BRPI9907066B1 - Process for preparing a suspension of phospholipides - Google Patents

Description

“PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DE UMA SUSPENSÃO DE FOSFOLIPÍDEOS” Campo da Invenção A presente invenção refere-se genericamente a processos para preparação de uma mistura de lipídeos e de uma suspensão uniforme e filtrável de fosfolipídeos contendo a mistura de lipídeos, essa suspensão sendo utilizável como um agente de contraste para ultra-som.

Fundamentos da Invenção A fabricação de um agente de contraste fosfolipídico pode ser dividida nas seguintes etapas^ (l) preparação de uma mistura de lipídeos! (2) combinação da solução bruta que envolve a hidratação e dispersão da mistura de lipídeos em um meio essencialmente aquoso para produzir uma suspensão de lipídeos! (3) filtração da solução bruta através de filtros de esterilização para tornar a suspensão livre de contaminantes microbianos! (4) dosagem da suspensão estéril em frascos individuais em uma área asséptica controlada! (5) carregamento dos frascos dosados em uma câmara de liofilização para substituir 0 gás no espaço superior do frasco por gás perfluoropropano (PFP); (6) transferência dos frascos vedados, após a troca de gás, para uma autoclave para esterilização terminal. Há três grandes obstáculos nesse processo·' (l) a uniformidade da mistura de lipídeos! (2) a hidratação da mistura de lipídeos! (3) a uniformidade e o tamanho das partículas da suspensão! e (4) a filtração estéril da suspensão através de um filtro de esterilização.

As misturas de fosfolipídeos são tipicamente produzidas por dissolução ou suspensão dos lipídeos requeridos em um sistema solvente aquoso ou não aquoso apropriado e, então, redução do volume por liofilização ou destilação. De maneira ideal, esse processo produz sólidos misturados misturados com elevadas uniformidade e pureza do material. Entretanto, embora funcione bem em pequena escala laboratorial, essa abordagem simples é freqüentemente problemática com o aumento da escala para quantidades de tamanho de produção. As dificuldades incluem: (1) a manutenção da uniformidade do material durante a etapa de remoção de solvente (devido a solubilidades diferenciais); (2) a manutenção da pureza (freqüentemente um problema quando se usa água, devido a reações colaterais hidrolíticas); (3) melhorar a pureza; (4) minimizar o volume de solvente; e (5) a recuperação dos sólidos finais (por exemplo, não é prático raspar os sólidos de um grande reator).

Após a fabricação de uma mistura de lipídeos, a combinação final tipicamente envolve a introdução da mistura em um meio aquoso. Como os fosfolipídeos são hidrofóbicos e não são prontamente solúveis em água, a adição de fosfolipídeos ou de uma mistura de lipídeos diretamente a uma solução aquosa faz com que o pó de lipídeos se agregue, formando aglomerados que são muito difíceis de dispersar. Desse modo, o processo de hidratação não pode ser controlado dentro de um tempo de processamento razoável. A hidratação direta de fosfolipídeos ou de uma mistura de lipídeos em um meio aquoso produz uma suspensão turva, com partículas que variam de 0,6 pm a 100 pm. Devido à distribuição de tamanhos de partículas relativamente grande, a suspensão não pode ser filtrada à temperatura ambiente quando a temperatura da solução de suspensão está abaixo das temperaturas de transição de fase de gel para cristal líquido dos lipídeos. Os lipídeos se acumulariam nos filtros, causando uma restrição na taxa de fluxo e, na maioria dos casos, os filtros seriam completamente bloqueados logo depois. Uma redução adicional no tamanho das partículas em suspensão não pode ser conseguida com um processo descontínuo convencional, mesmo após uma misturação prolongada (por exemplo, 6 horas) a temperaturas elevadas (por exemplo, 40 C a 00°C), com um propulsor marinho comumente utilizado.

Embora a filtração a temperaturas elevadas, isto é, acima das temperaturas de transição de fase de lipídeos, seja possível, uma quantidade significativa de partículas de lipídeos maiores ainda seria excluída quando fosse utilizada uma pressão de filtração normal. Por sua vez, concentrações do filtrado estéril teriam um teor de lipídeos variável de lote para lote, dependendo de como os lipídeos são inicialmente hidratados, o que, por sua vez, é determinado pelas características físicas, por exemplo, morfologia, dos materiais de partida. O processo de hidratação direta dos lipídeos ou da mistura de lipídeos para produzir uma suspensão uniforme e filtração da suspensão através de um filtro(s) de esterilização pode ser difícil e caro para ter sua escala aumentada a qualquer escala comercial razoável, por exemplo, > 20 litros.

Desse modo, os processos aqui reivindicados para fabricação de uma mistura de lipídeos e da subseqüente suspensão de fosfolipídeos devem resolver os problemas acima, proporcionando um processo prático que pode ser facilmente aumentado em escala e adotado para várias instalações de fabricação, sem modificação ou adaptação excessiva do equipamento existente.

Descrição Resumida da Invenção Portanto, um objetivo da presente invenção consiste na apresentação de um novo processo para preparação de uma mistura de lipídeos.

Outro objetivo da presente invenção consiste na apresentação de um novo processo para preparação de uma suspensão de fosfolipídeos e partir da mistura de fosfolipídeos.

Esses e outros objetivos, que tomar-se-ão claros durante a descrição detalhada a seguir, foram atingidos pela descoberta dos autores da invenção de que a dissolução de uma mistura de lipídeos em um solvente não aquoso adequado, antes da introdução de uma solução aquosa, permite a produção de uma suspensão de fosfolipídeos.

Descrtcão Detalhada da Tnvknoão [1] Desse modo, em uma primeira modalidade, a presente invenção apresenta um novo processo para preparação de uma suspensão de fosfolipídeos, que compreende: (1) contato de uma mistura de lipídeos com um solvente não aquoso, com o que a mistura de lipídeos se dissolve substancialmente no solvente não aquoso; e (2) contato da solução da etapa (1) com uma solução aquosa, para formar uma suspensão de lipídeos.

[2] Em uma modalidade preferida, o solvente não aquoso é selecionado dentre propileno glicol, etileno glicol e polietileno glicol 300.

[3] Em uma modalidade mais preferida, o solvente não aquoso é propileno glicol.

[4] Em outra modalidade preferida, a mistura de lipídeos compreende: (a) l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidil colina; (b) l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfotídico, sal monossódico; e (c) N-(metoxipolietileno glicol 5000 carbamoil)-l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidil etanol amina, sal mono-sódico.

[5] Em outra modalidade preferida, na etapa (1), o solvente não aquoso é aquecido a uma temperatura de aproximadamente 30 a 70°C antes do contato com a mistura de lipídeos.

[6] Em outra modalidade mais preferida, o solvente não aquoso é aquecido a uma temperatura de aproximadamente 50 a 552C antes do contato com a mistura de lipídeos.

[7] Em outra modalidade preferida, a razão de mistura de lipídeos para solvente não aquoso é de aproximadamente 5 mg de mistura de lipídeos por ml de solvente não aquoso a aproximadamente 15 mg/ml.

[8] Em outra modalidade mais preferida, a razão de mistura de lipídeos para solvente não aquoso é de aproximadamente 10 mg/ml.

[9] Em outra modalidade preferida, na etapa (2), a solução aquosa é selecionada dentre água, solução salina, uma mistura de solução salina/glicerina e uma mistura de solução salina/glicerina/solvente não aquoso.

[10] Em outra modalidade mais preferida, a solução aquosa é uma mistura de solução salina e glicerina.

[11] Em outra modalidade mais preferida, a solução aquosa é uma mistura de solução salina, glicerina e propileno glicol.

[12] Em outra modalidade mais preferida, 6,8 mg/ml de cloreto de sódio estão presentes, 0,1 ml/ml de glicerina estão presentes, 0,1 ml/ml de propileno glicol estão presentes, e aproximadamente 0,75 a 1,0 mg/ml da mistura de lipídeos estão presentes.

[13] Em uma modalidade ainda mais preferida, 0,75 mg/ml de mistura de lipídeos estão presentes.

[14] Em outra modalidade mais preferida, 1,0 mg/ml de mistura de lipídeos estão presentes.

[15] Em outra modalidade preferida, na etapa (2), a solução aquosa é aquecida até uma temperatura de aproximadamente 45 a 60°C antes do contato com a solução da etapa (1).

[16] Em outra modalidade mais preferida, a solução aquosa é aquecida até uma temperatura de aproximadamente 50 a 55°C antes do contato com a solução da etapa (1).

[17] Em outra modalidade preferida, o processo também compreende: (3) aquecimento da suspensão de lipídeos da etapa (2) a uma temperatura aproximadamente igual ou acima da temperatura mais elevada de transição de fase de gel para cristalina líquida dos lipídeos presentes na suspensão.

[18] Em outra modalidade mais preferida, na etapa (3), a suspensão de lipídeos é aquecida até uma temperatura de pelo menos aproximadamente 67°C.

[19] Em outra modalidade mais preferida, o processo também compreende: (4) filtração da suspensão de lipídeos através de um filtro de esterilização.

[20] Em outra modalidade ainda mais preferida, na etapa (4), a filtração é efetuada utilizando-se dois cartuchos de filtro de esterilização.

[21] Em uma modalidade preferida adicional, na etapa (4), os cartuchos de filtro de esterilização estão a uma temperatura de aproximadamente 70 a 80°C.

[22] Em outra modalidade preferida adicional, na etapa (4), utilizando-se filtros hidrofílicos de 0,2 pm.

[23] Em outra modalidade ainda mais preferida, o processo também compreende: (5) dosagem da solução filtrada da etapa (4) em um frasco.

[24] Em outra modalidade preferida adicional, o processo também compreende: (6) troca do gás no espaço superior do frasco da etapa (5) por um gás de perfluorocarboneto.

[25] Em outra modalidade ainda mais preferida, o gás de perfluorocarboneto é perfluoropropano.

[26] Em outra modalidade ainda mais preferida, a troca do gás no espaço superior é efetuada utilizando-se uma câmara de liofilização.

[27] Em outra modalidade ainda mais preferida, o processo também compreende: (7) esterilização do frasco da etapa (6).

[28] Em uma modalidade ainda mais preferida, na etapa (7), o frasco é esterilizado a aproximadamente 126-130°C, durante 1 a 10 minutos.

[29] Em uma segunda modalidade, a presente invenção apresenta um novo processo para preparação de uma mistura de lipídeos, que compreende: (a) contato de pelo menos dois lipídeos com um primeiro solvente não aquoso; (b) concentração da solução em um gel espesso; (c) contato do gel espesso com um segundo solvente não aquoso; e (d) coleta dos sólidos resultantes.

[30] Em uma modalidade preferida, na etapa (a), os lipídeos são: (i) l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidil colina; (ii) l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfotídico, sal monossódico; e (iii) N-(metoxipolietileno glicol 5000 carbamoil)-l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidil etanol amina, sal monossódico.

[31] Em outra modalidade preferida, na etapa (a), o primeiro solvente não aquoso é uma mistura de metanol e tolueno.

[32] Em outra modalidade preferida, na etapa (c), o segundo solvente não aquoso é um éter metil t-butílico.

[33] Em outra modalidade preferida, na etapa (a), a solução é aquecida até uma temperatura suficiente para a dissolução completa dos lipídeos no solvente.

[34] Em outra modalidade mais preferida, na etapa (a), a solução é aquecida a aproximadamente 25 a 75°C.

[35] Em outra modalidade preferida, na etapa (d), os sólidos coletados são lavados com éter metil t-butílico e secados a vácuo.

[36] Em uma terceira modalidade, a presente invenção apresenta uma nova suspensão de fosfolipídeos, que compreende: (a) uma mistura de lipídeos em uma quantidade de aproximadamente 0,75 - 1,0 mg/ml de suspensão; (b) cloreto de sódio em uma quantidade de aproximadamente 6,8 mg/ml de suspensão; (c) glicerina em uma quantidade de aproximadamente 0,1 ml/ml de suspensão; (d) propileno glicol em uma quantidade de aproximadamente 0,1 ml/ml de suspensão; e (e) água; em que a suspensão é preparada pelo processo que compreende: (1) contato de uma mistura de lipídeos com um solvente não aquoso, com o que a mistura de lipídeos se dissolve substancialmente no solvente não aquoso; (2) contato da solução da etapa (1) com uma solução aquosa, para formar uma suspensão de lipídeos; (3) aquecimento da suspensão de lipídeos da etapa (2) a uma temperatura aproximadamente igual ou acima da temperatura mais elevada de transição de fase de gel para cristalina líquida dos lipídeos presentes na suspensão; e (4) filtração da suspensão de lipídeos através de um filtro de esterilização.

[37] Em outra modalidade preferida, a mistura de lipídeos compreende: (a) l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidil colina; (b) l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfotídico, sal mono-sódico; e (c) N-(metoxipolietileno glicol 5000 carbamoil)-l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidil etanol amina, sal mono-sódico.

[38] Em outra modalidade mais preferida, o solvente não aquoso é aquecido a uma temperatura de aproximadamente 50 a 5 5o C antes do contato com a mistura de lipídeos.

[39] Em outra modalidade mais preferida, a razão de mistura de lipídeos para solvente não aquoso é de aproximadamente 10 mg/ml.

[40] Em outra modalidade mais preferida, a solução aquosa é uma mistura de solução salina, glicerina e propileno glicol.

[41] Em uma modalidade ainda mais preferida, 0,75 mg/ml de mistura de lipídeos estão presentes.

[42] Em outra modalidade mais preferida, a solução aquosa é aquecida até uma temperatura de aproximadamente 50 a 55°C antes do contato com a solução da etapa (1).

[43] Em outra modalidade mais preferida, na etapa (3), a suspensão de lipídeos é aquecida até uma temperatura de pelo menos aproximadamente 67°C.

[44] Em outra modalidade mais preferida, na etapa (4), usam-se dois filtros hidrofílicos de 0,2 qm.

Formulação Considera-se que a presente invenção seja praticada em escala de multigramas, escala de quilogramas, escala de multiquilogramas ou escala industrial. Escala de multigramas, conforme aqui utilizado, é, preferivelmente, a escala em que pelo menos um material de partida está presente em 10 gramas ou mais, mais preferivelmente pelo menos 50 gramas ou mais, ainda mais preferivelmente pelo menos 100 gramas ou mais, Escala de multiquilogramas, conforme aqui utilizado, significa a escala na qual mais de um quilograma de pelo menos um material de partida é utilizado. Escala industrial, conforme aqui utilizado, significa uma escala diferente da escala laboratorial e que é suficiente para suprir produto suficiente para testes clínicos ou distribuição a consumidores.

Mistura de lipídeos ou mistura de fosfolipídeos, conforme aqui utilizado, se destina a representar 2 ou mais lipídeos que tenham sido misturados. A mistura de lipídeos está, em geral, em forma de pó. Preferivelmente, pelo menos um dos lipídeos é um fosfolipídio. Preferivelmente, a mistura de lipídeos contém l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidil colina (DPPC), l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatídico, sal mono-sódico (DPPA), e N-(metoxipolietileno glicol 5000 carbamoil)-l,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidil etanol amina, sal mono-sódico (MPEG5000-DPPE). A quantidade de cada lipídio presente na mistura vai depender do produto final desejado. Razões preferidas de cada lipídio são descritas na seção de Exemplos. Uma ampla variedade de outros lipídeos, como aqueles descritos na patente norte-americana no. 5.469.854, de Unger et al. cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência, pode ser utilizada no presente processo.

Fosfolipídeo, conforme aqui utilizado, é uma substância graxa contendo uma cadeia(s) de hidrocarboneto oleoso (hidrofóbico), com um grupo extremidade fosfórico polar (hidrofílico). Fosfolipídeos são anfifílicos. Formam limites e vesículas fechadas espontaneamente em meios aquosos. Fosfolipídeos constituem aproximadamente 50% da massa da membrana plasmática de células animais.

Preparação da mistura de lipídeos A mistura de lipídeos pode ser preparada por um processo de suspensão aquosa-liofilização ou um processo de dissolução em solvente orgânico-precipitação usando solventes orgânicos, No processo de suspensão aquosa-liofilização, os lipídeos desejados são postos em suspensão em água a uma temperatura elevada e, então, concentrados por liofilização. Preferivelmente, usa-se um procedimento de dissolução.

Etapa (aí 0 procedimento de dissolução em' solvente orgânico-precipitação envolve o contato dos lipídeos desejados (por exemplo, DPPA, DPPC e MPEG5000 DPPE) com um primeiro sistema solvente não aquoso. Esse sistema é, tipicamente, uma combinação de solventes, por exemplo, CHCl3/MeOH, CH2Cl2/MeOH e tolueno/MeOH. Preferivelmente, o primeiro solvente não aquoso é uma mistura de tolueno e metanol. Pode ser desejável aquecer a solução de lipídeos a uma temperatura suficiente para se obter uma dissolução completa. Essa temperatura é, preferivelmente, de aproximadamente 25 a 75°C, mais preferivelmente de aproximadamente 35 a 65°C.

Após a dissolução, pode ser desejável remover matéria estranha não dissolvida por filtração a quente ou resfriamento à temperatura ambiente e, então, filtração. Métodos conhecidos de filtração podem ser utilizados (por exemplo, filtração por gravidade, filtração a vácuo ou filtração sob pressão).

Etapa (b): A solução é, então, concentrada em um gel espesso/semi-sólido. A concentração é feita, preferivelmente, por destilação a vácuo. Outros métodos de concentração da solução, como evaporação rotativa, também podem ser utilizados. A temperatura dessa etapa é, preferivelmente, de aproximadamente 20 a 60°C, mais preferivelmente de 30 a 50°C.

Etapa (c): O gel espesso/semi-sólido é, então, disperso em um segundo solvente não aquoso. A mistura transformada em uma pasta semifluida, preferivelmente próximo à temperatura ambiente (por exemplo, 15-30°C). Solventes secundários não aquosos utilizáveis são aqueles que fazem com que os lipídeos precipitem da solução filtrada. O segundo solvente não aquoso é, preferivelmente, éter metil t-butílico (MTBE). Outros éteres e álcoois podem ser utilizados.

Etapa (d): Os sólidos produzidos com a adição do segundo solvente não aquoso são, então, coletados. Preferivelmente, os sólidos coletados são lavados com outra parte do segundo solvente não aquoso (por exemplo, MTBE). A coleta pode ser efetuada mediante filtração a vácuo ou centrifugação, preferivelmente à temperatura ambiente. Após a coleta, é preferível que os sólidos sejam secados a vácuo, a uma temperatura de aproximadamente 20-60°C.

Pelas seguintes razões, o processo de dissolução com solvente orgânico/precipitação é preferível ao processo de suspensão aquosa/liofilização: (1) Como os lipídeos são muito solúveis em tolueno/metanol, os volumes de solvente são significativamente reduzidos (com relação ao procedimento aquoso). (2) Por causa dessa solubilidade aumentada, a temperatura do processo também é mais baixa com relação ao procedimento aquoso, evitando, dessa forma, a instabilidade hidrolítica dos ésteres de ácidos graxos. (3) Quando resfriada de volta à temperatura ambiente, a solução de lipídeos em tolueno/metanol permanece homogênea, permitindo a filtração à temperatura ambiente para remover matéria estranha sólida. (4) A precipitação em MTBE permite um rápido e fácil isolamento dos sólidos da Mistura de Lipídeos. Com o processo aquoso, usa-se um processo de liofilização demorado para isolar o material. (5) A precipitação em MTBE também permite a remoção de quaisquer impurezas solúveis em MTBE, que passem para a corrente de refugos do filtrado. Esse potencial de remoção de impurezas não é atingido quando uma solução é diretamente concentrada ou liofilizada em um sólido. (6) 0 presente processo fornece sólidos uniformes.

Preparação da suspensão de lipídeos Etapa (1): Na etapa (1), uma mistura de lipídeos é colocada em contato com um solvente não aquoso, com o que a mistura de lipídeos se dissolve substancialmente no solvente não aquoso. Alternativamente, os lipídeos individuais podem ser colocados em contato com o solvente não aquoso seqüencialmente, na ordem: DPPC, DPPA e MEPG5000-DPPE; DPPC, MPEG5000-DPPE e DPPA; MEPG5000-DPPE, DPPA e DPPC; ou MPEG5000-DPPE, DPPC e DPPA. 0 DPPA, sendo que o menos solúvel e o menos abundante dos lipídeos, não é adicionado primeiro. A adição de um dos outros lipídeos antes ou concomitantemente com a adição do DPPA facilita a dissolução do DPPA, Em outra alternativa, os lipídeos individuais podem ser combinados em suas formas sólidas, e a combinação dos sólidos colocada em contato com o solvente não aquoso.

Uma dissolução substancial é genericamente indicada quando a mistura de mistura de lipídeos e solvente não aquoso se torna clara. Conforme anteriormente apontado, fosfolipídeos em geral não são solúveis em água. Desse modo, a introdução direta de uma mistura de fosfolipídeos em um ambiente aquoso faz com que a mistura de lipídeos se agregue, formando grumos que são muito difíceis de dispersar. A presente invenção supera essa limitação dissolvendo a mistura de lipídeos em um solvente não aquoso, antes da introdução da solução aquosa. Isso permite dispersar uniformemente a mistura de lipídeos em um líquido. A dispersão líquida pode ser, então, introduzida em um ambiente aquoso desejado. Não aquoso significa um solvente ou mistura de solventes em que a quantidade de água presente seja suficientemente baixa para não impedir a dissolução da mistura de lipídeos. A quantidade de solvente não aquoso requerida vai depender da solubilidade da mistura de lipídeos e também da concentração final desejada de cada componente. Como os técnicos no assunto perceberão, o nível de água presente no solvente não aquoso que pode ser tolerado variará com base nas solubilidades em água dos lipídeos individuais na mistura de lipídeos. Quanto mais solúveis em água os fosfolipídeos individuais, mais água pode estar presente na etapa (1). Preferivelmente, usa-se propileno glicol como o solvente não aquoso. Entretanto, outros elementos da família dos poliòis, como etileno glicol e polietileno glicol 300, podem ser utilizados. A misturação mecânica da mistura de lipídeos com solvente não aquoso pode ser necessária para se obter uma dissolução completa. Os técnicos no assunto reconhecerão que vários modos de misturação estão disponíveis. E preferível usar um homogeneizador de elevado cisalhamento.

Os técnicos no assunto reconhecerão que a elevação da temperatura do solvente deve auxiliar na dissolução da mistura de lipídeos. A temperatura em que a etapa (1) pode ser efetuada pode variar da ambiente ao ponto de ebulição do solvente escolhido. Preferivelmente, a temperatura é de aproximadamente 30 a aproximadamente 70°C, mais preferivelmente de aproximadamente 45 a aproximadamente 60°C, e, ainda mais preferivelmente, de aproximadamente 50, 51, 52, 53, 54 ou 55°C. Quando se usa etileno glicol ou polietileno glicol 300, é preferível que a temperatura seja de aproximadamente 50 a aproximadamente 60°C, mais preferivelmente de aproximadamente 55°C. A manutenção da solução a uma temperatura elevada deve reduzir a viscosidade em solução e facilitar a preparação da formulação.

Um procedimento preferido para dissolução da mistura de lipídeos é o seguinte: (a) adicionar propileno glicol a um recipiente de pesagem apropriado, (b) aquecer o propileno glicol a aproximadamente 40-80°C em um banho de aquecimento, (c) pesar a mistura de lipídeos em um recipiente separado, (d) quando o propileno glicol tiver atingido a faixa de temperatura desejada, transferir a solução para o recipiente contendo a mistura de lipídeos, (e) colocar o recipiente de volta ao banho de aquecimento, até que a solução esteja clara, (f) misturar mecanicamente a solução de Mistura de Lipídeos/Propileno Glicol para assegurar uma dissolução ainda mais completa e uma dispersão uniforme da mistura de lipídeos. A razão de mistura de lipídeos para solvente não aquoso estará limitada, evidentemente, pela solubilidade da mistura de lipídeos. Essa razão também será influenciada pela quantidade desejada de mistura de lipídeos na formulação final. Preferivelmente, a razão é de aproximadamente 1 mg de mistura de lipídeos por ml de solvente (mg/ml) a aproximadamente 100 mg/ml, Mais preferivelmente, a mistura de lipídeos está presente em aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 mg/ml. Ainda mais preferivelmente, a mistura de lipídeos está presente em aproximadamente 10 mg/ml.

Etapa (2): A segunda etapa envolve o contato da solução da etapa (1) com uma solução aquosa, para formar uma suspensão de lipídeos. A solução aquosa pode ser água, solução salina, uma mistura de solução salina/glicerina ou uma mistura de solução salina/glicerina/solvente não aquoso. Solvente não aquoso é como previamente definido, preferivelmente propileno glicol. Suspensão, conforme aqui utilizado, se destina a indicar uma dispersão em que partículas insolúveis estejam dispersadas em um meio líquido.

Uma vez que a dissolução completa da mistura de lipídeos tenha sido conseguida (etapa (1)), a solução resultante pode ser, então, introduzida em uma solução aquosa. A solução aquosa pode conter um ou mais componentes selecionados dentre cloreto de sódio, gliceirna e um solvente não aquoso. Preferivelmente, a solução aquosa contém glicerina e cloreto de sódio. Preferivelmente, uma quantidade suficiente de propileno glicol está presente na solução aquosa, antes da adição da solução da etapa 1, para se atingir a concentração final desejada de propileno glicol. Não se espera que a ordem de adição dos componentes desejados tenha impactos sérios sobre a suspensão de lipídeos resultante.

Entretanto, é preferível que a solução de mistura de lipídeos seja adicionada a água, que pode já conter os componentes adicionais acima indicados.

Componentes desejáveis adicionais podem ser, então, adicionados. É mais preferível que a solução de mistura de lipídeos seja adicionada a uma / solução de água e cloreto de sódio (isto é, solução salina). E ainda mais preferível que a solução de mistura de lipídeos seja adicionada a uma solução de água, cloreto de sódio e glicerina. É ainda mais preferível que a solução de mistura de lipídeos seja adicionada a uma solução de água, cloreto de sódio, glicerina e propileno glicol. E preferível que 6,8 mg de NaCl estejam presentes por ml de formulação. Preferivelmente, 0,1 ml de glicerina está presente por ml de formulação. Uma concentração final de 0,1 ml de propileno glicol por ml de formulação é preferível. O pH final da formulação é, preferivelmente, de aproximadamente 5,5-7,0. A mistura de lipídeos está presente, preferivelmente, em uma quantidade de 0,75-1,0 mg/ml de formulação. A temperatura da solução aquosa pode variar da ambiente a 70°C. Preferivelmente, a temperatura é de aproximadamente 45 a 60°C, com 50, 51, 52, 53, 54 ou 55 graus sendo ainda mais preferida. Para se obter uma dissolução completa, a mistura precisará ser agitada, preferivelmente revolvida. Da mesma forma, o pH da solução pode precisar ser ajustado, dependendo da formulação final desejada. Um ácido (por exemplo, HC1) ou uma base (por exemplo, NaOH) pode ser adicionado para de obter esse ajuste. A suspensão de lipídeos conterá partículas líquidas de tamanhos variáveis. Um dos benefícios da presente invenção é a capacidade de se obterem consistentemente partículas pequenas, de tamanho quase uniforme. Desse modo, é preferível que a maior parte das partículas obtidas tenham menos de 100 nm de diâmetro, mais preferivelmente menos de 50 nm.

Um procedimento preferido para a dissolução da mistura de / lipídeos é o seguinte: (a) adicionar Agua para Injeção (WFI) a um recipiente de combinação, (b) iniciar a misturação e assegurar que a temperatura seja de 50-55°C, (c) adicionar cloreto de sódio ao recipiente de combinação. Esperar até que o sólido tenha se dissolvido completamente, antes de se proceder à próxima etapa, (d) adicionar glicerina ao recipiente de combinação. Permitir um tempo suficiente para misturação completa, (e) adicionar o propileno glicol restante que não esteja na solução de Mistura de Lipídeos/Propileno Glicol. Deixar passar um tempo para uma misturação completa, (f) reduzir a taxa de misturação para reduzir a turbulência no recipiente de combinação, (g) adicionar a solução de Mistura de Lipídeos/Propileno Glicol ao recipiente de combinação, (h) reajustar a misturação na taxa original, (i) adicionar WFI adicional, caso necessário, (j) continuar a misturação durante aproximadamente 25 minutos e assegurar uma misturação completa, (k) verificar e ajustar a solução no pH de alvo. Etapa (3): A etapa (3) envolve o aquecimento da suspensão de lipídeos obtida na etapa (2) a uma temperatura aproximadamente igual a ou acima da temperatura mais elevada de transição de fase de gel para cristalina líquida dos lipídeos presentes na solução.

Um dos objetivos desta etapa é fornecer uma suspensão filtrável. Uma soluçâo/suspensão é considerada filtrável se não houver uma redução significativa na taxa de fluxo em um processo normal, e não houver um aumento significativo na queda de pressão no sistema de filtração.

Os dados experimentais indicam que os lipídeos na formulação devem estar além de sua transição de fase de gel para cristalina líquida para simplificar a filtração estéril. Quando os lipídeos estão abaixo da temperatura de transição de fase, as partículas da suspensão são rígidas. Entretanto, quando estão acima de suas respectivas temperaturas de transição de fase de gel para cristalina líquida, estão em uma configuração mais frouxamente organizada e, portanto, mais facilmente filtráveis. DPPC e DPPA mostra transições de fase de 41°C e 67°C, respectivamente. MPEG5000-DPPE é solúvel em água, conseqüentemente não exibe uma transição de fase de gel para cristalina líquida, que é característica da maioria das suspensões de lipídeos hidratadas. Como os lipídeos na formulação preferida exibem todos diferentes transições de fase de gel para líquida, a temperatura de transição de fase mais elevada, 67°C, é preferencialmente utilizada para filtrar a solução. Com a manutenção da temperatura em ou acima de 67°C, todos os lipídeos estão além de suas respectivas transições de fase, assegurando a configuração frouxa enquanto atravessam os filtros. O aquecimento pode ser conseguido por uma camisa em torno / do recipiente de combinação, com uma serpentina de troca de calor. Agua quente/vapor de uma fonte controlada, por exemplo, um banho de água quente, ou um aquecedor de água, fornecería calor suficiente para manter a solução em combinação a uma determinada temperatura. Outras fontes de calor conhecidas pelos técnicos no assunto também poderíam ser utilizadas. Etapa (4): A etapa (4) é efetuada através da filtração da suspensão de lipídeos através de um filtro de esterilização. A finalidade dessa etapa é a obtenção de uma suspensão substancialmente livre de bactérias. Um filtrado é considerado substancialmente livre de bactérias quando a probabilidade de o filtrado conter pelo menos um microorganismo formador de colônia é menor que 10'6. A filtração é feita, preferivelmente, utilizando-se cartuchos de filtro de esterilização. Da mesma forma, pode ser necessário um meio para forçar a solução através dos filtros (por exemplo, bombeamento ou pressurização). Como a solução que está sendo filtrada precisa ser mantida a uma temperatura igual ou acima da temperatura mais elevada de transição de fase de gel para cristalina líquida dos lipídeos presentes na solução, a filtração deve ser efetuada aproximadamente a essa mesma temperatura. Para se conseguir isso, o filtro (por exemplo, cartuchos de filtro de esterilização) são, preferivelmente, fechados em caixas de filtro com camisa, que são continuamente aquecidas, por exemplo, por vapor d'água quente de um banho de água de temperatura controlada, para assegurar que a suspensão esteja acima das temperaturas de transição de fase dos lipídeos. A temperatura do filtro de esterilização é, preferivelmente, de 50 a 100°C, mais preferivelmente de 60 a 90°C, e ainda mais preferivelmente de 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ou 80°C.

Um ou mais filtros de esterilização podem ser utilizados para filtrar a suspensão. O número requerido se baseará em sua eficácia na remoção de bactérias. É preferível usar 2 filtros. O tamanho dos poros do filtro serão limitados pela necessidade de fornecer uma suspensão livre de bactérias. Preferivelmente, usam-se filtros hidrofílicos de 0,2 pm.

Uma formulação bruta da formulação preferida foi continuamente filtrada através de 2 filtros hidrofílicos de 0,2 pm durante até 3 horas, a uma taxa de aproximadamente 1 litro por minuto (1 1/min), isto é, uma passagem total de 180 litros da solução de suspensão através dos filtros. Os resultados experimentais mostram que não há nenhum bloqueio aparente dos filtros. Os ensaios de lipídeos indicam que não há nenhuma perda mensurável durante o processo de filtração (devida à acumulação no meio de filtro).

Uma solução bruta da formulação preferida foi combinada a 40°C-80°C, e a suspensão foi resfriada à temperatura ambiente antes da filtração estéril. Nenhum entupimento aparente dos filtros foi observado, indicando que a distribuição de tamanhos de partículas da suspensão está bem abaixo dos 0,2 pm do tamanho de poro do filtro. E desejável o emprego de calor durante a filtração para assegurar uma recuperação máxima da mistura de lipídeos no filtrado estéril (isto é, para minimizar a retenção em potencial de partículas de lipídio no meio de filtro).

Um procedimento preferido para a filtração da suspensão de lipídeos é o seguinte: (a) assegurar que todos os filtros com camisa estejam a 70°C-80°C, (b) assegurar que todas as válvulas na unidade de filtração estejam fechadas, (c) conectadas a mangueira de entrada de filtração à saída do recipiente de combinação, (d) abrir as válvulas para permitir que a solução atravesse os filtros, (e) lavar com 3 litros de solução os filtros, antes de coletar o filtrado, (f) continuar a filtração até o término.

Etapa (5): A dosagem da solução filtrada em um frasco completa a etapa (5). Preferivelmente, esta etapa é efetuada em uma área asséptica controlada. Os técnicos no assunto reconhecerão que o frasco selecionado e a quantidade de suspensão dosada no frasco dependerão do uso final considerado para a suspensão de lipídeos. A dosagem pode ser conseguida por vários métodos, incluindo pipeta, dosador de seringa manual (por exemplo, a máquina dosadora de seringa Filamatic®), ou uma máquina auto-dosadora industrial (por exemplo, a máquina de enchimento automático Cozzoli ou TL).

Etapa (6): A etapa (6) é efetuada trocando-se o gás no espaço superior dos frascos da etapa (5) por um gás de perfluorocarboneto. Um método preferido de troca é carregar os frascos dosados em uma câmara de liofilização e substituir o gás do espaço superior do frasco por um gás de perfluorocarboneto. Um gás preferido é o perfluoropropano (PFP). Outros métodos de troca do gás do espaço superior conhecidos pelos técnicos no assunto podem ser empregados.

Os frascos são vedados ao término do ciclo de troca de gás do espaço superior do frasco. Quando a pressão da câmara do liofilizador é trazida de volta à pressão atmosférica por carregamento da câmara com PFP, rolhas de frascos são assentadas para vedar os frascos.

Etapa (7): A etapa (7) envolve a esterilização terminal de um frasco após a etapa seis. Um método de esterilização terminal é mediante o uso de uma autoclave. Da mesma forma, os frascos vedados podem ser terminalmente esterilizados em um esterilizador de vapor, para aumentar ainda mais a certeza de esterilidade do produto. Deve-se tomar cuidado no processo de esterilização, pois alguma degradação dos lipídeos pode ser observada como resultado da autoclavagem. Preferivelmente, o frasco é esterilizado a aproximadamente 126-130°C, durante 1 a 10 minutos.

Outras características da invenção ficarão claras no decorrer das seguintes descrições de realizações exemplificativas, que são dadas para ilustrar a invenção e não devem ser tomadas como limitativas.

Exemplos: Tabela 1: Composição de Alvo da Mistura de Lipídeos Procedimentos de Fabricação da Mistura de Lipídeos i.telHM/Bttaaei 4S.SS «c tttM· ypntítnfimnm ^ L^Bk* iMTBSitey S.MiAipaceci «MUm· Um balão é carregado com tolueno (3,3 1), metanol (1,2 1), DPPA (59,6 g), DPPC (535 g) e MPEG5000 DPPE (405 g).

Após enxaguar as superfícies de contato com sólidos com 0,9 litros de metanol, a pasta semifluida é aquecida a 45-55°C até a dissolução completa. A solução é filtrada e, então, concentrada a vácuo a 35-45°C em / um gel espesso. Eter metil t-butílico (MTBE, 5,4 1) é adicionado, e a mistura é transformada em uma pasta semifluida a 15-30°C. Sólidos brancos são coletados por centrifugação ou filtração a vácuo, e lavados com MTBE (0,9 1). Os sólidos são, então, colocados em um forno a vácuo e secados até um peso constante a 40-50°C. A Mistura de Lipídeos seca é transferida para uma garrafa e armazenada de -15 a -25°C.

Em outra modalidade do procedimento de fabricação da mistura de lipídeos da presente invenção, o seguinte procedimento também pode ser utilizado.

Procedimento Alternativo de Fabricação da Mistura de Lipídeos As quantidades de fosfolipídeos foram ajustadas quanto à pureza, com base em um valor de “Usar Como”, a partir dos certificados de análise. O tamanho da batelada (peso de fosfolipídeos combinados) deste experimento foi de 2 kg.

Um balão de evaporação rotativa é carregado seqüencialmente com tolueno (3300 ml), metanol (1200 ml), DPPA (122,9 g; corrigido para uma pureza “usar como” de 97,0%), DPPC (total de 1098,5 g; 500,8 g de um lote com uma pureza “usar como” de 96,7%), e MPEG5000 DPPE (815,7 g; corrigido para uma pureza “usar como” de 99,3%). Após enxaguar os sólidos residuais no balão com metanol (900 ml), o balão é colocado em um evaporador rotativo (sem vácuo), e a pasta semifluida é aquecida entre 45 e 55°C (externa). Após a dissolução completa, a temperatura externa é reduzida entre 35 e 45°C, aplica-se um vácuo, e a solução é concentrada em um semi-sólido branco. 0 balão é removido do evaporador, e os sólidos são rompidos com uma espátula. O balão é reaplicado ao evaporador, e a concentração é continuada. Após atingir o ponto final (pressão de vácuo final de 20 mbar; sólido grumoso, granular, branco), MTBE (5.400 ml) é adicionado através do tubo de adição do evaporador rotativo, o vácuo é descontinuado, e a mistura é transformada em uma pasta semifluida durante 15 a 45 min, de 15 a 30°C. Os sólidos são isolados por centrifugaçâo ou filtração a vácuo, enxaguados com MTBE (3.800 ml) e secados a um peso constante em um forno a vácuo (40 a 50°C). Antes da transferência para garrafas de polietileno com tampas de polipropileno, os grumos de sólidos são rompidos através de uma tela (malha de 2 mm (0,079 polegadas)), fornecendo 1966,7 g (98%) de mistura de lipídeos (SG896) como um sólido branco. A suspensão de lipídeos preferida contém: 1.2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfotídico, sal monossódico (DPPA); 1.2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidil colina (DPPC); N-(metoxipolietileno glicol 5000 carbamoil)-l,2-dipalmitoil-sn- glicero-3-fosfatidil etanol amina, sal monossódico (MPEG5000-DPPE);

Propileno glicol, USP;

Glicerina, USP;

Cloreto de sódio, USP; e Agua para Injeção, USP.

Tabela 2: Formulações de Agente de Contraste Preferidas *A formulação A tem 1 mg/ml de mistura de lipídeos. A formulação B tem uma concentração de mistura de lipídeos de 0,75 mg/ml. **A mistura de lipídeos consiste em 53,5% em peso de DPPC, 6,0% em peso de DPPA e 40,5% em peso de MPEG5000-DPPE.

Tabela 3: Recipiente e Fechamento Preferidos O volume de enchimento do produto final pode ser de 1,0 - 2,0 ml/frasco.

Na preparação da formulação preferida, quando a mistura de lipídeos é diretamente hidratada com a solução de matriz aquosa contendo água para injeção, cloreto de sódio, glicerina e propileno glicol, os filtrados têm menos lipídeos, em comparação com a solução bruta pré-filtração. A perda de lipídeos varia de 12% a 48%, Esses resultados demonstram que o processo de filtração estéril não é eficazmente controlado e, portanto, o teor de lipídeos do produto final é altamente variável.

Por outro lado, com o emprego do processo aqui descrito, os resultados do ensaio de lipídeos demonstram uma recuperação completa dos lipídeos durante o processo de filtração. A variabilidade dos resultados do ensaio em torno de alvos teóricos está dentro da variabilidade normal do método de ensaio. A distribuição de tamanhos de partículas por número, por volume e por intensidade de reflexão de uma suspensão preparada primeiro solubilizando-se a mistura de lipídeos em propileno glicol indica que a maioria das partículas têm menos de 50 nm na solução bruta pré-filtrada tanto a 55°C quanto como a 70°C. A curva de distribuição de partículas não se altera após a filtração.

Seção de Utilidade O processo aqui reivindicado é utilizável na preparação de agentes de contraste para ultra-som. Esses agentes devem ser úteis para várias aplicações de formação de imagem, incluindo contraste intensificado em imagens ultra-sônicas ecocardiográficas e radiológicas.

Obviamente, inúmeras modificações e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima. Conseqüentemente, deve ficar entendido que, dentro do âmbito das reivindicações anexas, a invenção pode ser praticada de outras formas, além das especificamente aqui descritas.

Reivindicações

Claims (19)

1. PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DE UMA SUSPENSÃO DE FOSFOLIPÍDEOS, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: (a) contato dos seguintes fosfolipídeos: l,2*dipalmitoil'S/r glicero 3 - fosfatidil colina, ácido 1,2 ■ dip almitoil - s/r gl i ce r o - 3 - fosfo t.í d ico, sal mono-sódico! e N (metoxipolietileno glicol 5000 carbamoil)-l,2-dipalmitoil-sn~glicero"3‘fosfatidil etanolamina, sal mono-sódico; com um primeiro solvente não aquoso, que é uma mistura de metanol e tolueno, onde os fosfolipídeos se dissolvem e formam uma solução de fosfolipídeos! (b) contato da solução de fosfolipídeos com um segundo solvente não aquoso, que é éter metil t-butílico onde os fosfolipídeos se precipitam como uma mistura de fosfolipídeos sólida! (c) coleta da mistura de fosfolipídeos sólida! (d) contato da mistura de fosfolipídeos sólida com um terceiro solvente não aquoso, que é propilenoglicol, previamente aquecido a uma temperatura de 50°C a 55°C, onde a mistura de fosfolipídeos se dissolve para formar uma solução de mistura de fosfolipídeos! (e) contato da solução de mistura de fosfolipídeos, previamente aquecida até uma temperatura de 50°C a 55°C com uma solução aquosa previamente aquecida até uma temperatura de 50°C a 55°C, para produzir uma suspensão de fosfolipídeos.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa contém água, solução salina, uma mistura de solução salina/glicerina ou uma mistura de solução salina/glicerina/solvente não aquoso.

3. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa contém uma mistura de solução salina e glicerina.

4. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa contém uma mistura de solução salina, glicerina e propileno glicol.

5. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que 6,8 mg/ml de cloreto de sódio estão presentes, 0,1 ml/ml de glicerina estão presentes, 0,1 ml/ml de propileno glicol estão presentes, e 0,75 a 1,0 mg/ml da mistura de fosfolipídeos estão presentes na suspensão de fosfolipídeos.

6. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que 0,75 mg/ml de mistura de fosfolipídeos estão presentes.

7. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que 1,0 mg/ml de mistura de fosfolipídeos estão presentes.

8. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, na etapa (d), a razão de mistura de fosfolipídeos sólida para o terceiro solvente não aquoso é de 5 mg de mistura de fosfolipídeos sólida por ml de solvente não aquoso a 15 mg/ml.

9. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a razão de mistura de fosfolipídeos sólida para o terceiro solvente não aquoso é de 10 mg/ml.

10. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (d) do processo compreende adicionalmente: filtração da solução de mistura de fosfolipídeos através de um filtro de esterilização para formar uma solução de mistura de fosfolipídeos filtrada.

11. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a filtração é efetuada utilizando-se 2 cartuchos de filtro de esterilização.

12. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que os cartuchos de filtro de esterilização estão a uma temperatura de 70 a 80°C.

13. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que se utilizam filtros hidrofílicos de 0,2 pm.

14. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o processo compreende adicionalmente: a dosagem da solução de mistura de fosfolipídeos filtrada em um frasco.

15. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o processo compreende adicionalmente: troca do gás no espaço superior do frasco por um gás de perfluorocarboneto.

16. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o gás de perfluorocarboneto é perfluoropropano.

17. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a troca do gás no espaço superior é efetuada utilizando-se uma câmara de liofilização,

18. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o processo compreende adicionalmente: esterilização do frasco.

19. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o frasco é esterilizado a 126 130°C, durante 1 a 10 minutos.