CA2066598A1

CA2066598A1 - Process for the purification of a protein in inclusion bodies

Info

Publication number: CA2066598A1
Application number: CA002066598A
Authority: CA
Inventors: Francois B. Paul; Daniel H. Auriol; Pierre F. Monsan
Original assignee: Individual
Current assignee: Bioeurope
Priority date: 1990-08-01
Filing date: 1991-07-30
Publication date: 1992-02-02
Also published as: EP0495059A1; FR2665447B1; KR920702414A; JPH05502795A; FR2665447A1; WO1992002540A1

Abstract

2066598 9202540 PCTABS00110 La présente invention a pour objet un procédé de purification d'une protéine secrétée sous forme de corps d'inclusion insolubles par une bactérie, caractérisé en ce que: (a) on récolte les corps d'inclusion sous forme de pellets par broyage des cellules microbiennes et centrifugation, (b) on met les pellets en suspension avec une solution de substance hydrosoluble pouvant être gélifiée, (c) on injecte goutte-à-goutte le mélange des pellets et de la solution de substance hydrosoluble, dans une solution de gélification, réalisant ainsi l'encapsulation des pellets dans la substance gélifiée, (d) on met les pellets encapsulés en présence d'une solution de dissolution contenant au moins un agent chaotropique et éventuellement un agent réducteur, (e) on obtient la protéine dénaturée et purifiée en solution. 2066598 9202540 PCTABS00110 The subject of the present invention is a purification process of a protein secreted in the form of insoluble inclusion bodies by a bacterium, characterized in that: (a) the bodies are harvested inclusion in the form of pellets by grinding the cells microbials and centrifugation, (b) the pellets are suspended with a solution of water-soluble substance which can be gelled, (c) the mixture of pellets and solution of water-soluble substance, in a solution of gelation, thereby encapsulating the pellets in the substance gelled, (d) the encapsulated pellets are placed in the presence of a dissolution solution containing at least one chaotropic agent and optionally a reducing agent, (e) the protein is obtained denatured and purified in solution.

Description

WO 92/02540 6 6 ~ 9 gCI/FR91/00629 PROCEDE DE PURIFICATION D'UNE PROTEINE PRESENTE DANS
COR S D INCL S N
La présente invention se rapporte à un procédé de purification d'une protéine produite par une bactérie, sous forme de corps d'inclusion insolubles.
Elle se rapporte en particulier à la purification d'une protéine 5 produite chez Escherichia coli, notamment d'une protéine produite par génie génétique.
La technologie des ADN recombinants permet d'obtenir chez E. Coli l'expression de nombreuses protéines hétérologues. Ces protéines sont produites en grande quantité, mais sous forme insoluble. En effet, elles 10 sont précipitées sous forme d'agrégats appelés corps d'inclusion.
On a ainsi pu produire par exemple l'hormone de croissance humaine, I'hormone de croissance bovine, des interférons, I'interleukine 2, des activateurs du plasminogène.
En particulier, le gène codant pour la pro-urokinase (pro-UK) a pu être cloné et exprimé chez E. coli, (EP 365 894) La pro-urokinase représente la forme native monocaténaire de I'urokinase. L'urokinase est une enzyme du groupe des sérine-protéases connue pour ses propriétés thrombolytiques et fibrinolytiques.
-~ L'urokinase a donc trouvé une application importante en WO 92/02540 6 6 ~ 9 gCI / FR91 / 00629 PROCESS FOR THE PURIFICATION OF A PROTEIN PRESENT IN
COR SD INCL SN
The present invention relates to a purification process of a protein produced by a bacteria, in the form of inclusion bodies insoluble.
It relates in particular to the purification of a protein 5 produced in Escherichia coli, in particular of a protein produced by genetic engineering.
Recombinant DNA technology provides E. Coli the expression of many heterologous proteins. These proteins are produced in large quantities, but in insoluble form. Indeed, they 10 are precipitated in the form of aggregates called inclusion bodies.
We were thus able to produce, for example, growth hormone human, bovine growth hormone, interferons, interleukin 2, plasminogen activators.
In particular, the gene encoding pro-urokinase (pro-UK) could be cloned and expressed in E. coli, (EP 365 894) Pro-urokinase represents the native single-stranded form of Urokinase. Urokinase is an enzyme from the serine protease group known for its thrombolytic and fibrinolytic properties.
- ~ Urokinase has therefore found an important application in

2~ clinique, pour la dissolution des thrombus.
Cependant l'urokinase, si son action est systémique, peut entrainer un risque hémorragique aux doses couramment employées en thérapeutique.
On sait que le système enzymatique de fibrinolyse est placé
25 sous la dépendance du plasminogène, qui peut être activé en plasmine, la plasmine catalysant la dégradation de la fibrine. On distingue les inhibiteurs de la plasmine, comme l'alpha 2 antl-pla5mine et les activateurs du plasminogène. La régulation e~t effectuée grâce à des interactions moléculaires entre le plasminogène, les activateurs du plasminogène et la 30 fibrine. Parmi les activateurs du plasminogène, I'urokinase double chaîne :. ' ' ' .. . .

WO 92/02540 PCI/FR9l/00629 ~o~,~5~ 2 présente une forte affinité pour le plasminogène qu'elle peut activer même en l'absence de fibrine. Ceci la différencie de la pro-urokinase, qui présente é~alement une forte affinité, mais ne semble acliver le plasminogène qu'en présence de fibrine, d'où une relative spécificité pour les caillots de fibrine. Cette absence d'activité systémique rend l'utilisation de la pro-urokinase particulièrement intéressante en thérapeutique.
La pro-urokinase a tout d'abord été isolée dans l'urine humaine et à partir de différentes cultures cellulaires, mais le gène responsable de son expression a pu être isolé et cloné, pour l'obtention de la protéine recombinante.
La production de protéines recom binantes par des bactéries, en particulier par E. coli, se heurte à un problème de purification.
En effet, la protéine est secretée au sein de corps d'inclusion, insolubles. Classiquement, on va d'abord concentrer les cellules microbien-nes a partir du milieu de culture, par centrifugation ou ultrafiltration. La membrane des cellules est rompue par broyage mécanique ou sonication ou traitement enzymatique et les corps d'inclusion sont récoltés par centrifugation. Lors de cette centrifugation, le surnageant contient les constituants solubles de la bactérie. Mais la fraction particulaire ainsi recueillie, ou pellets, contient outre les corps d'inclusion renfermant les protéines recombinantes, des cellules non broyées, des débris cellulaires et des contaminants protéiques, solubles ou non.
Les pellets bruts sont ensuite lavés. Ce lavage est réalisé par une solution tampon aqueuse, afin d'éliminer les contaminants solubles.
~5 Toutefois, ceci implique des étapes de mélange et de centrifugation supplémentaires, et ne peut être effectué aisément à grande échelle.
Les protéines in501ubles presente5 dans les pellets sont ensuite mises en solution par dénaturation, en faisant varier la composition du milieu. Ainsi, dans US 4 694 073, la somatotropine recombinante est solubilisée par addition d'urée et/ou de diméthylsulfone. US 518 526 propose comme solution de dénaturation une solution contenant par WO 92/02540 PCr/FR91/00629 2 ~ clinical, for the dissolution of thrombi.
However, urokinase, if its action is systemic, may lead to a haemorrhagic risk at the doses commonly used in therapeutic.
We know that the fibrinolysis enzyme system is placed 25 dependent on plasminogen, which can be activated in plasmin, the plasmin catalyzes the breakdown of fibrin. We distinguish plasmin inhibitors, such as alpha 2 antl-pla5mine and activators plasminogen. The regulation was carried out thanks to interactions between plasminogen, plasminogen activators and the 30 fibrin. Among the plasminogen activators, the double chain urokinase :. '''' ... .

WO 92/02540 PCI / FR9l / 00629 ~ o ~, ~ 5 ~ 2 has a strong affinity for plasminogen which it can activate even in the absence of fibrin. This differentiates it from pro-urokinase, which also has a strong affinity, but does not seem to affect the plasminogen only in the presence of fibrin, hence a relative specificity for fibrin clots. This absence of systemic activity makes the use pro-urokinase particularly interesting in therapy.
Pro-urokinase was first isolated in the urine human and from different cell cultures but the gene responsible for its expression could be isolated and cloned, for obtaining recombinant protein.
The production of recombinant proteins by bacteria, in particular by E. coli, faces a purification problem.
Indeed, the protein is secreted within inclusion bodies, insoluble. Conventionally, we will first concentrate the microbial cells-born from the culture medium, by centrifugation or ultrafiltration. The cell membrane is ruptured by mechanical grinding or sonication or enzyme treatment and the inclusion bodies are harvested by centrifugation. During this centrifugation, the supernatant contains the soluble constituents of the bacteria. But the particulate fraction as well collected, or pellets, contains in addition to the inclusion bodies containing the recombinant proteins, unground cells, cell debris and protein contaminants, soluble or not.
The raw pellets are then washed. This washing is carried out by an aqueous buffer solution, to remove soluble contaminants.
~ 5 However, this involves mixing and centrifugation steps additional, and cannot be easily done on a large scale.
The soluble proteins present in the pellets are then dissolved by denaturation, by varying the composition of the middle. Thus, in US 4,694,073, the recombinant somatotropin is solubilized by addition of urea and / or dimethylsulfone. US 518,526 proposes as a denaturing solution a solution containing by WO 92/02540 PCr / FR91 / 00629

3 2066~98 exemple du chlorhydrate de guanidine, de l'urée, du SDS ou du Triton. Les composés insolubles doivent ensuite être éliminés par centrifu~ation, ce qui donne des résultats imparfaits.
La protéine est ensuite renaturée par suppression des agents 5 dénaturants dans son environnement; ceci est réalisé en diluant la solution de dissolution.
On peut ensuite procéder à des étapes de purification ultérieures par chromatographie d'échange d'ions ou filtration sur gel.
C'est pourquoi la présente invention concerne un procédé de 1~ purification d'une protéine secrétée sous forme de corps d'inclusion msolubles par une bactérie, caractérisé en ce que:
a) on récolte les corps d'inclusion sous forme de pellets par broyage des - cellules microbiennes et centrifugation, b) on met les pellets en suspension avec une solution de substance 15 hydrosoluble pouvant être gélifiée, c) on injecte goutte à goutte le mélange des pellets et de la solution de substance hydrosoluble, dans une solution de gélification, par e~emple une solution contenant des cations multivalents, réalisant ainsi l'encapsulation des pellets dans la substance gélifiée, 2~ d) on met les pellets encapsulés en présence d'une solution de dissolution contenant au moins un agent chaotropique et éventuellement un agent réducteur, e) on obtient la protéine dénaturée et purifiée en solution.
Certaines protéines, en particulier les protéines hétérologues 25 dont le gène est introduit dans le génôme de la bactérie sont maturées par celle-ci sous forme de corps d'inclusion. Ces corps d~nclusion, qui présentent un indice de réfraction les différenciant, forment des agrégats insolubles dans le cytoplasme.
Afin de récupérer la protéine sous forme purifiée, il faudra 3û tout d'abord isoler les corps d'inclusion. Pour cela on réalise un broyage mecanique des cellules microbiennes, préalablement concentrées par centrifugation, microfiltration ou ultrafiltration.

WO 92/02540 PCI~/FRgl/00629 ~,~5~9 ~près le broyage, une centrifugation de 4 000 à 5 000 g permet de séparer les pellets qui sont remis en suspension dans une soluti~n tampon; en particulier, on peut utiliser du tampon Tris- HCI 10 mM, pH 8,5. De préférence, I'ensemble de ces étapes est conduit à une tempéralure proche de 4C, afin d'inhiber les protéases pouvant être présentes dans la préparation.
La suspension des pellets dans une solution d'une substance hydrosoluble pouvant être ~élifiée peut être réalisée par mélange d'une solution de cette substance avec la suspension de pellets. Elle peut 1~ également être réalisée en ajoutant cette substance sous forme de poudre à
Ia suspension de pellets.
Par substances hydrosolubles pouvant être gélifiées, on entend des substances qui, sous l'effet d'une solution de gélification par exemple d'une solution présentant un certain pH ou par exposition à des cations multivalents, vont donner une masse conservant sa forme, essentiellement sous forme de gouttelettes solides.
Parmi ces substances, on peut citer les gommes de poly-saccharide naturelles comme la pectine et les alginates de métal alcalin.
Les substances préférées sont les alginates, en particulier l'alginate de 2~ sodium.
Ces alginates de métaux alcalins sont gélifiés en présence de cations multivalents, en particulier par injection goutte à goutte dans une solution contenant un cation multivalent, notamment dans une solution de chlorure de calcium.
L'ion de métal alcalin est remplacé par échange par un ion multivalent et la substance, en se géllfiant, va encapsuler les pellets. Cette capsule est formée d'un gel réticulé, qui emprisonne les composés insolubles. Mais cette capsule reste perméable aux substances en solution.
C'est pourquoi l'étape suivante va consister à dénaturer les protéines présentes sous forme insoluble. Pour cela, les pellets encapsulés sont mis en présence d'une solution de dissolution. Cette solution contient WO 92/02540 PCI~FR91/00629 au moins un agent chaotropique, dont le rôle esr de provoquer la dissociation des protéines en altérant leur confi~uration spatiale ou leur conformat~on; la solution peut contenir également au moins un agent réducteur, qui va rompre les ponts disulfures des protéines.
Parmi les agents chaotropiques, on peut citer l'urée et le chlorhydrate de guanidine. L'un des agents préférés est le chlorhydrate de guanidine 6M.
- Parmi les agents réducteurs, on peut citer le 2-mercapto-- éthanol et le dithiothreitol. Un agent préféré est le 2-mercapto-éthanol 50 mM. Par action de ce~tte solution de dissolution, les protéines dénaturées sont solubilisées et libérées des particules encapsulées. Les protéines passent à l'extérieur de la capsule, alors que les contaminants insolubles restent emprisonnés. La capsule doit résister au milieu dénaturant.
Dans les étapes suivantes, la protéine va être renaturée. Pour cela, après élimination des particules insolubles, on va diluer progres-sivement la solution par addition de tampon. La concentration en agents dénaturants décroit donc et la protéine se renature avec un excellent rendement. Le rendement de récupération de la protéine est proche de 2~ 1 00 S.
On procède ensuite à la purification finale de la protéine, par chromatographie d'échange d'ions et chromatographie hydrophobe.
Cette technique est reproductible et facilement extrapolable à grande échelle. Elle rend inutile l'étape de centrifugation de la solution de dissolution, I'élimination des composés insolubles étant réalisée par encapsulation.
L'encapsulation des pellets permet d'effectuer plus facilement leur lavage. La présente invention concerne donc un procédé de purification tel qu'il a é~é défini, caractérisé en ce qu'on lave par une solution tampon les pellets encapsulés, avant de réaliser l'étape de dissolution. De manière préférée, on utilise une solution tampon Tris- HCI 10 mM, pH 8,5 con~enant 0,1 % de Triton X- 100 dans laquelle on laisse incuber les pellets encapsulés, sous agitation douce, à basse température (4 - 6C).

, .' , .

WO 92/02540 PCI/FRg1/00629 "~93 6 Cette étape permet l'élimination des composés solubles, et les pellets encapsulés sont remis en suspension dans du tampon avant d'être mis en présence de la solution de dissolution.
Les pellets bruts obtenus après broyage et centrifugation des 5 cellules microbiennes peuvent être lavés avant d'~tre encapsulés.
L'invention se rapporte également à un procédé de purification d'une protéine secrétée sous forme de corps d'inclusion, caractérisé en ce ~u'on lave et on homogénéise les pellets avant de réaliser la susp~nsion. En particulier, les pellets peuvent être lavés par du tampon Tris- HCI 10 mM, pH 8.5 contenant 0,1 % de Triton X-100. Les pellets lavés sont concentrés par microfiltration et remis en suspension dans du tampon Tris- HCI 10 mM, pH ~.5.
La présente invention se rapporte à un procédé de purification d'une protéine, caractérisé en ce que la protéine est secrétée par une 15 souche d'Escherichia coli. En effet, on a pu sélectionner des souches de cette bactérie particulièrement aptes à produire des protéines. Ces protéines peuvent se trouver secrétées sous forme de corps d'inclusion.
E. coli est un hôte de choix pour le clonage de gènes. C'est pourquoi la présente invention se rapporte à un procédé de purification d'une protéine 20 caracterisé en ce que la protéine est une protéine recombinante, produite par E. col i.
On peut introduire chez E. coli le ~ène de nombreuses protéines, dans un vecteur d'expression fonctionnel dans la bactérie.
Notamment, la présente invention concerne un procédé de 25 purification d'une protéine, caractérisé en ce que la protéine secrétée par E. coli est la pro-urokinase recomblnante ~pro-UK).

WO 92/02540 PCltFR91/00629 7 2066~98 Le tableau suivant montre un mode de mise en oeuvre du procédé optimisé de purification et de renaturation de la pro-urokinase.
.
_ Etape volume protéinetemps litres grammesheures .
Fermentation 300 12 Centrifugation (pâte cellulaire) 75 4 3 passages en homogénéiseur (broyage300 5 mécanique des cellules). .
Centrifugation (pellets) 30 1000 4 Concentration par ; microfiltration 5 500 2 Encapsulation de pellets dans des particules d'alginate de calcium, 7 350 10 etapes de lavage et de filtration . Dissolution des pellets .
dans un mélange de guanidine-HCI 6M et 50 300 15 de 2^mercaptoéthanol 50mM, tampon Tris-HCI
I OmM, pH 8,5 (4C) I ere procédure de dilùtion de la solution 300 300 de dissolution dans de l'urée 6,5 M
tampon Tris-HCI I OmM
pH S.O, EDTA 5mM .
30 ( I 5C) 2ème procédure de dilution avec du tampon Tris-HCI
lOmM, pH 8,0, EDTA 1250 300 14 5mM ( I 5C) . 6 7 ' .

:

. .
.~ .
:

.

6~-~gQ~ 8 L'eff icacité de la renaturation de la pro-urokinase est déterminée en traitant la pro-lJK par la plasmine de façon à obtenir l'urokinase, pUi5 en mesurant l'activité de l'urokinase sur le substrat L-pyroglutamyl-glycyl-L-arginine-p-nitroanilide, la plasmine étant alors inhibée par l'aprotinine. Les protéines sonl dosées par le réactif de Bradford.

EXEI~,1PLE l:
EI~ICAPSULATION DE PELLETS DANS DES PARTICULES D'ALGINATE DE
CALCIUM

La préparation de pellets utilisée a été lavée 2 fois avec du tampon Tris-HCI lO mM, pH 8,5 contenant du Triton X-lO0 à 0~1'O.
15 ml de pellet sont mélangés avec 2,5 ml de tampon Tris-HCI pH 8,5, lO mM et 17,5 g d'alginate de sodium à 40 g/l dans l'eau.
Ce mélange est ensuite injecté goutte à goutte dans 200 ml d'une solution de chlorure de calcium l O0 mM à 4C. La gélification conduit à des particules de I mm de diamètre environ.
La quantité de particules correspondant à 5 ml de pellet est incubée pendant 18 heures à 4~C sous agitation douce intermittente, dans 125 ml de solution standard de dissolution. Cette solution contient du chlorhydrate de guanidine 6 M et du 2-mercapto-éthanol 50 mM.
Après renaturation, on mesure l'activité de la pro-urokinase 2 5 obtenue.
Des pellets de contrôle sont soumis à une procédure standard de dissolution e~ de renaturation, sans encapsulation.
Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 1.

3~

WO 92~02S40 PCI/FR9ltO0629 20~i6 ~98 o ~' . CJ o 'o _~ ~ _' ~' . ' : ', ': ' :-' ' -` .
. .: .

?,~6~9~ 1 o EXEMPLE 2:
E;~'C~PS~'L~TION DE PELLETS DANS UN GEL D'~LGII~ATE DE CALCIU~l!
L~VAGE DES PELLETS ENCAPSULES. DISSOLUTION ET RENATURATION
SUCCESSIVES DE LA PRO-UROKINASE
-Les matériaux insolubles (cellules, débris cellulaires, corps d'inclusion...) peuvent facilement être encapsulés dans un gel d'alginate de calcium. Cette méthode a été utilisée afin d'évaluer la possibilité de remplacer certaines étapes de cen~rifugation par de simples lavages des 15 pellets encapsulés. Il faut noter qu'une procédure spéciale de lavage peut facllement être introduite (en utilisant du chlorhydrate de guanidine, en particul ier).

- Préparation de pellets lavés sans opération d'encapsulation:
1 0 g de pellets (teneur en protéine: 60 %) ont d'abord éte centrifugés à 4C (10 min, 10 000 rpm). Le culot obtenu a été lavé 2 fois avec du tampon Tris-HCI 10 mM, pH 8,5 contenant du Triton X-100 à 0,1 cO.
Le culot ensuite obtenu a finalement été mis en suspension dans le même tampon ne contenant pas le Triton X-100 (masse finale de la suspension:
2~ 1 ~ g).

- Encapsulation des pcllets et lavage des pellets encapsulés:
10 g de pellets (non lavés; teneur en protéine: 60 9~) ont été
mélangés avec 3,3 g d'une solution d'alginate de sodium à 4 ~6. L'opération 2 5 d'encapsulation a été réalisée comme précédemment décrit.
Les pellees encapsulés ont été ensuite lavés une fois avec du tampon Tris-HCI 10 mM, pH 8,5, contenant du Triton X-100 à 0,1 'o.
La suspension de pellets encapsulés lavés a été mélangée avec 30 la solution contenant la guanidine et l'agent réducteur dans la proportion de I g de préparation initiale pour 5,75 ml de solution.

WO 92/02540 PCI/FR91/~0629 Il 20~6~98 Ainsi, pour Ig de préparation de pellets initiale, le volume de solution de dissolutlon est de 6,75 ml pour les pellets non encapsulés et de S.'l ml pour les pellets encapsulés.
. . .

: .
Tableau 2a : Lava~e des pellets encapsulés_ et non encapsulés 1~

Quantité Protéines, mg .
initiale de .
. 2~ protéines, mg .
ler lava~e 2ème lava~e = 720 76 Pel le~s non encapsulés 720 8S 90 .
::~ 3 ~
,.

.. .

.
.~ . .

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.' ' : ' ' WO 92/02540 PCI~/F~91/00629 13 2066~98 Tableau 2c: ComParaisOn de la récuperation de l'activité pro-UK et des protéines récupérées, selon que les pellets sont encapsulés ou non.

Activité
1~ Protéines pro-UK

. Récupération . par rapportRécupération à la quantitérelative introduise ' 2~ Pellets encapsulés 49 87 213 ~,' .
. Pel lets non 2 5 encapsulés . . . I ro Ces résultats mettent en évidence quc, en plus de la rétention de composés non solubilisés lors de l'opération de dissolution, I'encapsu-3~ lation de pellets dans un gel d'alginate de calcium présente I'avantage depermettre un lavage efficace des pellets avant dissolution sans nécessiter des opérations lourdes de cen~rifuga~ion.

. . .
~ . . .
''' ' , ~ .
: ~ ' WO 92/02540 Q PCI/FR9l/00629 ?,Q6~9 14 ~
-EXEMPLE 3: DISSOLUTION DE PELLETS EN UTILISANT DES LOTS
SUCCESSIFS DE CHLORHYDRATE DE GUANIDINE

5 ml de suspension de pellets sont mélangés avec 2,5 ml de 5tampon Tris- HCI, 10 mM, pH 8,5. Cette solution est ajoutée à 7,5 ml d'alginate de sodium SG-500 à 4 % (p/v) (Mero-Rousselot-Satia, France).
Après homogénéisation, le mélange d'alginate de sodium et de pellets est injecté goutte à goutte dans une solution de chlorure de calcium 100 mM à 4C.
10Après agitation douce des particules ou billes dans la solution de chlorure de calcium pendant 15 mn, les pellets encapsulés sont lavés deux fois en utilisant du tampon Tris-HCI 10 mM, pH 8,5.
Les pellets encapsulés sont introduits dans 125 ml de la solution standard de dissolution. Après une première période de dissolution 15d'une durée de 9 heures à 20C, la solution de chlorhydrate de guanidine est éliminée et on procède à un deuxième lot de dissolution dans les mêmes conditions.
L'activité et l'activité spécifique de la pro-UK sont rapportées dans le tableau 3.
20Le total des unités de pro-UK récupérées après encapsulation des pellets dans des particules d'alginate de calcium est largement supérieur à la pro-UK récupérée avec la procédure standard (+ 180 %).
L'activité spécifique de cette préparation est trois fois plus élevée que celle de la solution standard.
Une électrophorèse ~SDS-PAGE) du premier lot de dissolution montre une bande correspondant à un poids moléculaire de 30 kD
d'intensité plus faible que celle obtenue avec la procédure standard de dissolution.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

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WO 92/02540 15 2 0 S 6 ~ 9 8 PCI/FR91/00629 ~ ............................ ..

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FEUILLE DE REMPLACEMENT

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W092/02540 ~9~o 16 PCI/I;R91/0~629 EXEMPLE 4:
DISSOLUTION DE PRO-UK EN UTILISANT DE5 PARTICULES D~ALGINATE
DE CALCIU~l DANS UNE COLONNE

7 ml de suspension de pellets sont mélangées avec 2,5 ml de tampon Tris 10 mM, pH 8,5. Cette solution est mélangée avec 7 ml d'alginate de sodium SG-500 à 4 % (p/v) à 4C. La procédure a été alors identique à celle utilisée dans l'exemple 3.
Les particules d'alginate de calcium ont été introduites dans 1~ une colonne de 1,5 x 9 cm. La colonne est alimentée avec une solution s~andard de dissolution à un débit de 22 ml par heure pendant les six premières heures puis à 5 ml par heure pendant les six heures suivantes.
L'expérience est menée à 4C. Le contenu en protéines est suivi dans l'éluent en mesurant continuellement l'absorbance à 280 mn.
Les résultats sont rapportés dans les tableaux 4 et 5.

Seulement 50 % des protéines sont éluées de la colonne d'alginate de calcium à cause des faibles vitesses de diffusion entre le gel 2q et la solution de dissolution (Tableau 5).
~, 3q WO 92~02540 PCT/FR91/00629 - 17 206~598 C

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C ~ o,_ -- _ ' 3 2066 ~ 98 example of guanidine hydrochloride, urea, SDS or Triton. The insoluble compounds must then be removed by centrifugation, which gives imperfect results.
The protein is then renatured by removing agents 5 denaturants in its environment; this is done by diluting the solution of dissolution.
We can then proceed to purification steps subsequent by ion exchange chromatography or gel filtration.
This is why the present invention relates to a method of 1 ~ purification of a secreted protein in the form of an inclusion body msoluble by a bacterium, characterized in that:
a) the inclusion bodies are harvested in the form of pellets by grinding the - microbial cells and centrifugation, b) the pellets are suspended with a solution of substance 15 water-soluble which can be gelled, c) the mixture of the pellets and the solution of water-soluble substance, in a gelling solution, for example solution containing multivalent cations, thus achieving encapsulation pellets in the gelled substance, 2 ~ d) the encapsulated pellets are placed in the presence of a dissolution solution containing at least one chaotropic agent and optionally an agent reducer, e) the denatured and purified protein is obtained in solution.
Certain proteins, especially heterologous proteins 25 whose gene is introduced into the genome of the bacteria are matured by this in the form of an inclusion body. These exclusion bodies, which have a refractive index differentiating them, form aggregates insoluble in the cytoplasm.
In order to recover the protein in purified form, 3. First of all isolate the inclusion bodies. For this we perform a grinding mechanics of microbial cells, previously concentrated by centrifugation, microfiltration or ultrafiltration.

WO 92/02540 PCI ~ / FRgl / 00629 ~, ~ 5 ~ 9 ~ after grinding, centrifugation from 4,000 to 5,000 g allows to separate pellets which are resuspended in a soluti ~ n buffer; in in particular, 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5, can be used. Of preferably, all of these steps are carried out at a temperature close to of 4C, in order to inhibit the proteases that may be present in the preparation.
The suspension of pellets in a solution of a substance water-soluble can be ~ elified can be achieved by mixing a solution of this substance with the suspension of pellets. She can 1 ~ also be carried out by adding this substance in the form of a powder to The suspension of pellets.
By water-soluble substances which can be gelled, is meant substances which, under the effect of a gelling solution for example of a solution with a certain pH or by exposure to cations multivalents, will give a mass retaining its shape, essentially in the form of solid droplets.
Among these substances, mention may be made of poly-natural saccharides like pectin and alkali metal alginates.
The preferred substances are alginates, in particular alginate of 2 ~ sodium.
These alkali metal alginates are gelled in the presence of multivalent cations, in particular by drip injection into a solution containing a multivalent cation, especially in a solution of calcium chloride.
The alkali metal ion is replaced by exchange with an ion multivalent and the substance, by gelling, will encapsulate the pellets. This capsule is formed of a crosslinked gel, which traps the compounds insoluble. But this capsule remains permeable to substances in solution.
This is why the next step will be to denature the proteins present in insoluble form. For this, the encapsulated pellets are put in the presence of a solution of dissolution. This solution contains WO 92/02540 PCI ~ FR91 / 00629 at least one chaotropic agent, the role of which is to cause dissociation of proteins by altering their spatial confi ~ uration or their conformat on; the solution can also contain at least one agent reducing agent, which will break the disulfide bridges of proteins.
Among the chaotropic agents, mention may be made of urea and guanidine hydrochloride. One of the preferred agents is hydrochloride.
guanidine 6M.
- Among the reducing agents, mention may be made of 2-mercapto-- ethanol and dithiothreitol. A preferred agent is 2-mercapto-ethanol 50 mM. By the action of this solution, the proteins denatured are solubilized and released from the encapsulated particles. The proteins pass outside the capsule, while contaminants insolubles remain imprisoned. The capsule must withstand the middle denaturing.
In the following steps, the protein will be renatured. For that, after elimination of the insoluble particles, we will dilute progress-the solution by adding buffer. Agent concentration denaturants therefore decrease and the protein renates with excellent yield. The protein recovery yield is close to 2 ~ 1 00 S.
We then proceed to the final purification of the protein, by ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography.
This technique is reproducible and easily extrapolated in large scale. It eliminates the step of centrifuging the solution of dissolution, the elimination of the insoluble compounds being carried out by encapsulation.
The encapsulation of the pellets makes it easier to perform washing them. The present invention therefore relates to a purification process as it has been defined, characterized in that washing with a buffer solution the encapsulated pellets, before carrying out the dissolution step. So preferred, a 10 mM Tris-HCl buffer solution, pH 8.5, is used.
0.1% Triton X- 100 in which the pellets are incubated encapsulated, with gentle stirring, at low temperature (4 - 6C).

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WO 92/02540 PCI / FRg1 / 00629 "~ 93 6 This step allows the elimination of soluble compounds, and the encapsulated pellets are resuspended in buffer before being put in the presence of the solution of dissolution.
The raw pellets obtained after grinding and centrifugation of the 5 microbial cells can be washed before being encapsulated.
The invention also relates to a method for purifying a protein secreted in the form of an inclusion body, characterized in that ~ u'on wash and homogenize the pellets before carrying out the susp ~ nsion. In in particular, the pellets can be washed with 10 mM Tris-HCI buffer, pH 8.5 containing 0.1% Triton X-100. The washed pellets are concentrated by microfiltration and resuspended in 10 mM Tris-HCI buffer, pH ~. 5.
The present invention relates to a purification process of a protein, characterized in that the protein is secreted by a 15 strain of Escherichia coli. Indeed, we were able to select strains of this bacteria particularly able to produce proteins. These proteins can be secreted in the form of inclusion bodies.
E. coli is a host of choice for cloning genes. This is why the present invention relates to a method of purifying a protein 20 characterized in that the protein is a recombinant protein produced by E. col i.
We can introduce in E. coli the ene of many proteins, in a functional expression vector in the bacteria.
In particular, the present invention relates to a method of 25 purification of a protein, characterized in that the protein secreted by E. coli is the pro-urokinase recomblnante ~ pro-UK).

WO 92/02540 PCltFR91 / 00629 7 2066 ~ 98 The following table shows an implementation mode of the optimized process for the purification and renaturation of pro-urokinase.
.
_ Protein volume step time liters grams hours .
Fermentation 300 12 Centrifugation (cell paste) 75 4 3 passages in homogenizer (grinding 300 5 cell mechanics). .
Centrifugation (pellets) 30 1000 4 Concentration by ; microfiltration 5,500 2 Encapsulation of pellets in particles calcium alginate, 7,350 10 washing steps and filtration . Dissolution of pellets.
in a mixture of guanidine-HCI 6M and 50 300 15 of 2 ^ mercaptoethanol 50mM, Tris-HCI buffer I OmM, pH 8.5 (4C) I st procedure dilution of the solution 300 300 of dissolution in 6.5 M urea Tris-HCI I OmM buffer pH SO, EDTA 5mM.
30 (I 5C) 2nd procedure dilution with Tris-HCI buffer lOmM, pH 8.0, EDTA 1250 300 14 5mM (I 5C). 6 7 '.

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. .
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6 ~ - ~ gQ ~ 8 The efficacy of pro-urokinase renaturation is determined by treating pro-1JK with plasmin to obtain urokinase, pUi5 by measuring the activity of urokinase on the substrate L-pyroglutamyl-glycyl-L-arginine-p-nitroanilide, the plasmin then being inhibited by aprotinin. The proteins are dosed by the reagent of Bradford.

EXEI ~, 1PLE l:
EI ~ ICAPSULATION OF PELLETS IN ALGINATE PARTICLES OF
CALCIUM

The pellet preparation used was washed twice with 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5, containing Triton X-10O at 0 ~ 1'O.
15 ml of pellet are mixed with 2.5 ml of Tris- buffer HCI pH 8.5, 10 mM and 17.5 g of sodium alginate at 40 g / l in water.
This mixture is then injected dropwise into 200 ml of a solution of calcium chloride 10 mM at 4C. Gelation leads to particles of about 1 mm in diameter.
The quantity of particles corresponding to 5 ml of pellet is incubated for 18 hours at 4 ~ C with intermittent gentle shaking, in 125 ml of standard dissolution solution. This solution contains guanidine hydrochloride 6 M and 2-mercapto-ethanol 50 mM.
After renaturation, the activity of pro-urokinase is measured 2 5 obtained.
Control pellets are subject to a standard procedure dissolution e ~ renaturation, without encapsulation.
The results obtained are reported in Table 1.

3 ~

WO 92 ~ 02S40 PCI / FR9ltO0629 20 ~ i6 ~ 98 o ~ '. CJ o 'o _ ~ ~ _ ' ~ '. ':', ':' : - '' -`.
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?, ~ 6 ~ 9 ~ 1 o EXAMPLE 2:
E; ~ 'C ~ PS ~' L ~ TION OF PELLETS IN A GEL OF ~ LGII ~ ATE DE CALCIU ~ l!
WASHING OF ENCAPSULATED PELLETS. DISSOLUTION AND RENATURATION
PRO-UROKINASE SUCCESSIVES
-Insoluble materials (cells, cellular debris, bodies inclusion ...) can easily be encapsulated in alginate gel calcium. This method was used to assess the possibility of replace certain stages of cen ~ rifugation by simple washing of 15 encapsulated pellets. Note that a special washing procedure may easily be introduced (using guanidine hydrochloride, particular).

- Preparation of washed pellets without encapsulation operation:
1 0 g of pellets (protein content: 60%) were first put out centrifuged at 4C (10 min, 10,000 rpm). The pellet obtained was washed 2 times with 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5, containing 0.1 cO Triton X-100.
The pellet then obtained was finally suspended in the same buffer not containing Triton X-100 (final mass of the suspension:
2 ~ 1 ~ g).

- Encapsulation of pcllets and washing of encapsulated pellets:
10 g of pellets (unwashed; protein content: 60 9 ~) were mixed with 3.3 g of 4 ~ 6 sodium alginate solution. The operation Encapsulation was carried out as previously described.
The encapsulated shovels were then washed once with 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5, containing 0.1% Triton X-100.
The suspension of washed encapsulated pellets was mixed with 30 the solution containing guanidine and the reducing agent in the proportion of I g of initial preparation for 5.75 ml of solution.

WO 92/02540 PCI / FR91 / ~ 0629 It 20 ~ 6 ~ 98 Thus, for Ig of initial pellet preparation, the volume of dissolutlon solution is 6.75 ml for unencapsulated pellets and S.'l ml for encapsulated pellets.
. . .

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Table 2a: Lava ~ e of encapsulated and non-encapsulated pellets 1 ~

Amount Protein, mg.
initial of.
. 2 ~ protein, mg.
1st lava ~ e 2nd lava ~ e = 720 76 Pel le ~ s no encapsulated 720 8S 90 .
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. '':'' WO 92/02540 PCI ~ / F ~ 91/00629 13 2066 ~ 98 Table 2c: ComParaisOn of the recovery of pro-UK activity and proteins recovered, depending on whether the pellets are encapsulated or not.

Activity 1 ~ Pro-UK protein . Recovery . relative to Recovery to the quantitative introduce '2 ~ Pellets encapsulated 49 87 213 ~, '.
. Pel lets no 2 5 encapsulated. . . I ro These results show that, in addition to retention of compounds not dissolved during the dissolution operation, the encapsulation 3 ~ lation of pellets in a calcium alginate gel has the advantage of allowing effective washing of the pellets before dissolution without requiring cen ~ rifuga ~ ion heavy operations.

. . .
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'''', ~.
: ~ ' WO 92/02540 Q PCI / FR9l / 00629 ?, Q6 ~ 9 14 ~
-EXAMPLE 3: PELLET DISSOLUTION USING BATCHES
SUCCESSIVE GUANIDINE HYDROCHLORIDE

5 ml of pellet suspension are mixed with 2.5 ml of 5 Tris- HCI buffer, 10 mM, pH 8.5. This solution is added to 7.5 ml sodium alginate SG-500 at 4% (w / v) (Mero-Rousselot-Satia, France).
After homogenization, the mixture of sodium alginate and pellets is injected dropwise into a solution of calcium chloride 100 mM at 4C.
10After gentle agitation of the particles or beads in the solution of calcium chloride for 15 min, the encapsulated pellets are washed twice using 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5.
The encapsulated pellets are introduced into 125 ml of the standard dissolution solution. After a first dissolution period 15 of a duration of 9 hours at 20C, the guanidine hydrochloride solution is eliminated and a second batch of dissolution is carried out in the same conditions.
Pro-UK activity and specific activity are reported in table 3.
20Total pro-UK units recovered after encapsulation pellets in calcium alginate particles is widely higher than the pro-UK recovered with the standard procedure (+ 180%).
The specific activity of this preparation is three times higher than that of the standard solution.
Electrophoresis (SDS-PAGE) of the first batch of dissolution shows a band corresponding to a molecular weight of 30 kD
of lower intensity than that obtained with the standard procedure of dissolution.

REPLACEMENT SHEET

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W092 / 02540 ~ 9 ~ o 16 PCI / I; R91 / 0 ~ 629 EXAMPLE 4:

OF CALCIU ~ l IN A COLUMN

7 ml of pellet suspension is mixed with 2.5 ml of 10 mM Tris buffer, pH 8.5. This solution is mixed with 7 ml sodium alginate SG-500 at 4% (w / v) at 4C. The procedure was then identical to that used in Example 3.
The calcium alginate particles were introduced into 1 ~ a column of 1.5 x 9 cm. The column is supplied with a solution s ~ andard of dissolution at a flow rate of 22 ml per hour during the six first hours then 5 ml per hour for the next six hours.
The experiment is carried out at 4C. Protein content is tracked in elute it by continuously measuring the absorbance at 280 min.
The results are reported in Tables 4 and 5.

Only 50% of the proteins are eluted from the column calcium alginate due to the low diffusion rates between the gel 2q and the dissolution solution (Table 5).
~, 3q WO 92 ~ 02540 PCT / FR91 / 00629 - 17 206 ~ 598 VS

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Claims

1) Process for purifying a protein secreted in the form inclusion bodies insoluble by a bacterium, characterized in that:
a) the inclusion bodies are harvested in the form of pellets by grinding the microbial cells and centrifugation, b) the pellets are suspended with a solution of substance water-soluble that can be gelled, c) the mixture of the pellets and the solution of water-soluble substance, in a gelling solution, thus realizing the encapsulation of the pellets in the gelled substance, d) the encapsulated pellets are placed in the presence of a dissolution solution containing at least one chaotropic agent and optionally an agent reducer, e) the denatured and purified protein is obtained in solution.

2) Purification process according to claim 1, character-ized in that the encapsulated pellets are washed with a buffer solution before to carry out the dissolution step e).

3) Purification process according to one of claims 1 and

2. characterized in that the pellets are washed before carrying out the suspension of step b).

4) Purification process according to one of claims 1 to 3, characterized in that the water-soluble substance capable of being gelled is sodium alginate.

5) Purification process according to one of claims 1 to 4, characterized in that the gelling solution contains cations multivalent.

6) Purification process according to one of claims 1 to 5, characterized in that the gelling solution is a solution of calcium chloride.

7) Purification process according to one of claims 1 to 6.
characterized in that the chaotropic agent is chosen from urea and guanidine hydrochloride.

8) Purification process according to one of claims 1 to 7, characterized in that the reducing compound is 2 mercapto-ethanol.

9) Purification process according to one of claims 1 to 8.
characterized in that the protein is secreted by a strain of E. coli.

10) Purification process according to claim 9, characterized in that the secreted protein is a recombinant protein.

11) Purification process according to one of claims 9 and 10, characterized in that the secreted protein is pro-Urokinase.

12) Purification process according to one of the claims above, characterized in that the encapsulated pellets are introduced in a fixed-bed column before being placed in the presence of the solution of dissolution.