UTILISATION DE PRINCIPES ACTIFS PROTEGES VIS-A-VIS
DE LA DEGRADATION DANS LE RUMEN COMME
HEPATOPROTI=?CTEURS
La présente invention concerne l'utilisation de principes actifs protégés vis-à-vis de la dégradation dans le rumen chez le ruminant et suc~tout leur effet sur son état hépatique en début de lactation.
Il est connu d'après l'article de Remond et al (Ann. Zootech.) 1989, 38, 129-13î) qu'une méthionine protégée donnée à des vaches en début de lactation permet d'obtenir une augmentation de la quantité de lait produite au cours des deux premières semaines après la mise bas de 2,6 et 1,2 kg/jr et une augmentation moyenne des protéines d'environ 2 î g par jour ce qui se traduit par une augmentation du taux protéique moyen du lait de 1 à 2°~0.
Il est aussi connu selon l'article de Chilliard et al. (Reprod. Nutr.
Develop., 198î, 2î (2A), 32 î-398) qu'en début de lactation, la capacité d'ingestion des vaches laitières est affaiblie; la vache laitière se trouve en déficit ënergétique et pour le combler, elle mobilise ses réserves corporelles. Les triglycérides stockés dans les tissus adipeux sont hydrolysés en acide gras et transportés jusqu'au foie, dans lequel ils sont transfo~7nés en triglycérides et en corps cétoniques. La capacité de recyclage et d'exportation de ces acides gras non estérifiés par le foie sous forme de triglycérides est faible car ils doivent être transportés par l'intermédiaire de lipoprotéines telles que les VLDL (lipoprotéines de très faible densit:é). Or, il est connu selon (article de Rayssiguier et al (Res. Vet. Sci., 1988, 45, 389-393) qu'en début de lactation les VLDL sont synthëtisèes en très faible quantité ce qui entraine un surstockage de graisse au niveau hépatique et par la même se traduit paufois par une stéatose hépatique. Cette faible synthèse de VLDL serait due à une disponibilité
insuffisante d'un des constituants lipidiques (cholestérol) phospholipides) ou protéique (apoprotéine B).
Il est apparu de façon tout à fait surprenante que chez les ruminants l'ingestion de principes actifs protégés vis-a-vüs de la dégradation dans le rumen et libérant lesdits principes actifs dans la caillette et/ou l'intestin permettait de réduire ou de prévenir la stéatose hépatique.
21 4~ 8 7 8 0 USE OF PROTECTED ACTIVE INGREDIENTS
DEGRADATION IN RUMEN AS
HEPATOPROTI =? CTEURS
The present invention relates to the use of active principles protected vis-at-screw of the rumen degradation in the ruminant and suc ~ all their effect on his condition hepatic at the start of lactation.
It is known from the article by Remond et al (Ann. Zootech.) 1989, 38, 129-13î) that a protected methionine given to cows at the start of lactation allows get an increase in the amount of milk produced in the two raw weeks after giving birth of 2.6 and 1.2 kg / day and an average increase in proteins of around 2 g per day which results in an increase in rate average milk protein from 1 to 2 ° ~ 0.
It is also known according to the article by Chilliard et al. (Reprod. Nutr.
Develop., 198î, 2î (2A), 32 î-398) that at the start of lactation, the ingestion capacity of cows dairy is weakened; the dairy cow is in an energy deficit and for the fill, it mobilizes its body reserves. Stored triglycerides in the adipose tissue is hydrolyzed to fatty acid and transported to the liver, in which they are transfo ~ 7nes in triglycerides and ketone bodies. The ability to recycling and export of these fatty acids not esterified by the liver in the form of triglycerides is weak because they have to be transported through lipoproteins such as VLDL (very low density lipoproteins). Now, it is known according to (article by Rayssiguier et al (Res. Vet. Sci., 1988, 45, 389-393) only at the start of lactation the VLDL are synthesized in very small quantities which leads to overstocking of fat in the liver and the same sometimes results in steatosis hepatic. This weak synthesis of VLDL would be due to an availability insufficient of one of the lipid (cholesterol) phospholipid or protein components (apoprotein B).
It appeared quite surprisingly that in ruminants ingestion of active ingredients protected against degradation in the rumen and releasing said active ingredients in the abomasum and / or the intestine allowed to reduce or to prevent fatty liver disease.
21 4 ~ 8 7 8 0
2 Cette réduction de la stéatose hépatique est due d'une part à une augmentation de la libération des lipoprotéines hépatiques qui se traduit par l'augmentation de l'expression du gène hépatique de l'apoprotéine B
(augmentation de l'ARNm de l'apoB) et de la teneur intrahépatique de l'apo B~ en effet, l'apoprotéine, en tant qu'élément structural indispensable à la synthèse de VLDL, est l'un des facteurs majeurs limitants de la production de particules riches en triglycérides.
Les principes actifs protégés utilisés pour traiter les animaux peuvent être choisis notamment parmi les acides aminés, les aminoalcools, les polyols, les vitamines ou les mélanges de ces composés entre eux. Parmi les acides aminés on peut citer, à titre non limitatif, la méthionine et la lysine~ parmi les aminoalcools la choline;
parmi les polyols le sorbitol et parmi les vitamines, la niacine.
L'invention telle que revendiquée est toutefois restreinte à l'utilisation d'au moins un principe actif constitué par un acide aminé non associé à la choline et protégé vis-à-vis du rumen pour la préparation d'une composition destinée à être administrée aux ruminants par voie orale en vue de prévenir ou de traiter la stéatose hépatique.
La composition peut être administrée aux ruminants en vue de diminuer la teneur en triglycérides au niveau hépatique, ou encore augmenter la synthèse de l'apoprotéine B hépatique.
Comme acide aminé, on préfère utiliser la méthionine protégée.
21 4~878p 2 This reduction in fatty liver disease is due on the one hand to an increase in the release of hepatic lipoproteins which results in increased of the expression of the hepatic gene of apoprotein B
(increase in apoB mRNA) and content intrahepatic of apo B ~ indeed, apoprotein, as as a structural element essential to the synthesis of VLDL, is one of the major limiting factors in the production of particles rich in triglycerides.
Protected active ingredients used for treat the animals can be chosen in particular from amino acids, amino alcohols, polyols, vitamins or mixtures of these compounds with each other. Among amino acids include, but are not limited to, the methionine and lysine ~ among the amino alcohols choline;
among the polyols sorbitol and among the vitamins, the niacin.
The invention as claimed is however restricted to the use of at least one active ingredient consisting of an amino acid not associated with choline and protected from the rumen for the preparation of a composition intended to be administered to ruminants by orally to prevent or treat steatosis hepatic.
The composition can be administered to ruminants in order to lower the triglyceride content to the level hepatic, or even increase the synthesis of apoprotein B liver.
As the amino acid, it is preferred to use the protected methionine.
21 4 ~ 878p
3 Parmi les composés permettant une protection efficace dans le milieu du rumen et une libération dans la caillette ou l'intestin grêle on peut citer deux grands types de composés. Certains de ces composés permettent une protection et une libération qui est provoquée uniquement par un phénomène chimique, due à la. différence de la valeur du pH entre le rumen (5-6) et la ~~aillette (2-3); on peut citer dans cette catégorie d'abord les polymères pH
sensibles tels que les copolymères du styrène et de la vinylpyridine en mélange avec des corps gras tels que les acides gras, les huiles végétales ou animales hydrogénéès.
De nombreux brevets tels que les brevets US 4 877 621 ou US 3 Among the compounds allowing protection effective in the middle of the rumen and a release in the abomasum or small intestine we can cite two large types of compounds. Some of these compounds allow protection and a release that is brought about only by a chemical phenomenon, due to the. difference in value the pH between the rumen (5-6) and the ~~ fin (2-3); we can first mention in this category pH polymers sensitive such as copolymers of styrene and vinylpyridine mixed with fatty substances such as fatty acids, hydrogenated vegetable or animal oils.
Numerous patents such as US patents 4,877,621 or US
4 832 967 décrivent des compositions contenant de tels composés. Ces compositions permettent une excellente protection in vivo et in vitro des substances nutritives ou médicamenteuses et une bonne libération des principes actifs. Elles présentent le seul .inconvénient de contenir un produit chimique de synthèse qui d'un point de vue alimentaire et écologique n'est pas toujours très apprécié
tant du point de vue des autorités administratives d'autorisation de mise sur le marché que de celui des consommateurs .
Dans cette première catégorie de compositions ôù
la libération du principe actif est provoquée uniquement par un phénomène chimique, on peut citer, aussi les compositions à base de chitosane et d'acides carboxyliques.
Ces compositions sont par exemple décrites dans le brevet français publié sous le numéro 2 524 269. Ces compositions contiennent une quantité de principes actifs toujours inférieure à 60~ en poids et plus préférentiellement de 3a 2~ ~~78~
l'ordre de 30$ pour permettre une protection au niveau du rumen de l' ordre de 80 à 90 ô sur 24 heures et contiennent, en outre, une ou plusieurs charges minérales pH sensibles, en quantité notable (10 à 20% en poi.ds).
Une deuxième catégorie de brevets décrit des com-positions utilisant les propriétés d'hydrolyse enzymatique de certains composés naturels tels que la zéine. Parmi ces brevets on peut citer le brevet US 4 983 403 ou la demande de brevet européen EP 0 406 041.
La description et les exemples non limitatifs qui suivent décrivent l'effet des principes actifs décrits précédemment (acides amines, ami_noalcools, polyols et vitamines), protégés vis à vis de la dégradation dans le rumen et libérables dans la caillette ou l'intestin grêle, sur la libération des lipoprotéines hépatiques riches en triglycérides ainsi que l'effet su:r la synthèse de l'ARNm de l'apoprotéine B et sur la libération d'apoprotéine B au niveau hépatique.
~1 487 8 0 L'objectif du présent essai est d'évaluer dans quelle mesure une supplémentation en rnéthionine protégée contre les fermentations du rumen préparée notamment selon le brevet US 4 877 621 peut limiter la stéatose hépatique et la cétose chez des vaches grasses en début de lactation recevant une ration présentant une faible concentration énergétique.
Matériel et méthodes 1 - Animaux Quinze vaches sont réparties en 2 lots équilibrés sur la date de vêlage, la note d'état coporel, le poids vif 3 mois avant vêlage et la production laitière maximum de la lactation précédente.
Les cieux lots sont les suivants : témoin sans méthionine (T, 8 vaches), lot recevant de la méthionine protégée (M, 7 vaches), une ayant dû être sortie de l'expérience au début de la partie post expérience (42 jours après le vêlage).
2 - Alimentation a) Fin de~Testation Les animaux reçoivent de l'ensilage de maïs à volonté, avec du concentré
selon la protocole suivant, S(-4) à S(-1) indiquant les semaines avant le vêlage kg S(-4) et S(-2) S(-1) S(-3) Concentr 0,5 1,5 2,5 Tourteaux soja tann 1 1,0 1,0 Tourtaux soja non 0,5 0,5 0,5 tann L'apport de calcium est limité (100 ~;/j puis suppression 3 semaines avant vêlage) et on distribue un supplément d'environ 1 kg de foin par jour.
B. Début de la lactation Les animaux reçoivent, en un repas par jour, une ration complète de composition constante pendant les 3 premiers mois de lactation, contenant 75% d'ensilage de maïs, 20% de tourteau de soja tanné et 5% de tourteau de soja non tanné. On rajoute du concentré minéral vitaminé
(200 g/j), et du foin (1 kg/j).
Méthionine protégée (22 ct/~ ) Distribuée le matin à jeun dans un seau avec 200g de tourteau non tanné, pendant 5 jours à toutes les vaches (15) trois à quatre semaines avant mise-bas, puis tous les jours aux vaches du lot M à partir du 3 ou Sème jour après la mise-bas (au jour 3 à 5 de lactation), jusqu'en 6ème semaine de lactation incluse (42 jours).
Dosaae des lipoprotéines - Séparation des classes majeures de lipoprotéi-nes Les VLDL (lipoprotéines de très basse densité) ont été séparées à partir de 20 ml de plasma par ultracen-trifugation de flottaison: 40 000 tr/min pendant 16 heures et à 15°C.
Les IDL, LDL, HDLI et HDLh (lipoprotéines de den-sité intermédiaire, basse, haute densité légère et haute densité lourde) ont été séparées par gradient de densité â
T
39 000 tr/min pendant 46 heures et à 15°C, selon la technique décrite par Chapman, Golstein Lagrange et Laplaud, J. Lip. Res., 22, 339-358 (1981) et adaptée par Bauchard et al. (1989, J. Lip. Res., 30, 1499-1514).
Nous avons obtenu ainsi 5 classes de lipo-protéines:
- VLDL: d<1,018 g/ml - IDL: 1,018 g/ml<d<1,026 g/ml - LDL: 1,026 g/ml<d<1,060 g/ml - HDLI: 1,060 g/ml<d<1,091 g/ml - HDLh: 1,091 g/ml<d<1,180 g/ml Ces différentes fractions lipoprotéiques ont été
ensuite dialysées à 4°C pendant 7 heures avec un système de microdialyse afin d'éliminer le KBr.
- Séparation des LDL vraies et des HDL very light (HDLvl) dans la zone de densité 1,040-1,090 g/ml Nous avons dans un premier temps vérifié l'hété-rogénité de taille des particules dans la zone de densité
1,040-1,090 g/ml par électrophorèse sur gel en gradient d'acrylamide (gel PAA: 2,5-16%) de tous nos animaux à
chacun des différents stades étudiés. Après s'être assuré
de l'homogénéité de nos animaux, nous avons regroupé les plasmas par stade et par traitement puis isolé les particules lipoprotéiques par ultracentrifugation de flottaison selon le protocole décrit par Laplaud et al. (J.
Lip. Res., 1991, 32, 1429-1439), dans la zone de densité à
1, 040-l, 090 g/ml. Ces lipoprotéines de type HDL et LDL ont été ensuite séparées par chromatographie d'affinité sur colonne d'héparine-Sépharose ce qui nous a permis de sépa-rer et quantifier les particules LDL (sans contamination par des HDL) appelées "LDL vraies" d'une part et des HDL
non contaminées par des LDL d'autre part. Ces particules ont ensuite été analysées, comme les autres classes lipo-protéines séparées sur gradient, notamment la composition chimique.
- Détermination de la composition chimique Sur chacune des fractions lipoprotéiques plasma-tiques comme sur les plasmas totaux, nous avons dosé les apoprotéines A-1 et B par immunodiffusion radiale selon la méthode de Mancini adaptée par Auboiron et al., Reprod.
Nutr. Develop., 2,2275 (1989). Les protéines totales des fractions lipoprotéiques ont été dosées par colorimétrie par la méthode colorimétrique utilisant le réactif â base d'acide bicinchoninic (BCA, Pierce, IL, USA).
- Dosaqe de l'ARNm de l'apo B hépatique Les ARN totaux sont isolés à partir des biopsies de foie (environ 200 mg par le thiocyanate de guanidine/phénol-chloroforme d'aprês la méthode décrite par Chomczynski et Sacchi, Ann. Biochem., 162,156-159 (1987).
La quantification de l'ARNm d'apo B est réalisée selon la méthode suivante: 70g de chaque extrait d'ARN
totaux sont dénaturés en présence de formaldéhyde et dépo-sés par dilutions successives de 1/2 en 1/2 sur une membrane de nitrocellulose en utilisant un appareil de Dot-Blot (Schleicher & Schuell, SRC 26 D Minifold 1) soit 4 dépôts de 30, 15, 7,5 et 3,75~g environ pour chaque extrait d'ARN. L'hydridation est réalisée avec une sonde synthéti-sée â partir d'un fragment d'ADNc de l'apo B humaine puti-fiée en laboratoire et marquée au (aj~P) dCTP
(desoxycytidyltriphosphate) par marquage aléatoire (random priming). L'abondance de l'ARNm d'apo B est calculée par analyse densitométrique d'autoradiographies obtenues après exposition des membranes pendant 16 heures à -80°C.
La comparaison entre les différentes autoradio-graphies étant impossible, nous avons choisi de déposer sur une même membrane les ARN totaux correspondant aux diffé-rents stades de prélèvement (Sl, S2, S4 et S12) de 5 vaches (2 témoins et 3 méthionines ou vice-versa). Ceci nous a permis de déterminer l'évolution des teneurs en ARNm d'apo B au cours du début de lactation et de comparer cette évolution entre les vaches des lots témoins et expérimen-taux.
- Dosage de l'apoprotéine B intrahéoatiaue Les protéines totales intrahépatiques ont été
extraites par homogénéisation de fragments de foie prélevés par biopsie (50 mg) dans une solution de lyse hautement concentrée en détergents (désoxycholate de sodium, Triton X100*) et en inhibiteurs de protéases (benzamidine, PMSF, leupeptine, pepstatine).
* (marque de commerce) Les protéines intrahépatiques totales extraites ont été quantifiées par dosage colorimétrique selon la méthode de Bradford (1976). Des quantités comparables (100~,g) de protéines totales ont été déposées sur gradient de gel de polyacrylamide (3-7,5%) en conditions dénaturantes. Après migration électrophorétique, les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose par électrotransfert. Ces membranes sont incubées en présence d'anticorps polyclonal de lapin anti-apo B bovine.
La fixation de l'anticorps sur la bande correspondant à
l' apo B est révélée en incubant la membrane en présence de protéine A marquée à l'iode 125. Les teneurs en apo B
intrahépatiques sont calculées par analyse densitométrique à partir des autoradiographies obtenues après exposition des membranes pendant 16h à -80°C.
3. Lipides et apoprotéines plasmatiques(Tableau 1) Dès la premiêre semaine de lactation, la concentration en acides gras non estérifiés circulant est très élevée et elle le reste au stade S2; ces taux vont ensuite diminuer de près de 50% (P<0,05) de S2 à S4 (en période post-prandiale), pour atteindre des valeurs très faibles en 512. Les teneurs en cholestérol libre, en esters de cholestérol et phospholipides du plasma subissent une évolution inverse, voyant leur taux augmenter fortement entre S1 et 512, ces taux étant multipliés par des facteurs 4,832,967 describe compositions containing such compounds. These compositions allow excellent in vivo and in vitro protection of nutrients or and a good release of the principles assets. They have the only drawback of containing a synthetic chemical which from a standpoint food and ecological is not always appreciated both from the point of view of administrative authorities marketing authorization consumers.
In this first category of compositions where the release of the active ingredient is caused only by a chemical phenomenon, one can quote, also the compositions based on chitosan and carboxylic acids.
These compositions are for example described in the patent French published under number 2 524 269. These compositions always contain a quantity of active ingredients less than 60 ~ by weight and more preferably from 3a 2 ~ ~~ 78 ~
around $ 30 to allow protection at the level of rumen of the order of 80 to 90 ô over 24 hours and contain, in addition, one or more sensitive pH mineral fillers, in significant quantities (10 to 20% in poi.ds).
A second category of patents describes positions using the enzymatic hydrolysis properties certain natural compounds such as zein. Among these patents we can cite the patent US 4 983 403 or the application European patent EP 0 406 041.
The description and nonlimiting examples which follow describe the effect of the active ingredients described previously (amino acids, ami_noalcohols, polyols and vitamins), protected against degradation in the rumen and releasable in the abomasum or small intestine, on the release of hepatic lipoproteins rich in triglycerides as well as the effect su: r synthesis of mRNA
of apoprotein B and on the release of apoprotein B to liver level.
~ 1,487 8 0 The objective of this essay is to assess the extent to which a rnethionine supplementation protected against rumen fermentations prepared in particular according to US Pat. No. 4,877,621 can limit fatty liver disease and the ketosis in fat cows at the start of lactation receiving a ration presenting low energy concentration.
Material and methods 1 - Animals Fifteen cows are divided into 2 balanced batches on the date of calving, the note coral condition, live weight 3 months before calving and milk production maximum of previous lactation.
The two lots are: control without methionine (T, 8 cows), lot receiving protected methionine (M, 7 cows), one of which had to be removed from the experience at the start of the post-experience part (42 days after calving).
2 - Food a) End of ~ Test Animals receive corn silage at will, with concentrate according to the following protocol, S (-4) to S (-1) indicating the weeks before calving kg S (-4) and S (-2) S (-1) S (-3) Concentrate 0.5 1.5 2.5 Soybean meal tann 1 1.0 1.0 Soybean meal no 0.5 0.5 0.5 tann The calcium intake is limited (100 ~; / d then removal 3 weeks before calving) and a supplement of about 1 kg of hay is distributed daily.
B. Beginning of lactation The animals receive, in one meal per day, a full ration of constant composition during the 3 first lactation months, containing 75% silage corn, 20% tanned soybean meal and 5% soybean meal untanned soybeans. We add vitamin mineral concentrate (200 g / d), and hay (1 kg / d).
Protected methionine (22 ct / ~) Distributed in the morning on an empty stomach in a bucket with 200g untanned meal, for 5 days to all cows (15) three to four weeks before parturition, then every days to cows in lot M from the 3rd or 5th day after parturition (on day 3 to 5 of lactation), until the 6th week of lactation included (42 days).
Dose of lipoproteins - Separation of the major classes of lipoproteini-nes VLDL (very low density lipoproteins) were separated from 20 ml of plasma by ultracen-buoyancy prevention: 40,000 rpm for 16 hours and at 15 ° C.
IDL, LDL, HDLI and HDLh (lipoproteins of intermediate, low, high density light and high heavy density) were separated by density gradient â
T
39,000 rpm for 46 hours and at 15 ° C, depending on the technique described by Chapman, Golstein Lagrange and Laplaud, J. Lip. Res., 22, 339-358 (1981) and adapted by Bauchard et al. (1989, J. Lip. Res., 30, 1499-1514).
We thus obtained 5 classes of lipo-proteins:
- VLDL: d <1.018 g / ml - IDL: 1.018 g / ml <d <1.026 g / ml - LDL: 1.026 g / ml <d <1.060 g / ml - HDLI: 1.060 g / ml <d <1.091 g / ml - HDLh: 1.091 g / ml <d <1.180 g / ml These different lipoprotein fractions have been then dialyzed at 4 ° C for 7 hours with a system of microdialysis to remove KBr.
- Separation of true LDL and very light HDL
(HDLvl) in the density range 1.040-1.090 g / ml We first checked the summer-particle size uniformity in the density zone 1.040-1.090 g / ml by gradient gel electrophoresis acrylamide (PAA gel: 2.5-16%) from all our animals each of the different stages studied. After making sure of the homogeneity of our animals, we have grouped the plasmas by stage and by treatment then isolated lipoprotein particles by ultracentrifugation of flotation according to the protocol described by Laplaud et al. (J.
Lip. Res., 1991, 32, 1429-1439), in the density zone at 1.040-1.090 g / ml. These HDL and LDL lipoproteins have were then separated by affinity chromatography on heparin-Sepharose column which allowed us to separate rer and quantify LDL particles (without contamination by HDL) called "true LDL" on the one hand and HDL
not contaminated with LDL on the other hand. These particles were then analyzed, like the other lipo- classes proteins separated on a gradient, in particular the composition chemical.
- Determination of the chemical composition On each of the plasma lipoprotein fractions ticks as on total plasmas, we have dosed the apoproteins A-1 and B by radial immunodiffusion according to the Mancini method adapted by Auboiron et al., Reprod.
Nutr. Develop., 2.2275 (1989). Total protein lipoprotein fractions were dosed by colorimetry by the colorimetric method using the reagent based bicinchoninic acid (BCA, Pierce, IL, USA).
- Dose of hepatic apo B mRNA
Total RNAs are isolated from biopsies liver (approximately 200 mg per thiocyanate guanidine / phenol-chloroform according to the method described by Chomczynski and Sacchi, Ann. Biochem., 162, 156-159 (1987).
Quantification of apo B mRNA is performed according to the following method: 70g of each RNA extract totals are denatured in the presence of formaldehyde and depo-seated by successive dilutions of 1/2 in 1/2 on a nitrocellulose membrane using a Dot- device Blot (Schleicher & Schuell, SRC 26 D Minifold 1) or 4 deposits of 30, 15, 7.5 and 3.75 ~ g approximately for each extract of RNA. The hydridation is carried out with a synthetic probe.
seized from a fragment of human apo B cDNA
laboratory bound and labeled with (aj ~ P) dCTP
(desoxycytidyltriphosphate) by random labeling (random priming). The abundance of apo B mRNA is calculated by densitometric analysis of autoradiographies obtained after exposure of the membranes for 16 hours at -80 ° C.
The comparison between the different car radios being impossible, we chose to deposit on the same membrane the total RNA corresponding to the different rents stages of collection (Sl, S2, S4 and S12) from 5 cows (2 witnesses and 3 methionines or vice-versa). This has us allowed to determine the evolution of the levels of apo mRNA
B during the start of lactation and compare this evolution between cows in control and experimental batches rate.
- Intraheoat apoprotein B determination Total intrahepatic proteins were extracted by homogenization of liver fragments removed by biopsy (50 mg) in a highly lysis solution concentrated in detergents (sodium deoxycholate, Triton X100 *) and protease inhibitors (benzamidine, PMSF, leupeptin, pepstatin).
* (trademark) Total intrahepatic proteins extracted were quantified by colorimetric assay according to the Bradford method (1976). Comparable quantities (100 ~, g) of total proteins were deposited on a gradient polyacrylamide gel (3-7.5%) under conditions denaturing. After electrophoretic migration, the proteins are transferred onto nitrocellulose membrane by electrotransfer. These membranes are incubated in presence of bovine anti-apo B rabbit polyclonal antibody.
The binding of the antibody to the band corresponding to apo B is revealed by incubating the membrane in the presence of protein A labeled with iodine 125. The contents of apo B
intrahepatic are calculated by densitometric analysis from autoradiographies obtained after exposure membranes for 16h at -80 ° C.
3. Plasma lipids and apoproteins (Table 1) From the first week of lactation, the concentration of circulating non-esterified fatty acids is very high and remains so at S2 stage; these rates go then decrease by almost 50% (P <0.05) from S2 to S4 (in postprandial period), to reach very low in 512. The contents of free cholesterol, in esters plasma cholesterol and phospholipids undergo reverse evolution, seeing their rate increase sharply between S1 and 512, these rates being multiplied by factors
5, 3 et 2 respectivement. Par contre, la triglycéridémie reste constante tout au cours de cette période. Aucune différence significative n'est observée entre les 2 lots pour l'ensemble des fractions lipidiques étudiées.
Le taux d'apoprotéine B totale plasmatique n'évolue pas entre S1 et S2 et reste proche de 4 mg/dl, puis augmente jusqu' à une valeur de 11 mg/dl au stade S12 .
Cette évolution est comparable pour les 2 lots (témoin et méthionine).
10 Le taux d'apoprotéine A-I totale plasmatique augmente, comme dans le cas de l'apo B, principalement entre les stades S2 et S12 atteignant en moyenne 100 mg/dl en S12. Par contre, une légère différence est observée dans la forme d'évolution entre nos 2 lots. En effet, l'augmentation du taux d'apo A-I est essentiellement observée entre les stades S2 et S4 pour le lot "méthionine"
alors que cette augmentation est beaucoup plus progressive dans le lot "témoin". Malgré cette différence de forme d'évolution, aucune différence significative de leur teneur plasmatique est observée entre les 2 lots, quel que soit le stade de lactation étudié.
l0a Semaines aprs vlage Composs plasmatiques T 28.63.8a 26.75.1a 13.22.2b 2.80.8c AGNE
M 26.14.4a 22.82.8a 16.22.6b 2.30.6c T 3.30.5a 5.0l. la 9.72.1b 16.52.1c CL
M 4.30.8a 5.21.2a 10.72.7b 16.82.1c T 75.95.1a 105.79.4b 156.813.3c 205.211.94 EC
M 72.86.7a 97.66.Ob 160.79.1c 213.77.6d T 86.84.1a 120.5l3.lb 143.5l2.lb 154.112.5b PL
M 85.35.5a 121.3+23.8a 132.6+15.5a 187.9+13.5b T 17.81.9 17.81.2 16.60.8 17.51.0 TG
M 16.41.2 16.51.0 19.83.0 17.30.6 T 3.8l.Oa 4.7l.Oa 6.81.9b 10.72.4c apo B
M 3.71.5a 3.71.3a 4.81.7a 11.2t3.1b T 50.47.1a 63.18.3b 80.115.3c 100.716.84 Apo A-1 M 70.610.9a 69.15.1a 100.814.5b 106.95.9b Tableau: Évolution des teneurs en lipides (AGNE, Acides Gras Non Estérifiés; CL, Cholestérol Libre; EC, Esters de Cholestérol; PL, Phospholipides; TG:
Triglycérides) et en apoprotéines A-I et B (Apo A-1, Apo B) plasmatiques (mg/dl; moyenne ~ ES) chez la vache laitière au cours du début de lactation recevant un régime à base d'ensilage de maïs (régime témoin T, n=8) ou le même régime supplémenté en méthionine protégée de 4 à 6 jours jusqu'à
42 jours après le vêlage (régime méthionine M, n=7); S1=3-5 j; S2=10-12 j; S4=24-26 j; S12=71-89 j après le vêlage.
lOb Les concentrations plasmatiques des lipides ont été compa-rées à l'intérieur d'un même lot par test "t"
dans le cas de séries appariées; les valeurs affectées de 2 lettres différentes sont significativement différentes au seuil de 5%.
4. Lipoprotéines plasmatiques L'évolution globale des différentes familles lipoprotéiques montre que les concentrations plasmatiques en VLDL, IDL et HDL lourdes (HDLh) sont peu modifiées au cours des 12 premières semaines de lactation. Par contre, les taux plasmatiques en LDL et de HDL légères (HDLI) aug-mentent très fortement entre S1 et S12 (tableau 2). La com-position lipidique de ces deux familles de lipoprotéines n'est que peu modifiée.
Semaines aprs vlage Sl S2 S4 S12 LDL "vraies" 21.43.4a 22.83.1a 34.95.5b 63.05.8c T
M 14.62.9a 18.24.Oa 24.05.9b 59.36.4c HDLvl T 6.85.5ab 0.32.7a 17.48.2b 71.0l9.Oc M 3.54.1a 5.42.7ab 27.410.3b 98.038.4c Evolution de la concentration en lipoprotéine de type LDL "vraies" et HDL très légères (HDLvl) (mg/dl;
moyenne~ES) isolées par ultracentrifugation en gradient de densité puis par chromatographie d'affinité sur héparine-sépharose, chez la vache laitière au cours du début de lactation recevant un régime à base d'ensilage de maïs lOC
(régime témoin T, n=8) ou le même régime supplémenté en méthionine protégée (régime méthionine M, n=7) de 4 à 6 jours jusqu'à 42 jours après le vêlage.
Les concentrations plasmatiques des lipides ont été comparées à l'intérieur d'un même lot par test "t" dans le cas de séries appariées; les valeurs affectées de 2 lettres différentes sont significativement différentes au seuil de 5%.
En revanche, les teneurs respectives en apoprotéines A-I et B des LDL isolées (tableau 3) entre les densités 1,020-1,060 g/ml varient fortement avec le stade 2~1 487 8 0 de lactation étudié. Ainsi, la concentration en apo B augmente de 3 à 9 mg/dl entre S1 et 512 et celle de l'apo A-I de 2 à 16 mg/dl. La contribution de l'apoprotéine A-I au contenu total des particules dans cette zone s'élevant de 7 à 10 % et est plus rapide dans le temps pour le groupe recevant de la méthionine.
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,;u 5. Niveaux hépatiques en ARNm d'apo B (Tableaux 4 et 5 ) Les résultats présentés concernent les 8 vaches du lot témoin, et les 6 ou 7 vaches du lot méthionine (7 en période de traitement avec la méthionine protégée et 6 sur la totalité de l'essai).
La quantification de l'ARNm d'apo B hépatique a été
réalisée par analyse en Dot-Blot. Les évolutions des niveaux d'ARNm de l'apo B (unités arbitraires/~,g d'ARN) entre 2 stades consécutifs de prélèvement (S2-S1; S4-S2; S12-S4) ont été
calculées pour les 2 lots de vaches (tableau 4). Les importantes variations de niveaux d'ARNm d'apo B entre animaux et les différences d'intensité de signal existant entre autoradiographies induisent l'apparition d'écarts-types importants lors de ce calcul. Nous pouvons toutefois noter une augmentation significative des niveaux d'ARNm d'apo B
intrahépatiques entre les stades Sl et S2 pour le lot méthionine (6 vaches sur 7, P<0,035 ou 6 vaches sur 6, P<0,02) et entre les stades S2 et S4 pour le lot témoin (7 vaches sur 8,P <0,06).
volution des teneurs hpatiques en ARNm d'apo B
Lots S2-S1 S4-S2 Tmoin (n=8) 910 607 1359 + 698* 658 974 Mthionine (n=7) 3505 + 920** 183 1407 -Mthionine (n=6) 4109 + 778*** 253 1454 1428 1358 Évolution des teneurs intrahépatiques de l'ARNm d'apo B (unités arbitraires/~,g d'ARN totaux, ~ SE) entre 2 stades consécutifs de prélèvement chez la vache laitière en début de lactation recevant un régime à base d'ensilage de maïs (régime témoin T, n=8) ou le même régime supplémenté en méthionine protégée (régime méthionine M, n=7 ou n=6) de 3 à 5 jours jusqu'à 42 jours après le vêlage (S1=3-5 j; S2=10-12 j;
S4=24-26 j; S12=71-89j).
Les valeurs sont significativement différentes de 0 au seuil de 6% (*), 3,5% (**) ou 2% (***) (Test du signe).
Dans le but d'éliminer les écarts induits par les différences d'intensité de signal existant entre les autoradiographies, le rapport des niveaux hépatiques d'ARNm d'apo B mesurés entre 2 semaines consécutives de prélèvement (S2/S1; S4/S2; S12/S4) a été calculé (tableau 5). Ce rapport permet de mettre en évidence une augmentation significative (P<0,01) de l'ARNm d'apo B de 50% entre les stades S1 et S2 dans le lot méthionine alors qu'aucune variation significative n'est observée pour le lot témoin pour cette même période.
Rapport des niveaux hpatiques d'ARNm d'apo B
Lots S2/Sl S4/S2 Tmoin (n=8) 1.08 + 0.07a 1.20 0.10 1.10 0.09 Mthionine (n=7) 1.50 + O.lOb 0.96 0.12 -Mthionine (n=6) 1.58 + 0.05b 0.98 0.13 1.27 0.17 Rapport des teneurs intrahépatiques de l'ARNm d'apo B (unités arbitraires/~,g d'ARN totaux, ~ SE) entre 2 stades consécutifs de prélèvement chez la vache laitière en début de lactation recevant un régime à base d'ensilage de maïs (régime témoin T, n=8) ou le même régime supplémenté en méthionine protégée (régime méthionine M, n=7 ou n=6) de 3 à 5 jours jusqu'à 42 jours après le vêlage (S1=3-5j; S2=10-12j; S4=24-26j; S12=71-89j).
Les valeurs affectées de deux lettres différentes sont significativement différentes au seuil de 1%. 5, 3 and 2 respectively. However, triglyceridemia remains constant throughout this period. Any difference significant is observed between the 2 lots for all the lipid fractions studied.
Total plasma apoprotein B level does not change between S1 and S2 and remains close to 4 mg / dl, then increases to a value of 11 mg / dl at stage S12.
This development is comparable for the 2 lots (control and methionine).
10 Total plasma apoprotein AI level increases, as in the case of apo B, mainly between stages S2 and S12 reaching on average 100 mg / dl in S12. On the other hand, a slight difference is observed in the form of development between our 2 lots. Indeed, the increase in the rate of apo AI is essentially observed between stages S2 and S4 for the batch "methionine"
while this increase is much more gradual in the "witness" lot. Despite this difference in form no significant difference in their content plasma is observed between the 2 batches, whatever the lactation stage studied.
l0a Weeks after calving Composs plasma T 28.63.8a 26.75.1a 13.22.2b 2.80.8c AGNE
M 26.14.4a 22.82.8a 16.22.6b 2.30.6c T 3.30.5a 5.0l. 9.72.1b 16.52.1c CL
M 4.30.8a 5.21.2a 10.72.7b 16.82.1c T 75.95.1a 105.79.4b 156.813.3c 205.211.94 EC
M 72.86.7a 97.66.Ob 160.79.1c 213.77.6d T 86.84.1a 120.5l3.lb 143.5l2.lb 154.112.5b PL
M 85.35.5a 121.3 + 23.8a 132.6 + 15.5a 187.9 + 13.5b T 17.81.9 17.81.2 16.60.8 17.51.0 TG
M 16.41.2 16.51.0 19.83.0 17.30.6 T 3.8l.Oa 4.7l.Oa 6.81.9b 10.72.4c apo B
M 3.71.5a 3.71.3a 4.81.7a 11.2t3.1b T 50.47.1a 63.18.3b 80.115.3c 100,716.84 Apo A-1 M 70.610.9a 69.15.1a 100.814.5b 106.95.9b Table: Evolution of lipid contents (AGNE, Non Esterified Fatty Acids; CL, Free Cholesterol; EC, Cholesterol Esters; PL, Phospholipids; TG:
Triglycerides) and in apoproteins AI and B (Apo A-1, Apo B) levels (mg / dl; mean ~ ES) in dairy cows during the start of lactation receiving a diet based corn silage (control diet T, n = 8) or the same diet supplemented with protected methionine from 4 to 6 days up to 42 days after calving (methionine M diet, n = 7); S1 = 3-5 j; S2 = 10-12 d; S4 = 24-26 d; S12 = 71-89 d after calving.
lob Plasma lipid concentrations have been compared within the same batch by "t" test in the case of paired series; the assigned values of 2 different letters are significantly different at 5% threshold.
4. Plasma lipoproteins The overall evolution of the different families lipoproteins shows that plasma concentrations in VLDL, heavy IDL and HDL (HDLh) are little changed at during the first 12 weeks of lactation. On the other hand, plasma LDL and light HDL (HDLI) levels increased lie very strongly between S1 and S12 (Table 2). The com-lipid position of these two families of lipoproteins is only slightly modified.
Weeks after calving Sl S2 S4 S12 LDL "true" 21.43.4a 22.83.1a 34.95.5b 63.05.8c T
M 14.62.9a 18.24.Oa 24.05.9b 59.36.4c HDLvl T 6.85.5ab 0.32.7a 17.48.2b 71.0l9.Oc M 3.54.1a 5.42.7ab 27.410.3b 98.038.4c Evolution of the lipoprotein concentration of type LDL "true" and very light HDL (HDLvl) (mg / dl;
medium ~ ES) isolated by gradient ultracentrifugation density then by affinity chromatography on heparin-sepharosis, in dairy cows during the onset of lactation receiving a corn silage diet loc (control diet T, n = 8) or the same diet supplemented with protected methionine (methionine M diet, n = 7) from 4 to 6 days up to 42 days after calving.
Plasma lipid concentrations have were compared within the same batch by "t" test in the case of paired series; the assigned values of 2 different letters are significantly different at 5% threshold.
On the other hand, the respective apoprotein contents AI and B of the isolated LDLs (table 3) between the densities 1.020-1.060 g / ml vary greatly with stage 2 ~ 1,487 8 0 lactation studied. Thus, the apo B concentration increases from 3 to 9 mg / dl between S1 and 512 and that of apo AI from 2 to 16 mg / dl. The contribution of apoprotein AI at total content of particles in this area rising from 7 to 10% and is more fast in time for the group receiving methionine.
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,; u 5. Liver levels in apo B mRNA (Tables 4 and 5) The results presented relate to the 8 cows of the control batch, and the 6 or 7 cows in the methionine batch (7 in treatment period with protected methionine and 6 on the entire test).
The quantification of hepatic apo B mRNA was performed by Dot-Blot analysis. The evolutions of the levels of apo B mRNA (arbitrary units / ~, g of RNA) between 2 stages samples (S2-S1; S4-S2; S12-S4) were calculated for the 2 batches of cows (table 4). The large variations in apo B mRNA levels between animals and the differences in signal strength between autoradiographs induce the appearance of standard deviations important during this calculation. We can however note a significant increase in apo B mRNA levels intrahepatic between stages Sl and S2 for the lot methionine (6 cows out of 7, P <0.035 or 6 cows out of 6, P <0.02) and between stages S2 and S4 for the control batch (7 cows on 8, P <0.06).
content evolution hpatic in Apo B mRNA
Lots S2-S1 S4-S2 Witness (n = 8) 910 607 1359 + 698 * 658 974 Mthionine (n = 7) 3505 + 920 ** 183 1407 -Mthionine (n = 6) 4109 + 778 *** 253 1454 1428 1358 Evolution of intrahepatic levels of mRNA
of apo B (arbitrary units / ~, g of total RNA, ~ SE) between 2 consecutive stages of sampling in dairy cows in start of lactation receiving a silage-based diet of corn (control diet T, n = 8) or the same diet supplemented with protected methionine (methionine M diet, n = 7 or n = 6) from 3 to 5 days up to 42 days after calving (S1 = 3-5 days; S2 = 10-12 days;
S4 = 24-26 d; S12 = 71-89j).
Values are significantly different from 0 at the threshold of 6% (*), 3.5% (**) or 2% (***) (Sign test).
In order to eliminate the differences caused by differences in signal strength between autoradiographs, the ratio of hepatic mRNA levels apo B measured between 2 consecutive weeks of sampling (S2 / S1; S4 / S2; S12 / S4) has been calculated (Table 5). This report highlights a significant increase (P <0.01) 50% apo B mRNA between stages S1 and S2 in the methionine batch while no significant variation is not observed for the control batch for this same period.
Levels report mRNA hpatic from apo B
Lots S2 / Sl S4 / S2 Witness (n = 8) 1.08 + 0.07a 1.20 0.10 1.10 0.09 Mthionine (n = 7) 1.50 + O.lOb 0.96 0.12 -Mthionine (n = 6) 1.58 + 0.05b 0.98 0.13 1.27 0.17 Report of intrahepatic levels of apo mRNA
B (arbitrary units / ~, g of total RNA, ~ SE) between 2 stages consecutive collection from dairy cows at the start of lactation receiving a corn silage diet (diet control T, n = 8) or the same diet supplemented with methionine protected (methionine M diet, n = 7 or n = 6) from 3 to 5 days up to 42 days after calving (S1 = 3-5 days; S2 = 10-12 days; S4 = 24-26d; S12 = 71-89j).
Values with two different letters are significantly different at the 1% threshold.
6. Variation des teneurs hépatigues d'agio B
(Tableaux 6 et 7) La quantification de l'apo B intrahépatique a été
réalisée par analyse en Western-Blot. Les évolutions des niveaux de l'apo B (unités arbitraires / 109 cellules) entre 2 stades consécutifs de prélèvement (S2-S1; S4-S2; S12-S4) ont été calculées pour les 2 lots de vaches (tableau 6).
Les importantes variations de niveaux d'apo B entre les animaux et les différences d'intensité de signal existant entre autoradiographies induisent l'apparition d'écarts-types importants lors de ce calcul. Nous pouvons toutefois noter une augmentation significative des niveaux d'apo B
intrahépatiques (d'après le test du signe) entre les stades S2 et S1 pour le lot méthionine (p<0,01) et entre les stades S4 et S2 pour le lot témoin (p<0,035).
Evolution des teneurs hpatiques en apo B
Lots S2-S1 S4-S2 Tmoin (n=8) -0,56 6,9 19,10 5,4* 89,2 21**
Mthionine (n=7) 18,20 2,9** x.67 7,2 -Mthionine (n=6) 14,00 3,6** 3.92 7,1 X6,5 23**
Évolution des teneurs intrahépatiques d'apo B
(unités arbitraires /109 cellules, ~SE) entre 2 stades consécutifs de prélèvement chez la vache laitière au cours du début de lactation recevant un régime à base d' ensilage de maïs (régime témoin T, n=8) ou le même régime supplémenté en méthionine protégée (régime méthionine M, n=7 ou n=6) de 3 à 5 jours jusqu'à 42 jours après le vêlage (S1=3-5j; S2=10-12j; S4=24-26j; S12=71-89j).
Les différences sont significativement différentes de 0 au seuil de 3,5% (*) ou au seuil de 1%
(**) (test U) .
Dans le but d'éliminer les différences d'intensité de signal existant entre autoradiographies, le rapport des niveaux hépatiques d'apo B entre 2 semaines consécutives de prélèvement (S2/S1; S4/S2; S12/S4) a été
calculé (tableau 7). Ce rapport permet de mettre en évidence une augmentation significative (p<0,01) du niveau d'apo B de 68% entre les stades S2 et S1 dans le lot méthionine alors qu'aucune variation significative n'est observée pour le lot témoin pour cette même période.
16a Rapport des niveaux hpatiques d'apo B
Lots S2/S1 S4/S2 Tmoin (n=8) 1.07 + 0.12a 1.52 0.20 2.49 0.40 Mthionine (n=7) 1.68 + 0.09b 1.22 0.16 -Mthionine (n=6) 1.66 + O.lOb 1.14 0.16 2.70 0.54 Rapport des teneurs intrahépatiques d'apo B
(unités arbitraires /~g d'ARN totaux, ~SE) entre 2 stades consécutifs de prélèvement chez la vache laitiëre au cours du début de lactation recevant un régime à base d' ensilage de maïs (régime témoin T, n=8) ou le même régime supplémenté en méthionine protégée (régime méthionine M, n=7 ou n=6) de 3 à 5 jours jusqu'à 42 jours après le vêlage (S1=3-5j; S2=10-12j; S4=24-26j; S12=71-89j).
Les valeurs affectées de deux lettres différentes sont significativement différentes au seuil de 1%.
On reproduit l'exemple 1 sur 16 vaches (6 témoins et 10 expérimentées). Les vaches reçoivent la même alimentation de base que dans l'exemple 1 et reçoivent pour les vaches (M) 40 g de méthionine protégée (environ 28 g de méthionine digestible) et pour les vaches (M+L) 18 g de méthionine protégée (13 g de méthionine digestible) et 100 g de méthionine/lysine protégée (50 g de lysine digestible et 15 g de méthionine digestible).
16b Les résultats concernant les analyses sanguines sont indiqués dans le tableau 8, les résultats concernant les teneurs hépatiques en triglycérides, ARNm d'apo B et apo B sont indiqués dans les tableaux 9,10 et 11.
__ ~ 1 4~ 8 7 8 0 lî
Teneurs en métabolites sanguins en 2ème et 4ème semaines de lactation (1) Tmoin Mthionine Mth. + Lysine (n=6) (n=5) (N=5) S2 0,68 ( 0,15)0,66 ( 0,14)0,4 ( 0,15) AGNE (mM) S4 0,48 ( 0,11 0,45 ( 0,11)0,33 ( 0,11) ) S2 3 ( 3) 42 ( 4) 42 ( 4) Glucose (mg/dl) S4 40 ( 4) 36 ( 4) 40 ( 4) S2 0,54 ( 0,13)0) 9 ( 0,14)0,88 ( 0,14)a Lactate (mM) S4 0,85 ( 0,18)0,63 ( 0,20)0,56 ( 0,20) b-hydroxybutyrate S2 2, 8 ( 0,42)7 ,86 ( 2,26 ( 0,50) 0,45)b (mM) S4 3,01 ( 0, 2,93 ( 0,5)2,93 ( 0,83) 0) S2 6,1 ( 1,1 2,2 ( 1,3)c3,0 ( 1,3)d ) Actone (m dl) S4 5, ( 2,) 4,6 ( 2,9) 5,9 ( 3,0) S2 3 , I ( 3,3)36,5 ( 4,4)28,5 ( 3,5)e Ure (m~T dl) S4 39,2 ( 3,4) 3 ,4 ( 4,6)32, ( 3,6) (l) Valeurs ajustées en fonction de la covariable de premiére semaine a. Différent du lot témoin (P < 0,10) b. Différent du lot témoin (P < 0,1î) c. Différent du lot témoin (P < 0,05) d. Différent du lot témoin (P < 0, I 1 ) e. Diffé~°ent du lot témoin (P < 0,1 1 ) Teneurs hépatiques en triglycérides (mg/g foie frais congelés) Semaine aprs -vlage Tmoin (n=6) 54,5 12,5 70,6 19,9 55,2 15,3 Mthionine (n=5) 34,6 4,1a 67,6 11,8b 36,4 9,7a Mt.+ lys.(n=5) 36,2 5,9 46,2 13,2 25,3 9,8 a, b: P<0, 05. Test t de comparaison de moyennes d'une même ligne dans le cas de séries appariées.
La méthionine et/ou la lysine ont été distribuées après la semaine S1.
Teneurs hépatiques en ARNm d'apo B
(U.A./~Cg ARN totaux) Semaine aprs S1 S2 S4 vlage Tmoin (n=6) 134,8 20,7 150,8 21,9 130,1 17,4 Mthionine (n=5) 101,3 18,4a 83,5 11,4a 151,6 30,1b Mt. + lys.(n=5) g7~9 118,30 155,9 19,2a 123,2 16,4bc a, b: P<0,05; a,c: P<0,10. Test t de comparaison de moyen nes d'une même ligne dans le cas de séries appariées.
a La méthionine et/ou la lysine ont été distribuées après la semaine S1.
Teneurs hépatique en apo B (U.A./109 celluloses) Semaines aprs Sl S2 S4 vlage Tmoin (n=6) 53,94 6,25 50,6 7,2 66,4 17,8 Mthionine (n=5) 45,5 8,1a 41,4 l2,la 65,6 12,6b Mt. + lys.(n=5) 46,2 7,7 c 65,7 9,6d 99,8 41,24 a, b: P<0,03; c, d: P<0,2. Test t de composition de moyennes d'une même ligne dans le cas de séries appariées.
La méthionine et/ou la lysine ont été distribuées après la semaine S1.
Les teneurs en métabolites sanguins (tableau 8) ne montrent que peu d'effets significatifs des traitements.
On observe toutefois qu'en deuxième semaine de lactation, le traitement par la méthionine a diminué significativement les teneurs en corps cétoniques ((3. hydroxybutyrate et acétone). Des tendances similaires, mais moins significatives, sont observées avec le traitement méthionine + lysine.
Le lot Témoin présente des teneurs hépatiques en triglycérides (TG) assez élevées en semaine S1 (première semaine après vêlage) qui tendent à augmenter en semaine S2 (+ 30%, NS) puis à diminuer légèrement de la même amplitude en semaine S4 (-22%, NS). Les vaches étaient au début de lactation en état de stéatose (54,5-70,6 mg de TG/g de foie) .
Dans le lot supplémenté en méthionine, les teneurs hépatiques en TG sont plus faibles en semaine S1 (avant traitement par la méthionine) que dans le lot Témoin mais augmentent fortement en semaine S2 (+95%, P<0,05) pour 10 atteindre des valeurs comparables à celles observées dans le lot Témoin, Toutefois, l'infiltration lipidique diminue de façon significative en semaine S4 (-46%, P<0,05). Une augmentation significative à la fois des niveaux intrahépatiques de l'ARNm d'apo B (+82%, P<0,05) et de l'apo B (+58%, P<0,03) apparaît en semaine 4 par rapport à
la semaine S2.
Dans le lot supplémenté en méthionine et en lysine, les teneurs hépatiques en TG en semaine S1 (avant 20 traitement par la méthionine + lysine) sont comparables à
celles observées pour le lot supplémenté en méthionine.
Toutefois, on n'observe pas d'augmentation importante du taux en TG en semaine S2 , contrairement au lot supplémenté
en méthionine seule . La baisse entre les semaines S2 et S4 conduit à un faible taux d'infiltration lipidique en semaine S4. Une augmentation des niveaux intrahépatiques de l'ARNm d'apo B (+ 59%, P<0,10) et de l'apo B (+ 42%, P<0,20) apparaît dès la semaine S2 pour toutes les vaches malgré un écart type important. 6. Variation in hepatic levels of agio B
(Tables 6 and 7) The quantification of intrahepatic apo B was performed by Western-Blot analysis. The evolutions of apo B levels (arbitrary units / 109 cells) between 2 consecutive stages of sampling (S2-S1; S4-S2; S12-S4) were calculated for the 2 batches of cows (Table 6).
Significant variations in apo B levels between animals and the differences in signal strength existing between autoradiographies induce the appearance of deviations-important types when doing this calculation. We can however note a significant increase in apo B levels intrahepatic (according to the sign test) between stages S2 and S1 for the methionine batch (p <0.01) and between the stages S4 and S2 for the control group (p <0.035).
Evolution of hpatic contents in apo B
Lots S2-S1 S4-S2 Witness (n = 8) -0.56 6.9 19.10 5.4 * 89.2 21 **
Mthionine (n = 7) 18.20 2.9 ** x.67 7.2 -Mthionine (n = 6) 14.00 3.6 ** 3.92 7.1 X6.5 23 **
Evolution of intrahepatic levels of apo B
(arbitrary units / 109 cells, ~ SE) between 2 stages consecutive collection from the dairy cow during from the start of lactation receiving a silage-based diet corn (control diet T, n = 8) or the same diet supplemented with protected methionine (methionine M diet, n = 7 or n = 6) from 3 to 5 days up to 42 days after calving (S1 = 3-5d; S2 = 10-12d; S4 = 24-26d; S12 = 71-89d).
The differences are significantly different from 0 at the 3.5% threshold (*) or at the 1% threshold (**) (U test).
In order to eliminate differences signal strength between autoradiographs, the ratio of hepatic apo B levels between 2 weeks direct debit (S2 / S1; S4 / S2; S12 / S4) has been calculated (Table 7). This report allows you to evidence of a significant increase (p <0.01) in the level 68% apo B between stages S2 and S1 in the batch methionine while no significant variation is observed for the control batch for this same period.
16a Levels report apo hpatics B
Lots S2 / S1 S4 / S2 Witness (n = 8) 1.07 + 0.12a 1.52 0.20 2.49 0.40 Mthionine (n = 7) 1.68 + 0.09b 1.22 0.16 -Mthionine (n = 6) 1.66 + O.lOb 1.14 0.16 2.70 0.54 Report of intrahepatic levels of apo B
(arbitrary units / ~ g of total RNA, ~ SE) between 2 stages consecutive collection from the dairy cow during from the start of lactation receiving a silage-based diet corn (control diet T, n = 8) or the same diet supplemented with protected methionine (methionine M diet, n = 7 or n = 6) from 3 to 5 days up to 42 days after calving (S1 = 3-5d; S2 = 10-12d; S4 = 24-26d; S12 = 71-89d).
Values affected by two different letters are significantly different at the 1% threshold.
Example 1 is reproduced on 16 cows (6 controls and 10 experienced). The cows receive the same basic food as in Example 1 and receive for cows (M) 40 g of protected methionine (approximately 28 g of digestible methionine) and for cows (M + L) 18 g of protected methionine (13 g of digestible methionine) and 100 g methionine / protected lysine (50 g lysine digestible and 15 g of digestible methionine).
16b Results regarding blood tests are shown in Table 8, the results for hepatic triglyceride levels, apo B mRNA and apo B are shown in Tables 9, 10 and 11.
__ ~ 1 4 ~ 8 7 8 0 lî
Blood metabolite levels in the 2nd and 4th week of lactation (1) Witness Mthionine Mth. + Lysine (n = 6) (n = 5) (N = 5) S2 0.68 (0.15) 0.66 (0.14) 0.4 (0.15) AGNE (mM) S4 0.48 (0.11 0.45 (0.11) 0.33 (0.11) ) S2 3 (3) 42 (4) 42 (4) Glucose (mg / dl) S4 40 (4) 36 (4) 40 (4) S2 0.54 (0.13) 0) 9 (0.14) 0.88 (0.14) a Lactate (mM) S4 0.85 (0.18) 0.63 (0.20) 0.56 (0.20) b-hydroxybutyrate S2 2, 8 (0.42) 7.86 (2.26 (0.50) 0.45) b (mM) S4 3.01 (0.23 (0.5) 2.93 (0.83) 0) S2 6.1 (1.1 2.2 (1.3) c3.0 (1.3) d ) Actone (m dl) S4 5, (2,) 4.6 (2.9) 5.9 (3.0) S2 3, I (3.3) 36.5 (4.4) 28.5 (3.5) e Ure (m ~ T dl) S4 39.2 (3.4) 3, 4 (4.6) 32, (3.6) (l) Values adjusted according to the first week covariate at. Different from control lot (P <0.10) b. Different from control lot (P <0.1î) vs. Different from control lot (P <0.05) d. Different from the control batch (P <0, I 1) e. Difference from the control batch (P <0.1 1) Liver triglyceride levels (mg / g fresh frozen liver) Week after -vlage Witness (n = 6) 54.5 12.5 70.6 19.9 55.2 15.3 Mthionine (n = 5) 34.6 4.1a 67.6 11.8b 36.4 9.7a Mt. + lys. (N = 5) 36.2 5.9 46.2 13.2 25.3 9.8 a, b: P <0.05. Test t for comparing means of the same line in the case of paired series.
Methionine and / or lysine were distributed after the week S1.
Liver contents in apo B mRNA
(AU / ~ Cg total RNA) Week after S1 S2 S4 vlage Witness (n = 6) 134.8 20.7 150.8 21.9 130.1 17.4 Mthionine (n = 5) 101.3 18.4a 83.5 11.4a 151.6 30.1b Mt. + lys. (N = 5) g7 ~ 9 118.30 155.9 19.2a 123.2 16.4bc a, b: P <0.05; a, c: P <0.10. Means comparison t test nes of the same line in the case of paired series.
at Methionine and / or lysine were distributed after the week S1.
Liver contents in apo B (UA / 109 celluloses) Weeks after Sl S2 S4 vlage Witness (n = 6) 53.94 6.25 50.6 7.2 66.4 17.8 Mthionine (n = 5) 45.5 8.1a 41.4 l2, la 65.6 12.6b Mt. + lys. (N = 5) 46.2 7.7 c 65.7 9.6d 99.8 41.24 a, b: P <0.03; c, d: P <0.2. Composition t-test means of the same line in the case of paired series.
Methionine and / or lysine were distributed after the week S1.
Levels of blood metabolites (Table 8) show only few significant effects of the treatments.
However, we observe that in the second week of lactation, methionine treatment decreased significantly the contents of ketone bodies ((3. hydroxybutyrate and acetone). Similar trends, but less significant, are observed with treatment methionine + lysine.
The control batch has hepatic contents in fairly high triglycerides (TG) in week S1 (first week after calving) which tend to increase in week S2 (+ 30%, NS) then decrease slightly by the same magnitude weekdays S4 (-22%, NS). The cows were at the beginning of lactation in a state of steatosis (54.5-70.6 mg TG / g liver).
In the batch supplemented with methionine, the hepatic TG contents are lower in week S1 (before treatment with methionine) than in the control batch but strongly increase in week S2 (+ 95%, P <0.05) for 10 reach values comparable to those observed in the control batch, however, the lipid infiltration decreases significantly during week S4 (-46%, P <0.05). A
significant increase in both levels intrahepatic of apo B mRNA (+ 82%, P <0.05) and apo B (+ 58%, P <0.03) appears in week 4 compared to week S2.
In the batch supplemented with methionine and lysine, liver contents in TG in week S1 (before 20 methionine + lysine therapy) are comparable to those observed for the batch supplemented with methionine.
However, there is no significant increase in the rate in TG in week S2, unlike the supplemented lot methionine alone. The decrease between weeks S2 and S4 leads to a low rate of lipid infiltration in week S4. An increase in intrahepatic levels of apo B mRNA (+ 59%, P <0.10) and apo B (+ 42%, P <0.20) appears from week S2 for all cows despite a large standard deviation.