~ WO 95/2580~ 2 1 ~ ~ 2 ~
I
CERVEAU (BDNF) La présente invention concerne des vecteurs l~ d'origine virale et leur utilisation pour le traitement et/ou la prévention des maladies r~ vu~ el~iL;vc O.
s Plus ~f~lLi.,ul;èlellleliL, elle concerne des adénovirus r~PfntnhinAntc comportant une séquence d'ADN codant pour le facteur ~ ulvLI~lli lue dérivé du cerveau (BDNF, "brain-derived r~ivLlvpll;c factor"). L'invention concerne egalement la préparation de ces vecteurs, les ~ Af~ ` les contenant et leur utilisation Lllél,lpeuL~uè, notamment en thérapie génique.
0 Les maladies l~ulvdc~ aL;veo le~ lLel,L une large part des dépenses de santé dans les pays orf~iflf~nt~ Y, pa~t qui ne cesse de s'accroitre suite au v;~
de la population. Au titre de ces affe.~,tions, on peut citer notamment la maladiê
d`Alzheimer, le maladie de Parkinson, la chorée de ~ ntingtnn, la sclérose latérale fllll.rULlv~lui~e~-. etc. Les signes ~ et l'étiologie de ces maladies sont fort variés, mais toutes ces maladies résultent d'une pe~te l,lv,i leOO;~ de ceriulesneuronales dans le systeme nerveu~.~ central, patfois au sein de structure très localisées comme la substance noire dans la maladie de Parkinson Bien que certains traitements rhorm~r~f~ln~if~ PC palliatifs soient déjà disponibles, leurs effets sont li,1,3L~..,~.L
limités La présente invention décrit une approche Ill.~Al~..l;rl~,f~ nouverie, 20 r^-tirll~iPtPmPnt avantageuse pour le traitement de ces maladies. Plus ~O.I;.~"':.` ~,.,I
la présente invention décrit des vecteurs permettant de IJlull~uuvv;l d;i`éeLelll~llL la su.~vie des ceriules nenales impliquées dans ces rAthnlngiPc, par expression efficace et localisée de cerLains facteurs lrophiques.
Les facteurs trophiques sont une classe de molécules ayant des propriétés de 2s stimu'iation de la croissance neuritique ou de la survie des cel1iules nerveuses. Le premier facteur possédant des propriétés ll~uuvLiu,ul,iq~_O, le NGF ("Nerve Gro vth Factor"), a été caractérisé i'i y a une quarantaine d'années (pour revue, voir Levi-Montalcini et Angelleti, Physiol. Rev. 48 (1968) 534). Ce n'est que récemment que d`autres facteurs lleuiuLiul,l,;q~,~O ont été identifiés, et notamment le facteur I.~ vLru~ll; Lue dérivé du cerveau (BDNF) ~'Thoenen, Trends in NeSci. 14 (199I)165). Le BDNF est ume protéine de 118 acides aminés et de poids molécu'iaite 13,5 kD. Tin vitro, le BDNF stimule la fotmation de neurites et la survie en cu'iture des neutvneS v ~' eO de la rétine, des muLvlleuuvllf~ de la moelle épiniète, des ~ 8~2QO
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neurones ,' ' ~ . du septum ainsi que des neurones I I .. i du - (revue par Lindsay in N~ UULIUI~I~;C Factors, Ed, (1993) 257, Academic Press). Toutefois, bien que ses prûpriétés soient i...~., I'application 11,. .,.~,. ..1;.1...~ du BDNF se heurte à différents obstacles. En particulier, I'absence de S ~ du BDNF limite toute utilisatiûn Ill~ A~ Par ailleu~s, il n'existe pas de moyens efficaces permettant de délivrer le BDNF de manière durable et localisée à certaines régions desirées de l'organisme. Enfin, il est essentiel que le BDNF délivré soit actif et puisse exercer une activité l~ in vivo.
La présente invention appotte une solution IJal Liculi~ lcl.L avantageuse à ces problèmes. La présente invention réside en effet dans la mise au point de vecteurs ,a.~i~ul;~le.,.e.l~ efficaces pour délivrer in vivo et de manière localisée, des quantités actives de BDNF. Dans la demande copendante n PCTIEP93/02519, il a été montré que les adenovirus pouvaient etre utilisés pour le 5 transfett de gènes in vivo dans le système nerveux. La présente invention concerne des ~;VIIsLluc~iul~s nouvelles, ~a~ ,uli~ L adaptées et efficaces pour le transfert d'un gène spécifique dans le système nerveux. Plus I L~ uli~ ll~,lll, la présente invention concerne lm adénovirus l~col~birlal-L ~:VIII~II ' une séquence d'ADN codant pour le facteur nèulVLIUI lli.l..s dérivé du cerveau (BDNF), sa préparation, et son utilisation 20 pour le traitement etlou la prévention des maladies r..~vd~ aLvc:~.
La d~lllàl~ a maintenant montré qu'il est possible de construire des adénovirus ~ contenant une séquence codant rour le BDNF, d'ddllliul;i~L~
ces adénovirus ~ in vivo, et que cette ' ~ l rermet une expression stable et localisée de quantités al~ actives de BDNF in vivo, 2s et en particulier dans le systeme nerveux, et sans effet cyt~lrS~ iq~ Les propriétés particulièrement avantageuses des vecteurs de l'invention découlent notamment de la consttuction utilisée (adénovirus défectif, délété de certaines régions virales), du promoteur utilisé pour l'exrression de la séquence codant pour le BDNF
(promoteur viral ou tissu-spécifique de préférence), et des méthodes d'~
30 dudit vecteur, permettant l'exrtession erficace et dans les tissus appropriés du BDNF.
La présente invention foutnit ainsi des vecteurs viraux utilisables di e~t~ .lL en thérapie génique, particulièrement adaptés et efficaces pour diriger l'expression du BDNF in vivo. La présente invention offre ainsi une nouvelle approche particulièrement avantageuse pour le traitement et/ou la prévention des maladies35 I~uuvd~ aLv~. ~ WO 95/2580~ 2 1 ~ ~ 2 ~
I
BRAIN (BDNF) The present invention relates to vectors l ~ of viral origin and their use for the treatment and / or prevention of diseases r ~ seen ~ el ~ iL; vc O.
s More ~ f ~ lLi., ul; èlellleliL, it relates to adenoviruses r ~ PfntnhinAntc comprising a DNA sequence encoding the brain-derived factor ~ulvLI~lli lue (BDNF, "brain-derived r~ivLlvpll;c factor"). The invention also relates to the preparation of these vectors, the ~ Af~ ` containing them and their use Lllél, lpeuL ~ uè, particularly in gene therapy.
0 Diseases l~ulvdc~ aL; veo le~ lLel,L a large part of the expenditure of health in the countries orf~iflf~nt~Y, p~t which continues to increase following the v;~
Population. Under these affe. ~, tions, we can cite in particular the disease Alzheimer`s disease, Parkinson`s disease, ~ntingtnn`s chorea, lateral sclerosis fllll.rULlv~him~e~-. etc The ~ signs and etiology of these diseases are strong varied, but all these diseases result from a small amount of neuronal ceriules in the central nervous system, sometimes within very localized structures.
such as the substantia nigra in Parkinson's disease Although some treatments rhorm~r~f~ln~if~ PC palliatives are already available, their effects are li,1,3L~..,~.L
The present invention describes an approach Ill. ~ Al ~ ..l; rl ~, f ~ nouverie, 20 r ^ -tirll ~ iPtPmPnt advantageous for the treatment of these diseases. More ~OI;.~"':.` ~,.,I
the present invention describes vectors allowing IJlull ~ uuvv; ld; i`éeLelll ~ llL the su. ~ life of nenal ceriules involved in these rAthnlngiPc, by effective expression and localization of certain trophic factors.
Trophic factors are a class of molecules with properties of 2s stimulation of neuritic growth or nerve cell survival. the first factor with ll~uuvLiu,ul,iq~_O properties, the NGF ("Nerve Gro vth Factor"), was characterized about forty years ago (for review, see Levi-Montalcini and Angelleti, Physiol. Rev. 48 (1968) 534). It is only recently that other factors lleuiuLiul,l,;q~,~O have been identified, and in particular the factor I.~vLru~ll; Lue brain derivative (BDNF) ~'Thoenen, Trends in NeSci. 14 (199I)165). BDNF is a protein with 118 amino acids and a molecular weight of 13.5 kD. In vitro, BDNF stimulates the formation of neurites and the survival in culture of neutvnes v ~ ' eO of the retina, muLvlleuuvllf ~ of the spinal cord, ~ 8~2QO
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neurons ,'' ~ . of the septum as well as neurons II .. i of the - (reviewed by Lindsay in N~ UULIUI~I~; C Factors, Ed, (1993) 257, Academic Press). However, although its properties are i...~., the application 11,. .,.~,. ..1;.1...~ of the BDNF comes up against various obstacles. In particular, the absence of S ~ of the BDNF limits any use Ill~ A~ Incidentally, there is no no effective means to deliver BDNF in a long-lasting and localized to certain desired regions of the body. Finally, it is essential that the BDNF delivered is active and can exert activity in vivo.
The present invention brings an advantageous IJal Liculi ~ lcl.L solution to these problems. The present invention lies in fact in the development of vectors , a. ~ i ~ ul; ~ le., .el ~ effective in delivering in vivo and in a localized manner, quantities active BDNF. In copending application n PCTIEP93/02519, it was shown that adenoviruses could be used for the 5 in vivo gene transfer into the nervous system. The present invention relates to ~; VIIsLluc ~ iul ~ s news, ~ a ~, uli ~ L adapted and effective for the transfer of a specific gene in the nervous system. More IT ~ uli ~ ll ~, lll, the present invention relates to the adenovirus l ~ col ~ birlal-L ~: VIII ~ II 'a DNA sequence encoding the brain-derived nèulVLIUI lli.l..s factor (BDNF), its preparation, and its use 20 for the treatment andlor prevention of diseases r .. ~ vd ~ aLvc: ~.
The d~lllàl~ has now shown that it is possible to build adenovirus ~ containing a sequence encoding rour BDNF, ddllliul; i ~ L ~
these adenoviruses ~ in vivo, and that this '~ l rermet a stable and localized expression of al ~ active amounts of BDNF in vivo, 2s and in particular in the nervous system, and without effect cyt ~ lrS ~ iq ~ The particularly advantageous properties of the vectors of the invention derive in particular the construction used (defective adenovirus, deletion of certain regions viral), of the promoter used for the expression of the sequence coding for BDNF
(preferably viral or tissue-specific promoter), and methods for 30 of said vector, allowing the effective expression and in the appropriate tissues of BDNF.
The present invention thus provides viral vectors that can be used di e ~ t ~.
gene therapy, particularly suitable and effective for directing the expression of BDNF in vivo. The present invention thus offers a new approach particularly advantageous for the treatment and / or prevention of illnesses35 I ~ uuvd ~ aLv ~.
2 1 8~2~
wo ss/2s804 . ~ ~
Un premier objet de l'invention réside donc dans un adénovirus "~. "~
défectif ;ul}lp~ llL une séquence d'ADN codant pour le facteur l-., u-,L-~l~ uedérivé du cerveau (BDNF) ou un dérivé de celui-ci.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un tel adénovirus s e ' ~ défectif pour la préparation d'ume ~:o~ ~s;[io~ P~ -^ destinée au traitement ou à la prévention des maladies llèu ud~ .dLive~.
Le facteur rl~uLIu~ ue dérivé du cerveau (BDNF) produit dans le cadre de la présente invention peut être le BDNF humain ou un BDNF animal. La séquenced'ADN codant pour le BDNF humain et pour le BDNF de rat a été clonée et 0 séquencée (l\l~;~u,~ ,e et al., Genomics 10 (1991) 558), ainsi que notamment la séquence codant pour le BDNF de porc (Leibrock et al., Nature 341 (1989) 149).
Prpr~ sment à leur illcul~Julaliull dans un vecteur adénovirus ælon l'invention, ces séquences sont d~ modifiées, par exemple par m~lf9~n9~P dirigée, en particulier pour l'insertion de sites de restriction appropriés. Les séquences décrites dans l'art antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selonl'invention, et des adaptations préalables peuvent s'avérer nécessaires, pour obtenir des e,.~l eS .;UI~S illl~UI Lall~e~ (voir exemple 1.2.) . Dans le cadre de la présente invention, on préfère utiliser ume séquence d'ADN codant pour le facteur ~ UL-u~ dérivé du cerveau humain (hBDNF). Par ailleurs, comme indiqué ci-avant, il est également possible d'utiliser ume :u-~LIue~iull codant pour un dérivé du BDNF, en particulier un dérivé du BDNF humain. Un tel dérivé comprend par exemple toute séquence obtenuepar mutation, délétion et/ou addition par rapport à la séquence native, et codant pour un produit conservant l'une au moins des propriétés biologiques du BDNF (effet trophique et/ou di~él, ). Ces ".~ ;ri.~ peuvent être réalisées par les 2s techniques connues de l'homme du métier (voir techniques générales de biologie moléculaire ci-apres et exemple 2). L'activité biologique des dérivés ainsi obtenus peut ensuite être aisément ~PfP minPP, comme indiqué notamment dans l'exemple 3.. Lesdérivés au sens de l'invention peuvent également être obtenus par hybridation à pattir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la sequence native ou un 30 fragment de celle-ci.
Ces dérivés sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité
pour leurs sites de fixation, des séquénces permettant une expression améliorée rn vivo, des molécules présentant une plus grande résistance aux protéases, des molécules Wo 9s/2s804 A _ I Ir ~ t r ayant une efficacité ~ plus grande ou des effets secondaires moirldres, ou év~nh~ m~nt de nouvelles propriétés hi~ giq-~
Parrni les dérivés préférés, on peut citer plus particulièrement les variantsnah~rels, les molécules dans lesquelles un ou plusieurs résidus ont été substitués, les s dérivés obtenus par délétion de régions 1l' ul~el ~ ~.lalll pas ou peu dans l'interaction avec les sites de liaison considérés ou exprimant une activité indésirable, et les dérivés comportant par rapport a la séquence native des résidus su~ e:~, tels que par exemple un signal de sécrétion et/ou un peptide de jonction. De manière pà~ie~l;è~elllcll~ d~a..Lav~e, la séquence de la préænte invention code pour le lo BDNFprécédé de la région pro native (proBDNF).
Par ailleurs, il est ~alLi~ .èl~ lL important pour une meilleure mise en oeuvre de la présente invention que la séquence utilisée contienne également un signal de sécrétion permettant de diriger le BDNF synthétisé dans les voies de sécrétion des oellules infectées, de manière à ce que le BDNF synthétisé soit libéré dans les 15 Culll~al Li~ A " ~ et puisse activer ses récepteurs. Le signal de sécrétion est av ' V ' le propre signal du BDNF. Mais il peut également s'agir d'un signal de secrétion hétérologue ou meme artificiel.
La séquence d'ADN codant pour le facteur ll~,uuL u~l-iu~.~ dérivé du cerveau 20 utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN génomique (ADNg), ou une ~:u--~L~ucLiu~l hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut également s'agir de séquences .Ll.éLi-iu~ ou ~el.li~y--Ll,éLi-l..w. Il est à noter que dans la séquence génomique codant pour le BDNF, les introns sont localisw dans lw régions non codantes. De 25 manière ~a~ ,ul;è.ell,~..L avanhageuse, on utilise un ADNc ou un ADNg. En particulier, I'utilisation d'un ADNg peut permettre une meilleure expression dans les cellules humaines.
Dans un premier mode de réalisation de l'invention, I'ddel-UY;-us comprend donc une séquence d'ADNc codant pour le facteur llèuluLlu~ , dérivé du cerveau 30 (BDNF). Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, I'd~é..uv;.u~
comprend une séquence d'ADNg codant pour le facteur llèuuuLLulJIl;~ue dérivé du cerveau (BDNF). AY~ - l la séquence d'ADN code pour le proBDNF et, de preférence, le préproBDNF.
Wo 95/25804 2 ~ 8 ~ r~ c t s Av l~y~r.~rll.. - 1 la séquence codant pour le BDNF est plac~e sous le contrôle de signauA permettant son expression dans les cellules nerveuses.
Préférr^~iPIlPmPnt il s'agit de signaux l'eA~ ;U~ élélulog.l~,:" c'est-à-dire de si~naux différents de ceuA naturellement lP~ de l'expression du BDNF. Il 5 peut s'agir en particulier de séquences " ~ de l'expression d'autres protéines, ou de séquences byilalr~ ... Notamment, il peut s'agir de séquences ~ vlli~eS degènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences ,c,ulllul;cèb issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences 1~ r5 issues du génome d'un virus, y compris l'adc~.uv;lus utilisé. A
l o cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs ElA, MLP, CMV, LTR-RSV, etc.
En outre, ces séquences d'~Aplr,D~;vll peuYent être modifiées par addition de séquenoes d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. Il peut en effet être 1~ lir~ . ll intéressant d'utiliser des signaux dl~,AI.IL.,.~.. JII actifs r;~l - - -- -1 OU llaj~liLall~ dans les oellules nerveuses, de manière à ce que la 5 séquence d'ADN ne soit exprimée et ne produise son effet que lorsque le virus a err~Lv~ infecté une cellule nerveuse. A cet égard, on peut citer par exemple lespromoteurs de l'énolase neurone-spécifique, de la GFAP, etc.
Dans un premier mode de réalisation particulier, I'rnvention concerne un adénovirus ~ CUIIIb;~ défectif ~u---~". une séquence d'ADNc codant pour le 20 facteur ,,~ullù~ll;que dérivé du cerveau humain (hBDNF) sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.
Dans un autre mode de réalisation particulier, I'invention conceme un adénovirus ., - défectif comprenant une séquence d'ADNg codant pour le facteur rl~u~lv~ u~ dérivé du cerveau humain (hBDNF) sous le contrôle du 2s promoteur LTR-RSV.
La Irll~ - a en effet montre que le promoteur LTR du virus du sarcome de rous (RSV) permettait une expression durable et importante du BDNF
dans les cellules du système nerveux, notamment central.
Toujours dans un mode préféré, I'invention concerne un adénovirus 30 ~r~ = ' défectif culll~lcllal-i une séquence d'ADN codamt pour le facteur n~ullu~ dêrivé du cerveau humain (hBDNF) sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans le système nerveux. Un mode IJal~;cUl;èlel~ ll préféré de mise en oeuvre de la présente invention réside dans un adénovirus recombinant défectif comprenant les séquences ITR, une séquence 35 permettant l'- ~ . une séquence d'ADN codant pour le &cteur 2~ 8~2~
Wo 95/25804 P~llr~, ~v O
AeV1~ dérivé du cerveau humain (hBDNF) ou un dérivé de celui-ci sous lecontrôle d'uA promoteur permettant uAe expression majoritaire dans le système nerveux, et dans lequel le gène E1 et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 est non s Les adénovirus défectifs selon l'invention sont des adénovirus iAcapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. G, ' t, le génome des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-" " soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence d'ADN codant pour le BDNF.
PréfPrPntipllpmpnt~ le virus défectif de l'invention conserve les séquences de son génome qui sont nécessaires à 1'~ des particules virales. Encore plus préférPntiPIlPmPnt comme indiqué ci-avant, le génome du virus ~ défectif selon l'invention comprend les séquences rrR, une séquence permettant r. ~ . Ie gène El non fonctionAel et au moins un des gènes E2, E4, L,1-L5 non r~
Il existe différents sérotypes d'adenovirus, dont la structure et les propriétésvarient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la presente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou eAcore simienAe (exemple: SAV). De 2s préférence, I';ldé,~ ;.vs d`origine aAimale est un adénovirus canin, plus UA adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise daAs le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Les adénovirus ~ défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique cormue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991)195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par l~ "- homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN codant pour le BDNF. La ~ homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire W095/~5804 2 ~ Q~ /r~ -appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de preférence (i) être ~ r~"ll.~ par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de ~ Ia pa~tie du génome de l'Gdéll.,virus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de ~ A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignee de rein, ' ~IUIGil>a humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (19~.7) 59) qui contient nrf~ nPnt. intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). Des stratégies de uvl~L u~ de vecteur~ dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes n FR 93 05954 et F'R 93 08596 qui sont illc~ à la présente par référence.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également toute utilisation d'un adénovirus tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une destinée au traitement etlou à la prévention des maladies ~ ;V~. Plus }~G-Li~uli~ ,l.L, elle conceme toute utilisation de ces adénovirus pour la préparation d'une ~ 1-1, "~ q~p destinée au traitement et/ou à la prévention de la maladie de Parkinson, de la maladie d'Alzheimer, de la sclérose latérale Glll~ LIu~lliu,~.., (ALS), de ia nialadie d'T~ntin~t--n de répilepsie et de la démence vasculaire.
La présente invention concerne également une e~mrt~e*if,n l~
uulll~ alll un ou plusieurs adénovirus IPf~ dé&cti& tels que décrits pl~ I Ces ~ l ", P~ peuvent être formulées en vue d'h~LIluli~Ll~lliw~ par voie topique, orale, parentérale, intranasale, vciu.~,~,; I "" ,~, ,,l..: ~, sous-cutanée, illll~10CUlailt~ U . etc. De préférence, les 25 e~ P~ -. de l'invention contiennent un véhicule ,vl-a..l.a~
tiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe dans le système nerveux du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, i~t~niq -P~. ou de ~:O~I.p~a;liO.~S sèches, notamment Iyophilisf~es, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum IuI.~iulogiqu~, permettent la30 ~ 4,lilulic..l de solutes injectables. L'injection directe dans le système nerveux du patient est dVa~ . car elle permet de concentrer l'effet ll~PI,~ IJ au niveau des tissus affectés. L'injection directe dans !e système nerveux central du patient est 1 réalisée au moyen d'un appareil d'injection ~L~ Ld~ u~:. L'emploi d'un tel appareil permet en effet de cibler avec une grande précision le site d'injection.
wos5/2580s ~ 2~ rl ~
A cet égard, I'invention concerne également une méthode de traitement des maladies lleuL~ n~.dliv~ comprenant 1'~ l a un patient d'un adénovirus ,~.",.1,;..~"1 tel que défini ci-avant. Plus pG LiCu]i,:.el..~, l'invention concerne une méthode de traitement des maladies l.~ UU ~ ldliV~ comprenamt 1'~
s ~L~L~. ~ique d'un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant.
Les doses .I'~ )ViLU~ le~,blll~ GIlL défectif utilisées pour l'injection peuventêtrê adaptées en fonction de différents paramètres, et notammênt en fonction du mode II utilisé, de la pathologie concernée ou encore dê la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus le~ selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises ent~e 104 et 1014 pfulml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond aupouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'unê culture cellulaire appropriée, puis mêsure, c~ l après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de ~ 1 du titre pfu d'une solution virale sont bien .~. u ".. ~f.'.: dans la littérature.
Un autre objet de rinvention conoerne toute cellule de mammifère mfectée par un ou plusieurs adénovirus IP.~ defectifs tels que décrits ci-dessus. Plus i~,UIi~L~ ll, I'invention concerne toute population de cellules humaines infectée par ces adénovirus. Il peut s'agir en particulier de fihn~hlo~fPc myoblastes, 20 hépatocytes, I~t ld~inO~ , cellules Pn~ thPliAIPi cellules gliales, etc.
Les cellules selon l'invention peuvent etre issues de cultures primaires. Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de rhomme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agissant plus particulièrement de fihn~h~o~tP~, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de 2s biopsies, par exemple selon la technique decrite par Ham [Methods Cerl.Biol. 21a (1980) 255]. Ces cellules peuvent être utilisées diLe~Lt~ llL pour l'infection par les adénovirus, ou conservees, par exemple par ~ n~PiAtifm, pour 1'~ de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de 30 banques préétablies.
Les cellules en culture sont ensuite inffflées par des adénovrrus ,.~.,,,11~;.,~."~, pour leur conférer la capacité de produire du BDNF. L'infection est réalisee in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, 3s rhomme du métier peut adapter la multiplicité d'infection et i,.~ I fl'~ Ie nombre wossl2s8o~ 2 1 842GO ~l/r~
de cycles d'infection réalisé. Il est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilite appropriées lorsque les cerlules sont destinées a une r ' ~Li~ in vivo. Les doses d'adénovirus rèc~lllbindlll utilisées pour l'infection des ceLules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché. Les s conditions décrites ci-avant pour l'r~ in vivo peuvent être appliquées à
l'infection in vitro.
Un autre objet de rinvention concerne un implant ~:O~ lell~L des cellules mammifère infectées par un ou plusieurs adénovirus ~ défectifs telles que décrites ci-dessus, et une matrice ~ ^ e. Préfén~nt~ m~ t, les implants selon I'invention ~,ollllJI~,l~nC.~L 105 à lol cellules. Plus préfér~ lPm~nt, ils en 106 à 108.
Plus ~ lelllell~, dans les implants de rinvention, la matrice extracellulaire comprend un compose gélifiant et év~nt~ ml~nt un support permettant l'ancrage des ceriules.
Pour la préparation des implants selon l'invention, différents t,vpes de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilises pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la cnn~titl-tinn d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'a&ésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le collagène, la gélatine, les 20 ~Iy~ll~ o~ly~ , la ~il,.wle~ e, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du collagène. Il peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus prefér~n~ m~nt on utilise du collagène de type 1.
Comme indiqué ci-avant, les l~ kl~ - selon l'invention ~ lelul~
AvA~ r,.- ~ un support permettant l'ancrage des cellules. Le terme ancrage 2s désigne toute forme d'illt~.d~ biologique et/ou chimique et/ou physique entrdînant l'a&ésion et/ou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux.
On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou bio-compatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de ~ n~ eLllylèl~e 30 (PI~E) ou un support d'origine biologique.
Les implants selon l'invention peuvent étre implantés en différents sites de l'organisme. En particulier, 1';",l,' A~ ll peut être effectuée au niveau de la cavité
r-~ritnn~, dans le tissu sous-cutané (région sus-pubienne, fosses iliaques ou inguinales, etc), dans un organe, un muscle, une tumeur, le système nerveux central, wog5n5804 2~ ;8~2~ P l/r~
ou encore sous une muqueuse. Les implants selon l'invention sont pd Li~,uliè.~ lt avantageux en ce æns qu'ils permettent de controler la libération du produit ll,f~ dans l'organisme: Celle-ci est tout d'abord déterrninée par la multiplicité
d'infecuon et par le nombre de cellules implantées. Ensuite, la libération peut être s contrôlée soit par le retrait de l'implant, ce qui arrête .i~rti~ ,.,t le traitement, soit par l'utilisation de systèmes d'~)-~;v-- régulable, permettant d'induire ou de réprimer l'expression des gènes 1~
La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le traitement ou la prévention des maladies .-eulu~ éld~iv~. Elle est tout particulièrement adaptée au traitement des maladies d'Alzheimer, de Parkinson, de ~--nfln~ffm et de rALS. Les vecteurs d~ v~ilfJu,~ ælon l'invention présentent en outre des avantages importants, lies notamment à leur très haute efficacité d'infection des cellules nerveuæs, permettant de réaliær des infections à partir de faibles volumes de suspension virale.
De plus, I'infection par les adénovirus de l'invention est très localisée au site d'injection, ce qui évite les risques de diffusion aux structures cérébrales voisines.
En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel que les ovins, les bovins, les animaux ~ (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La présente invention sera plus c .~ décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Lf~ende des f~ res hgure 1: Rt l..~s~..i< ii~JI~ du vecteur pXL2244 Figure 2: Représentation du vecteur pSh-Ad-BDNF
2s Techni~les ~énérales de biolo~ie ~
Les méthodes l'~ lf~ utiliæes en biologie moléculaire telles que les extractions yl~fll~Lv~ d'ADN 1~ , la f f~ntrif~ finn d'ADN 1~ ;fll~f en gradient de chlorure de césium, l~ JIIUI~ sur gels d'agarose ou d'acrylamide, lapufification de fragments d'ADN par f I~,L uéluLioll~ les extraction de protéines au 30 phénol ou au phénol-~ ,-vru--l-e, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la L~ ru~ ALiull dans Escherichia coli, etc ... sont bien connues de l'homme de métier et sont ill ( .. " 1~, . ~ 1 l décrites dans la littérature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning. a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, woss/2s80.1 2 ~ /r~_~
Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols inMolecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
- Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la sêrie M13 sont d'origine W~ iC (Bethesda Research 1.~ . " ;~
s Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par ~lF.l~v~ vl~e en gels d'agarose ou d'~ ld~lu i~, extraits au phénol ou par un mélange phénoVchloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les -~ du fournisseur.
Le ~r~ ;r- des extrémités 5' IJIV~ Ul.. ~ peut être effectué par le 10 frdgment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les ~ ,r;- ~
du fil -~;c~ . La destruction des extrémités 3' lulvèl~ est effectuée en prêsence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les .~ - du fabricant. La destruction dês extrémités 5' ~JIvélll-....l-~., est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase Sl.
Ld ~u F~ dirigée in vitro par oli~odév~llu~levLdè~ ~lltl.éLi~ue~ peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res-(1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham.
L'~ ,l,r;. ~ ;que de fragments d'ADN par la technique dite de PCR
Lolymérase-catalyzed Chain _eaction, Saiki R.K. et al., Science ~Q (1985) 1350^
1354; Muliis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 1~ (1987) 335^350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermai cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les du fabricant.
La vérification des séquences '~ ' . peut etre effectuée par la méthode développée par Sûnger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utiiisant le kit distribué par Amersham.
ExemDles Exemple 1: Col.,~, . du vecteur pSll-Ad-BDNF.
Cet exemple décrit la :vlliflucl;vll d'un vecteur ,Vl~ une séquence d'ADN codant pour le BDNF sous le contrôle d'un promoteur constitué par le LTR du virus du sarcome de rous (LTR^RSV).
1.1. Vecteur de départ (pXL2244): Lê piasmide pXL2244 contient l'ADNc de l'ApoAI sous le contrôle du promoteur LTR du virus RSV, ainsi que des séquences de rlvv;.us Ad5 (figure 1). D a été construit par insertion d'un fragment Clal^EcoRV
Wo 9s/25804 l ~/r~: .'t ~
contenant l'ADNc codant pour la préproApoAI dans le vecteur pLTR RSV-~gal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626), digéré par les même enzym~es.
1~ Clonage d'un ADNc codant pour le prepro-BDNF. L'ADNc complet 5 codant pour le prepro-BDNF de rat (790 pb) a été cloné à partir d'une banque d'ADN
génomique de rat par la technique de PCR, en utilisant comme amorce les ..1;~;...~". lf~ , suivants:
O~ f lf~ 5': 5'-TTCATCGAATTCCACCAGGTGAGAAG-3' (SEQ lD nl) Oli ~ tiflf~ 3': 5'-AATATAATCTAGACAACATAAATCC-3' (SEQ ID n"2) O La région 5' de la séquence obtenue a ensuite été mf~difiée par insertion d'un site de restriction Clal, 25 bases en amont de l'ATG. Ce site a été introduit par PCR au moyen des ~ ,..1.5,.1;.1, suivants:
o~ .5~ 5': 5'-TAGCTTCATCGATTTCCACCAG-3' (SEQ ID n3) O~i~,. ,.~, ., lf~"L;~ l~ 3': 'i'-AATATAATCTAGACAACATAAATCC-3' (SEQ ID n4) La séquence ainsi obtenue a ensLIite été sous-clonée dans le plasmide pCRlI
(Invitrogen) pour générer le plasmide pCRII-BDNF.
1.3. Construction du vecteur pSh-Ad-BDNF
Cet exemple décrit la Cu.l~LIu.:Liwl du vecteur pSh-Ad-BDNF contenant la 20 sequence codant pour le prepro-BDNF sous controle du LTR du virus RSV, ainsi que des séquences de l'~dé-luvi-us Ad'i perrnettant la ~ ",~ "-- in vivo.
Le vecteur pCRII-BDNF a eté digére par les enzymes ClaI et Kpnl, et le fragment de 0,85 kb résultant, contenant la séquence codant pour le prépro-BDNF a ensuite été isolé et purifié par éle,L.-, ' ~ae sur un gel d'agarose LMP ("Low Melting 2s Point"). PArAll"~ t, le vecteur pXL2244 a été digéré par les mêmes enzyrnes de reStriction Clal et Kpnl, puis précipité après inactivation de ces dernières. Le vecteur linéaire résultant, prf~Al~lllf~mf-nt isolé et purifie par ele-,L u,~,',v,~: sur un gel d'agarose, et le fragment de 0,85 kb ont ensuite été ligaturés pour générer le vecteur pSh-Ad-BDNF (figure 2).
30 Exemple 2 ~ du Yecteur pSll-Ad-BDNFtag.
Cet exemple décril la Cu.~LIu~Liù-l d'un second vecteur ~ "~"t une séquence d'ADN de fusion codant pour le BDNF sous le contrôle d'un promoteur constitué par le LTR du virus du sarcome de rous (LTR-RSV).
Woss/2s80~ 21 8 4 2 0 0 ~l/r~
2.1. Géneration de l'ADN de fusion: Dans cet exemple, une forme alternative - ~ de la séquence d'ADN codant pour le prépro-BDNF a été const~uite. Cette forme a été
obtenue par insertion, à l'extrémité 3' terminale de la séquence décrite dans l'exemple s 1.2., d'une séquence codant pour un épitope de sept acides aminés (tag) reconnu par un anticorps disponible ~:u~ h,.l.~ (IBI, Integra Flincci~on~c~ Eaubonne, France). La séquence de la région ainsi fusionnée est la suivante (SEQ ID n5):
Arg Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp ***
C-t er Seg, ~ nn, BDNF
5 La séquence ainsi obtenue a ensuite été sous-clonée dans le plasmide pCRII
(Invitrogen) pour générer le plasmide pCRII-BDNFtag.
2.2. Construction du vecteur pSh-Ad-BDNFtag Cet exemple décrit la cu~lsl~ uCliull du vecteur pSh-Ad-BDNFtag contenant la séquence de fusion codant pour le prepro-BDNF sous contrôle du LTR du virus RSV,20 ainsi que des séguences de l'adénovirus Ad5 permettant la ~ l. in vivo.
Le vecteur pCRlI-BDNFtag a été digéré par les enzymes ClaI et Kpnl, et le fragment de 0,87 kb résultant, contenant la séquence codant pour le prépro-BDNFtag a ensuite été isolé et purifié par ~ r ~ sur un gel d'agarose LMP ("Low Melt;ng Point"). r ~ t, le vecteur pXL2244 (exemple 1.1.) a été digéré par les 25 mêrnes enz~vmes de restriction ClaI et Kpnl, puis précipité après inactivation de ces dernières. Le vecteur linéaire résultant, pr~ m~nt isolé et purifié par lu~llulè~: sur un gel d'agarose, et le fragment de 0,87 kb ont ensuite été ligaturés pour générer le vecteur pSh-Ad-BDNFtag.
30 Exemple 3. Fo~ ~;on:~l;t~ des vecteurs pSh-Ad-BDNF et pSh-Ad-BDNFtag La capacité des vecteurs pSh-Ad-BDNF et pSh-Ad-BDNFtag à exprimer sur culture cellulaire une forme hi~iq Pml~nt active du BDNF a été démontrée par lla-l:,rt:~liull transitoire de cellules COS1. Pour cela, les cellules (2.106 cellules par ~1 ~42~
Wo 95/25804 ~ rJvS,'~
boite de 10 cm de diamètre) ont été l~ are~éea (8 ,ug de vecteur) en présence deTransfectam. Après 48 heures, le surnageant de culture des cellules a été récolté. Des dilutions sérielles (1/200 et 1/50) de ce surnageant ont ensuite été ajoutées à des cultures primaires de neurones du septum (Hefti et al. In Dissection and Tissue cultures: Manual of the Nervous System (1989) 172, Alan R. Liss, Inc). L'effet trophique (survie cellulaire et pousse neuritique) sur ces cultures a été observé après coloration, et l'effet di~réle..L;~ u par dosage de l'expression de l'enzyme choline acétyl transférase (ChAT), selon la technique décrite par Fonnum (J. Neurochem. 24 (1975) 407).
10 Exemple 4. CO.L~Ll . dec ~d~..v.;. ua ~ tc contenant une âéquence codant pour le BDNF
4.1. Construction de l'adénovirus Ad-BDNF
Le vecteur pSh-Ad-BDNF a été linéarisé et ~:uLIc~arecL~ avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trars les 15 fonctions codées par les régions E1 (E1 A et ElB) d'du~.~v v u uS.
Plus ~.éc;.,émcl.L, I'adénovirus Ad-BDNF a été obtenu par ..
homologue in vivo entre l'~ r.uv;-ua mutant Ad-dll324 (Ilu~ d~a~d et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pSh-Ad-BDNF, selon le protocole suivant: le plasmide pSh-Ad-BDNF et l'~é..vvi-us Ad-dll324, linéarisé par l'enzyme Clal, ont été co-0 transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la. ,. . h~m~ g~ Les adénovirus ~ " ~ ainsi générés ont été
'~ ' par purification sur plaque. Après isolement, I'ADN de l'adénovirus .. ' a éte amplifié dans la lignee cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l';~d~ ,v;-u~ défectif ~culllvlll~l~L non purifié ayant un titre5 d'environ 101 pfu/ml.
Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient de. chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al.,Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-BDNF peut être conservé à -80C dans 20% de glycérol.
4.2. Construction de l'l~delluviu ua Ad-BDNFtag wo 9s~25804 2 7 8 4 2 0 0 L'adénovirus Ad-BDNFtag a éte construit selon le meme protocole que rd~ uvilus Ad-BDNF, mais en utilisant comme vecteur de départ le vecteur pSh-Ad-- BDNFtag.
Exemple 5. Ii~ .o de l'ad,..~, . ;. ~ Ad-BDNF
s La capacité de l'adénovirus Ad-BDNF à infecter des cellules en culture et àexprimer dans le milieu de culture une forme biologiquemeM active du BDNF a été
démontrée par infection des lignées 293 humaine et PC12 de rat. La préænce de BDNF actif dans le surnageant de culture a ensuite été déterminée dans les mêmesconditions que dans l'exemple 3.
Ces études permenent de montrer que lI~d~ V;LUS exprime bien une forme .; active du BDNF en culture cellulaire.
Exemple 6: Transfert in YiVo du gène BDNF par un ad,.-~,v;.~ ~c ' à
des rats prcsentant une lésion du fimbria-fornix Cet exemple décrit le transfert du gène BDNF in vivo au moyen d'un vecteur adénoviral selon l'invention. Il montre sur un modèle animal de la lésion du fimbria-fornix, que les vecteurs de l'invention permettent d'induire l'expression in vivo de quantités ~ de BDNF.
Sur des rats pr~ h~ nt anesthésiés, la voie septo-l~ l ,.a, ~ " 'l);' l- ~ (fimbria-forrlix) a été sectionnée au niveau de l'l~ c gauche. Cette lésion mécanique a été réalisée à l'aide d'un couteau chirurgical rétractable. Les :w-dulnJlé~
~Li~ ~iuu~ utilisées à cet effet sont, par rapport au bregma: AP: -1,7; ML: +1,5;
V: -5,5 à -0,5.
L'adénovirus recombinant BDNF a été injecté ' ' après la lésion, dans le noyau médian du septum et dans la partie dorsale de l'ili~ a.l-l,e déafférenté
(~ ~ du coté de la lésion). Plus IJI~ uliè~ ,.LL, I'adénovirus injecté est r;~&~ vilu~ Ad-BDNF préparé dans l'exemple 4.1., utilisé sous forme purifiée ,5 106 pfu/~l), dans une solution saline phosphate (PBS).
Les inje~tions sont réalisées à l'aide d'une canule (diamètre extérieur 280 ~lm)connectée à une pompe. La vitesse d'injection est fixée à 0,5 Ill/min, après quoi, la canule reste en place pendant 4 minutes ~ ,Y-~ S avant d'être remontée. Les Wo 95/2580~ 2 1 ~ 4 2 ~ J/r~ . 01 volumes d'injection dans l'~ et le septum sont le~e~ive~ L 3 ,ul et 2 ~LI.
La ~ .ILii~ l d'adénovirus injectée est de 3,5. 106 pfu/~
Pour l'injection dans l'hirr~nr~, les ~8~ éle~ ue~ sont les suivantes: AP=4; Ml,=3,5; V--3,1 (les l:WII' ' AP et ML sont .l~ .,... par s rapport au bre~ma, la CWI~ V par rapport à la surface de l'os crânien au niveau du bregma.
Pour rinjection dans le septum, les :wld~ Léli' , sont les suivantes: AP=1; Ml,=1; V=-6 (les cwrdonnées AP et Ml, sont ~ par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la surface de l'os crânien au niveau ~o du brêgma. Dans cette condition, la canule présente un angle de 9 degrés par rapport à
la verticale (dans le sens médio-latéral) afin d'éviter le sinus veineux médian.
Les effets ~ de l'hl~ de l'_.l~ ,v;~us selon l'invention ont été mis en évidence par trois types d'analyse: une analyse 1 ~I.~T~ et . une analyse quantitative et une analyse C~ elll~ lle.
5 Anh¦~vsehicfolo~ic--.oeti.. "".. ,h .l~
-~! wo 95/25804 2 ~ 8 ~ P l~r~.
La lésion mécanique du fimbria-fornix induit une perte de neurones ~ vliu.~ Luw (révélée en ;" ~ ~iP par un anticorps anti-choline acetyl transférase, ChAT) dans le septum médian, ainsi que la dénenation ~llol;n~;qhe dans ~ (détectée en histochimie par l'activité de l'acétyl choline estérase, AChE~.
s L'analyse hi~f~ll~iq~P des ceneaux injectés est réalisée 3 semaines après l'injection iu.Lld~él~:b-dle de l'adénovirus Ad-BDNF. Pour cela, les animaux sont sacrifiés, sous anesthésie, par perfusion il.ud~ud;d.lu~ de 4% paraformaldéhyde, Après ~ ,L,~ C.IL, po6t-fixation et ~.r.,~ iion, le ceneau est coupé au cryomat selon le plan coronal: des coupes sériées coronales de 30 ,um d'épaisseur sonf. réalisées sur toute la longueur du septum médian et aux niveaux antérieur, médian et postérieur de ~'hirr~mrP Pour le septum médian, des coupes espacées de 180 llm (1 coupe sur 6)sont colorées au cr~wyl violet (rour évaluer la densité neuronale) et par un anticorps anti ChAT (Biochem) (pour identifier les neurones ~
La méthode ~' ' . est celle de la 6h~Ldvih~ -biotine peroxydase révélée par la DAB. Pour l';-:~ e, des coupes espacées de 180 ,um sont colorées selon la méthode ~ :q~P pour l'AChE (acétyl choline estérase) afin de détecter l'innervation ~ vli~ ;iqu~. Les coupes sont montées sur lames de verre.
An~lyse ql~ntit~tive Le nombre de neurones I~ . (ChAT positifs) dans le septum median est le paramètre d'évaluation des effets de l'd~ V;lhS Ad-BDNF. Le ~.l~nlllJil est réalisé sur un échantillon (1 coupe sur 6 sur toute la longueur du septum médian). Pour chaque coupe, les neurones ChAT positifs sont dénombrés séparément des 2 cotés du septum. Les résultats cumulés pour toutes les coupes sont exprimés par le rapport du nombre de neurones ChAT rositifs du coté lésé sur le 2s nombre de neurones ChAT positifs du coté non lésé.
Ans~jyse~l"",~ ",~"' le Il est connu qu'une lésion bilatérale de la voie septo-l~ conduit à
des déficits mnésiques. Afin d'évaluer les effets r ,l~. L~"u-els protecteurs d'une injection d'ad~llvYilus Ad-BDNF sur ce type de lésion, les ~lroll"dll~ mnésiques des animaux sont analysées au cours de 2 tests ~:V~I}JOI~ IILhh~ le test de la piscine de Morris (mémoire de référence visuo-spatiale) et le test TMTT ("two-trials memory task";"mémoire à court-terme d'un ~IIV;IUIh..,.ll~llL nouveau").
wo ss/2s80~ 2 1 8 4 2 0 0 r~l~rlvs~
Exemple 7: Transfert in vivo du gène BDNF par un ad;.luv;. ~: ~ ' à
des rats présenhnt une lésion de la voie nigro-striée Cet exemple décrit le transfert du gène BDNF in vivo au moyen d'um vecteur adénoviral ælon l'invention. Il montre sur un modèle animal de la lésion de la voie nigro-striée, que les vecteurs de l'invention permenent d'induire l'expression in vivo de quantités ~ P~ --, de BDNF.
Sur des rats prP:lh~ pnlpnt ~m~h.oei~ la voie nigro-striée a été lésée au niveau du faisoeau ~ - PlJ~;q ~ médian (MFB) par injection de la toxine 6-hydroxy dopamine (60H-DA). Cene lésion chimique par injection a été unilatérale,0 suivant les CWld~llu~ .Lel~:UI~lid~U~ suivantes: AP: O et -1; ML: +1,6; V: -8,6 et -9 (les c~ ' AP et ML sont ~If'l.'' I I I I I~PP~ pa~ rapport au bregma, la coordonnée V parrapport à la dure-mère). La barre d'incisive est fixée au ni~eau +5 mm.
L'adénovirus leculllLl~ BDNF a été injecté r ~' ' ' après la lésion, dans la substance noire et le striatum, du coté de la lésion. Plus ~ uli~ llle~
r~dé--~v;- uS injecté est l'adéno~ irus Ad-BDNF préparé dans l'exemple 4.1, utilisé sous forme purifiée (3,5 106 pfu/lll), dans une solution saline phosphate (PBS).
Les injections ont été réalisées à l'aide d'une canule (diamètre extérieur 280 llm) connectée à une pompe. La vitesse d'injection est fixée à 0,5 ~lmin, après quoi, la canule reste en place pendant 4 minutes ~ ~,.l,lP,~ 5 avant d'être remontée. Lesvolumes d'injection dans le striatum et la substance noire sont lPs~,Puli~ 2x3 111 et 2 ,ul. La ~ - l d'~ l;, lu v ;~ u~ inj ectée est de 3,5. l 06 pfu/~
Pour l'injection dans la substance noire, les ~w~ ul~ u~s sont les suivantes: AP--5,8; ML=+2; V--7,5 (les -)U-du..ll~r,:3 AP et ML sont 25 pat rapport au bregma, la ~:U~J~dU.~.~O~ V par r8pport à la dure~mère).
Pour les rnjections dans le striatum, les ~:ou-dO~Ul~s ~ éUId~ U~ sont les suivantes: AP=+0,5 et -0,5; ML=3; V=-5,5 Oes ~U-dUn~ S AP et ML sont ,l~l~,l,...~Pp~parrapportaubregma~lacoordonnéevparrapportàladure-mère)~
Les effets ~ iap~uli~u~s de l'i~ de l'adenovirus selon l'invention 30 ont eté mis en évidence par trois types d'an81yse: une analyse hi~lneiT-P et ,.. ,.. ,1.,~l. ~ 1,;.. ;.1.. ~ une analyse quantitative et une analyse col--~-l~
~ Woss/2s804 2 l ~3 4 2 0 0 ~ r~ h~ ~
A~A~lvse l.: ~t~ et i"""",~
La lésion chimique de la voie nigro-striée induit une perte neuronale dans la substance noire ainsi que la dénervation ~ Ar.~ dans le striatum trévélées en " ", ~ .. ~'. ' ~. ,l~if~ par un anticorps anti-tyrosine l,y~uAyl~, TH), s L'analyse ~ i"~ des cerveaux injectés est réalisée 3 semaines après l'injection ;,.~ .5.,'il...,1r de l'~lé~lu.;.us Ad-BDNF dans les conditions décrites dans l'exemple 6. Les coupes sériées coronales de 30 llm d'épaisseur sont réalisées dans la substance noire et le striatum. Des coupes espacées de 180 llm (1 coupe sur 6) sont colorées au crésyl violet (pour évaluer la densité neuronale) et ;...." ~ q- ' - par lo un anticorps anti tyrosine ~J~ yl~ (TH) (pour détecter les neurones , A.' . ~;q; ~ dans la substance noire et leur innervation dans le striatum).
Analvse ql~ntitAfive Le nombre de neurones ~ (TH positifs), dans la substance noire est le paramètre d'évaluation des effets de rd~ièlluvi~uS Ad-BDNF. Le s dénombrement est réalisé sur un échantillon (1 coupe sur 6 sur toute la longueur de la substance noire). Pour chaque coupe, les neurones TH positi& sont dénombres séparément des 2 cotés de la substance noire. Les résultats cumulés pour toutes les coupes sont exprimés en proportion: nombre de neurones TH positifs du coté lésé par rapport au nombre de neurones TH positifs du cote non lésé.
20 An~lyse~u,,l~,u,~..,....lAlf~
Afrn d'évaluer les effets fonctionnels protecteurs d'une injection d'~dé l~vl. uS
Ad-BDNF sur la lésion de la voie nigro-striée, les ~ r~" ~ ~ ~e~ sensori-motrices des animaux sont analysées au cours de 2 tests cu..,~t~ .,u,u~: le test de la rotation induite par des agonistes '~ ,u,-~u ph;.-e, rll~ et lévodopa~, 2s et le test de préhension ("paw-reaching").
Exemple 8: Transfert in vivo du gène BDNF par un ad;.,~ ' ' à
des rats présentant une lésion de la voie perforante Cet exemple décrit le transfert du gène BDNF in vivo au moyen d'un Yecteur adénoviral selon l'invention 11 montre sur un modèle animal de la lésion de la voie 30 perforante, que les vecteurs de l'rnvention permettent d'induire l'expression in vivo de quantitéS th., ~ ; de BDNF.
WOgs/25804 21 84200 r~llr~s~
Sur des rats prPolohlPmpnt anesthésiés, la voie entor~hino ~
(voie perforante) a été sectionnée lmil ~~-alPmPnt à l'aide d'un couteau chirurgical. Les wuld~u)l~OeS ~Lélé~ ueS utilisées à cet effet sont, par rapport au lambda: AP:
+0,75; ML: +4,1 à 6,6; V: -7,7 (coordonnée V déterminée par rapport à la dure-s mère).
L'adénovirus ~ecoll~ BDNF est injecté ' ' après la lésion, soit au niveau de la lésion, soit au niveau de ~ P at du cortex entorhinal. Plusl~alLic~Jlie~ ell~ vilus injecté est l'~ léllov;lus Ad-BDNF préparé dans l'exemple 4.1., utilisé sous forme purifiée (3,5106 pfu/lll), dans une solution saline 0 phosphate (PBS).
Les injections ont été réalisées à l'aide d'une canule (diamètre extérieur 280 m) connectée à une pompe. La vitesse d'injection est fixée à 0,5 lli/min, après quoi, la canule reste en place pendant 4 minutes s~ ;,ès avant d'être remontée. Les 15 volumes d'injection dans 1'1,;l,1,~ le cortex entorhinal et le site de lésion de la voie perforante sont l~elivelllellL 3 111, 2 111 et 2 ,ul. La - "~ d`d ;léll~,vi, us injectée est de 3,5. 106 pfu/~JI.
Les effets l1~P~"I.. I;q~r; de l'r,~ ;"" de l'dd~ lVilU~ selon l'invention peuvent être mis en évidence par une analyse cu~l~,u~ e~lle l~le dans les conditions de 20 I'exemple 6.
~ WO95l25804 2 ~ 84~ r~
T.TC~B DF ~Fn1TT~NoT~
(1 ) INFORMATION GENERALE:
( i ) DEPOSANT:
A,l NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
~ C VILLE20ANTovNyue RaVmond ARON
1 0 E PAYS: FRANCE
Fl CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Virus rP, ' ;nAntc, préparation et 15 ut~l~cAt1nn en thérapie qénique (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: S
(iv) FORME LISIBLE PAR OPDINATEUR:
I B) nRnTN~ATT~rlR - IBM PC ~ f ~ hl P
C) SYSTEME D ' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2~ TNFoRMATTnN POTJR T~A sT~n In NO: 1:
ARA-~TRRTc~IQUES DE LA SEQUENCE:
(A~ LONGUEUR: 26 pa~res de bases (B) TYPE: acide r,ucléique (D) CONFIGURATIQN linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) ~Y~U~ lUU~:~ NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(Xi) L)li:~U~l~llUN DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
~Z) INFnR~A~IQN Ptl[IR A ,~T~n TD NO
L . 2.
(i) t~AR~ UU~:~ DE LA SEQUENCE:
(A. LONGUEUR: 25 paires de bases (Bl TYPE: acids nucléique (D CONFIGURATION lineaire (ii) TYPE DE MOLECU1E: ADNc (iii) ~lYI:~ULII~ UU~. NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
MTATMTCT A~A('AA~'ATA MTCC. 25 ~2~ 1NFnRMAq'I(7N PnrlR T.A sFn Tr~ NO: 8:
ARA~TT~RT.STIQUE5 DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: Aimple WO 95/2580~ /rl t (D) CONFIGURATION: lineaire (ii) TYPE DE MOLBCULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(ili) ANTI-SENS: NON
(xi~ D~ c~lN~ N DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
(2~ TN~)RMATION POUR T.A ST~-l Tn NO: 4:
(i) ~'AR ~ U~!;S DE LA SEQUENCE:
(A, LONGUEUR: 25 paires de bases (B' TYP-: acide nucléigue (C' NOM3RE DE BRINS: simple (Dl CON-IGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) ~Y~O ~ Uu~:: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
AATATAATCT R~ArAAf~A~A AATCC 25 25 ( 2 ~ ~ORMATION POUR LA SEO In NO: S:
(i) t'ARA~ Lll~Ul:i~ DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc ( i i i ) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
AGA GGC GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC TAG , 30 40 Arg Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp *** 2 1 8~2~
wo ss/2s804 . ~~
A first object of the invention therefore lies in an adenovirus "~. "~
defective; ul} lp ~ llL a DNA sequence encoding the brain-derived factor l-, u-, L- ~ l ~ ue (BDNF) or a derivative thereof.
The invention also relates to the use of such an adenovirus se '~ defective for the preparation of ume ~: o~ ~s;[io~ P~ -^ destined the treatment or prevention of disease llèu ud ~. dLive ~.
The brain-derived factor rl~uLIu~ ue (BDNF) produced as part of of the present invention may be human BDNF or animal BDNF. The DNA sequence coding for human BDNF and for rat BDNF has been cloned and 0 sequenced (l\l~;~u,~, e et al., Genomics 10 (1991) 558), as well as in particular the coding sequence for porcine BDNF (Leibrock et al., Nature 341 (1989) 149).
Prpr ~ sment to their illcul ~ Julaliull in an aelon adenovirus vector the invention, these sequences are d ~ modified, for example by m ~ lf9 ~ n9 ~ P directed, in particular for the insertion of appropriate restriction sites. The sequences described in the prior art are in fact not constructed for use according to the invention, and prior adaptations may prove necessary, to obtain e,.~l eS .;UI~S illl~UI Lall~e~ (see example 1.2.) . In the context of the present invention, prefers to use a DNA sequence encoding the factor ~UL-u~ derived from human brain (hBDNF). Furthermore, as indicated above, it is also possible to use ume:u-~LIue~iull encoding a derivative of BDNF, in particular a derived from human BDNF. Such a derivative comprises, for example, any sequence obtained by mutation, deletion and/or addition with respect to the native sequence, and coding for a product retaining at least one of the biological properties of BDNF (effect trophic and / or di ~ el,). These ".~;ri.~ can be made by the 2s techniques known to those skilled in the art (see general biology techniques molecule below and example 2). The biological activity of the derivatives thus obtained can then easily be ~ PfP minPP, as indicated in particular in Example 3.. The derivatives within the meaning of the invention can also be obtained by hybridization to pattir of nucleic acid libraries, using as a probe the native sequence or a 30 fragment thereof.
These derivatives are in particular molecules having a greater affinity for their binding sites, sequences allowing an improved expression rn vivo, molecules with greater resistance to proteases, molecules Wo 9s/2s804 A _ I Ir ~ tr having ~ greater efficacy or lesser side effects, or ev~nh~ m~nt new properties hi~ giq-~
Among the preferred derivatives, mention may be made more particularly of the variantsnah ~ rels, the molecules in which one or more residues have been substituted, the s derivatives obtained by deletion of regions 1l ul ~ el ~ ~ .lalll little or no interaction with the binding sites considered or expressing an undesirable activity, and the derivatives comprising with respect to the native sequence residues su ~ e: ~, such as by example a secretion signal and/or a joining peptide. So pà ~ ie ~ l; è ~ ellllcll ~ d ~ a.. Lav ~ e, the sequence of the present invention codes for the lo BDNF preceded by the native pro region (proBDNF).
Moreover, it is ~ alLi ~ .èl ~ lL important for better implementation implementation of the present invention that the sequence used also contains a signal of secretion making it possible to direct the synthesized BDNF into the secretory pathways of infected cells, so that the synthesized BDNF is released into the 15 Culll~al Li~ A " ~ and can activate its receptors. The secretion signal is av ' V ' the own signal of the BDNF. But it can also be a signal of heterologous or even artificial secretion.
The DNA sequence encoding factor ll~,uuL u~l-iu~.~ derived from brain 20 used in the context of the present invention can be a cDNA, a genomic DNA
(gDNA), or a ~: u--~ L ~ ucLiu ~ l hybrid consisting for example of a cDNA in which one or more introns would be inserted. It can also be sequences .Ll.éLi-iu~ or ~el.li~y--Ll,éLi-l..w. It should be noted that in the genomic sequence coding for BDNF, the introns are located in the non-coding regions. Of 25 way ~ a ~, ul; è.ell, ~ .. L avanhageuse, using a cDNA or gDNA. In particular, the use of a gDNA can allow a better expression in the human cells.
In a first embodiment of the invention, I'ddel-UY;-us comprises therefore a cDNA sequence coding for the factor llèuluLlu ~, derived from the brain 30 (BDNF). In another preferred embodiment of the invention, I'd ~ é..uv; .u ~
comprises a gDNA sequence encoding the factor llèuuuLLulJIl; ~ ue derived from brain (BDNF). AY ~ - l the DNA sequence codes for proBDNF and, of preferably, preproBDNF.
Wo 95/25804 2~8~r~ct s Av l~y~r.~rll.. - 1 the coding sequence for BDNF is placed under the control of signalA allowing its expression in nerve cells.
Préférr^ ~ iPIlPmPnt these are signals the eA ~; U ~ élélulog.l ~,:" that is to say of if ~ nal different ceuA naturally lP ~ the expression of BDNF. He 5 may be in particular sequences "~ of the expression of other proteins, or sequences byilalr ~ ... In particular, it may be sequences ~ vlli ~ eS eukaryotic or viral degenes. For example, it can be sequences ,c,ulllul;cèb from the genome of the cell to be infected. Likewise, it may be 1 ~ r5 sequences from the genome of a virus, including adc ~ .uv; read used. HAS
In this regard, mention may be made, for example, of the ElA, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. promoters.
In addition, these sequences of ~Aplr, D~; vll can be modified by adding sequences activation, regulation, or allowing tissue-specific expression. He can effect be 1~ lir~ . Interesting to use active dl~, AI.IL.,.~.. JII signals r;~l - - -- -1 OR llaj~liLall~ in the nerve cells, so that the 5 DNA sequence is expressed and produces its effect only when the virus has err~Lv~ infected a nerve cell. In this regard, mention may be made, for example, of promoters of neuron-specific enolase, GFAP, etc.
In a first particular embodiment, the invention relates to a adenovirus ~ CUIIIb; ~ defective ~ u---~". a cDNA sequence coding for the 20 factor,, ~ ullù ~ ll; that derived from the human brain (hBDNF) under the control of LTR-RSV promoter.
In another particular embodiment, the invention relates to a adenovirus., - defective comprising a gDNA sequence coding for the human brain-derived factor rl~u~lv~ u~ (hBDNF) under the control of 2s LTR-RSV promoter.
The Irll ~ - has indeed shown that the LTR promoter of the virus of rous sarcoma (RSV) allowed long-lasting and significant expression of BDNF
in the cells of the nervous system, especially the central one.
Still in a preferred mode, the invention relates to an adenovirus 30 ~ r ~ = 'defective culll ~ lcllal-i a codamt DNA sequence for the factor n ~ ullu ~ derived from human brain (hBDNF) under the control of a promoter allowing a majority expression in the nervous system. A way IJal ~; cUl; èlel ~ ll preferred implementation of the present invention lies in a defective recombinant adenovirus comprising the ITR sequences, a sequence 35 allowing the - ~. a DNA sequence encoding the &ctor 2~ 8~2~
Wo 95/25804 P~llr~, ~v O
AeV1 ~ derived from human brain (hBDNF) or a derivative thereof under the control of uA promoter allowing uAe majority expression in the system nervous, and in which the E1 gene and at least one of the E2, E4, L1-L5 genes is not s The defective adenoviruses according to the invention are iAcapable adenoviruses of replicate autonomously in the target cell. G, 't, the genome of defective adenoviruses used in the context of the present invention therefore lacks at least sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell.
These regions can either be eliminated (in whole or in part) or made non-"" or substituted by other sequences and in particular by the sequence DNA encoding BDNF.
PréfPrPntipllpmpnt ~ the defective virus of the invention retains the sequences of its genome which are necessary for the viral particles. Even more preferPntiPIlPmPnt as indicated above, the genome of the virus ~ defective according to the invention comprises the rrR sequences, a sequence allowing r. ~ . The non-functioning El gene Ael and at least one of the E2, E4, L,1-L5 genes no r~
There are different serotypes of adenovirus, which vary somewhat in structure and properties. Among these serotypes, it is preferred to use in the context of present invention the human adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or the adenovirus of animal origin (see application FR 93 05954). Among the adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenovirus of canine, bovine, murine origin (example: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, avian or eAcore simienAe (example: SAV). Of 2s preferably, I'; ldé, ~; .vs of aAimale origin is a canine adenovirus, more UA adenovirus CAV2 [manhattan strain or A26/61 (ATCC VR-800) for example]. Preferably, within the framework of the invention, the adenovirus of human or canine or mixed origin.
The defective adenoviruses according to the invention can be prepared by any technique known to those skilled in the art (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they can be prepared by the ~ "- homologous between an adenovirus and a plasmid carrying inter alia the DNA sequence coding for BDNF. The ~ homologous se produced after co-transfection of said adenoviruses and plasmid in a cell line W095/~5804 2 ~ Q~ /r~ -appropriate. The cell line used should preferably (i) be ~ r ~ "ll. ~ by said elements, and (ii), include the sequences capable of ~ Ia pa ~ tie of the genome of the defective virus, preferably in integrated form to avoid risks of ~ As an example of lineage, we can mention the lineage of kidney, human 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (19~.7) 59) which contains nrf~nPnt. integrated into its genome, the left part of the genome of a Ad5 adenovirus (12%). Strategies of uvl~L u~ of vector~ derived from adenoviruses have also been described in applications n FR 93 05954 and F'R 93 08596 which are illc ~ herein by reference.
Then, the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to conventional molecular biology techniques, as illustrated in the examples.
As indicated above, the present invention also relates to any use of an adenovirus as described above for the preparation of a intended for the treatment and/or prevention of diseases ~ ;V~. More }~G-Li~uli~ ,ll, it concerns any use of these adenovirus for the preparation of a ~ 1-1, "~ q ~ p intended for treatment and/or prevention of Parkinson's disease, Alzheimer's disease, lateral sclerosis Glll ~ LIu ~ lliu, ~ .., (ALS), of ia nialadie of T ~ ntin ~ t--n of repilepsy and vascular dementia.
The present invention also relates to an e ~ mrt ~ e * if, nl ~
uulll ~ alll one or more IPf ~ adenoviruses detected as described pl~ I These ~ l ", P~ can be formulated with a view to of h ~ LIluli ~ Ll ~ lliw ~ topical, oral, parenteral, intranasal, vciu. ~, ~,; I "" ,~, ,,l..:~, subcutaneous, illll~10CUlailt~ U . etc Preferably, the 25e~ P~ -. of the invention contain a vehicle, vl-a..la ~
critically acceptable for an injectable formulation, in particular for an injection directly into the patient's nervous system. In particular, these may be solutions sterile, i~t~niq -P~. or ~: O ~ Ip ~ a; liO. ~ S dry, including Iyophilisf ~ es, which, by addition as appropriate of sterilized water or serum IuI. ~ iulogiciqu ~, allow la30 ~ 4, lilulic..l of injectable solutions. Direct injection into the nervous system of the patient is dVa~. because it makes it possible to concentrate the effect ll ~ PI, ~ IJ at the level affected tissues. Direct injection into the patient's central nervous system is 1 performed by means of an injection device ~ L ~ Ld ~ u ~:. employment of such a device makes it possible to target the injection site with great precision.
wos5/2580s~2~rl~
In this respect, the invention also relates to a method for processing diseases lleuL ~ n ~ .dliv ~ including 1'~ the a patient of an adenovirus ,~.",.1,;..~"1 as defined above. More pG LiCu]i,:.el..~, the invention relates to a method of treating diseases l. ~ UU ~ ldliV ~ comprenamt 1'~
s ~L~L~. ~ ic of a recombinant adenovirus as defined above.
The doses .I '~) ViLU ~ the ~, blll ~ defective GIlL used for the injection can be adapted according to various parameters, and in particular according to the mode II used, the pathology concerned or the duration of the treatment wanted. In general, the adenoviruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses between ent ~ e 104 and 1014 pfulml, and preferably 106 to 1010 pfu/ml. The term pfu ("plaque forming unit") corresponds to the infectivity of a virus solution, and is determined by infection of a culture appropriate cell, then measurement, c ~ l after 48 hours, of the number of beaches of infected cells. The techniques of ~1 of the pfu titer of a viral solution are fine.~. u ".. ~f.'.: in literature.
Another object of the invention relates to any mammalian cell infected with one or more adenovirus IP. ~ defective as described above. More i ~, UIi ~ L ~ ll, the invention relates to any population of infected human cells by these adenoviruses. It may be in particular fihn ~ hlo ~ fPc myoblasts, 20 hepatocytes, I~t ld~inO~ cells, Pn~thPliAIPi glial cells, etc.
The cells according to the invention can be derived from primary cultures. Those-these can be removed by any technique known to those skilled in the art, then placed in culture under conditions allowing their proliferation. Regarding more particularly from fihn~h~o~tP~, these can be easily obtained from 2s biopsies, for example according to the technique described by Ham [Methods Cerl.Biol. 21a (1980) 255]. These cells can be used diLe ~ Lt ~ llL for infection by adenovirus, or preserved, for example by ~ n ~ PiAtifm, for 1 ~ of autologous libraries for later use. The cells according to the invention can also be secondary cultures, obtained for example from 30 pre-established banks.
The cells in culture are then infffled by adénovrrus ,.~.,,,11~;.,~."~, to give them the ability to produce BDNF. The infection is carried out in vitro according to techniques known to those skilled in the art. Specifically, depending on the type of cells used and the number of copies of virus per cell desired, 3s r skilled in the art can adapt the multiplicity of infection and i,. ~ I fl '~ Ie number wossl2s8o~ 2 1 842GB ~l/r~
of cycles of infection carried out. It is understood that these steps must be carried out under appropriate sterility conditions when the cells are intended for a r '~Li~ in vivo. Doses of rec~lllbindlll adenovirus used for infection cells can be adapted by those skilled in the art according to the desired goal. The s conditions described above for the r ~ in vivo can be applied to in vitro infection.
Another object of the invention relates to an implant ~: O ~ lell ~ L cells mammal infected with one or more defective adenoviruses such as described above, and a matrix ~ ^ e. Préfén ~ nt ~ m ~ t, the implants according to the invention ~, ollllJI ~, l ~ nC. ~ L 105 to lol cells. More preferred ~ lPm ~ nt, they in 106 to 108.
More ~ lellell ~, in the implants of the invention, the matrix extracellular comprises a gelling compound and év ~ nt ~ ml ~ nt a support allowing the anchoring of the ceriules.
For the preparation of the implants according to the invention, different t, vpes of gelling agents can be used. Gelling agents are used for cell embedding in a matrix having the cnn ~ titl-tinn of a gel, and to promote the anchoring of the cells on the support, if applicable. Different cell damage agents can therefore be used as gelling agents, such as in particular collagen, gelatin, 20 ~Iy~ll~ o~ly~ , the ~il,.wle~ e, lectins, etc. Preferably, one uses in the framework of the present invention collagen. It may be original collagen human, bovine or murine. More preferred ~ n ~ m ~ nt type 1 collagen is used.
As indicated above, the l ~ kl ~ - according to the invention ~ lelul ~
AvA ~ r,.- ~ a support allowing the anchoring of the cells. The term anchor 2s designates any form of biological and/or chemical and/or physical illness involving the a&esion and/or the fixation of the cells on the support. In addition, cells can either cover the support used, or penetrate inside this support, or both.
It is preferred to use within the scope of the invention a solid, non-toxic and/or biocompatible. In particular, one can use fibers of ~ n ~ eLllylèl ~ e 30 (PI ~ E) or a carrier of biological origin.
The implants according to the invention can be implanted at different sites of the organism. In particular, 1 ';"l,'A ~ ll can be performed at the level of the cavity r-~ritnn~, in the subcutaneous tissue (suprapubic region, iliac fossae or inguinales, etc.), in an organ, a muscle, a tumour, the central nervous system, wog5n5804 2~ ;8~2~ P l/r~
or under a mucous membrane. The implants according to the invention are pd Li ~, uliè. ~ lt advantageous in that they make it possible to control the release of the product ll,f~ in the organism: This is first of all determined by the multiplicity of infecuon and the number of implanted cells. Then release can be s controlled either by the removal of the implant, which stops .i ~ rti ~,., t the treatment, or by the use of systems of ~)-~; v-- adjustable, making it possible to induce or suppress gene expression 1~
The present invention thus offers a very effective means for the treatment or disease prevention .-eulu ~ eld ~ iv ~. It is particularly suitable for the treatment of Alzheimer's, Parkinson's, ~ --nfln ~ ffm and rALS diseases. The vectors d ~ v ~ ilfJu, ~ ælon the invention also have significant advantages, linked in particular to their very high efficiency in infecting nerve cells, making it possible to carry out infections from small volumes of viral suspension.
In addition, the infection by the adenoviruses of the invention is very localized at the injection site, which avoids the risk of diffusion to neighboring cerebral structures.
In addition, this processing may concern both humans and any animal such as such as sheep, cattle, animals ~ (dogs, cats, etc.), horses, fish, etc The present invention will be more c. ~ described using the examples which follow, which should be considered as illustrative and not limiting.
Lf~ende des f~ res Figure 1: Rt l..~s~..i< ii~JI~ of vector pXL2244 Figure 2: Representation of the vector pSh-Ad-BDNF
2s Techni~les ~énérales de biolo~ie~
The methods used in molecular biology such as extractions yl ~ fll ~ Lv ~ of DNA 1 ~, the ff ~ ntrif ~ finn of DNA 1 ~; fll ~ f in cesium chloride gradient, the ~ JIIUI ~ on agarose or acrylamide gels, lapufification of DNA fragments by f I ~, L uéluLioll ~ the extraction of proteins with 30 phenol or phenol-~, -vru--the, DNA precipitation in saline medium by ethanol or isopropanol, the L~ ru~ ALiull in Escherichia coli, etc... are well known to those skilled in the art and are ill (.. "1 ~,. ~ 1 l described in the literature [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning. a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, woss/2s80.1 2 ~ /r~_~
Cold Spring Harbor, NY, 1982; Ausubel FM et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
- Plasmids of the pBR322 and pUC type and the phages of the M13 series are original W~ iC (Bethesda Research 1.~ . ";~
s For ligations, DNA fragments can be separated by size by ~ lF.l ~ v ~ vl ~ e in agarose gels or ~ ld ~ lu i ~, phenol extracts or by a phenoVchloroform mixture, precipitated with ethanol then incubated in the presence of DNA
phage T4 ligase (Biolabs) according to - ~ supplier.
The ~ r ~; r- ends 5 'IJIV ~ Ul .. ~ can be done by the 10 Klenow fragment of DNA Polymerase I from E. coli (Biolabs) according to the ~,r;-~
wire -~; c~. The destruction of the ends 3' lulvèl ~ is carried out in the presence phage T4 DNA polymerase (Biolabs) used according to the. ~ - of maker. The destruction of the ends 5 '~JIvélll-....l-~., is carried out by a treatment mediated by the Sl nuclease.
Ld ~u F~ directed in vitro by oli~odév~llu~levLdè~ ~lltl.éLi~ue~ can be carried out according to the method developed by Taylor et al. [Nucleic Acids Res-(1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham.
The ~ ,l,r;. ~; as DNA fragments by the so-called PCR technique Lolymerase-catalyzed Chain _eaction, Saiki RK et al., Science ~Q (1985) 1350^
1354; Muliis KB and Faloona FA, Meth. Enzyme. 1~ (1987) 335^350] can be carried out using a "DNA thermai cycler" (Perkin Elmer Cetus) according to the from the manufacturer.
Checking '~' sequences. can be done by the method developed by Sûnger et al. [proc. Natl. Acad. Science. USA, 74 (1977) 5463-5467] en using the kit distributed by Amersham.
Examples Example 1: Col.,~, . of the vector pSll-Ad-BDNF.
This example describes the :vlliflucl;vll of a vector, Vl~ a sequence DNA encoding BDNF under the control of a promoter consisting of the LTR of rous sarcoma virus (LTR^RSV).
1.1. Starting vector (pXL2244): The plasmid pXL2244 contains the cDNA of ApoAI under the control of the LTR promoter of the RSV virus, as well as sequences of rlvv;.us Ad5 (Figure 1). D was constructed by inserting a Clal^EcoRV fragment Wo 9s/25804 l~/r~: .'t~
containing the cDNA encoding the preproApoAI in the vector pLTR RSV-~gal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626), digested by the same enzymes.
1 ~ Cloning of a cDNA encoding prepro-BDNF. The complete cDNA
5 encoding rat prepro-BDNF (790 bp) was cloned from a DNA library rat genomic by the PCR technique, using as primer the ..1;~;...~". lf~ , following:
O~ f lf~ 5': 5'-TTCATCGAATTCCACCAGGTGAGAAG-3' (SEQ ID nl) Oli ~ tiflf ~ 3': 5'-AATATAATCTAGACAACATAAATCC-3' (SEQ ID n"2) O The 5 'region of the sequence obtained was then mf ~ difié by insertion of a Clal restriction site, 25 bases upstream of the ATG. This site was introduced by PCR at average of the following ~ ,..1.5,.1;.1,:
o~.5~5': 5'-TAGCTTCATCGATTTCCACCAG-3' (SEQ ID n3) O~i~,. ,.~, ., lf~"L;~ l~ 3': 'i'-AATATAATCTAGACAACATAAATCC-3' (SEQ ID n4) The sequence thus obtained has ensLIite been subcloned into the plasmid pCRlI
(Invitrogen) to generate the pCRII-BDNF plasmid.
1.3. Construction of the vector pSh-Ad-BDNF
This example describes the Cu.l~LIu.:Liwl of the pSh-Ad-BDNF vector containing the 20 sequence encoding prepro-BDNF under the control of the LTR of the RSV virus, as well as sequences of the ~ dé-luvi-us Ad'i perrnettant the ~ ", ~ "-- in vivo.
The pCRII-BDNF vector was digested with the ClaI and KpnI enzymes, and the resulting 0.85 kb fragment containing the coding sequence for prepro-BDNF a then isolated and purified by ele, L.-, '~ ae on an LMP agarose gel ("Low Melting 2s Point"). PArAll"~ t, the vector pXL2244 was digested with the same enzymes of restriction Clal and Kpnl, then precipitated after inactivation of the latter. The vector resulting linear, prf ~ Al ~ lllf ~ mf-nt isolated and purified by ele-, L u, ~, ', v, ~: on an agarose gel, and the 0.85 kb fragment were then ligated to generate the vector pSh-Ad-BDNF (Figure 2).
30 Example 2 ~ Yector pSll-Ad-BDNFtag.
This example describes the Cu.~LIu~Liù-l of a second vector ~ "~"t a fusion DNA sequence encoding BDNF under the control of a promoter consisting of the rous sarcoma virus LTR (LTR-RSV).
Woss/2s80~ 21 8 4 2 0 0 ~l/r~
2.1. Generation of fusion DNA: In this example, an alternative form - ~ DNA sequence encoding prepro-BDNF was const ~ uite. This form was obtained by insertion, at the 3' terminal end of the sequence described in the example s 1.2., of a sequence coding for an epitope of seven amino acids (tag) recognized by an available antibody ~:u~ h,.l.~ (IBI, Integra Flincci~on~c~ Eaubonne, France). The sequence of the region thus fused is as follows (SEQ ID n5):
Arg Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp ***
Ct er Seg, ~ nn, BDNF
5 The sequence thus obtained was then subcloned into the plasmid pCRII
(Invitrogen) to generate the pCRII-BDNFtag plasmid.
2.2. Construction of the vector pSh-Ad-BDNFtag This example describes the cu ~ lsl ~ uCliull of the pSh-Ad-BDNFtag vector containing the fusion sequence encoding prepro-BDNF under the control of the LTR of the RSV virus, 20 as well as sequences of the Ad5 adenovirus allowing the ~ l. in vivo.
The pCRlI-BDNFtag vector was digested with the ClaI and Kpnl enzymes, and the resulting 0.87 kb fragment containing the prepro-BDNFtag coding sequence was then isolated and purified by ~r~ on an LMP ("Low Melt;ng Point"). r ~ t, the vector pXL2244 (Example 1.1.) was digested with the 25 same restriction enzymes ClaI and Kpnl, then precipitated after inactivation of these latest. The resulting linear vector, pr ~ m ~ nt isolated and purified by lu ~ llulè ~: on an agarose gel, and the 0.87 kb fragment was then ligated to generate the pSh-Ad-BDNFtag vector.
Example 3. Fo ~ ~; on: ~ l; t ~ vectors pSh-Ad-BDNF and pSh-Ad-BDNFtag The ability of the pSh-Ad-BDNF and pSh-Ad-BDNFtag vectors to express on cell culture an active hi~iq Pml~nt form of BDNF was demonstrated by lla-l:,rt:liull transient of COS1 cells. For this, the cells (2.106 cells per ~1 ~42~
Wo 95/25804~rJvS,'~
box 10 cm in diameter) were l ~ are ~ éea (8, ug of vector) in the presence of Transfectam. After 48 hours, the cell culture supernatant was harvested. From serial dilutions (1/200 and 1/50) of this supernatant were then added to primary cultures of septal neurons (Hefti et al. In Dissection and Tissue cultures: Manual of the Nervous System (1989) 172, Alan R. Liss, Inc). The effect trophic (cell survival and neuritic growth) on these cultures was observed after coloring, and the effect di ~ réle..L; ~ u by assaying the expression of the enzyme choline acetyl transferase (ChAT), according to the technique described by Fonnum (J. Neurochem. 24 (1975) 407).
Example 4. CO.L~L1. dec ~d~..v.;. ua ~ tc containing a sequence encoding BDNF
4.1. Construction of the Ad-BDNF adenovirus The pSh-Ad-BDNF vector was linearized and ~:uLIc~arecL~ with a vector deficient adenoviral, in the helper cells (line 293) providing in transit the 15 functions encoded by the E1 regions (E1 A and ElB) of du ~. ~ vvu uS.
Plus ~.ec;.,emcl.L, the Ad-BDNF adenovirus was obtained by ..
homolog in vivo between the ~ r.uv;-ua mutant Ad-dll324 (Ilu ~ d ~ a ~ d et al., Cell 31 (1982) 543) and the vector pSh-Ad-BDNF, according to the following protocol: the plasmid pSh-Ad-BDNF and the ~é..vvi-us Ad-dll324, linearized by the enzyme Clal, were co-0 transfected into line 293 in the presence of calcium phosphate, to allow the. ,. . h~m~ g~ The adenoviruses ~ " ~ thus generated were '~' by plaque purification. After isolation, the DNA of the adenovirus .. ' was amplified in cell line 293, resulting in a supernatant culture containing the; ~ d ~, v; -u ~ ~ culllvlll ~ l ~ unpurified defective L having a titre5 of about 101 pfu / ml.
The viral particles are then purified by gradient centrifugation. cesium chloride according to known techniques (see in particular Graham et al., Virology 52 (1973) 456). The Ad-BDNF adenovirus can be stored at -80C in 20% glycerol.
4.2. Construction of the l~delluviu ua Ad-BDNFtag wo 9s~25804 2 7 8 4 2 0 0 Ad-BDNFtag adenovirus was constructed using the same protocol as rd ~ uvilus Ad-BDNF, but using as starting vector the vector pSh-Ad--BDNFtag.
Example 5. Ii~ .o of ad,..~, . ;. ~Ad-BDNF
s The capacity of the Ad-BDNF adenovirus to infect cells in culture and to express in the culture medium a biologically active form of BDNF has been demonstrated by infection of the human 293 and rat PC12 lines. The presence of Active BDNF in the culture supernatant was then determined under the same conditions as in Example 3.
These studies permenent to show that lI ~ d ~ V; LUS expresses well a form .; activates BDNF in cell culture.
Example 6: Transfer in YiVo of the BDNF gene by an ad,.- ~, v;. ~ ~ c 'to rats with fimbria-fornix lesion This example describes the transfer of the BDNF gene in vivo using a vector adenoviral according to the invention. It shows on an animal model of the lesion of the fimbria-fornix, that the vectors of the invention make it possible to induce the expression in vivo of ~ amounts of BDNF.
On pr ~ h ~ nt anesthetized rats, the septo-l ~ l ,.a, ~ "'l); l- ~ (fimbria-forrlix) was severed at the level of the left l~c. This mechanical lesion has was performed using a retractable surgical knife. The :w-dulnJlé~
~Li~ ~iuu~ used for this purpose are, relative to bregma: AP: -1.7; ML: +1.5;
V: -5.5 to -0.5.
The recombinant adenovirus BDNF was injected '' after the lesion, in the middle nucleus of the septum and in the dorsal part of the deafferented ili~ al-l,e (~ ~ on the side of the lesion). More IJI ~ uliè ~,.LL, the injected adenovirus is r;~&~ vilu~ Ad-BDNF prepared in example 4.1., used in purified form 5,106 pfu/~l), in phosphate saline solution (PBS).
The inje ~ tions are made using a cannula (external diameter 280 ~ lm) connected to a pump. The injection speed is fixed at 0.5 Ill/min, after which the cannula remains in place for 4 minutes ~, Y-~ S before being reassembled. The Wo 95/2580~ 2 1 ~ 4 2 ~ J/r~ . 01 injection volumes in the ~ and the septum are the ~ e ~ ive ~ L 3, ul and 2 ~ LI.
The ~ .ILii ~ the injected adenovirus is 3.5. 106 pfu/~
For injection into the hirr~nr~, the ~8~ ele~ ue~ are the following: PA=4; M1 =3.5; V--3,1 (the l:WII'' AP and ML are .l~ .,... by s compared to the bre ~ ma, the CWI ~ V compared to the surface of the cranial bone at the level of bregma.
For injection into the septum, the :wld~ Léli' , are the following: PA=1; M1,=1; V=-6 (the cwrdata AP and Ml, are ~ by relative to the bregma, the V coordinate relative to the surface of the cranial bone at the level ~o of bregma. In this condition, the cannula presents an angle of 9 degrees with respect to the vertical (in the medio-lateral direction) in order to avoid the median venous sinus.
The effects ~ of the hl ~ of the _.l ~, v; ~ us according to the invention were highlighted by three types of analysis: an analysis 1 ~I.~T~ and . a quantitative analysis and a C ~ elll ~ lle analysis.
5 Anh¦~vsehicfolo~ic--.oeti.. "".. ,h .l~
-~! wo 95/25804 2 ~ 8 ~ P l~r~.
Mechanical damage to the fimbria-fornix induces loss of neurons ~ vliu. ~ Luw (revealed in;" ~ ~ iP by an anti-choline acetyl antibody transferase, ChAT) in the median septum, as well as denenation ~llol;n~;qhe in ~ (detected in histochemistry by the activity of acetyl choline esterase, AChE ~.
s The hi~f~ll~iq~P analysis of the injected ceneaux is carried out 3 weeks after injection iu.Lld ~ el ~: b-dle Ad-BDNF adenovirus. For this, animals are sacrificed, under anesthesia, by il.ud ~ ud; d.lu ~ infusion of 4% paraformaldehyde, After ~,L,~ C.IL, po6t-fixation and ~.r.,~ iion, the ceneau is cut in the cryomat according to the coronal plane: serial coronal sections 30 μm thick sonf. made on the entire length of the median septum and at the anterior, medial and posterior levels of ~ ' hirr ~ mrP For the median septum, sections spaced 180 μm (1 section out of 6) are stained with cr ~ wyl violet (rour to assess neuronal density) and by an anti ChAT antibody (Biochem) (to identify neurons ~
The ~'' method. is that of 6h~Ldvih~ -biotin peroxidase revealed by DAB. For the;-:~ e, cuts spaced 180 μm apart are stained according to the ~:q~P method for AChE (acetyl choline esterase) in order to detect the innervation ~ vli~; iqu~. Sections are mounted on glass slides.
An~lysis ql~ntit~tive The number of neurons I~. (ChAT positive) in the septum median is the parameter for evaluating the effects of d~ V;1hS Ad-BDNF. the ~.l~nlllJil is made on a sample (1 cut out of 6 along the entire length of the middle septum). For each section, the ChAT positive neurons are counted separately on both sides of the septum. The cumulative results for all cuts are expressed as the ratio of the number of rositive ChAT neurons on the injured side to the 2s number of positive ChAT neurons on the non-injured side.
Ans~jyse~l"",~ ",~"' the It is known that a bilateral lesion of the septo-l~ pathway leads to memory deficits. To assess the effects r, l ~. L~"u-els protective of an injection of ad ~ llvYilus Ad-BDNF on this type of lesion, the mnesic ~ lroll "dll ~ animals are analyzed during 2 tests ~:V~I}JOI~ IILhh~ the Morris pool test (visuo-spatial reference memory) and the TMTT test ("two-trials memory task";"short-term memory of a new ~IIV;IUIh..,.ll~llL").
wo ss/2s80~ 2 1 8 4 2 0 0 r~l~rlvs~
Example 7: In vivo transfer of the BDNF gene by an ad;.luv;. ~:~' to rats with nigrostriatal lesion This example describes the transfer of the BDNF gene in vivo using a vector adenoviral according to the invention. It shows on an animal model of the pathway lesion nigro-striatal, that the vectors of the invention permenent to induce the expression in vivo of amounts ~ P ~ --, of BDNF.
In prP:lh~ pnlpnt ~m~h.oei~ rats, the nigro-striatal pathway was injured at the median level of the pheasant ~ - PlJ ~; q ~ (MFB) by injection of the toxin 6-hydroxy dopamine (60H-DA). Cene chemical lesion by injection was unilateral, 0 according to the following CWld ~ llu ~ .Lel ~: UI ~ lid ~ U ~: AP: O and -1; ML: +1.6; V: -8.6 and -9 (the c~ ' AP and ML are ~If'l.'' IIIII~PP~ pa~ relative to the bregma, the coordinate V with respect to the dura mater). The incisor bar is fixed at ni~water +5 mm.
The adenovirus leculllLl ~ BDNF was injected r ~ ''' after the lesion, in the substantia nigra and the striatum, on the side of the lesion. More ~ uli~ lle~
r ~ dé-- ~ v; - uS injected is the adeno ~ irus Ad-BDNF prepared in Example 4.1, used under purified form (3.5 106 pfu/III), in a phosphate saline solution (PBS).
The injections were performed using a cannula (external diameter 280 llm) connected to a pump. The injection speed is fixed at 0.5 ~lmin, after which the cannula remains in place for 4 minutes ~ ~, .l, lP, ~ 5 before being reassembled. Injection volumes in the striatum and substantia nigra are lPs~,Puli~ 2x3 111 and 2,ul. The ~ - l of ~ l;, lu v; ~ u ~ injected is 3.5. l 06 pfu/~
For injection into the substantia nigra, the ~w~ ul~ u~s are the following: AP--5.8; ML=+2; V--7.5 (the -)U-du..ll~r,:3 AP and ML are 25 pat compared to bregma, the ~: U ~ J ~ dU. ~. ~ O ~ V by r8pport to the hard ~ mother).
For injections into the striatum, the ~:ou-dO~Ul~s ~éUId~ U~ are the following: AP=+0.5 and -0.5; ML=3; V=-5.5 Oes ~U-dUn~ S AP and ML are ,l~l~,l,...~Pp~relativetobregma~thecoordinatevrelativetothedura mater)~
The effects ~ iap ~ uli ~ u ~ s of the i ~ of the adenovirus according to the invention 30 were highlighted by three types of an81yse: a hi ~ lneiT-P analysis and ,.. ,.. ,1.,~l. ~ 1,;..;.1.. ~ a quantitative analysis and a col--~-l~ analysis ~ Woss/2s804 2 l ~3 4 2 0 0 ~ r~ h~ ~
A~A~lvse l.: ~t~ and i"""",~
Chemical injury to the nigrostriatal pathway induces neuronal loss in the substantia nigra as well as the denervation ~Ar.~ in the striatum revealed in "",~..~'.'~. , l ~ if ~ by an anti-tyrosine antibody l, y ~ uAyl ~, TH), s The ~ i"~ analysis of the injected brains is carried out 3 weeks after the injection;,.~ .5.,'il...,1r of the ~ lé~lu.;.us Ad-BDNF under the conditions described in Example 6. The coronal serial sections 30 μm thick are made in the substantia nigra and striatum. Cuts spaced 180 μm (1 in 6 cuts) are stained with cresyl violet (to assess neuronal density) and ;...." ~ q- ' - by lo an anti-tyrosine antibody ~J~ yl~ (TH) (to detect neurons , HAS.' . ~;q; ~ in the substantia nigra and their innervation in the striatum).
ql~ntitAfive analysis The number of neurons ~ (TH positive), in the substance black is the parameter for evaluating the effects of rd~ièlluvi~uS Ad-BDNF. the counting is carried out on a sample (1 cut out of 6 over the entire length of the substantia nigra). For each section, the TH positive neurons are counted separately on both sides of the substantia nigra. The cumulative results for all cuts are expressed as a proportion: number of TH positive neurons on the side injured by relative to the number of TH positive neurons on the uninjured side.
20 An~lyse~u,,l~,u,~..,....lAlf~
Afrn to evaluate the protective functional effects of an injection of ~ die l ~ vl. US
Ad-BDNF on the lesion of the nigro-striatal pathway, the sensory-motor ~ r~" ~ ~ ~e~
animals are analyzed during 2 tests cu..,~t~ .,u,u~: the rotation test induced by agonists '~, u,-~ u ph;.-e, rll~ and levodopa~, 2s and the paw-reaching test.
Example 8: In vivo transfer of the BDNF gene by an ad;., ~ ''to rats with a perforator lesion This example describes the transfer of the BDNF gene in vivo using a vector adenoviral according to the invention 11 shows on an animal model of the lesion of the way 30 perforating, that the vectors of the invention make it possible to induce the expression in vivo of quantityS th., ~; of BDNF.
WOgs/25804 21 84200 r~llr~s~
In anesthetized prPolohlPmpnt rats, the entor~hino~ pathway (perforating way) was cut lmil ~~-alPmPnt using a surgical knife. The wuld~u)l~OeS ~Lélé~ ueS used for this purpose are, with respect to lambda: AP:
+0.75; ML: +4.1 to 6.6; V: -7.7 (coordinate V determined with respect to the hard-s mother).
The adenovirus ~ecoll~ BDNF is injected '' after the lesion, either at the level of the lesion or at the level of ~ P at of the entorhinal cortex. Plusl ~ alLic ~ Jlie ~ ell ~ vilus injected is the ~ lellov; read Ad-BDNF prepared in Example 4.1., used in purified form (3.5106 pfu/III), in a saline solution 0 phosphate (PBS).
The injections were performed using a cannula (external diameter 280 m) connected to a pump. The injection speed is fixed at 0.5 ili/min, after which the cannula remains in place for 4 minutes s ~;, es before being lifted. The 15 volumes of injection in 1'1,; l, 1, ~ the entorhinal cortex and the site of lesion of the perforating route are the ~ elivelllellL 3 111, 2 111 and 2, ul. La - "~ d`d ;léll~, vi, us injected is 3.5. 106 pfu/~JI.
The effects l1 ~ P ~ "I .. I; q ~ r; of the r, ~; "" of the dd ~ lVilU ~ according to the invention can be demonstrated by an analysis cu~l~,u~e~lle l~le under the conditions of 20 Example 6.
~ WO95l25804 2 ~ 84~ r~
T.TC~B DF ~Fn1TT~NoT~
(1 ) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANT:
A,l NAME: RHONE-POULENC RORER SA
~ C VILLE20ANTovNyue RaVmond ARON
1 0 TH COUNTRY: FRANCE
ZIP CODE: 92165 (ii) TITLE OF THE INVENTION: rP virus, ';nAntc, preparation and 15 ut~l~cAt1nn in gene therapy (iii) NUMBER OF SEQUENCES: S
(iv) OPDINATOR READABLE FORM:
IB) nRnTN~ATT~rlR - IBM PC ~ f ~ hl P
C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2~ TNFoRMATTnN POTJR T~A sT~n In NO: 1:
ARA-~TRRTc~ICS OF THE SEQUENCE:
(A~ LENGTH: 26 pa~ers of bases (B) TYPE: r,ucleic acid (D) Linear CONFIGURATION
(ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(iii) ~Y~U~ lUU~:~ NO
(iii) ANTI-SENSE: NO
(Xi) L)li:~U~l~llUN OF SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
~Z) INFnR~A~IQN Ptl[IR A ,~T~n TD NO
L . 2.
(i) t~AR~ UU~:~ OF THE SEQUENCE:
(A. LENGTH: 25 base pairs (Bl TYPE: nucleic acids (D CONFIGURATION linear (ii) TYPE OF MOLECU1E: cDNA
(iii) ~lYI:~ULII~ UU~. NOPE
(iii) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:
MTATMTCT A~A('AA~'ATA MTCC. 25 ~2~ 1NFnRMAq'I(7N PnrlR TA sFn Tr~ NO: 8:
ARA~TT~RT.STIC5 OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 22 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF STRANDS: Aimple WO 95/2580~ /rl t (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLBCULE: cDNA
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(ili) ANTI-SENSE: NO
(xi~ D~ c~ lN~ N OF SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
(2~ TN~)RMATION FOR TA ST~-l Tn NO: 4:
(i) ~'AR ~ U~!;S OF THE SEQUENCE:
(A, LENGTH: 25 base pairs (B' TYP-: nucleic acid (C' NUMBER OF STRANDS: single (Dl CON-IGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(iii) ~Y~O ~ Uu~:: NO
(iii) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:
AATATAATCT R~ArAAf~A~A AATCC 25 25 ( 2 ~ ~ORMATION FOR SEO In NO: S:
(i) t'ARA~ Lll~Ul:i~ OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 30 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF STRANDS: double (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
( iii ) HYPOTHETIC: NO
(iii) ANTI-SENSE: NO
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5:
AGA GGC GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC TAG , 30 40 Arg Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp ***