j CA 02210953 1997-07-30 .,s NO~JVEAUX INHIBITEURS l:)E FARNESYL TRANSFERASE. LEUR
- PREPAR~TION ET LES COMPOSITIONS PHARMACEUTIOUES
QUI LES CONTIENNENT
La présente invention concerne de nouveaux inhibiteurs de farnésyl 5 transférase de formule générale:
'2 N~N~COOR (I) W
leur préparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
L'inhibition de la farnésyl transférase et, par conséquent, de la farnésylation de la protéine ras, bloque la c~p~cité de la protéine ras mutée à transformer les 10 cellules normales en cellules cancéreuses.
La séquence C-terminale du gène ras contient le motif "CAA~Y" ou "Cys-Aaa1-Aaa2-Xaa" dans lequel Aaa représente un aminoacide aliphatique et Xaa représente un aminoacide quelconque.
Il est connu que des tétrapeptides avec une séquence CAAX peuvent inhiber la farnésylation de la protéine ras. Par exemple, la ~m~n~e EP 0 618 221 présente des dérivés peptidiques de la tétrahydro 1,2,3,4-isoquinoléine mais dont la chaîne latérale est fixée sur la position 3 du squelette hétérocyclique. Dans la d~?m~n~le PCT
W O 91/16340 et dans la ~l~m~n~e EP 0 461 869 ont été décrits des peptides inhibiteurs de la farnésyl transférase Cys-Aaa1-Aaa2-Xaa qui sont plus 20 ~ particulièrement représentés par les peptides Cys-Val-Leu-Ser, Cys-Val-Ile-Met et Cys-Val-Val-Met qui manifestent leur activité inhibitrice à des concentrations voisines de 10-6M ou 10-7M.
Il a m~ A..I été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention, que les peptides de formule générale (I) manifestent leur activité inhibitrice (ICso) à
25 des con~n~rations de l'ordre de 10-8M.
Dans la formule générale (I), R1 représente un radical de formule générale Y-S-A1- dans lequel Y représente unatome d'hydrogène, ou un reste d'aminoacide ou un reste d'acide gras ou un radical alkyle ou alkoxycarbonyle, ou un radical R4-S- dans lequel R4 représent un radical CA 022109~3 1997-07-30 W O96/24612 PCT~R96100199 ~ 2 alkyle contenant 1 à 6 atomes de carbone éventuellement substitué par un radicalphényle ou un radical de formule générale:
~N COOR (Il) R~3 dans laquelle Al, Xl, Yl, R2, R'2, X2, Y2, ~, R3, R'3 et R sont définis comme 5 ci-après, et Al représente un radical alcoylène droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué en a du groupement >C(Xl)(Yl) par un radical amino, alkylamino c(mt~n~nt 1 à 4 atomes de carbone, alcanoylamino contenant 1 à 4 atomes de carbone ou alkoxycarbonylamino dont la partie alkyle contient 1 à 4 atomes de carbone, 10 Xl et Yl représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O, R2 représente un radical alkyle droit ou ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement substitué par un radical cyclohexyle, R'2 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle droit ou ramifié contenant 1 15 à 6 atomes de carbone, X2 et Y2 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O, R3 représente un radical alkyle cont~n~nt droit ou ramifié cnnt~n~nt 1 à 4 atomes de carbone éventuellement subs~itllé par un radical hydroxy, alkoxy contenant 1 à 4atomes de carbone, mercapto, alkylthio conten~nt 1 à 4 atomes de carbone, alkylsul-finyle contenant 1 à 4 atomes de carbone ou alkylsulfonyle contenant 1 à 4 atomes de carbone, étant entendu que, lorsque R3 représente un radical alkyle substitué par un radical hydroxy, R3 peut former avec le radical carboxy en cc une lactone, R'3 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle droit ou ramifié contenant 1 25 à 6 atomes de carbone, X représente un atome d'oxygène ou de soufre, et R représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle éventuellement substitué par un radical alkoxy contenant 1 à 4 atomes de carbone, alkylthio contenant 1 à 4 atomes de carbone, alkylsulfinyle contenant 1 à 4 atomes de carbone, alkylsulfonyle CA 022109~3 1997-07-30 Wo 96t24612 PCT/FR96/oO199 contenant 1 à 4 atomes de carbone, phényle, phénoxy, phénylthio, phénylsulfinyle, phénylsulfonyle, alkylamino contenant 1 à 4 atomes de carbone ou dialkylamino dont chaque partie alkyle contient 1 à ~ atomes de carbone, ou un radical phényle éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes ou radicaux, identiques ou différents choisis parmi les atomes d'halogène et les radicaux alkyles, alkoxy, alkylthio ou alcanoyle contenant 1 à 4 atomes de carbone.
Plus particulièrement, R1 représente un radical de formule Y-S-A1- dans lequel Y représente un atome d'hydrogène ou un reste lysine ou un reste d'acide gras contenant jusqu'à 20 atomes de carbone et A1 représente un radical éthylène ou propylène éventuellement substitué par un radical amino, X1 et Y1 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O, R2 représente un radical isopropyle, méthyl-1 propyle, tert-butyle ou cyclohexylméthyle, R'2 représente un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, X2 et Y2 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O, R3 représente un radical méthyle ou éthyle substitué par un radical hydroxy, méthoxy, mercapto, méthylthio, méthylsulfinyle ou méthylsulfonyle, R'3 représente un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, X représente un atome d'o~;ygène, et R représente un alome d'hydrogène ou un radical alkyle contenant 1 à 4 atomes decarbone éventuellement substitué par un radical alcoxy, ou un radical phényle.
Plus particulièrement encore, R1 représente un radical de formule Y-S-A1- dans lequel Y représente un atome d'hydrogène et A1 représente un radical éthylène ou propylène éventuellement substitué par un radical amino, X1 et Y1 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >CO, R2 représente un radical isopropyle, méthyl-1 propyle, tert-butyle ou cyclohexyl-méthyle, R'2 représente un atome d'hydrogène, X2 et Y2 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O, CA 022109~3 1997-07-30 WO 96/2461 j CA 02210953 1997-07-30 ., s NO ~ J LEAUX INHIBITEURS l:) E FARNESYL TRANSFERASE. THEIR
- PREPARATION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS
WHO CONTAIN THEM
The present invention relates to new farnesyl inhibitors 5 transferase of general formula:
'2 N ~ N ~ COOR (I) W
their preparation and the pharmaceutical compositions containing them.
Inhibition of farnesyl transferase and therefore farnesylation ras protein, blocks the c ~ p ~ city of mutated ras protein to transform 10 normal cells into cancer cells.
The C-terminal sequence of the ras gene contains the motif "CAA ~ Y" or "Cys-Aaa1-Aaa2-Xaa" in which Aaa represents an aliphatic amino acid and Xaa represents any amino acid.
It is known that tetrapeptides with a CAAX sequence can inhibit farnesylation of the ras protein. For example, the ~ m ~ n ~ e EP 0 618 221 presents peptide derivatives of tetrahydro 1,2,3,4-isoquinoline but whose chain lateral is fixed on position 3 of the heterocyclic skeleton. In the beginning the PCT
WO 91/16340 and in the ~ l ~ m ~ n ~ e EP 0 461 869 have been described peptides farnesyl transferase inhibitors Cys-Aaa1-Aaa2-Xaa which are more 20 ~ particularly represented by the peptides Cys-Val-Leu-Ser, Cys-Val-Ile-Met and Cys-Val-Val-Met which manifest their inhibitory activity at concentrations close to 10-6M or 10-7M.
It am ~ A..I was found, and this is what is the subject of the present invention, that the peptides of general formula (I) manifest their inhibitory activity (ICso) to 25 con ~ n ~ rations of the order of 10-8M.
In the general formula (I), R1 represents a radical of general formula YS-A1- in which Y represents a hydrogen atom, or an amino acid residue or a fatty acid residue or a radical alkyl or alkoxycarbonyl, or a radical R4-S- in which R4 represents a radical CA 022109 ~ 3 1997-07-30 W O96 / 24612 PCT ~ R96100199 ~ 2 alkyl containing 1 to 6 carbon atoms optionally substituted by a phenyl radical or a radical of general formula:
~ N COOR (He) R ~ 3 in which Al, Xl, Yl, R2, R'2, X2, Y2, ~, R3, R'3 and R are defined as 5 below, and Al represents a straight or branched alkylene radical containing 1 to 4 carbon atoms optionally substituted at a of the group> C (Xl) (Yl) by a amino radical, alkylamino c (mt ~ n ~ nt 1 to 4 carbon atoms, alkanoylamino containing 1 to 4 carbon atoms or alkoxycarbonylamino of which the alkyl part contains 1 to 4 carbon atoms, 10 Xl and Yl each represent a hydrogen atom or form together with the carbon atom to which they are linked a group> C = O, R2 represents a straight or branched alkyl radical containing 1 to 4 carbon atoms optionally substituted by a cyclohexyl radical, R'2 represents a hydrogen atom or a straight or branched alkyl radical containing 1 15 to 6 carbon atoms, X2 and Y2 each represent a hydrogen atom or form together with the carbon atom to which they are linked a group> C = O, R3 represents an alkyl radical cont ~ n ~ nt straight or branched cnnt ~ n ~ nt 1 to 4 atoms of carbon possibly subs ~ itllé by a hydroxy radical, alkoxy containing 1 to 4 carbon atoms, mercapto, alkylthio containing ~ nt 1 to 4 carbon atoms, alkylsul-finyl containing 1 to 4 carbon atoms or alkylsulfonyl containing 1 to 4 carbon atoms carbon, it being understood that when R3 represents an alkyl radical substituted by a hydroxy radical, R3 can form with the carboxy radical in cc a lactone, R'3 represents a hydrogen atom or a straight or branched alkyl radical containing 1 25 to 6 carbon atoms, X represents an oxygen or sulfur atom, and R represents a hydrogen atom or an alkyl radical optionally substituted by an alkoxy radical containing 1 to 4 carbon atoms, alkylthio containing 1 to 4 carbon atoms, alkylsulfinyl containing 1 to 4 carbon atoms, alkylsulfonyl CA 022109 ~ 3 1997-07-30 Wo 96t24612 PCT / FR96 / oO199 containing 1 to 4 carbon atoms, phenyl, phenoxy, phenylthio, phenylsulfinyl, phenylsulfonyl, alkylamino containing 1 to 4 carbon atoms or dialkylamino of which each alkyl part contains 1 to ~ carbon atoms, or a phenyl radical optionally substituted by one or more atoms or radicals, identical or different chosen from halogen atoms and alkyl, alkoxy, alkylthio or alkanoyl containing 1 to 4 carbon atoms.
More specifically, R1 represents a radical of formula YS-A1- in which Y represents an atom of hydrogen or a lysine residue or a fatty acid residue containing up to 20 atoms of carbon and A1 represents an ethylene or propylene radical optionally substituted by an amino radical, X1 and Y1 each represent a hydrogen atom or form together with the carbon atom to which they are linked a group> C = O, R2 represents an isopropyl, 1-methyl propyl, tert-butyl or cyclohexylmethyl, R'2 represents a hydrogen atom or a methyl radical, X2 and Y2 each represent a hydrogen atom or form together with the carbon atom to which they are linked a group> C = O, R3 represents a methyl or ethyl radical substituted by a hydroxy radical, methoxy, mercapto, methylthio, methylsulfinyl or methylsulfonyl, R'3 represents a hydrogen atom or a methyl radical, X represents an atom of o ~; ygene, and R represents a hydrogen atom or an alkyl radical containing 1 to 4 carbon atoms optionally substituted by an alkoxy radical, or a phenyl radical.
More particularly still, R1 represents a radical of formula YS-A1- in which Y represents an atom of hydrogen and A1 represents an ethylene or propylene radical optionally substituted by an amino radical, X1 and Y1 each represent a hydrogen atom or form together with the carbon atom to which they are linked a group> CO, R2 represents an isopropyl, 1-methylpropyl, tert-butyl or cyclohexyl- radical methyl, R'2 represents a hydrogen atom, X2 and Y2 each represent a hydrogen atom or form together with the carbon atom to which they are linked a group> C = O, CA 022109 ~ 3 1997-07-30 WO 96/2461
2 PCT~R96/00199 -R3 représente un radical méthyle ou éthyle substitué par un radical hydroxv, méthoxy, mercapto ou méthylthio, R'3 représente un atome d'hydrogène, et R représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle contenant 1 à 4 atomes de5 carbone.
Tout particulièrement intéressants sont les produits de formule générale (I) dans laquelle R1 représente un radical mercapto-2 éthyle ou amino-1 mercapto-2 éthyle, X1 et Y1 représ~ntent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >CO, R2 représente un10 radical isopropyle, X2 et Y2 représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O, R'2 représente un atome d'hydrogène, R3 représente un radical méthylthio-2 éthyle ouméthylsulfinyle-2 éthyle, R'3 représente un atome d'hydrogène et R représente unatome d'hydrogène.
La présente invention concerne également les formes stéréoisomères des produits de formule générale (I). Les restes des aminoacides représentés par RIC(X1)(Y1). R2cH(NR2)[c(x2)(y2)] et R3CH(NR'3)CO-OH ont de préférence la configuration des aminoacides naturels.
La présente invention concerne également les sels minéraux ou organiques 20 ainsi que les esters des produits de formule générale (I).
Selon l'invention, les nouveaux produits de formule générale (I) peuvent être obtenus par synthèse en phase solide en utilisant une stratégie de synthèse "9-fluorénylméthoxycarbonyl (FMOC)". Dans ce cas, les groupements thiols sont protégés par des groupements trityl ou acét~midométhyl, les fonctions amines par des 25 groupements Boc (t.butoxycarbonyl) et les fonctions acides sous forme d'estert.butylique, les fonctions alcool par des groupernents t.butyl et les fonctions amide et imidazole par des groupements trityl. La synthèse peut être réalisée sur une résine confinée dans des seringues d'extraction en phase solide de 3 cm3 en polyéthylène haute densité munies de filtres en teflon. Les seringues sont montées sur une vanne à
30 deux voies en teflon et ferrnées par un bouchon à ailettes à usage unique en polyéthylène haute densité. L'agitation des seringues est réalisée sur un appareil rotatif pour tubes à hémolyse. Les opérations de lavage et de filtration sont conduites sur une station de travail d'extraction en phase solide.
Les synthèses peuvent être réalisées sur 50 !lmoles de résine. Les couplages 35 des acides aminés sont réalisés en traitant pendant 1 heure la résine par 250 ~moles CA 022109~3 1997-07-30 WO 96/24612 PCT/FR96/00l99 de l'acide aminé convenablement protégé en présence de 2~0 ~lmoles de 2-(lH-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthvlul-onium, hexafluorophosphate (HBTU), 250 ~unoles de N-hydoxybenzotriazole et 750 !lmoles de diisopropyléthylamine dans 1,2 cm3 d'un mélange N-méthylpyrrolidone-2 (NMP)/diméthylformamide (1/1 en 5 volumes). La déprotection du groupement FMOC est réalisée par 3 traitements successifs de la résine pendant 2 fois 1 minute puis 20 minutes par 2 cm3 de pipéridine en solution à 2 ~o (v/v) dans la NMP.
Par exemple, la Cys-(NMe)Val-[(R,S)-tétrahydro-1,2,3,4-isoquinoléine-1-carbonyl]-Met peut être préparée de la manière suivante:
On soumet successivement 50 !lmoles de résine Fmoc-Met [résine de Wang;
Wang et al., J. Amer. Chem. Soc., 95, 1328, (1973)] aux traitements suivants:
- déprotection du groupement FMOC, - lavage par 5 fois 2 cm3 de NMP, - couplage de l'acide FMOC-(R,S)-tétrahydro-1,2,3,4-isoquinoléine-1-carboxylique, - lavage par 5 fois 2 cm3 de NMP, - déprotection du groupement FMOC, - lavage par 5 fois 2 cm3 de NMP, - couplage de la FMOC-N-méthvlvaline, - lavage par 5 fois 2 cm3 de NMP, - déprotection du groupement FMOC, - lavage par 5 fois 2 cm3 de NMP, - couplage de la FMOC-cystéine(S-trityl), - lavage par 5 fois 2 cm3 de NMP, - déprotection du groupement FMOC, puis - lavage par 5 fois 2 cm3 de NMP.
La synthèse terminée, les produits sont séparés par traitement de la résine par 10 cm3 d'un mélange acide trifluoroacétique-phénol-éthanedithiol-thioanisole-eau (40-3-1-2-2 en volumes) pendant 1 heure 30 minutes. La résine est ensuite éliminée par filtration. Le filtrat est concentré sous pression réduite au moyen d'un évaporateur centrifuge (RC10-10 Jouan) équipé d'une pompe à palettes et d'un piège à -90~C
pendant 1,5 heures, la température de la chambre d'évaporation étant m~in~nue à
50~C. Le volume final du concentrat est d'environ 1 cm3. Le produit est ensuite précipité par addition de 15 cm3 d'un mélange de méthyl-tert-butyléther et d'éther de pétrole (2-1 en volumes) puis il est recueilli par centrifugation. Le culot est ensuite CA 022109~3 1997-07-30 W O96/24612 PCT~FR96/00199 solubilisé dans 1 cm3 d'acide trifluoroacétique, précipité par addition de 15 cm3 de méthyl-tert-butyléther puis lavé par 15 cm3 de méthyl-tert-butyléther. Le produit est ensuite séché sous pression réduite (3,5 kPa3. Le produit est enfin purifié par chromatographie liquide à haute perforrnance (HPLC) sur une colonne C1g 100 A
(250 x 10 mm, BioRad) éluée par un gradient d'acétonitrile contenant 0,07 % d'acide trifluoroacétique (en volumes) dans l'eau contenant 0,07 % d'acide trifluoroacétique (en volumes) à un débit de 6 cm3/min puis lyophilisé. Le produit obtenu est caractérisé par son spectre de masse (electrospray).
L'acide tétrahydro-1,2,3,4-isoquinoléine-1-carboxylique, sous forme racémique peut être préparé par hydrogénation de l'acide isoquinoléine-1-carboxylique dans les conditions décrites par R.T. Shuman et coll., J. Med. Chem., 36, 314 (1993).
L'introduction du groupement protecteur FMOC sur un aminoacide est effectuée par action de l'aminoacide sur le chloroformiate de 9-fluorénylméthyl (FMOC-chlorure) en présence d'une base.
L'activité inhibitrice de la farnésyltransférase et de la farnésylation de la protéine Ras peut être mise en évidence dans le test suivant:
L'activité farnésyltransférase est déterminée par la quantité de (3H) farnésyl transférée à partir du (3H) farnésylpyrophosphate [(3H) FPP) sur la protéine p21H-ras. Le mélange réactionnel standard est composé, pour un volume final de 60 ,ul, de Tris-HCI 50mM, MgC12 5mM, dithiotréitol 5 mM, octyl-~-D-glucopyranoside 0,2 %, p21 H-ras 200 picomoles, (3H) FPP (à 61000 dpm/picomole) 4,5 picomoles.
La réaction est initiée par addition d'environ 5 ng de farnésyltransférase h1lm~in~ purifiée à partir de cultures de cellules THP1. Après incubation pendant 20 minutes à 37~C en plaque de micro~ dtion cont~n~nt 96 trous de 1 cm3 par plaque (Titer Plate~', Beckman), la réaction est stoppée par addition de 0,4 cm3 de SDS à
0,1 % dans le méthanol à 0~C. Le mélange est ensuite additionné de 0,4 cm3 d'acide (~
trichloroacétique (TCA) à 30 % dans le méthanol. Les plaques sont laissées pendant 1 heure dans la glace. Le contenu précipité est alors retenu sur membrane en fibre de(É~) verre Filtermat(E~, Pharmacia) avec l'unité de filtration (Combi Cell Harvester(~, Skatron) et rincé avec de l'acide trichloroacétique à 6 % dans l'eau distillée. Les membranes sont séchées au four à micro-ondes puis imprégnées de scintill~nt par fusion sous air chaud de Meltilex(~ (Pharrnacia) et enfin comptées en cpm dans un compteur ~-PIate(~) (LKB). Chaque essai est répété 3 fois.
CA 022109~3 1997-07-30 Wo 96/24612 PCTtFR96/00199 L'unité d'activité est définie par 1 picomole de t3H) FPP transférée sur p21 H-ras en 20 minutes.
Les pourcentages d'inhibition sont obtenus par comparaison des essais avec et sans inhibiteur après déduction des blancs, les ICso étant mesurées à partir des5 inhibitions obtenues avec 9 concentrations différentes en utilisant les logiciels Fn7.fitt~r~) ou Grafit~).
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau I.
TABLEAU I
Activité
Produit inhibitrice Cys-(N-Me)Val-[(R,S)-tétrahydo-1,2,3,4-isoquinoléinc-1-carbony]]-Mct 2,6 x 10-8 M
Les nouveaux peptides de formule générale (I) peuvent se présenter sous forme de sels non toxiques et pharmaceutiquement acceptables. Ces sels non toxiques co"lp.elment les sels avec les acides minéraux (acides chlorhydrique, sulfurique, bromhydrique, phosphorique, nitrique) ou avec les acides organiques (acides acétique, propionique, succinique, maléique, hydroxymaléique, benzoique, 15 fumarique, méthanesulfonique, trifluoroacétique ou oxalique) ou avec les bases minérales (soude, potasse, lithine, chaux) ou organiques (amines tertiaires comme la triéthylamine, la pipéridine, la benzylamine) selon la nature des aminoacides qui constituent le peptide de formule générale (I).
Les nouveaux peptides selon l'invention, qui inhibent la farnésyltransférase 20 et la farnésylation de la protéine Ras, sont des agents anticancéreux remarquables qui agissent tant au niveau des tumeurs solides que liquides.
La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques qui contiennent au moins un peptide de formule générale (I) en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants pharmaceutiquement acceptables qu'ils soient 25 inertes ou physiologiquement actifs.
Ces compositions peuvent être a~mini~trées par voie orale, parentérale ou rectale.
Les compositions pour a(lmini~tration orale comprennent des comprimés, des pilules, des poudres ou des granulés. Dans ces compositions le produit actif selon 30 l'invention est mélangé à un ou plusieurs diluants inertes tels que saccharose, lactose CA 022109~3 1997-07-30 ou amidon. Ces compositions peu~ ent comprendl e des substances autres que les diluants, par exemple un lubrifiant tel que le stéarate de magnésium.
Comme compositions liquides pour administration orale peuvent être utilisées des émulsions pharmaceutiquement acceptables, des solutions, des suspensions, des sirops, des élixirs contenant des diluants inertes tel que l'eau ou l'huile de paraffine. Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres que les diluants, par exemple des produits mouillants, édulcorants ou arom~ti~nt.~
Les compositions selon l'invention pour ~lministration parentérale peuvent être des solutions stériles aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer le propylèneglycol, un polyéthylèneglycol, des huiles végétales, en particulier l'huile d'olive ou des esters organiques injectables par exemple l'oléate d'éthyle. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants, en particulier des agents mouillants, émulsifiants et dispersants. La stérilisation peut se faire de plusieurs fa,cons, par exemple à l'aide d'un filtre bactériologique, en incorporant à la composition des agents stérilisants ou par chauffage. Elles peuvent être également préparées sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable.
Les compositions pour administration rectale sont des suppositoires qui peuvent contenir, outre le produit actif, des excipients tels que le beurre de cacao.
Les compositions selon l'invention sont particulièrement utiles en thérapeutique humaine dans le traitement de cancers d'origines diverses.
En thérapeutique humaine, les doses dépendent de l'effet recherché, de la durée du traitement et des facteurs propres au sujet à traiter.
Généralement, les doses sont comprises, chez l'homme, entre 0,1 et 20 mg/kg par jour par voie intra-péritonéale. 2 PCT ~ R96 / 00199 -R3 represents a methyl or ethyl radical substituted by a hydroxv radical, methoxy, mercapto or methylthio, R'3 represents a hydrogen atom, and R represents a hydrogen atom or an alkyl radical containing 1 to 4 carbon atoms.
Of particular interest are the products of general formula (I) in which R1 represents a 2-mercapto-ethyl or 1-amino-mercapto-2 radical ethyl, X1 and Y1 represent ~ ntent each a hydrogen atom or form together with the carbon atom to which they are linked a group> CO, R2 represents an isopropyl radical, X2 and Y2 each represent a hydrogen atom or form together with the carbon atom to which they are linked a group> C = O, R'2 represents a hydrogen atom, R3 represents a 2-methylthioethyl or 2-methylsulfinylethyl radical, R'3 represents a hydrogen atom and R represents a hydrogen atom.
The present invention also relates to the stereoisomeric forms of products of general formula (I). The remains of the amino acids represented by RIC (X1) (Y1). R2cH (NR2) [c (x2) (y2)] and R3CH (NR'3) CO-OH preferably have the configuration of natural amino acids.
The present invention also relates to mineral or organic salts 20 as well as the esters of the products of general formula (I).
According to the invention, the new products of general formula (I) can be obtained by solid phase synthesis using a synthesis strategy "9-fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC)". In this case, the thiol groups are protected by trityl or acet ~ midomethyl groups, the amine functions by 25 Boc (t.butoxycarbonyl) groups and the acid functions in the form of butyl ester, the alcohol functions with t.butyl groups and the amide and imidazole by trityl groups. The synthesis can be carried out on a resin confined in 3 cm3 polyethylene solid phase syringes high density fitted with teflon filters. The syringes are mounted on a gate valve.
30 two ways in teflon and closed by a disposable wing plug in high density polyethylene. The syringes are shaken on a device rotary for hemolysis tubes. Washing and filtration operations are carried out on a solid phase extraction workstation.
The syntheses can be carried out on 50 μmoles of resin. The couplings 35 amino acids are produced by treating the resin for 1 hour with 250 ~ moles CA 022109 ~ 3 1997-07-30 WO 96/24612 PCT / FR96 / 00l99 amino acid suitably protected in the presence of 2 ~ 0 ~ lmoles of 2- (1H-benzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethvlul-onium, hexafluorophosphate (HBTU), 250 ~ unoles of N-hydoxybenzotriazole and 750! Lmoles of diisopropylethylamine in 1.2 cm3 of an N-methylpyrrolidone-2 (NMP) / dimethylformamide mixture (1/1 in 5 volumes). Deprotection of the FMOC group is carried out by 3 treatments of the resin for 2 times 1 minute then 20 minutes per 2 cm3 of piperidine in solution at 2 ~ o (v / v) in the NMP.
For example, Cys- (NMe) Val - [(R, S) -tétrahydro-1,2,3,4-isoquinoline-1-carbonyl] -Met can be prepared as follows:
50 μmol of Fmoc-Met resin [Wang resin;
Wang et al., J. Amer. Chem. Soc., 95, 1328, (1973)] to the following treatments:
- deprotection of the FMOC group, - washing with 5 times 2 cm3 of NMP, - coupling of FMOC- (R, S) -tetrahydro-1,2,3,4-isoquinoline-1- acid carboxylic, - washing with 5 times 2 cm3 of NMP, - deprotection of the FMOC group, - washing with 5 times 2 cm3 of NMP, - coupling of FMOC-N-methvlvaline, - washing with 5 times 2 cm3 of NMP, - deprotection of the FMOC group, - washing with 5 times 2 cm3 of NMP, - coupling of FMOC-cysteine (S-trityl), - washing with 5 times 2 cm3 of NMP, - deprotection of the FMOC group, then - washing with 5 times 2 cm3 of NMP.
The synthesis finished, the products are separated by treatment of the resin per 10 cm3 of a trifluoroacetic acid-phenol-ethanedithiol-thioanisole-water mixture (40-3-1-2-2 by volume) for 1 hour 30 minutes. The resin is then removed by filtration. The filtrate is concentrated under reduced pressure by means of an evaporator centrifugal (RC10-10 Jouan) equipped with a vane pump and a trap at -90 ~ C
for 1.5 hours, the temperature of the evaporation chamber being m ~ in ~ naked at 50 ~ C. The final volume of the concentrate is approximately 1 cm3. The product is then precipitated by adding 15 cm3 of a mixture of methyl-tert-butyl ether and ether petroleum (2-1 by volume) then it is collected by centrifugation. The pellet is then CA 022109 ~ 3 1997-07-30 W O96 / 24612 PCT ~ FR96 / 00199 dissolved in 1 cm3 of trifluoroacetic acid, precipitated by adding 15 cm3 of methyl-tert-butyl ether then washed with 15 cm3 of methyl-tert-butyl ether. The product is then dried under reduced pressure (3.5 kPa3. The product is finally purified by high performance liquid chromatography (HPLC) on a C1g 100 A column (250 x 10 mm, BioRad) eluted by an acetonitrile gradient containing 0.07% acid trifluoroacetic (by volume) in water containing 0.07% trifluoroacetic acid (by volume) at a flow rate of 6 cm3 / min then lyophilized. The product obtained is characterized by its mass spectrum (electrospray).
Tetrahydro-1,2,3,4-isoquinoline-1-carboxylic acid, in the form can be prepared by hydrogenation of isoquinoline-1- acid carboxylic under the conditions described by RT Shuman et al., J. Med. Chem., 36, 314 (1993).
The introduction of the FMOC protecting group on an amino acid is effected by the action of the amino acid on 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC-chloride) in the presence of a base.
The inhibitory activity of farnesyltransferase and farnesylation of Ras protein can be demonstrated in the following test:
Farnesyltransferase activity is determined by the amount of (3H) farnesyl transferred from (3H) farnesylpyrophosphate [(3H) FPP) to the p21H-ras protein. The standard reaction mixture is composed, for a final volume of 60 μl, 50mM Tris-HCI, 5mM MgC12, 5mM dithiotreitol, octyl- ~ -D-glucopyranoside 0.2%, p21 H-ras 200 picomoles, (3H) FPP (at 61000 dpm / picomole) 4.5 picomoles.
The reaction is initiated by the addition of approximately 5 ng of farnesyltransferase h1lm ~ in ~ purified from THP1 cell cultures. After incubation for 20 minutes at 37 ~ C in micro plate ~ dtion cont ~ n ~ nt 96 holes of 1 cm3 per plate (Titer Plate ~ ', Beckman), the reaction is stopped by adding 0.4 cm3 of SDS to 0.1% in methanol at 0 ~ C. 0.4 cm3 of acid is then added to the mixture (~
30% trichloroacetic acid (TCA) in methanol. The plates are left for 1 hour in the ice. The precipitated content is then retained on a fiber membrane of (É ~) Filtermat glass (E ~, Pharmacia) with the filtration unit (Combi Cell Harvester (~, Skatron) and rinsed with 6% trichloroacetic acid in distilled water. The membranes are dried in the microwave and then impregnated with scintill ~ nt by Meltilex hot melt (~ (Pharrnacia) and finally counted in cpm in a counter ~ -PIate (~) (LKB). Each test is repeated 3 times.
CA 022109 ~ 3 1997-07-30 Wo 96/24612 PCTtFR96 / 00199 The activity unit is defined by 1 picomole of t3H) FPP transferred to p21 H-ras in 20 minutes.
The inhibition percentages are obtained by comparison of the tests with and without inhibitor after deduction of blanks, ICso being measured from 5 inhibitions obtained with 9 different concentrations using software Fn7.fitt ~ r ~) or Grafit ~).
The results obtained are collated in Table I.
TABLE I
Activity Inhibitory product Cys- (N-Me) Val - [(R, S) -tétrahydo-1,2,3,4-isoquinoléinc-1-carbony]] - Mct 2,6 x 10-8 M
The new peptides of general formula (I) can be present under form of non-toxic and pharmaceutically acceptable salts. These non-toxic salts co "lp.elment the salts with mineral acids (hydrochloric, sulfuric acids, hydrobromic, phosphoric, nitric) or with organic acids (acids acetic, propionic, succinic, maleic, hydroxymaleic, benzoic, 15 fumaric, methanesulfonic, trifluoroacetic or oxalic) or with the bases mineral (soda, potash, lithine, lime) or organic (tertiary amines such as triethylamine, piperidine, benzylamine) depending on the nature of the amino acids which constitute the peptide of general formula (I).
The new peptides according to the invention, which inhibit farnesyltransferase 20 and farnesylation of the Ras protein are remarkable anticancer agents which act on both solid and liquid tumors.
The present invention also relates to pharmaceutical compositions which contain at least one peptide of general formula (I) in combination with a or more pharmaceutically acceptable diluents or adjuvants, whether they are 25 inert or physiologically active.
These compositions can be a ~ mini ~ very oral, parenteral or rectal.
The compositions for oral administration include tablets, pills, powders or granules. In these compositions the active product according to The invention is mixed with one or more inert diluents such as sucrose, lactose CA 022109 ~ 3 1997-07-30 or starch. These compositions little ~ ent includes substances other than thinners, for example a lubricant such as magnesium stearate.
As liquid compositions for oral administration may be used pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs containing inert diluents such as water or paraffin oil. These compositions can also include substances other than diluents, for example wetting, sweetening or arom ~ ti ~ nt. ~
The compositions according to the invention for parenteral administration can be sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions. As a solvent or vehicle, propylene glycol, a polyethylene glycol, vegetable oils, in particular olive oil or esters injectable organic, for example ethyl oleate. These compositions can also contain adjuvants, in particular wetting agents, emulsifiers and dispersants. Sterilization can be done in several ways, for example using a bacteriological filter, incorporating sterilizing agents into the composition or by heater. They can also be prepared in the form of compositions sterile solids which can be dissolved when used in sterile water or any other sterile injectable medium.
The compositions for rectal administration are suppositories which may contain, in addition to the active product, excipients such as cocoa butter.
The compositions according to the invention are particularly useful in human therapy in the treatment of cancers of various origins.
In human therapy, the doses depend on the desired effect, on the duration of treatment and factors specific to the subject to be treated.
Generally, the doses are, in humans, between 0.1 and 20 mg / kg per day intraperitoneally.