21235~5 " Composition lipidique polaire d'origine végétale permett~nt de vehiculer un agent actif et/ou de le faire pénétrer dans une cellule cible "
La présente invention concerne une S composition lipidique polaire d'origine végétale permettant de véhiculer un agent actif et/ou de le faire pénétrer dans une cellule cible.
Pour des raisons d'ordre écologique, on cherche actuellement à protéger au maximum les animaux et à éviter autant que possible de les utiliser au niveau du laboratoire : cette tendance actuelle, encouragée par les diverses ligues pour la protection des bêtes, fait que les produits d'origine animale sont de plus en plus mal acceptés.
Indépendamment de ces préoccupations d'ordre philosophique, le développement des produits provenant du- règne animal pourrait se trouver freiné dans l'avenir : en effet, ces dernières années, on a vu apparaître dans le règne animal, et en particulier chez les ruminants, des virus de type prion qui attaquent le cerveau et les tissus nerveux et sont responsables d'atteintes neurologiques extrement graves.
Or, il n'est pas exclu que de tels virus soient susceptibles de se propager chez les humains ;
21235~
on craint que leur développement puisse avoir des consé~uences dramatiques.
Compte tenu de cette incertitude, il existe actuellement un préjugé à l'encontre des produits provenant du règne animal.
Il est en particulier à noter ~ue certains produits extraits des tissus nerveux d'origine bovine ont, d'ores et déjà, été interdits par la Pharmacie Centrale des Hôpitaux de Paris.
Cette contrainte nouvelle est source de difficultés liées au fait que les produits d'origine animale se trouvent déjà dans un état partiellement ou totalement synthétisés, tandis que l'utilisation de produits végétaux exige toujours des manipulations complémentaires pouvant s'avérer longues et coûteuses.
Compte tenu de ce contexte, les chercheurs exerçant dans des domaines tels que la dermatologie ou la pharmacologie tentent de plus en plus à utiliser des produits provenant du règne végétal ou des produits d'origine marine en remplacement des produits animaux, et ce, malgré les difficultés accrues ainsi rencontrées.
Ces recherches ont abouti, conformément au document antérieur non publié WO-.~-92/~1 321, à la mise au point d'un procédé nouveau permettant d'obtenir - à partir d'un compose végétal tel que de la farine de céréale ou un extrait tel que du son, ou encore des lipides extraits de céréale par des solvants chlorés - un melange lipidique riche en phospholipides, glycolipides et ceramides et en particulier un mélange lipidique de base ayant la composition pondérale suivante :
- céramides 90 %
- lécithines 5 %
- galactolipides 5 %
2123~8~
Il a déjà eté proposé de préparer à partir de ce mélange lipidique de base des compositions pouvant etre utilisées dans des domaines tels que la cosmétologie ou la dermatologie.
On a maintenant découvert, conformément à
l'invention, que ce mélange de base d'origine exclusivement végétale peut avoir de nombreuses et importantes autres applications, en particulier dans le domaine de la pharmacologie.
Les biologistes savent, depuis dejà de nombreuses années, que toutes les cellules du règne animal sont entourées de membranes plasmiques qui constituent des barrières à perméabilité sélective ;
ces cytomembranes dont la texture est largement constante, sont essentiellement constituées par une double couche continue de molécules lipidiques disposées parallèlement entre-elles et réunies par leurs groupes hydrophobes, dans laquelle diverses protéines membranaires sont encastrées.
Différents constituants entrent dans la composition de ces doubles couches lipidiques de la membrane plasmique et, notamment, des huiles non polaires, ou des constituants polaires dont il n'existe pas de classification universellement reconnue par les spécialistes et parmi lesquels on peut mentionner:
- les phospholipides tels que la lécithine, - - les glycolipides ou galactolipides, - les céramides, les sphingolipides et les glycosphingolipides.
212~585 3bis Chaque type de cellule a une composition en constituants lipidiques notamment en constitutants lipidiques polaires qui lui est particulière, et les spécialistes ont pu établir des gammes de compositions propres à chaque type de cellule.
Le tableau ci-dessous donne à titre d'exemple les compositions lipidiques approximatives de différentes membranes cellulaires.
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I 21235~5 "Polar lipid composition of vegetable origin allows ~ nt to convey an active agent and / or penetrate a target cell"
The present invention relates to a S polar lipid composition of vegetable origin making it possible to convey an active agent and/or to penetrate a target cell.
For ecological reasons, we currently seeks to protect animals as much as possible and to avoid as much as possible using them laboratory level: this current trend, encouraged by the various leagues for the protection animals, makes products of animal origin are increasingly poorly accepted.
Regardless of these order concerns philosophical, the development of products from of the animal kingdom could find itself hampered in the future: indeed, in recent years, we have seen appear in the animal kingdom, and in particular in ruminants, prion-type viruses which attack the brain and nervous tissue and are responsible for extreme neurological damage serious.
However, it is not excluded that such viruses are likely to spread to humans;
21235~
it is feared that their development may have dramatic consequences.
Given this uncertainty, there is currently a prejudice against the products from the animal kingdom.
It is particularly to be noted ~ue certain products extracted from nervous tissue of bovine origin have already been banned by the Pharmacy Central Hospitals of Paris.
This new constraint is a source of difficulties linked to the fact that the original products animal are already in a state partially or fully synthesized, while the use of plant products always require handling additional information which can prove to be long and costly.
Given this context, researchers practicing in fields such as dermatology or pharmacology are increasingly trying to use products originating from the vegetable kingdom or from products of marine origin as a replacement for products animals, despite the increased difficulties thus encountered.
This research resulted, in accordance with the prior unpublished document WO-. ~ -92 / ~ 1321, at the development of a new process for to obtain - from a plant compound such as cereal flour or an extract such as bran, or still lipids extracted from cereals by chlorinated solvents - a lipid mixture rich in phospholipids, glycolipids and ceramides and in particular a basic lipid mixture having the following composition by weight:
- 90% ceramides - lecithins 5%
- galactolipids 5%
2123~8~
It has already been proposed to prepare from of this basic lipid mixture of the compositions can be used in areas such as cosmetology or dermatology.
We have now found, according to the invention, that this original base mixture exclusively vegetable can have many and important other applications, especially in the field of pharmacology.
Biologists have known for a long time many years, that all the cells of the kingdom animal are surrounded by plasma membranes which constitute selective permeability barriers;
these cytomembranes whose texture is largely constant, are essentially constituted by a continuous double layer of lipid molecules arranged parallel to each other and joined by their hydrophobic groups, in which various membrane proteins are embedded.
Different constituents enter into the composition of these lipid double layers of the plasma membrane and, in particular, oils not polar constituents, or polar constituents of which it there is no universal classification recognized by specialists and among whom we may mention:
- phospholipids such as lecithin, - - glycolipids or galactolipids, - ceramides, sphingolipids and glycosphingolipids.
212~585 3bis Each type of cell has a composition in lipid constituents, in particular as constituents polar lipids which is peculiar to it, and the specialists were able to establish ranges of compositions specific to each type of cell.
The table below gives as example the approximate lipid compositions of different cell membranes.
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Les chercheurs ont pu prouver que les constituants polaires des cytomembranes lipidiques ont un rôle déterminant sur la perméabilité cellulaire et donc influent sur les possibilités de pénétration des agents actifs à l'intérieur des cellules.
Or, conformément à l'invention, on s'est rendu compte que le mélange de base susmentionné a une composition largement identique à celle des constituants lipidiques polaires entrant dans la composition des doubles couches lipidiques des membranes plasmiques, et, que, à partir de ce mélange - de base, il est possible de fabriquer, par fractionne-ments successifs, un mélange lipidique "second" dont la composition est identique à celle qui est propre à
un type donné de cellules.
L'idée à la base de l'invention est d'utiliser cette identité pour fabri~uer, à partir du mélange lipidique polaire de base, une composition dans laquelle on reconstitue la formule lipidique des cytomembranes lipidiques pour vehiculer un agent actif ou faciliter sa pénétration dans une celluIe cible.
A cet effet, l'invention se rapporte à une composition lipidique polaire d'origine vegétale caractérisée en ce qu'elle est constituée par une émulsion aqueuse injectable, intra-articulaire, topique ou ingérable d'un mélange lipidique polaire .riche en phospholipides en particulier en lécithine et en ~éramides, ayant une composition essentiellemen~
identique à celle des constituants lipidiques polaires 30 des cytomembranes lipidique~ des cellules et obtenu à
partir d'un composé végétal tel que de la farine de céréales ou un extrait tel que du son ou des lipides extraits de ceréales.
Cette composition, qui peut être pharmaceu-tique, cosmétique ou encore diététique peut revêtir FEa.~ r~ Js~ ~NT
21~3~i8~
des formes variées sans pour cela sortir du cadre del'invention et, dans certains cas, la composition peut même cons~ituer l'agent actif proprement dit.
A titre d'exemple, il est connu qu'un excès de cholestérol peu~ provoquer le dépôt, sur la paroi interne des artères, d'une plaque d'athérome constituée par un mél~nge de cellules chargées de graisse et de cristaux de cholestérol. La réaction de la paroi en regard de la plaque d'athérome est variable : elle commence par une sclérose (athérosclérose) et est suivie de calcifications (médiacalcose). Il peut s'ensuivre des thromboses (coagulation du sang dans l'artère) et des anévrismes (distention de la paroi).
Or, on a déjà pu mettre en évidence que les mélanges lipidiques polaires conformes à
l'invention et en particulier les céramides et derivés sont des émulsifiants du cholestérol : l'injection dans le circuit sanguin d' un patient dont les artères sont porteuses de nombreuses plaques d'athérome d'une composition, conforme à l'invent:ion peut pèrmettre de faciliter l'élimination de ces dépots ; ce mélange lipidique va en effet extraire le cholestérol puis faciliter son évacuation dans 1P circuit sanguin.
Plus précisément, pour obtenir la composi-tion réellement mise en oeuvre conformément à
l'invention, on utilise la notion de HLB ou "Hyrophile-Lipophile Balance'! qui correspond à un classement des émulsifiants selon leur hydrophilie ou leur lipophilie. Une HLB faible (3 à 5) caractérise une émulsion à phase continue huileuse, une HLB plus élevée (10 à 12) une émulsion à phase continue aqueuse et au-delà une solubilisation.
Or, à partir de cette notion, on a développé de nombreuses méthodes tant theoriques 21235~3~
qu'expérimentales pour déterminer dans chaque cas particulier la composition d'un système de tensio-actifs donnant l'émulsion la plus fine et donc le couplage optimum de plusieurs tensio-actifs.
Selon l'invention, pour déterminer in vitro la composition optimale pour l'émulsification du cholestérol, on a utilisé un processus expérimental basé sur la recherche par mesure de la conductivité de la quantité d'eau provoquant l'inversion de phase d'une émulsion.
On a ainsi obtenu un HLB de 8 à 10.
Conformément à une variante particulièrement avantageuse de l'invention, l'émulsion a une composition essentiellement identique à celle des cytomembranes lipidiques d'une cellule cible et renferme un agent actif enrobé dans une gaine du mélange lipidique.
Une telle composition peut, à titre d'exemple, renfermer un agent d'hydratation associé, le cas échéant, à des additifs tels que des vitamines A ou E et enrobé dans une gaine ayant une composition identique à celle des cytomembranes lipidiques des cellules de l'épiderme et en particulier du stratum cornQum ; les agents d'hydratation présents dans ces compositions peuvent etre des agents humectants ou hygroscopiques liposolubles tels que par exemple la l~noline, des acides gras polyinsaturés notamment la vitamine F, l'acide linoléique, l'acide gammalinoléni~
que ou l'acide eicosapentaenoique ou encore des agents hydrosolubles tels que la ~lycérine, les mucopolysac-charides, les dérivés d'allantoïne, les acides aminés, l'urée, le sodium, le potassium~
Dans de telles compositions, qui peuvent être utilisees pour la lutte contre le vieillissement ou le traitement des brûlés, le mélange lipidique 2123,j~
polaire agit en fait à deux niveaux : il améliore la permeabilité membranaire vis-à-vis de l'agent actif, mais, parallèlement contribue lui-même à l'hydratation des cellules ; on a, en effet, récemment pu mettre en évidence le rôle dans les mécanismes d'hydratation de la peau des phospholipides et surtout des céramides qui sont susceptibles de contribuer à une meilleure rétention de l'eau, de restructurer l'épiderme et notamment le ciment intercornéocytaire et d'améliorer la résistance de la peau aux agressions extérieures.
La composition conforme à l'invention peut également revêtir la forme d'une composition médica-menteuse destinée a diverses classes thérapeutiques et dont l'agent actif peut revêtir des formes variées et notamment être choisi dans le groupe formé par les antibiotiques, les anti-inflammatoires, les cortidoï-des, les antiviraux, les anticancéreux et les médicaments des pathologies cardiovasculaires.
A titre d'exemple, on peut plus précisément citer la possibilité de véhiculer les agents actifs suivants :
.~ .~
2123~i85 . . .
Classe thérapeutique ll Agents actifs ; ~
Cardio-angéiologie Rutine _ Dermatologie Vitamine A acide Endocrinologie et Testosterone hormones Métabolisme Huiles riches en acide acide gamma linoléique acide eicosapentaenoique acide docosahexaenoique I _ --Rhumatologie Hydrocortisone (anti-inflammatoires non stéroidiens) _ I
Immuno allergolo~ie Allergènes _ , ~ . _ Grâce au choix d'un mélange lipidique polaire dont la composition correspond à celle des cytomembranes lipidiques des cellules cibles que l'on désire traiter, il est ainsi possible d'injecter l'agent actif directement sur le site voulu où il va "attaquer" sélectivement les cellules cibles permettant ainsi, pour un effet et un rendement améliorés, de diminuer sa concentration et donc d'éviter autant que possible les effets secondaires.
Les exemples susmentionnés ne sont, bien .entendu, pas limitatifs et on peut envisager de nombreuses autres applications de l'invention, cons-istant notamment à faire rentrer un élément tel que du sodium dans une cellule déficiente.
Dans tous les cas, la gaine lipidique polaire constitue, grace à sa composition sélective, un vecteur permettant d'améliorer la perméabilité de la cellule cible pour le produit actif.
Il est également possible, selon une autre . ~
2123~5 caractéristique de l'invention, d'incorporer dans la composition, en tant qu'agent actif, non pas un composé à proprement parler "traitant" mais une substance toxique sélective pour un agent pathogène, notamment un virus, une bactérie ou un champignon.
Dans ce cas particulier, la gaine lipidique polaire fait office de "leurre" pour piéger l'agent pathogène et faciliter son élimination.
On peut utiliser cet aspect de l'invention pour la lutte contre le sida en enrobant de l'AZT dans une gaine lipidique polaire dont la composition correspond à celle des cytomembranes lipidiques des leucocytes : le virus du sida peut en effet reconnaltre les lipides constitutifs de la gaine qui correspondent à sa voie de pénétration normale dans les cellules et venir ainsi en contact avec l'AZT de fa~on à favoriser sa destruction.
Le système lipidique polaire du présent brevet peut être également utilisé comme véhicule de composants de vaccins nécessaires au renforcement de 1'immunité humorale et cellulaire.
Les caractéristiques de la composition lipidique polaire qui fait l'objet de l'invention seront dé~aillées dans les exemples ci-dessous :
EXEMPLE 1 :
On a fabriqué une composition cosmétique ayant la formule pondérale suivante :
Vitamine E acétate 0,5 ~
Lécithine hydrogénée 0,5 % -Céramides 0,5 %
Vitamine A 0,1 %
~1 000 000 ui/g) Conservateurs + Eau.
2 1 2 3 `~
Cette composition s'est avérée très stable et à un toucher particulier qui plaît aux utilisatrices.
EXEMPLE 2 :
S Compte rendu d'un test réalisé dans les Laboratoires de la Faculté de Pharmacie de Chatenay Malabry (France) dans le but de vérifier l'activité
d'un mélange lipidique polaire conforme à l'invention sur la protection par les corticoides contre une att~que radicalaire.
Le principe de ce test consiste à soumettre des hématies isolées de leur plasma à une agression de type oxydatif dans des conditions contrôl.ées et standardisées de façon à leur permettre de mettre en jeu tout leur équipement enzymati~ue et moléculaire pour résister à cette agression jusqu'à modification de la membrane cellulaire et éclatement et lyse de la cellule.
Plus précisément, différentes préparations contenant des hématies ont été soumises à une attaque par des radicaux libres organiques produits par décomposition thermale d'un composé azoté soluble dans l'eau particulier : le chlorhydrate de 2,2'-azo-bis-2 amidinopropane (100 n~), sous atmosphère d'air à 37 C.
On a ainsi pu produire une quantité connue et constante de radicaux peroxydés.
A intervalle régulier dans le temps, on a prélevé, dans la préparation, un petit volume de surnageant et on a analyse son contenu en hémoglobine par spectrophotométrie (l = 540 nm ou 405 nm).
- La résistance dè la population d'hématies de chacune des préparations testées a alors été exprimée par le temps de demi lyse, c'est-à-dire le temps de li~ération de 50 ~ du contenu en hémoglobine.
Pour réaliser ce test, on a choisi des r _ . ~ . ;. ~. .~ . .
2123~8~
hématies humaines isolées préalablement lavées et remises en suspension dans de l'hematocrite (à 11 %) ;
ces cellules présentent, en effet, l'avantage d'avoir une demi-vie relativement courte (environ 110 jours) 5 et de posséder tout l'équipement moleculaire et enzymatique de la protection anti-radicaux libres, ce qui leur permet d'être représentatives des autres cellules de l'organisme.
Pour réaliser ce test, on a préalablement préparé les compositions suivantes conformes à
l'invention :
Composition A
Vitamine E acétate 2 Lécithine hydrogénée Céramides 1 %
Vitamine A acide 0,05 Conservateurs ~ Eau.
Composition B
Vitamine E acétate 2 ~
Lécithine hydrogénée 1 %
Céramides 1 %
Dexamethasone 0,02 %
Conservateurs + Eau.
On a ensuite fabrique le~ cinq préparations tests suivantes :
1 : Hématies 2 : Hématies + Composi~ion A (1/10) 2 1 2 3 5 ~ ~
The researchers were able to prove that the polar constituents of lipid cytomembranes have a determining role in cell permeability and thus influence the possibilities of penetration of active agents inside the cells.
Now, in accordance with the invention, we have realized that the aforementioned base mix has a composition largely identical to that of polar lipid constituents entering the composition of the lipid bilayers of plasma membranes, and, that, from this mixture - basic, it is possible to manufacture, by splitting-successive ments, a "second" lipid mixture of which the composition is identical to that specific to a given type of cell.
The idea underlying the invention is to use this identity to manufacture, from the basic polar lipid mixture, a composition in which the lipid formula of the lipid cytomembranes for carrying an active agent or facilitate its penetration into a target cell.
To this end, the invention relates to a polar lipid composition of plant origin characterized in that it consists of a aqueous emulsion for injection, intra-articular, topical or ingestible of a polar lipid blend .rich in phospholipids in particular in lecithin and in ~ eramides, having a composition essentially identical to that of polar lipid constituents 30 lipid cytomembranes ~ cells and obtained at from a plant compound such as corn flour cereals or an extract such as bran or lipids cereal extracts.
This composition, which can be pharmaceutically tic, cosmetic or dietetic can cover FEa.~ r~ Js~ ~NT
21~3~i8~
various forms without thereby departing from the scope of the invention and, in certain cases, the composition may even cons ~ ituer the active agent itself.
For example, it is known that a excess cholesterol little ~ cause the deposit, on the inner wall of the arteries, an atherosclerotic plaque constituted by a mixture of cells responsible for fat and cholesterol crystals. The reaction of the wall facing the atherosclerotic plaque is variable: it begins with sclerosis (atherosclerosis) and is followed by calcifications (mediacalcosis). Thrombosis may result (blood clotting in the artery) and aneurysms (distention of the wall).
However, we have already shown that polar lipid mixtures conforming to the invention and in particular the ceramides and derivatives are cholesterol emulsifiers: the injection in the blood circuit of a patient whose arteries are carriers of numerous atheroma plaques of a composition, in accordance with the invention: ion can make it possible to facilitate the elimination of these deposits; this mixture lipid will indeed extract the cholesterol then facilitate its evacuation in the blood circuit.
More precisely, to obtain the composition tion actually implemented in accordance with the invention, the notion of HLB or "Hyrophilic-Lipophilic Balance'! which corresponds to a classification of emulsifiers according to their hydrophilicity or their lipophilicity. A low HLB (3 to 5) characterizes an oily continuous phase emulsion, an HLB plus high (10 to 12) an aqueous continuous phase emulsion and beyond that a solubilization.
However, from this notion, we have developed numerous methods, both theoretical 21235~3~
only experimental to determine in each case particular the composition of a tensioning system active ingredients giving the finest emulsion and therefore the optimum coupling of several surfactants.
According to the invention, to determine in vitro the optimal composition for the emulsification of cholesterol, an experimental process was used based on research by measuring the conductivity of the amount of water causing the phase inversion of an emulsion.
This resulted in an HLB of 8 to 10.
According to a variant particularly advantageous of the invention, the emulsion has an essentially identical composition to that of the lipid cytomembranes of a cell targets and contains an active agent coated in a sheath of the lipid mixture.
Such a composition can, as for example, contain an associated hydrating agent, if necessary, to additives such as vitamins A or E and coated in a sheath having a composition identical to that of the lipid cytomembranes of cells of the epidermis and in particular of the stratum cornQum; the hydrating agents present in these compositions can be humectants or fat-soluble hygroscopic substances such as, for example, l ~ noline, polyunsaturated fatty acids including vitamin F, linoleic acid, gammalinolenic acid~
as or eicosapentaenoic acid or agents water-soluble such as ~ lycerin, mucopolysac-charides, allantoin derivatives, amino acids, urea, sodium, potassium~
In such compositions, which can be used for the fight against aging or the treatment of burns, the lipid mixture 2123,j~
fleece actually acts on two levels: it improves the membrane permeability with respect to the active agent, but, at the same time, contributes itself to the hydration cells ; we have, in fact, recently been able to put highlights the role in the hydration mechanisms of the skin of phospholipids and especially ceramides which are likely to contribute to a better water retention, restructure the epidermis and in particular the intercorneocyte cement and to improve the skin's resistance to external aggressions.
The composition in accordance with the invention can also take the form of a medicinal composition liar intended for various therapeutic classes and whose active agent can take various forms and in particular to be chosen from the group formed by the antibiotics, anti-inflammatories, corti-des, antivirals, anticancer drugs and drugs for cardiovascular diseases.
For example, we can more specifically cite the possibility of conveying the following active agents:
.~ .~
2123~i85 . . .
Therapeutic class ll Active agents ; ~
Cardio-Angeiology Rutin _ Dermatology Vitamin A acid Endocrinology and Testosterone hormone Metabolism Acid-rich oils gamma linoleic acid eicosapentaenoic acid docosahexaenoic acid I _ --Rheumatology Hydrocortisone (anti-inflammatories nonsteroidals) _ I
Immuno allergolo ~ ie Allergens _ , ~ . _ Thanks to the choice of a lipid mixture fleece whose composition corresponds to that of lipid cytomembranes of target cells that we wishes to treat, it is thus possible to inject the active agent directly on the desired site where it goes selectively "attacking" target cells thus allowing, for an effect and a yield improved, to reduce his concentration and therefore avoid side effects as much as possible.
The above examples are, of course, not . heard, not limiting and we can consider many other applications of the invention, consisting in particular in bringing in an element such than sodium in a deficient cell.
In all cases, the lipid sheath fleece constitutes, thanks to its selective composition, a vector for improving the permeability of the target cell for the active product.
It is also possible, according to another . ~
2123~5 characteristic of the invention, to incorporate in the composition, as an active agent, not a compound strictly speaking "treating" but a toxic substance selective for a pathogenic agent, including a virus, bacterium or fungus.
In this particular case, the lipid sheath fleece acts as a "decoy" to trap the agent pathogen and facilitate its elimination.
This aspect of the invention can be used for the fight against AIDS by coating AZT in a polar lipid sheath whose composition corresponds to that of the lipid cytomembranes of leukocytes: the AIDS virus can indeed recognize the constituent lipids of the sheath which correspond to its normal route of entry into the cells and thus come into contact with the AZT of how to promote its destruction.
The polar lipid system of the present patent can also be used as a vehicle for vaccine components needed to strengthen humoral and cellular immunity.
The characteristics of the composition polar lipid which is the subject of the invention will be detailed in the examples below:
EXAMPLE 1:
A cosmetic composition was made having the following weight formula:
Vitamin E acetate 0.5 ~
Hydrogenated lecithin 0.5% -Ceramides 0.5%
Vitamin A 0.1%
~1,000,000 iu/g) Preservatives + Water.
2 1 2 3 `~
This composition has proven to be very stable and a special touch that appeals to users.
EXAMPLE 2:
S Report of a test carried out in the Laboratories of the Faculty of Pharmacy of Chatenay Malabry (France) in order to verify the activity of a polar lipid mixture in accordance with the invention on protection by corticosteroids against radical attack.
The principle of this test is to submit red blood cells isolated from their plasma to an attack of oxidative type under controlled conditions and standardized in such a way as to allow them to implement game all their enzymatic and molecular equipment to resist this aggression until modified of the cell membrane and bursting and lysis of the cell.
Specifically, different preparations containing red blood cells were attacked by organic free radicals produced by thermal decomposition of a nitrogen compound soluble in particular water: 2,2'-azo-bis-2 hydrochloride amidinopropane (100 n~), under an air atmosphere at 37 C.
We were thus able to produce a known quantity and peroxide radical constant.
At regular intervals in time, we have taken from the preparation a small volume of supernatant and its hemoglobin content was analyzed by spectrophotometry (l = 540 nm or 405 nm).
- The resistance of the population of red blood cells each of the preparations tested was then expressed by the half-lysis time, i.e. the time of li ~ eration of 50 ~ hemoglobin content.
To perform this test, we chose r _ . ~ . ;. ~. .~ . .
2123~8~
isolated human red blood cells previously washed and resuspended in hematocrit (at 11%);
these cells have the advantage of having a relatively short half-life (about 110 days) 5 and to possess all the molecular equipment and enzymatic anti-free radical protection, this which allows them to be representative of the others body cells.
To perform this test, we first prepared the following compositions in accordance with the invention:
Composition A
Vitamin E acetate 2 hydrogenated lecithin Ceramides 1%
Vitamin A acid 0.05 Preservatives ~ Water.
Composition B
Vitamin E acetate 2 ~
Hydrogenated lecithin 1%
Ceramides 1%
Dexamethasone 0.02%
Preservatives + Water.
We then made the ~ five preparations following tests:
1: RBCs 2: Red blood cells + Composition A (1/10)
3 : Hématies + Cvmposition B (1/10) 3: Red blood cells + Cvmposition B (1/10)
4 : Hématies + Betneval (marque déposée) (1/10) ` S : Hématies + Effederm (marque déposée) (1/10).
2123~
Le Betneval et l'Effederm correspondent à
des médicaments du commerce renfermant respectivement de la dexaméthasone et de la vitamine A acide à des concentrations similaires à celles des compositions A
et B conformes à l'invention.
Le tableau ci-dessus donne les temps de demi lyse T50 exprimés en minute ob~enus pour chacune des préparations testées :
¦ Préparation l T50 ]
;
15 1 ~
Ces résultats montrent que l'addition des deux produits du commerce ne protège que très faiblement la durée de vie des hematies soumises à un "stress" radicalaire, tandis que les deux compositions conformes à l'invention qui ont été testées ont permis d'obtenir une protection de beaucoup supérieure.
EXEMPLE 3 :
- Compte rendu d'un tPst réalisé au Laboratoire du Tissu Conjonctif du CNRS de Creteil (France) dans le but de vérifier l'activité d'un mélange lipidique polaire conforme à l'invention sur l'inhibition d'une enæyme particulière, l'élastase leucocytaire humaine (ELH) qui présente la propriéte de détruire l'élastine et donc de provoquer un vieillissement cellulaire et d'altérer également les parois artérielles.
212~
L'activité du mélange conforme à l'invention a été comparée à celle de l'acide oléique, substance de référence.
Le principe de ce test consiste à mesurer 1'inhibition de l'activité enzymatique par différentes préparations testées en suivant la cinétique à 410 nm de la dégradation d'un substrat S correspondant essentiellement à l'élastine le : Me-O-Suc-Ala2-Pro-Val-pNa (N-Méthoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-Nitro-anilide) Dans ce test, on mesure, dans le temps, l'evolution de la concentration en p-Nitroanil:Lne qui se trouve libérée sous l'effet de l'activ:ite de 1'enzyme ELH sur le substrat S.
Pour réaliser ces tests, on a utili~é en tant que tampons de réaction T :
- soit le tris-HCl 0,1 M + 0,01 % de triton X-100 à pH 8, - soit le tris-HCL 0,1 M à pH 8.
De manière générale, on a pu observer une meilleure inhibition dans le tris-HCL, mais une activité enzymatique plus faible que dans le tampon tris-HCL + 0,01 % de triton X-100.
Dans le cadre de cet exemple :
.- la figure 1 représen~e l'activité anti-elastasique de-l'acide oléique de référence, - la figure 2 représente l'actlvite anti-élastasique 3~ de la préparation A, - la figure 3 représente l'activité anti-élastasique de la préparation B, - la figure 4 représente l'activité anti-élastasi~ue de la préparation C, - la figure 5 représente l'activité anti-élastasique 2123~
de la préparation D.
Plus précisément :
Pour chacune des sustances testées, on a préparé les cuves 1 à 5 dont la composition est répertoriées dans le tableau ci-après :
.
-~
. .
E E I ~~ E
i h ~ O ~ O ~
~ ~0~ t~
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a~
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~ ~ _ ~ I
o :1 ~ R
L~ ~ 1~ P~ u~
FE ~Q ~ ?
2 1 2 3 5 g 3 On a ensuite agité chacune des cuves pendant 30 mn à 37C de manière à laisser à 1'enzyme le temps d'agir sur son substrat.
On a ensuite effectué la lecture à 410 nm de la concentration en p-nitro-aniline et reporté
les résultats obtenus sur des courbes 1 à 5 qui correspondent aux cuves de même numérotation. Les courbes numérotées 1 correspondent à la référence tandis que les courbes 2 et 3 représentent les cinétiques en l'a~sence de préparations testées et les courbes 4 et 5 en présence de ces préparations.
Sur chacune de ces courbes, on a reporté, en abcisse, le temps en minutes et, en ordonnée, la déviation optique DO lue à 410 nm.
Les préparations testées ont été les suivantes :
- Préparation A : Ceramide 1 % + lécithine hydrogénée 1 960 - Préparation B : Céramide 1 % + lécithine hydrogénée 1 ~ ~ Vitamine E acétate 2 %
- Préparation C : Céramide 1 ~ ~ lécithine hydrogénée 1 ~ + Vitamine E acétate 2 ~ +
Vitamine A acide 0,05 %5 - Préparation D : Ceramide 1 ~ ~ lécithine hydrogénee 1 % + Vitamine E acétate 2 % +
- Dexamethazone 0,02 ~.
Pour l'acide oléique de reférence, on a procédé de manière quelque peu différente vu que l'on a utilisé sept cuves de mesure à partir desquelles on a établi, à chaque fois, les courbes correspondant au suivi de la cinétique de la li~ération de p-nitro-aniline. Les courbes 1 à 3 correspondent respective-ment, comme pour les préparations conformes à
212~S8~
l'invention, à la courbe de référence et auxcinétiques en l'absence d'acide oléique. Les courbes 4 et 5 correspondent à une concentration en acide oléique égale à 0,1 ~g/ml tandis que les courbes 6 et 7 correspondent à une concentration en acide oléique de 1 ~g/ml.
Les courbes correspondant à l'acide oléique de référence ainsi qu'aux préparations A à D sont jointes en annexe.
Sur chacune d'entre-elles, on a mesuré le pourcentage d'inhibition de l'activité anti-élastasique de chacune des différentes préparatLon au bout de 10 mn et on a trouvé les résultats suivc~nts :
Acide oléique de référence à 0,1 yg/ml : 36 %
Acide oléique de référence à 1 ~g/ml : 84 %
Préparation A : 45 %
Préparation B : 24 %
Préparation C : 29 %
20 Préparation D : 51 ~.
Ces résultats permettent de prouver clairement l'activité anti-élastasique des compositions conformes à l'invention et, en particu-lier, des céxamides.
Cette activité n'avait jusqu'à présentjamais été démontrée.
, I
3~
FE~gS~ c~ r ~ 4: Red blood cells + Betneval (registered trademark) (1/10) ` S: Red blood cells + Effederm (registered trademark) (1/10).
2123~
Betneval and Effederm correspond to commercial drugs containing respectively dexamethasone and vitamin A acid at concentrations similar to compositions A
and B in accordance with the invention.
The table above gives the times of half lysis T50 expressed in minute ob ~ enus for each preparations tested:
¦ Preparation l T50 ]
;
15 1 ~
These results show that the addition of two commercial products only protects very the lifespan of red blood cells subjected to a radical "stress", while the two compositions in accordance with the invention which have been tested have allowed to obtain much greater protection.
EXAMPLE 3:
- Report of a tPst carried out at the Connective Tissue Laboratory of the CNRS of Creteil (France) for the purpose of verifying the activity of a polar lipid mixture in accordance with the invention on inhibition of a particular enzyme, elastase human leukocyte (ELH) which has the property to destroy elastin and thus to cause a cellular aging and also alter the arterial walls.
212~
The activity of the mixture in accordance with the invention has been compared to that of oleic acid, a substance reference.
The principle of this test is to measure inhibition of enzymatic activity by different preparations tested by following the kinetics at 410 nm of the degradation of a corresponding substrate S
essentially to elastin the: Me-O-Suc-Ala2-Pro-Val-pNa (N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-Nitro-anilide) In this test, we measure, over time, the evolution of the p-Nitroanil:Lne concentration which is released under the effect of the activity of the ELH enzyme on the substrate S.
To carry out these tests, we used as reaction buffers T:
- either 0.1 M tris-HCl + 0.01% triton X-100 at pH 8, - or 0.1 M tris-HCL at pH 8.
In general, we observed a better inhibition in tris-HCL, but a lower enzyme activity than in buffer tris-HCL + 0.01% triton X-100.
In this example:
.- Figure 1 represents ~ e anti-elastase activity reference oleic acid, - Figure 2 shows the anti-elastase actlvite 3~ of preparation A, - Figure 3 shows the anti-elastase activity preparation B, - Figure 4 shows the anti-élastasi ~ ue activity preparation C, - Figure 5 shows the anti-elastase activity 2123~
of preparation D.
More precisely :
For each of the substances tested, we have prepared tanks 1 to 5 whose composition is listed in the table below:
.
-~
. .
IEE~~E
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o:1 ~ R
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FE ~Q ~ ?
2 1 2 3 5g 3 Each of the tanks was then agitated for 30 min at 37C so as to leave the enzyme time to act on its substrate.
The reading was then taken at 410 nm of p-nitro-aniline concentration and reported the results obtained on curves 1 to 5 which correspond to tanks with the same numbering. The curves numbered 1 correspond to the reference while curves 2 and 3 represent the kinetics in the a ~ sence of tested preparations and the curves 4 and 5 in the presence of these preparations.
On each of these curves, we have reported, in abscissa, the time in minutes and, in ordered, the optical deviation DO read at 410 nm.
The preparations tested were following:
- Preparation A: Ceramide 1% + hydrogenated lecithin 1960 - Preparation B: Ceramide 1% + hydrogenated lecithin 1 ~ ~ Vitamin E acetate 2%
- Preparation C: Ceramide 1 ~ ~ hydrogenated lecithin 1 ~ + Vitamin E acetate 2 ~ +
Vitamin A acid 0.05%5 - Preparation D: Ceramide 1 ~ ~ hydrogenated lecithin 1% + Vitamin E acetate 2% +
- Dexamethazone 0.02 ~.
For the reference oleic acid, we have proceeded in a somewhat different way since we used seven measuring cells from which established, each time, the curves corresponding to the monitoring of the kinetics of the release of p-nitro-aniline. Curves 1 to 3 correspond respectively-ment, as for preparations complying with 212~S8~
the invention, to the reference curve and to the kinetics in the absence of oleic acid. Curves 4 and 5 correspond to an acid concentration oleic equal to 0.1 ~ g / ml while the curves 6 and 7 correspond to an oleic acid concentration of 1 ~ g / ml.
The curves corresponding to oleic acid reference as well as to preparations A to D are appended.
On each of them, we measured the percentage inhibition of anti-elastase of each of the different preparations to the after 10 minutes and we found the following results:
Reference oleic acid at 0.1 yg/ml: 36%
Reference oleic acid at 1 ~ g/ml: 84%
Preparation A: 45%
Preparation B: 24%
Preparation C: 29%
20 Preparation D: 51 ~.
These results allow us to prove clearly the anti-elastase activity of compositions in accordance with the invention and, in particular bind, cexamides.
This activity had never before been demonstrated.
, I
3~
FE~gS~ c~ r ~