- 1 1 3 1 i7 ~ 3 La présente lnventlon a pour ob~et une nouvelle composition de milleu d- culture de baceérles appartenant au genre Bordeeella, ce mllleu de cultur- co~t~nant au molns un dérlvé étherlflé de polymère de D-glucose.
L'lnventlon concerne également une méthode de culture desdltes bactéries à
l'aide d'un tel milieu.
On sait que la culture de bactérles du genre Bordetella, par exemple Bordetella pertussis, Bordetella parapertussls et Bordetella bronchlseptica, soulève des problèmes dlfficlles, notamment dans la mise au polnt de mllieux de culture purement synthétiques.
La bactérle ~ordetella pertussls est l'agent pathogène de la coqueluche, et sa culture lndustrlelle est nécessa~re pour produire des vacclns antlcoquelucheux acellulaires ou à germes entiers.
On sait également que la culture de Bordetella pertussis, phase I, per~et l'obtentlon, dans le milleu de culture, de la toxlne pertussis (encore appelée LPF ou LPF-HA : Leukocytosls Promotlng Factor-Hemagglutlnln) et le F-HA (Filamentous Hemagglutinin) qui sont des substances antigéniques susceptibles d'entrer dans la composltlon d'un vaccln acellulaire anticoquelucheux.
Les bactérles du genre Bordetella ont été d'abord cultlvées sur un 2a milieu solide appelé ~illeu de ~ordet-Gengou.
On a proposé depuls dlverses composleions de mllleux llquides pour la culture des bactérles apparteran~ au genre Bordetella, en particuller Bordetella pertussls en phase I.
Le premler mll~eu llqulde pour la culture des bactérles Bordetella pertussls en phase I a éte décrit par Hornlbrook J.~'., Public Health Reports, 54 , n41, 1847-1851 (1939). Le mllleu decrit par Hornlbrook contiene de l'amldon. Hornlbrook a slgnale e~ outre qu'll esc posslble de remplacer l'amidon par la bêta-dextrlne ou par l'alpha-dextrlne. Ces dextrlnes, maintenant appelées alpha et bêta-cyclodextrlne, sont des polyosides obtenus par l'actlon de b. macerans sur l'amldon de pomme de terre.
Plusleurs auteurs ont ensulte apporté des modificatlons et amélloratlons au mllieu décrlt par Hornibrook et un mllieu liquide purement synthétique a été mls au polnt par Stainer et Scholte, J. Gen. ~icrobiol., 63, 211-220 (1970).
Le milleu de culture de Stalner et Scholte, appelé couramment milieu SS, est chimiquement déflni. Il ese dépourvu de substances naturelles ou de leurs dérivés, tels que des extraits de levures, des polypeptonea, etc L'absence de telles substances complexes dans le mllieu rend plu8 alsée la purificatlon des antigènes protéiques excrétés par les mlcro-4Q organismes, co~me la toxlne pertussls et le F-HA. Le mllieu SS per~et en outre - 1 1 3 1 i7 ~ 3 The present lnventlon ob ~ and a new composition of milleu d- culture of baceérles belonging to the genus Bordeeella, this mllleu of cultur- co ~ t ~ nant in molns an etherlflé drop of D-glucose polymer.
The invention also relates to a method for growing bacteria using such a medium.
We know that the culture of bacteria of the genus Bordetella, for example Bordetella pertussis, Bordetella parapertussls and Bordetella bronchlseptica, raises dlfficlles problems, in particular in the setting of polnt of mllieux purely synthetic cultures.
The bacteria ~ ordetella pertussls is the pathogen of whooping cough, and its lndustrlelle culture is necessary to produce acellular or whole germ pertussis vacclns.
We also know that the culture of Bordetella pertussis, phase I, per ~ and obtain, in the milleu of culture, pertussis toxlne (again called LPF or LPF-HA: Leukocytosls Promotlng Factor-Hemagglutlnln) and the F-HA (Filamentous Hemagglutinin) which are antigenic substances likely to enter the composition of an acellular vaccln pertussis.
The bacteria of the genus Bordetella were first cultivated on a 2a solid medium called ~ illeu de ~ ordet-Gengou.
We have proposed a number of different types of illicit the culture of bacteria apparteran ~ in the genus Bordetella, in particular Bordetella pertussls in phase I.
The premler mll ~ eu llqulde for the culture of Bordetella bacteria pertussls in phase I was described by Hornlbrook J. ~ '., Public Health Reports, 54, n41, 1847-1851 (1939). The mllleu described by Hornlbrook contains the amldon. Hornlbrook has also announced that he can replace starch by beta-dextrl or by alpha-dextrl. These commands, now called alpha and beta-cyclodextrlne, are polysaccharides obtained by the actlon of b. macerans on the potato amldon.
Several authors have therefore made changes and improve with mllieu declt by Hornibrook and a purely liquid mllieu synthetic was mls polnt by Stainer and Scholte, J. Gen. ~ icrobiol., 63, 211-220 (1970).
The Stalner and Scholte crop, commonly called SS environment, is chemically deflected. It is devoid of natural substances or their derivatives, such as yeast extracts, polypeptonea, etc.
The absence of such complex substances in the world makes it more alsée the purificatlon of the protein antigens excreted by mlcro-4Q organisms, co ~ me toxlne pertussls and F-HA. The mllieu SS per ~ and further
- 2 - 1 3 1 1 7 ~ 3 une bonne reproductlbilité de la quallté de9 suspensions de germes obtenues e~
fln d~ culture.
L- mllleu SS contlent essentlellement, en proportlons déflnles, les produit~ sulvants : Glutamate de sodium, L-prollne, chlorure de sodium, dlhydrogénophosphate de potasslum, chlorure de potassium, chlorure de magnésium, chlorure de calclum, et trls-hydroxyméthylamlnométhane, auxquels on ajoute les prodults suivants : L-cystlne, sulfate ferreux, aclde ascorblque, glutathlon rédult et niaclne.
Dans un milieu SS modifié, on a~oute en outre une solution de casamino-acides ou de peptides correspondants.
Toutefols, le mllieu SS ne permet pas l'expresslon des antigènes déjà cieés en quantité suffisante compatibl avec un développement industrlel.
De plus, avec ce milleu llqulde, l'antlgène F-HA ne peut être prodult que lorsque la culture est réalisée dans des conditions statlques.
Bour produlre la toxlne pertussls et le F-HA dans un milieu llqulde aglté, Imaizumi ee al., J. Clln. Microbiol., l7, n5, 781-786 (1983), ont définl un milieu de Stainer et Scholte modifié dans lequel ils ont a~outé un dérivé méthylé de la bêta-cyclodextrine. Ce polyoside cyclique, encore appelé
Heptakis (2,6-O-dlméthyl) beta-cyclodextrine, aug~ente à la fols la biomasse et la production de toxine pertussls et de F-HA.
Toutefols, l'utillsation de ce dérlvé méthylé de la bêta-cyclo-dextrine soulève des problèmes économiques, en raison de l'étape de préparation du dérlvé dlméthylé en positlon 2,6, à partir de la bêta-cyclo-dextrine, par reactlon enzymatlque.
Un des objets de la présente inventlon est une composltion de ml11eu de culture à base de composés chlmiquement déflnls, capable de favorlser le développement des bactérles du genre Bordetella, et en partlculier de favorlser la productlon slmultanee des antigènes toxine pertussis et F-HA avec un rendement élevé Ce nouveau mllleu de culture per~et d'éviter l'emploi coûteux de dérlvés étherlflés de la cyclodextrine.
On a malntenant découvert que les dérives éthériflés de polymères de D-glucose de masse moléculaire au molns égale à 2000 n'ont d'effet nl sur la productlon de la toxlne pertussls, ni sur la production de F-HA, et meme lnhlbent la crolssance des cultures de bactérles du genre Bordetella, mals que, de facon surprenante, ces dérivés éthérifiés, lorsqu'lls sont assoclés à
la cyclodextrlne ou ses dérlvés, favorisent le développement microblen et/ou la productlon simultanée de toxlne pertussls et de F-HA avec un rendement élevé.
L'invention a donc pour ob~et une nouvelle composielon de milieu de culture des bactérles appartenant au 8enre Bordetella, comprenant les ~ 3 ~ 1 3 1 1 7 ~ ~
lngrédlent3 de base nécessaires à cette culture, alnsl qu'une cyclodextrlne ou ses t~rl~-, caractérlsée par le falt que ladlte composltlon contlent en outre au ~ol~- u~ dérlvé éthérlflé d'un poly~ère de D-glucose dont la masse mol~cul~lr- ~-t au molns égale à 2000.
Les polymèreq de D-glucose dont dérlvent les prodults éthérlflés utlllsés selon l'inventlon sont des polymère~ dont les motlfs D-glucose sont réunls par une llalson alpha comme dans l'amylo~e, ou par une llalson bêta co~me dans la cellulo~e.
Parml les dérivés éthér~flés de polymères de D-glucose, on cltera notamment les dérlvés éthérifiés de la cellulo~e dans lesquels une partle des groupements hydroxyle sont éthérlfiés par des groupements alkyle inférieur ou hydroxy-alkyle lnferleur. Parmi les dérlvés éthériflés de la cellulose, on citera en partlculler la ~éthylcellulose, l'hydroxypropyl méthylcellulose, l'hydroxyéthyl cellulose, l'hydroxybutyl méthylcellulose etc... ; tous ces prodults sont des produles co~merclaux vendus nota~ment par les flrmes Dow Chemlcal, Colorcon, ~nlon Carblde Corporatlon et Hercules Inc. On cltera également la carboxyméthylcellulose qul est égale~ent un prodult commerclal, vendu notamment par les firmes Hercules Inc. ou E.I. du Pont de Nemours. Parml les autres dérivés éthérifiés de polymères de D-glucose, on cltera aussl les dérivés correspondants de l'amldon, et en particulier de l'amylose.
La limlte supérleure du poids ~oléculaire des dérivés éthérlfiés de polymères de D-glucose n'est pas déterminante De préférence, on choislt le dérlvé éthérifié de fa~on que le poids ~oléculaire et le degré de substltutlon soient tels que le dérivé aux concentratlons utilisées solt soluble dans l'eau. Généralement le mllieu de culture de l'lnvention contient de 0,01 à
2g/lltre du dérlvé éthéri~le du polvmère de D-glucose, et de préférence de 0,05 à O,Sg/litre.
Le dérlvé ethérlfié peut être a~outé dans le mllleu en plusieurs fols, g~n~ralemene de 2 à 6 fols ; on a~oute par exemple à chaque fois de 0,01 à lg/lltre tudlt dérlve La cyclodextrine (ou un de ses dérlvés) est présente dans le mllleu de culture de l'lnventlon à ralson de 0,5 à 5g/lltre, de préférence de 1 à 2g/lltre.
La cyclodextrlne peut être l'alpha-cyclodextrlne, la bêta-cyclodextrine ou la gamma-cyclodextrlne. Les dérlvés de cyclodextrlne sont notamment les dérlvés éthérlflés.
L'lnventlon a également pour ob~et l'utillsatlon des dérlvés éthérlfiés de polymères de D-glucose, tels que déflnla cl-dessus, en assoclatlon avec la cyclodextrlne ou ~es dérlvés, dans la culture de bactéries du genre Bordetella, et en partlculler dana la culture er. milleu aglté de _ 4 _ ~ 3 ~ 1 7 ~ ~
Bordetella pertussis, pour favori9er 18 crolssance de la culture et/ou l'expr~aion dea ~ntlgène~ toxioe p~rtus~l~ et F-HA.
L'in~ention a en partlculler pour obJet un procédé de culture des bacterie~ tu genrc Borde~ella, à l'alde de la compooltlon de mllleu te culture décrlte ci-de~sus. Ce procédé, qul consl~te à cultlver legdltes bactérles dans un mllleu de culture approprlé, le mllleu de culture contenant une cyclodextrlne ou ses dérlvé4, est caractérlsé par le falt que l'on a~oute audit mllieu de culture au moins un dérlvé éehériflé de polymère de D-glucose, tel que déflnl ci-dessus~
lQ Ledlt dérlvé éthérlflé de polymère de D-glucose peut etre ajouté en une seule fols en début de culture, ou en plusleurs fol~, comme lndiqué
précédemment, de facon à utlllser de 0,05 à 2g/lltre, et de préférence de O,05 à 0,5g/litre, dudit dérivé~
On décrit ci-après un mode d'exécutlon particulier du procédé de lS l'invention, en mllleu liquide agité.
Parmi les milieux de culture de base utilisables dans le procédé de l'invention, on cieera notamment un milleu SS modiflé ayant la compositlon sulvante (pour I litre) :
- glutamaee de sodluml0~72 g 2~ - L-proline 0,24 g - KH2PO4 0,50 g - KCl 0,20 g g 2' 2 O,l0 g - CaC12 0,02 g - Trlst 6,l0 g - Casamlno acldes l0,00 g - ~aCl 2,50 g - L-cystlne 40,00mg 4' 2 l0,00mg - Aclde ascorbique 20,00mg - Glutathlon rédult l00,00mg - ~iaclne 4,00mg ou peptides correspondants préparés par hydrolyse enzymatlque de la casélne.
On ef~eceue les précultures dan~ le mllleu SS modif1é contenant ou non une cyclodextrlne.
La culeure proprement dlte eat effectuée par ensemencement d'un fermenteur avec une concentratlon en germeq de l'ordre de l0 ou 10 germes/ml. La concentratlon en germes est évaluée p~r la lecture de la densleé
4Q optlque en anRlyse qpectrophoeométrlque à 650n~.
~i t ( marque de commerce) 5 13~17~3 Le mllieu de culture dans le fermenteur est le mllleu SS modifié
conte~nt un- cyclodextrlne à une concentration de 1,7g/litre.
La culturc est effectuée à 35-37C, de préférence à 36C.
Oo opère en milieu agleé avec aératlon.
Le dérivé éthérifié de polymère de D-glucose utlllsé est lcl une celullose ayant un poids moléculalre moyen de 9.300, et dont certains groupements alcool one éeé méehyléa (~ de substltutlon : environ 30Z en polds) .
Lorsque l'addition de méthylcellulose est réallsée en une seule fols, la quantité ajoutée est de préférence O,lg/litre environ. Cette addition peut se faire lorsque le germe est en phase de croissance exponentielle, ~énéralement après 24heures de culture.
Lorsque l'additlon est réalisée en plusieur rois, la quantité totale ajoutée est également, de préférence, 0,lg/litre.
On peu~ a~outer la solutlon de méthylcellulose en 4 fois, par exemple après 7 heures, 24 heures, 33 heures et 38 heures de culture.
L'évolutlon de la biomasse est appréciée par la mesure au cours du temps de la densite optlque à 650nm et par mesure de l'opacité à l'alde d'un standard OMS équivalent à 10 "opacity Units" par ml, une unité correspondant à
2C un milliard de germes/ml.
La teneur en antigènes toxlne pertussis et F-HA dans le surnag2ant est estlmée par un test ELISA à l'aide d'anticorps antl-F-HA et d'anticorps anti-toxine pertussls purlflés par lmmunoaffinlté à partir de sera hyperimmunises respectlvement de chèvre et d'âne.
La durée de culture dépend du developpement microbien et de l'expression dans le surnageant de culture de la toxlne pertussis et du F-HA.
Elle se situe entre 30 et 72 heures. et le plus souvent entre 40 et 45 heures.
Les exemples sulvants lllu~trent l'lnvention sans toutefois la limlter.
EXEMPLE L
Afln de mettre en évldence l'effet favorable de la composltion de mllieu de l'lnventlon sur le développement de B. pertussis en phase I et sur la productlon dans le milieu de culture des antigènes toxine pertussis et F-HA, on a réalisé une étude comparative des formules de milieu suivantes :
- mllieu de Stalner et Scholte modlflé (apport d'hydrolysat de caséine) ;
- mllieu A - milieu de Stalner et Scholte modiflé contenant la bêta-cyclodextrine à une concentratlon de 1,67g/litre ;
- mllleu de Stalner et Scholta modlfle conte~ant d- 18 bêta-- 6 - ~3~7~
2,6-dl-O-méthylcyc10dextrlne à la concentratlon flnale de 1,67g/lltre (mllleu d~fi~l par I~alzuml A., Su~uki Y., Ono S., Sato H. and Sato Y. (1983) J. Clin.
Mlcroblol., 17, n5, 781-786) ;
- ~ilieu B ~ identlque au mllleu A, avec en outre addltions ponctuelles de méthylcellulose ~ype A15 commerclallsée par la soclété
Colorcon, comme décrlt ci-dessus.
Ces mllleux ont été essayés en fermenteur de capacité utlle 30 litres avec B. pertussis en phase I souche TOHAMA.
Ces cultures ont éte réallsées dans des conditions de fermentation ldentlques (agltatlon, aération, pH, durée, etc... ) On a évalué à lntervalles réguliers la biomasse et la teneur en toxine pertussls et F-HA dans le surnageant.
Les résultats sont lndlqués dans le3 flgures 1, 2 et 3 ci-après.
La flgure I représente l'évolution dans le temps de la blomasse en fonction de la co~posi~ion du milleu de culture ;
La flgure 2 représente l'évolution dans le temp~ de la production de F-HA en fonctlon de la composltion du mllleu de culture ;
I.a flgure ~ représente ltévolutlon dans le temps de la productlon de toxlne pertussls en fonction de la composltion du milieu de culture.
A l'analyse des courbes obtenues 11 appara~t que :
I'addltion seule de bêta-cyclodextrlne au milleu de Stainer et ~cholte ne perme~ pas d'aug~enter la biomasse, nl la production des antlgènes toxlne pertussls et F-HA. Dans le mllleu et dans les condltlons de fermentatlon utillsées (avec agitation), 11 n'v a pas de productlon de F-HA
dans le milleu de culeure.
Par Contre, la su~stitutlon ce la bêta-cyclodextrine par son derivé
2,6- di-O-méthylé favorlse le développement mlcroblen et la production de toxlne pertussls et F-HA.
Enfin, le ~ilieu B (avec addltlon de méthylcellulose), aug~ente encore davantage la blo~asse et la productlon de toxine pertussls et de F-HA
dans le mllleu.
La souche TOHAMA est une souche déposée auprèq de la collectlon Instltute for Fer~entation, Osaka (Japon) sous le n IFO-14073.
Elle est en outre dlsponible auprès de la Japanese Federatlon of Culture Collections of Mlcroorganisms, Instltute of Metical Science, Unlverslty of Tokyo, Shiro~anedal-461, Mllato-ku, Tokyo 108 (Japon).
EXE~PLE 2 Afln d'évaluer l'lnfluence de différents dérlvés dc la celluloss sur le développement de la bio~as~e et sur l'expre~slon des antlgèn2~ eoxine pertus~is et F-HA dans le surnageant de culture, une sérle d'eY~aio d- cul~ure _ 7 _ 1 3 ~ 1 7 ~ ~
en erlen~ ont été réallsés.
A l'aide de deux ampoules de B. pertussls souche TOHA~A en phase I
lyophll~e-, on a ensemencé 8 tubes contenant le mllleu ~ollde de Bordet-Gen~ou. Après incubatlon pendant 68 heures à 36C, en a~mosphère humlde, chaque tube e~t reprls par envlron 25ml de milleu A tel que déflni à
l'exemple l (SS modlflé avec bêta-cyclodextrlne). La suspenslon de germes obtenue est utillsée pour ensemencer 4 erlens de 2 lltres contenant 500ml de mllleu A. Les erlens sont ml8 en lncubatlon pendant 24 heures à 36C sous agltatlon.
Les suspenslons bactérlennes sont réunles et le mélange sert à
ensemencer 18 erlens de 2 litres renfermant 450ml de mllleu A. Ils sont mls en incubatlon sous agitatlon pendant 48 heures. Au bout de 24 heures, chaque sérle de 2 erlens resolt 25ml d'une solutlon contenant 1,25g/lltre diun des dérivés de la cellulose indiqués dans le tableau I ci-après.
Après 42 heures de culture, la concentratlon en toxine pertussls et F-HA dans chaque mllieu testé est détermlnée par méthode immunoenzymatlque.
Les résultats sont regroupés dans le tableau I.
TABLEAU I
Dérivé de cellulose Tox. pertussls F-HA
a~outé au mllleu A unités ELISA/ml unltés ELISAIml I Témoins mllleu A seul 1~ 50 1 Methocel AL5 50 1560 Me~hocel A4C 25 825 ~lethocel A4M 25 325 Methocel E5 ~D 1100 Methocel El5 ~5 lS62 Methocel E4M 27 llO0 Carboxymethylcellulose type Akucel AF 2805 17 50 Les dérivés méthylés de la cellulose type méthocel Al5, A4C et A4M
co~mercialisés par la Société Colorcon, ont une influence trle~ favorable sur la productlon des antlgènes toxine pertussis et F-~A. La teneur en toxln-pertussls dans le mllleu de culture, après 42 heure~ de culture, eat 2 à 4 - 8 - 13117~3 fols plu~ éle~ée que celle obtenue avec le mllieu A et, en ce qul concerne la concentr-tio~ en F-HA, 6 à 30 fols plus forte. Dan9 les conditlons utlll~ées, lea ~-lll~ur~ rendements ont éeé obtenus avec la méthylcellulose type Al5.
L~ d~erivés carboxyméehylés ont un effet favorable sur l'expresslon S de 1~ toxlne pertuasls. La protuctlon de toxlne pertus~ly est cependant molns élevée qu~ celle obtenue à l'ald- de~ dérivés méthylés de la cellulose. Par contre, dans le~ conditlons étudlées, les dérivés carbo~yméthylés de la cellulose n'ont aucune lnfluence sur la productlon de F-HA.
EXE~PLE 3 Cet exemple décrlt le procédé de fermentation de la souche TOHAMA de Bordetella pertussis en phase I dans le mllieu B (SS modiflé +
bêta-cyclodextrlne + méthylcellulose), en fermenteur de volume utile de lO00 lltres. Le but de cette culture est de produlre dans le surnageant de culture des quantltés importantes d'antigènes toxlne pertussis et F-HA, compatlbles avec la réallsatlon à l'échelle ~ndustrlelle d'un vaccln antl-coquelucheux acellulalre composé des prlncipes actlfs hautement purlflés : anatoxlne pertussls et/ou F-HA.
Cette culture lndustrielle comprend les étapes suivantes :
2a PRECULTURE I
Des tubes contenant le mllleu sollde de Bordet Gengou sont ensemencés avec la souche TOHAMA de Bordetella pertussis en phase I.
Cinq ampoules lyophilisées, reprises chacune par I ml de milleu tryptlcase so~a sont utilisées pour ensemencer 30 tubes renfermant le mllieu de Bordet-Gengou. Les tubes sont placés à l'étuve à 36C sous atmosphère humlde pendant 60 heures.
Chaque tube est reprls par environ 25ml de mllleu A. Après contrôle de la pureté par l'essai de Gram, les suspenslons de germes récupérées sont mélangées. Le melange est utlllsé pour ensemencer 16 erlens de 2 lltre~
contenant chacun 400~1 de mllleu A. Chaque erlen reçoit envlron SOml du mélange de la suspenslon de germes. Les erlens sont mls en incubation à 36C
pendant 24 heures sous agltatlon type va et vlent.
Après examen de la pureté des erlens par l'essal de Gram et le contrôle de l'absence de développement de contamlnants sur les milleux de Bordet-Gengou, les suspen~lons bactérlennes des erlens sont réunles et la concentratlon en germes est estlmée par mesure de la denslté optique à 650nm.
Préculture 2 : D0650nm - I,80 corre~pontant à environ 40.109 ger~es/~l.
13~17~3 g PRECULTURE 3 : Stade préfermenteur~
D~ux fermenteurs renfermant 40 litres de milleu A sont ensemencés chacun ~-c 3,2 litres de la préculture précédente, pour avoir une suspenslon de gen~oo ~ltrant au molns lO9 germes/ml.
La culture est réalls~e à 36C, 90UB agitatlon mod~rée et sous aération pendant 24 heures.
En fln de fermentation, la puret~ est contrôlée par essal de Gram et la denslté de germes appréclée par la mesure de la denslté optlque à 650n~.
Après 24 heures d'lncubation le~ densités optlques mesurées sur chaque préfermeneeur étalent égale~ à 3,01 et 3,37, ce qui correspond à une concentratlon bactérlenne d'envlron 64-68.lO germes/ml.
CULTURE INDUSTRIELLE
La culture industrlelle a éte réallsée en fermenteur contenant lO00 lltres de mllieu B tel que déflni à l'exemple l. Ce fermenteur a été en~esencé
avec la préculture précédente La concentratlon en germes après ensemencement est de l'ordre de 5.lO germes/ml~
La culture est effectuée à 36C, sous agltatlon pendant 40 heures, avec aératlon.
En cours de fermentatlon, on a~oute en plusleurs fols une solutlon de méthylcellulose type Colorcon Al5, en fonction de l'évolutlon de la blomasse au cours du temps. Les addltions de méthylcellulose ont été
effectuées au bout de 7h, 24h et 32h de culture. Chaque addltlon conslstalt à
transférer dans le fermenteur 24 litres d'une solutlon de mllleu A contenant l,25g/litre de me~hylcellulose.
La culture est arrêtée à t ~ 40 heures.
Après refroldissement, la culture est lnactlvée par l'addltlon de merthiolate à la concentration finale de 0,01% (P/V), et centrlfugée en contlnu.
Le surnagean~ est clarlflé par flltratlon.
L'évolutlon de la blomasse alnsl que la teneur en an~lgènes (mesurée par un test ELISA) dans le surnageant de culture, au cours du temp~, sont résumées dans le tableau II cl-après.
- lo 1 ~1 1 7 ~ 3 TABLEAU II
T..p9 d- DO ~ __ 650 Concentraelon Teneur en F-HA Teneur en cultur- en 8er~esUnltés ELISA toxlne par ml p~r ml pertussi~
Unltés ELISA
par ml _ 9 t 0 0,3017,5.10 _ t 6h 0,7715.10 _ lQ t 22h 3,54 72.109 _ _ t 24h 4,10 90.10 450 240 t 30h 5,97 120.109 1800 480 . t 40h 8,20 170.10 2200 550 - 2 - 1 3 1 1 7 ~ 3 good reproducibility of the quallté de9 suspensions of germs obtained e ~
fln culture.
L- mllleu SS contlent essentlellement, in proportlons deflnles, the product ~ solvents: Sodium glutamate, L-prollne, sodium chloride, potasslum hydrogen phosphate, potassium chloride, chloride magnesium, calclum chloride, and trls-hydroxymethylamlnomethane, which are add the following products: L-cystlne, ferrous sulphate, ascorbic acid, glutathlon redult and niaclne.
In a modified SS medium, we also have a solution of casamino acids or corresponding peptides.
Toutefols, the mllieu SS does not allow the expression of antigens already cieées in sufficient quantity compatible with industrial development.
In addition, with this milleu llqulde, the F-HA antigen can only be produced when the culture is carried out under statistical conditions.
Bour produces pertussls toxlne and F-HA in a llqulde medium aglté, Imaizumi ee al., J. Clln. Microbiol., L7, n5, 781-786 (1983), have define a modified Stainer and Scholte medium in which they have methylated derivative of beta-cyclodextrin. This cyclic polysaccharide, also called Heptakis (2,6-O-dlmethyl) beta-cyclodextrin, increased in the biomass and the production of pertussis toxin and F-HA.
Toutefols, the use of this methylated beta-cyclo- derivative dextrin raises economic problems, due to the stage of preparation of the methylated positlon 2.6, from beta-cyclo-dextrin, by enzymatic reaction.
One of the objects of the present invention is a composition of ml11eu of culture based on chemically defined compounds, capable of promoting the development of bacteria of the genus Bordetella, and in particular of promote the multiple production of toxin pertussis and F-HA antigens with high yield This new culture mllleu per ~ and avoid employment expensive ethereal cyclodextrin derivatives.
It has now been discovered that the etherified derivatives of polymers of D-glucose of molecular mass per molns equal to 2000 have no effect on the production of toxin pertussls, nor on the production of F-HA, and even The growth of cultures of bacteria of the genus Bordetella, unhealthy that, surprisingly, these etherified derivatives, when they are associated with cyclodextrlne or its derivatives, promote microblen development and / or simultaneous production of toxin pertussls and F-HA with a yield Student.
The invention therefore ob ~ and a new composielon medium culture of bacteria belonging to 8enre Bordetella, including ~ 3 ~ 1 3 1 1 7 ~ ~
lngrédlent3 basic necessary for this culture, alnsl that a cyclodextrlne or ses t ~ rl ~ -, characterized by the falt that ladlte composltlon contlent further au ~ ol ~ - u ~ etherlflé puff of a poly ~ era of D-glucose whose mass mol ~ cul ~ lr- ~ -t at molns equal to 2000.
D-glucose polymers from which ethereal products are derived utlllsés according to the inventlon are polymers ~ whose D-glucose motlfs are reunited by an alpha llalson as in amylo ~ e, or by a beta llalson co ~ me in the cellulo ~ e.
Parml ether derivatives ~ flés of polymers of D-glucose, we will clter in particular the etherified cells of the cellulo in which a part of the hydroxyl groups are etherified by lower alkyl groups or hydroxy-alkyl lnferleur. Among the etherified cellulose derivatives are:
will cite in partlculler ~ ethylcellulose, hydroxypropyl methylcellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxybutyl methylcellulose etc ...; all these prodults are co ~ merclal produles sold in particular by Dow flrmes Chemlcal, Colorcon, ~ nlon Carblde Corporatlon and Hercules Inc. On cltera also the carboxymethylcellulose which is equal ~ ent a commercial product, sold in particular by the firms Hercules Inc. or EI du Pont de Nemours. Parml the other etherified derivatives of D-glucose polymers, we will also clter corresponding derivatives of amldon, and in particular of amylose.
The upper limlte of the ~ olecular weight of etherlfied derivatives of polymers of D-glucose is not decisive Preferably, we choose the etherified so that the weight ~ olecular and the degree of substltutlon are such that the derivative of the concentrates used is soluble in the water. Generally the culture medium of the invention contains from 0.01 to 2g / lltre of the ethereal derivative ~ the polymer of D-glucose, and preferably of 0.05 to O, Sg / liter.
The etherlfied drop can be a ~ out in the mllleu in several fols, g ~ n ~ ralemene from 2 to 6 fols; we have ~ out for example each time from 0.01 to lg / lltre tudlt derlve Cyclodextrin (or one of its derivatives) is present in the mllleu of culture of lnventlon with ralson from 0.5 to 5g / lt, preferably of 1 to 2g / liter.
The cyclodextrlne can be the alpha-cyclodextrlne, the beta-cyclodextrin or gamma-cyclodextrlne. Cyclodextrlne derivatives are especially etherlflé bouts.
The lnventlon also has ob ~ and the utillsatlon of derivatives etherified from polymers of D-glucose, as defined above, in assoclatlon with cyclodextrlne or ~ es dedlvés, in the culture of bacteria of the genus Bordetella, and partlculler in culture er. milleu aglté of _ 4 _ ~ 3 ~ 1 7 ~ ~
Bordetella pertussis, to promote 9 culture crols and / or the expr ~ aion dea ~ ntlgene ~ toxioe p ~ rtus ~ l ~ and F-HA.
In ~ ention has partlculler for obJet a method of growing bacteria ~ you genrc Borde ~ ella, with the alde of the compooltlon of mllleu te culture declte above ~ sus. This process, which consl ~ te to cultivate bacterial legdltes in a suitable culture medium, the culture medium containing a cyclodextrlne or its délvé4, is characterized by the falt which one has ~ oute to said culture medium at least one etherified derivative of D-glucose polymer, as defined above ~
lQ etherlflé ledlt of D-glucose polymer can be added in only one fols at the start of cultivation, or in addition their fol ~, as indicated previously, so as to use from 0.05 to 2 g / l, and preferably from 0.05 at 0.5 g / liter, of said derivative ~
We describe below a particular mode of execution of the lS the invention, in stirred liquid mllleu.
Among the basic culture media which can be used in the the invention, we will cite in particular a milleu SS modiflé having the compositlon next (for I liter):
- sodluml glutamaee0 ~ 72 g 2 ~ - L-proline 0.24 g - KH2PO4 0.50 g - KCl 0.20 g g 2 '2 O, l0 g - CaC12 0.02 g - Trlst 6, l0 g - Casamlno acldes l0.00 g - ~ aCl 2.50 g - L-cystlne 40.00mg 4 '2 l0.00mg - Ascorbic acid 20.00mg - Reduced glutathlon l00.00mg - ~ iaclne 4.00mg or corresponding peptides prepared by enzymatic hydrolysis of caselene.
We ef ~ eceue the precultures dan ~ the SS mllleu modif1é containing or not a cyclodextrlne.
The properly dlte culeuse is made by seeding a fermenter with a germ concentration of around 10 or 10 germs / ml. The concentration of germs is evaluated by reading the density.
4Q optlque en anRlyse qpectrophoeométrlque à 650n ~.
~ it (trademark) 5 13 ~ 17 ~ 3 The culture medium in the fermenter is the modified SS mllleu tale ~ nt un- cyclodextrlne at a concentration of 1.7g / liter.
Cultivation is carried out at 35-37C, preferably at 36C.
Oo operates in an agle environment with aeratlon.
The etherified derivative of D-glucose polymer used is lcl a celullose with an average molecular weight of 9,300, some of which alcohol groups one éeé méhyléa (~ of substltutlon: approximately 30Z in polds).
When the addition of methylcellulose is combined in one However, the amount added is preferably about 0.1 g / liter. This addition can be done when the germ is in exponential growth phase, ~ generally after 24 hours of culture.
When the additlon is carried out in several kings, the total quantity added is also preferably 0.1 lg / liter.
We can ~ a ~ outer the methylcellulose solutlon in 4 times, by example after 7 hours, 24 hours, 33 hours and 38 hours of culture.
The evolution of the biomass is assessed by the measurement during the optic density time at 650nm and by measuring the alde opacity of a WHO standard equivalent to 10 "opacity Units" per ml, one unit corresponding to 2C one billion germs / ml.
The content of pertussis toxin and F-HA antigens in the supernatant is estlmée by an ELISA test using anti-F-HA antibodies and antibodies anti-toxin pertussls purlflé by lmmunoaffinlté from sera respectly hyperimmunized goat and donkey.
The duration of culture depends on microbial development and expression in the culture supernatant of toxin pertussis and F-HA.
It is between 30 and 72 hours. and most often between 40 and 45 hours.
The following examples lllu ~ trent lnvention without however the limlter.
EXAMPLE L
In order to highlight the favorable effect of the composition of mllieu de lnventlon on the development of B. pertussis in phase I and on the production in the culture medium of pertussis toxin antigens and F-HA, we carried out a comparative study of the following medium formulas:
- mllieu de Stalner et Scholte modlflé (addition of hydrolyzate of casein);
- mllieu A - modified Stalner and Scholte medium containing the beta-cyclodextrin at a concentration of 1.67 g / liter;
- mllleu of Stalner and Scholta modlfle story ~ ant d- 18 beta-- 6 - ~ 3 ~ 7 ~
2,6-dl-O-methylcyc10dextract to the final concentration of 1.67 g / l (ml d ~ fi ~ l by I ~ alzuml A., Su ~ uki Y., Ono S., Sato H. and Sato Y. (1983) J. Clin.
Mlcroblol., 17, n5, 781-786);
- ~ ilieu B ~ identlque au mllleu A, with further addltions methylcellulose punctuals ~ ype A15 traded by the company Colorcon, as shown above.
These mllleux were tested in fermenter of capacity utlle 30 liters with B. pertussis in phase I TOHAMA strain.
These cultures were grown under fermentation conditions ldentlques (agltatlon, aeration, pH, duration, etc ...) Biomass and carbon content were assessed at regular intervals pertussls toxin and F-HA in the supernatant.
The results are shown in Figures 3, 1 and 2 below.
The figure I represents the evolution over time of the blomass in function of the co ~ posi ~ ion of the milleu of culture;
Figure 2 represents the evolution over time of the production of F-HA according to the composition of the culture medium;
Ia flgure ~ represents ltévolutlon in time of productlon toxlne pertussls depending on the composition of the culture medium.
Upon analysis of the curves obtained 11 it appears that:
The only addition of beta-cyclodextract to the mill of Stainer and ~ cholte does not perish ~ no increase ~ enter the biomass, nl the production of antigen toxlne pertussls and F-HA. In the mllleu and in the condltlons of fermentatlon used (with agitation), 11 has no F-HA productlon in the middle of the culeure.
On the other hand, the su ~ stitutlon this beta-cyclodextrin by its derivative 2,6- di-O-methylated promotes mlcroblen development and the production of toxlne pertussls and F-HA.
Finally, the ~ ilieu B (with addltlon of methylcellulose), aug ~ ente even more the blo ~ asse and the productlon of toxin pertussls and F-HA
in the mllleu.
The TOHAMA strain is a strain deposited with the collectlon Instltute for Fer ~ entation, Osaka (Japan) under the number IFO-14073.
It is also available from the Japanese Federatlon of Culture Collections of Mlcroorganisms, Instltute of Metical Science, Unlverslty of Tokyo, Shiro ~ anedal-461, Mllato-ku, Tokyo 108 (Japan).
EXE ~ PLE 2 To assess the influence of different cellulosic products on the development of bio ~ as ~ e and on the expression ~ slon of antlgèn2 ~ eoxine pertus ~ is and F-HA in the culture supernatant, a serle of eY ~ aio d- cul ~ ure _ 7 _ 1 3 ~ 1 7 ~ ~
en erlen ~ were reallés.
Using two ampoules of B. pertussls strain TOHA ~ A in phase I
lyophll ~ e-, we seeded 8 tubes containing the mllleu ~ ollde Bordet-Gen ~ or. After incubation for 68 hours at 36C, in a ~ mosphere humlde, each tube e ~ t reprls by about 25ml of milleu A as defined in example l (SS modlflé with beta-cyclodextrlne). The suspense of germs obtained is used to seed 4 erlens of 2 liters containing 500ml of mllleu A. The erlens are ml8 in lncubatlon for 24 hours at 36C under agltatlon.
The bacterial suspenslons are combined and the mixture is used to inoculate 18 erlens of 2 liters containing 450ml of mllleu A. They are mls in incubation under agitation for 48 hours. After 24 hours, each serl of 2 erlens resolt 25ml of a solutlon containing 1.25g / liter of one cellulose derivatives indicated in Table I below.
After 42 hours of culture, the toxin concentration pertussls and F-HA in each medium tested is determined by enzyme immunoassay.
The results are collated in Table I.
TABLE I
Cellulose derivative Tox. pertussls F-HA
a ~ outé au mllleu A ELISA units / ml ELISAIml I Witnesses mllleu Alone 1 ~ 50 1 Methocel AL5 50 1560 Me ~ hocel A4C 25 825 ~ lethocel A4M 25 325 Methocel E5 ~ D 1100 Methocel El5 ~ 5 lS62 Methocel E4M 27 llO0 Carboxymethylcellulose type Akucel AF 2805 17 50 Methylated derivatives of methocel-type cellulose Al5, A4C and A4M
co-marketed by Colorcon, have a very favorable influence on the production of pertussis toxin and F- ~ A antigens. The toxln- content pertussls in the culture mllleu, after 42 hours of culture ~ eat 2 to 4 - 8 - 13117 ~ 3 fols plu ~ éle ~ ée than that obtained with the mllieu A and, as far as the concentr-tio ~ in F-HA, 6 to 30 times stronger. Dan9 conditlons utlll ~ ées, lea ~ -lll ~ ur ~ yields have been obtained with methylcellulose type Al5.
Carboxymethyl derivatives have a favorable effect on expression S of 1 ~ toxlne pertuasls. The toxlne pertus ~ ly protuctlon is however molns higher than that obtained with ald- from ~ methylated derivatives of cellulose. By against, in the ~ conditlons studied, the carbo-ymethylated derivatives of the cellulose have no influence on the production of F-HA.
EXE ~ PLE 3 This example describes the fermentation process of the TOHAMA strain of Bordetella pertussis in phase I in mllieu B (modified SS +
beta-cyclodextrlne + methylcellulose), in a fermenter with a useful volume of 10 000 ltres. The purpose of this culture is to produce in the culture supernatant significant amounts of pertussis toxin and F-HA antigens, compatible with reallsatlon on the scale ~ ndustrlelle of an anti-pertussis vaccln acellulalre composed of highly purlflated active principles: toxoid pertussls and / or F-HA.
This industrial culture includes the following stages:
2a PRECULTURE I
Tubes containing Bordet Gengou's mllleu sollde are seeded with the TOHAMA strain of Bordetella pertussis in phase I.
Five freeze-dried vials, each taken up by I ml of milleu tryptlcase so ~ a are used to inoculate 30 tubes containing the mllieu from Bordet-Gengou. The tubes are placed in an oven at 36C in an atmosphere humlde for 60 hours.
Each tube is represented by approximately 25ml of mlAleu A. After control of purity by the Gram test, the suspenslons of germs recovered are mixed. The mixture is used to seed 16 erlens of 2 liters ~
each containing 400 ~ 1 of mllleu A. Each erlen receives envlron SOml of mixture of suspenslon of germs. Erlens are mls in incubation at 36C
for 24 hours under type agltatlon goes and flies.
After examining the purity of the Erlenmegs by the Gram test and the control of the absence of development of contaminants on the thousands of Bordet-Gengou, the suspens ~ lons bactérlennes des erlens are reunited and the germ concentration is estimated by measuring the optical density at 650nm.
Preculture 2: D0650nm - I, 80 corre ~ bridging at around 40.109 ger ~ es / ~ l.
13 ~ 17 ~ 3 g PRECULTURE 3: Prefermenter stage ~
Two fermenters containing 40 liters of milleu A are sown each ~ -c 3.2 liters of the previous preculture, to have a suspenslon of gen ~ oo ~ ltrant in molns l9 germs / ml.
The culture is reall ~ e to 36C, 90UB agitatlon mod ~ rée and under aeration for 24 hours.
At the end of fermentation, the purity is checked by Gram test and the density of germs appreciated by the measurement of the density optlque at 650n ~.
After 24 hours of incubation the ~ optical densities measured on each prefermeneer spread out equal to 3.01 and 3.37, which corresponds to a bacterial concentration of around 64-68.10 bacteria / ml.
INDUSTRIAL CULTURE
Industrial culture was carried out in a fermenter containing l00 lltres of mllieu B as defined in example l. This fermenter has been ~ esencé
with the previous preculture The concentration of germs after sowing is of the order of 5.10 germs / ml ~
The culture is carried out at 36C, under agltatlon for 40 hours, with aeratlon.
During fermentatlon, we have ~ in addition to their solutlon Colorcon Al5 methylcellulose, depending on the evolution of the blomass over time. Additions of methylcellulose have been carried out after 7 hours, 24 hours and 32 hours of culture. Each addltlon conslstalt to transfer to the fermenter 24 liters of a solution of ml A containing l, 25g / liter of me ~ hylcellulose.
The culture is stopped at t ~ 40 hours.
After cooling, the culture is activated by the addition of merthiolate at a final concentration of 0.01% (W / V), and centrlfugée en contlnu.
The supernatant ~ is clarlflé by flltratlon.
The evolution of blomasse alnsl as the content of an ~ genes (measured by an ELISA test) in the culture supernatant, during temp ~, are summarized in Table II cl below.
- lo 1 ~ 1 1 7 ~ 3 TABLE II
T..p9 d- DO ~ __ 650 Concentraelon F-HA content cultur- en 8er ~ esUnltés ELISA toxlne per ml p ~ r ml pertussi ~
ELISA
per ml _ 9 t 0 0.3017.5.10 _ t 6h 0.7715.10 _ lQ t 22h 3.54 72.109 _ _ t 24h 4.10 90.10 450 240 t 30h 5.97 120.109 1800 480 . t 40h 8.20 170.10 2200 550