CA2019475C

CA2019475C - Process for measuring the biological activity of a soil

Info

Publication number: CA2019475C
Application number: CA 2019475
Authority: CA
Inventors: Claude Bourguignon
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-06-21
Filing date: 1990-06-21
Publication date: 2000-11-28
Anticipated expiration: 2010-06-21
Also published as: CA2019475A1

Abstract

Le procédé consiste: - à établir une corrélation entre, d'une part, la teneur en phosphate alcaline d'une série de sols de référence dont l'activité biologique est jugée satisfaisante et, d'autre part, une autre caractéristique physique et/ou chimique de cette série de sols de référence, par exemple la surface interne de ces sols, - à mesurer la teneur en phosphatase alcaline et ladite autre caractéristique du sol objet de la détermination, et - à comparer les résultats desdites mesures à la corrélation établie à partir des sols de référence.The process consists of: - establishing a correlation between, on the one hand, the alkaline phosphate content of a series of reference soils whose biological activity is deemed satisfactory and, on the other hand, another physical characteristic and / or chemical of this series of reference soils, for example the internal surface of these soils, - to measure the alkaline phosphatase content and said other characteristic of the soil being determined, and - to compare the results of said measurements with the established correlation from reference soils.

Description

~~.~~1 Procédé de détermination de l'activité biologique d'un sol.
La présente invention concerne, d'une manière générale, un procédé de détermination de l'activité b:iolog:ique d'ûn s01.
A l'heure actuelle, lorsque l'on désire estimer l'activité biologique d'un sol, on doit mettre en oeuvre des méthodes longues et complexes, telles que les méthodes biocidales (Jenkinason et L~add, 1981) ou les méthodes de mesure du dégagement de gai carbonique au de la teneur en adénosine tri-phosphate (Maire, 1987). Il s'ensuit que l'on se heurte à un coQt d'analyse trop élevé ou à un durée excessive des opérations pour pouvoir appliquer ces méthodes à des déterminations de routine.
Or, il serait souhaitable de pouvoir disposer d'un procédé qui permette da mesurer l'activité biologique ou microbienne d'un sol, qui soit suffisamment simple, rapide et économique pour que les agriculteurs puissent y avoir recoure â tïtre ordinaire.
Ce but est atteint selon l'invention en ce sens qu'elle propose un procédé qui consiste - e établir une corrélation entre, d'une part, la teneur en phosphatase alcaline d'une série de sols de référence dont l'activité biologique est jugée satisfaisante et, d'autre part, d'autres caractéristiques physiques et/ou chimiques de cette série de sols de référence, - é mesurer la teneur en phosphatase alcaline et lesdites autres caractéristiques du sol objet de la détermination, et - à comparer les résultats desdites mesures à la corrélation établie e partir des sols de référence.
La teneur en phosphatase alcaline peut être déterminée indirectement par la mesure de son activité enzymat~.que, laquelle peut Vitre mise en évidence, par exemple, par la dégradation du phosphate de p-nitrophényle en p-nitrophénol.
Le ahoïx s'est porté sur 2~a phosphatase alcaline plut8t ~~1 ~.~~~~1 _~_ que sur une autre enzyme car cette en~:yme répond r~ quatre critères importants - alla intervient dans une voie métabolique fondamentale (cycle de l'ATP) et, donc, elle existe chez tous les microorganismes ;
- elle n'existe pas dans les racines des plantes, - son activité ne dépend pas de la teneur en phosphore des sols (la phosphatase acide est, elle, inhibée par les fortes teneurs en phosphore), et i0 - sa technique de dosage est simple et peu coflteuse.
Par suite, la dosage de l'activité de cette enzyme dans un échantillon da sol reflète bien, et de mani~re économique, l'activité biologique microbienne du sol en question.
T1 est toutefois nécessaire de corréler cette mesure avec une autre caractéristique du sol.
Dans un premier mode de mise en oeuvre de l'invention, une autre dite caractéristique est la surface interne du sel, c'est-à-dire la surface déployée par un quantité donnée de sol étalée en couche élémentaire.
Dans un second mode de mise en oeuvre de l'invention, une autre dite caractéristique~avec laquelle est corrélée la mesure de la phosphatase alcaline est la teneur en carbone organique du sol:
Dans un troisième mode de mise en oeuvre de l'invention, une autre dite caractéristique avec laquelle est corrélée la mesure de la phosphatase alcaline est la capacité d'échange cationique du sol.
Les mesures faites sur les sols de référence permettent de tirer de la représentation graphique de leur corrélation une droite de régression et l'ensemble axes/draite ds régression forme un abaque que l°on utilise ensuit e pour estimer l'activité biologique du sol soumis â la détermination.
Plus précisément, on a déterminé escpérimentalement, ~~~."~;
dans la cadre du premier mode da mise an oeuvre Ewoquf~ plias haut, qua la droite de régression obtenue à partir des couples de mesures . activité enzymatique de 1a phosphatasa alcaline exprimée en Ng de p-nitrophénol produit ~ partir de phosphata da p-nitrophényle /g de sol sec/heure, pattée en ordonnée . surface interne du sol exprimée an mZ/g de sol, portée en abscisse, fait apparaftre un facteur da régression r da l'ordre de 0,95.
Dans la cadre du second mode d~ mise an oauvne de l'invention, la droite de régression obtenus é partir des couplas de mesuras . activité enzymatique de la phosphatase alcaline exprimée en Ng de p-nitrophénol produit à partir de phosphate de p-nitrophényla /g da sol sec/heure, portée en ordonnée, . teneur en carbone organique du sol exprimé en °/°°, 20 portés an abscisses, fait apparaitre un facteur da régression r de l'ordre de p,?5.
Dans la cadre du troisiéme mode da misa en oeuvre de l'invention, la droite de régression obtenue à partir des 25 couplas de masures .
. activité enzymatique da la phosphatase alcaline exprimée en Ng de p-nitrophénol produit é partir de phosphate de p-nitrophényle /~ de sol sec/heure, portée en ordonnée, 30 . capacité d'ér_hange cationique du sol exprimée en milliéquivalents/g de sol ssc portée en abscisse, faït apparaître un facteur de régression r de l'ordre de x,65.
duel que soit le mode de misa an oeuvre choisi, on 35 compara las valeurs de l'activité enzymatique da 1a -a-phosphatase alcaline données, d'une part, par la courba da régression et, d'autre part, par la mesure effectuée sur la sol soumis à la détermination, pour la marne valeur d'autres caractéristiques choisies - surface intea~na du sol, teneur an carbone organique du sol ou capacité duéchange cationique du sol - et l'on interpréte, la résull:at ~ partir des hyperboles de confiance comme suit - valeur dans les hyperboles â 95 ~S : bon - valeur dans las hyperboles ~ 90 Rs : insuffisant ou fort - valeur hors des hyperboles à 9~~c : mauvais ou excessif I1 a été vérifié sur plus de deux cents sols agricoles des zones tempérées et tropicales que le procédé selon l'invention donne des résultats parfaitement corrélés avec ceux des méthodes complexes évoquées plus haut.
Le protocole opératoire des trois variantes du procédé
selon 1"invention est décrit ci-après, étant toutefois entendu que las techniques de dosage sont en elles-mêmes connues et que l'invention réside dans la corrélation dea zp mesures .
Pour las sols ds référence, dans ces exemples, on a utilisé des pxélàvements sur des parCellas d'essais de -longue durée (Déhérain, Versailles, Dijon, x~CC&'j dont on connagt bïen les fonctionnements et les rendements des cultural.

Corrélation entre la mesure de l'activité enxyma~tique de la phosphatase alcaline et celle Ia surface interna du 8~z.
1) Masure de l'activité enzyVmatirruo de la phos~phatase acide On utilise la méthode de TABATAHAI et BRENNER, 2982, In. Methods of Soil Analysis, Part 2 by A.L. PAGE et al.
American Sociaty of Agronomy, modifiée par Claude BOURGUIGNON, 1987.

_~_ Le sol est tamisé é 2mm. Une partie est expos~se pendant ~ jours ~ l'air libre et une autre partie est utilisée immédiatement. Dans les deux.ras (sol frais et sol séché é
l'air), le protocole est le m8me a -Mesure de l'humidité
On pëse un échantillon de 5p g de sol séché à l'air ou frais, an le met à sécher pendant 24 heures dans une étuve é
105~C et on le pése de nouveau aprës refroidissement dans un deasicateur. à.a différence donne la tanneur en humidité
exprimée en grammes, teneur dont il faudra tenir compte pour l'expression des résultats (point c4. ci-dessous).
b -Incubation enzymatique .
On introduit une prise d'essai de 2 g de sol (frais ou séché à 1°sir) dans une fâole Erlenmeyer de 5~ ml et on ajoute 0,2 m3 d~ toluène, 4 ml d'une solution tampon à
pH 10,8 (Diluer dans 8~p1 ml d'eau, 2p0 ml d'une solution mère contenant 12,1 g de tampon fris (hydroxyméthylaminométhane), 11,6 g d°acide malique, 24 g d'acide citrique et 6,3 g d'acide borique dans 488 ml de NaOH, 1N. Diluer aven Hz0 et ramener é 1 litre) et 1 ml d°una solution de phosphate de p-nitrophényle. On agate, on bouche la fiole et an incube dans un agitateur fonctionnant à 50 révolutions/mn (5~ rpm) é 37°C pendant 1 heure. Sous l'action de la phosphatase acide contenue dans la prise d'essai, une quantité plus ouvmoins grande de phosphate de p-nitrophényle est convertie en p-nitrophénol.
c -Mesure spectrophotométrique Elle consiste à mesurer la quantité de p-nitrophénal ' produite, laquelle est fonction de 1'actl.vité de la phospha~tase alcalüne.
cï . ~'émoin On met 1,g de sol à incuber comme précédemment, ma~.s sans adjonction de phosphate de p-nitraphényle. Aprés incubation, on ajoute 1 ml d'une solution aqueuse de CaClz.HzO, à la concentration de 73,5g/litre et 4 ml d'une aolutian aqueuse de NaOH ~,5 Molaire. On agate, puis on filtre sur papier Whatman n° 4Ql et lit au spectrophotomât.re saur 4l~Nm. :~~ .
c2.Courbe d'étalonnage (solution standard colore) .
On dilue 1 ml d'une solution standaîrd de p-nitrophénol (1g/1) dans 1~0 ml d'eau et, l'on distribue la dilution résultante dans des f~.oles Erlenmeysr, ~f raison respectivement de O, 1, 2, 3, 4 et 5 ml. On ajuste ~ 5 ml i avec de l'eau, ce qui donne une gamme da concentrations 0 allant de p à 50 Ng de p-nitrophénol. On mesure l'absarption de cette gamme ~ 410Nm et on trace la courbe correspondante.
c3.prise d'essai ' A l'issue de la période d'incubation enzymatique, an ajaute, comme pour le témoin, 1 ml d'une solution aqueuse de ~5 CaClz.HzO, ~ la concentration de 73,5g/litre et 4 ml d'une solution aqueuse de WaOH 0,5 Molaire. On agite, puis on filtre sur papier Whatman n° 4~. Le spectrophomètre étant calé en fonction de l'erreur introduite par 1e témoin, on iw mesure 1°absorption à 41~~m.
0 a4. eacpression des résultats A partir de cette absorption et de la courbe d'étalonnage obtenue sous c2,,on détermine la concentration ~'i en p-nitrophénol. de la prise d'essai et donc, indirectement, l'activité ~nzymatique de la phosphatase alcaline.
25 Cette activité est exprimée en Ng de p-nitrophénol produit en une heure par 1g de sal sec, c'est-â-dire en tenant compte de la mesure de l'humidité effectuée sous a '~
ci-dessus. ~~. ~~ 1 Method for determining the biological activity of a soil.
The present invention relates, in general, a method for determining the activity b: iolog: ique d'ûn s01.
At present, when we want to estimate the biological activity of a soil, we must implement long and complex methods, such as methods biocidales (Jenkinason and L ~ add, 1981) or the methods of measurement of carbon dioxide emission at the content of adenosine tri-phosphate (Maire, 1987). It follows that one meets too high an analysis cost or a duration excessive operations to be able to apply these methods to routine determinations.
However, it would be desirable to have a process for measuring biological activity or microbial of a soil, which is sufficiently simple, rapid and economical so that farmers can have resorts to ordinary life.
This object is achieved according to the invention in the sense that it proposes a process which consists - to establish a correlation between, on the one hand, the alkaline phosphatase content of a series of soils reference whose biological activity is deemed satisfactory and, on the other hand, other physical characteristics and / or chemicals from this reference soil series, - measure the alkaline phosphatase content and said other characteristics of the soil subject to the determination, and - compare the results of said measurements with the correlation established from reference soils.
The alkaline phosphatase content can be determined indirectly by measuring its enzymatic activity ~ .que, which can be highlighted, for example, by the degradation of p-nitrophenyl phosphate to p-nitrophenol.
The ahoïx was carried on 2 ~ has alkaline phosphatase plut8t ~~ 1 ~. ~~~~ 1 _ ~ _ than on another enzyme because this in ~: yme responds r ~ four important criteria - alla intervenes in a metabolic pathway fundamental (ATP cycle) and, therefore, it exists in all microorganisms;
- it does not exist in the roots of plants, - its activity does not depend on the phosphorus content soils (acid phosphatase is inhibited by high phosphorus contents), and i0 - its dosing technique is simple and inexpensive.
As a result, the assay of the activity of this enzyme in a soil sample reflects well, and so economic, microbial biological activity of the soil in question.
T1 is however necessary to correlate this measurement with another characteristic of the soil.
In a first embodiment of the invention, another so-called characteristic is the internal surface of the salt, i.e. the area deployed by a given quantity of soil spread in an elementary layer.
In a second embodiment of the invention, another so-called characteristic ~ with which the measure of alkaline phosphatase is carbon content organic soil:
In a third embodiment of the invention, another so-called characteristic with which is correlated the measure of alkaline phosphatase is the cation exchange capacity of the soil.
The measurements made on the reference soils allow to draw from the graphic representation of their correlation a regression line and the axis / line set ds regression forms an abacus which we then use e to estimate the biological activity of the soil subjected to determination.
More precisely, we determined experimentally, ~~~. "~;
as part of the first mode of implementation Ewoquf ~ plias top, that the regression line obtained from couples of measures . enzymatic activity of alkaline phosphatasa expressed in Ng of p-nitrophenol produced ~ from phosphata da p-nitrophenyle / g dry soil / hour, patte en orderly . internal surface of the soil expressed in mZ / g of soil, plotted on the abscissa, brings up a regression factor r of the order from 0.95.
As part of the second mode the invention, the regression line obtained from couplas de mesuras . enzymatic activity of alkaline phosphatase expressed in Ng of p-nitrophenol produced from p-nitrophenyla phosphate / g of dry soil / hour, brought in orderly, . organic carbon content of the soil expressed in ° / °°, 20 plotted on the abscissa, brings up a regression factor r of the order of p,? 5.
Within the framework of the third mode of implementation of the invention, the regression line obtained from 25 couplas of hovels.
. enzymatic activity of alkaline phosphatase expressed in Ng of p-nitrophenol produced from p-nitrophenyl phosphate / ~ dry soil / hour, brought in orderly, 30 . cation exchange capacity of the soil expressed in milliequivalents / g of ssc soil plotted on the abscissa, a regression factor r of the order appears of x, 65.
duel whatever the mode of bet an work chosen, we 35 compare the values of the enzyme activity in 1a -at-alkaline phosphatase given, on the one hand, by the courba da regression and, on the other hand, by the measurement made on the soil subject to determination, for marl value other selected characteristics - intea ~ na surface area, content an organic soil carbon or cation exchange capacity soil - and we interpret, the result: at ~ from trust hyperbolas as follows - value in hyperbolas at 95 ~ S: good - value in hyperbolas ~ 90 Rs: insufficient or strong - value outside the hyperbolas at 9 ~~ c: bad or excessive It has been checked on over two hundred agricultural soils temperate and tropical areas that the process according to the invention gives results perfectly correlated with those of the complex methods mentioned above.
The operating protocol of the three variants of the process according to the invention is described below, being however understood that the dosing techniques are in themselves known and that the invention lies in the correlation of zp measures.
For the reference floors, in these examples, we have used pxelections on test parcel of -long-term (Déhérain, Versailles, Dijon, x ~ CC &'j which we connagt bien the functioning and yields of cultural.

Correlation between the measurement of enxymatic activity of alkaline phosphatase and that the interna surface of the 8 ~ z.
1) Masking of the enzyVmatirruo activity of the phos ~ phatase acid We use the method of TABATAHAI and BRENNER, 2982, In. Methods of Soil Analysis, Part 2 by AL PAGE et al.
American Sociaty of Agronomy, modified by Claude BOURGUIGNON, 1987.

_ ~ _ The soil is sieved at 2mm. A part is exposed during ~ days ~ in the open air and another part is used at once. In both areas (fresh soil and dried soil air), the protocol is the same a -Measurement of humidity Weigh a 5pg sample of air-dried soil or fresh, put it to dry for 24 hours in an oven 105 ~ C and weighed again after cooling in a deasateur. unlike gives the moisture tanner expressed in grams, content to be taken into account for the expression of the results (point c4. below).
b - Enzymatic incubation.
We introduce a test sample of 2 g of soil (fresh or dried at 1 ° sir) in an Erlenmeyer flask of 5 ~ ml and add 0.2 m3 of toluene, 4 ml of a buffer solution to pH 10.8 (Dilute in 8 ~ p1 ml of water, 2p0 ml of a solution mother containing 12.1 g of fried buffer (hydroxymethylaminomethane), 11.6 g of malic acid, 24 g citric acid and 6.3 g boric acid in 488 ml of NaOH, 1N. Dilute with Hz0 and reduce to 1 liter) and 1 ml ° a solution of p-nitrophenyl phosphate. We agate, we stopper the flask and incubate in a working shaker at 50 revolutions / min (5 ~ rpm) at 37 ° C for 1 hour. Under the action of the acid phosphatase contained in the intake a lesser amount of phosphate of p-nitrophenyl is converted to p-nitrophenol.
c - Spectrophotometric measurement It consists in measuring the quantity of p-nitrophenal ' produced, which is a function of the activity of the phospha ~ tase alcalüne.
this . ~ 'emoin We put 1, g of soil to incubate as before, my ~ .s without the addition of p-nitraphenyl phosphate. After incubation, 1 ml of an aqueous solution of CaClz.HzO, at a concentration of 73.5 g / liter and 4 ml of a aolutian aqueous NaOH ~, 5 Molar. We agate, then we filter on Whatman n ° 4Ql paper and read on the spectrophotometer.
Know 4l ~ Nm. : ~~.
c2.Calibration curve (standard color solution).
Dilute 1 ml of a standard solution of p-nitrophenol (1g / 1) in 1 ~ 0 ml of water and the dilution is distributed resulting in f ~ .oles Erlenmeysr, ~ f reason respectively O, 1, 2, 3, 4 and 5 ml. We adjust ~ 5 ml i with water, which gives a range of concentrations 0 ranging from p to 50 Ng of p-nitrophenol. We measure the absorption of this range ~ 410Nm and we plot the corresponding curve.
c3.test socket ' At the end of the enzymatic incubation period, year add, as for the control, 1 ml of an aqueous solution of ~ 5 CaClz.HzO, ~ the concentration of 73.5 g / liter and 4 ml of a 0.5 molar aqueous WaOH solution. We shake, then we filter on Whatman paper n ° 4 ~. The spectrophometer being calibrated according to the error introduced by the first witness, we iw measure 1 ° absorption at 41 ~~ m.
0 a4. eacpression of results From this absorption and the curve calibration obtained under c2, the concentration ~ 'i is determined in p-nitrophenol. of the test portion and therefore, indirectly, ~ nzymatic activity of alkaline phosphatase.
25 This activity is expressed in Ng of p-nitrophenol produced in one hour per 1g of dry salt, that is to say in taking into account the humidity measurement carried out under a '~
above.

2 - Mesure de la surface interne du sol 30 La mesure utilisée est celle de la technique dite °'au bleu de méthyléne" du Laboratoire Centra. des Pants et Chaussées. Le dosage consiste à faire des ajouts de bleu de méthyléne (1~ g/1) dans une suspension contenant la prise d'essai jusqu'au recouvrement des particules du sol par une 35 couche monomoléculaire de ce colorant.

_7-a - Préparation de l'échantillon de sol.
Un prélévement de sol est tamisé ~ 2mm et une prise â' essai de 1 c~ est prélevée et mise diane 3.00 ml d' eau permutée. On y ajoute 1V1 ml d'une solution aqueuse d'hexamétaphosphate de sodium à 100 g/l. On met enaui.te au mixeur pendant 30 sacondea.
b -- Fixation du bleu de méthl!lèsne On fait des ajouts de 2 ml de solution de bleu de méthyléne (10g/1) jusqu'à ce qu'une goutte du mélange suspension de sol/blpu da méthyléne, déposée sur du papier filtre, laisse apparaftre une auréole bleu clair autour de la tache résultante.
c - Expression des résultats La surface interne est exprimée en m~/g de sol de la façon suivante :
surface interne = (x.s)(1/y) formula dans laquelle x ~ volume en ml de solution de bleu de méthylène nécessaire pour recouvrir lg de sol s = surface en m2 déployée par lg de bleu de méthylène, en 1!occurence 19,85 m~
y = pourcentage pondéral d'argile dans le sol. 2 - Measurement of the internal surface of the ground 30 The measurement used is that of the so-called °
methylene blue "from the Centra Laboratory. Pants and Roadways. The dosage consists of adding blue methylene (1 ~ g / 1) in a suspension containing the intake until the soil particles are covered by a 35 monomolecular layer of this dye.

_7-a - Preparation of the soil sample.
A soil sample is sieved ~ 2mm and a plug â 1 test of 1 c ~ is taken and put in 3.00 ml of water permuted. 1V1 ml of an aqueous solution is added thereto sodium hexametaphosphate at 100 g / l. We set up mixer for 30 bags.
b - Fixing of methl blue! lèsne Add 2 ml of blue broth solution methylene (10g / 1) until a drop of the mixture soil suspension / blpu da methylene, deposited on paper filter, show a light blue halo around the resulting spot.
c - Expression of results The internal surface is expressed in m ~ / g of soil of the as follows:
internal surface = (xs) (1 / y) formula in which x ~ volume in ml of methylene blue solution necessary to cover lg of soil s = area in m2 deployed per lg of methylene blue, in 1! occurrence 19.85 m ~
y = weight percentage of clay in the soil.

3 - Corrélation Une série de mesures a été faite sur des échantillons de sols de référence considérés comme satisfaisants sur le plan de leur activité biologique.
Les résultats sont exprimés graphiquement à 1a figure 1 du dessin annexé.
A partïr de ces résultats, on a pu établir une droite de régression dont le coefficient de régreésion r est de ~D,95â. On obtient ainsi un abaque de Gorréla~ion:
Exploitation En procédant aux mémes mesures de l'activité
enzymatique de la phosphatase alcaline et de 1a surface interne sur un échantillon de sui dont on veut déterminer _8_ l'activité biologique et en comparant les résultats cabtenus avec l'abaque issue de l'étape 3, on peLtt juger de cette act3,vit~ biologique.
~X~MPLE; 2 Corrélation entre la mesure dt~ l'act:iwité enzymatique de la phosphatase alcaline et celle de la teneur en carbone organique.
1) Mesure de_ l'activité enzymatigue de 7.a phas~'hatase acide On procàde Gamme â l'exemple 1 et 1e résultat obtenu est exprimé de la même fa~an.
2) Masure de la teneur en carbone orqanic~ue La méthode utilisée est celle de ANNE, P. 1945; Ann.
Agron. 15:161-172, modifiée par la norme AFNOR d'analyse des sols. ~11e consiste à oxyder~ls carbone organique par une solution sulfo-chromique à l'ébullition et â doser les ions Cr+++ par spectrocolorimëtrie ~ 625 Nm.
a - Mode o ératoire On opèr~ sur une prise d'essaz de sol pesant de 2~p mg ~ 5 g selon que le sol est suppose contenir de 20 â 1 ~ de carbone. On introduit cette prise d'essai dans un ballon ~
col radé, on ajoute 50 ml de mélange sulfo-chromique (.30 g de Cria dissous dans 54tb ml d'eau distillée k 500 m1 d'acide sulfurique concentré) et 15 m1 d°acïde sulfurique concentré.
Aprés avoir adapté au col rodé du ballon un réfrigérant r~
reflux, on porte le contenu du ballon à l'ébullition pendant 5 mn. On laisse refroidir pendant 3Qt mn, puis on transvase quantïtativement dans une fiole jaugée de 2~~ ml. On laisse reposer une heure, après quoi on décante le liquide clair de ' la fiole. Après un nouveau repas, de 12 heures cette fois, on décante dans un pilulier à bouchon hermétique.
b - Mesure s~eotrocolarimètrigue b1. Gamme étalon On prépare, à partir d'une solution mère de glucose à
1,~ g/1 (donc à 4 g de carbone par l:~tre), une gamme de -g_ dilutions titrant respectx.vement ?~, 1~, 2~, 6p, IQIO, 20~, 3pp, 4p0, 50~f et 6N~ Ng de carbone/ml. 4n mesure l'absorption de cette gamme sous 6~5 Erm et on trace la courbe d'étalonnage correspondante.
b2. Mesure L'appareil étant calé pour tenir compte de l'absorption d'un témoin préparé selon le principe cla:QSique rappelé saur l'exemple 2, on mesure l'absorption de la prise d'essai préparée comme indiqué sous a (suspension de liquide d'incubation), et l'on s'en rapporte à la e:ourba d'étalonnage pour en tirer la concentration en carbone exprimée en Ng de carbone par cm3 de suspension (valeur qui peut directement être rapportée au poids de sel sec).
c - Expression des résultats La teneur en carbone organique est eacprimée comme suit Teneur en carbone (~S) = (x) (1/5~p) (1~p) (~1I10~-h) , formule dans laquelle .
z = concentration en carbone en Ng/g p ~ poids de la prise d'essaï (en g) h = humidité de la terre (en g) mesurée comme à
l'exemple 2.
3 - Corrélation Une série de mesures a été'faite sur des échantillons de sole de référence considérés comme satisfaisants sur le plan de leur activité biologique.
Les résultats sont exprimés graphiquement à la figure 3 du dessin annexé.
~1 partir de ces résultats, on a pu établir une droïte d~ régression dont le coefficient de régression r est de 0,5012. On obtient ainsi un abaque de corrélation. 3 - Correlation A series of measurements was made on samples of reference soils considered satisfactory on the plan of their biological activity.
The results are expressed graphically in FIG. 1 of the attached drawing.
From these results, we were able to establish a straight line regression whose regression coefficient r is ~ D, 95â. This gives a Gorréla ~ ion abacus:
Operation By performing the same activity measurements of alkaline phosphatase and of the surface internal on a sample of sui which we want to determine _8_ biological activity and comparing the results with the abacus from step 3, we can judge this act3, lives ~ biological.
~ X ~ MPLE; 2 Correlation between the dt ~ act measurement: enzymatic iity of alkaline phosphatase and that of carbon content organic.
1) Measurement of the enzymatic activity of 7.a phases ~ hatase acid We proceed to Range in Example 1 and the result obtained is expressed in the same fa ~ an.
2) Hiding the carbon content orqanic ~ ue The method used is that of ANNE, P. 1945; Ann.
Agron. 15: 161-172, modified by the AFNOR standard for the analysis of soils. ~ 11e consists in oxidizing ~ ls organic carbon by a sulfochromic solution to boil and dose ions Cr +++ by spectrocolorimëtrie ~ 625 Nm.
a - O eratory mode We operate ~ on a soil gas test weighing 2 ~ p mg ~ 5 g depending on whether the soil is supposed to contain 20 to 1 ~
carbon. We introduce this test portion in a balloon ~
stripped neck, 50 ml of sulfo-chromic mixture (.30 g of Cria dissolved in 54tb ml of distilled water k 500 m1 of acid concentrated sulfuric acid) and 15 m1 of concentrated sulfuric acid.
After having adapted a coolant r ~ to the ground neck of the flask reflux, the contents of the flask are brought to the boil for 5 min. Leave to cool for 3Qt min, then transfer quantitatively in a 2 ~~ ml volumetric flask. We let stand for one hour, after which the clear liquid is decanted from ' the vial. After a new meal, 12 hours this time, decanted in an airtight container.
b - Measure s ~ eotrocolarimètrigue b1. Standard range We prepare, from a mother solution of glucose to 1, ~ g / 1 (so at 4 g of carbon per liter: ~ tre), a range of -g_ dilutions titrating respectx.vement? ~, 1 ~, 2 ~, 6p, IQIO, 20 ~, 3pp, 4p0, 50 ~ f and 6N ~ Ng carbon / ml. 4n measure the absorption of this range under 6 ~ 5 Erm and we trace the corresponding calibration curve.
b2. Measured The device being calibrated to take into account the absorption of a witness prepared according to the principle cla: QSique called back will know example 2, the absorption of the test portion is measured prepared as indicated under a (liquid suspension incubation), and we refer to the e: ourba calibration to derive the carbon concentration expressed in Ng of carbon per cm3 of suspension (value which can be directly related to the weight of dry salt).
c - Expression of results The organic carbon content is expressed as follows Carbon content (~ S) = (x) (1/5 ~ p) (1 ~ p) (~ 1I10 ~ -h), formula in which.
z = carbon concentration in Ng / g p ~ weight of test sample (in g) h = soil moisture (in g) measured as at example 2.
3 - Correlation A series of measurements was made on samples of reference sole considered satisfactory on the plan of their biological activity.
The results are expressed graphically in Figure 3 of the attached drawing.
~ 1 from these results, we were able to establish a straight line d ~ regression whose regression coefficient r is 0.5012. We thus obtain a correlation abacus.

4 - Exploitation En procédant aux mêmes mesures de l'activité

enzymatique de la phosphatase alcaline et de la teneur en carbone organique sur un échantillon de sol dont on veut déterminer l'activité biologique et en comparant les résultats obtenus avec l'abaque issu de l'étape 3, on peut juger de cette activité biologique.

Corrélation entre la mesure de l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline et celle de la capacité d'échange cationique.
1) Mesure de l'activité enzymatique de la phosphatase acide On procède comme à l'exemple 1 et le résultat obtenu est exprimé de la même façon.
2) Mesure de la capacité d'échange cationique On utilise la méthode de RHOADES, J.D. 1982. In Methods of soil analysis, Part 2 by PAGE, A.L. ; MILLER, R.H. and KEENEY, D.R. American Society of Agronomy, Madison, U.S.A.
Cette méthode distingue les sols contenant des carbonates et les sols acides.
2a- Sols contenant des carbonates 2a1 -Mode opératoire On pèse 4 à 5 g de sol sec que l'on met dans un tube à
centrifuger. On ajoute 33 ml d'une solution saturante de NaOAc, 0,4N et de NaCl 0,1N avec 60 % d'éthanol et ajustée à
pH 8,2 avec une solution de NaOH 6N. On agite pendant 5 mn et on centrifuge à 1000 tours/mn pendant 5 mn. On élimine le surnageant et on répète d'opération quatre fois. On ajoute ensuite 33 ml d'une solution de MgNOa à 0,5 N, on agite pendant 5mn et on centrifuge jusqu'à éclaircissement du surnageant que l'on verse dans une fiole de 10~ ml. On répète l'opération deux fois- et on raméne à lp~ ml exactement.
On dose, dans des aliquots du contenu de la fiole, le sodium et le chlore présents dans la solution par rapport à

_11_ des solutions standard (M~:thada de RHOADES, section 10-3.4 du même ouvrage).
2a2 - Fx~pression des résultats La capacité d'échange cationique (C.E.C.), en milliéquivalents pour 100 g de sol sec, a~st exprimée comme suit C.E.C. r (1~D0/p sol) [ (cNa) (lON/v a1)-(cCl) (7.00/v al) (cNaCl) j dans laquelle - p sol est le poids en grammes de l'échantillon de sol - cNa est la concentration en Na, ~xprim~,e en milliéquivalents par litre, de la so7.ution saturante - v al est le volume de l'aliquot en ml - cCl est la concentration en C1, exprimée en milliéquivalents par litre, de la solution saturant - cNaCl est la concentration sn NaCI, exprimée en millïéquivalents par litre, de la solution saturante 2b- Sols acides 2b1 -Mode opératoire .
On pèle 2 g le sol sec que l'on place dans un tube é
centrifugation. On ajoute 2p ml d'une solution de BaClz 0,2M. On agite pendant 2 heures et on centrifuge. On jette le surnageant et on répète l'opération deux fois avec 2.0 ml de BaClz ~,O02M. On ajoute 10 ml d'une solution de MgS04 p~p~~SM et on agite pendant l heure. On ajuste la capacité
d'échange d celle d°une solution de r~f~rence de MgSO~
~,0~15M par ajouts successifs d'une solution de MgSO~a ~1f005M
ou d'eau distillée. On agite doucement pendant une nuit: On pèse le tube et on centrifuge. On détermine le pH et ls concentration en Mg du surnageant.

2b2 Expression de9 résultats La capacité d'é.change cationique (C.E.C.), en milliéquivalents pour 104 g de sol sec, est exprime comme suit si l' on n' a a jouté que de l' eau d:i.stillée :
CEC = 1pN ( (~ ~ 1°Ca V3 ) /p sol 1Q - si l'on a ajouté du MgSO4 CEC a 10~ ( ~, N1V~ -C~ Va ) /p sol formules dans lesquelles - p sol ~ poids en grammes de l'échantillon de sal sec - Ci = concentration en Mg dans le surnageant en milliéquivalents/ ml - Vm - volume en ml de la solution de MgSO~ ajoutée - Va = volume en m1 de la solutîon finale de , surnageant.
3 - Corrélation Une série de mesr~res a été faite sur des échantillons de sols de référence considérés comme sahisfaisant~ sur le plan de leur activité biologique.
Les résultats sont exprimés graphiquement ~i la figure 3 du dessin annexé.
partir de ces résultats, on a pu établir une droite de régressïon dont le coefficient de régression r est de x,6482. On obtient ains5. un abaque de corrélation.
4 - Exploitation En procédant aux mêmes mesures de l'activité
enzymatique de la phosphatase alcaline et de la capaQité
d~échange cationique sui un échantillon de sol dont on veut déterminer l'activité biologique et en comparant les résultats obtenus avec l'abaque issu de l'étape 3, on peut juger de cette activité biologique.
Que l'on ait recours à l'un ou l'autre mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, on n'a à effectuer que des opérations simples, rapides et peu coflteuses. On peut, par suite, les appliquer couramment aux sols agricoles en vue d'aboutir à une "analyse conseil". Cela est d'autant plus utile que l'intensification de l'agriculture a conduit à une perte de matière organique dans les sols avec une baisse consécutive de leur activité microbienne. Le procédé
selon l'invention permet aux agriculteurs de juger de l'état de leur sol ainsi. que de vérifier l'efficacité de tel ou tel produit dans le maintien ou l'augmentation de son activité
biologique.
I1 est bien entendu que la présente invention n'est pas limitée aux modes opératoires décrits ci-dessus, é titre d'exemples. En particulier, l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline pourrait être déterminée en utilisant un autre substrat que le phosphate de p-nitrophényle, ou méme la phosphatase alcaline pourrait être dosée directement par tout procédé approprié. De même, la teneur en carbone, la C.E.C. et la surface interne pourraient être mesurées par toutes autres méthodes reconnues sur le plan national ou international. 4 - Operation Using the same activity measurements of alkaline phosphatase and the content of organic carbon on a soil sample we want determining biological activity and comparing the results obtained with the abacus from step 3, we can judge this biological activity.

Correlation between the measurement of enzyme activity of alkaline phosphatase and that of the exchange capacity cationic.
1) Measurement of the enzymatic activity of phosphatase acid We proceed as in Example 1 and the result obtained is expressed in the same way.
2) Measurement of the cation exchange capacity We use the method of RHOADES, JD 1982. In Methods of soil analysis, Part 2 by PAGE, AL; MILLER, RH and KEENEY, DR American Society of Agronomy, Madison, USA
This method distinguishes soils containing carbonates and acid soils.
2a- Soils containing carbonates 2a1 - Operating mode We weigh 4 to 5 g of dry soil which we put in a tube to centrifuge. 33 ml of a saturated solution of NaOAc, 0.4N and 0.1N NaCl with 60% ethanol and adjusted to pH 8.2 with 6N NaOH solution. Shake for 5 min and centrifuged at 1000 rpm for 5 min. We eliminate the supernatant and the operation is repeated four times. We add then 33 ml of a 0.5 N MgNOa solution, stirred for 5 min and centrifuged until the supernatant which is poured into a 10 ~ ml flask. We repeat the operation twice- and we bring back to lp ~ ml exactly.
We measure, in aliquots of the contents of the vial, the sodium and chlorine present in the solution compared to _11_ standard solutions (M ~: thada de RHOADES, section 10-3.4 of the same work).
2a2 - Fx ~ pressure of results The cation exchange capacity (CEC), in milliequivalents per 100 g of dry soil, a ~ st expressed as follows CEC r (1 ~ D0 / p sol) [(cNa) (lON / v a1) - (cCl) (7.00 / v al) (cNaCl) j in which - p sol is the weight in grams of the soil sample - cNa is the concentration of Na, ~ xprim ~, e in milliequivalents per liter, of the solution saturating - v al is the volume of the aliquot in ml - cCl is the C1 concentration, expressed in milliequivalents per liter of the solution saturating - cNaCl is the concentration sn NaCI, expressed in millivalents per liter of the solution saturating 2b- Acid soils 2b1 - Operating mode.
We peel 2 g of dry soil which we place in a tube centrifugation. 2p ml of a BaClz solution are added 0.2M. Stir for 2 hours and centrifuge. One throws the supernatant and the operation is repeated twice with 2.0 ml of BaClz ~, O02M. 10 ml of a MgSO 4 solution are added p ~ p ~~ SM and stirred for 1 hour. We adjust the capacity exchange of that of a reference solution of MgSO ~
~, 0 ~ 15M by successive additions of a MgSO solution ~ a ~ 1f005M
or distilled water. Shake gently overnight:
weigh the tube and centrifuge. We determine the pH and ls Mg concentration of the supernatant.

2b2 Expression of 9 results The cation exchange capacity (CEC), in milliequivalents per 104 g of dry soil, is expressed as follows if you have only added water d: i.stilled:
CEC = 1pN ((~ ~ 1 ° Ca V3) / p sol 1Q - if MgSO4 has been added CEC a 10 ~ (~, N1V ~ -C ~ Va) / p sol formulas in which - p sol ~ weight in grams of the dry sal sample - Ci = concentration of Mg in the supernatant in milliequivalents / ml - Vm - volume in ml of the MgSO solution ~ added - Va = volume in m1 of the final solution of, supernatant.
3 - Correlation A series of measurements was made on samples of reference soils considered as satisfactory ~ on the plan of their biological activity.
The results are expressed graphically ~ i Figure 3 of the attached drawing.
from these results, we were able to establish a straight line regression whose regression coefficient r is x, 6482. We get thus5. a correlation abacus.
4 - Operation Using the same activity measurements of alkaline phosphatase and capacity of cation exchange on a soil sample that we want determining biological activity and comparing the results obtained with the abacus from step 3, we can judge this biological activity.
Whether you use one or the other work of the method according to the invention, one only has to perform simple, fast and inexpensive operations. We can, therefore, commonly apply them to agricultural soils in with a view to arriving at an "advisory analysis". This is all more useful than the intensification of agriculture has led loss of organic matter in soils with a consecutive decrease in their microbial activity. The process according to the invention allows farmers to judge the state from their soil as well. than checking the effectiveness of this or that product in maintaining or increasing its activity organic.
It is understood that the present invention is not limited to the procedures described above, by way of examples. In particular, the enzymatic activity of alkaline phosphatase could be determined using another substrate than p-nitrophenyl phosphate, or even alkaline phosphatase could be measured directly by any suitable process. Likewise, the carbon content, CEC and internal surface could be measured by any other nationally recognized methods or international.

Claims

1 1.- Method for determining biological activity soil that consists of:
- to establish a correlation between, on the one hand, the alkaline phosphatase content of a series of reference soils whose biological activity is deemed satisfactory and, on the other hand, the carbon content of this series of soils reference, - to measure the alkaline phosphatase content and the carbon content of the soil whose activity is to be determined organic, and - compare the results of said measurements with the correlation established from reference soils, characterized in that, moreover, it consists - to establish a correlation between, on the one hand, said alkaline phosphatase content of the soil series of reference, and, secondly, their exchange capacity cationic, and thirdly, their internal surface, - to measure the cation exchange capacity and the internal surface of the soil whose activity is to be determined organic, and - compare the results of said measurements with corresponding correlations established from the soils of reference.

2.- Method according to claim 1, characterized in what it is to measure the alkaline phosphatase content indirectly, by measuring its activity enzymatic.

3.- Method according to claim 2 characterized in what the regression line obtained from the couples measurement - enzymatic activity of alkaline phosphatase expressed in µg of p-nitrophenol produced from p-nitrophenyl phosphate / g dry soil / hour, laid on the ordinate, - internal surface of the soil expressed in m2 / g of soil, plotted on the abscissa, shows a regression factor r of the order from 0.95.

4.- Method according to one of claims 1 to 3 characterized in that the regression line obtained at from the pairs of measurements, - enzymatic activity of alkaline phosphatase expressed in µg of p-nitrophenol produced from p-nitrophenyl phosphate / g dry soil / hour, laid on the ordinate, - organic carbon content of the soil expressed in for thousand (° / °°), plotted on the abscissa, shows a regression factor r of the order of 0.75.

5.- Method according to one of claims 1 to 4 characterized in that the regression line obtained at from the pairs of measurements, - enzymatic activity of alkaline phosphatase expressed in µg of p-nitrophenol produced from p-nitrophenyl phosphate / g dry soil / hour, laid on the ordinate, - cation exchange capacity of the soil expressed in milliequivalents / g of soil, plotted on the abscissa, shows a regression factor r of the order of 0.65.

6.- Method according to any one of the claims 3 to 5 characterized in that it consists in comparing the values given enzymatic activity of alkaline phosphatase, on the one hand, by the regression curve and, on the other hand, by the measurement on the soil subject to the determination, for the same value of other characteristics chosen between the surface soil, its organic carbon content and its capacity cation exchange, and to interpret the result from confidence hyperbolas as follows - value in hyperbolas at 95%: good - value in hyperbolas at 90%: insufficient, or strong - value outside hyperbolas at 90%: bad excessive.