POPC.
15 Les maximums d'émission de fluorescence des tryptophanes dans les différentes apoA-I et complexes sont identiques indiquant que les tryptophanes sont dans le même environnement dans les trois protéines.
Table 1 ProduitMaximum d'emission Al Paris 335 POPC/C/AI Paris 332 Al recombinante 334 POPC/C/AI rec 332 Al plasma 336 POPC/C/AI plasma 333 CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA~R96/00747 6.3. Isolation et caractérisation des complexes apoA-I/lipides Des complexes avec l'apoA-I et du POPC ont été préparés par la technique au cholate. Les complexes ont été séparés des apoA-I libres par chromatographie de gel filtration sur une colonne Superose 6PG et leurs 5 compositions analysées. Les profils de gel filtrations sont indiqués sur la figure 5. Un seul pic homogène est obtenu pour les complexes faits avec l'apoA-I native tandis qu'avec les apoA-I recombinantes, des populations hétérogènes sont observées. Les apoA-I libres sont éluées dans les fractions 20 à 24. Les concentrations en phospholipides et la fluorescence des 10 tryptophanes par fractions pour les différents complexes sont indiqués sur la figure 6.
Exemple 7 - Construction d'un vecteur adénoviral pour l'expression de l'ApoAI mutée Un ADNc codant pour un variant selon l'invention contenant la 15 mutation Arg -~ Cys en position 151 de l'ApoAI mature est obtenu par PCR.
Les amorces Alm1: ATC GAT ACC GCC ATG AAA GCT GCG GTG CTG (SEQ ID
n~ 11), Alm2: ATG GGC GCG CGC GCA GTC GCG CAT CTC CTC (SEQ ID
20 n~ 12), Alm3: GAG GAG ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC CAT (SEQ
ID n~ 13) ~ et Alm4: GTC GAC GGC GCC TCA CTG GGT GTT GAG CTT (SEQ
IDn~ 14) sont utilisées. Ies amorces Alm1 et Alm4 introduisent respectivement des sites Clal en 5' et Sall en 3' de l'ADNc tandis que les amorces Alm2 et CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCT~R96/00747 Alm3 qui sont complémentaires introduisent ia mutation. Des reactions PCR
avec les couples d'amorces AlM1-Alm2 et Alm3-Alm4 sont d'abord pratiqués sur un ADNc de l'ApoAI non muté. Les fragments issus de ces PCR sont ensuite réintroduits dans une troisième PCR en présence des amorces Alm1 et Alm4, ce qui génére un fragment de 822pb qui est ensuite cloné dans pCRII (Invitrogen) pour vérification de sa séquence. Le fragment Clal /Sall qui contient l'ADNc muté est ensuite introduit par les même sites de restriction dans le vecteur navette pXL-RSV-LPL qui contient l'ADNc de la LPL sous contrôle d'un promoteur LTR-RSV et avec un site de 10 polyadénylation de l'hormone de croissance bovine, ensubstitution de l'ADNc de la LPL (FR9406759). Tout autre vecteur navette peut bien évidemment être utilisé. Le vecteur résultant est ensuite linéarisé et cotransfecté dans 293 pour l'obtention d'adénovirus recombinants. Les adénovirus ainsi obtenus peuvent être amplifiés sur plages, purifiés (notamment par chlorure 15 de césium) puis conservés congelés, par exemple dans du glycérol. Pour leur utilisation thérapeutique, ils peuvent être associés à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment Iyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Dans leur utilisation pour le traitementdes pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être administrés selon différents modes, et notamment par injection intraveineuse. Préférentiellement, ils sont injectés au niveau de la veine porte. Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les 30 virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1 o14 pfu/ml. Pour les AAV et les CA 022187~9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA~R96/00747 adénovirus, des doses de 1 o6 à 1 o10 pfu/ml peuvent également être ~ utilisées. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du 5 nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.

CA 022l87~9 l997-ll-06 W O 96/37608 PcTl~K~lvo747 LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S A
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (i) DEPOSANT:
(A) NOM: UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
(B) RUE:
(C) VILLE:
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSTITUT PASTEUR DE LILLE
(B) RUE:
(C) VILLE:
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL:
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Nouveaux variants de l'apolipoprotéine A-I
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 14 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 842 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens (ix) CARACTERISTIQUE:
~A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..842 (D) AUTRES INFORMATIONS:/product= "human apo AI cDNA"

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser CA 022l87~9 l997-ll-06 W 096137608 PCT/~h~ c747 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp val Leu Lys Asp 0 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala-Arg Ala Hls Val Asp Ala Leu Arg Thr Hls Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln *

CA 022l87~9 l997-ll-06 W 096/37608 PCTA~R96t00747 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire ~ ii ) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo saplens (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..21 (D) AUTRES INFORMATIONS:/product= "variant apo AI cDNA"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= Sq5490 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
AAGGCACCCC ACTCAGCCAG G . 21 50 ( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: nucléotide ( c ) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= S~5491 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

CA 022l87~9 l997-ll-06 W 096/37608 PCTA~R96/00747 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= Sq5492 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: 1i ne~ ire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= Sq5493 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (c) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= S8 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc ( ix ) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= S4 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:

CA 022l87~9 l997-ll-06 W 096/37608 PCT~R96/00747 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= S6 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUEN OE: SEQ ID NO: 9:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 603 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..603 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:

Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu ' 45 Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu Hls Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala His CA 022l87~9 l997-ll-06 W 096137608 PCTn~R96/00747 .

Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala AGA CTG GCC GAG TAC CAC GCC AAG GCC ACC GAG CAT CTG AGC ACG CTC 480Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu 15 Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln *

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire ( i i ) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= alml (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYP~: nucleotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= alm2 (xi) D~SCRIPTION DE LA SEQUEN OE: SEQ ID NO: 12:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

CA 022l87~9 l997-ll-06 W096/37608 PCTA~R96/00747 (A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= alm3 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:

15 ( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases ~B) TYPE: nucléotide (c) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= alm4 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: 6.1. Turbidity measurements 6.1.1. Turbidimetry as a function of temperature Measuring the absorbance of the DMPC vesicles at 325 nm in 15 presence of apoA-I is a measure of complex formation small discoid proteoiids. Variation analysis of temperature between 1 9-28 ~ C shows us a decrease in absorbance around the transition temperature of phospholipids (23 ~ C), witness to the formation of complexes. Figure 4 (whether or not GdnHDL is present 20 to avoid the formation of dimers) shows the comparison of the formation of these complexes with the recombinant apoA-lnormal and apoA-I Paris, as well as native apoA-I. These three proteins have behaviors ~ fairly close but with apoA-I Paris, there is a tendency to associate with itself to form dimers.
6.1.2. Turbidimetry as a function of time CA 022187 ~ 9 1997-11-06 The decrease in turbidimetry of DMPC vesicles after incubation apoA-I was followed at given temperature as a function of time in whether or not GdnHDL is present. The time constant (1 / t1 / 2 which corresponds at 50% decrease in initial turbidimetry) is evaluated as a function of 1 / T
5 (temperature in Kelvin). Association speed is fast for apoA-I
native, weaker for recombinant apoA-I, in particular apoA-I Paris.
Furthermore, the addition of GdnHDL increases the protein-lipid association.
This is very important for recombinant apoA-I, in particular apoA-I Paris.
6.2. Tryptophan fluorescence emission spectrum The fluorescence emission spectrum of tryptophans in different apoA-I was measured at wavelengths between 300 and 400 nm (excitation at 295 nm). The emission maximums are shown in Table 1 below for apoA-I and for apoA-I / cholesterol / POPC complexes.
15 The fluorescence emission maximums of tryptophans in different apoA-I and complexes are identical indicating that the tryptophans are in the same environment in all three proteins.
Table 1 ProductMaximum emission Al Paris 335 POPC / C / AI Paris 332 Recombinant Al 334 POPC / C / AI rec 332 Al plasma 336 POPC / C / AI plasma 333 CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA ~ R96 / 00747 6.3. Isolation and characterization of apoA-I / lipid complexes Complexes with apoA-I and POPC were prepared by the cholate technique. The complexes were separated from the free apoA-I by gel filtration chromatography on a Superose 6PG column and their 5 compositions analyzed. The gel filtration profiles are indicated on the figure 5. A single homogeneous peak is obtained for the complexes made with native apoA-I while with recombinant apoA-I, populations heterogeneous are observed. Free apoA-I are eluted in fractions 20 to 24. The phospholipid concentrations and the fluorescence of 10 tryptophans per fraction for the different complexes are shown in Figure 6.
Example 7 - Construction of an adenoviral vector for the expression of mutated ApoAI
A cDNA encoding a variant according to the invention containing the 15 Arg - ~ Cys mutation at position 151 of mature ApoAI is obtained by PCR.
The primers Alm1: ATC GAT ACC GCC ATG AAA GCT GCG GTG CTG (SEQ ID
n ~ 11), Alm2: ATG GGC GCG CGC GCA GTC GCG CAT CTC CTC (SEQ ID
20 n ~ 12), Alm3: GAG GAG ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC CAT (SEQ
ID # 13) ~ and Alm4: GTC GAC GGC GCC TCA CTG GGT GTT GAG CTT (SEQ
IDn ~ 14) are used. Primers Alm1 and Alm4 introduce respectively Clal sites in 5 ′ and Sall in 3 ′ of the cDNA while the primers Alm2 and CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCT ~ R96 / 00747 Alm3 which are complementary introduce the mutation. PCR reactions with the starting pairs AlM1-Alm2 and Alm3-Alm4 are first practiced on a non-mutated ApoAI cDNA. The fragments from these PCRs are then reintroduced into a third PCR in the presence of the primers Alm1 and Alm4, which generates a fragment of 822pb which is then cloned into pCRII (Invitrogen) for verification of its sequence. The Clal / Sall fragment which contains the mutated cDNA is then introduced by the same sites of restriction in the shuttle vector pXL-RSV-LPL which contains the cDNA of the LPL under the control of an LTR-RSV promoter and with a 10 bovine growth hormone polyadenylation, cDNA substitution of the LPL (FR9406759). Any other shuttle vector can obviously to be used. The resulting vector is then linearized and cotransfected in 293 for obtaining recombinant adenoviruses. Adenoviruses as well obtained can be amplified on ranges, purified (in particular by chloride 15 of cesium) and then stored frozen, for example in glycerol. For their therapeutic use, they can be associated with any vehicle pharmaceutically acceptable. These may in particular be solutions salines (monosodium phosphate, disodium, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition according to the case of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutions. In their use for the treatment of pathologies linked to dyslipoproteinemias, recombinant adenoviruses defective according to the invention can be administered in different modes, and especially by intravenous injection. Preferably, they are injected at the portal vein. The doses of virus used for injection can be adapted according to different parameters, and in particular depending on the mode of administration used, the pathology concerned or still the duration of the treatment sought. In general, 30 recombinant viruses according to the invention are formulated and administered in the form doses between 104 and 1 o14 pfu / ml. For AAVs and CA 022187 ~ 9 1997-11-06 W 096/37608 PCTA ~ R96 / 00747 adenovirus, doses of 1 6 to 1 10 pfu / ml may also be ~ used. The term pfu ("plaque forming unit") corresponds to the power infectious of a suspension of virions, and is determined by infection of a appropriate cell culture, and measurement, usually after 48 hours, of 5 number of ranges of infected cells. Techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.

CA 022l87 ~ 9 l997-ll-06 WO 96/37608 PcTl ~ K ~ lvo747 LIST OF SEQUENCES

(1) GENERAL INFORMATION:
(i) DEPOSITOR:
(A) NAME: RHONE-POULENC RORER SA
(B) STREET: 20, avenue Raymond ARON
(C) CITY: ANTONY
(E) COUNTRY: FRANCE
(F) POSTAL CODE: 92165 (i) DEPOSITOR:
(A) NAME: PIERRE ET MARIE CURIE UNIVERSITY
(B) STREET:
(C) CITY:
(E) COUNTRY: FRANCE
(F) POSTAL CODE:
(i) DEPOSITOR:
(A) NAME: INSTITUT PASTEUR DE LILLE
(B) STREET:
(C) CITY:
(E) COUNTRY: FRANCE
(F) POSTAL CODE:
(ii) TITLE OF THE INVENTION: New variants of apolipoprotein AI
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 14 (iv) COMPUTER-DETACHABLE FORM:
(A) TYPE OF SUPPORT: Tape (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.30 (EPO) (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 842 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: double (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(iii) HYPOTHETIC: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGIN:
(A) ORGANIZATION: Homo sapiens (ix) CHARACTERISTIC:
~ A) NAME / KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..842 (D) OTHER INFORMATION: / product = "human apo AI cDNA"

(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser CA 022l87 ~ 9 l997-ll-06 W 096137608 PCT / ~ h ~ c747 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp val Leu Lys Asp 0 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala-Arg Ala Hls Val Asp Ala Leu Arg Thr Hls Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln *
260,265 CA 022l87 ~ 9 l997-ll-06 W 096/37608 PCTA ~ R96t00747 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: double (D) CONFIGURATION: linear ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(iii) HYPOTHETIC: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGIN:
(A) ORGANIZATION: Homo saplens (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..21 (D) OTHER INFORMATION: / product = "variant apo AI cDNA"
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(D) OTHER INFORMATION: / product = Sq5490 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
AAGGCACCCC ACTCAGCCAG G. 21 50 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleotide (c) NUMBER OF STRANDS: simple (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(D) OTHER INFORMATION: / product = S ~ 5491 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

CA 022l87 ~ 9 l997-ll-06 W 096/37608 PCTA ~ R96 / 00747 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(D) OTHER INFORMATION: / product = Sq5492 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: 1i ne ~ ire (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(D) OTHER INFORMATION: / product = Sq5493 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleotide (c) NUMBER OF STRANDS: simple (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(D) OTHER INFORMATION: / product = S8 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(D) OTHER INFORMATION: / product = S4 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:

CA 022l87 ~ 9 l997-ll-06 W 096/37608 PCT ~ R96 / 00747 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(D) OTHER INFORMATION: / product = S6 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUEN OE: SEQ ID NO: 9:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 603 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: double (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(vi) ORIGIN:
(A) ORGANIZATION: Homo sapiens (ix) CHARACTERISTIC:
(A) NAME / KEY: CDS
(B) LOCATION: 1..603 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:

Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu '45 Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu Hls Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala His CA 022l87 ~ 9 l997-ll-06 W 096137608 PCTn ~ R96 / 00747 .

Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala AGA CTG GCC GAG TAC CAC GCC AAG GCC ACC GAG CAT CTG AGC ACG CTC 480Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu 15 Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln *
195,200 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(D) OTHER INFORMATION: / product = alml (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYP ~: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(D) OTHER INFORMATION: / product = alm2 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUEN OE: SEQ ID NO: 12:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

CA 022l87 ~ 9 l997-ll-06 W096 / 37608 PCTA ~ R96 / 00747 (A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleotide (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(D) OTHER INFORMATION: / product = alm3 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:

15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 30 base pairs ~ B) TYPE: nucleotide (c) NUMBER OF STRANDS: simple (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(ix) CHARACTERISTIC:
(D) OTHER INFORMATION: / product = alm4 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:

Claims (18)

REVENDICATIONS 1. Variant de l'apolipoprotéine A-I humaine comprenant une cystéine en position 151. 1. Variant of human apolipoprotein AI comprising a cysteine in position 151. 2. Variant selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend la séquence peptidique SEQ ID n° 2. 2. Variant according to claim 1 characterized in that it comprises the peptide sequence SEQ ID No. 2. 3. Variant selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il s'agit de l'apoA-I Paris. 3. Variant according to claim 1 or 2 characterized in that it is apoA-I Paris. 4. Variant selon les revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une protéine recombinante. 4. Variant according to claims 1 to 3 characterized in that it is of a recombinant protein. 5. Variant selon l'une des revendications 1 à 4 sous forme de dimère. 5. Variant according to one of claims 1 to 4 in dimer form. 6. Variant selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un homodimère. 6. Variant according to claim 5 characterized in that it is a homodimer. 7. Acide nucléique codant pour un variant d'apolipoprotéine A-I selon l'une des revendications précédentes. 7. Nucleic acid encoding an apolipoprotein AI variant according to one of the preceding claims. 8. Acide nucléique selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ADNc. 8. Nucleic acid according to claim 7 characterized in that it it is a cDNA. 9. Acide nucléique selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ADNg. 9. Nucleic acid according to claim 7 characterized in that it is a gDNA. 10. Acide nucléique selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un ARN. 10. Nucleic acid according to claim 7, characterized in that it it is an RNA. 11. Acide nucléique selon l'une des revendications 7 à 9 caractérisé
en ce qu'il comprend la séquence nucléique SEQ ID n° 2. 11. Nucleic acid according to one of claims 7 to 9 characterized in that it comprises the nucleic acid sequence SEQ ID No. 2. 12. Vecteur comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 7 à 11. 12. Vector comprising a nucleic acid according to one of claims 7 to 11. 13. Vecteur selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur viral. 13. Vector according to claim 11, characterized in that it is a viral vector. 14. Vecteur selon la revendication 11 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur chimique. 14. Vector according to claim 11, characterized in that it is a chemical vector. 15. Adénovirus recombinant défectif comprenant, inséré dans son génome, un ADN codant pour un variant de l'apolipoprotéine A-I selon la revendication 1. 15. Defective recombinant adenovirus comprising, inserted into its genome, a DNA encoding a variant of apolipoprotein AI according to the claim 1. 16. Cellule modifiée génétiquement par insertion d'un acide nucléique selon la revendication 7. 16. Cell genetically modified by insertion of a nucleic acid according to claim 7. 17. Implant comprenant des cellules de mammifères génétiquement modifiées par insertion d'un acide nucléique selon la revendication 7 et une matrice extracellulaire. 17. Implant comprising mammalian cells genetically modified by inserting a nucleic acid according to claim 7 and a extracellular matrix. 18. Composition pharmaceutique comprenant un variant de l'apolipoprotéine A-I selon l'une des revendications 1 à 6, et/ou un acide nucléique selon la revendication 7, et/ou un vecteur selon la revendication 12 et/ou une cellule génétiquement modifiée selon la revendication 16. 18. Pharmaceutical composition comprising a variant of apolipoprotein AI according to one of Claims 1 to 6, and/or an acid nucleic acid according to claim 7, and/or a vector according to claim 12 and/or a genetically modified cell according to claim 16.
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