RU2769434C1

RU2769434C1 - Method for isolation of acinetobacter baylyi bacteria from river water

Info

Publication number: RU2769434C1
Application number: RU2021130073A
Authority: RU
Inventors: Евгений Петрович Сиволодский
Original assignee: Евгений Петрович Сиволодский
Priority date: 2021-10-14
Filing date: 2021-10-14
Publication date: 2022-03-31

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology. A method for isolating Acinetobacter baylyi bacteria from river water is proposed, which involves inoculation of the test material into a liquid selective synthetic nutrient medium containing L-phenylalanine (CAS 63-91-2), ethanol, NaCl, Na₂SO₄, MgSO₄, KH₂PO₄, K₂HPO₄ and distilled water in the specified ratios. Incubation is carried out under aerobic conditions at 28°C for 48 hours, followed by transfer to a dense selective nutrient medium of the same composition, additionally containing agar, and incubation at 28°C under aerobic conditions for 48 hours. Then, species identification of bacterial isolates is carried out according to phenotypic traits.

EFFECT: invention makes it possible to increase the selectivity of Acinetobacter baylyi bacteria isolation from the external environment.

1 cl, 2 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии. Может быть использовано при бактериологических исследованиях по выделению из внешней среды (рек) бактерий Acinetobacter baylyi для поиска биоремедиаторов загрязнений природной среды, а также при производстве питательных сред для выделения этих бактерий.The invention relates to the field of biotechnology. It can be used in bacteriological studies to isolate Acinetobacter baylyi bacteria from the environment (rivers) to search for bioremediators of environmental pollution, as well as in the production of nutrient media for the isolation of these bacteria.

Способы селективного выделения бактерий A. baylyi из объектов внешней среды не известны. Бактерии A. baylyi были впервые выделены совместно с шестью другими новыми видами рода Acinetobacter в 2003 году в Австралии из активированного ила, однако методика их выделения в статье не сообщается (Carr E.L., Kampfer P., Patel В.K.С., Gurtler V., Seviour R.J. Seven novel spesies of Acinetobacter isolated from activated sludge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, Vol. 53, No 4, p. 953-963; DOI 10.1099/ijs.0.02486-0).Methods for the selective isolation of A. baylyi bacteria from environmental objects are not known. A. baylyi bacteria were first isolated together with six other new species of the genus Acinetobacter in 2003 in Australia from activated sludge, but the method of their isolation is not reported in the article (Carr E.L., Kampfer P., Patel B.K.C., Gurtler V ., Seviour, R. J., Seven novel spesies of Acinetobacter isolated from activated sludge, Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, Vol. 53, No 4, p. 953-963; DOI 10.1099/ijs.0.02486-0).

Известен способ выделения и идентификации бактерий рода Acinetobacter с использованием синтетической этанол-аммонийной среды ЭАС (Определение грамотрицательных потенциально патогенных бактерий - возбудителей внутрибольничных инфекций. Методические рекомендации. По состоянию на 2014 год. Утверждены зам.Министра здравоохранения СССР К.И. Акуловым 3.06. 1986 года). Отбор проб патологического материала производят в 10 мл стерильной жидкой накопительной среды ЭАС-1, используя для смывов эту же среду. Затем посевы на среде ЭАС-1 выдерживают при 30°С в течение 48 ч. При появлении на поверхности среды бесцветной пленки пересевают материал с пленки на 2-4 сектора плотной среды ЭАС-2 и инкубируют при 30°С 24 ч; при отсутствии роста посевы оставляют еще на 24 ч. На среде ЭАС-2 колонии A. calcoaceticus оранжевые, иногда желтые, средних размеров, выпуклые, с ровными краями; колонии A. lwoffii бледно-зеленые, мелкие, выпуклые. Для идентификации снимают 2-3 колонии и проводят по тестам в соответствии с идентификацией неферментирующих бактерий. Примечание к способу. Питательные среды. Этанол-аммонийная среда жидкая (ЭАС-1). К 100 мл дистиллированной воды добавляют фосфат натрий-аммоний 0,15 г; фосфат калия однозамещенный 0,04 г; сульфат калия 0,02; хлорид магния 0,02 г. После стерилизации при 0,5 атм в течение 15 мин прибавляют 1,2 мл этилового 96-градусного спирта и разливают асептично по 10 мл в пробирки. Этанол-аммонийная среда плотная (ЭАС-2). Основной состав среды тот же, но до стерилизации добавляют 1,5 г агара (порошкового 1,8 г) и 0,5 мл 1,6-процентного щелочного раствора бромтимолового синего. По нашим данным изучения среды ЭАС-2 на ней растут бактерии многих видов ацинетобактеров (A. baumannii, A. pittii, A. nosocomialis, A. baylyi, A. johnsonii и другие), а также бактерии Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, отсутствует рост прочих видов энтеробактерий, неферментирующих и грамположительных бактерий.A known method for the isolation and identification of bacteria of the genus Acinetobacter using synthetic ethanol-ammonium environment EAS (Determination of gram-negative potentially pathogenic bacteria - pathogens of nosocomial infections. Methodological recommendations. As of 2014. Approved by Deputy Minister of Health of the USSR K.I. Akulov 3.06. 1986 of the year). Sampling of pathological material is carried out in 10 ml of sterile liquid storage medium EAS-1, using the same medium for washings. Then the inoculations on the EAS-1 medium are kept at 30°C for 48 hours. When a colorless film appears on the surface of the medium, the material is inoculated from the film into 2-4 sectors of the dense EAS-2 medium and incubated at 30°C for 24 hours; in the absence of growth, the inoculations are left for another 24 hours. On the EAS-2 medium, the colonies of A. calcoaceticus are orange, sometimes yellow, medium in size, convex, with smooth edges; colonies of A. lwoffii are pale green, small, convex. For identification, 2-3 colonies are removed and carried out according to tests in accordance with the identification of non-fermenting bacteria. Note on the method. nutrient media. Liquid ethanol-ammonium medium (EAS-1). Sodium ammonium phosphate 0.15 g is added to 100 ml of distilled water; potassium phosphate monosubstituted 0.04 g; potassium sulfate 0.02; magnesium chloride 0.02 g. After sterilization at 0.5 atm for 15 minutes, add 1.2 ml of ethyl 96-degree alcohol and pour aseptically 10 ml into test tubes. Ethanol-ammonium medium dense (EAS-2). The main composition of the medium is the same, but 1.5 g of agar (powder 1.8 g) and 0.5 ml of a 1.6% alkaline solution of bromthymol blue are added before sterilization. According to our data on the study of the EAS-2 medium, bacteria of many species of Acinetobacter (A. baumannii, A. pittii, A. nosocomialis, A. baylyi, A. johnsonii, and others) grow on it, as well as the bacteria Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, there is no growth of other types of enterobacteria, non-fermentative and gram-positive bacteria.

Известен способ выделения бактерий рода Acinetobacter из естественных почвенных и водных экосистем с использованием метода обогащения в минимальной минеральной среде с добавлением 0,1% (мас./об.) ацетата натрия, как единственного источника углерода (Krizova L., Maixnerova М., Sedo О., Nemec A. Acinetobacter albensis sp. nov., isolated from natural soil and water ecosystems. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2015. Vol. 65, No 11. P. 3905-3912; doi 10.1099/ijsem.0.000511).A known method of isolation of bacteria of the genus Acinetobacter from natural soil and water ecosystems using the method of enrichment in a minimum mineral environment with the addition of 0.1% (w/v) sodium acetate as the only source of carbon (Krizova L., Maixnerova M., Sedo O., Nemec A. Acinetobacter albensis sp. nov., isolated from natural soil and water ecosystems, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2015, Vol. 65, No 11, P. 3905-3912; doi 10.1099/ijsem .0.000511).

Известен также способ выделения и идентификации бактерий комплекса Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii (комплекса ACB) с применением селективной синтетической питательной среды «Ацинетобактер фенилаланин агар» (Сиволодский Е.П., Горелова Г.В., Богословская С.П., Зуева Е.В. Селективная синтетическая питательная среда «Ацинетобактер фенилаланин агар» для выделения и идентификации бактерий комплекса Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii // Инфекция и иммунитет. 2020. Т. 10, №3. С. 591-596. doi: 10.15789/2020-7619-ASS-1177). Селективность этой среды обусловлена трофической селекцией ацинетобактеров L-фенилаланином в качестве единственного источника углерода и азота, а также дополнительной селекцией триметопримом. Состав питательной среды: L-фенилаланин (СAS No 63-91-2) 2,0-3,0 г; триметоприм 0,006-0,01 г; диметилсульфоксид 6-10 мл; NaCl 5,0 г; Na₂SO₄ 2,0 г; KН₂РO₄ 1,0 г; K₂НРO₄ 2,5 г; MgSO₄ 0,1 г; агар 15,0 г; вода дистиллированная 1 л; рН 7,2±0,2. Приготовление: в 1 л дистиллированной воды вносят все ингредиенты, кроме триметоприма, растворяют при нагревании, кипятят 5 мин, добавляют триметоприм (6 мл 0,1% раствора в диметилсульфоксиде), проверяют рН 7,2; разливают в чашки Петри. Для контроля среды используют клинические штаммы A. baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella oxytoca. Методика применения. Исследуемый материал, например, отделяемое ран засевают бактериологической петлей на поверхность сектора селективной среды (1/4 часть чашки Петри); для количественного изучения используют по 100 мкл соответствующего разведения материала (мочи) и растирают шпателем по всей поверхности среды в чашке. Посевы инкубируют аэробно при 37°С в течение 18-24 ч. Затем определяют принадлежность бактерий к ацинетобактерам комплекса АСВ по наличию характерных колоний диаметром 1-2 мм, круглых, выпуклых, с ровными краями, светло-серых, непрозрачных. Контрольную проверку бактерий из колоний или газона бактерий проводят тестом на цитохромоксидазу (в течение 20 с) и экспрессным (1 ч) определением окисления и ферментации глюкозы (ОФ-тест) пероксидводородным микрообъемным методом. Ацинетобактеры комплекса АСВ оксидазоотрицательные, не ферментируют, но окисляют глюкозу в течение 1 ч. Иногда на селективной среде наблюдается очень подавленный рост синегнойной палочки: мелкоточечные колонии менее 0,1 мм, окруженные прозрачной пленкой, оксидазоположительные. Очень редко наблюдается подавленный рост клебсиелл: мелкие колонии 0,1 мм, выпуклые, оксидазоотрицательные, ферментируют глюкозу в течение 1 ч. Дальнейшую видовую идентификацию проводят по комплексу фенотипических признаков или методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. При изучении 400 проб клинического материала были выделены на селективной среде ацинетобактеры комплекса АСВ в 26 пробах (18 проб в монокультуре, в 8 пробах в ассоцациях с синегнойной палочкой и клебсиеллами); традиционным методом были выделены бактерии комплекса АСВ в 20 пробах (7 проб в монокультуре, в 13 пробах в ассоциациях с другими видами бактерий). Из 26 штаммов ацинетобактеров, выделенных на селективной среде, 25 относились комплексу АСВ (A. baumannii-23, A. pittii-2 штамма), 1 штамм A. baylyi не относился к видам комплекса АСВ.There is also known a method for isolating and identifying bacteria of the Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex (ACB complex) using a selective synthetic nutrient medium "Acinetobacter phenylalanine agar" (Sivolodsky E.P., Gorelova G.V., Bogoslovskaya S.P., Zueva E. B. Selective synthetic nutrient medium "Acinetobacter phenylalanine agar" for the isolation and identification of bacteria of the Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex // Infection and Immunity. 2020. V. 10, No. 3. P. 591-596. doi: 10.15789/2020-7619 -ASS-1177). The selectivity of this medium is due to the trophic selection of Acinetobacter by L-phenylalanine as the sole source of carbon and nitrogen, as well as additional selection by trimethoprim. The composition of the nutrient medium: L-phenylalanine (CAS No 63-91-2) 2.0-3.0 g; trimethoprim 0.006-0.01 g; dimethyl sulfoxide 6-10 ml; NaCl 5.0 g; Na ₂ SO ₄ 2.0 g; KH ₂ RO ₄ 1.0 g; K ₂ HPO ₄ 2.5 g; MgSO ₄ 0.1 g; agar 15.0 g; distilled water 1 l; pH 7.2±0.2. Preparation: add all ingredients except trimethoprim to 1 liter of distilled water, dissolve when heated, boil for 5 minutes, add trimethoprim (6 ml of 0.1% solution in dimethyl sulfoxide), check pH 7.2; poured into Petri dishes. To control the environment, clinical strains of A. baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella oxytoca are used. Method of application. The studied material, for example, wound discharge, is inoculated with a bacteriological loop on the surface of the sector of the selective medium (1/4 of a Petri dish); for quantitative study, 100 µl of the appropriate dilution of the material (urine) is used and rubbed with a spatula over the entire surface of the medium in the cup. The inoculations are incubated aerobically at 37°C for 18-24 hours. Then the bacteria are determined to belong to the Acinetobacter of the DIA complex by the presence of characteristic colonies 1-2 mm in diameter, round, convex, with smooth edges, light gray, opaque. A control check of bacteria from colonies or a lawn of bacteria is carried out by a test for cytochrome oxidase (for 20 s) and an express (1 h) determination of oxidation and fermentation of glucose (RP-test) by the hydrogen peroxide microvolume method. Acinetobacter of the ASV complex is oxidase-negative, does not ferment, but oxidizes glucose for 1 hour. Sometimes a very suppressed growth of Pseudomonas aeruginosa is observed on a selective medium: small-dotted colonies less than 0.1 mm, surrounded by a transparent film, oxidase-positive. Suppressed growth of Klebsiella is very rarely observed: small colonies 0.1 mm, convex, oxidase-negative, ferment glucose for 1 hour. Further species identification is carried out by a complex of phenotypic characters or by MALDI-TOF mass spectrometry. When studying 400 samples of clinical material, Acinetobacter of the ASV complex was isolated on a selective medium in 26 samples (18 samples in monoculture, in 8 samples in association with Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella); Bacteria of the ASV complex were isolated by the traditional method in 20 samples (7 samples in monoculture, in 13 samples in associations with other bacterial species). Of the 26 Acinetobacter strains isolated on the selective medium, 25 belonged to the ASV complex (A. baumannii-23, A. pittii-2 strains), 1 strain of A. baylyi did not belong to the species of the ASV complex.

Прототипом заявляемого способа нами избран способ выделения и идентификации бактерий рода Acinetobacter с использованием синтетической этанол-аммонийной среды ЭАС (Определение грамотрицательных потенциально патогенных бактерий - возбудителей внутрибольничных инфекций. Методические рекомендации. По состоянию на 2014 г. Утверждены зам. Министра здравоохранения СССР К.И. Акуловым 3.06.1986 года), так как он имеет больше совпадающих существенных признаков, чем другие аналоги.As a prototype of the proposed method, we have chosen a method for isolating and identifying bacteria of the genus Acinetobacter using synthetic ethanol-ammonium environment EAS (Determination of gram-negative potentially pathogenic bacteria - pathogens of nosocomial infections. Methodological recommendations. As of 2014, approved by the Deputy Minister of Health of the USSR K.I. Akulov on June 3, 1986), since it has more matching essential features than other analogues.

Недостатком прототипного способа с использованием синтетическоо этанол-аммонийной среды является слабая видовая селективность питательной среды для вида Acinetobacter baylyi, вследствие чего на этой среде растут бактерии многих видов ацинетобактеров (A. baumannii, A. nosocomialis, A. pittii, A. lwoffii, A. johnsonii), а также других родов бактерий (Pseudomonas, Klebsiella).The disadvantage of the prototype method using synthetic ethanol-ammonium medium is the weak species selectivity of the nutrient medium for the species Acinetobacter baylyi, as a result of which bacteria of many species of Acinetobacter grow on this medium (A. baumannii, A. nosocomialis, A. pittii, A. lwoffii, A. johnsonii), as well as other genera of bacteria (Pseudomonas, Klebsiella).

Целью изобретения является повышение селективности способа выделения бактерий вида A. baylyi из объектов внешней среды (речной воды). Повышение селективности исследования состоит в достижении роста на селективной среде заявляемого способа преимущественно бактерий вида А. baylyi.The aim of the invention is to increase the selectivity of the method for isolating bacteria of the species A. baylyi from environmental objects (river water). Increasing the selectivity of the study is to achieve growth on the selective medium of the proposed method, predominantly bacteria of the species A. baylyi.

В соответствии с изобретением решение указанной технической задачи достигается тем, что исследуемый материал засевают в жидкую питательную среду, содержащую в качестве единственного источника азота L-фенилаланин (СAS No 63-91-2), источника углерода этанол, минеральные соли NaCl, Na₂SO₄, MgSO₄, KН₂РO₄, K₂НРO₄, дистиллированную воду при следующем содержании ингредиентов: L-фенилаланин 2,0-3,0 г; этанол 96-градусный 4-6 мл; NaCl 5,0 г; Na₂SO₄ 2,0 г; MgSO₄ 0,1 г; KН₂РO₄ 1,0 г; K₂НРO₄ 2,5 г; вода дистиллированная 1 л; рН 7,2±0,2; плотная питательная среда этого же состава имеет дополнительно агар 15,0 г; при этом все ингредиенты, кроме этанола, растворяют при нагревании, кипятят в течение 5 мин, затем добавляют этанол в расчетном количестве в горячую среду, проверяют рН, разливают в стерильные флаконы и чашки Петри; посевы в жидкой среде инкубируют при 28°С в аэробных условиях в течение 48 ч; пересевают обогащенный материал из флаконов петлей на плотную среду этого же состава и выращивают при 28°С в аэробных условиях в течение 48 ч, затем пересевают изолированные колонии на секторы питательного агара, инкубируют при 28°С в течение 24 ч с последующей идентификацией бактерий A. baylyi по фенотипическим признакам. Примечание: бактериологический контроль качества питательной среды заявляемого способа проводят при изготовлении среды; суточные бульонные культуры контрольных штаммов A.baylyi (позитивный контроль) и P. aeruginosa АТСС 27853, E.coli АТСС 25922 (отрицательный контроль) засевают по одной петле радиальным штрихом на поверхность плотной среды в чашке Петри, инкубируют аэробно при 28°С в течение 24 ч, учитывают результат - питательная среда пригодна к использованию, если имеется рост бактерий A. baylyi и нет роста P. aeruginosa АТСС 27853, Е. coli АТСС 25922. Срок хранения готовых сред 15 суток при температуре от 4°С до 8°С.In accordance with the invention, the solution of this technical problem is achieved by inoculating the test material into a liquid nutrient medium containing L-phenylalanine (CAS No 63-91-2) as the only source of nitrogen, ethanol, mineral salts NaCl, Na ₂ SO ₄ , MgSO ₄ , KH ₂ PO ₄ , K ₂ HPO ₄ , distilled water with the following content of ingredients: L-phenylalanine 2.0-3.0 g; ethanol 96-degree 4-6 ml; NaCl 5.0 g; Na ₂ SO ₄ 2.0 g; MgSO ₄ 0.1 g; KH ₂ RO ₄ 1.0 g; K ₂ HPO ₄ 2.5 g; distilled water 1 l; pH 7.2±0.2; a dense nutrient medium of the same composition has an additional agar of 15.0 g; at the same time, all ingredients, except ethanol, are dissolved when heated, boiled for 5 minutes, then ethanol is added in the calculated amount to the hot medium, pH is checked, poured into sterile vials and Petri dishes; crops in a liquid medium are incubated at 28°C under aerobic conditions for 48 hours; the enriched material from the flasks is inoculated with a loop onto a solid medium of the same composition and grown at 28°C under aerobic conditions for 48 h, then the isolated colonies are inoculated onto nutrient agar sectors, incubated at 28°C for 24 h, followed by the identification of bacteria A. baylyi by phenotypic traits. Note: bacteriological quality control of the nutrient medium of the proposed method is carried out during the manufacture of the medium; daily broth cultures of the control strains A.baylyi (positive control) and P. aeruginosa ATCC 27853, E.coli ATCC 25922 (negative control) are inoculated one loop by a radial stroke on the surface of a dense medium in a Petri dish, incubated aerobically at 28°C for 24 hours, take into account the result - the nutrient medium is suitable for use if there is growth of A. baylyi bacteria and no growth of P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922. The shelf life of ready-made media is 15 days at a temperature of 4 ° C to 8 ° C .

Первый отличительный существенный признак способа - использование в синтетической среде заявляемого способа аминокислоты L-фенилаланина (СAS No 63-91-2) в качестве единственного источника азота. Применение этой аминокислоты в указанном качестве не известно. В прототипе в синтетической этанол-аммонийной среде (ЭАС) используют в качестве единственного источника азота минеральный источник (фосфат натрий-аммония). В аналоге по Krizova L. et al. (Krizova L., Maixnerova M., Sedo O., Nemec A. Acinetobacter albensis sp.nov., isolated from natural soil and water ecosystems. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2015. Vol. 65, No 11, p. 3905-3912; doi 10.1099/ijsem.0/000511) также используют в качестве единственного источника азота минимальные минеральные среды.The first distinguishing essential feature of the method is the use of the amino acid L-phenylalanine (CAS No 63-91-2) in the synthetic environment of the proposed method as the sole source of nitrogen. The use of this amino acid as indicated is not known. In the prototype in a synthetic ethanol-ammonium environment (EAS) is used as the only source of nitrogen mineral source (sodium ammonium phosphate). In the analogue according to Krizova L. et al. (Krizova L., Maixnerova M., Sedo O., Nemec A. Acinetobacter albensis sp.nov., isolated from natural soil and water ecosystems. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2015. Vol. 65, No 11, p. 3905-3912; doi 10.1099/ijsem.0/000511) also use minimal mineral media as the sole source of nitrogen.

Известно применение L-фенилаланина в качестве единственного источника углерода и азота в аналоге синтетической среде «Ацинетовактер фенилаланин агар» (Сиволодский Е.П., Горелова Г.В., Богословская С.П., Зуева Е.В. Селективная синтетическая питательная среда «Ацинетобактер фенилаланин агар» для выделения и идентификации бактерий комплекса Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii // Инфекция и иммунитет. 2020. Т. 10, №3. С. 591-596. doi: 10.15789/2020-7619-ASS-1177). Однако, известно, что бактерии вида A. baylyi не могут использовать L-фенилаланин как единственный источник углерода (Carr E.L., Kampfer P., Petel В.K.С., Gurtler V., Seviour R.J. Seven novel species of Acinetobacter isolated from activated sludge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. Vol. 53, No 4, p. 953-963. doi: 10.1099/ijs.0.02486-0). Поэтому бактерии A.baylyi не растут на питательной среде «Ацинетобактер фенилаланин агар». Нами в эксперименте впервые показано, что бактерии A. baylyi интенсивно используют для роста L-фенилаланин в качестве единственного источника только азота при наличии этанола как единственного источника углерода (таблица 1).It is known to use L-phenylalanine as the only source of carbon and nitrogen in an analogue of the synthetic medium "Acinetovacter phenylalanine agar" (Sivolodsky E.P., Gorelova G.V., Bogoslovskaya S.P., Zueva E.V. Selective synthetic nutrient medium " Acinetobacter phenylalanine agar" for the isolation and identification of bacteria of the Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex // Infection and Immunity. 2020. Vol. 10, No. 3. P. 591-596. doi: 10.15789/2020-7619-ASS-1177). However, it is known that bacteria of the species A. baylyi cannot use L-phenylalanine as the sole carbon source (Carr E.L., Kampfer P., Petel B.K.C., Gurtler V., Seviour R.J. Seven novel species of Acinetobacter isolated from activated sludge Int J Syst Evol Microbiol 2003 Vol 53 No 4 pp 953-963 doi: 10.1099/ijs.0.02486-0). Therefore, A.baylyi bacteria do not grow on the nutrient medium "Acinetobacter phenylalanine agar". We experimentally showed for the first time that A. baylyi bacteria intensively use L-phenylalanine as the only source of only nitrogen for growth in the presence of ethanol as the only carbon source (Table 1).

Мы впервые использовали для синтетической селективной среды сочетание этанола как единственного источника углерода и L-фенилаланина как единственного для A. baylyi источника только азота. Это сочетание неожиданно выявило необычный узко-селективный эффект обильного выделения A. baylyi из объекта внешней среды - 95% всех изолятов бактерий (19 из 20 изученных колоний), выделенных из пробы воды реки Невы, являлись видом A. baylyi (таблица 2). При этом сравнительное изучение способа прототипа с использованием синтетической этанол-аммонийной среды не выявило выделения бактерий A. baylyi, однако обнаружило бактерии пяти прочих видов ацинетобактеров (A. johnsonii, A. radioresistens, A. haemolyticus, A. towneri, A. tandoii) и изолятов других родов бактерий (таблица 2). При повторных исследованиях трех проб воды были получены результаты одинаковой направленности: заявляемым способом выделялись преимущественно бактерии A. baylyi (90-95% изолятов), прототипным способом -бактерии многих других видов ацинетобактеров.For the first time, we used a combination of ethanol as the only source of carbon and L-phenylalanine as the only source of nitrogen for A. baylyi for a synthetic selective medium. This combination unexpectedly revealed an unusual narrow selective effect of the abundant isolation of A. baylyi from the environmental object - 95% of all bacterial isolates (19 out of 20 colonies studied) isolated from the water sample of the Neva River were A. baylyi (Table 2). At the same time, a comparative study of the prototype method using a synthetic ethanol-ammonium medium did not reveal the isolation of A. baylyi bacteria, however, bacteria of five other types of Acinetobacter were found (A. johnsonii, A. radioresistens, A. haemolyticus, A. towneri, A. tandoii) and isolates of other bacterial genera (Table 2). In repeated studies of three water samples, the results of the same direction were obtained: the claimed method isolated predominantly A. baylyi bacteria (90-95% of isolates), the prototype method - bacteria of many other types of Acinetobacter.

Механизм выявленного узко-селективного выделения бактерий А. baylyi заявляемым способом состоит в том, что известный источник углерода этанол, имеющий широкий спектр селективного действия для большинства видов ацинетобактеров. при дополнении его L-фенилаланином, который является для A. baylyi источником только азота, создают более специфические селективные условия,чем при универсальном минеральном источнике азота или использовании аминокислот как источника углерода и азота, что обеспечивает преимущественное выделение A. baylyi из объектов внешней среды. При этом отличительный существенный признак (L-фенилаланин как источник только азота) непосредственно определяет решение поставленной технической задачи повышения селективности выделения бактерий А. baylyi из объектов внешней среды. Механизм достижения необычного узкоселективного выделения A. baylyi выявлен впервые и представлен только в материалах данной заявки.The mechanism of the identified narrowly selective isolation of bacteria A. baylyi by the claimed method is that the known source of carbon is ethanol, which has a wide range of selective action for most types of Acinetobacter. when it is supplemented with L-phenylalanine, which is a source of only nitrogen for A. baylyi, more specific selective conditions are created than with a universal mineral source of nitrogen or the use of amino acids as a source of carbon and nitrogen, which ensures the predominant isolation of A. baylyi from environmental objects. At the same time, the distinctive essential feature (L-phenylalanine as a source of only nitrogen) directly determines the solution of the set technical problem of increasing the selectivity of the isolation of A. baylyi bacteria from environmental objects. The mechanism for achieving the unusual narrowly selective isolation of A. baylyi has been identified for the first time and is presented only in the materials of this application.

Второй отличительный существенный признак способа - использование в составе синтетической среды заявляемого способа комплекса минеральных солей, г/л: NaCl 5,0; Na₂SO₄ 2,0; K₂НРO₄ 2,5; MgSO₄ 0,1, обеспечивает метаболизм бактерий и направляет его на усвоение этанола и L-фенилаланина как единственных источников углерода и азота.The second distinguishing essential feature of the method is the use of a complex of mineral salts in the composition of the synthetic medium of the proposed method, g/l: NaCl 5.0; Na ₂ SO ₄ 2.0; K ₂ HPO ₄ 2.5; MgSO ₄ 0.1 ensures the metabolism of bacteria and directs it to the assimilation of ethanol and L-phenylalanine as the only sources of carbon and nitrogen.

Существенными признаками способа являются: наличие в питательной среде заявляемого способа этанола как источника углерода; температурный режим 28°С, который обеспечивает рост бактерий всех видов рода

The essential features of the method are: the presence in the nutrient medium of the proposed method of ethanol as a source of carbon; temperature regime of 28 ° C, which ensures the growth of bacteria of all types of the genus

Acinetobacter; аэробные условия культивирования; этап предварительного обогащения речной воды в жидкой питательной среде и время инкубирования посевов в течение 48 ч, которые обусловлены разнообразием и малой концентрацией микроорганизмов в воде.Acinetobacter; aerobic cultivation conditions; the stage of preliminary enrichment of river water in a liquid nutrient medium and the time of incubation of crops for 48 hours, which are due to the diversity and low concentration of microorganisms in the water.

Примеры, подтверждающие возможность осуществления способаExamples confirming the possibility of implementing the method

Пример 1. Исследуемый материал - воду реки Невы (температура воды 14°С) засевают в объеме 10 мл в флакон с 40 мл жидкой питательной среды заявляемого способа (состав и приготовление питательной среды указаны в примечании к примеру). Посев инкубируют в аэробных условиях при 28°С в течение 48 ч, затем пересевают бактериологической петлей обогащенный материал из флакона на поверхность плотной питательной среды такого же состава в двух чашках Петри. Инкубируют посевы в аэробных условиях при 28°С в течение 48 ч. Отбирают для последующей видовой идентификации 10 изолированных колоний, характерных для ацинетобактеров, пересевают их на секторы плотной питательной среды, инкубируют при 28°С в течение 24 ч. Контрольная идентификация установила принадлежность девяти из десяти изолятов к виду A.baylyi по комплексу фенотипических признаков (грамотрицательные кокко-бактерии, неподвижные, оксидазоотрицательные, каталазоположительные; не ферментируют, но окисляют глюкозу; не имеют нитратредуктазы; имеют уреазу; утилизируют в качестве единственного источника углерода D-глюкозу; не утилизируют L-арабинозу, путресцин). Видовая идентификация методом MALDI-TOF масс-спектрометрии подтвердила принадлежность 9 изолятов к виду A. baylyi.Example 1. The test material - water of the Neva River (water temperature 14°C) is inoculated in a volume of 10 ml into a vial with 40 ml of liquid nutrient medium of the proposed method (the composition and preparation of the nutrient medium are indicated in the note to the example). The inoculation is incubated under aerobic conditions at 28°C for 48 hours, then the enriched material from the vial is inoculated with a bacteriological loop onto the surface of a dense nutrient medium of the same composition in two Petri dishes. The inoculations are incubated under aerobic conditions at 28°C for 48 hours. 10 isolated colonies characteristic of Acinetobacter are selected for subsequent species identification, they are subcultured on sectors of a dense nutrient medium, and incubated at 28°C for 24 hours. from ten isolates to the species A.baylyi according to a complex of phenotypic traits (gram-negative cocco-bacteria, immobile, oxidase-negative, catalase-positive; do not ferment, but oxidize glucose; do not have nitrate reductase; have urease; utilize D-glucose as the only source of carbon; do not utilize L-arabinose, putrescine). Species identification by MALDI-TOF mass spectrometry confirmed that 9 isolates belong to the species A. baylyi.

Примечание к примеру 1. Методика приготовления питательной среды заявляемого способа. Жидкая питательная среда. В 1 л дистиллированной воды вносят: L-фенилаланин (CAS 63-91-2) 2,0 г; NaCl 5,0 г; Na₂SO₄ 2,0 г; KН₂РO₄ 1,0 г; K₂НРO₄ 2,5 г; MgSO₄ 0,1 г; растворяют при нагревании, кипятят в течение 5 мин, добавляют в теплую среду 4 мл 96-градусного этанола, проверяют рН 7,2±0,2, разливают по 40 мл в стерильные флаконы. Плотная питательная среда содержит на 1 л дистиллированной воды те же компоненты и дополнительно 15 г агара. Все компоненты растворяют при нагревании, кипятят в течение 5 мин, затем добавляют в теплую среду 4 мл этанола, проверяют рН 7,2±0,2, разливают в стерильные чашки. Бактериологический контроль качества питательной среды заявляемого способа проводят при изготовлении среды; суточные бульонные культуры контрольных штаммов A. baylyi (позитивный контроль) и P. aeruginosa АТСС 27853, E.coli АТСС 25922 (отрицательный контроль) засевают по одной петле радиальным штрихом на поверхность плотной среды в чашке Петри, инкубируют аэробно при 28°С в течение 24 ч, учитывают результат - питательная среда пригодна к использованию, если имеется рост бактерий A. baylyi и нет роста P. aeruginosa АТСС 27853, Е. coli АТСС 25922. Срок хранения готовых сред 15 суток при температуре от 4°С по 8°С.Note to example 1. The method of preparation of the nutrient medium of the proposed method. Liquid nutrient medium. In 1 liter of distilled water add: L-phenylalanine (CAS 63-91-2) 2.0 g; NaCl 5.0 g; Na ₂ SO ₄ 2.0 g; KH ₂ RO ₄ 1.0 g; K ₂ HPO ₄ 2.5 g; MgSO ₄ 0.1 g; dissolve when heated, boil for 5 minutes, add 4 ml of 96-degree ethanol to a warm medium, check pH 7.2 ± 0.2, pour 40 ml into sterile vials. Solid nutrient medium contains the same components per 1 liter of distilled water and an additional 15 g of agar. All components are dissolved by heating, boiled for 5 minutes, then 4 ml of ethanol are added to a warm medium, pH 7.2 ± 0.2 is checked, poured into sterile cups. Bacteriological quality control of the nutrient medium of the proposed method is carried out in the manufacture of the medium; daily broth cultures of the control strains A. baylyi (positive control) and P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922 (negative control) are inoculated one by one loop with a radial stroke on the surface of a dense medium in a Petri dish, incubated aerobically at 28°C for 24 hours, take into account the result - the nutrient medium is suitable for use if there is growth of A. baylyi bacteria and no growth of P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC 25922. The shelf life of ready-made media is 15 days at a temperature of 4 ° C to 8 ° C .

Пример 2. Исследуемый материал - воду реки Невы (температура воды 100 С) засевают в объеме 10 мл в флакон с 40 мл жидкой питательной среды заявляемого способа, содержащей на 1 л дистиллированной воды L-фенилаланин (CAS 63-91-2) 3,0 г, этанол 96-градусный 6 мл и остальные ингредиенты по примечанию к примеру 1. Посев инкубируют в аэробных условиях при 28°С в течение 48 ч, затем пересевают бактериологической петлей обогащенный материал из флакона на поверхность плотной питательной среды такого же состава в двух чашках Петри. Инкубируют посевы аэробно при 28°С течение 48 ч. Отбирают для последующей видовой идентификации 10 изолированных колоний, характерных для ацинетобактеров, пересевают их на секторы плотной питательной среды, инкубируют аэробно при 28°С в течение 24 ч. Контрольная идентификация по фенотипическим признакам установила принадлежность 9 из 10 изолятов к виду A. baylyi.Example 2. The test material - the water of the Neva River (water temperature 100 C) is inoculated in a volume of 10 ml into a vial with 40 ml of liquid nutrient medium of the proposed method, containing L-phenylalanine (CAS 63-91-2) 3 per liter of distilled water, 0 g, ethanol 96-degree 6 ml and the rest of the ingredients according to the note for example 1. The inoculation is incubated under aerobic conditions at 28 ° C for 48 hours, then the enriched material from the vial is inoculated with a bacteriological loop onto the surface of a dense nutrient medium of the same composition in two Petri dishes. The inoculations are incubated aerobically at 28°C for 48 hours. 10 isolated colonies characteristic of Acinetobacter are selected for subsequent species identification, they are subcultured on sectors of a dense nutrient medium, and aerobically incubated at 28°C for 24 hours. 9 out of 10 isolates belong to the species A. baylyi.

Таким образом, при всех предельных концентрациях основных ингредиентов питательной среды заявляемого способа (L-фенилаланин 2,0-3,0 г/л, этанол 96-градусный 4-6 мл/л) получены четкие результаты узкой селективности выделения бактерий вида A. baylyi из проб воды реки Невы - 9 из 10 изолятов.Thus, at all limiting concentrations of the main ingredients of the nutrient medium of the proposed method (L-phenylalanine 2.0-3.0 g/l, ethanol 96-degree 4-6 ml/l), clear results of the narrow selectivity of the isolation of A. baylyi bacteria were obtained. from water samples of the Neva River - 9 out of 10 isolates.

Claims

A method for isolating bacteria of the species Acinetobacter baylyi from river water, involving inoculation of the test material in a liquid selective nutrient medium containing a nitrogen source, a carbon source ethanol, mineral salts, distilled water; incubation of crops at 28°C under aerobic conditions for 48 hours; transferring the enriched material to a dense selective nutrient medium of the same composition with agar and incubation at 28°C for 48 hours under aerobic conditions; transfer of isolated colonies to sectors of a dense nutrient medium, incubation of crops aerobically at 28°C for 24 hours, followed by species identification of bacterial isolates by phenotypic characteristics, characterized in that in liquid and dense selective media, L-phenylalanine is used as the only source of nitrogen, as well as NaCl, Na ₂ SO ₄ , K ₂ HPO ₄ , MgSO ₄ with the following content of ingredients, g:

L-phenylalanine (CAS 63-91-2) 2.0-3.0 ethanol 96 degree 4-6 ml NaCl 5.0 _Na2SO4 _{_} 2.0 _MgSO4 0.1 _KH2PO4 _{_} 1.0 _K2HPO4 _{_} 2.5 agar (absent in liquid medium) 15.0 distilled water 1 l

while ethanol is added after dissolution and boiling of all other ingredients for 5 minutes, pH 7.2±0.2.