CA1043701A

CA1043701A - Method and reagents for the early diagnosis of pregnancy__

Info

Publication number: CA1043701A
Application number: CA189,602A
Authority: CA
Inventors: Robert L. Prugnaud
Original assignee: LABORATOIRE THERANOL
Current assignee: LABORATOIRE THERANOL
Priority date: 1973-01-08
Filing date: 1974-01-07
Publication date: 1978-12-05
Also published as: IL43964A0; FR2213711A5; IL43964A; JPS49102188A; SU607564A3

Abstract

L'établissement d'un diagnostic précoce de la grossesse chez les mammifères chez lesquels l'état de grossesse provoque l'excrétion de gonadotropine chorionique d'origine placentaire dans l'urine, est effectué à l'aide d'un réactif constitué d'une composition lyophilisée destinée à être mélangée avec un liquide de dilution immédiatement avant l'emploi; cette composition est constituée de trois couches lyophilisées superposées, la couche inférieure comprenant un substrat constitué par des érythrocytes ou par un polymère synthétique pouvant être utilisé comme substrat, sur lequel est adsorbée de la gonadotrobine chorionique douée de propriétés antigéniques, la couche supérieure comprenant un antisérum vis-à-vis de la gonadotropine chorionique antigénique, et une couche médiane interposée entre les couches inférieure et supérieure, qui comprend un tampon phosphate contenant un agent de chélation des ions calcium. On met en contact de l'urine , éventuellement diluée, à examiner, avec le réactif ci-dessus, on laisse reposer le mélange réactionnel pendant ? heure à 2 heures et on examine ensuite si la réaction d'agglutination a eu lieu ou a été inhibitée. Le rapport de concentration en anticorps de l'anti-sérum/antigène est tel que le réactif présente un seuil de sensibilité sélectif vis-à-vis de la gonatropine chorionique excrétée dans l'urine, qui est supérieur à 1500 U.I. de GCH/litre d'urine; la réactions d'agglutination est inhibitée lorsque l'urine contient plus de 1500 U.I. de GCH/litre d'urine, ce qui est attesté par le dépôt d'un anneau formé par le substrat.The establishment of an early diagnosis of pregnancy in mammals in which the state of pregnancy causes the excretion of chorionic gonadotropin of placental origin in the urine, is carried out using a reagent consisting of a lyophilized composition intended to be mixed with a dilution liquid immediately before use; this composition consists of three superimposed lyophilized layers, the lower layer comprising a substrate constituted by erythrocytes or by a synthetic polymer which can be used as a substrate, on which is adsorbed chorionic gonadotrobin endowed with antigenic properties, the upper layer comprising an antiserum vis-à-vis the antigenic chorionic gonadotropin, and a middle layer interposed between the lower and upper layers, which comprises a phosphate buffer containing a chelating agent of calcium ions. Urine, possibly diluted, to be examined is brought into contact with the above reagent, the reaction mixture is allowed to stand for? hour to 2 hours and then it is examined whether the agglutination reaction has taken place or has been inhibited. The anti-serum / antigen antibody concentration ratio is such that the reagent has a selective sensitivity threshold vis-à-vis the chorionic gonatropin excreted in the urine, which is greater than 1500 IU of GCH / liter urine; the agglutination reaction is inhibited when the urine contains more than 1500 IU of GCH / liter of urine, which is evidenced by the deposition of a ring formed by the substrate.

Description

3~9~ 3 a9~
La présente invention est relative a un nouveau procédé
d'établissement d'un diagnos~ic précoce de la grossesse, ainsi qu'a un réactif modifié pour la mise en oeuvre de ce procédé.
Comme on le sait, les hormones gonadotropes, ou gonado-trophines, sont les hormones qui stimulent les gonades. Les gonado-trophines sont produites, chez les mammifères, par l'hypophyse, le placenta, et, dans le cas de juments gravides, également par l'endometrium. L'on peut citer parmi les hormones gonadotropes, l'hormone folliculo-stimulante (FSH), l'hormone lutéinisante (LH), lalutéotropine (LTH) et la gonadotrophine chorionique (GCH).
L'on sait que les effets biologiques de la GCH et de la LH sont similaires. L'on sait aussi que l'urine de mammifères gravides contient de la gonadotrophine chorionique d'origine placentaire, et que, chez la femme, l'urine contient, au milieu du cycle mens-truel, de la LH d'origine hypophysaire dont l'action provoque l'ovulation et la formation du corps jaune. L'on sait egalement que l'urine de femme en période pré-ménopausique, c'est-à-dire dans le cas de ménopause incipiens, contient des gonadotrophines d'origine hypophysaire.
2a La présence de gonadotrophine chorionique d'origine pla-centaire dans l'urine constitue un moyen de diagnostic précoce de la grossesse. C'est la raison pour laquelle des réactifs permettant le diagnostic précoce de la grossesse ont été mis au point.
Ces réactifs sont essentiellement constitués par des sup-ports sur lesquels est adsorbé un antigène constitué par la gonadotrophine chorionique (GCH) et par un anti-sérum de gonado-trophine chorionique ; la réaction entre l'antigène GCH porté

par son support, et l'antisérum donne lieu à un précipité jaune clair, homogènlo, ou agglutinat ; en présence d'un excès de GCH
libre dans le milieu réactionnel, apporté, par exemple, sous la forme de gonadotrophine chorionique contenue dans l'urine de femelle gravide, la réaction ci-dessus ne se produit pas, elle est inhibée par la présence de GCH dans l'urine et il ne se for-me pas d'agglutinat.
Lorsque le support sur lequel ast adsorbé la GCEI est cons-titué par des érythrocytes convenablement traités et lorsque la 10 réaction érythrocytes,~antisérum ne se produit pas et qu'il ne se forme pas d'agglutinat, les érythrocytes se déposent au fond du tube de réaction sous la forme d'un anneau brun-:foncé. Cette réac-tion, connue sous le nom de réaction de WIDE et GEMZELL, a été
décrite dans ACTA ENDOCRINOL,35,261 (1960~ et il en a été tiré
parti dans les Brevets :Erançais N 1 299 171 et 1 343 189 au nom d'ORGA~O~ N.V. ~ :
Lorsque le support mis en oeu~7re est constitué par un poly-mère synthétique, comme décrit dans les ~evets français ~
1 322 869 et 1 411 279 au nom d'ORTHO PHARMACEUTICAI CORP., lors-20 que la réaction antigène/antisérum est inhibée par la présence de GCH dans l'urine examinée, la réaction d'agglutination ne se produit pas. .
Toutefois, les réactifs décrits dans les Brevets ci-dessus présentent une sensibilité telle que la réaction antigène/anti-sérum est inhibée non seulement dlns les cas où l'urine examinée contient de la gonadotrophine chorionique gravidique, c'est-à- .
dire d'origine placentaire, mais aussi dans ceux où l'urine exa-minée contient des gonadotrophines d'origine hypophysaire, dans les m~nopauses incipiens et au milieu du cycle menstruel.
Or, il a pu être mis en ~vidence que les gonadotrophines d'origine hypophysaire sont ~l~mln~es dans l'urine, aussi bien . ~,' o~
dans le cas de ménopause incipiens, qu'au milieu d'un cycle mens-truel, suivant un taux qui est toujours inférieur ~ 500 U.I. par litre d'urine.
Par contre, si l'on procède à un test quantitatif d'établis-sement d'un diagnostic précoce de la grossesse au 9ème jour de retard des règles, il s'est avéré qu'en cas de yrossesse, le taux d'élimination de la gonadotrophine chorionique gravidique (GCH) dans l'urine est toujours supérieur ~ 1500 U.I.par litre.
Comme la zone intermédiaire, comprise entre des taux d'éli-mination de GCH de 500 à 1500 U.I. par litre d'urine, ne corres-pond à aucune interprétation utilisable, puisque les taux qui y sont inclus sont supérieurs à ceux qui correspondent aux méno~
pauses incipiens et aux milieux de cycles menstruels, et infé-rieurs à ceux qui permettent de diagnostiquer une grossesse nor-male, il est nécessaire que, conformément ~ la présente invention, le réactif mis en oeuvre pour établir un diagnostic précoce de la grossesse présente un seuil de sensibilité suffisamment élevé
pour éliminer tout risque de confusion ou d'erreur et pour que l'absence d'agglutination ne se produise et ne soit observée qu'en présence de gonadotrophine chorionique gravidique dans l'urine examinée.
En d'autres termes, le seuil de sensibilité du réactif mis en oeuvre conformément ~ la présente invention doit etre supé-rieur à 1500 U.I. de GCH présentes par litre d'urine examinée.
La nécessité du choix d'un seuil de sensibilité du réac-tif supérieur ~ 1500 U.I. de GCH éliminées par litre d'urine ressort de la Figure 1 annexée, qui représente un graphique d'éli-mination de la GCH pendant la grossesse, dans lequel on a porté :
- en abscisse le nombre de mois compris entre la fécondation (0) et l'accouchement (9), - en ordonnée, le taux de GCH excrétée dans l'urine, ~xprimé en unites internationales de GCH par litre d'urine, suivant une échelle logarithmique.
Dans ce graphique, la zone 1 représente la zone d'élimina-tion de la gonadotrophine d'origine hypophysaire excrétée dans l'urine en cas de ménopause incipiens et au milieu du cycle m~ns-truel, qui est sensiblement comprise entre 0 et 500 U.I. de GCE/litre d'urine ; la zone 2 correspond à la zone intermédiaire, sensiblement comprise entre une excrétion de 500 U.I. de 5CH/li-tre et de 1500 U.I. de GCH/litre d'urine, dans laquelle il se produit une réaction inconstante, un anneau plus ou moins net étant susceptible d'appara~tre dans le cas o~ le support mis en oeuvre était constitué par des érythlocytes, sans que le test ainsi effectué puisse conduire ~ des résultats aisément interpré
tables ; la zone 3 correspond aux taux d'élimination de GCH (ex-primée en U.I.) par litre d'urine au cours de la grossesse, dans laquelle il ne se produit pas d'agglutination, ce ~ui donne lieu à un milieu réactionnel sensiblement limpide, à la base duquel se dépose un anneau d'érythrocytes lorsque ces derniers avaient été utilisés comme supports.
Il y a lieu de mentionner que la zone 4 représentée hachu-rée sur le graphi~ue correspond au schéma d'élimination de la GCH au cours de la grossesse, depuis la fécondation ~usqu'à l'ac-couchement. La droite 5 parallale à l'ordonnée représente la date optimale la plus précoce à la~uelle le test peut atre ef-fectué, à savoir le 9ème jour du retard des ragles. Le point 6 qui se trouve ~ l'intersection de la droite 5 et de la limite inférieure de la zone 4, et le point 7 qui se trouve ~ l'inter-section de la droite 5 et de la limite supérieure de la zone 4 font appara~tre respectivement les taux minimum et maximum nor-maux d'excr~tion de GGH par litre d'urine, au 9ame jour du retard des r~gles.

La présente invention a, par suite, pour but de pourvoir à un procédé et à un réactif d'établissement d'un diagnostic precoce de la grossesse, qui repondent mieux aux nécessités de la pratique que les procedes et reactifs visant au même but anterieurement connus, notamment en ce que le procédé et le reactif conformes a la présente invention permettent d'etablir un diagnostic precoce pratiquement sûr, d'ou sont eliminees les incidences éventuelles dues aux ménopauses incipiens et aux milieux de cycles menstruels perturbés, et en ce que le procédé et le reactif de l'invention permettent la mise au point d'un test facile a ut.iliser par des personnes non averties de l'hormonologie, de l'immunologie et des lectures de reactions, pratique, specifique et fiable, et conferant à
l'urine testee un aspect tel qu'il elimine pratiquement toute ambiguite dans l'interpretation de l'etat, gravidique ou non, de l'interessee.
La presente invention concerne un procede d'établissement d'un diagnostic précoce de la grossesse chez les mannifères chez lesquels l'etat de grossesse provoque l'excretion de 20 gonadotropine chorionique d'origine placentaire dans l'urine. -Le procede de l'invention est caracterise en ce que:
a) l'on met en contact de l'urine, éventuellement diluee, à examiner, avec un reactif constitue d'une composition lyophilisee destinée à être m~langee avec un liquide de dilution immédiatement avant l'emploi, cette composition étant constituée de trois couches lyophilisées superposées, la couche inférieure comprenant un substrat constitue par des érythrocytes ou par un polymère synthétique pouvant etre utiiisé comme substrat, sur lequel est absorbee de la gonadotrobine chorionique douée de proprietes antigeniques, la couche supérieure comprenant un antiserum vis-à-vis de la gonadotropine chorionique antigénique, et une couche médiane interposée entre les couches inférieure r~l :
, ~1 et superieure, la couche médiane comprenant un tampon phosphate contenant un agent de chélation des ions calcium;
b) on laisse reposer le melange reactionnel pendant 3 ~ 9 ~ 3 a9 ~
The present invention relates to a new process establishing an early diagnosis of pregnancy, as well that a modified reagent for the implementation of this process.
As we know, gonadotropic hormones, or gonado-trophins, are the hormones that stimulate the gonads. The gonado-trophins are produced, in mammals, by the pituitary gland, the placenta, and, in the case of pregnant mares, also by the endometrium. Among the gonadotropic hormones, follicle stimulating hormone (FSH), luteinizing hormone (LH), laluteotropin (LTH) and chorionic gonadotropin (GCH).
It is known that the biological effects of GCH and LH are similar. We also know that the urine of pregnant mammals contains chorionic gonadotropin of placental origin, and that in women, urine contains, in the middle of the monthly cycle, truel, pituitary LH whose action causes ovulation and yellow body formation. We also know than female urine in the pre-menopausal period, that is to say in the case of menopause incipiens, contains gonadotropins of pituitary origin.
2a The presence of chorionic gonadotropin of plat origin centric in the urine is a means of early diagnosis of pregnancy. This is the reason why reagents allowing early diagnosis of pregnancy have been brought to point.
These reagents are essentially constituted by sup-ports on which an antigen constituted by the chorionic gonadotropin (GCH) and by a gonado antiserum chorionic trophine; the reaction between the carried GCH antigen by its support, and the antiserum gives rise to a yellow precipitate clear, homogenous, or agglutinate; in the presence of an excess of GCH
free in the reaction medium, brought, for example, under the form of chorionic gonadotropin contained in the urine of pregnant female, the above reaction does not occur, it is inhibited by the presence of GCH in the urine and does not form me no agglutinate.
When the support on which the GCEI has been adsorbed is suckled by properly treated erythrocytes and when the 10 erythrocyte reaction, ~ antiserum does not occur and does not does not form agglutinate, the erythrocytes settle at the bottom of the reaction tube in the form of a dark brown ring. This reaction tion, known as the WIDE and GEMZELL reaction, was described in ACTA ENDOCRINOL, 35,261 (1960 ~ and it was taken from it party in the Patents: Erançais N 1 299 171 and 1 343 189 at name of ORGA ~ O ~ NV ~:
When the support used ~ 7re consists of a poly-synthetic mother, as described in ~ French evets ~
1 322 869 and 1 411 279 on behalf of ORTHO PHARMACEUTICAI CORP., When-20 that the antigen / antiserum reaction is inhibited by the presence of GCH in the urine examined, the agglutination reaction does not not produce. .
However, the reagents described in the above Patents have a sensitivity such as the antigen / anti-serum is inhibited not only in cases where urine examined contains pregnancy chorionic gonadotropin, that is.
say placental origin, but also in those where urine exa-mined contains gonadotropins of pituitary origin, in menopause in the middle and middle of the menstrual cycle.
However, it has been possible to demonstrate that the gonadotropins of pituitary origin are ~ l ~ mln ~ es in the urine, as well . ~, ' o ~
in the case of incipian menopause, that in the middle of a monthly cycle truel, at a rate which is always lower ~ 500 IU per liter of urine.
On the other hand, if a quantitative test of establishments is carried out early diagnosis of pregnancy on the 9th day of delay in menstruation, it turned out that in case of pregnancy, the rate elimination of pregnancy chorionic gonadotropin (GCH) in the urine is always above ~ 1500 IU per liter.
As the intermediate zone, between rates of eli-GCH mination from 500 to 1500 IU per liter of urine, does not correspond to has no usable interpretation, since the rates therein are included are greater than those corresponding to meno ~
Incipian and mid-cycle breaks, and inferior laughing at those who diagnose a normal pregnancy male, it is necessary that, in accordance with the present invention, the reagent used to establish an early diagnosis of pregnancy has a sufficiently high sensitivity threshold to eliminate any risk of confusion or error and so that absence of agglutination does not occur and is not observed that in the presence of gravid chorionic gonadotropin in urine examined.
In other words, the sensitivity threshold of the reagent put implemented in accordance with ~ the present invention must be less than 1500 IU GCH present per liter of urine examined.
The need to choose a sensitivity threshold for the reaction higher tif ~ 1500 IU of GCH eliminated per liter of urine Figure 1 appended, which represents a graph of eli-GCH mination during pregnancy, in which we carried:
- on the abscissa the number of months between fertilization (0) and childbirth (9), - on the ordinate, the rate of GCH excreted in the urine, ~ xpressed in international units of GCH per liter of urine, according to a logarithmic scale.
In this graph, zone 1 represents the elimination zone tion of the pituitary gonadotropin excreted in urine in case of menopause incipiens and in the middle of the cycle m ~ ns-truel, which is substantially between 0 and 500 IU of GCE / liter of urine; zone 2 corresponds to the intermediate zone, substantially between an excretion of 500 IU of 5CH / li-tre and 1500 IU GCH / liter of urine, in which it produces an inconsistent reaction, a more or less clear ring being likely to appear in the case where the support work consisted of erythrocytes, without the test thus carried out can lead to easily interpreted results tables; zone 3 corresponds to GCH elimination rates (ex-rewarded in IU) per liter of urine during pregnancy, in which does not agglutinate, this ~ ui gives rise to a substantially clear reaction medium, on the basis of which a ring of erythrocytes is deposited when the latter had been used as supports.
It should be mentioned that the zone 4 represented hatched-rée on the graphi ~ ue corresponds to the elimination scheme of the GCH during pregnancy, from fertilization ~ until acc-sleeping. The straight line 5 parallel to the ordinate represents the earliest optimal date at which the test can be effective carried out, namely the 9th day of the delay of the ragles. Point 6 which is at the intersection of line 5 and the limit zone 4, and point 7 which is ~ the inter-section of line 5 and the upper limit of zone 4 show the minimum and maximum rates respectively.
GGH excretion ailments per liter of urine, on the 9th day of delay rules.

The present invention therefore aims to provide a process and a reagent for establishing a early diagnosis of pregnancy, which respond better to necessities of practice as the processes and reagents aimed for the same purpose previously known, in particular in that the process and reagent according to the present invention allow to establish an almost sure early diagnosis of where Eliminate the possible effects due to menopause incipians and in the midst of disturbed menstrual cycles, and in that the process and the reagent of the invention allow developing an easy-to-use test for people not aware of hormonology, immunology and readings of reactions, practical, specific and reliable, and giving urine tested for an appearance such that it virtually eliminates ambiguous in the interpretation of the state, gravidical or not, of the interested.
The present invention relates to a method of establishment of an early diagnosis of pregnancy in mannifers in which the state of pregnancy causes the excretion of 20 chorionic gonadotropin of placental origin in the urine. -The method of the invention is characterized in that:
a) contacting urine, possibly diluted, to be examined, with a reagent consisting of a composition lyophilized intended to be m ~ langee with a dilution liquid immediately before use, this composition being constituted of three superimposed freeze-dried layers, the bottom layer comprising a substrate constituted by erythrocytes or by a synthetic polymer that can be used as a substrate, on which is absorbed from the chorionic gonadotrobin endowed with antigenic properties, the upper layer comprising a antiserum vis-à-vis the antigenic chorionic gonadotropin, and a middle layer interposed between the lower layers r ~ l:
, ~ 1 and upper, the middle layer comprising a phosphate buffer containing a calcium ion chelating agent;
b) the reaction mixture is left to stand for

2 heure à 2 heures; et c) on examine ensuite si la réaction d'agglutination a eu lieu ou a éte inhibitee; le rapport de concentration en ~ ;
anticorps de l'anti-serum/antigène est tel que le reactif presente un seuil de sensibilite sélectif vis-à-vis de la gona-tropine chorionique excretee dans l'urine, qui est superieur à
1500 U.I. de GCH/litre d'urine, la réaction d'agglutination étant inhibitee lorsque l'urine contient plus de 1500 U.I. de ~
GCH/litre d'urine. . .
L'invention concerne egalement un reactif d'etablissement d'un diagnostic precoce de la grossesse, utilisable dans le procede ci-dessus. Le reactif conforme à l'invention est caracterise en --: .
ce qu'il est constitue d'une composition lyophilisee destinée à .
être melangee avec un liquide de dilution immédiatement avant ::~
l'emploi; cette composition est constituee de trois couches lyophilisees superposees, la couche inferieure comprenant un :
2Q substrat constitué par des érythrocytes ou par un polymère ~;
synthétique pouvant être utilisé comme substrat, sur lequel est absorbée de la gonadotropine chorionique douee de propriétés :, antigéniques, la couche supérieure comprenant un anti-s~rum vis-a-vis de la gonadotropine chorionique antigénique, et une :
couche médiane interposée entre les couches inférieure et superieure, la couche médiane comprenant un tampon phosphate :
contenant un agent de ch~lation des ions calcium. Le rapport de concentration en anticorps de l'anti-sérum/antigène est tel que le r~actif présente un seuil de sensibilité sélectif vis-à-vis 30 de la gonadotropine excrétee dans l'urine, qui est supérieur à ~:
15~Q U.I. de GCH/litre d'urine, et établit de façon positlve l'etat de grosse~se uniquement lorsque le taux d'elimination de GCH est superieur ~ 1500 U.I. par litre d'urine.
Suivant une disposition preferee de ce mode de realisa-tion du réactif, l'on ~ait varier la concentration en anticorps de l'anti-sérum, par augmentation du volume de l'anti-sérum.
Suivant une autre disposition préférée de ce mode de réalisation du réactif, l'on procède à un choix, parmi les diffé-rents antisérums des différents lapins utilisés comme fournisseurs d'anti-sérums, des anti-sérums dont la concentration en anti-corps est la plus élevée.
Suivant un autre mode de réalisation avantageux du réactif conforme à l'invention, l'on fait varier, dans le rapport concentration en anticorps de l'anti-sérum/antigène, le dénomina-teur, ~ savoir la quantité d'antigene, en faisant varier la quantité
de support sur lequel est adsorbé l'antigène.
Suivant une autre disposition de l'invention, l'on peut - faire varier la quantite d'antigène adsorbée sur le support.
` Suivant un mode de réalisation préféré du réactif con-forme à la présente invention, celui-ci comprend 0,36 - 0,44 ml 20 de sérum de lapins ayant reçu des injections de GCH, ce qui correspond à environ 7-8 mg d'extrait sec, et 0,36 - 0,44 ml d'une suspension à 4% d'érythrocytes de mouton sur lesquels est adsorbée la GCH sensibilisee au formol, ladite suspension pesant, après i lyophilisation, environ 16 mg.
L'invention pourra etre mieux comprise à l'aide du complémen~t de description qui va suivre, qui se refère aux dessins dans lesquels:

,-., 1 L ~

~t~

~ la Fi~ure 2 est une vue en perspective d'un appareil-lage pour la mise en oeuvre d'u~procedé d'etablissement d'un diagnostic precoce de la grossesse conforme à l'invention, et - la Figure 3 est une vue en perspective d'un autre appareillage pour la mise en oeuvre de ce procedé.
Il doit être bien entendu toutefois que ces dessins et les parties descriptives correspondantes sont donnees uniquement à , titre d'illustration de l'obJet de l'invention, mais n'en consti-tuent en aucune manière une limitation.
L'appareillage représente à la Figure 2 comprend une structure de support 8 qui comporte un ratelier ou analogue 9 dans lequel sont menagés des évidements lO destinés à recevoir les différents éléments de l'appareilla~e, à savoir : un compte-gouttes 11, un tube 12 contenant le réactif et un tube 13 contenant le liquide de dilution. La structure de support 8 comporte à sa base un miroir 14 dans lequel se reflète la partie inferieure du tube à réactif 12. La structure de support 8 est fermee à sa ~ partie arrière par un ecran 1~ qui evite une dispersion gênante i~ de la lumière et favorise, au contraire, sa concentration sur le miroir, facilitant ainsi la lecture de la reaction.
Dans le mode de réalisation representé à la Figure 3, le ratelier ou analogue 16 ne porte plus que deux éléments, à
savoir : un tube à reactif 17 et un tube 18 contenant le liquide de dilution et réalisé de manière a aspirer le volume d'urine à exa-miner, à la manière d'un compte-gouttes.
La mise en oeuvre du procédé selon l'invention à l'aide il de l'appareillage ainsi decrit est realisee comme suit:
i Après avoir recueilli sa première urine de la journee tet l'avoir éventuellement conservée dans un flacon fermé, à l'abri de :, .

.~, ~.-' la ehaleur), l'utilisatrice prélè~e quelques gouttes de cette urin2 à l'aide du compte-gouttes 11 pour les introduire dans le tube 12 qui contient le r~actif, après quoi elle introduit le liquide de dilution, qui est avantageusement de l'eau distillée, contenu dans le tube 13, dans le tube 12c Apr~s avoir bouché le tube 12, elle l'agite bien, le re-place sur son support 10 et le laisse reposer sur une surface plane, à l'abri de toute vibration et de la chaleur, en évitant toute manipulation, ni au cours des deux heures pendant lesquelles le tube 12 repose, ni au bout de ces deux heures, après.lesquelles elle regarde dans le miroir 14 l'image du fond du tube 12.
Si 1'image qui appara~t est un liquide brun-jaune u~i, la réaction d'agglutination a eu lieu, le test est négatif, et l'uti-lisatrice n'est pas enceinte.
Si l'image qui appara~t dans le miroir 14 permet de voir soit une urine de couleur et de turbidité inchangée (cas où le support de la GCH antigènique était constitué par un polymère synthétique), soit un anneau régulier brun foncé dont la dimension peut ~tre variable, (si le support de la GCH antigènique était constitu~ par des ~rythrocytes), la réaction d'agglutination a été
inhibée par la pr~sence de gonadotrophine chorionique dans l'urine test~e ; le test est positif et l'utilisatrice ast enceinte.
. Dans le cas où l'appareillage utilis~ est celui représente à la Figure 3, l'utilisatrice introduira d'abord le liquide de dilution contenu dans le tube 18, dans le tube à réactif 17, puis aspirera l'urine à l'aide du tuhe 18 au moyen duquel elle intro-duira ensuite l'urine dans le tube 17. La suite des opérations se déroulera comme décrit en liaison avec l'appareillage de la Figure 2. En effet, comme au cours de la première demi-heure le test est r~versible, l'ordre d'addition de l'urine à examiner et B du liquide de dilution ne présente pas d'incidence sur les xésul-_ ~,_ -7Q~l tats obtenus.
Il resulte de la description ci-dessus que quels que soient les modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'applica-tion adoptes, l'on obtient un nouveau procéde et un reactif modifie d'etablissement d'un diagnostic precoce de la grossesse qui presen-tent par rapport aux procedes et aux reactifs anterieurement connus, des avantages importants qui ont ete tres nettement mis en evidence dans ce qui precede, et qui presentent en outre l'avan-tage de permettre une extension de leurs applications sans requerir d'adaptation : ils permettent en effet de detecter aise-ment et rapidement la presence de gonadotropine chorionique dans l'urine d'hommes atteints de tumeurs testiculaires du type de ;:~
teratome et de l'epitheliome.

: :
:
.! . ~
.. ...... ....

,, , - ~

- . .
.

'. . - 10 . 2 hours to 2 hours; and c) it is then examined whether the agglutination reaction has occurred or has been inhibited; the concentration ratio in ~;
anti-serum antibody / antigen is such that the reagent has a selective sensitivity threshold for gona-chorionic tropine excreted in the urine, which is greater than 1500 IU GCH / liter urine, agglutination reaction being inhibited when urine contains more than 1500 IU of ~
GCH / liter of urine. . .
The invention also relates to an establishment reagent an early diagnosis of pregnancy, usable in the process above. The reagent according to the invention is characterized in -:.
what it consists of a lyophilized composition intended for.
be mixed with a dilution liquid immediately before :: ~
employment; this composition is made up of three layers lyophilized superimposed, the lower layer comprising a:
2Q substrate constituted by erythrocytes or by a polymer ~;
synthetic that can be used as a substrate, on which is absorbed from chorionic gonadotropin with properties:, antigenic, the upper layer comprising an anti-s ~ rum vis-à-vis the antigenic chorionic gonadotropin, and one:
middle layer interposed between the lower layers and upper, the middle layer comprising a phosphate buffer:
containing a calcium ion ch ~ lating agent. The report of anti-serum / antigen antibody concentration is such that the active r ~ has a selective sensitivity threshold vis-à-vis 30 of gonadotropin excreted in the urine, which is greater than ~:
15 ~ QIU of GCH / liter of urine, and positively establishes fat state only occurs when the elimination rate of GCH is greater than 1500 IU per liter of urine.
According to a preferred provision of this embodiment-tion of the reagent, we ~ vary the antibody concentration of the antiserum, by increasing the volume of the antiserum.
According to another preferred arrangement of this mode of production of the reagent, a choice is made from among the different antisera rent from different rabbits used as suppliers anti-sera, anti-sera with an anti-body concentration is the highest.
According to another advantageous embodiment of the reagent according to the invention, is varied in the report anti-serum / antigen antibody concentration, the denomina-teur, ~ know the amount of antigen, by varying the amount of support on which the antigen is adsorbed.
According to another provision of the invention, one can - vary the amount of antigen adsorbed on the support.
`According to a preferred embodiment of the reagent form of the present invention, this comprises 0.36 - 0.44 ml 20 serum from rabbits who received GCH injections, which corresponds to approximately 7-8 mg of dry extract, and 0.36 - 0.44 ml of a 4% suspension of sheep erythrocytes on which is adsorbed GCH sensitized to formalin, said suspension weighing, after i lyophilization, about 16 mg.
The invention can be better understood using the Complementary description which follows, which refers to the drawings wherein:

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~ the Fi ~ ure 2 is a perspective view of an apparatus-lage for the implementation of u ~ method of establishing a early diagnosis of pregnancy in accordance with the invention, and - Figure 3 is a perspective view of another apparatus for implementing this process.
It should be understood, however, that these drawings and the corresponding descriptive parts are given only to, title of illustration of the object of the invention, but does not constitute in no way kill a limitation.
The apparatus shown in Figure 2 includes a support structure 8 which comprises a rack or the like 9 in which are provided with recesses 10 intended to receive the different elements of the equipment, namely: an account-drops 11, a tube 12 containing the reagent and a tube 13 containing the dilution liquid. The support structure 8 comprises at its base a mirror 14 in which is reflected the lower part of the reagent tube 12. The support structure 8 is closed at its ~ rear part by a screen 1 ~ which avoids annoying dispersion i ~ light and promotes, on the contrary, its concentration on the mirror, thus facilitating the reading of the reaction.
In the embodiment shown in Figure 3, the rack or the like 16 has only two elements left, namely: a reagent tube 17 and a tube 18 containing the liquid dilution and carried out so as to draw up the volume of urine to be exa mine, like a dropper.
The implementation of the method according to the invention using it of the apparatus thus described is produced as follows:
i After having collected his first urine of the day tet possibly have kept it in a closed bottle, away from :,.

. ~, ~ .- ' heat), the user takes a few drops of this urine using the dropper 11 to introduce them into the tube 12 which contains the active r ~, after which it introduces the liquid of dilution, which is advantageously distilled water, contained in tube 13, in tube 12c After plugging the tube 12, it shakes it well, re-place on its support 10 and let it rest on a flat surface, away from any vibration and heat, avoiding any handling, or during the two hours during which the tube 12 rests, nor after these two hours, after which she looks in the mirror 14 at the image of the bottom of the tube 12.
If the image that appears is a brown-yellow liquid u ~ i, the agglutination reaction has taken place, the test is negative, and the reader is not pregnant.
If the image which appears in the mirror 14 makes it possible to see either unchanged color and turbidity urine (case where the support for antigenic GCH consisted of a polymer synthetic), or a regular dark brown ring whose dimension may be variable, (if the support for antigenic GCH was constituted by ~ rhythm cells), the agglutination reaction was inhibited by the presence of chorionic gonadotropin in the urine test ~ e; the test is positive and the user is pregnant.
. In the case where the apparatus used ~ is that represented in Figure 3, the user will first introduce the dilution contained in tube 18, in reagent tube 17, then will draw up the urine with the aid of the tuhe 18 by means of which it intro will then pass the urine into tube 17. The rest of the operations will take place as described in connection with the apparatus of the Figure 2. Indeed, as during the first half hour the test is reversible, the order of addition of urine to be examined and B dilution liquid does not affect the xesul-_ ~, _ -7Q ~ l states obtained.
It follows from the above description that whatever either the modes of implementation, of realization and of application-tion adopted, a new procedure is obtained and a modified reagent establishing an early diagnosis of pregnancy that presents try with respect to previous processes and reagents known, important advantages that have been very clearly put highlighted in the foregoing, and which further present the advantage to allow an extension of their applications without require adaptation: they indeed make it easy to detect quickly and quickly the presence of chorionic gonadotropin in the urine of men with testicular tumors such as: ~
teratom and epithelioma.

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Claims

The embodiments of the invention about which an exclusive right of property or privilege is claimed are defined as follows:

1. Method for establishing an early diagnosis of pregnancy in mammals in which the condition of pregnancy causes excretion of chorionic gonadotropin of placental origin in the urine, characterized in that:
a) contacting urine, possibly diluted, to be examined, with a reagent consisting of a lyophilic composition line intended to be mixed with a dilution liquid immediately before use, said composition consisting of three superimposed freeze-dried layers, the bottom layer comprising a substrate constituted by erythrocytes or by a synthetic polymer that can be used as a substrate, on which is absorbed from the chorionic gonadotropin endowed with antigenic properties, the upper layer comprising an anti serum for antigenic chorionic gonadotropin, and a middle layer interposed between said layers lower and upper, the middle layer comprising a buffer phosphate containing a calcium ion chelating agent;
b) the reaction mixture is allowed to stand for ? hour to 2 hours; and c) it is then examined whether the agglutination reaction occurred or was inhibited, the ratio of anti-serum antibody / antigen being such as the reagent has a selective sensitivity threshold for gona-chorionic tropin excreted in the urine, which is greater than 1500 IU GCH / liter urine, agglutination reaction being inhibited when the urine contains more than 1500 IU of GCH / liter of urine.

2. Method according to claim 1, characterized in that that the urine of the test subject is collected on the ninth day late periods.

3. Reagent for early diagnosis of pregnancy in mammals in which the condition of pregnancy causes excretion of chorionic gonadotropin of placental origin in the urine, characterized in that it consists of a lyophilized composition intended to be mixed with a dilution liquid immediately before use, said composition consisting of three lyophilized layers superimposed, the lower layer comprising a substrate made up of erythrocytes or a synthetic polymer can be used as a substrate, on which is absorbed chorionic gonadotropin with antigenic properties, the upper layer comprising an anti-serum against the antigenic chorionic gonadotropin, and a middle layer interposed between said lower and upper layers, the middle layer comprising a phosphate buffer containing a calcium ion chelating agent, the concentration ratio the anti-serum / antigen antibody being such that the reagent has a selective sensitivity threshold vis-à-vis of gonadotropin excreted in the urine, which is higher at 1500 IU GCH / liter of urine, and establishes positively state of pregnancy only when elimination rate GCH is greater than 1500 IU per liter of urine.

4. Reagent according to claim 3, characterized in that that we vary the antibody concentration of the anti serum, by increasing the volume of the antiserum.

5. Reagent according to claim 3, characterized in what we made a choice, among the different anti-sera different rabbits used as anti-serum suppliers, anti-sera with the highest antibody concentration high.

6. Reagent according to claim 3, characterized in that the concentration ratio is varied anti-serum antibody / antigen, varying the amount of support on which the antigen is adsorbed.

7. Reagent according to claim 3, characterized in that the concentration ratio is varied anti-serum antibody / antigen, varying the amount of antigen adsorbed on the support.

8. Reagent according to claim 3, characterized in that it contains 0.36 - 0.44 ml of serum from rabbits having received GCH injections, which equates to approximately 7-8 mg dry extract, and 0.36 - 0.44 ml of a 4% suspension sheep erythrocytes on which GCH is adsorbed sibilitée formalin, said suspension weighing, after lyophi-about 16 mg.