CA2113464A1

CA2113464A1 - Expression in non-tumoral human lymphoblastoid lines with an integrative vector

Info

Publication number: CA2113464A1
Application number: CA 2113464
Authority: CA
Inventors: Annick Ballay; Georges Boffa; Jean-Pierre Cartron; Stany Chretien; Patrick Lambin; Claude Lopez; Sylvie Prigent; Charles Salmon
Original assignee: Individual
Current assignee: FONDATION NATIONALE DE TRANSFUSION SANGUINE
Priority date: 1991-08-01
Filing date: 1991-08-01
Publication date: 1993-02-18

Abstract

The use of human cell lines for producing heterologous proteins, particularly therapeutically useful proteins, on an industrial scale after genetic engineering of their coding sequence and insertion into a suitable vector, is disclosed. The cell lines are non-tumoral lymphoblastoid lines which have been immortalized by EBV. The construction of an integrative-type vector plasmid comprising an expression cassette designed to promote the optimal expression of heterologous DNA sequences in lymphoblastoid cells is also disclosed.

Description

W O 93/03163 PC~r/FR91/00636 WO 93/03163 PC ~ r / FR91 / 00636

2 ~ ~l 3 '~

Expresslon dans des l~gnees lymphoblasto~des huma~nes non-tumorales avec un vecteur lntegrat~f.

s ___________ ~ 'invention concerne l'utilisation de lignées cellulaires humaines pour la production, à l'échelle industrielle, de protéines hétérologues, plus particulièrement de protéines d'intérêt thérapeutique, après manipulation génétique de leur séquence codante.
Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation de cellules lymphoblastoïdes humaines, immortalisées in ~itro par le virus d'Epstein-Barr et s~lectionnées pour leur absence de caractère tumoral ou tumorigène. Pour assurer l'expression de protéines hétérologues par lesdites cellules, la séquence codante de ces protéines est insérée dans un plasmide vecteur génétiquement manipulé, de type intégratif et portant une cassette d'expression conçue pour permettre l'expression desdites protéines dans les cellules lymphoblastoïdes transformées, clonées et sélectionnées, et ayant intégré la cassette d'expression dans 1'ADN chromoso.nique cellulaire.
L'invention concerne aussi la conception et la construction de ce plasmide vecteur destiné à assurer une production optimale des protéines hétérologues par les cellules lymphoblastoïdes transformées.
La production de prot~ines d'intérêt thérapeutique difficiles à purifier à partir de sources naturelles o~
elles sont présentes en petites quantités ou dont les sources sont potentiellement dangereuses comme les tumeurs ou le plasma sanguin éventueliement contamin~ par des virus, justifie encore de nombreux efforts de recherche et développement en cultures de cellules in vitro, dans des conditions de culture bien standardis~es et offrant des . 35 garanties d'innocuité.
Cependant l'expression de molécules de grand~
ta~lle et dont l'acti~ité biologique d~pend de la structure WO93/03162 ~ ~ l 3 '~

Expresslon in lymphoblasto-human genes non-tumor with a vector lntegrat ~ f.

s ___________ ~ 'invention relates to the use of lines cell phones for production, at scale industrial, heterologous proteins, plus particularly proteins of therapeutic interest, after genetic manipulation of their coding sequence.
More particularly, the invention relates the use of human lymphoblastoid cells, immortalized in ~ itro by the Epstein-Barr virus and selected for their absence of tumor character or tumorigenic. To ensure protein expression heterologous by said cells, the coding sequence of these proteins is inserted into a vector plasmid genetically manipulated, of an integrative type and bearing a expression cassette designed to allow expression said proteins in lymphoblastoid cells transformed, cloned and selected, and having integrated the expression cassette in cellular chromosomal DNA.
The invention also relates to the design and construction of this vector plasmid intended to ensure a optimal production of heterologous proteins by transformed lymphoblastoid cells.
The production of proteins of therapeutic interest difficult to purify from natural sources o ~
they are present in small quantities or whose sources are potentially dangerous like tumors or the blood plasma possibly contaminated by viruses, still justifies many research efforts and development in cell cultures in vitro, in well standardized growing conditions offering . 35 safety guarantees.
However the expression of large molecules ~
ta ~ lle and whose biological activity d ~ hangs from the structure WO93 / 0316

3 PCT/FR91/006 spa ~a~ ~e~ de la maturation eorrecte (glycosylation, sia~ylation, etc..) n'est pas possible dans n'importe quel type de cellule, en particulier dans les microorganismes, dont la fermentation industrielle est simple. Par contre dans les cellules eucaryotes, si la maturation des molécules pose moins de prablèmes, c'est la culture même des cellules qui pose des problèmes à l'échelle industrielle, la plupart des cellules non tumorales ne se multipliant que sous forme de monocouche, adhérant au récipient de culture. Des progrès importants ont été apportés par la mise au point de techniques de culture sur microporteurs et en bioréacteurs mais elles ne conviennent pas à tous les types de cellules et po~ent des problèmes si les protéines ne sont pas excrétées dans le milieu de culture. D'autre part des cellules comme les Vero qui sont particulièrement bien adaptées à ce mode de culture sont très réfractaires aux manipulations génétiques.
La recherche de nouvelles lignées cellulaires et de vecteurs adaptés pour permettre la manipulation génétique de celles-ci justifie donc toujours d'importants efforts de recherche~
C'est pourquoi la Demanderesse a envisagé
l'utilisation de lign~es lymphoblasto~des humaines semblables à celles qu'on utilise d~j~ pour la production d'anticorps monoclonaux mais cette utilisation nécessite la mise au point de vecteurs de clonage et d'expression particuli~rement adapt~s à ces cellules.
~ ne lign~e lypmphoblastoïde humaine, la lignée Namalwa, a d~jà été utilisée pour produire une protéine hétérologue ; elle se multiplie bien en suspension et sécrète la prot~ine hétérologue dans le milieu où on peut la récupérer, 80US forme biologiquement active ~Yanagi et al.
Gene 1989r76,19 et DNA 1989,8,419) mais cette lignée est dérivée d'un lymphome de Burkltt et présente un haut degr~
de tumoriq~niclté.
C'e t pourquoi l'ob~ectif de la pr~sente invention est l'utilisation de cellules lymphoblasto~des humaines non ~

:`

WO93/03163 ~1 I 3 ~ ~ ~ PCT/FR91/006~

tumorales et non tumorigènes.
De telles cellules sont connues : par transformation avec le virus d'Epstein-Barr (EBV) on peut immortaliser des lymphocytes B du sang d'un donneur sain quelconque, et sélectionner des lignées qui ne synthétisent que l'antigène nucléaire EBNA-l de l'EBV ~Thoda et al.
Cancer Res. 38, 1978, 3560). De telles lignées prolifèrent de manière indéfinie en culture mais ne sont pa-q tumorales, ce qu'on vérifie par leur absence de capacité de former des colonies en agar, et elles ne sont pas tumorigènes sur la souris "nu-nu" (Gurtsevitch et al, Int J. Cancer 47, 87, 1988, Tursz, Medecine/Sciences 6, Suppl.42, 1989).
La Demanderesse utilise déjà des lignées de ce type pour produire des anticorps monoclonaux. Un milieu de culture pauvre en protéines a été mis au point pour faciliter la purification des molécules sécretées (brevet F
2 600 076).
Ce type de cellule a déjà servi de modèle pour exprimer des protéines héterologues dont le gène est ins~ré
dans un réplicon autonome qui `se maintient à l'état épisomique dans la cellule parce qu'il porte l'origine de réplication de l'EBV qui se retrouve sous le contrale de la protéine EBNA-l de l'EBV qui a servi à immortaliser la lignée cellulaire ~Xioussis et al~ EMBO J.6, 1987, 355 ;
Young et al. Gene 62, 1988, 171 ; Jalanko et al. Gene 78, 1989, 287). Toutefois, l'~tat épisomique du réplicon ne permet pas de garantir la stabilit~ de son nombre de copies par cellule et donc la capacité de production de la protéine hét~rologue au cours du temps, surtout à une échelle industrielle qui implique un tr~s grand nombre de cycles de multiplication cellulaire.
C'est pourquoi la présente invention concerne ~galement la mise au point, par manipulation gén~etique, d'un vecteur comportant tous les éléments necessaires l'expression d'une prot~ine het~rologue dans les cellules lymphoblasto~des humaines mais egalement des éléments d'ADN
favorisant l'intégration de cet ensemble dans l'ADN
"'~

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3 1~ 6 ~ 4 chromosomique de la cellule réceptrice.
Ainsi la présente invention concerne l'utilisation de lignées de cellules lymphoblastoïdes humaines, immortalisées in vitro par l'EBV et sélectionnées pour leur absence de caractère tumoral ou tumorigène, lesdites cellules pouvant être dérivées des lymphocytes B d'un donneur sain quelconque ou, parmi de telles lignées, on peut choisir une lignée particulière et bien caractérisée, déposée à l'ATCC sous la référence CCL 156 RPMI 1788.
L'utilisation selon l'invention permet la production, à l'échelle industrielle, de protéines hétéro}ogues cod~es par un segment d'ADN adapté pour ~tre inséré dans un plasmide vecteur g~nétiquement manipulé, de type int~gratif et portant une cassette d'expression comprenant tous les éléments permettant l'expression desdites protéines hétérologues après intégration de ladite cassette d'expression dans l'ADN chromosomique des cellules lympho~lastoïdes.
La présente invention concerne également la conception et la construction du plasmide vecteur destiné à
l'utilisation des cellules lymphoblastoïdes pour la production de proté~nes hétérologues. Ledit plasmide comprend, outre les éléments d'ADN bactérien nécessaires ~
son amplification dans un hôte de type E.Coli et qu$
2S dérivent du plasmide de départ pMIP10 (Ballav et al. Hepadna Viruses, 1987, 481 Ed. Alan R. Liss), - les ~léments qui constituent une cassette d'expression permettant 1'insertion d'un ADN hétérologue quelconque en vue de son expression dans les cellules lymphoblasto~des humaines, - la séquence d'ADN de 1'Adenovirus 5 codant pour les ARN VA
I et VA II pour optimaliser la traduct~on des ARN messagers (Mathews, Cell ~, 223, 1975 ; Soderland et al, Cell 1, 585, 1976 ; Schneider et al, Cell ~1, 291, 1984, Svensson et al.
EMBO J. 4, 957, 1985) ;
- le plasmide comprend en outre un gène de sélection manlpulé pour etre efficace dans les cellules eucaryotes :
,,.

WO93/03163 PCT/FR91/0~ ~
2113 !~ 6 i~ ' on peut choisir l'ADN codant pour la xanthine-guanine phosphoribosyl transférase (XGPRT) de E.coli placé sous le -~
contrôle du promoteur et des signaux de maturation du gène TK du virus Herpes simplex 1 (~SV1) (Mulligan Berg. Proc.
Natl~ Acad. Sci~ USA ~8, 2072, 1981) ; on peut également choisir l'ADNc de la dihydrofolate réductase de souris (DHFR) qui permet une amplification génique en présence de méthotrexate (Alt et al, J. Biol. Chem.253, 1357, 1978) on peut aussi envisager l'utilisation simultanée des deux gènes de sélection, insérés à des points distincts du p}asmide vecteur.
- le plasmide vecteur comprend également des éléments d'ADN
sélectionnés pour favoriser l'intégration de l'ADN
plasmidique dans l'ADN chromosomique de la cellule Iymphoblasto~de. Ces éléments d'ADN seront plus particulièrement choisis parmi les fragments d'ADN
mitochondr~al de souris qui ont été décrits comme favorisant la multimérisation en tandem d'ADN hétérologue au cours de 1'intégration dans le génome de cellules de mammifères (Lutfalla et al. Soma~ic cell and Mol. Genetics, 11, 223, 1985).
La cassette d'expression comprend un ensemble d'éléments constituant une unité de transcription fonctionnelle dans les cellules choisies et plus particulièrement :
- en amont de la position qui recevra la séquence d'A~N
hét~rologue, des éléments de r~gulation d'Adenovirus humains comprenant une séquence activatrice, un promoteur et une séquence ~'leader", - et, en aval de cette position, un signal de polyad~nylation dérivé du virus SV 40.
Les éléments d~rivés d'Adenovirus humains sont de préférence :
- le promoteur de l'Adenovirus 5 tLavery et al. J. Virol.
61, 14666, 1987) placé sous le controle d'une séquence acti~atr~ce de la transcriptlon, situee en amont du promoteur, ét de pr6f6rence la s6quence act1vatrice ElA de :`~

W093/03163~ 34~,4 PCI/FR91/00636 l'Adenovirus 5, - le promoteur majeur tardif (MLP) de 1'Adenovirus 2 couplé
à une copie ADNc de la séquence ~leader~ tripartite de l'Adenovirus 2, ce qui permet une augmentation de l'efficacité de la traduction des ARN messagers. Ces divers éléments indépendants sont décrits par Berkner (Biotechniques 6, 616, 1988).
Ce choix n'est pas limitatif : d'autres éléments dérivés d'Adenovirus peuvent aussi être utilisés comme }e promoteur ma~eur tardif de l'Adenovirus 5 et les "enhancers" du BKV
~Grinnell et al, Mol Cell. Biol. 6, 3596-3605, 1986) ou du SV40 ~Zenke et al, EMBO J. 5, 387-397, 1986), et en particulier de leur association en tandem (Berg et al., Nucl. Acid. Res, 16, 1635, 1988).
La zone centrale de la cassette d'expression, destinée à 1'insertion de la séquence d'ADN hétérologue a été consue pour offrir des sites de restriction rares pour favoriser cette manipulation d'insertion, et plus particulièrement, les sites Not I, Bst E II, Bgl II, Mlu I.
L'invention est plus particulièrement destinée à
l'utilisation des cellules décrites, avec le plasmide vecteur décrit, pour produire des protéines d'intérêt therapeutique difficiles à purifier à partir de sources naturelles. L'invention comprend donc 1'insertion des ADN
codant pour ces protéines h~térologues dans la cassette d'expression telle que d~crite plus haut. Le plasm~de vecteur est ensuite introduit dans les cellules par électroporation ~Potter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81, 7~61, 1984).
Comme premier ADN utilisé à titre de modèle pour prouver la faisabilité technique des productions proposées, on a utilisé l'ADN de l'érythropo'~étine humaine (qui sera notée Epo ou Epo HR pour erythropo'~tine humaine recombinante). On peut aussi utiliser un ADN d'une protéine analogue présentant l'activité de l'érytb.ropo'iétine.
La protéine naturelle est produ~te dans les reins et circule en trè5 faible quan~ite dans le plllma. Elle ~oue ~ ' WO93/03163 ~ PCT/FK91/006~

un rale essentiel dans la maturation des érythrocytes.
Elle comprend 166 acides aminés et de 40 à 50 % de glucides ce qui impose sa synthèse dans des cellules appropriées. Son extraction à partir d'urine de patients aplasiques ~Mikake et al. J. Biol. Chem. 252 55S8, 1977) et à partir de tumeurs rénales (Sherwood et al. Endocrinology 99, 504, 1976) sont décrites mais ne permettent pas une production industrielle.
La production d'Epo humaine recombinante a également ~té d~crite dans divers types de cellules (COS, CHO, BHK, NIH 3T3) mais les inconvénients de ces diff~rentes cellules ont déjà ét~ évoqués plus haut.
Un deuxi~me modèle a été mis au point. avec la séquence codante de l'interleukine 3 (IL-3).
L'IL-3 est une ~lycoprotéine de 20-26 kDa stimu~ant la prolifération et la différenciation des prog~niteurs hématopoi~tiques appartenant aux lignées ~rythroïdes, mégacaryocytaires, granulo-macrophàgiques, éosinophiles et basophiles, dont l'ADNc humain a été cloné
par Yang et al ~Cell 47,3-10,1986~. Chez la souris, l'IL-3 est impliqu~e dans l'autorenouvellement et la différenciation de la cellule souche multipotente ~CFU-S), en synergie avec l'IL-1. L'IL-3 possède également, en synergie avec les cytokines spécifiques de chaque lignée, une activité sur la croissance et les fonctions de cellules différenciées (macrophages et mastocytes, polynucléaires neutrophiles et éosinophiles). A cause de son rôle dans la stimulation des cellules souches hématopoi~tiques, l'IL-3 pourrait trouver une application thérapeutique dans le traitemen~ des aplasies médullaires (Shrader, Annu. Rev.
Immunol. 4, 205-230, 1986 ; Mizel, FASEB J. 3, 2379, 1989 ;
Tigaud et al., medecine/sciences 7, 444, l991). Il a ét~
montr~ aussi que l'IL-3 stimule l' h~matopoi~se chez les primates, en synergie avec le GM-CSF ~Donahue et al., 35 Science 241, 1820, 1988).
Un troisi~me mod~le a été mis au point avec la séquence codante du GM-CSF (granulocyte-macrophage colony WO93/03163 PCT/FR91/~6~
3 ~ 8 stimulating factor). Le GM-CSF est aussi une multipoiétine, c'est-à-dire un facteur de croissance capable, comme l'IL-3, de stimuler la croissance et la différenciation de plusieurs lignées hématopoiétiques (granulo-monocytaires, érythroides et colonies mixtes) et d'agir sur les fonctions des cellules différenciées (macrophages). Le gène humain du GM-CSF a été
cloné par plusieurs équipes (Wong et al, Science 228, 810, 1985 ; Lee et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4360, 1985 ;
Cantrell et al, Proc. Natl Acad; Sci USA 82, 6250, 1985 ;
Miyatake et al, EMBO J. 4, 2561, 1985) et cette molécule fait l'objet d'études de développement clinique chez l'homme dans le traitement des aplasies médullaires, des leucopénies d'origine virale ~EBV, HIV) et le traitement des cytopénies induites par les chimiothérapies anti-néoplasiques ~Clark et Kamen, Science 236, 1229, 1987 ; Groopman et al, N. Engl. J.
Med. 32~1, 1449, 1989 ; Applebaum et al, Sem. Hematol. 26, 7, 1989 ; Solal-Céligny, médecine/Sciences 4, 231, 1991 ;
Tigaud et al., médecine/sciences 7, 444, 1991).
; La présente invention couvre également les lign~es cellulaires après leur transformation stable par un plasmide vecteur tel que décrit et qui ont été clon~es et sélectionnées par criblage, parmi de nombreux clones transformés, pour leur taux ~levé de sécrétion de la protéine hetérologue choisie. Les procédés de récolte et de purification sont adaptés à chacune des protéines.
Les exemples suivants sont destinés ~ illustrer l'invent~on sans toutefois en limi~er la port~e.
Les 2 figures suivantes permettent de mieux comprendre les constructions g~nétiques :
Fioure 1 : Schéma de la construction du vecteur pTS39.
Toutes les constructions d~rivent du plasmide pMLP10. Les abréviations suivantes sont utilisées pour désigner le~
différents fragments d'ADN : E : séquence activatrice du gene ElA d'Ad5 ; MLP : promoteur ma~eur tardif d'Ad2 ; L :
copie ADNc de la sé~uence leader tripartite d'Ad2 ; CAT :
gène bact~rien codant pour la chloramphenicol acétyl transf~rase ; Ll : polylinker du pUC18 ; L2 `:

WO93/03163 PCT/FR91/006~
~1~3is~

oligonucléotide de synthèse ; P : région codante de la protéine hétérologue ; pA : signal de polyadénylation du virus SV40 ; XGPRT : gène bactérien codant pour la xanthine guanine phosphoryosyl transférase ; VA : g~nes d'Ad5 codant pour les ARN VA ; mito : fragment d'ADN murin d'origine mitochondriale ; DHFR : ADNc murin codant pour la dihydrofolate reductase.
Eigure 2 : Schéma du vecteur d'expression de type intégratif pTS39.
ADN mito : fragment d'ADN murin d'origine mitochondriale. Un second gène de sélection (DHFR) est placé en position bicistronique en aval de la région codante P.
Autres abréviations : comme figure 1.
.
Exem~le 1 : construction du vecteur inté~ratif Le vecteur intégratif pTS39 représenté sur la figure 2 a été construit par les étapes successives suivantes, schématisées dans la figure l. -`
- Le plasmide de départ est le pMLP10 (Ballay et al. Hepadna Viruses, 481, 1987, Ed. Alan R. Liss).
- Le plasmide pMLPCAT dérive du pMLPlO par insertion du fragment Ein~III-~mHI du pHp34-CAT contenant le gène CAT et les signaux de maturation de SV40 (P. Gilardi et al, Nucleic Acid Research 20. 7877-7887, 1984) entre les sites ~in~III
et ~mHI du pMLP10.
- Le plasmide pTS1 a ensuite été obtenu par insertion du polynker ~QRI-~in~III de pUCl8 au niveau du site ~I du pMIPCAT. ~~
- Le plasmide pTS2 dérive du pTSl par insertion de l'oligonucléotide de synthèse suivant ~noté L2 ~ans les schémas) :
-AGCTTGCGGCCGCGGTTACCAGATCTACGCGTGTT-3' -ACGCCGGCGCCAATGGTCTAGATGCGCACAA-5' contenant les sites rares NotI, SaCII, a~EII, ~gLII, ~
entre les sites ~in~ H~aI du pTSl, et où sera ins~rée la séquence codante de la protéine hét~rologue choisie (notée P ) -: ' :

~ e plasmide pTS5 est ensuite obtenu en insérant le fragment HindIII du pAG60VA (contenant les gènes VAI et VAII
d'Ad5) au niveau du site XbaI du pTS2.
- Le plasmide pTS17 déri~e du pTS5 par insertion du fragment PvuII de pAGT40 (contenant le gène XGPRT sous le contrôle du promoteur et des signaux de ~.aturation du gène Tk du virus H5Vl) au niveau du site ~maI de ~
- Le plasmide pTS37 dérive de pTS17 par insertion du fragment ECoRI-E~I du p~1 contenant séquence d'ADN
mitochondrial de souris au niveau du site SacI du pTSl7.
- Enfin, le plasmide pTS39 est obtenu en insérant le fragment E~mH1-B~lII du pTG1086 (contenant la région codante du cDNA DHFR murin, qui constitue un moyen de pression sélective alternatif au XGPRT) au niveau du site BglII de lS pTS37, pour être placé en position bicistronique par rapport à la séquence codante P insérée dans l'oligonucléotide L2.
- Le plasmide pTS39 sera noté pTS39-P quand la séquence codante d'une protéine héterologue sera insérée dans l'oligonucléotide L2 (et donc noté L2-P sur le schéma).
Exem~le 2 : Utilisation du ~lasmide ~TS39 ~our ~roduire 2.1. Isolement du aène de l'E~o Une banque d'ADN génomique a été cribl~e avec un oligonucléotide 30-mer:5'-CGTGATATTCTCGGCCTCCTTGGCCTCCAA-3' déduit de la séquence du gène (Lin et al, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA ~, 7580, 1985). Cette sonde est complementaire inversée de l'ARN messager et elle reConnatt la s~quence de l'Epo en position 12~-159 (la base No 1 repr~sentant l'initiation de la traduction).
Le vecteur de clonage est EMBL 3, il contient des fragments insérés d'ADN humain de 12 à 20 kb. On etale 107 clones répartis sur 10 bo~tes de 15 cm de diamètre. Trois sé;rieQ de filtres, répliques de ces bo~tes, ont été lavée~
et hybridées avec leQ sondes oligonucléotidiqueQ marquées l'aide de la T4 polynucléotide kinase, et présentant une W093/03163 PCT/FR91/006~
3 '~ G~
activité spécifique de 109 cpm/~g, dans les conditions suivantes :
- Pré-hybridation : 3 SSC, 2 X Denhardt's, 0,005 ~ Tétra-sodium disphosphate (Nappi), 100 ~g/ml sperme de saumon, 52C pendant 4 h.
- Hybridation : 6 SSC, 2 X Denhardt's, 0,05 % Nappi, 20 ~g/ml tARN, 55C pendant la nuit avec la sonde Epo ~106 cpm/ml par filtre).
- Lavage : 2XSSC, température laboratoire, 2 X SSC, 0,005 %
Nappi, 3 x 20 min. à 52C.
- Lavage supplémentaire en 1 X SSC, 0,05 % Nappi à 52C
pendant 20 min et/ou 0,1 SSC, 0,05 % Nappi à 52C pendant 20min.
Quatre criblages successifs ont été réalisés pour aboutir à la caracterisation de 3 clones purs hybridant très fortement avec la sonde.
L'ADN de ces 3 phages a été amplifié, puis analysé. Afin de controler la pr~sence du gène Epo dans son intégralité, la carte de restriction de ces 3 clones a ét~
construite et la présence des extrémités 3' et 5' du g~ne Epo a été recherchée en utilisant deux sondes oligonucléotidiques reconnaissant les bornes de ce gène.
Deux clones parmi les trois contenaient le gène Epo dans son intégralité. Des fragments de restriction contenant le gène Epo dans son intégralité ont ét~ sous clonés dans un vecteur d'ampl~fication du type pUC. Ainsi les deux fragments de restriction ~mHI-~indIII de 5,4 kb et ~s~ BqlII de 4 kb ont ~t~ sous clonés.

~
Les ARN totaux d'une tumeur rénale humaine exprimant de façon constitutive l'Epo ont été isolés. A
partir de ces ARN totaux la fraction ARN poly A+ a été
isolée par passage sur colonne d'oligo-dT et clonée par la m~thode PCR.
Deux sondes encadrant l'ADNc de 1'Epo ont ~t~
choisies :

;.

,c~ P~ 12 . S 10 : 5'-CTGGAGTGTCCATGGGACAG-3' Cet oligonucléotide (20-mer) est en position 694 par rapport à l'adénosine l de l'ATG (initiation de la traduction du messager Epo). Cet oligonucléotide reconnalt la séquence inverse complémentaire de l'ARNm de l'Epo et borne la partie 3' de 1'ADNc.
. INTS 9 : 5'-AGGCGGGAGATGGGGTGC-3' Cet oligonucléotide ~20-mer) est dans le même sens que l'ARNm et borne la partie 5' de l'ADNc de l'Epo (position-lO
par rapport à l'adénosine l du codon d'initiation). La sonde INTS lO permet de recopier la matrice ARNm de l'Epo en utilisant la reverse transcriptase. L'ARNm est ensuite d~gradé à la soude pendant l heure à 65C. Cet ADNc simple brin peut-être alors amplifié par la technique PCR en utilisant les deux sondes bornant l'ADNc : INTS lO et INTS
9. Un fragment d'ADN de 723 pb a été ainsi amplifié puis isolé par électrophorèse, cloné dans un vecteur d'amplification du type pUC puis séquenc~.

2 ~ Introduction des s~uences c~odantes de l'Epo dans le Yecteur DTS:~9 La s~quence codante de 1'Epo (génomique ou ADNc) est introduite dans lloligonucléotide (L2) du plasmide pTS39 sous ~orme de fragment ~EII~ II entre les sites ~i et ~5lII.
Les constructions résultantes seront appelées pTS39-Epo.

2 4. Transfection _des cellules et sé1~s~_ transforman~
La transfection est réalisée avec un électropulsateur ATEIM (Bioblock, France). Deux solutions acqueuses sont prépar~es préalablement :
. Le milieu de fusion: Inositol 250 mM, RH2PO4 1 n~, Mg Acétate 0,5 mM, Ca Acétate 0,l mM ; pH 7,4.
. Le milieu post-fusion: NaCl 132 mM, XCI 8 mM, XH2P04 lmN, ~- Mg Acétate 0,1 mM, Ca Acétate 0,1 mM ; pH 7,4.

: : .

13 ~ 3~
Après 2 jours de culture, les cellules sont lavées et ajustées à 4.107/ml dans le milieu de fusion. La suspension est incubée lO min à 0C en présence de l'ADN à transfecter ~5~g/lO6 cellules). Un échantillon de la suspension est placé entre les électrodes de l'appareil et l'électroporation est conduite dans les conditions suivantes: 4 impulsions rectangulaires à l seconde d'intervalle de durée lO0 ~s, avec un champ électrique de l.500 V/cm2. Immédiatement après le choc électrique la suspension est diluée au l/20 puis incubée 20 min à 37C. La viabilité des cellules se situe entre 20 et 60 %. Les cellules sont ensuite mises en culture à une concentration de 0,5 lO6 cellules/ml.
48 heures après la transfection un aliquot du surnageant est prélevé pour le dosage de l'Epo. Les cellules sont alors cultivées en milieu selectif (Iscove, lO % SVF -sérum de veau foetal - dialys~, acide myco~hénolis~ 1 ~g/ml, ~an~hin~ 250 ~g/ml correspondant au g~ne de sélection XGPRT). -Après 14 à 21 jours de sélection sur le pool, des clonages par dilution limite sont réalisés en microplaques de 96 puits en présence de cellules nourricières tlymphocytes humains totaux, irradiés à 4000 rds, issus de donneurs sains).

= ~ _ .
*Cellules ATCC CCLl56 transformés par le vecteur d'expression pTS39-Epo.
Environ 6.lO6 cellules CCLl56 sont transfectées par ~lectroporation avec 30 ~g d'ADN plasmidique puis soumises 48 h après transfection, au milieu sélectif contenant la xanthine et l'acide mycoph~nolique. La population résistante est clonée par dilution limite en présence de cellules nourricières ~lymphocytes humains irradi~s). Parmi les différents clones obtenus, le clone 156 0,5AF8 secrète environ lO0 à 150 unités d'Epo par ml de milieu de culture/72 h et a été suivi ~ lon~ terme en WO93/03163 ~ PCT/FR91/006 ~ 14 présence et en absence de pression de sélection. Les résultats indiquent que ce clone est stable sur 48 passages soit environ 7 mois de culture en absence de pression de sélection.
5L'analyse en Southern blot de 1'ADN total extrait du clone 156 0.5AF8 indique que le vecteur pTS39-Epo est intëgré en tandem dans le génome cellulaire à raison de 15 ~
20 copies par cellule, que le clone soit cultivé en présence ou en l'absence de pression de sélection.
10En culture en "roller", le clone 0.5AF8 secrète 80 à 100 U Epo/ml en trois jours de culture en milieu pauvre en protéines CK4 ou CK4N ~milieu de base : melange Iscove-Ham F12 (1:1) ; CK4 : suppléments : albumine humaine 50 mg/l, transferrine humaine (saturée ~ 30 % par ad~onction de 15FeC13)~ 1 mgil, insuline bovine 3 mg/l, acide linoléique 1 mg/l, putrescine 10 ~M, éthanolamine 20 ~M ; CK4N, idem plus ribonucléotides : Adénosine 100 mg/l, Cytidine 100 mg/l, Guanosine 100 mg/}, Uridine 100 mg/l). Ce taux de sécrétion peut etre renouvelé 3 fois si le milieu est changé tous les 20:: 3 jours.

~-~*Cellules immortalisées in vitro par l'EBV ~lignée INTS-F5).
~: L'expérience réalisée sur les cellules CCL156 a ~; été reproduite sur des cellules F5, déjà utilisées au ~: 25 laboratoire pour la production d'anticorps monoclonaux (Goosens et al. J. Immunol. Methods 1987, lQ1, 193) et qui sont transfectées avec le vecteur pTS39-Epo. Les dosages d'Epo effectu~s à différents temps après la transfection sont positifs : on détecte 29 U Epo/ml/106 cellules apr~s 21 jours de sélection.

' ~i2Q~
*Culture d'érythroblastes de ~oie foetal.
35L'activit~ de l'Epo est meQur~e in ~ltro d'apr~s 1~ t ncorporat$on de 59Fe p~r l`es ~rythroblastes de foie ~:; foet~l de sour1s ~prélevés au 13e jour de gestation) WO93/03163 2 11~ 1 PCT/FR91/006 cultivés en 26 heures selon une méthode dérivée de celle décrite par Stephenson et al, (Endocrinology 88, 1519, 1971).
Les cellules sont dissociées mécaniquement et S mises en suspension en milieu RPMI 1640 (Tambourin et al, Biomedicine 1~, 112, 1983 ; Goldwasser et al, Endocrinology 9?, 315, 1975) à la concentration 1,6 x 106 cellules/ml contenant 7 % de sérum de veau foetal, 85 ~M d'albumine et 0,4 ~M de transferrine humaine.
Selon les cas un milieu sans sérum est utilisé
dans lequel des pho.cpholipides naturels ~so~a, ovolecithine) purifiés ou synthétiques (32 x 10-3M) et du cholestérol ~1,6 x 10-3M) sont solubilisés en chloroforme, secondairement ~vaporé sous courant d'azote. Les lipides en solution d'albumine ~ 1 mg/ml en RPMI sont dispersés par les ultrasons en glace fondante (Boffa et coll, Exp. Hématol.
10, 675, 1982).
La suspension cellulaire est répartie en volume de 200 ~l dans les puits à fond rond des plaques de culture "Nunclon"M. Après une incubation de 21 heures à 37C en présence de 0,7% de CO2, la 59Fe-transferrine est incorpor~e dans les puits, les plaques sont agit~es et remises en incubateur pour une incubation prolongée de 5 heures~
Chaque échantillon est analys~ à 3 ou 4 concentrations protéiques. L'activité de chaque dose résulte d'une quadruple détermination. Le taux d'incorporation du 59Fe sur l'hème extrait par la m~thyléthylcetone ou dans les cellules est mesuré en fonction du logarithme de la dose de l'échantillon et les résultats sont exprimés en milliunité/ml ou par mg de protéine.
L'~talon est de 1'Epo humaine de recombinaison titrant 100.000 U/mg. Son activit~ sp~cifique a ét~ d~finie - d'apr~s les échantillons d'Epo humaine issus de la seconde préparation de Référence Internationale ~Annable et al, Bull. Wld. Hlth. Org. ~l, 99, 1972).
*Culture de progén~teurs érythroides de moelle osseuse ou de sang périphérique.

. ~.

~ Les effets de l'Epo HR sur la maturation des BFUe et des CFUe ont été déterminés en culture de précurseurs cellulaires érythroïdes sur méthylcellulose en milieu IMDM
dépourvu de sérum (Cormier et al, Cell Différentiation, 11, 261, 1985). L'Epo HR, comme l'Epo humaine urinaire, détermine la différentiation et la maturation des BFUe issus de la moelle osseuse de souris ou du sang périph~rique humain. L'effet-dose de l'Epo HR sur le développement des CFUe est comparé avec celui donne par l'Epo naturelle.
*Détection par tests radio-immunologiques.
Le dosage radioimmunologique de l'Epo HR a ét~
réalisé dans les surnageants cellulaires selon deux procéd~s:
. p~r précipitation par double anticorps en phase soluble :
un immunsérum de lapin anti-Epo urinaire humaine monospé`cifique (Terry Fox Lab, Vancouver) est incubé avec un étalon d'Epo H ou un échantillon à doser pendant 16 h à 4C.
Après ce délai, 2000 cpm 125I-Epo HR (Amersham) sont ajoutés et les préparations sont incubées 2 h à 4C. La dilution de l'immunsérum choisie est celle qui donne une radioactivit~
fixée de 20 à 30 %. La dilution finale de l'immunsérum se situe entre 10-4 et 10-5. Après une incubation de 2 h à 20C
avec des immunoglobulines de ch~re anti-Fc de lapin, la radioactivité du culot est mesur~e.
. par précipitation par double anticorps en phase solide sur TachisorbM :
les réactifs sont r~partis en un seul temps sur plaques de microti~ration DynatechM 96 puits sous un volume final ~e 220~1. Apr~s une incubation de 2 heures sous agitation horizontale rotative a la temp~ra~ure ambiante, la r~colte s'effectue sur filtre de fibres de verre sur appareil SkatronM .
La distribution concerne successivement l'Epo de la gamme ou de l'échantillon sous un volume de 100 ~1, l'~mmun sérum antl Epo 10 ~1, 125-I-Epo HR 10 ~1 et le Tachisorb R 100 ~1. Apr~s transfert en tube de polystyr~ne des échantillons sur fibres de verre, la radioactivité est WO93/03163 PC~/FR91/006 7 2~ ?~;7 mesurée.
La gamme de mesure de la méthode est comprise entre 1 et lOOmU.
Les surnageants des cellules transformées possèdent des activités pou~ant atteindre 800 U/ml alors que les surnageants cellulaires avec vecteur anti-sens sont dépourvus d'activité. Il y a toujours une excellente correlation entre les ~osages biologiques in vitro et le dosage radioimmunologique.
2.7. Détec~iQn et mesure de l'~c~ivité bioloaiq~e in vivo de l'Epo HR :
L'activité in ViYo de l'Epo produite dans les surnageants de culture des cellules lymphoblastoïdes lS transformées est testée après injection à des souris rendues polyg~obuliques par transfusion afin d'hinhiber la synthèse ~-d'Epo endogène (Jacobson. et al Proc. Soc. Exp. Biol. Med, 94, 243, 1957). Les r~sultats indiquent que l'Epo produite par les cellules lymphoblastoïdes présente une puissante activité biologique comparable à celle de l'Epo HR produite par des cellules CHO (Brevet Kirin-Amgen EP 0 148 605).
Les r~sultats traduisent une étroite corrélation avec les dosages biologiques in vitro d'après la seconde préparation de r~férence internationale d'Epo urinaire . 25 humaine.

E~em~le 3 _ PrQ~ de p~p~ratiQ~ d~ con~entr~s 3.a) Premi~re méthod~
Le surnageant de culture cellulaire en milieu pauvre en protéines ~CK4) est concentr~ par ultrafiltration sur membrane PM10 Amicon ou par filtration tangentielle sur MinitanM ~qu~p~ d'une membrane PLGC suivie par un lavage en solution en glucose 12,5 mM, galactose 12,5 mM, PEG 6000 0,1 mg/ml ~-mercaptoethanol 10-4 M, ~usqu'à une résistivité du W093/0~163 ~s 18 PCT/FR91tO06 filtrat supérieure à 5000 Ohms.
Le.concentrat lyophilise est chromatographié sur UltrogelM AcA44 en tampon acetate de calcium 10 mM, NaCl 100 mM, phénol 5,6 10-4 M, glucose 12,5 mM, galactose 12,5 mM, PEG 6000 0,1 mg/ml pH 6,8. Les fractions actives sont concentrées par ultrafiltration et lyophilisées. Le produit est ensuite traité par HPLC sur colonne TSK 545 DEAE en tampon -acétate 0,048 mM, CaC12 3mM, glucose 12,5 mM, galactose 12,5 mM, PEG-6000 0,1 mg/ml, ~-mercaptoethanol 10-4 M puis élution par un gradient de molarité discontinue de NaCl. Le rendement en activité est voisin de 75- %. Après dialyse et concentration, le produit est chromatographié sur :CM Affigel blueM en tampon phosphate lOmM, NaCl lSO mM pH
7,2. L'Epo est éluée par une molarité de 1,15 M NaCl.
L'activité spécifique de l'Epo HR est supérieure à 100.000 U/mg.

; 3.b) :c_ i: Q ~
:Le concentrat des milieux de culture obtenu sur - 20 membranes d'ultrafiltration est t`raité sur DEAE SéphacelM ~
4C en tampon acétate 48 mM, CaC12 3mM, phénol 5,4 10-4 M, pH 4,5. L'activité retenue est éluée en NaCl 0,6 M.
Apr~s concentration et dialyse, l'~luat est soumis à une filtration sur UltrogelM AcA44, puis la fraction active d~tectée par RIA est chromatographiée en HPLC-DEAE en pr~sence de r~ducteurs et d'hexoses stabilisants. L'Epo HR
~luée en tampon pH 5,5, à faible molarité de NaCl, est concentr~e sur membrane AmiconM PM10 puis charg~e sur une colonne de WGA-Sépharose 6MB en tampon PBS à 4C. Son élution est obtenue par N-acetylglucosamine 0,5 M.
En électrophorèse sur gel en gradient de polyacrylamide (4 30 %) en présence de SDS, un composant de 34 kDa est obser~
dans les préparations issues du WGA-S~pharose. Ce composant e.st identifie en "immunoblot" par des immunoglobulineQ-polyclonales anti-Epo ~R et des anticorps monoclonaux anti-Epo HR. Un composant minoritaire migrant Qur une zone de 42 kDa est observé dans certaines préparations. Ce composant :

WO93/03163 2 ^~ PCT/FR91/00636 n'est pas reconnu en immunoblots par des immuns sérums polyclonauY. anti-Epo HR. Ce résultat est confirmé par la détection radioimmunologique et par l'analyse en culture d'érythroblastes de foie foetal de souris des éluats d'électrophorèse préparative en gel de polyacrylamide SDS.
Selon les cas, une étape de purification complémentaire est réalisée solt sur CM Affigel blueM, soit sur HA-UltrogelM ou en H LC filtration en milieu SDS 0,l %. Le poids moléculaire apparent de l'Epo HR en gel de polyacrylamide/SDS est de 34 kDa.
L'activite spécifique obtenue est sup~rieure à
120.000 U/mg en culture d'~ry~hroblastes et en RIA avec des rendements compris entre 20 et 30 %.

3.c) Troisième méthode : Immunopurificatio~ de l~EPQ-E~
*c-l. Pr~paration de 1'immunoadsorbant A partir de surnageants cellulaires la pr~paration d'Epo HR purifiee a ~t~ r~alis~e d'après la méthode d~crite dans le deuxième exemple ci-dessus. L'activité spécifique de cette préparation déterminée par dosage radioimmunologique et par son activité en culture d'érythroblastes était de 130.000 U.I.
l'Epo HR lyophilisée puis reprise en solution en présence de SDS ~ 0,05 % a servi à l'immunisation de souris Balb/c.
Chaque souris a reçu à 15 jours d'intervalle trois injections intrapéritonéales aux doses suivantes : 90, 45 et lO ou 35 ~g pour la dernière injection. Toutes les fusions ont été r~alisées 5 jours apr~s la derni~re injection.
Selon les expériences 30 à 9~ ~ des puits de fusion ont ~té test~s. Les anticorps sont recherch~s dans les surnageants des puits de fusion d'après leur capacit~ de fixer l'l25I-Epo HR. L'identification des complexes marqués est obtenue par un anticorps de chèvre anti-IgG de souris fixé par liaison covalente sur protéine A de staphylocoques.
Les complexes sont collectés et comptés.
Au cours de la lOème fusion, 3 hybrides se sont W093/03l~ 3 4~ l'CT/F~91/006 révélés positifs et ont été clonés. Le sérum de la souris qui a fourni les splénocytes présentait une réactivité
immunologique de 65 % avec une dilution au 1/3000. Un anticorps monoclonal anti-Epo de référence : EplO-141A26 de classe IgG a été obtenu. Son taux de fixation est compris entre 50 et 60 %. Le clone producteur de l'anticorps s'est avéré stable après de multiples clonages et sous clonages.
Une expansion réalisée en culture et en ascite a permis d'obtenir des volumes suffisants pour la purification de plusieurs dizaines de milligrammes d'anticorps. La purification des anticorps est réalisée sur protéine G-Sépharose. L'anticorps purifié est obtenu par adsorption de l'ascite en tampon phosphate 0,1 M, pH 7,5, lavage à pH 6,5 et élution en tampon glycine-HCl 0,1 M, pH 2,8. Des lots de 30 mg d'anticorps EplO-141A26 purifié sont obtenus et fixés sur Sépharose 4B activité (8ml de gel) par le bromure de cyanogène. A titre d'exemple une telle colonne peut fixer environ 5 à 6 mg d'Epo HR. Des essais pr~liminaires ont montré que 1'Epo était adsorbée par 1'anticorps immobilis~
un pH voisin de la neutralité. Son élution a été analysée à
différents pH : 6,5, 4,5, 2,8 et 2,2 ; elle s'effectue principalement à partir de pH 4,5 jusqu'à 2,8.
La conservation de l'immunoadsor~ant est effectu~e en tampon phosphate pH 7,5, Thymiro~alM 0,02 % à 4C ; la colonne peut être utilisée pour de nombreux cycles.

*c-2. Purification de l'Epo La purification est r~alisée en deux étapes :
- Première étape :
Le surnageant de cellules lymphoblastoïdes est amené par ultrafiltration à une concentration protéique de 3 à 4 mg/ml, puis dialysé en eau d~minéralisée et équilibré avec l'acide acétique à pH 4,5 et ~ 1.000 Ohms par addition d'eau.
Apr~s élimination d'un précipite par centrifugation le produit est traité sur colonne de DEA~
S~phacelM, équilibré en tampon acétate 0,04 M, CaCl~ 0,0025 WO93/03163 21 2 1 i 3 1 ~ PCT/FR91/006 M et phénol 5,4 10-4 M, avec un rapport égal à 0,1 (volume d'échangeur en ml/protéines incorporées en mg).
L'élution de la fraction active obtenue par addition de 0,6 M NaCl dans le tampon de départ représente 15 à 20 % des protéines incorporées. Les produits élués sont équilibrés pH 7 puis dialysés jusqu'à une résistivité de 80 à 100 Ohms.
- Deuxième étape :
Elle est réalisée sur l'immunoadsorbant préparé selon la méthode décrite ci-dessus. Les protéines éluées de la DEAE
SéphacelM sont incorporées sur l'immunoadsorbant en tampon phosphate 0,1 M pH 7,5 à 4C avec un débit de 6 à 7 ml/heure. Le lavage est effectué ~ pH 6,5 dans le même tampon. L'élution de l'Epo a ~té obtenue par un tampon glycine 0,1 M HCl pH 2,2 avec un débit de 50 ml~heure ~ la température ambiante. L'éluat est équilibré par du tampon tris l M, pH 7,5. Le rendement en activité se situe entre 50 et 60 % de l'Epo active de départ.
*c-3. Caractéristiques de l'Epo HR immunopurifiée ~ partir des produits des cellules lymphoblasto~des.
Le degr~ d'homogénéité des pr~parations d'Epo HR
èst apprécié par densitom~trie après électrophorèse en gel de polyacrylamide SDS. L'Epo est homogène à plus de 98 %.
Le poids moléculaire apparent mesuré par électrophor~se en gel de polyacrylamide SDS est de 34.000 daltons. Son comportement électrophorétique est identique à celui de l'Epo produite par des cellules CHO ainsi qu'à celui de la molecule radioiodée (comm~rcialisée par Amersham). Son point isoélectrique est compris entre 3,5 et 4. Son activité
spécifique est sup~xieure aux pré~arations d'Epo urinaire et se situe selon les lots aux environs de 200.000 UI/mg.

Exemple 4 : Utilisa~L~ d~ Dlasmide Yecteur iA~ 9.L

Une sonde constituée de 1'oligonucléotide complémentaire lnverse ~30-mer) d`'une séquence de l'IL-3 :
S'TAA GTG TGT TAT AAT TTC ATC GAT CAT GTT 3' WO93/03163 ~ PCT/FR91/006~
3~ 22 ~
a été utilisée pour cribler une banque d'ADN génomique de leucocytes humains et une banque d'ADNc de foie foetal humain. La sonde synthétisée correspond à la base llO (et sui~antes) en aval de l'ATG initiateur de la séquence codante ADNc de 1'IL-3.
Plusieurs clones ont été isolés et la présence du gène a été confirmée par cartographie de restriction. Les phages contenant ces gènes sont sous-clonés dans pUC 18 sous forme de fragment Acc I de 5,4 Kb. Avant d'introduire ce fragment dans la cassette d'expression du plasmide vecteur, les séquences promoteur et 3' non traduite en sont éliminées. Pour ce~a, la région contenant la séquence codante est amplifiée par la méthode PCR ~ l'aide des 2 oligonucléotides de synthèse suivants :
INTS l6 : 5' GATCCAAACATGAGCCGCCT 3' début : position -9 de l'ATG (Met initiatrice) INTS 17 : 5' ATGTCCCGAGGCGCTGTGGT 3' d~but : position 52 en aval du codon stop en utilisant comme matrice les clones génomiques dans pUCl8, caractériisés précédemment.
Le produit d'amplification de 2.140 pb est sous-cloné dans le site Sma I d'un pUCl8 et partiellement séquencé pour ~érifier l'intégrité du gène IL-3 ~selon Yang et Clark, dans "Developmental Control of globin gene expression" A.R. Liss p.3-ll 1987).
La séquence codante ainsi contrôlée a ~té
introduite dans la cassette d'expression du plasmide vecteur décrit dans l'exemple l. Un clone cellulaire transformé
donnant une r~ponse bien positive a été sélectionné et multiplié~
De l'interleukine-3 biologiquement active est sécrétée dans le milieu de culture des cellules.

35 produire du GM-CSF humain dans les cellules `
~ ` ,::.
; Une sonde constituée de l'oligonucléotide ~ . ```, ` ``:

;~

W093/03163 23 2 ~ fi-. PCT/FR91/006 complémentaire inverse (30 mer) d'une séquence du GM-CSF :
5' TTG CTC TAA GCA CTT GAG CAG GAA GCT CTG 3' a été utilisée pour cribler une banque d'ADN génomique de leucocytes humains et une banque d'ADNc de foie foetal humain. La sonde synthétisée correspond à la base 157 (et suivantes) en aval de l'ATG initiateur de la séquence codante du GM-CSF.
Plusieurs clones ont ~té isolés et la présence du gène a été confirmée par cartographie de restriction. Les phages contenant ces gènes sont sous-clonés dans pUC18 sous forme de fragment Hind III/Eco RI de 3,2 Kb. Avant d'introduire ce fragment dans la cassette d'expression du plasmide vecteur, les s~quences promoteur et 3' non traduite en sont éliminées. Pour cela, la région contenant la séquence codante est amplifiée par la méthode PCR à l'aide des 2 oligonucléotides de synthèse suivants :
INTS 19 : 5'CACAGAGAGAAAGGCTAAAG 3' début : position-31 de l'ATG (Met initiatrice) INTS 18 : 5' ATTCCCATTCTTCTGCCATG 3' début : position 177 en aval du codon stop en utilisant comme matrice les clones génomiques dans pUC18, caractéris~s précéaemment.
Le produit d'amplification de 2.240 pb est sous-cloné dans le site Sma I d'un pUC18 et partiellement séquencé pour verifiex l'intégrité du gène GM-CSF ~selon Miyatake et al. EMBO J.4, ~561, 1985).
La séguence codante ainsi contr~lée a été
introduite dans la cassette d'expression du plasmide vecteur décrit dans l'exemple 1. Un clone cellulaire transform~
donnant une réponse bien positive a été sélectionné et multipli~.
Du GM-CSF biologiquement actif est s~crét~ dans le - milieu de cultures des cellules. 3 PCT / FR91 / 006 spa ~ a ~ ~ e ~ of correct maturation (glycosylation, sia ~ ylation, etc.) is not possible in any cell type, especially in microorganisms, whose industrial fermentation is simple. On the other hand in eukaryotic cells, if the molecules mature poses fewer problems, it is the very culture of cells which poses problems on an industrial scale, most non-tumor cells multiplying only in the form of monolayer, adhering to the culture vessel. Some progress have been brought about by the development of culture techniques on microcarriers and bioreactors but they are not suitable for all types of cells and may cause problems if the proteins are not excreted in the culture medium. On the other hand cells like the Veros which are particularly good adapted to this culture method are very resistant to genetic engineering.
The search for new cell lines and vectors adapted to allow genetic manipulation of these therefore always justifies significant efforts to research ~
This is why the Applicant has considered the use of human lymphoblasto lines similar to the ones we use for production monoclonal antibodies but this use requires the development of cloning and expression vectors particularly adapted to these cells.
~ ne line ~ e human lypmphoblastoid, the line Namalwa, ad ~ was used to produce protein heterologous; it multiplies well in suspension and secretes the heterologous protein in the environment where it can be recover, 80US biologically active form ~ Yanagi et al.
Gene 1989r76,19 and DNA 1989,8,419) but this line is derived from Burkltt lymphoma and has a high degree ~
of tumoriq ~ niclté.
This is why the objective of the present invention is the use of lymphoblasto cells ~ non human ~

: `

WO93 / 03163 ~ 1 I 3 ~ ~ ~ PCT / FR91 / 006 ~

tumor and non-tumorigenic.
Such cells are known: by transformation with Epstein-Barr virus (EBV) we can immortalize B cells from the blood of a healthy donor any, and select lines that do not synthesize that the EBNA-1 nuclear antigen of EBV ~ Thoda et al.
Cancer Res. 38, 1978, 3560). Such lines proliferate indefinitely in culture but are not tumor-related, which is verified by their lack of capacity to form agar colonies, and they are not tumorigenic on the "nu-nu" mouse (Gurtsevitch et al, Int J. Cancer 47, 87, 1988, Tursz, Medecine / Sciences 6, Suppl. 42, 1989).
The Applicant already uses lines of this type to produce monoclonal antibodies. A middle of low protein culture has been developed to facilitate the purification of secreted molecules (F patent 2,600,076).
This type of cell has already served as a model for express heterologous proteins whose gene is ins ~ re in an autonomous replicon which `maintains itself in the state episomal in the cell because it carries the origin of replication of EBV which is found under the control of EBNA-1 protein of EBV which served to immortalize the cell line ~ Xioussis et al ~ EMBO J.6, 1987, 355;
Young et al. Gene 62, 1988, 171; Jalanko et al. Gene 78, 1989, 287). However, the episomal state of the replicon does not does not guarantee the stability of its number of copies per cell and therefore the production capacity of the protein heterologous over time, especially on a scale industrial which involves a very large number of cycles of cell multiplication.
This is why the present invention relates ~ also the development, by gen ~ etical manipulation, of a vector with all the necessary elements expression of a heterologous protein in cells lymphoblasto ~ of humans but also of DNA elements promoting the integration of this set into DNA
"'~

WO93 / 03163 PCT / FR91 / 006 ~
3 1 ~ 6 ~ 4 chromosome of the receptor cell.
Thus the present invention relates to the use human lymphoblastoid cell lines, immortalized in vitro by EBV and selected for their absence of tumor or tumorigenic character, said cells that can be derived from B cells from a any healthy donor or, among such lines, one can choose a particular and well-characterized line, filed with ATCC under the reference CCL 156 RPMI 1788.
The use according to the invention allows the production, on an industrial scale, of proteins hetero} ogues encoded by a DNA segment adapted to be inserted into a genetically manipulated vector plasmid, int ~ gratif type and carrying an expression cassette including all the elements allowing the expression of said heterologous proteins after integration of said expression cassette in chromosomal DNA of cells lympho ~ lastoids.
The present invention also relates to the design and construction of the vector plasmid intended for the use of lymphoblastoid cells for production of heterologous proteins. Said plasmid includes, in addition to the necessary bacterial DNA elements ~
its amplification in an E.Coli type host and that $
2S are derived from the starting plasmid pMIP10 (Ballav et al. Hepadna Viruses, 1987, 481 Ed. Alan R. Liss), - the elements which constitute an expression cassette allowing the insertion of any heterologous DNA in view of its expression in lymphoblasto ~ cells human, - the DNA sequence of Adenovirus 5 coding for VA RNAs I and VA II to optimize the translation of messenger RNAs (Mathews, Cell ~, 223, 1975; Soderland et al, Cell 1, 585, 1976; Schneider et al, Cell ~ 1, 291, 1984, Svensson et al.
EMBO J. 4, 957, 1985);
- the plasmid also comprises a selection gene manipulated to be effective in eukaryotic cells:
,,.

WO93 / 03163 PCT / FR91 / 0 ~ ~
2113! ~ 6 i ~ ' we can choose the DNA coding for xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (XGPRT) from E.coli placed under the - ~
control of promoter and maturation signals of the gene Herpes simplex 1 virus TK (~ SV1) (Mulligan Berg. Proc.
Natl ~ Acad. Sci ~ USA ~ 8, 2072, 1981); we can also choose the mouse dihydrofolate reductase cDNA
(DHFR) which allows gene amplification in the presence of methotrexate (Alt et al, J. Biol. Chem. 253, 1357, 1978) we can also consider the simultaneous use of both selection genes, inserted at points distinct from the p} asmid vector.
- the vector plasmid also includes DNA elements selected to promote DNA integration plasmid in the chromosomal DNA of the cell Iymphoblasto ~ de. These DNA elements will be more particularly chosen from DNA fragments mitochondr ~ al of mice which have been described as favoring tandem multimerization of heterologous DNA during Integration into the genome of mammalian cells (Lutfalla et al. Soma ~ ic cell and Mol. Genetics, 11, 223, 1985).
The expression cassette includes a set of elements constituting a transcription unit functional in selected cells and more especially:
- upstream of the position which will receive the sequence of A ~ N
heterologous, regulatory elements of human Adenovirus comprising an activator sequence, a promoter and a sequence ~ 'leader ", - and, downstream of this position, a signal polyad ~ nylation derived from the SV 40 virus.
Elements of human Adenoviruses are from preference :
- the promoter of the Adenovirus 5 tLavery et al. J. Virol.
61, 14666, 1987) placed under the control of a sequence acti ~ atr ~ ce of transcriptlon, located upstream of promoter, and preferably the ElA activating sequence of : `~

W093 / 03163 ~ 34 ~, 4 PCI / FR91 / 00636 Adenovirus 5, - the major late promoter (MLP) of the coupled Adenovirus 2 to a cDNA copy of the ~ leader ~ tripartite sequence of Adenovirus 2, which allows an increase in the efficiency of translation of messenger RNAs. These various independent elements are described by Berkner (Biotechniques 6, 616, 1988).
This choice is not exhaustive: other derived elements Adenovirus can also be used as a promoter late master of Adenovirus 5 and BKV enhancers ~ Grinnell et al, Mol Cell. Biol. 6, 3596-3605, 1986) or SV40 ~ Zenke et al, EMBO J. 5, 387-397, 1986), and in particular of their association in tandem (Berg et al., Nucl. Acid. Res, 16, 1635, 1988).
The central area of the expression cassette, for insertion of the heterologous DNA sequence a was designed to offer rare restriction sites for favor this insertion manipulation, and more in particular, the sites Not I, Bst E II, Bgl II, Mlu I.
The invention is more particularly intended for the use of the cells described, with the plasmid vector described, to produce proteins of interest difficult to purify from sources natural. The invention therefore includes the insertion of DNA
encoding these heterologous proteins in the cassette of expression as described above. The plasma of vector is then introduced into cells by electroporation ~ Potter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81, 7 ~ 61, 1984).
As the first DNA used as a model for prove the technical feasibility of the proposed productions, we used the DNA of human erythropo 'etin (which will be noted Epo or Epo HR for human erythropo 'tine recombinant). You can also use DNA from a protein analog showing the activity of erythropropietin.
Natural protein is produced in the kidneys and circulates in very low quan ~ ite in the plllma. She ~ oue ~ ' WO93 / 03163 ~ PCT / FK91 / 006 ~

an essential role in the maturation of erythrocytes.
It contains 166 amino acids and 40 to 50% of carbohydrates which requires its synthesis in cells appropriate. Its extraction from patients' urine aplastic ~ Mikake et al. J. Biol. Chem. 252 55S8, 1977) and from kidney tumors (Sherwood et al. Endocrinology 99, 504, 1976) are described but do not allow a industrial production.
The production of recombinant human Epo has also ~ tee described in various types of cells (COS, CHO, BHK, NIH 3T3) but the disadvantages of these diff ~ rents cells have already been mentioned above.
A second model has been developed. with the coding sequence of interleukin 3 (IL-3).
IL-3 is a ~ lycoprotein of 20-26 kDa stimulates the proliferation and differentiation of hematopoietic progenitors belonging to the lineages ~ rhythmroids, megakaryocytic, granulo-macrophobic, eosinophils and basophils, from which human cDNA has been cloned by Yang et al ~ Cell 47,3-10,1986 ~. In mice, IL-3 is involved in self-renewal and differentiation of the multipotent stem cell ~ CFU-S), in synergy with IL-1. IL-3 also has, in synergy with the specific cytokines of each line, activity on cell growth and function differentiated (macrophages and mast cells, polynuclear neutrophils and eosinophils). Because of its role in the stimulation of hematopoi ~ stem cells, IL-3 could find a therapeutic application in the treatment of spinal cord aplasia (Shrader, Annu. Rev.
Immunol. 4, 205-230, 1986; Mizel, FASEB J. 3, 2379, 1989;
Tigaud et al., Medicine / science 7, 444, l991). He was ~
also show that IL-3 stimulates h ~ matopoi ~ in primates, in synergy with GM-CSF ~ Donahue et al., 35 Science 241, 1820, 1988).
A third model has been developed with the coding sequence of GM-CSF (granulocyte-macrophage colony WO93 / 03163 PCT / FR91 / ~ 6 ~
3 ~ 8 stimulating factor). GM-CSF is also a multipoietin, that is to say a capable growth factor, such as IL-3, to stimulate the growth and differentiation of several hematopoietic lines (granulocytocytic, erythroid) and mixed colonies) and act on cell functions differentiated (macrophages). The human GM-CSF gene has been cloned by several teams (Wong et al, Science 228, 810, 1985; Lee et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4360, 1985;
Cantrell et al, Proc. Natl Acad; Sci USA 82, 6250, 1985;
Miyatake et al, EMBO J. 4, 2561, 1985) and this molecule is the subject of clinical development studies in humans in the treatment of spinal cord aplasia, leukopenia of viral origin (EBV, HIV) and the treatment of cytopenia induced by anti-neoplastic chemotherapy ~ Clark and Kamen, Science 236, 1229, 1987; Groopman et al, N. Engl. J.
Med. 32 ~ 1, 1449, 1989; Applebaum et al, Sem. Hematol. 26, 7, 1989; Solal-Céligny, medicine / Sciences 4, 231, 1991;
Tigaud et al., Medicine / science 7, 444, 1991).
; The present invention also covers lines ~ es cells after their stable transformation by a plasmid vector as described and which have been cloned and selected by screening, among many clones transformed, for their rate ~ raised secretion of selected heterologous protein. Harvesting and purification are adapted to each protein.
The following examples are intended to illustrate the invent ~ on without however limiting the port ~ e.
The 2 following figures allow better understand genetic constructions:
Fioure 1: Diagram of the construction of the vector pTS39.
All of the constructs are derived from the plasmid pMLP10. The The following abbreviations are used to denote the ~
different DNA fragments: E: activator sequence of Ad5 ElA gene; MLP: late ad2 promoter; L:
cDNA copy of Ad2 tripartite leader sequence; CAT:
bact gene ~ nothing coding for chloramphenicol acetyl transfase; L1: pUC18 polylinker; L2 `:

WO93 / 03163 PCT / FR91 / 006 ~
~ 1 ~ 3is ~

synthetic oligonucleotide; P: coding region of the heterologous protein; pA: polyadenylation signal of SV40 virus; XGPRT: bacterial gene coding for xanthine guanine phosphoryosyl transferase; VA: genes of Ad5 encoding for VA RNAs; mito: original murine DNA fragment mitochondrial; DHFR: murine cDNA coding for dihydrofolate reductase.
Eigure 2: Diagram of the integrative type expression vector pTS39.
Mito DNA: murine DNA fragment of mitochondrial origin. A
second selection gene (DHFR) is placed in position bicistronic downstream of the coding region P.
Other abbreviations: as Figure 1.
.
Example 1: construction of the integer vector The integrative vector pTS39 represented on the Figure 2 was built in successive steps following, shown schematically in Figure l. -`
- The starting plasmid is pMLP10 (Ballay et al. Hepadna Viruses, 481, 1987, Ed. Alan R. Liss).
- The plasmid pMLPCAT is derived from pMLPlO by insertion of the Ein ~ III- ~ mHI fragment of pHp34-CAT containing the CAT gene and SV40 maturation signals (P. Gilardi et al, Nucleic Acid Research 20. 7877-7887, 1984) between sites ~ in ~ III
and ~ mHI of pMLP10.
- The plasmid pTS1 was then obtained by insertion of the polynker ~ QRI- ~ in ~ III of pUCl8 at site ~ I of pMIPCAT. ~~
- The plasmid pTS2 is derived from pTS1 by insertion of the following synthetic oligonucleotide ~ noted L2 ~ years diagrams):
-AGCTTGCGGCCGCGGTTACCAGATCTACGCGTGTT-3 ' -ACGCCGGCGCCAATGGTCTAGATGCGCACAA-5 ' containing the rare sites NotI, SaCII, a ~ EII, ~ gLII, ~
between the sites ~ in ~ H ~ aI of pTSl, and where will be inserted ~ r coding sequence of the chosen heterologous protein (noted P) -: ':

~ e plasmid pTS5 is then obtained by inserting the HindIII fragment of pAG60VA (containing the VAI and VAII genes Ad5) at the XbaI site of pTS2.
- The plasmid pTS17 derived from pTS5 by insertion of the fragment PAGT40 pvuII (containing the XGPRT gene under the control of promoter and ~ .aturation signals of the virus Tk gene H5Vl) at the site ~ may of ~
- The plasmid pTS37 is derived from pTS17 by insertion of the ECoRI-E ~ I fragment from p ~ 1 containing DNA sequence mouse mitochondrial at the SacI site of pTSl7.
- Finally, the plasmid pTS39 is obtained by inserting the fragment E ~ mH1-B ~ lII of pTG1086 (containing the coding region murine DHFR cDNA, which is a means of pressure selective alternative to XGPRT) at the BglII site of lS pTS37, to be placed in a bicistronic position relative to to the coding sequence P inserted into the oligonucleotide L2.
- The plasmid pTS39 will be noted pTS39-P when the sequence coding of a heterologous protein will be inserted into the oligonucleotide L2 (and therefore noted L2-P on the diagram).
Example 2: Using the ~ TS39 ~ plasmid ~ our ~ roduire 2.1. Isolation of the E ~ o Aene A genomic DNA bank has been screened with a 30-mer oligonucleotide: 5'-CGTGATATTCTCGGCCTCCTTGGCCTCCAA-3 ' deduced from the gene sequence (Lin et al, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA ~, 7580, 1985). This probe is complementary reverse of messenger RNA and it recognizes the sequence of Epo in position 12 ~ -159 (base No 1 representing ~
translation initiation).
The cloning vector is EMBL 3, it contains inserted fragments of human DNA from 12 to 20 kb. We spread 107 clones distributed over 10 boxes ~ 15 cm in diameter. Three se; rieQ of filters, replicas of these boxes ~ your, have been washed ~
and hybridized with the labeled oligonucleotide probes Q
using T4 polynucleotide kinase, and exhibiting W093 / 03163 PCT / FR91 / 006 ~
3 '~ G ~
specific activity of 109 cpm / ~ g, under the conditions following:
- Pre-hybridization: 3 SSC, 2 X Denhardt's, 0.005 ~ Tetra-sodium disphosphate (Nappi), 100 ~ g / ml salmon sperm, 52C for 4 h.
- Hybridization: 6 SSC, 2 X Denhardt's, 0.05% Nappi, 20 ~ g / ml tRNA, 55C overnight with the Epo probe ~ 106 cpm / ml per filter).
- Washing: 2XSSC, laboratory temperature, 2 X SSC, 0.005%
Nappi, 3 x 20 min. at 52C.
- Additional washing in 1 X SSC, 0.05% Nappi at 52C
for 20 min and / or 0.1 SSC, 0.05% Nappi at 52C for 20min.
Four successive screenings were carried out for lead to the characterization of 3 pure clones hybridizing very strongly with the probe.
The DNA of these 3 phages was amplified, then analysis. In order to control the presence of the Epo gene in its completeness, the restriction map of these 3 clones was ~
constructed and the presence of the 3 'and 5' ends of the g ~ ne Epo was searched using two probes oligonucleotides recognizing the limits of this gene.
Two of the three clones contained the Epo gene in its entirety. Restriction fragments containing the gene Epo in its entirety were ~ subcloned into a vector amplification type pUC. So the two fragments of restriction ~ mHI- ~ indIII of 5.4 kb and ~ s ~ BqlII of 4 kb have ~ t ~ under cloned.

~
The total RNA of a human renal tumor constitutively expressing the Epo have been isolated. AT
from these total RNAs the poly A + RNA fraction was isolated by passage through an oligo-dT column and cloned by the PCR method.
Two probes framing the Epo cDNA were ~
chosen:

;.

, c ~ P ~ 12 . S 10: 5'-CTGGAGTGTCCATGGGACAG-3 ' This oligonucleotide (20-mer) is in position 694 relative to ATG adenosine l (initiation of translation of messenger Epo). This oligonucleotide recognizes the sequence complementary reverse of the Epo mRNA and bounds the part 3 'of cDNA.
. INTS 9: 5'-AGGCGGGAGATGGGGTGC-3 ' This oligonucleotide ~ 20-mer) is in the same direction as mRNA and bounds the 5 'part of the Epo cDNA (position-10 compared to adenosine l of the initiation codon). The probe INTS lO allows to copy the Epo mRNA matrix into using reverse transcriptase. MRNA is then of ~ graded with soda for the hour at 65C. This simple cDNA
strand maybe then amplified by the PCR technique in using the two probes limiting the cDNA: INTS 10 and INTS
9. A 723 bp DNA fragment was thus amplified and then isolated by electrophoresis, cloned into a vector amplification type pUC then sequenced ~.

2 ~ Introduction of the co oding sequences of Epo in the Yector DTS: ~ 9 The coding sequence of Epo (genomics or cDNA) is introduced into the oligonucleotide (L2) of the plasmid pTS39 under ~ fragment elm ~ EII ~ II between sites ~ i and ~ 5lII.
The resulting constructions will be called pTS39-Epo.

2 4. Transfection _ of cells and se1 ~ s ~ _ transforman ~
The transfection is carried out with a ATEIM electropulser (Bioblock, France). Two solutions Acqueuses are prepared in advance:
. The melting medium: Inositol 250 mM, RH2PO4 1 n ~, Mg 0.5 mM acetate, Ca 0.1 mM acetate; pH 7.4.
. The post-fusion medium: NaCl 132 mM, XCI 8 mM, XH2P04 lmN, ~ - Mg 0.1 mM acetate, Ca acetate 0.1 mM; pH 7.4.

::.

13 ~ 3 ~
After 2 days of culture, the cells are washed and adjusted to 4.107 / ml in the fusion medium. Suspension is incubated 10 min at 0C in the presence of the DNA to be transfected ~ 5 ~ g / 106 cells). A sample of the suspension is placed between the electrodes of the device and electroporation is carried out under the conditions following: 4 rectangular pulses per second duration interval l00 ~ s, with an electric field of l.500 V / cm2. Immediately after the electric shock the suspension is diluted to 1/20 then incubated 20 min at 37C. The cell viability is between 20 and 60%. The cells are then cultured at a concentration 0.5 lO6 cells / ml.
48 hours after transfection an aliquot of supernatant is removed for the determination of Epo. Cells are then cultivated in a selective medium (Iscove, lO% SVF -fetal calf serum - dialys ~, myco acid ~ henolis ~ 1 ~ g / ml, ~ an ~ hin ~ 250 ~ g / ml corresponding to the selection g ~ ne XGPRT). -After 14 to 21 days of selection on the pool, cloning by limiting dilution is carried out in microplates 96 wells in the presence of feeder cells total human tlymphocytes, irradiated at 4000 rds, from healthy donors).

= ~ _.
* ATCC CCL156 cells transformed by the vector of expression pTS39-Epo.
About 6.106 CCL156 cells are transfected by ~ lectroporation with 30 ~ g of plasmid DNA then submitted 48 h after transfection, in a selective medium containing xanthine and mycoph ~ nolic acid. The resistant population is cloned by limiting dilution in presence of feeder cells ~ human lymphocytes irradiated ~ s). Among the different clones obtained, clone 156 0.5AF8 secretes approximately 100 to 150 units of Epo per ml of culture medium / 72 h and was followed ~ long ~ term in WO93 / 03163 ~ PCT / FR91 / 006 ~ 14 presence and absence of selection pressure. The results indicate that this clone is stable over 48 passages i.e. approximately 7 months of culture in the absence of pressure from selection.
5 Southern blot analysis of the total DNA extracted of clone 156 0.5AF8 indicates that the vector pTS39-Epo is integrated in tandem in the cell genome at a rate of 15 ~
20 copies per cell, whether the clone is cultured in the presence or in the absence of selection pressure.
10In roller culture, clone 0.5AF8 secret 80 at 100 U Epo / ml in three days of culture in a medium low in CK4 or CK4N proteins ~ base medium: Iscove-Ham mixture F12 (1: 1); CK4: supplements: human albumin 50 mg / l, human transferrin (saturated ~ 30% by ad ~ anointing of 15FeC13) ~ 1 mgil, bovine insulin 3 mg / l, linoleic acid 1 mg / l, putrescine 10 ~ M, ethanolamine 20 ~ M; CK4N, same as above ribonucleotides: Adenosine 100 mg / l, Cytidine 100 mg / l, Guanosine 100 mg /}, Uridine 100 mg / l). This secretion rate can be renewed 3 times if the medium is changed every 20 :: 3 days.

~ - ~ * Cells immortalized in vitro by EBV ~ INTS-F5 line).
~: The experiment carried out on CCL156 cells has ~; was reproduced on F5 cells, already used in ~: 25 laboratory for the production of monoclonal antibodies (Goosens et al. J. Immunol. Methods 1987, lQ1, 193) and which are transfected with the vector pTS39-Epo. The dosages of Epo performed at different times after transfection are positive: 29 U Epo / ml / 106 cells are detected after 21 s selection days.

'~ i2Q ~
* Culture of erythroblasts of ~ fetal goose.
35The activity of Epo is mQur ~ e in ~ ltro according to ~
1 ~ t ncorporat $ on of 59Fe p ~ rl`es ~ liver rhythmroblasts ~ :; foet ~ l of sour1s ~ taken on the 13th day of gestation) WO93 / 03163 2 11 ~ 1 PCT / FR91 / 006 grown in 26 hours using a method derived from that described by Stephenson et al, (Endocrinology 88, 1519, 1971).
The cells are mechanically dissociated and S suspended in RPMI 1640 medium (Tambourin et al, Biomedicine 1 ~, 112, 1983; Goldwasser et al, Endocrinology 9 ?, 315, 1975) at a concentration of 1.6 x 10 6 cells / ml containing 7% fetal calf serum, 85 ~ M albumin and 0.4 ~ M human transferrin.
Depending on the case, a serum-free medium is used in which natural pho.cpholipids ~ so ~ a, ovolecithin) purified or synthetic (32 x 10-3M) and cholesterol ~ 1.6 x 10-3M) are dissolved in chloroform, secondarily ~ vaporized under a stream of nitrogen. Lipids in solution albumin ~ 1 mg / ml in RPMI are dispersed by ultrasound in melting ice (Boffa et al, Exp. Hématol.
10, 675, 1982).
The cell suspension is distributed in volume of 200 ~ l in round bottom wells of culture plates "Nunclon" M. After an incubation of 21 hours at 37C in presence of 0.7% CO2, 59Fe-transferrin is incorporated ~ e in the wells, the plates are agitated and put back in incubator for a prolonged incubation of 5 hours ~
Each sample is analyzed ~ 3 or 4 protein concentrations. The activity of each dose results of a quadruple determination. The incorporation rate of 59Fe on heme extracted with m ~ thethylethyl ketone or in cells is measured based on the logarithm of the dose of the sample and the results are expressed in milliunit / ml or per mg of protein.
The heel is recombinant human Epo grading 100,000 U / mg. Its specific activity has been defined - according to the samples of human Epo from the second Preparation of International Reference ~ Annable et al, Bull. Wld. Hlth. Org. ~ l, 99, 1972).
* Culture of erythroid progenitors from bone marrow or peripheral blood.

. ~.

~ The effects of Epo HR on the maturation of BFUe and CFUe were determined in culture of precursors erythroid cells on methylcellulose in IMDM medium serum-free (Cormier et al, Cell Differentiation, 11, 261, 1985). Epo HR, like human urinary Epo, determines the differentiation and maturation of BFUe from mouse bone marrow or peripheral blood human. The dose effect of Epo HR on the development of CFUe is compared with that given by natural Epo.
* Detection by radioimmunological tests.
The radioimmunoassay for Epo HR was ~
produced in cellular supernatants according to two procedures:
. p ~ r precipitation by double antibody in soluble phase:
a human urinary Epo rabbit immune serum monospecific (Terry Fox Lab, Vancouver) is incubated with a Epo H standard or a sample to be assayed for 16 h at 4C.
After this time, 2000 cpm 125I-Epo HR (Amersham) is added and the preparations are incubated for 2 h at 4C. The dilution of the immune system chosen is that which gives radioactivity ~
set from 20 to 30%. The final dilution of the immune serum is is between 10-4 and 10-5. After a 2 h incubation at 20C
with rabbit anti-Fc immunoglobulins, the radioactivity of the pellet is measured.
. by precipitation by double antibody in solid phase on TachisorbM:
the reagents are distributed in one time on plates of microti ~ ration DynatechM 96 wells under a final volume ~ e 220 ~ 1. After a 2 hour incubation with shaking horizontal rotating at room temperature, harvesting is performed on a glass fiber filter on a device SkatronM.
The distribution successively concerns the Epo of the range or sample under a volume of 100 ~ 1, the ~ mmun serum antl Epo 10 ~ 1, 125-I-Epo HR 10 ~ 1 and the Tachisorb R 100 ~ 1. After transfer to a polystyrene tube samples on glass fibers, radioactivity is WO93 / 03163 PC ~ / FR91 / 006 7 2 ~? ~; 7 measured.
The measurement range of the method is included between 1 and lOOmU.
Supernatants of transformed cells have activities that can reach 800 U / ml while cell supernatants with antisense vector are devoid of activity. There is always an excellent correlation between ~ in vitro biological osages and radioimmunoassay.
2.7. Detection of iQn and measurement of in vivo biological activity Epo HR:
Epo's in ViYo activity produced in culture supernatants of lymphoblastoid cells lS transformed is tested after injection in returned mice polyg ~ obulic by transfusion in order to inhibit synthesis ~ -of endogenous Epo (Jacobson. et al Proc. Soc. Exp. Biol. Med, 94, 243, 1957). The results indicate that the Epo produced by lymphoblastoid cells presents a powerful biological activity comparable to that of the Epo HR produced by CHO cells (Kirin-Amgen patent EP 0 148 605).
The results show a close correlation with in vitro biological assays according to the second international reference preparation for urinary epo . 25 human.

E ~ em ~ le 3 _ PrQ ~ de p ~ p ~ ratiQ ~ de ~ con ~ entr ~ s 3.a) First method Cell culture supernatant in medium poor in protein ~ CK4) is concentrated ~ by ultrafiltration on PM10 Amicon membrane or by tangential filtration on MinitanM ~ qu ~ p ~ of a PLGC membrane followed by washing in 12.5 mM glucose solution, 12.5 mM galactose, PEG 6000 0.1 mg / ml ~ -mercaptoethanol 10-4 M, ~ until a resistivity of W093 / 0 ~ 163 ~ s 18 PCT / FR91tO06 filtrate greater than 5000 Ohms.
The lyophilized concentrate is chromatographed on UltrogelM AcA44 in 10 mM calcium acetate buffer, NaCl 100 mM, phenol 5.6 10-4 M, glucose 12.5 mM, galactose 12.5 mM, PEG 6000 0.1 mg / ml pH 6.8. The active fractions are concentrated by ultrafiltration and lyophilized. The product is then treated by HPLC on a TSK 545 DEAE column in 0.048 mM acetate buffer, 3 mM CaC12, 12.5 mM glucose, galactose 12.5 mM, PEG-6000 0.1 mg / ml, ~ -mercaptoethanol 10-4 M then elution by a discontinuous molarity gradient NaCl. The activity yield is close to 75-%. After dialysis and concentration, the product is chromatographed on : CM Affigel blueM in lOmM phosphate buffer, NaCl lSO mM pH
7.2. The Epo is eluted with a molarity of 1.15 M NaCl.
The specific activity of Epo HR is more than 100,000 U / mg.

; 3.b): c_ i: Q ~
: The concentrate of culture media obtained on - 20 ultrafiltration membranes are treated on DEAE SéphacelM ~
4C in 48 mM acetate buffer, 3 mM CaC12, phenol 5.4 10-4 M, pH 4.5. The selected activity is eluted in 0.6 M NaCl.
After concentration and dialysis, the eluate is subjected to filtration on UltrogelM AcA44, then the fraction active detected by RIA is chromatographed in HPLC-DEAE in presence of reducing agents and stabilizing hexoses. Epo HR
~ read in pH 5.5 buffer, low molarity of NaCl, is concentrated on AmiconM PM10 membrane then loaded onto a WGA-Sepharose column 6MB in PBS buffer at 4C. His elution is obtained by N-acetylglucosamine 0.5 M.
In polyacrylamide gradient gel electrophoresis (4 30%) in the presence of SDS, a 34 kDa component is observed ~
in preparations from WGA-S ~ pharose. This component e.st identifies in "immunoblot" by immunoglobulinQ-anti-Epo ~ R polyclonal and anti-monoclonal antibodies Epo HR. A migrant minority component in an area of 42 kDa is observed in certain preparations. This component :

WO93 / 03163 2 ^ ~ PCT / FR91 / 00636 is not recognized in immunoblots by immune sera polyclonauY. anti-Epo HR. This result is confirmed by the radioimmunological detection and by culture analysis of mouse fetal erythroblasts from eluates preparative electrophoresis in SDS polyacrylamide gel.
Depending on the case, an additional purification step is performed solt on CM Affigel blueM, either on HA-UltrogelM or in H LC filtration in SDS medium 0.1%. Molecular weight apparent of the Epo HR in polyacrylamide / SDS gel is 34 kDa.
The specific activity obtained is greater than 120,000 U / mg in culture of ~ ry ~ hroblasts and in RIA with yields between 20 and 30%.

3.c) Third method: Immunopurificatio ~ de ~ EPQ-E ~
* cl. Preparation of the immunoadsorbent Preparation of cell supernatants of purified Epo HR was carried out according to the method described in the second example above. The specific activity of this preparation determined by radioimmunoassay and by its activity in erythroblast culture was 130,000 IU
Freeze-dried Epo HR then taken up in solution in presence of SDS ~ 0.05% was used to immunize mice Balb / c.
Each mouse received 15 days apart three intraperitoneal injections at the following doses: 90, 45 and 10 or 35 ~ g for the last injection. All mergers were made 5 days after the last injection.
According to experiments 30 to 9 ~ ~ wells fusion were ~ tested ~ s. Antibodies are searched for in the supernatants of the melting wells according to their ability to attach the 125I-Epo HR. Identification of labeled complexes is obtained by a goat anti-mouse IgG antibody fixed by covalent bond to protein A of staphylococci.
The complexes are collected and counted.
During the 10th fusion, 3 hybrids W093 / 03l ~ 3 4 ~ CT / F ~ 91/006 found positive and were cloned. Mouse serum which provided the splenocytes exhibited reactivity 65% immunological with a 1/3000 dilution. A
reference anti-Epo monoclonal antibody: EplO-141A26 from IgG class has been obtained. Its fixation rate is understood between 50 and 60%. The antibody-producing clone has found to be stable after multiple cloning and subcloning.
An expansion in culture and ascites has allowed to obtain sufficient volumes for purification several tens of milligrams of antibodies. The antibody purification is carried out on protein G-Sepharosis. The purified antibody is obtained by adsorption of ascites in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.5, washing at pH 6.5 and elution in 0.1 M glycine-HCl buffer, pH 2.8. Lots of 30 mg of purified EplO-141A26 antibody are obtained and fixed on Sepharose 4B activity (8ml of gel) by bromide cyanogen. As an example, such a column can fix approximately 5 to 6 mg of Epo HR. Preliminary tests have shown that Epo was adsorbed by immobilized antibody ~
a pH close to neutrality. His elution was analyzed at different pH: 6.5, 4.5, 2.8 and 2.2; it takes place mainly from pH 4.5 to 2.8.
The preservation of the immunoadsor ~ ant is carried out in phosphate buffer pH 7.5, Thymiro ~ alM 0.02% at 4C; the column can be used for many cycles.

* c-2. Purification of Epo The purification is carried out in two stages:
- First stage :
The supernatant of lymphoblastoid cells is brought by ultrafiltration at a protein concentration of 3 to 4 mg / ml, then dialyzed in mineralized water and balanced with acetic acid at pH 4.5 and ~ 1,000 Ohms by addition of water.
After elimination of a precipitate by centrifugation the product is treated on a DEA column ~
S ~ phacelM, balanced in 0.04 M acetate buffer, CaCl ~ 0.0025 WO93 / 03163 21 2 1 i 3 1 ~ PCT / FR91 / 006 M and phenol 5.4 10-4 M, with a ratio equal to 0.1 (volume exchanger in ml / proteins incorporated in mg).
Elution of the active fraction obtained by addition of 0.6 M NaCl in the starting buffer represents 15 to 20% of the incorporated proteins. Eluted products are balanced pH 7 then dialyzed to a resistivity of 80 to 100 Ohms.
- Second step :
It is performed on the immunoadsorbent prepared according to the method described above. Proteins eluted from DEAE
SephacelM are incorporated on the immunoadsorbent in buffer 0.1 M phosphate pH 7.5 at 4C with a flow rate of 6 to 7 ml / hour. Washing is carried out ~ pH 6.5 in the same buffer. The elution of the Epo was obtained by a buffer 0.1 M glycine HCl pH 2.2 with a flow rate of 50 ml ~ hour ~ the ambient temperature. The eluate is balanced by buffer tris l M, pH 7.5. The activity yield is between 50 and 60% of the active starting Epo.
* c-3. Characteristics of the immunopurified Epo HR ~ from lymphoblastoid cell products.
The degree of homogeneity of Epo HR preparations is appreciated by densitom ~ sorting after gel electrophoresis polyacrylamide SDS. The Epo is more than 98% homogeneous.
The apparent molecular weight measured by electrophor ~ se en SDS polyacrylamide gel is 34,000 daltons. His electrophoretic behavior is identical to that of the Epo produced by CHO cells as well as that of the radioiodinated molecule (marketed by Amersham). His point isoelectric is between 3.5 and 4. Its activity specific is superior to the pre ~ arations of urinary Epo and is, depending on the batch, around 200,000 IU / mg.

Example 4: Use ~ L ~ d ~ Yl plasmid iA ~ 9.L

A probe consisting of the oligonucleotide lnverse ~ 30-mer) of an IL-3 sequence:
S'TAA GTG TGT TAT AAT TTC ATC GAT CAT GTT 3 ' WO93 / 03163 ~ PCT / FR91 / 006 ~
3 ~ 22 ~
was used to screen a genomic DNA library of human leukocytes and a fetal liver cDNA bank human. The synthesized probe corresponds to the base 110 (and sui ~ antes) downstream of the sequence initiating ATG
coding IL-3 cDNA.
Several clones were isolated and the presence of gene was confirmed by restriction mapping. The phages containing these genes are subcloned into pUC 18 under 5.4 Kb Acc I fragment form. Before introducing this fragment in the expression plasmid of the vector plasmid, promoter and 3 'untranslated sequences are eliminated. For this ~ a, the region containing the sequence coding is amplified by the PCR method ~ using the 2 following synthetic oligonucleotides:
INTS l6: 5 'GATCCAAACATGAGCCGCCT 3' start: position -9 of the ATG (initiating Met) INTS 17: 5 'ATGTCCCGAGGCGCTGTGGT 3' d ~ but: position 52 downstream of the stop codon using as matrix the genomic clones in pUCl8, previously characterized.
The 2.140 bp amplification product is under-cloned into the Sma I site of a pUCl8 and partially sequenced to ~ verify the integrity of the IL-3 gene ~ according to Yang and Clark, in "Developmental Control of globin gene expression "AR Liss p.3-ll 1987).
The coding sequence thus checked was ~
introduced into the expression plasmid of the vector plasmid described in example l. A transformed cell clone giving a very positive response has been selected and multiplied ~
Biologically active interleukin-3 is secreted into the cell culture medium.

35 produce human GM-CSF in cells `
~ `, ::.
; A probe made up of the oligonucleotide ~. `` ``, `` `:

; ~

W093 / 03163 23 2 ~ fi-. PCT / FR91 / 006 inverse complement (30 mer) of a GM-CSF sequence:
5 'TTG CTC TAA GCA CTT GAG CAG GAA GCT CTG 3' was used to screen a genomic DNA library of human leukocytes and a fetal liver cDNA bank human. The synthesized probe corresponds to base 157 (and following) downstream of the sequence initiating ATG
coding of GM-CSF.
Several clones were isolated and the presence of gene was confirmed by restriction mapping. The phages containing these genes are subcloned into pUC18 under 3.2 Kb Hind III / Eco RI fragment form. Before to introduce this fragment into the expression cassette of the vector plasmid, promoter and 3 'untranslated sequences are eliminated. For this, the region containing the coding sequence is amplified by the PCR method using of the following 2 synthetic oligonucleotides:
INTS 19: 5'CACAGAGAGAAAGGCTAAAG 3 ' start: position-31 of the ATG (initiating Met) INTS 18: 5 'ATTCCCATTCTTCTGCCATG 3' start: position 177 downstream of the stop codon using the genomic clones in pUC18 as a matrix, features ~ s previously.
The 2,240 bp amplification product is under-cloned into the Sma I site of a pUC18 and partially sequenced to verify the integrity of the GM-CSF gene ~ according to Miyatake et al. EMBO J.4, ~ 561, 1985).
The coding sequence thus controlled was introduced into the expression plasmid of the vector plasmid described in Example 1. A cell clone transformed ~
giving a very positive answer was selected and multiply ~.
Biologically active GM-CSF is found in the - cell culture medium.

Claims

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1.- Use of cell lines human lymphoblastoids, immortalized in vitro by the Epstein-Barr virus (EEV) and selected for their absence of tumoral or tumorigenic character, for the industrial scale protein production heterologous encoded by a segment of DNA inserted into a genetically engineered vector plasmid, integrative type and carrying an expression cassette comprising all the elements allowing the expression of said proteins heterologous in said lymphoblastoid cells after integration of said expression cassette into DNA
cell chromosome.

2.- Plasmid vector intended for the use of lymphoblastoid cells for protein production heterologs according to claim 1, comprising the elements of bacterial DNA necessary for its amplification in a bacterial host of the E.coli type, characterized in that that it simultaneously includes:
a) the DNA elements constituting an expression cassette of heterologous DNA, said cassette being designed with a view to its use in human lymphoblastoid cells, b) the DNA sequence of Adenovirus 5 encoding the RNAs VAI and VAII, to optimize RNA translation messengers, c) a selection gene manipulated to be effective in eukaryotic cells, d) DNA elements selected to promote integration of plasmid DNA into chromosomal DNA
cellular.

3.- Plasmid vector according to claim 2 characterized in that the DNA elements constituting a expression cassette included in said vector plasmid include:

a) a transcription activator sequence derived from a Adenovirus, b) a promoter and a "leader" sequence derived from a Adenovirus, c) a synthetic oligonucleotide containing sites of retraction intended for the insertion of the DNA sequence coding for a chosen heterologous protein, d) a polyadenylation signal derived from the SV 40 virus.

4.- Plasmid vector according to claim 2 or 3 characterized in that, in the expression cassette:
- element a) is the activating sequence of the EIA gene of human Adenovirus 5;
- element b) is the late major promoter of human Adenovirus 2 associated with the "leader" sequence tripartite of the same Adenovirus 2;
- element c) has been designed to provide sites of rare restriction to promote insertion manipulation of the heterologous DNA sequence.

5.- Plasmid vector according to any one of claims 2 to 4 characterized in that the oligonucleotide included in the expression cassette offers the sites of restriction Not I, Bst EII, Bgl II, MLu I.

6.- Plasmid vector according to any one of claims 2 to 5 characterized in that the gene of selection is chosen from - DNA encoding xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (XGPRT) from E-coli placed under the control of the promoter and maturation signals of the Tk gene of the HSV1 virus.
- mouse dihydrofolate reductase (DHFR) cDNA
- or the combination of both, inserted at separate points of the vector plasmid.

7 .- Plasmid vector according to any one of claims 2 to 6 characterized in that the elements of DNA included in said plasmid to promote integration include a fragment of mitochondrial DNA from mouse.

8.- Plasmid vector according to any one of claim 2 to 7 characterized in that the heterologous DNA
included in the expression cassette consists of the coding sequence of a protein selected from proteins of therapeutic interest difficult to purify from a natural source.

9.- Plasmid vector according to any one of claim 2 to 8 characterized in that the heterologous DNA
included in the expression cassette consists of the erythropoietin or protein coding sequence having the activity of erythropoietin.

10.- Plasmid vector according to any one of claim 2 to 8 characterized in that the heterologous DNA
included in the expression cassette consists of the coding sequence for interleukin 3 or a protein having interleukin 3 activity.

11.- Plasmid vector according to any one of claim 2 to 8 characterized in that the heterologous DNA
included in the expression cassette consists of the GM-CSF coding sequence.
12.- Lymphoblastoid cell lines human immortalized with EBV for use according to the claim 1, characterized in that they are stably transformed by the DNA elements of a vector plasmid according to any one of claims 2 at 12.
13.- Cell lines according to claim 12, characterized in that they are cloned and selected by screening for their high rate of secretion of the chosen heterologous protein.
14.- Cell lines according to claim 12 or 13, characterized in that the starting line receptor of the vector plasmid is the line deposited at ATCC under reference CCL 156 RPMI 1788.
15 .- Cell lines according to claim

12 or 13, characterized in that the starting line receptor of the vector plasmid is a line derived from B lymphocytes from a healthy donor, by immortalization by the EBV.