CA 0220609~ 1997-0~-27 , PATENT RULES
SECTION ~04(4) NOTICE
It is the applicant's wish that, until either a patent has issued on the basis of the application or the application is refused, or is abandoned and no longer subject to reinstatement, or is withdrawn, the Commissioner only authorize the furnishing of a sample of any deposited biological material referred to in the specification to an independent expert nominated by the Commissioner in accordance with section 109 of the Patent Rules.
., Feb. 3, 1997 JDM:s~i C:~<EEP\B10-INFO.PGS
CA 0220609~ 1997-0~-27 WO97/13784 PCT~R95/01317 "R~cepteur lactoferrine d'~elicobacter"
La présente invention concerne la prévention et le traitement des infections gastriques dues a la bacterie H~licobacter. Elle a pour objet une proteine de surface nouvellement identifiée et purifiée à partir d~Hélicobacter ainsi que son usage à titre de vaccin. Cette protéine a la capacité de se lier à la lactoferrine d'origine hllm~ine H~licobacter pylori est une bactérie gram-négative retrouvée ~ la surface de la muqueuse gastrique ~o chez l'homme. Cette bactérie est associée à un certain nombre de pathologies gastroduodénales dont elle serait, du moins pour certaines, l'agent pathogène responsable. Il s~agit en particulier des gastrites aiguës ou chroniques (inflammation de la muqueuse), des ulcères (destruction de ~5 la muqueuse), des dyspepsies et de certains cancers tel que l'adenocarcinome gastrique.
A cet egard, il est dejà apparu hautement souhaitable de mettre au point un vaccin pour prevenir et lutter contre les infections à Helicobacter.
Differents antigènes ont dejà ete proposes comme CA 0220609~ 1997-0~-27 agent vaccinal potentiel : il s~agit notamment de l~uréase (WO 90/4030), de la cytotoxine et de la proteine heat-shock (WO 93/18150) et des adhesines.
Neanmoins, on prevoit qu'un vaccin anti-Hélicobacter, pour atteindre un m~imum d'efficacite, devra contenir plus d'un antigène. Il est donc nécessaire de poursuivre l'identification des proteines d'Hélicobacter susceptibles d'être employées à cet effet.
tO on a maintenant mis en evidence dans un e~trait membranaire d'Hélicobacter, la presence d'une protéine capable de se lier à la lactoferrine humaine. De manière surprenante, cette protéine est constituee de deu~ sous-unités et peut être reconnue par des anticorps monoclonaux initialement dressés contre le recepteur transferrine de Neisseria meningitidis.
C'est pourquoi l'invention a pour objet :
(i) une proteine d'Hélicobacter sous forme substantiellement purifiée, ladite prot~ine ayant un poids moléculaire apparent d'environ 98 kD ou d'environ 70 kD, tel que défini après migration sur gel de SDS-PAGE à
environ 10 % de polyacrylamide et susceptible d'être substantiellement puri~iee ~ partir d'un extrait membranaire d~Helicobacter par chromatographie d~affinité
sur une colonne de lactoferrine ; ainsi (ii) qu'une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prevention d~une infection à
Helicobacter qui comprend à titre de principe vaccinant, au moins une protéine selon l'invention.
Par "proteine de 98 ou 70 kD substantiellement -CA 0220609~ 1997-0~-27 WO97/13784 PCT~R95/01317 purifiée~, on entend une préparation de cette protéine d~pourvue de la majeure partie des constituants cellulaires d~Hélicobacter. Bien évidemment, des cont~m; n~nts mineurs ne sont pas exclus.
Une protéine selon l~invention peut être o~tenue à partir d'Hélicobacter ou être obtenue par voie recombinante par expression du fragment d'ADN
correspondant, dans un système hétérologue, bactéries, ~O levures ou cellules de mammifères.
De manière avantageuse, une protéine selon l'invention est susceptible d'être obtenue ~ partir d'H.
pylori.
Une composition selon l'invention peut être fa~riquee de manière conventionnelle. En particulier, on associe une protéine selon l'invention avec un adjuvant, un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceuti~ue. Une composition selon l'invention peut être a~mini~trée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie orale ou parenterale. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou repetee une ou plusieurs fois apres un certain delai d'intervalle. Le dosage approprie varie en fonction de divers paramatres, par exemple, de l'individu traité ou du mode d'administration.
L'invention est illustree ci-apres, en se 3~ referant a la Figure 1 qui presente le profil électrophorétique sur gel de SDS-PAGE (polyacrylamide lO %) d'une préparation éluée d'une colonne de Sépharose 4B-Lactoferrine, apres application d'un extrait mem~ranaire d'H. pylori, tel que révélé au bleu de Coomassie (colonne CA 0220609~ 1997-0~-27 WO 97/1378~ PCT/FR95/01317 A) et au nitrate d'argent (colonne B). Les étalons des poids moléculaires sont la phosphorylase B (94 kD), 1'albumine bovine t67 kD), l'ovalbumine (43 kD), l'anhydrase carbonique (30 kD), l'inhibiteur de la trypsine isole du soja (soybean trypsin inhibitor) (20,1 kD) et l'alpha-lactalbumine (14,4 kD).
1D Exemple 1 : Purification du recepteur de la lactoferrine à partir d'H. pylori.
1.1 Culture.
A partir d'une souche d'~. pylori n' ATCC 43579 (disponible auprès de l'ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockvil]e MD - U.S.A) conservee en glycérol à - 70 C, on ensemenc:e un flacon de 25 cm2 contenant un milieu biphasique. Le milieu biphasique comprend une phase solide constituée de 10 ml de gélose Colombia (bioMérieux) additionnée de 6 % de sang de mouton frais et une phase liquide constituée de 3 ml de bouillon Trypticase soja (Difco) contenant 20 % de sérum de veau foetal. Les flacons sont places dans un sac etanche dit "generbag" tBBL) et incubes sous agitation rotative douce à 37 C pendant 48 heures en condition de microaerophilie (8-10 % CO2, 5-7 %
~2 et 85-87 % N2) obtenu par le System Microaer (BBL).
Après 48 heures de culture, une sous-culture est realisee en ensemençant à partir de cette culture liquide, des boîtes de Petri contenant un milieu solide gélosé
(gélose Colombia additionnee de 6 % de sang de mouton frais). A partir d'une culture obtenue dans un flacon de 25 cm2, on ensemence environ 50 boîtes de Pétri. Ces boîtes WO97/13784 PCT~R95/01317 sont placées dans des jarres d'anaréobiose en conditions de microa~rophilie obtenues par le système Anaérocult C
(Merck). Les boites de Pétri sont ainsi incubees pendant 4 jours à 37-C.
Les nappes bactériennes sont recoltees par raclage en présence d~un faible volume de P8S (bioMérieux) et par centrifugation. Les germes sont ensuite laves par du PBS dans le but d'~liminer les résidus de milieu de 1~ culture.
1.2 Purification.
Le culot bactérien lavé est mis en suspension 17 dans de l'eau distillée et est soumis à une agitation vigoureuse. Cette suspension est centrifugée à 18 000 x g pendant 30 min. On rajoute au surnageant recueilli un certain volume de N-Lauroyl Sarkosine à 25 % (p/v) de façon que la concentration finale en Sarkosyl soit de O,1 %
2Q (p/v).
La fraction est placee dans un boyau de dialyse (Spectrum, seuil de coupure 10 OOO daltons) et dialysee contre lO volumes du tampon Tris-HCl 50 mM pH 8,O contenant NaCl 0,15M, EDTA lOmM, Sarkosyl O,1 %.
En parallèle, on prepare une colonne de Sépharose 4B (Pharmacia) sur lequel a ete immobilisee de la lactoferrine humaine (Sigma). Le greffage de la 3~ lactoferrine sur la résine de Sépharose 4B CNBr se fait selon les recommandations du ~abricant. La densité de ligand est d~environ 5 mg de lactoferrine par ml de gel Le mélange est incubé une nuit à +4'C sous agitation rotative.
Le gel est conditionné dans une colonne de 10 ml; après CA 02206095 l997-05-27 WO97/13784 PCT~RW5/01317 décantation, le gel est lavé par environ 20 volumes de colonne de tampon A (Tris-HCl 50 mM pH 8,0 contenant EDTA
10 mM, Sarkosyl 0,1 %, PMSF lOO~M (phényl méthyl sulfonyl fluoride Sigma)) contenant du NaCl O,15M, puis environ 6 volumes de colonne de tampon A contenant du NaCl 0,5M, enfin par environ 6 volumes de colonne de tampon A
contenant du NaCl lM.
L'élution est réalisée en appliquant à la colonne 1Q le tampon Tris-HCl 50 mM pH 8,0 contenant EDTA lO mM, Sarkosyl 0,05 %, PMSF 100 ~M et un gradient de guanidine HCl de O a 2M.
Les fractions éluées dans la gamme de guanidine de 0,75 à 2M sont regroupées. Cette préparation est ~ialysée corLtre le tc~.pon Tris=~Cl 50l,u~ p~ 8,0 et concentrée par evaporation rotative sous vide.
1.3 Analyse de la fraction purifiée.
La préparation obtenue après chromatographie d'affinité sur colonne de Sépharose 4B-lactoferrine humaine est analysée par électrophorèse sur gel de SDS-PAGE à lO %
d'acrylamide, selon la technique de Laemmli, Nature (1970), 227 : 680 Après migration, le gel a ete coloré au bleu de Coomassie. Cette coloration comprend plusieurs étapes : (1) étape de fixation : incubation du gel dans une solution de méthanol (50 ml), acide acétique (25 ml), acide trichloroacétique (25 ml) et eau distillée (9O0 ml) ; (2) étape de coloration : incubation du gel dans un mélange de méthanol : acide acétique : eau (30:l0:60) contenant du bleu de Coomassie R250 0,25% (p/v) ; (3) étape de d~coloration dans le mélange méthanol : acide acétique :
eau (30:10:60).
Tel que montré à la figure 1, colonne A, cette coloration révèle un certain nombre de bandes, aucune n'~tant révélée aux alentours de 100 kD.
La préparation obtenue a été analysée par la methode de coloration au nitrate d'argent.
Cette coloration s'ef~ectue sur les protéines transférées préalablement sur nitrocellulose (Schleicher and Schuell BA 0,45), selon la méthode décrite par Kovarik et al, J. Folia Biologica (praha) 1987, 33 : 253.
1Ç
Tel que montré à la figure 1, colonne B, la révélation au nitrate d'argent a permis de mettre en évidence deux bandes supplémentaires, non révélées par la coloration au bleu de Coomassie. Néanmoins, parmi ces Z0 bandes, il n'était pas possible d'indiquer si l'une d~entre elles correspondait au récepteur lactoferrine.
Pour surmonter cette déficience, on a eu l'idée tout hasard, de soumettre une préparation telle que pr~cédemment obtenue à une révélation par immunoaffinité en utilisant des anticorps monoclonau~ initialement dressés contre le récepteur transferrine de N. meningitidis. Pour ce faire, une préparation a été soumise ~ une électrophorèse sur gel de SDS-PAGE, puis transférée sur ~0 nitrocellulose.
un gel de SDS-PAGE est préparé comme précédemment et, après électrophorese, trans~éré sur nitrocellulose. La nitrocellulose est saturée dans un tampon bloquant (lait CA 0220609~ l997-0~-27 WO 97/137~4 PCT/FR95/01317 écrémé 1% (p/v), NaC1 0,9 % (p/v) dans Tris-HCl 50 mM pH
8), puis incubée dans une solution d'anticorps anti-récepteur de la transferrine de N. meningitidis (25 ~g IgG/ml dans du tampon bloquant) pendant 1 heure à 37-C
sous agitation, puis lavée 3 fois avec du tampon bloquant et enfln incubée avec un deuxième anticorps (anti-espèce du premier) conjugué à la peroxydase. La nitrocellulose est en~in ~évélée avec un subtrat précipitant de la peroxydase : le 4 chloro-1-naphtol en présence de H202.
1~
De manière surprenante, deux bandes ont été ainsi révélées : l~une ayant un poids moléculaire apparent de 98 000 daltons, l'autre de 70 000 daltons. L'étude aux anticorps monoclonaux permet d'indiquer que ces deux bandes correspondent à deux sous-unités d'un même récepteur alors qu'il est connu que le récepteur lactoferrine de N.
meningitidis est un r~cepteur simple chaîne (Schryvers Morris, Infect. Immun. (1988) 56:1144).
20Exemple 2 : Composition pharmaceutique destinée à
une administration orale.
La protéine de 98 ou 70 kD susceptible d'être obtenue comme dans l'exemple 1 peut être encapsulée seule ou en présence d'autres protéines de H. pylori dans des capsules de gélatine afin de protéger l'antigène contre la dégradation par le suc gastrique ou bien administrée en présence de bicarbonate de sodium. De telles formulations ont déjà été utilisées pour des compositions pharmaceutiques (Blac~ et al, Dev. Biol. Stand. (1983) 53).
La protéine peut egalement être encapsulée dans des microsphères de PLGA (copolymères d'acide glycolique et acide lactique) selon le protocole decrit ailleurs (Eldridge et al, Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1989) CA 02206095 l997-05-27 wo97ll37s4 PCT~R95/01317 146:59). La protéine peut egalement être incluse dans desliposomes préparés selon les méthodes conventionnelles largement décrites ("Liposomes: a practical approach, ed.
RRC New, D. Rickwood ~ 8.D. Hames, 1990, Oxford University Press, ISBN 0-19-963077-1).
Independamment de la formulation, la quantité de protéine a' ; n; strée à l'homme par voie orale est de l'ordre de 1 ~ lO mg par prise, et l'on preconise au moins 1Q 3 prises a intervalle de 4 semaines.
~ xemple 3 : Composition pharmaceutique destinée à
une administration parentérale.
~5 La protéine de 98 ou 70 kD susceptible d'être obtenue comme dans l'exemple 1, est adsor~ee sur gel d'alumine de facon tout à fait conventionnelle. La protéine en solution à l mg/ml dans un tampon dont le pH est voisin de 6,s est mise en contact pendant 1 heure avec de l'hydroxyde d~aluminium à lO mg/ml mesuré en Al+++. La composition finale de la preparation est la suivante : une protéine selon l'invention 50 ~g/ml, Al+++ 250 ~g/ml, merthiolate l/1000, le tout en PBS.
Comme dans le cas de 1'administration orale, 3 injections sont préconisees, chacune espacee de 4 semaines de la precedente. CA 0220609 ~ 1997-0 ~ -27 , PATENT RULES
SECTION ~ 04 (4) INSTRUCTIONS
It is the applicant's wish that, until either a patent has issued on the basis of the application or the application is refused, or is abandoned and no longer subject to reinstatement, or is withdrawn, the Commissioner only authorize the furnishing of a sample of any deposited biological material referred to in the specification to an independent expert nominated by the Commissioner in accordance with section 109 of the Patent Rules.
., Feb. 3, 1997 JDM: s ~ i C: ~ <EEP \ B10-INFO.PGS
CA 0220609 ~ 1997-0 ~ -27 WO97 / 13784 PCT ~ R95 / 01317 "Lactoferrin receptor for ~ elicobacter"
The present invention relates to the prevention and treatment of gastric infections caused by bacteria H ~ licobacter. It relates to a surface protein newly identified and purified from Helicobacter as well as its use as a vaccine. This protein has the ability to bind to lactoferrin of hllm origin ~ ine H ~ licobacter pylori is a gram-negative found ~ the surface of the gastric mucosa ~ o in humans. This bacteria is associated with a certain number of gastroduodenal pathologies which it would be, of least for some, the pathogen responsible. he especially acute or chronic gastritis (inflammation of the mucosa), ulcers (destruction of ~ 5 mucosa), dyspepsia and certain cancers such as gastric adenocarcinoma.
In this respect, it has already appeared highly desirable to develop a vaccine to prevent and fight Helicobacter infections.
Different antigens have already been proposed as CA 0220609 ~ 1997-0 ~ -27 potential vaccine agent: these include urease (WO 90/4030), cytotoxin and heat-shock protein (WO 93/18150) and adhesins.
However, it is expected that a vaccine against Hélicobacter, to reach a m ~ imum of efficiency, will have to contain more than one antigen. It is therefore necessary to continue identifying helicobacter proteins likely to be used for this purpose.
tO we have now highlighted in a line Helicobacter membrane, the presence of a protein capable of binding to human lactoferrin. So surprisingly, this protein is made up of two units and can be recognized by monoclonal antibodies initially raised against the transferrin receptor for Neisseria meningitidis.
This is why the subject of the invention is:
(i) a Helicobacter protein in the form substantially purified, said protein having a weight apparent molecular of about 98 kD or about 70 kD, as defined after migration on SDS-PAGE gel to about 10% polyacrylamide and likely to be substantially puri ~ iee ~ from an extract Helicobacter membrane by affinity chromatography on a lactoferrin column; so (ii) a pharmaceutical composition intended treatment or prevention of infection with Helicobacter which includes as a vaccinating principle, at minus one protein according to the invention.
By "protein of 98 or 70 kD substantially -CA 0220609 ~ 1997-0 ~ -27 WO97 / 13784 PCT ~ R95 / 01317 purified ~ means a preparation of this protein d ~ provided with the major part of the cellular constituents d ~ Helicobacter. Obviously, cont ~ m; n ~ nts minors are not excluded.
A protein according to the invention can be kept from Helicobacter or be obtained by recombinant by expression of the DNA fragment correspondent, in a heterologous system, bacteria, ~ O yeasts or mammalian cells.
Advantageously, a protein according to the invention is likely to be obtained from H.
pylori.
A composition according to the invention can be fa ~ riquee conventionally. In particular, we associates a protein according to the invention with an adjuvant, a thinner or a support acceptable from a point of view pharmaceuti ~ ue. A composition according to the invention can be a ~ mini ~ entered by any conventional route in use in the field of vaccines, in particular by the oral or parenting. Administration can take place in single dose or repeated once or several times after certain interval time. The appropriate dosage varies in function of various parameters, for example, the individual treated or the mode of administration.
The invention is illustrated below, by 3 ~ referring to Figure 1 which presents the profile electrophoretic on SDS-PAGE gel (10% polyacrylamide) of a preparation eluted from a column of Sepharose 4B-Lactoferrin, after application of a mem extract of H. pylori, as revealed in Coomassie blue (column CA 0220609 ~ 1997-0 ~ -27 WO 97/1378 ~ PCT / FR95 / 01317 A) and silver nitrate (column B). The stallions of molecular weights are phosphorylase B (94 kD), Bovine albumin t67 kD), ovalbumin (43 kD), carbonic anhydrase (30 kD), the trypsin inhibitor isolates soybean trypsin inhibitor (20.1 kD) and alpha-lactalbumin (14.4 kD).
1D Example 1: Purification of the lactoferrin from H. pylori.
1.1 Culture.
From a strain of ~. pylori n 'ATCC 43579 (available from ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockvil] e MD - USA) stored in glycerol at - 70 C, on seed: a 25 cm2 bottle containing a medium biphasic. The biphasic medium includes a solid phase consisting of 10 ml Colombia agar (bioMérieux) supplemented with 6% fresh sheep blood and one phase liquid consisting of 3 ml of Trypticase soy broth (Difco) containing 20% fetal calf serum. The bottles are placed in a waterproof bag called "generbag" tBBL) and incubations with gentle rotary shaking at 37 C for 48 hours in microaerophilic conditions (8-10% CO2, 5-7%
~ 2 and 85-87% N2) obtained by the System Microaer (BBL).
After 48 hours of culture, a subculture is made by seeding from this liquid culture, Petri dishes containing agar solid medium (Colombia agar supplemented with 6% sheep blood fresh). From a culture obtained in a bottle of 25 cm2, approximately 50 Petri dishes are inoculated. These boxes WO97 / 13784 PCT ~ R95 / 01317 are placed in anareobiosis jars in conditions of microa ~ rophilia obtained by the Anaérocult C system (Merck). The petri dishes are thus incubated for 4 days at 37-C.
The bacterial layers are harvested by scraping in the presence of a low volume of P8S (bioMérieux) and by centrifugation. The germs are then washed with PBS for the purpose of ~ removing residues of 1 ~ culture.
1.2 Purification.
The washed bacterial pellet is suspended 17 in distilled water and is stirred vigorous. This suspension is centrifuged at 18,000 xg for 30 min. We add to the supernatant collected a certain volume of N-Lauroyl Sarkosine at 25% (w / v) so the final concentration of Sarkosyl is 0.1%
2Q (w / v).
The fraction is placed in a dialysis hose (Spectrum, cut-off threshold 10 OOO daltons) and dialysis against 10 volumes of 50 mM Tris-HCl buffer pH 8, O containing 0.15M NaCl, 10mM EDTA, Sarkosyl O, 1%.
In parallel, we prepare a Sepharose column 4B (Pharmacia) on which was immobilized human lactoferrin (Sigma). The grafting of the 3 ~ lactoferrin on Sepharose resin 4B CNBr is made as recommended by the manufacturer. The density of ligand is ~ 5 mg lactoferrin per ml Le gel mixture is incubated overnight at + 4 ° C with rotary shaking.
The gel is packaged in a 10 ml column; after CA 02206095 l997-05-27 WO97 / 13784 PCT ~ RW5 / 01317 decantation, the gel is washed with approximately 20 volumes of buffer column A (50 mM Tris-HCl pH 8.0 containing EDTA
10 mM, Sarkosyl 0.1%, PMSF 100 ~ M (phenyl methyl sulfonyl fluoride Sigma)) containing NaCl O, 15M, then approximately 6 column volumes of buffer A containing 0.5M NaCl, finally by about 6 column volumes of buffer A
containing 1M NaCl.
Elution is achieved by applying to the column 1Q 50 mM Tris-HCl buffer pH 8.0 containing EDTA 10 mM, 0.05% Sarkosyl, 100 ~ M PMSF and a guanidine gradient HCl from O to 2M.
The fractions eluted in the guanidine range from 0.75 to 2M are grouped together. This preparation is ~ ialysée corLtre le tc ~ .pon Tris = ~ Cl 50l, u ~ p ~ 8,0 and concentrated by rotary evaporation under vacuum.
1.3 Analysis of the purified fraction.
The preparation obtained after chromatography of affinity on column of Sepharose 4B-human lactoferrin is analyzed by electrophoresis on SDS-PAGE gel at 10%
acrylamide, according to the technique of Laemmli, Nature (1970), 227: 680 After migration, the gel was stained with blue Coomassie. This coloring includes several stages: (1) fixing step: incubation of the gel in a solution of methanol (50 ml), acetic acid (25 ml), acid trichloroacetic (25 ml) and distilled water (90 ml); (2) staining step: incubation of the gel in a mixture of methanol: acetic acid: water (30: 10: 60) containing Coomassie blue R250 0.25% (w / v); (3) stage of d ~ coloring in the methanol: acetic acid mixture:
water (30:10:60).
As shown in Figure 1, column A, this coloring reveals a number of bands, none not being revealed around 100 kD.
The preparation obtained was analyzed by the silver nitrate staining method.
This coloration is done on proteins previously transferred to nitrocellulose (Schleicher and Schuell BA 0.45), according to the method described by Kovarik et al, J. Folia Biologica (praha) 1987, 33: 253.
As shown in Figure 1, column B, the revelation with silver nitrate allowed to set evidence of two additional bands, not revealed by the Coomassie blue staining. However, among these Z0 bands, it was not possible to indicate if one of ~
they corresponded to the lactoferrin receptor.
To overcome this deficiency, we had the idea by any chance, to submit a preparation such as pr ~ previously obtained by revelation by immunoaffinity in using monoclonal antibodies ~ originally trained against the transferrin receptor of N. meningitidis. For to do this, a preparation has been submitted ~ a SDS-PAGE gel electrophoresis, then transferred to ~ 0 nitrocellulose.
an SDS-PAGE gel is prepared as above and, after electrophoresis, trans ~ erated on nitrocellulose. The nitrocellulose is saturated in a blocking buffer (milk CA 0220609 ~ l997-0 ~ -27 WO 97/137 ~ 4 PCT / FR95 / 01317 skim 1% (w / v), NaC1 0.9% (w / v) in 50 mM Tris-HCl pH
8), then incubated in a solution of anti-N. meningitidis transferrin receptor (25 ~ g IgG / ml in blocking buffer) for 1 hour at 37-C
with stirring, then washed 3 times with blocking buffer and finally incubated with a second antibody (anti-species of first) conjugated to peroxidase. Nitrocellulose is in ~ in ~ revealed with a substrate which precipitates peroxidase : 4 chloro-1-naphthol in the presence of H2O2.
1 ~
Surprisingly, two bands were thus revealed: one with an apparent molecular weight of 98 000 daltons, the other 70,000 daltons. The study in monoclonal antibody indicates that these two bands correspond to two subunits of the same receiver then that it is known that the N. lactoferrin receptor meningitidis is a single chain receiver (Schryvers Morris, Infect. Immun. (1988) 56: 1144).
Example 2: Pharmaceutical composition intended for oral administration.
The 98 or 70 kD protein likely to be obtained as in Example 1 can be encapsulated alone or in the presence of other H. pylori proteins in gelatin capsules to protect the antigen from degradation by gastric juice or administered in presence of sodium bicarbonate. Such formulations have already been used for compositions pharmaceuticals (Blac ~ et al, Dev. Biol. Stand. (1983) 53).
The protein can also be encapsulated in PLGA microspheres (glycolic acid copolymers and lactic acid) according to the protocol described elsewhere (Eldridge et al, Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1989) CA 02206095 l997-05-27 wo97ll37s4 PCT ~ R95 / 01317 146: 59). Protein can also be included in liposomes prepared according to conventional methods widely described ("Liposomes: a practical approach, ed.
RRC New, D. Rickwood ~ 8.D. Hames, 1990, Oxford University Press, ISBN 0-19-963077-1).
Regardless of the formulation, the amount of protein a ';not; strate to humans orally is to the order of 1 ~ 10 mg per dose, and we recommend at least 1Q 3 taken every 4 weeks.
~ xample 3: Pharmaceutical composition intended for parenteral administration.
~ 5 The 98 or 70 kD protein likely to be obtained as in Example 1, is adsorbed on the gel alumina in a completely conventional way. Protein in solution at 1 mg / ml in a buffer whose pH is close 6, s came into contact for 1 hour with aluminum hydroxide at 10 mg / ml measured in Al +++. The final composition of the preparation is as follows:
protein according to the invention 50 ~ g / ml, Al +++ 250 ~ g / ml, merthiolate l / 1000, all in PBS.
As in the case of oral administration, 3 injections are recommended, each 4 weeks apart from the previous one.