JP3597784B2

JP3597784B2 - Peptic ulcer inhibitory composition and food and drink containing it

Info

Publication number: JP3597784B2
Application number: JP2001034703A
Authority: JP
Inventors: 伸二東口; 武祚金
Original assignee: 株式会社ファーマフーズ研究所
Priority date: 2001-02-09
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2004-12-08
Anticipated expiration: 2021-02-09
Also published as: JP2002234849A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属の菌に由来する消化性潰瘍等を抑制する組成物及びそれを含有する飲食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
消化性潰瘍（胃潰瘍、十二指腸潰瘍）や慢性胃炎の発病や再発に深く関与している病原菌として、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属の菌、特にヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ、以下ピロリ菌という）が知られている。
【０００３】
しかし、ピロリ菌は高い確率で多くの人の胃の中に存在しているものの、ピロリ菌が存在する人でも健常人がいることから、近年、ピロリ菌の存在が必ずしも消化性潰瘍等につながるものではなく、ピロリ菌により胃潰瘍を発症するのはある特定の菌株が有する細胞障害因子が原因ではないかと考えられている。
【０００４】
現在、ピロリ菌による炎症、潰瘍等の細胞障害と直接的な関わりが考えられているのは、空砲化毒素（分子量８７ｋＤａ、以下ＶａｃＡという）と毒素随伴タンパク（分子量１０５ｋＤａ〜１４０ｋＤａ、以下ＣａｇＡという）である。そして、これらのＶａｃＡ及びＣａｇＡはピロリ菌の分離菌株であっても存在する株と存在しない株があることも実証されている（ＳｈａｒｍａＳＡｅｔａｌ，ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ６３；１６８１−１６８７，１９９５）。実際に、ピロリ菌保有患者の血清抗体として、サイトトキシン（１２８ｋＤａ）とＶａｃＡに対する血清抗体は、全ての患者から検出されるのではなく、消化性潰瘍などの特殊な病態で高率に陽性になることが報告されており、また、ｉｎｖｉｔｒｏの試験でも上記毒素により細胞が空砲化する現象が確認されている（ＬｅｕｎｋＲＤｅｔａｌ，ＪＭｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２６：９３−９９，１９８８）。
【０００５】
更に、ＣａｇＡに対する血清抗体陽性率は、胃炎患者で６０〜６３％、胃潰瘍患者では８０〜１００％となっており、ＣａｇＡも胃潰瘍と深い関連のある毒素ではないかと考えられている。
【０００６】
又ピロリ菌の超音波破砕上清中には低分子タンパクである熱ショックタンパク（ＨＳＰ、分子量２５ｋＤａ〜３０ｋＤａ）があることが知られているが、本タンパクがもつ生物学的意義については未だ解明が進んでいない。
一方、ピロリ菌による消化性潰瘍等の予防及び治療方法として、例えば以下のような方法が提案されている。
【０００７】
▲１▼特開平４−２７５２３２号公報には、ピロリ菌の全菌体を抗原とした卵黄由来の抗体を含有する食品を用いることにより、ピロリ菌感染の予防方法が開示されている。
【０００８】
▲２▼特開平１０−２８７５８５号公報及び特開平１１−８０１９７号公報には、ピロリ菌に特異的なウレアーゼ（分子量３２ｋＤａ、６０ｋＤａ）や鞭毛（分子量５３ｋＤａ、５４ｋＤａ）を抗原とした卵黄由来の抗体を含有する食品を用いることにより、ピロリ菌の胃での付着を阻止する物質が開示されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、ヒトの場合、通常、ピロリ菌は胃粘膜細胞の奥深くまで入り込んで定着するため、完全除菌は抗生物質等の薬剤でも難しいと言われている。したがって、実際の消化性潰瘍患者を考えた場合、上記の公報に開示された、単にピロリ菌の付着阻害による予防・治療法では、効果的にピロリ菌の除菌や、炎症を抑制できるとは決して言い難い。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、ピロリ菌による消化性潰瘍をより効果的に抑制する組成物及びそれを含有する飲食品を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の消化性潰瘍抑制組成物は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属の菌から抽出された分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク質及び分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク質を抗原として免疫した鶏の卵から得られた抗体を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の飲食品は、前記消化性潰瘍抑制組成物を含有することを特徴とする。
【００１３】
本発明によれば、経口摂取することによりピロリ菌による消化性潰瘍を効果的に抑制できる組成物及び飲食品を提供できる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明の消化性潰瘍組成物は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属の菌から抽出された分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク質及び分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク質を抗原として免疫した鶏の卵の抽出物を有効成分として含有する。
【００１５】
上記ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属の菌としては、特に限定するものではないが、好ましくはサイトトキシンを生産する株であるヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）、ヘリコバクターシネジ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクターフェネリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｆｅｎｎｅｌｌｉａｅ）、ヘリコバクターハイルマニー（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｈｅｉｌｍａｎｉｉ）、ヘリコバクターラッピニ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｒａｐｐｉｎｉ）、ヘリコバクターフェリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｆｅｌｉｓ）等が挙げられる。
【００１６】
また、上記の分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａ及び分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク質は、例えば以下のような方法で菌体から調製できる。
【００１７】
サイトトキシンを生産するピロリ菌株を常法にしたがって培養し、菌体の不活性化処理を行う。この菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波破砕機等により破砕した後、菌体を可溶化する。好ましくは、緩衝液にグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ４）を用いて菌体を可溶化する。この溶液を遠心して可溶化抽出溶液を回収し、ゲル濾過等により、目的の分子量の画分を分取し、必要に応じて凍結乾燥する。
【００１８】
なお、上記の分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク質は、その分子量から判断するとＶａｃＡ及びＣａｇＡを含むと考えられ、又上記の分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク質についてはＨＳＰを含むと考えられる。
【００１９】
上記のようにして調製したタンパク質を鶏に免疫する方法としては、例えばＭａｋｏｔｏＳ．ｅｔａｌ，Ｂｉｏｓｃｉ. Ｂｉｏｔｅｃｈ. Ｂｉｏｃｈｅｍ.，５６（２）:２７０−２７４，１９９２に記載された方法等を採用できる。なお、本発明においては、上記タンパク質を免疫原として用いる際には、分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク質と、分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク質とをタンパク質当たり１対１で混ぜて用いることが好ましく、より好ましくは、分子量２０ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク質と、分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク質とを１対１で混ぜて用いることが好ましい。
【００２０】
また、抗原を免疫された鶏が生産した卵から抗体を調製する方法としては、卵から卵黄液を分離し、得られた卵黄液を粉末化した後、その粉末をエタノールによって脱脂した粉末中から緩衝液を用いて抽出することにより調製できる。なお、上記免疫卵をそのまま消化性潰瘍抑制組成物として用いることもできる。
【００２１】
本発明の消化性潰瘍抑制組成物の１日当たりの有効摂取量は、上記抗体換算で好ましくは１〜１０，０００ｍｇであり、より好ましくは１〜１００ｍｇである。該摂取量が抗体換算で１ｍｇ未満であると消化性潰瘍抑制効果が期待できず、１０，０００ｍｇ超であるとハンドリングの面等で問題を生じる。
【００２２】
また、本発明の消化性潰瘍抑制組成物の形態としては、特に制限はなく、例えば錠剤、カプセル剤、溶液、粉末、顆粒等が挙げられる。
【００２３】
本発明の飲食品は、上記消化性潰瘍抑制組成物を０．０１〜１０ｇ（抗体換算で１〜１０００ｍｇ）含むことが好ましく、０．０１〜０．１ｇ（抗体換算で１〜１００ｍｇ）含むことがより好ましい。
【００２４】
上記飲食品としては、特に制限はなく、例えば清涼飲料、ヨーグルト、錠菓、チョコレート、ガム、錠剤等が挙げられる。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
実施例１
▲１▼抗原の調製
胃潰瘍患者からヘリコバクター・ピロリ株を分離し、サイトトキシンを生産する株であることを確認した後、７％（ｖ／ｖ）馬脱繊維血液を含むＳｋｉｒｒｏｗの寒天培地で３７℃、４日間培養した（１０％ＣＯ_２、１０％空気、加湿）。
【００２７】
次いで、コロニーをかきとり、生理食塩水に懸濁し、この懸濁液に０．５％（ｖ／ｖ）となるようにホルマリンを加え、室温１８時間放置して菌体の不活化処理を行った。
【００２８】
次いで、菌体を３，０００×ｇ、１０分間の遠心分離で集め、生理食塩水で３回洗浄した。菌体を１×１０^８ＣＦＵ／ｍｌになるよう生理食塩水に分散させ、抗原液Ａとした。
【００２９】
特開平１０−２８７５８５号公報に記載された方法によりウレアーゼを分取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにてウレアーゼＡ（３２ｋＤａ）とウレアーゼＢ（６０ｋＤａ）を確認した後、タンパク含量として１．０ｍｇ／ｍｌとなるよう溶液を調製し、抗原液Ｂとした。
【００３０】
更に、抗原液Ａをグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ４）に懸濁して超音波破砕機により破砕した後、菌体を可溶化（３７℃×２時間）した。この可溶化抽出溶液と不溶部分を遠心（８，０００ｒｐｍ×２０分）した後、ゲル濾過（ＹＭＣ−ＰａｃｋＤｉｏｌ−２００，５００×８．０ｍｍＩ．Ｄ．，ＹＭＣ）により、分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａ、８０ｋＤａ〜２００ｋＤａの菌体抽出タンパク液を分取し、凍結乾燥してそれぞれ粉末を得た。
【００３１】
得られた菌体抽出タンパク質をタンパク含量として１．０ｍｇ／ｍｌとなるように溶液を調製し、分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク液を抗原液Ｃ、８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク液を抗原液Ｄ、両方をタンパク質含量として１対１で含む抗原液Ｅとした。
【００３２】
▲２▼免疫卵黄の調製
産卵鶏（ホワイトレグホン）を５群に分け、上記５種類の抗原液（抗原液Ａ、抗原液Ｂ、抗原液Ｃ、抗原液Ｄ、抗原液Ｅ）を１羽当たり１ｍｌ筋肉注射した。初回免疫後、１週毎に各群から集めた鶏卵から卵黄を分離し、週毎の特異抗体価を測定した。
【００３３】
鶏卵卵黄中の特異抗体価の測定は、週毎に集められた各卵黄液を２，０００倍希釈して酵素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡ法という）により行った。週毎の特異抗体価が下がってきた頃合を見計らって、実施例１で得られた５種類の抗原液を用いて追加免疫を行った。
【００３４】
追加免疫後も上記と同様のＥＬＩＳＡ法により特異抗体価を測定し、抗体価が安定した時から鶏卵を採取し、これを免疫卵とした。
【００３５】
各免疫卵１ｋｇをホモミキサーで均質化した後、噴霧乾燥して粉末を調製し、卵黄粉末（抗体含有卵黄粉末）を得た。上記の各抗体含有卵黄粉末４７０ｇに、エタノールを５倍量添加して脱脂を行い、脂質が１％以下になるよう脱脂を繰り返し行った。得られた脱脂卵黄粉末にＰＢＳバッファーを加えて卵黄水溶性タンパク質を抽出し、抽出溶液を凍結乾燥して粉末化し、抗体粉末Ａ（抗原液Ａの免疫卵から得られた粉末）、抗体粉末Ｂ（抗原液Ｂの免疫卵から得られた粉末）、抗体粉末Ｃ（抗原液Ｃの免疫卵から得られた粉末）、抗体粉末Ｄ（抗原液Ｄの免疫卵から得られた粉末）、抗体粉末Ｅ（抗原液Ｅの免疫卵から得られた粉末）を得た。更に、市販の卵を使用し、上記と同様の方法を用いて得られた粉末をコントロール粉末とした。
【００３６】
▲３▼細胞障害因子に対する抗体活性の評価
ＥＬＩＳＡの固相化抗原を、▲１▼ピロリ菌の全菌体、▲２▼ウレアーゼ、▲３▼１ｋＤａ〜３０ｋＤａの菌体抽出タンパク質、▲４▼８０ｋＤａ〜２００ｋＤａの菌体抽出タンパク質、及び▲５▼１ｋＤａ〜３０ｋＤａ及び８０ｋＤａ〜２００ｋＤａ（１：１）の菌体抽出タンパク質ミックスとし、コーティングを行った。
【００３７】
上記抗体粉末Ａ〜Ｅ及びコントロール粉末を１ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、倍々希釈を１０回行い、ＥＬＩＳＡ法にて分析を行い、同じ発色値での濃度を、コントロール粉末と比較して何倍になるかを求め、その倍数を特異抗体価として評価した。その結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】

【００３９】
表１から、抗体粉末Ｅに含まれる抗体は、全菌体にも若干反応するものの、特に分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａの菌体抽出タンパク質に対して高い特異抗体価を示すことが分かる。また、抗体粉末Ｃに含まれる抗体は、▲３▼１ｋＤａ〜３０ｋＤａの菌体抽出タンパク質に対する特異抗体価が比較的低いことから、該菌体抽出タンパク質は抗原性が弱いことが分かる。また、抗体粉末Ｅに含まれる抗体はウレアーゼ抗原とは反応しないことが分かる。
【００４０】
実施例２（細胞空砲化抑制効果試験）
ＨｅＬａ細胞を用いて、ピロリ菌が有する毒素による空砲化試験を以下のようにして行なった。
【００４１】
イーグルＭＥＭ培地（ニッスイ製）９．４ｇを蒸留水に溶解して全量を１，０００ｍｌとした。その後、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）で完全滅菌し、室温まで冷却した後、滅菌済み１０％炭酸水素ナトリウム水溶液を１５ｍｌ加えた。そして、使用前に濾過滅菌したＬ−グルタミン０．２９２ｇ及び牛胎児血清を加えて調製し、ＨｅＬａ細胞の培養液として用いた。
【００４２】
実験は極力継代が少ないもので行い、細胞の状態を確認した後、カウンターにより細胞が１０^３個になるように、８穴の滅菌プレートにアプライした。
【００４３】
そして、▲１▼滅菌生理食塩水（ネガティブコントロール）、▲２▼実施例１に記載のピロリ菌培養液を遠心分離（１，０００ｒｐｍ、１０分間）した上清（ポジティブコントロール）を添加した。このポジティブコントロールによる細胞空砲化を確認した後、上記▲２▼に実施例１で得られた抗体粉末Ａ〜Ｅを０．０１、０．１、０．５、１％になるように添加した各溶液を０．１ｍｌずつ添加し、２４時間後の細胞の様子を顕微鏡にて観察した。その結果を表２に示す。
【００４４】
【表２】

【００４５】
表２から、抗体粉末Ｃは細胞の空砲化現象をほとんど抑制しないが、抗体粉末Ｄは細胞の空砲化現象を抑制することが分かる。特に、両方の抗体を含有する抗体粉末Ｅは劇的に細胞の空砲化現象を抑制することが分かる。
【００４６】
実施例３（マウスによる除菌効果試験）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、８週齢）を使用し、本消化性潰瘍抑制組成物による除菌試験を実施した。
【００４７】
上記マウスに、実施例１で分離されたピロリ菌株（１×１０^９個）を経口投与し、１週間後、試験群の一部を屠殺して胃内のピロリ菌数を測定してピロリ菌が定着していることを確認した。その後、試験動物を６群（１群１０匹）に分け、下記の飼料を与えた（自由摂取）。
【００４８】
１群：通常飼料
２群：通常飼料＋抗体粉末Ａ（０．０１％、０．１％、１％）
３群：通常飼料＋抗体粉末Ｂ（０．０１％、０．１％、１％）
４群：通常飼料＋抗体粉末Ｃ（０．０１％、０．１％、１％）
５群：通常飼料＋抗体粉末Ｄ（０．０１％、０．１％、１％）
６群：通常飼料＋抗体粉末Ｅ（０．０１％、０．１％、１％）
【００４９】
上記飼料で２ヶ月間飼育した後、開腹し、胃内のピロリ菌の数を測定した。その結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】

【００５１】
表３から、抗体粉末Ｅを投与した群は、意外にも抗体粉末Ｂを投与した群とほぼ同程度の高い除菌効果が得られることが分かる。
【００５２】
実施例４（スナネズミによる炎症および潰瘍抑制効果試験）
スナネズミはピロリ菌が感染（胃粘膜細胞奥深くまで定着）し、４〜６ヵ月後に非常に高い確率で出血を伴う重度の炎症（胃潰瘍）を発症するモデル動物として認知され、本状態が、実際ヒトでの胃潰瘍患者と状況が似ていると言われている。
【００５３】
本モデル動物を用い、実施例１で分離されたピロリ菌株を１×１０^９個投与し４ヵ月後、試験群の一部を屠殺し、胃を開腹して胃内の潰瘍状態を確認した。屠殺した試験動物全てにおいて出血を伴う潰瘍を確認した後、試験動物を６群（１群８匹）に分け、下記の飼料を与えた（自由摂取）。
【００５４】
１群：通常飼料
２群：通常飼料＋抗体粉末Ａ（０．０１％、０．１％、１％）
３群：通常飼料＋抗体粉末Ｂ（０．０１％、０．１％、１％）
４群：通常飼料＋抗体粉末Ｃ（０．０１％、０．１％、１％）
５群：通常飼料＋抗体粉末Ｄ（０．０１％、０．１％、１％）
６群：通常飼料＋抗体粉末Ｅ（０．０１％、０．１％、１％）
【００５５】
上記の飼料で２ヶ月間飼育した後、開腹して胃内のピロリ菌の数、及び胃炎・出血を伴う潰瘍の状況を以下の５つの評価基準で点数化して８匹の平均点を求めた。
【００５６】
０：症状なし
１：赤くはれ上がっている（１箇所）
２：赤くはれ上がっている（２箇所）
３：赤くはれ上がっている（３箇所以上）
４：出血が認められる（１箇所）
５：出血が無数認められる（２箇所以上）
その結果を表４に示す。
【００５７】
【表４】

【００５８】
表４から、抗体粉末Ｂ及び抗体粉末Ｅを投与した群は、抗体粉末Ａを投与した群に比べて高い除菌効果が得られているものの、どの群も実施例３のような完全除菌に近い状態には至っていないことが分かる。
【００５９】
また、炎症状態は、抗体粉末Ａ及び抗体粉末Ｂを投与した群においてはほとんど回復しておらず、抗体粉末Ｃ及び抗体粉末Ｄを投与した群においてもやや回復傾向が見られるにとどまっている。一方、抗体粉末Ｅを投与した群においては著しい炎症回復効果が認められることが分かる。本結果から、今回初めてＶａｃＡ及びＣａｇＡを含むタンパクの抗体とＨＳＰを含むタンパクの抗体を合わせることで驚くべき抗炎症効果が得られることが分かる。
【００６０】
実施例５
以下、本発明の消化性潰瘍抑制組成物を含有する飲食品の処方例を挙げる。
【００６１】
（１）ヨーグルトの処方例
牛乳９６％
脱脂粉乳０．５％
本発明の消化性潰瘍抑制組成物３％
水０．５％
【００６２】
（２）顆粒粉末の処方例
牛乳５０％
卵４０％
砂糖１０％
本発明の消化性潰瘍抑制組成物３％
【００６３】
（３）胃炎、胃潰瘍又は十二指腸潰瘍予防タブレットの処方例
本発明の消化性潰瘍抑制組成物３％
デキストリン７０％
【００６４】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、有効成分として、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属の菌から抽出された分子量８０ｋＤａ〜２００ｋＤａのタンパク質を抗原として免疫した鶏の卵から得られた抗体と分子量１ｋＤａ〜３０ｋＤａのタンパク質を抗原として免疫した鶏の卵から得られた抗体を合わせたことにより、驚くべき抗炎症効果を得ることができた。故に、本抗体を含有させることで、経口摂取することによりピロリ菌による消化性潰瘍を効果的に抑制できる組成物及び飲食品を提供できる。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a composition for suppressing peptic ulcer or the like derived from bacteria of the genus Helicobacter , and to a food or drink containing the same.
[0002]
[Prior art]
Helicobacter bacteria, particularly Helicobacter pylori , are pathogenic bacteria that are deeply involved in the onset and recurrence of peptic ulcers (gastric ulcers, duodenal ulcers) and chronic gastritis. pylori (hereinafter referred to as H. pylori) is known.
[0003]
However, although H. pylori is present in the stomach of many people with a high probability, the presence of H. pylori in recent years does not necessarily lead to peptic ulcers, etc. However, it is thought that the gastric ulcer caused by H. pylori may be caused by a cytotoxic factor of a specific strain.
[0004]
At present, it is considered that cytotoxicity such as inflammation and ulceration caused by H. pylori is directly related to emptying toxin (molecular weight 87 kDa, hereinafter referred to as Vac A) and toxin-associated protein (molecular weight 105 kDa to 140 kDa, hereinafter Cag A) It is). It has also been demonstrated that these Vac A and Cag A are present even though they are isolated strains of H. pylori (SharmaSA et al, Infect Immun 63; 1681-1687, 1995). In fact, serum antibodies to cytotoxin (128 kDa) and Vac A are not detected in all patients, but are highly positive in special disease states such as peptic ulcers. It has also been reported that the toxin causes cells to be blunted in in vitro tests (Leunk RD et al, J Med Microbiol 26: 93-99, 1988).
[0005]
Furthermore, the serum antibody positive rate against Cag A is 60-63% in gastritis patients and 80-100% in gastric ulcer patients, and it is considered that Cag A is also a toxin closely related to gastric ulcer.
[0006]
It is also known that H. pylori sonicated supernatant contains heat shock protein (HSP, molecular weight 25 kDa to 30 kDa) which is a low molecular weight protein, but the biological significance of this protein is still elucidated. Has not progressed.
On the other hand, for example, the following methods have been proposed as methods for preventing and treating peptic ulcers caused by H. pylori.
[0007]
{Circle around (1)} Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-275232 discloses a method for preventing H. pylori infection by using a food containing an egg yolk-derived antibody that uses whole H. pylori cells as antigens.
[0008]
(2) JP-A-10-287585 and JP-A-11-80197 describe yolk-derived antibodies using urease (molecular weight: 32 kDa, 60 kDa) and flagella (molecular weight: 53 kDa, 54 kDa) specific to H. pylori. A substance that inhibits adhesion of H. pylori to the stomach by using a food containing the same is disclosed.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
However, in humans, it is said that H. pylori usually penetrates deeply into gastric mucosal cells and colonizes it, so that complete eradication is difficult even with drugs such as antibiotics. Therefore, when considering a patient with actual peptic ulcer, the prophylactic and therapeutic method disclosed in the above-mentioned gazette simply by inhibiting H. pylori adhesion can effectively eliminate H. pylori and suppress inflammation. Never hard to say.
[0010]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition that more effectively suppresses peptic ulcer caused by H. pylori, and a food and drink containing the same.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
To achieve the above object, peptic ulcer inhibiting composition of the present invention, Helicobacter (Helicobacter) eggs genus chicken proteins and molecular weight 80KDa～ 200 kDa protein with a molecular weight 1kDa~30kDa extracted from the bacteria were immunized as an antigen Characterized by containing an antibody obtained from the above as an active ingredient.
[0012]
Further, the food and drink of the present invention is characterized by containing the composition for suppressing peptic ulcer.
[0013]
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the composition and food / beverage products which can suppress the peptic ulcer by H. pylori effectively by ingestion can be provided.
[0014]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Peptic ulcer composition of the present invention contains a Helicobacter (Helicobacter) egg extracts chicken immunized with proteins and molecular weight 80KDa～ 200 kDa protein of the genus molecular weight 1kDa~30kDa extracted from the cells as an antigen as an active ingredient I do.
[0015]
The bacterium of the genus Helicobacter is not particularly limited, but is preferably a strain that produces cytotoxin, Helicobacter pylori. pylori), Helicobacter cinaedi), Helicobacter feneri (Helicobacter fennelliae), Helicobacter Heilmanny (Helicobacter) heilmanii), Helicobacter rappini (Helicobacter) rappini), Helicobacter felis and the like.
[0016]
Also, the molecular weight 1kDa~30kDa and molecular weight 80KDa～ 200 kDa protein may be prepared from the bacterial cells, for example, by the following method.
[0017]
The H. pylori strain producing cytotoxin is cultured according to a conventional method, and the cells are inactivated. The cells are suspended in an appropriate buffer, crushed by an ultrasonic crusher or the like, and the cells are solubilized. Preferably, the cells are solubilized using a glycine hydrochloride buffer (pH 4) as a buffer. This solution is centrifuged to collect a solubilized extraction solution, a fraction having a target molecular weight is collected by gel filtration or the like, and freeze-dried as necessary.
[0018]
Incidentally, the protein of the molecular weight 80KDa～ 200 kDa is considered to include Vac A and Cag A Judging from the molecular weight, and the protein of the molecular weight 1kDa~30kDa is believed to comprise HSP.
[0019]
As a method for immunizing chickens with the protein prepared as described above, for example, Makoto S. et al. et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56 (2): 270-274, 1992. In the present invention, when using the protein as an immunogen, a protein with a molecular weight 1KDa～30kDa, it is preferable that a protein of molecular weight 80KDa～ 200 kDa used mixed with the protein per one-to-one, more preferably , a protein of molecular weight 20KDa～30kDa, it is preferable to use a protein having a molecular weight 80KDa～ 200 kDa mixed at one to one.
[0020]
In addition, as a method for preparing an antibody from an egg produced by a chicken immunized with an antigen, an egg yolk solution is separated from the egg, the obtained yolk solution is powdered, and the powder is defatted with ethanol from the powder. It can be prepared by extraction using a buffer. In addition, the said immune egg can also be used as a peptic ulcer suppression composition as it is.
[0021]
The effective daily intake of the peptic ulcer suppression composition of the present invention is preferably 1 to 10,000 mg, more preferably 1 to 100 mg, in terms of the above antibody. If the intake is less than 1 mg in terms of antibody, the effect of suppressing peptic ulcer cannot be expected, and if it exceeds 10,000 mg, problems arise in handling and the like.
[0022]
The form of the composition for suppressing peptic ulcer of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include tablets, capsules, solutions, powders, and granules.
[0023]
The food or drink of the present invention preferably contains 0.01 to 10 g (1 to 1000 mg in terms of antibody), and preferably 0.01 to 0.1 g (1 to 100 mg in terms of antibody) of the peptic ulcer suppression composition. Is more preferred.
[0024]
The food and drink are not particularly limited and include, for example, soft drinks, yogurt, tablet confectionery, chocolate, gum, tablets and the like.
[0025]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0026]
Example 1
(1) Preparation of antigen Helicobacter pylori strain was isolated from a patient with gastric ulcer and confirmed to be a cytotoxin-producing strain. After that, the strain was cultured on a Skiroll agar medium containing 7% (v / v) equine defibrillated blood. C. for 4 days (10% CO ₂ , 10% air, humidified).
[0027]
Next, the colonies were scraped off, suspended in a physiological saline solution, to this suspension was added formalin to a concentration of 0.5% (v / v), and the suspension was left at room temperature for 18 hours to inactivate the cells. .
[0028]
Next, the cells were collected by centrifugation at 3,000 × g for 10 minutes, and washed three times with physiological saline. The bacterial cells were dispersed in physiological saline at a concentration of 1 × 10 ⁸ CFU / ml to obtain an antigen solution A.
[0029]
Urease is separated by the method described in JP-A-10-287585, and after confirming urease A (32 kDa) and urease B (60 kDa) by SDS-PAGE, the protein content becomes 1.0 mg / ml. A solution was prepared and used as antigen solution B.
[0030]
Further, the antigen solution A was suspended in a glycine hydrochloride buffer (pH 4) and crushed by an ultrasonic crusher, and the cells were solubilized (37 ° C. × 2 hours). After the solubilized extraction solution and the insoluble portion were centrifuged (8,000 rpm × 20 minutes), the molecular weight was 1 kDa to 30 kDa by gel filtration (YMC-Pack Diol-200, 500 × 8.0 mm ID, YMC). An 80 kDa to 200 kDa cell extract protein solution was fractionated and freeze-dried to obtain respective powders.
[0031]
A solution was prepared so that the obtained cell extract protein had a protein content of 1.0 mg / ml, and a protein solution having a molecular weight of 1 kDa to 30 kDa was used as an antigen solution C, and a protein solution having a molecular weight of 80 kDa to 200 kDa was used as an antigen solution D. Antigen solution E containing 1: 1 protein content was used.
[0032]
(2) Preparation of immunized egg yolk The laying hens (White Leghorn) are divided into five groups, and the above five types of antigen solutions (antigen solution A, antigen solution B, antigen solution C, antigen solution D, antigen solution E) are used per bird. 1 ml intramuscular injection. After the first immunization, the yolk was separated from the chicken eggs collected from each group every week, and the specific antibody titer was measured every week.
[0033]
The measurement of the specific antibody titer in the chicken egg yolk was performed by enzyme immunoassay (hereinafter, referred to as ELISA) by diluting each yolk fluid collected every week by 2,000 times. When the specific antibody titer was lowered every week, booster immunization was performed using the five kinds of antigen solutions obtained in Example 1.
[0034]
After the additional immunization, the specific antibody titer was measured by the same ELISA method as described above. When the antibody titer became stable, chicken eggs were collected and used as immunized eggs.
[0035]
1 kg of each immunized egg was homogenized with a homomixer and then spray-dried to prepare a powder to obtain an egg yolk powder (antibody-containing egg yolk powder). To 470 g of the above-described antibody-containing egg yolk powder, ethanol was added in a 5-fold amount to perform defatting, and the defatting was repeated until the lipid content was 1% or less. A PBS buffer is added to the obtained defatted egg yolk powder to extract the yolk water-soluble protein, and the extracted solution is freeze-dried to make a powder. Antibody powder A (powder obtained from immunized egg of antigen solution A), antibody powder B (Powder obtained from immunized egg of antigen solution B), antibody powder C (powder obtained from immunized egg of antigen solution C), antibody powder D (powder obtained from immunized egg of antigen solution D), antibody powder E (powder obtained from immunized eggs of antigen solution E) was obtained. Further, using a commercially available egg, a powder obtained by the same method as above was used as a control powder.
[0036]
(3) Evaluation of antibody activity against cytotoxic factor The immobilized antigen of ELISA was used for (1) whole cells of H. pylori, (2) urease, (3) protein extracted from 1 kDa to 30 kDa, and (4) 80 kDa. Coating was performed using a cell extract protein of ~ 200 kDa and (5) a cell extract protein mix of 1 kDa ~ 30 kDa and 80 kDa ~ 200 kDa (1: 1).
[0037]
The antibody powders A to E and the control powder were prepared at a concentration of 1 mg / ml, and diluted ten times, and analyzed by the ELISA method. The concentration at the same color development value was several times that of the control powder. Was determined, and the multiple was evaluated as a specific antibody titer. Table 1 shows the results.
[0038]
[Table 1]

[0039]
From Table 1, it can be seen that the antibody contained in the antibody powder E slightly reacts with all the cells, but shows a high specific antibody titer particularly for the cell extract protein having a molecular weight of 80 kDa to 200 kDa. In addition, since the antibody contained in the antibody powder C has a relatively low specific antibody titer against the protein extract of 1 kDa to 30 kDa, it is understood that the protein extract of the cell has weak antigenicity. In addition, it can be seen that the antibody contained in the antibody powder E does not react with the urease antigen.
[0040]
Example 2 (Cell emptying suppression effect test)
Using HeLa cells, a blanking test with a toxin possessed by H. pylori was performed as follows.
[0041]
9.4 g of Eagle MEM medium (manufactured by Nissui) was dissolved in distilled water to make a total volume of 1,000 ml. Thereafter, the solution was completely sterilized in an autoclave (121 ° C., 15 minutes), cooled to room temperature, and 15 ml of a sterilized 10% aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added. It was prepared by adding 0.292 g of L-glutamine sterilized by filtration before use and fetal calf serum and used as a culture solution of HeLa cells.
[0042]
Experiments were performed in what utmost small passage, after checking the state of the cell, so the cell by counter reaches 10 ^3, was applied to a sterile plate 8 holes.
[0043]
Then, (1) sterile physiological saline (negative control) and (2) a supernatant (positive control) obtained by centrifuging (1,000 rpm, 10 minutes) the H. pylori culture solution described in Example 1 were added. After confirming the cell blanking by the positive control, the antibody powders A to E obtained in Example 1 were added to the above (2) so as to be 0.01, 0.1, 0.5 and 1%. 0.1 ml of each solution was added, and the state of the cells after 24 hours was observed with a microscope. Table 2 shows the results.
[0044]
[Table 2]

[0045]
From Table 2, it can be seen that the antibody powder C hardly suppresses the cell emptying phenomenon, whereas the antibody powder D suppresses the cell emptying phenomenon. In particular, it can be seen that the antibody powder E containing both antibodies dramatically suppresses the cell emptying phenomenon.
[0046]
Example 3 (Test for disinfection effect by mouse)
BALB / c mice (male, 8 weeks old) were used to carry out a bacteria elimination test using the present composition for suppressing peptic ulcer.
[0047]
To the above mice, the H. pylori strain (1 × 10 ⁹ ) isolated in Example 1 was orally administered. One week later, a part of the test group was sacrificed, and the number of H. pylori in the stomach was measured to determine the number of H. pylori in the stomach. Was established. Thereafter, the test animals were divided into six groups (10 animals per group) and fed the following feed (free intake).
[0048]
1 group: normal feed 2 groups: normal feed + antibody powder A (0.01%, 0.1%, 1%)
Group 3: normal feed + antibody powder B (0.01%, 0.1%, 1%)
Group 4: normal feed + antibody powder C (0.01%, 0.1%, 1%)
Group 5: normal feed + antibody powder D (0.01%, 0.1%, 1%)
6 groups: normal feed + antibody powder E (0.01%, 0.1%, 1%)
[0049]
After breeding for 2 months on the above feed, the abdomen was opened and the number of H. pylori in the stomach was measured. Table 3 shows the results.
[0050]
[Table 3]

[0051]
From Table 3, it can be seen that the group to which the antibody powder E was administered surprisingly had almost the same high eradication effect as the group to which the antibody powder B was administered.
[0052]
Example 4 (Test for Inhibition of Inflammation and Ulcer by Gerbils)
Mongolian gerbils are recognized as model animals that become infected with H. pylori (settle deep into gastric mucosal cells) and develop severe inflammation (gastric ulcer) with bleeding at a very high probability 4 to 6 months later. It is said that the situation is similar to that of a gastric ulcer patient.
[0053]
Four months after administering 1 × 10 ⁹ H. pylori strains isolated in Example 1 using this model animal, a part of the test group was sacrificed, and the stomach was opened to confirm the ulcer state in the stomach. After confirming ulcers with bleeding in all of the sacrificed test animals, the test animals were divided into 6 groups (8 animals per group) and fed the following feed (free intake).
[0054]
1 group: normal feed 2 groups: normal feed + antibody powder A (0.01%, 0.1%, 1%)
Group 3: normal feed + antibody powder B (0.01%, 0.1%, 1%)
Group 4: normal feed + antibody powder C (0.01%, 0.1%, 1%)
Group 5: normal feed + antibody powder D (0.01%, 0.1%, 1%)
6 groups: normal feed + antibody powder E (0.01%, 0.1%, 1%)
[0055]
After breeding for 2 months on the above-mentioned feed, the abdomen was opened, and the number of H. pylori in the stomach and the status of ulcer with gastritis / bleeding were scored based on the following five evaluation criteria to obtain an average score of 8 animals. .
[0056]
0: No symptoms 1: Swelling red (one spot)
2: Red swelling (2 places)
3: Red swelling (3 or more places)
4: Bleeding is observed (one place)
5: countless bleeding (two or more)
Table 4 shows the results.
[0057]
[Table 4]

[0058]
From Table 4, it can be seen that although the group to which the antibody powder B and the antibody powder E were administered had a higher eradication effect than the group to which the antibody powder A was administered, all the groups were completely sterilized as in Example 3. It can be seen that the state has not been approached.
[0059]
In addition, the inflammatory state hardly recovered in the group to which the antibody powder A and the antibody powder B were administered, and the tendency to recover only slightly in the group to which the antibody powder C and the antibody powder D were administered. On the other hand, it can be seen that in the group to which the antibody powder E was administered, a remarkable inflammatory recovery effect was observed. From these results, for the first time, it can be seen that a surprising anti-inflammatory effect can be obtained by combining a protein antibody containing Vac A and Cag A with a protein antibody containing HSP.
[0060]
Example 5
Hereinafter, formulation examples of foods and drinks containing the peptic ulcer suppression composition of the present invention will be described.
[0061]
(1) Prescription example of yogurt 96% milk
0.5% skim milk powder
Peptic ulcer inhibitory composition of the present invention 3%
Water 0.5%
[0062]
(2) Formulation example of granule powder Milk 50%
Egg 40%
10% sugar
Peptic ulcer inhibitory composition of the present invention 3%
[0063]
(3) Formulation example of tablet for preventing gastritis, gastric ulcer or duodenal ulcer Peptic ulcer inhibitory composition of the present invention 3%
Dextrin 70%
[0064]
【The invention's effect】
According to the present invention described above, as active ingredient, Helicobacter (Helicobacter) antibody and molecular weight obtained from chicken eggs that a protein of the extracted molecular weight 80KDa～ 200 kDa from bacteria immunized as an antigen of the genus 1kDa~30kDa A surprising anti-inflammatory effect could be obtained by combining antibodies obtained from eggs of chickens immunized with the above protein as an antigen. Therefore, by containing the present antibody, it is possible to provide a composition and a food or drink which can effectively suppress peptic ulcer caused by H. pylori by oral ingestion.

Claims

Digestion, characterized in that it contains a Helicobacter (Helicobacter) genus antibody proteins and molecular weight 80kDa~ 200k Da protein with a molecular weight 1kDa~30kDa extracted from the cells obtained from chicken eggs that had been immunized as an antigen as an active ingredient A composition for inhibiting ulcers.

A food or drink comprising the composition for suppressing peptic ulcer.