WO93/12128 WO93/12128
2 1 13 ~ PCT/FR92/01182 DERIVES DE LA 9-(8-D-XYLOF~RANNOSYL) ADENINE
ET DE LA 1-(B-D-XYLOFURANNOSYL)CYTOSINE, LEUR PREPARATION ET LEUR APPLICATION EN THERAPEUTIQUE.
La présente invention a pour objet des dérivés de la 9-(B-~-xylofurannosyl)adénine et de la 1-(~-D-xylofurannosyl)cytosi-ne, leur préparation et leur application en thérapeutique.
Les composés de l'invention répondent à la formule générale (I) B
R3 0 ~/
OR
dans laquelle R1 représente un atome d'hydrogene, un groupe (C2 4)alcanoy-le, un groupe aroyle ou un groupe nitro, R2 représente un atome d'hydrogène, un groupe (C2 ~)alcanoy-le, un groupe aroyle ou un groupe nitro, R3 représente un atome d'hydrogène, un groupe (C2 ~)alcanoy-le, un groupe aroyle ou un groupe nitro, B représente un radical de formule H R' <N~N~J ou o~3 dan~ lequel R' représente un atome d'hydrogène ou un groupe (C2 ~)alcanoyle.
~09 composé~ dan~ lesquels - R1 ~ acétyle, R2 ' R3 ~ acétyle et B ~ adénine, - Rl ~ H, R2 ' R3 ~ benzoyle et B ~ adénine, - Rl J H, R2 ~ R3 ~ acétyle et B ~ adénine, - Rl ~ acétyle, R2 ' R3 ~ benzoyle et B ~ adénine ou cyto~lne~
- Rl ~ R2 ~ R3 ~ H et B - adénine ou cytosine no ~ont toutefois pas partle de l'invention.
~ S~-~ 2 Les composés préférés de l'invention sont ceux pour lesquels le groupe (C2_ 4 ) alcanoyle est le groupe acétyle et le groupe aroyle est le groupe benzoyle.
Les composés des exemples sont préparés selon les schémas donnés en annexe.
Les composés pou~ lesquels Rl, R2 et R3 représentent un groupe NO2 sont préparés à partir des composés correspondants dans lesquels Rl, R2 et R3 représentent un atome d'hydrogène par réaction avec de l'acide nitrique en présence d'anhydride acétique et d'urée.
W093/12128 ~ PCT/FR92/01182 Les exemples suivants illustrent en détail la préparation de quelques composés selon l'invention. Les numéros indiqués entre parenthèses dans les titres des exemples correspondent à ceux du tableau donné plus loin.
Les microanalyses élémentaires et les spectres U.V., RMN et de masse confirment les structures des produits obtenus.
Exemple 1 (composé n 1).
9-(2,5-di-acétyl-~-D-xylofurannosyl)adénine.
a) 9-(5-0-tert-butyldiméthylsilyl-B-D-xylofurannosyl)adénine.
A une suspension de 3,2 g (11,97 mmoles) de 9-(B-D-xylofuran-nosyl)adénine dans 24 ml de pyridine anhydre, on ajoute 2,3 g (15,26 mmoles) de chlorure de tert-butyldiméthylsilyle. Le mélange réactionnel est a~ité à l'abri de l'humidité durant 14 heures, puis dilué avec 200 ml de chloroforme. La solution résultante est lavée successivement avec une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbonate de sodium et avec de l'eau (deux fois 100 ml pour chaque lavage).
La phase organique est ensuite séchée sur sulfate de sodium, filtrée et évaporée à sec et coévaporée avec du toluène. Le résidu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice. On obtient 3 g de 9-(5-0-tert-butyldiméthylsilyl-B-D-xylofurannosyl)adénine pur. F = 201-202C (cristallisé dans le méthanol).
b) 9-(2,3-di-0-acétyl-5-0-tert-butyldiméthylsilyl-B-D-xylofu-rannosyl)adénine.
A une solutlon de 2,9 g (7,6 mmoles) de 9-(5-0-tert-butyl-dlméthylsilyl-B-D-xylofurannosyl-)adénine dans 38 ml de pyrldine anhydre, on a~oute, à 0C, 1,58 ml (16,76 mmoles) d'anhydrlde acétlque.
Le mélange réactlonnel est agité à température ambiante durant 40 heures, puls dllué avec 200 ml de chloroforme. La solutlon résultante est lavée successlvement avec une solu-tlon aqueu8e 8aturée d'hydrogénocarbonate de sodium et de l'eau (deux fols 100 ml pour chaque lavage).
La phase organlque est ensulte séchée sur sulfate de sodium, f~ltréo et évaporée à sec et coévaporée avec du toluène. Le ~ a.3~ 4 résidu est purifié sur colonne de gel de silice. On obtient 1,8 g de composé pur. F = 133-134C (cristallisé dans un mélange chloroforme - éther isopropylique).
c) 9-(2,5-di-0-acétyl-B-~-xylofurannosyl)adénine.
A une solution de 1,7 ~ (3,65 mmoles) de 9-(2,3-di-0-acétyl-5-0-tert-butyldiméthylsilyl-B-D-xylofurannosyl)adénine dans 44 ml de tétrahydrofuranne, on ajoute 0,31 ml (5,4 mmoles) d'acide acétique et 11,2 ml d'une solution lN de fluorure de tétrabutylammonium dans le tétrahydrofuranne. Après 3 heures d'agitation à température am~iante, le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite, puis coévaporé avec du toluène. Le résidu est purifié sur colonne de gel de silice.
On obtient 1,1 g de composé pur. F = 117-119C (cristallisé
dans l'acétate d'éthyle).
ExemDle 2 (composé n 6).
9-(3-0-nitro-B-D-xylofurannosyl)adénine.
A 6 ml (143 mmoles) d'acide nitrique fumant refroidi à -30C, on ajoute, par portion et sous forte agitation 218 mg (3,63 mmoles) d'urée. On laisse la température progressivement remonter jusqu'à 10C afin d'éliminer l'acide nitreux, puis on refroidit à nouveau à -30C. On ajoute alors goutte à
goutte O,SS ml (5,82 mmoles) d'anhydride acétique puis, par portions, O,5 g (1,42 mmole) de 9-(2,5-di-0-acétyl-B-D-xylo-furannosyl)adénine. On laisse la température proqressivement remonter jusqu'à 20C et l'agitation est poursuivie pendant 40 minutes. Le mélange réactionnel est refroidi à -20C, puis versé goutte à goutte et sous agitation sur 200 ml d'une solution aqueuse saturée de sulfate d'ammonium, mélangée à de la glace (pH ~ 6,7). On vérifie que le pH est supérieur ou égal à 1 et on a~oute rapldement une 901ution aqueuse saturée d'hydrogénocarbonate de sodium, jusqu'à ce que le pH soit égal à 6,5.
~a phase agueu8e o~t extraite avec du chloroforme et les phases organique9, rassemblée~, sont lavées trois fois avec de l'eau, pu~8 séChéeg gur sUlfate de sOdium et évaporées à
~ec. Le résidu egt disgout 80ug agitation dans 45 ml de WO93/12128 ~¦ J;~ PCT/FR92/01182 méthanol ammoniacal (préalablement saturé à -10C et herméti-quement fermé), et l'agitation est poursuivie pendant 6 heuresj à t~mpérature ambiante.
Le mélange réactionnel est évaporé à sec et coévaporé trois fois avec de l'éthanol absolu. On obtient directement 0,27 g de 9-(3-0-nitro-B-D-xylofurannosyl)adénine pur par cristal-lisation dans l'éthanol. F = 220-223C.
Exemple 3 (composé n 18).
N4-acétyl-1-(2,3,5-tri-O-acétyl-B-D-xylofurannosyl)cytosine.
A une suspension de 0,5 g (2,06 mmoles) de 1-(B-D-xylofuran-nosyl)cytosine dans 6,5 ml de pyridine anhydre, on ajoute goutte à goutte, à 0C et sous agitation, 1,2 ml (12,7 mmoles) d'anhydride acétique. Le mélange réactionnel est agité durant 1 heure à 0C, puis durant 48 heures à tempéra-ture ambiante. 100 ml d'eau et 100 mi de chloroforme sont ensuite ajoutés. La phase organique est séparée, séchée sur sulfate de sodium, évaporée à sec et coévaporée avec du dioxanne. Le résidu est dissout dans du dioxanne et lyophili-sé pour donner 0,64 g de N4-acétyl-1-(2,3,5-tri-O-acétyl-B-D-xylofurannosyl)cytosine pur. F = 94-97C.
ExemPle 4 (composés n 10 et n 11).
1-(3,5-di-O-acétyl-B-D-xylofurannosyl)cytosine et 1-~5-O-acétyl-B-D-xylofurannosyl)cytosine.
A une solution de 1,3 g (3,16 mmoles) de N4-acétyl-1-(2,3,5-tri-O-acétyl-B-D-xylofurannosyl)cytosine (composé n 18) dans 100 ml de pyridine, on ajoute 0,65 ml (13,1 mmoles) d'hydrate d'hydrazlne. Le mélange réactionnel est agité durant 1 heure à température amblante et 0,65 ml (13,1 mmoles) d'hydrate d'hydrazine e~t à nouveau ajouté. On poursuit l'agitation durant 5 heureq et ajoute 20 ml d'acétone. Après 2 heures d'agitatlon, le mélange est évaporé à sec, et coévaporé trois foi~ avec du toluène. Le ré5idu est purifié par chromatogra-phie qur colonne do gel de silice et donne, par ordre d'élu-tion, 0,50 g de composé n 10 et 0,30 g de composé n 11 , , ' ', - ~ , W093/12128 ~ 3;-.("~ PCT/FR92/01182 n 10 : F = 144-146C (cristallisé dans l'acétate d'éthyle) n 11 : F = 103-106C (lyophilisé dans l'eau).
Le tableau ci-après illustre les structures et propriétés physiques de quelques composés de l'invention.
WO93/12128 ~ PCT/FR92/01182 ;: 7 Tableau ~1 :omposé ,~ R3 F(C) 1 A Ac H Ac 117-119 2 A H H Ac 234-236 2 1 13 ~ PCT/FR92/01182 9-(8-D-XYLOF~RANNOSYL) ADENINE DERIVATIVES
AND 1-(BD-XYLOFURANNOSYL)CYTOSINE, THEIR PREPARATION AND APPLICATION IN THERAPEUTIC.
The present invention relates to derivatives of 9- (B-~-xylofurannosyl)adenine and 1-(~-D-xylofurannosyl)cytosi-ne, their preparation and their application in therapy.
The compounds of the invention correspond to the general formula (I) B
R3 0 ~/
GOLD
in which R1 represents a hydrogen atom, a (C2 4)alkanoy-le, an aroyl group or a nitro group, R2 represents a hydrogen atom, a (C2 ~)alkanoy- group le, an aroyl group or a nitro group, R3 represents a hydrogen atom, a (C2 ~)alkanoy- group le, an aroyl group or a nitro group, B represents a radical of formula H R' <N~N~J or o~3 dan~ in which R' represents a hydrogen atom or a group (C2 ~) alkanoyl.
~09 compound~ dan~ which ones - R1 ~ acetyl, R2 'R3 ~ acetyl and B ~ adenine, - Rl ~ H, R2 'R3 ~ benzoyl and B ~ adenine, - Rl JH, R2 ~ R3 ~ acetyl and B ~ adenine, - Rl ~ acetyl, R2 'R3 ~ benzoyl and B ~ adenine or cyto~lne~
- Rl ~ R2 ~ R3 ~ H and B - adenine or cytosine no ~ however have no share of the invention.
~ S~-~ 2 The preferred compounds of the invention are those for which the (C2_ 4 ) alkanoyl group is the acetyl group and the group aroyl is the benzoyl group.
The compounds of the examples are prepared according to the schemes given in the appendix.
The compounds louse ~ which Rl, R2 and R3 represent a group NO2 are prepared from the corresponding compounds in which R1, R2 and R3 represent a hydrogen atom by reaction with nitric acid in the presence of anhydride acetic acid and urea.
W093/12128 ~ PCT/FR92/01182 The following examples illustrate in detail the preparation of some compounds according to the invention. The numbers given in parentheses in the titles of the examples correspond to those in the table given below.
Elemental microanalyses and UV, NMR and mass confirm the structures of the products obtained.
Example 1 (compound 1).
9-(2,5-di-acetyl-~-D-xylofurannosyl)adenine.
a) 9-(5-O-tert-butyldimethylsilyl-BD-xylofurannosyl)adenine.
To a suspension of 3.2 g (11.97 mmol) of 9-(BD-xylofuran-nosyl) adenine in 24 ml of anhydrous pyridine, 2.3 g (15.26 mmol) of tert-butyldimethylsilyl chloride. the reaction mixture is a ~ ity away from moisture during 14 hours, then diluted with 200 ml of chloroform. The solution resultant is washed successively with an aqueous solution saturated with sodium hydrogencarbonate and with water (two times 100 ml for each wash).
The organic phase is then dried over sodium sulphate, filtered and evaporated to dryness and coevaporated with toluene. the residue is purified by chromatography on a gel column of silica. 3 g of 9-(5-0-tert-butyldimethylsilyl-BD-pure xylofurannosyl)adenine. F = 201-202C (crystallized in methanol).
b) 9-(2,3-di-0-acetyl-5-0-tert-butyldimethylsilyl-BD-xylofu-rannosyl)adenine.
Has a solution of 2.9 g (7.6 mmol) of 9-(5-0-tert-butyl-dlmethylsilyl-BD-xylofurannosyl-)adenine in 38 ml of anhydrous pyrldine, we have ~ out, at 0C, 1.58 ml (16.76 mmol) of acetic anhydride.
The reaction mixture is stirred at room temperature for 40 hours, pulse dllué with 200 ml of chloroform. The resulting solutlon is washed successively with a solution tlon aqueous 8e saturated with sodium hydrogencarbonate and water (twice 100 ml for each wash).
The organic phase is then dried over sodium sulphate, f ~ ltréo and evaporated to dryness and coevaporated with toluene. the ~ a.3~ 4 residue is purified on a column of silica gel. We obtain 1.8 g of pure compound. F = 133-134C (crystallized in a chloroform-isopropyl ether mixture).
c) 9-(2,5-di-O-acetyl-B-~-xylofurannosyl)adenine.
To a solution of 1.7 ~ (3.65 mmol) of 9-(2,3-di-0-acetyl-5-0-tert-butyldimethylsilyl-BD-xylofurannosyl)adenine in 44 ml of tetrahydrofuran, add 0.31 ml (5.4 mmol) of acetic acid and 11.2 ml of an lN solution of fluoride of tetrabutylammonium in tetrahydrofuran. After 3 hours stirring at am ~ iante temperature, the reaction mixture is evaporated under reduced pressure, then coevaporated with toluene. The residue is purified on a column of silica gel.
1.1 g of pure compound are obtained. F = 117-119C (crystallized in ethyl acetate).
Example 2 (compound 6).
9-(3-0-nitro-BD-xylofurannosyl)adenine.
6 ml (143 mmoles) of fuming nitric acid cooled to -30C, 218 mg (3.63 mmoles) of urea. We let the temperature gradually go up to 10C in order to eliminate the nitrous acid, then it is cooled again to -30C. We then add drop to drop O,SS ml (5.82 mmol) of acetic anhydride then, by servings, 0.5 g (1.42 mmol) of 9-(2,5-di-O-acetyl-BD-xylo-furannosyl)adenine. We leave the temperature gradually rise to 20C and stirring is continued for 40 minutes. The reaction mixture is cooled to -20C, then poured drop by drop and with stirring onto 200 ml of a saturated aqueous solution of ammonium sulphate, mixed with ice (pH ~ 6.7). Check that the pH is above or equal to 1 and we have ~ oute rapldement a saturated aqueous 901ution of sodium hydrogencarbonate, until the pH is equal to 6.5.
~ a phase agueu8e o ~ t extracted with chloroform and the organic phases9, collected ~, are washed three times with water, pu~8 dried gur sodium sulphate and evaporated to ~ec. The residue egt disgout 80ug stirring in 45ml of WO93 / 12128 ~¦ J; ~ PCT / FR92 / 01182 ammoniacal methanol (previously saturated at -10C and sealed closed), and stirring is continued for 6 hours at room temperature.
The reaction mixture is evaporated to dryness and coevaporated three times with absolute ethanol. We directly obtain 0.27 g of pure 9-(3-0-nitro-BD-xylofurannosyl)adenine per crystal-lysis in ethanol. F=220-223C.
Example 3 (compound 18).
N4-acetyl-1-(2,3,5-tri-O-acetyl-BD-xylofurannosyl)cytosine.
To a suspension of 0.5 g (2.06 mmol) of 1-(BD-xylofuran-nosyl)cytosine in 6.5 ml of anhydrous pyridine, add dropwise, at 0C and with stirring, 1.2 ml (12.7 mmoles) of acetic anhydride. The reaction mixture is stirred for 1 hour at 0C, then for 48 hours at room temperature.
ambient ture. 100 ml of water and 100 ml of chloroform are then added. The organic phase is separated, dried over sodium sulfate, evaporated to dryness and coevaporated with dioxane. The residue is dissolved in dioxane and freeze-dried.
dried to give 0.64 g of N4-acetyl-1-(2,3,5-tri-O-acetyl-BD-pure xylofurannosyl)cytosine. F=94-97C.
Example 4 (compounds no. 10 and no. 11).
1-(3,5-di-O-acetyl-BD-xylofurannosyl)cytosine and 1-~5-O-acetyl-BD-xylofurannosyl)cytosine.
To a solution of 1.3 g (3.16 mmol) of N4-acetyl-1-(2,3,5-tri-O-acetyl-BD-xylofurannosyl)cytosine (compound 18) in 100 ml of pyridine, 0.65 ml (13.1 mmol) of hydrate is added of hydrazine. The reaction mixture is stirred for 1 hour at room temperature and 0.65 ml (13.1 mmol) of hydrate e ~ t hydrazine again added. We continue the commotion for 5 hoursq and add 20 ml of acetone. After 2 hours stirring, the mixture is evaporated to dryness, and coevaporated three faith ~ with toluene. The residue is purified by chromatography.
phie qur column of silica gel and gives, in order of elu-tion, 0.50 g of compound No. 10 and 0.30 g of compound No. 11 , , '', - ~ , W093/12128 ~ 3;-.("~ PCT/FR92/01182 n 10: F = 144-146C (crystallized from ethyl acetate) n 11: F=103-106C (freeze-dried in water).
The table below illustrates the structures and properties physics of some compounds of the invention.
WO93/12128 ~ PCT/FR92/01182 ;: 7 Board ~1 : compound ,~ R3 F(C) 1 A Ac H Ac 117-119 2 AHH Ac 234-236
3 A No2 NO 2 NO2 137-140 3 A No2 NO 2 NO2 137-140
4 A H NO2 NO2 83-185 (décomp.) 8 C H Bz Bz 1 8 4 - 1 8 5 9 C H H Bz 120-124 C H Ac Ac 144-146 11 C H H Ac 103-106 13 C' No2 H NO2 89-94 C ~ H 149-151 FEU1L~ E ~E P~MPLAC~r31ENT
WO93~12128 PCT/FR92/01182 Tableau (suite) Composé B ~ R~ R~ R~
16 C NO2 H H 1;2-155 1~ c~ c H H H 137-138 18 C~~ A c Ac Ac Ac 94-97 19 c~ c H Ac Ac 96-101 .
~ Ac H Ac 204-206 A . adénine C = cytosine Ac , acétyle , CH3CO
Bz . benzoyle . C6H5CO
FEUILLE D~: REI~PLP.CEM.-~NT
WO93/12128 ~ ~ 3 "~ PCT/FR92/01182 Le~ composés de l'inventlon ont été soumiq à une série d'es-sais pharmacologiques qui ont mis en évidence leur intéret comme substances à activités thérapeutiques.
1) Etude de l'activité anti VIH 1.
La multiplication du VIH 1 (souche HTLV III B) dans les cel-lules MT4 (cellules T4 transformées par HTLV-l) est suivie par l'effet cytopathoqène induit par le virus. Les cellules sont infectées avec une dose de VIH 1 produisant après 4 jours une diminution de 90 % du nombre de cellules vivantes.
Les composés testés sont ajoutés, après l'adsorption du virus, dans le milieu de culture à différentes concentra-tions.
La via~i~ité des cellules est mesurée par une réaction colo-rimétrique basée sur leur capacité a réduire le 3-(4,5 dimé-thylthiazol-2-yl)-2,5 diphényl-tétrazolium bromide en for-mazan, propriété due aux deshydrogénases mitochondriales. La quantité de formazan produite (D.O. à 540 nm) est proportion-nelle au nombre de cellules vivantes.
Le pourcentage de protection des cellules infectées par le traitement avec le~ composés est calculé en appliquant la formule propo~ée par Pauwel~ et col.
D.O. 540 de~ cellules infectées traitées - D.O. 540 de~
cellules infectéc~
D.O. 540 des cellule~ non infectée~ - D.O. 540 de-~ cellules infectée~
Par cette m;thode, on met en évidenco que les concentrations llmlto~ donnant un ef~et antl VIH 1 vont de 10-3M à 10-5M.
2) Etude doJ actlvltéJ antl HSV1, antl HSV2 et antlvacclne.
Sur do~ colluleJ do ~lngo llgnéo Vero, on teste l'activité
antlvlralo do~ composoJ do 1 ' inventlon, en me~urant l'lnhl-bltlon de l'o~ot cytopathogèno lndult par 100 T~CD 50 (quantlto do ~lruJ capablo do nécro~or 50 % des cellules).
LeJ vlrus ut~ oJ ~ont l'herpo~ ~mplex type 1 (HSV1), F~1LLE I~E REMPLAt:EM2 NT
't~
093t1~128 ~ ~ 3C! ~ j~ PCT/FR92/01182 .
souche F, l'herpès simplex type 2 (HSV2), souche G, et le virus de la vaccine, souche Copenhague.
Les essais sont effectués en microplaques de 96 godets sur des cellules agées de 48 heures.
Pour tous les virus, on ajoute successivement :
- 100 TCID 50~ de virus dans un volume de 0.1 ml - et 0,1 ml de chaque substance à une concentration de 2 10 3M, de 2 10 4M, de 2 10 5M et de 2 10 6M. La concentra-tion finale des substances est donc de 10-3M, de 10-~M, de lO~sm et de 10-6M. Les dilutions de virus et des substances sont effectuées dans du milieu Dulbecco contenant 2 % de sérum de veau foetal (SVF).
Chaque concentration de substance est testée en quadruple.
Les microplaques sont centrifugées à 3000 g pendant 45 minu-tes à température ambiante.
Après avoir éliminé le virus, on rajoute 0,2 ml de milieu de culture (MBE ~ 10 % de SVF) contenant les substances à tester à des concentrations de 10-3M, de 10-4M, de 10-5M et de 1 o - 6M
Les microplaques sont incubées à 37C dans une atmosphère contenant 5 % de C02.
L'effet antiviral des substances est mesuré en comparant l'effet cytopathogène observé dans les cupules contenant les produits à celui observé dans les cupules témoin virus.
L'effet antlviral est obtenu pour des concentrations allant de 10 ~M à 10 sM. Dans un deuxième temp5, les produits ayant montré une activité antivirale sont repris selon le même protocole, mais en utilisant des dllutions finales de 10~~ , 5.10-5, 2,5.10-5, 1.105, 5.10-6, 2,5.10-6 et 10-6.
Les résultats des essais pharmacologlques montrent que les compoJos de l ' lnvention sont actlfs v~g-à-vls des vlrus HIV1, HSVl, HSV2 ot vaccine. Ils ont également été testés à titre d'exemple sur le~ vlrus suivantJ : cytomégalovlrus humaln ~CMV) souche ~D 169, vlrus Slndbls, vlrus coxsackle B3 ~CoxB3), pollovlru9 type I (Polio I), 50uche Mahoney, vlrus reJpiratolre syncytlal ~RSV), souche A2, paramyxovlrus type TII ~ Para III ) .
FEU!LL~ Dr R~MPLACE~q~
W093/12128 PCTtFR92tO1182 Les composés de l'invention peuvent donc etre utilisés pour leur activité antiproliférative et herpétique et dans le traitement topique d'infections cutanées à HSV1 et HSV2.
FEUI~LE DE Rl.'.qPLA"E;~i_S~T
P ~ /FR92/01182 W O 93/12128 ~ `Cl ~ , AN N E X E 1 ~y \p ~DMSCl TBDMS0 o ~ A R - C /
tlO~y~ 0 OH
OH.
TBDMSO o /` R -CO ~/
~/ ( bu ) ~ N , F OC -R
O
HNO~/AC20~NH2-ll-NH2 A
0, A N~/C~H~O~ ~CJ-l R C' ~ .
OC~R
o A Adén~n~
R ~ C1-C~ alkyle ou arylo TBDMS ~ tortlobutyl~éthyl~lyle F~A-I!LL~ ~ P~.~L~",~P.~i-5;1T
WO 93/12128 ~ ~ . ] PCI /FR92/01 182 R- ~/
~ N~ COR
HO ~ ~ R-C ~ R ~o ~ ICRC
OH O
NH2-N~2~H20 R-CO ~ O f puis séparation par chromatographie OH
R CO - ~ C
C = cytos ine R = C 1 -C 4 alkyle FEUlLLE DF REMPLACEME:N~ 4AH NO2 NO2 83-185 (decomp.) 8 CH Bz Bz 1 8 4 - 1 8 5 9 CHH Bz 120-124 CH Ac Ac 144-146 11 CHH Ac 103-106 13 C' No2 H NO2 89-94 C~H 149-151 FEU1L~ E ~EP~MPLAC~r31ENT
WO93~12128 PCT/FR92/01182 Table (continued) Compound B ~ R~ R~ R~
16 C NO2 HH 1;2-155 1~ c~ c HHH 137-138 18 C~~ A c Ac Ac Ac 94-97 19 c~ c H Ac Ac 96-101 .
~ Ac H Ac 204-206 HAS . adenine C = cytosine Ac, acetyl, CH3CO
Bz. benzoyl. C6H5CO
SHEET D~: REI~PLP.CEM.-~NT
WO93/12128~~3"~PCT/FR92/01182 The compounds of the invention have been subjected to a series of tests.
pharmacological knowledge that has demonstrated their interest as substances with therapeutic activities.
1) Study of the anti HIV 1 activity.
The multiplication of HIV 1 (strain HTLV III B) in cells lules MT4 (T4 cells transformed by HTLV-1) is followed by the cytopathic effect induced by the virus. Cells are infected with a dose of HIV 1 producing after 4 days a 90% decrease in the number of living cells.
The compounds tested are added, after the adsorption of the virus, in the culture medium at different concentrations tions.
The via ~ i ~ ity of the cells is measured by a color reaction rimetric based on their ability to reduce the 3-(4.5 dime-thylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl-tetrazolium bromide in form-mazan, property due to mitochondrial dehydrogenases. The amount of formazan produced (OD at 540 nm) is proportion-nal to the number of living cells.
The percentage of protection of cells infected by the treatment with the ~ compounds is calculated by applying the formula propo ~ ed by Pauwel ~ and col.
OD 540 of ~ treated infected cells - OD 540 of ~
infected cells OD 540 of uninfected~ cells - OD 540 of-~ cells infected~
By this method, it is evident that the concentrations llmlto ~ giving an ef ~ and antl HIV 1 range from 10-3M to 10-5M.
2) Study of actlvltéJ antl HSV1, antl HSV2 and antlvaccine.
On do~ colluleJ do ~ lngo llgnéo Vero, we test the activity antlvlralo do ~ composoJ do 1 inventlon, by me ~ urant the lnhl-bltlon of the o ~ ot cytopathogeno lndult by 100 T ~ CD 50 (quantlto do ~ lruJ capablo do necro ~ gold 50% of the cells).
LeJ vlrus ut~ oJ ~have herpo~ ~mplex type 1 (HSV1), F~1LLE I~E REPLACE:EM2 NT
't~
093t1~128~~3C! ~ j ~ PCT / FR92 / 01182 .
strain F, herpes simplex type 2 (HSV2), strain G, and the vaccinia virus, Copenhagen strain.
The tests are carried out in microplates of 96 wells on 48 hour old cells.
For all viruses, add successively:
- 100 TCID 50~ of virus in a volume of 0.1 ml - and 0.1 ml of each substance at a concentration of 2 10 3M, 2 10 4M, 2 10 5M and 2 10 6M. The concentration final tion of the substances is therefore 10-3M, 10-~M, lO~sm and 10-6M. Dilutions of viruses and substances are carried out in Dulbecco medium containing 2% of fetal calf serum (FCS).
Each substance concentration is tested in quadruplicate.
The microplates are centrifuged at 3000 g for 45 min.
your at room temperature.
After eliminating the virus, add 0.2 ml of culture medium.
culture (MBE ~ 10% FCS) containing the substances to be tested at concentrations of 10-3M, 10-4M, 10-5M and 1 o - 6M
The microplates are incubated at 37C in an atmosphere containing 5% C02.
The antiviral effect of substances is measured by comparing the cytopathic effect observed in the wells containing the products to that observed in the virus control wells.
The antiviral effect is obtained for concentrations ranging from 10 ~M to 10 sM. Secondly5, products with shown antiviral activity are taken up according to the same protocol, but using final dilutions of 10~~ , 5.10-5, 2.5.10-5, 1.105, 5.10-6, 2.5.10-6 and 10-6.
The results of pharmacological tests show that the components of the lnvention are actlfs v ~ g-to-vls HIV1 vlrus, HSV1, HSV2 and vaccinia. They have also been tested as example on the following vlrusJ: cytomegalovlrus humaln ~CMV) strain ~D 169, vlrus Slndbls, vlrus coxsackle B3 ~CoxB3), pollovlru9 type I (Polio I), 50uche Mahoney, vlrus reJpiratolre syncytlal ~RSV), strain A2, paramyxovlrus type TII~Para III).
FEU!LL~ Dr R~MPLACE~q~
W093/12128 PCTtFR92tO1182 The compounds of the invention can therefore be used for their antiproliferative and herpetic activity and in the topical treatment of HSV1 and HSV2 skin infections.
FEUI~LE DE Rl.'.qPLA"E;~i_S~T
P ~ /FR92/01182 WO 93/12128 ~ `Cl ~, APPENDIX 1 ~y \p ~DMSCl TBDMS0 o ~ AR - C /
tlO~y~ 0 OH
OH.
TBDMSO o /` R -CO ~/
~/ ( bu ) ~ N , F OC -R
O
HNO~/AC20~NH2-ll-NH2 HAS
0. AN~/C~H~O~ ~CJ-l RC' ~ .
OC~R
oh In Aden~n~
R~C1-C~ alkyl or arylo TBDMS~tortlobutyl~ethyl~lyl F~AI!LL~ ~ P~.~L~",~P.~i-5;1T
WO 93/12128 ~ ~. ] PCI /FR92/01 182 R-~/
~N~COR
HO~~RC~R~o~ICRC
OH O
NH2-N~2~H20 R-CO ~ O f then separation by chromatography OH
R CO - ~ C
C = cytosine R=C1-C4 alkyl DF SHEET REPLACED:N~