BRPI1106904A2 - mÉtodo para remover lÍquido de um substrato poroso em que os embriÕes de plantas sço dispostos - Google Patents
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Abstract
MÉTODO PARA REMOVER LÍQUIDO DE UM SUBSTRATO POROSO EM QUE OS EMBRIÕES DE PLANTAS SçO DISPOSTOS. A presente invenção fornece os métodos de remover o líquido de um substrato poroso no qual os embriões de plantas estão dispostos.
Description
"MÉTODO PARA REMOVER LÍQUIDO DE UM SUBSTRATO POROSO EM QUE OS EMBRIÕES DE PLANTAS SÃO DISPOSTOS" FUNDAMENTOS
A silvicultura moderna muitas vezes necessita do plantio de grandes números de plantas geneticamente idênticas que foram selecionadas por ter propriedades vantajosas. A produção de novas plantas através da reprodução sexual que produz sementes botânicas é geralmente não prática. A propagação assexual, por intermédio da cultura de embriões somáticos ou zigóticos, foi apresentada para algumas espécies para produzir grandes números de embriões geneticamente idênticos, cada um tendo a capacidade de desenvolver em uma planta normal.
A clonagem somática é o processo de criar plantas geneticamente idênticas a partir do tecido da planta outro que não os gametas macho e fêmea. Em um método para a clonagem somática, o tecido vegetal é cultivado e, um meio de início que inclui hormônios, tais como auxinas e/ou citocininas, para iniciar a formação de tecido embriogênico, tal como massas de suspensão embriogênicas, que são capazes de desenvolver em embriões somáticos. O tecido embriogênico é novamente cultivado em um meio de multiplicação que promove o estabelecimento e multiplicação do tecido embriogênico para formar os embriões pré-cotiledonários (isto é, os embriões que não possuem cotilédones). Os embriões pré-cotiledonários são depois cultivados em um meio de desenvolvimento que promove o desenvolvimento e a maturação dos embriões somáticos cotiledonários que podem, por exemplo, ser colocados no meio de germinação para produzir os germinantes, e subseqüentemente transferidos ao solo para outro crescimento, ou alternativamente, colocado dentro das sementes fabricadas e plantado no solo onde estes germinam para produzir mudas. As sementes fabricadas são descritas, por exemplo, na Patente U.S. N-5.564.224; 5.687.504; 5.701.699; e 6.119.395. O processo de embriogênese somática é tipicamente laborioso e ineficiente. Por exemplo, uma das etapas no processo envolve o movimento do tecido embriogênico a partir do meio de multiplicação de líquido e subsequente plaqueamento em baixa densidade em uma superfície de meio semi-sóiido para o desenvolvimento e maturação de embriões. Esta etapa é tipicamente feita de maneira manual por um técnico habilitado usando uma pipeta para dispensar uma mistura de células embriogênicas e meio líquido no meio de desenvolvimento.
Outra etapa de trabalho intensiva no processo de embriogênese é a colheita seletiva do meio de desenvolvimento dos embriões individuais para a germinação. No final da fase de desenvolvimento, os embriões podem estar presentes em vários estágios de maturidade e desenvolvimento. Aqueles que são mais prováveis de germinar com sucesso em plantas normais são preferencialmente selecionados usando vários critérios de triagem visualmente avaliados tais como o tamanho do embrião, forma (por exemplo, simetria axial), desenvolvimento do cotilédone, textura de superfície, cor, e outros, e manualmente colhidos do meio de desenvolvimento com um par de fórceps. Os embriões selecionados desejados são depois cuidadosamente posicionados, e separados um dos outros para outro processamento. Este é um trabalho altamente habilitado e ainda tedioso que consome tempo e é caro. Além disso, este possui um gargalo de maior produção quando a saída desejada final é milhões de plantas.
Esforços foram feitos para automatizar o processo de embriogênese somática. A tecnologia de embriogênese somática em escala e automática pode garantir o uso de grandes volumes de meio líquido ou água para propósitos de diluição e/ou fragmentação dos embriões imaturos e maduros de modo a mover e posicionar os embriões para etapas subsequentes do processo. Por exemplo, as culturas de suspensão no final do estágio de multiplicação podem ser diluídas de modo a facilitar o plaqueamento regular dos embriões pré-cotiledonários no meio de desenvolvimento.
Outro exemplo do uso de grandes volumes de líquido é na etapa de fragmentação. A fragmentação é uma etapa de processamento que ocorre no fim do desenvolvimento e maturação em que os embriões são fisicamente separados uns dos outros e a massa de suspensão embriogênica (ESM) adjacente antes de outro processamento tal como, por exemplo, inserção na semente fabricada, ou colocação no meio de germinação ou pré- germinação para outro tratamento antes da inserção na semente fabricada. A fragmentação pode ser efetuada pulverizando-se os embriões e ESM ligado com o líquido para removê-lo do meio de desenvolvimento; usando uma série de peneiras para separar os embriões uns dos outros e do ESM residual; colocando os embriões em grandes volumes de líquido; e subseqüentemente colocando os embriões individuais em um substrato poroso.
A presença do líquido em excesso no substrato em que os embriões são colocados na etapa de plaqueamento e/ou etapa de fragmentação pode ser problemática. Evitar o excesso de umidade e retenção dos resíduos hormonais do meio líquido na interface gel-célula é crítico para a qualidade do desenvolvimento do embrião. Além disso, a presença do líquido no substrato nos quais os embriões são dispostos pode ter efeitos negativos significantes na germinação.
Portanto, são necessários métodos para remover o líquido da superfície dos embriões e o substrato no qual os embriões estão dispostos, sem prejudicar os embriões ou perturbar a posição dos embriões no substrato. A presente invenção dedica-se a estas e outras necessidades. sumário
A presente invenção fornece métodos de remover líquido de um substrato poroso no qual os embriões das plantas estão dispostos. Os métodos da invenção incluem as etapas de: (a) fornecer um substrato poroso tendo uma superfície de topo e uma superfície de fundo; (b) dispor os embriões de plantas na superfície de topo do substrato poroso; (c) fornecer um orifício de entrada em comunicação com uma fonte de vácuo, em que a área transversal do orifício de entrada é de menos do que a área de superfície do fundo do substrato poroso; (d) levar o orifício de entrada e uma porção da superfície de fundo do substrato poroso tendo os embriões de plantas dispostos na superfície de topo correspondente na proximidade de cada outra de modo que a orifício de entrada está em comunicação com a fonte de vácuo, deste modo aplicando vácuo à porção da superfície de fundo do substrato poroso em proximidade ao orifício de entrada; e (e) mover o orifício de entrada e a superfície de fundo do substrato poroso com relação um ao outro enquanto o orifício de entrada está em comunicação com a fonte de vácuo até substancialmente toda de uma área desejada de da superfície de fundo do substrato poroso ter estado em proximidade ao orifício de entrada, deste modo removendo o líquido da área desejada do substrato poroso no qual os embriões de plantas estão dispostos. Descrição DAS FIGURAS
Os aspectos precedentes e muitas das vantagens presentes desta invenção se tornarão mais prontamente apreciados de modo que os mesmos se tornarem melhor entendidos através da referência à seguinte descrição detalhada, quando tomados em conjunto com os desenhos em anexo, em que:
A FIGURA 1 ilustra de maneira esquemática um sistema a vácuo exemplar para o uso de acordo com uma forma de realização dos métodos da invenção; e A FIGURA 2 ilustra de maneira esquemática uma forma de
realização dos métodos da invenção em que um substrato poroso com os embriões dispostos no topo da superfície do substrato poroso é movido através de uma abertura em um alojamento de vácuo. Descrição DETALHADA Como aqui usado, o termo "massa de suspensão embriogênica" (ESM) se refere ao estágio inicial dos embriões no processo da multiplicação através da germinação e clivagem.
Como aqui usado, o termo "tecido embriogênico" se refere a um agregado de dezenas a centenas de células embriogênicas que formam uma massa de suspensão embriogênica.
Como aqui usado, o termo "embrião vegetal" se refere a um embrião vegetal zigótico ou um embrião vegetal somático. Um embrião vegetal zigótico é um embrião encontrado dentro de uma semente botânica produzida através da reprodução sexual. Os embriões vegetais somáticos podem ser produzidos através da cultura de tecido embriogênico através de métodos padrão sob condições laboratoriais em que as células que compreendem o tecido são separadas uma das outras e instigadas a desenvolver em embriões minúsculos completos. Como aqui usado, "embrião vegetal" inclui os embriões em vários estágios de desenvolvimento e inclui tanto os embriões pré-cotiledonários quanto os cotiledonários.
Como aqui usado, o tempo "embrião pré-cotiledonário" se refere a um embrião que ainda não possui qualquer cotilédone.
Como aqui usado, o termo "embrião cotiledonário" se refere a um embrião que possui um ou mais cotilédones.
Como aqui usado, o termo "líquido" se refere a qualquer líquido usado no processo de embriogênese incluindo, mas não limitando a, água, solução isotônica, ou meio de cultura.
Como aqui usado, o termo "plaqueamento" se refere ao processo de dispensar a massa de suspensão embriogênica e/ou embriões em uma superfície.
Como aqui usado, o termo "fragmentação" se refere ao processo de separar os embriões cotiledonários da massa de suspensão embriogênica e dos outros embriões para produzir embriões individuais. O processo de embriogênese somática é um processo para desenvolver os embriões vegetais in vitro. Os métodos para produzir os embriões vegetais somáticos são conhecidos na técnica e foram previamente descritos (ver, por exemplo, Patentes U.S. N°-4.957.866; 5.034.326: 5.036.007; 5.041.382; 5.236.841; 5.294.549; 5.482.857; 5.563.061; e 5.821.126). Em geral, o processo de embriogênese somática inclui as etapas de (1) início ou indução, para iniciar A formação DO tecido embriogênico, tal como massa de suspensão embriogênica (ESM), que é uma massa mucilaginosa branca que inclui includes os embriões em estágio inicial tendo um suspensor longo de parede fina associado com um topo pequeno com citoplasma denso e núcleo grande; (2) multiplicação, às vezes indicada como manutenção, para estabelecer e multiplicar o tecido embriogênico para formar embriões pré-cotiledonários, que podem ser caracterizados como tendo topos embrionários macios, com suspensores múltiplos; (3) desenvolvimento, para desenvolver e formar os embriões cotiledonários maduros somáticos; e (4) etapas pós-desenvolvimento tais como fragmentação, estratificação, germinação, colocação em sementes fabricadas, e transferência ao solo para outro crescimento e desenvolvimento.
Como previamente descrito na seção Fundamentos, o processo de embriogênese somática é de trabalho intensivo. Esforços foram feitos para automatizar e melhorar o processo para facilitar a produção de dezenas a centenas de embriões de plantas. Por exemplo, a etapa de multiplicação pode ser em um bio-reactor líquido escala comercial. No término da etapa de multiplicação, os embriões pré-cotiledonários podem ser transferidos para o meio de desenvolvimento.
Um método de transferir os embriões pré-cotiledonários para o meio de desenvolvimento é descrito na Patente U.S. Ne 7.785.884. A etapa de transferência pode ser realizada, por exemplo, removendo-se um volume de cultura de suspensão de um bio-reactor; permitindo que as células assentassem e medindo o volume de célula assentada; diluindo o volume de células assentadas com um meio de diluição estéril; dispersando uniformemente as células e o meio de diluição em uma densidade desejada em um substrato poroso disposto em uma superfície não porosa; removendo o meio de diluição estéril do substrato poroso, deste modo aprisionar os embriões pré-cotiledonários uniformemente dispersados no substrato poroso; e transferir o substrato poroso com os embriões pré-cotiledonários dispostos a um meio de desenvolvimento.
O meio de diluição estéril pode ser removido do substrato poroso através de uma variedade de métodos. Por exemplo, o substrato poroso pode ser ligado a uma estrutura de plaqueamento que compreende manivelas e pode ser verticalmente levantada pelas manivelas usando qualquer quaisquer meios adequados, tais como meios manuais ou através de meios robóticos. O meio de diluição estéril também pode ser removido usando qualquer método que evita atrapalhar a distribuição das células plaqueadas, tais como, por exemplo, sucção, drenagem, imersão, ou manchamento do meio de diluição estéril.
Os métodos acima descritos são de trabalho intensivo e envolvem a transferência do substrato poroso e das células dispostas a várias superfícies que são usadas somente um vez ou precisam ser freqüentemente manipuladas para ser prontas para ser usadas outras vezes.
Após o plaqueamento e remoção do líquido, os embriões pré-cotiledonários podem ser substituídos no meio de desenvolvimento por um período de tempo para desenvolver nos embriões cotiledonários. No fim do período de desenvolvimento, os embriões cotiledonários estão em vários degraus ligados a e embebidos nos tecidos suspensores e o ESM residual subdesenvolvido, junto com os embriões desenvolvidos de maneira incompleta, embriões formados de maneira anormal, embriões menores do que o normal ou maiores do que o normal, e outras partes de material vegetal que não o embrião, e a outros embriões. E importante para a germinação normal subsequente separar os embriões da massa de suspensão e de outros embriões para produzir os embriões individuais. Este processo de separação é indicado como "fragmentação". Como com o processo de plaqueamento, a fragmentação é trabalhosa. Tipicamente, os embriões são selecionados à mão e transferidos no papel de filtro seco ou meio que usa fórceps.
Automatizar a etapa de fragmentação é importante para melhorar a melhora comercial do processo de embriogênese, tanto para a produtividade quanto para o bem estar do trabalhador. Durante a fragmentação automatizada, os embriões podem ser lavados de um meio de desenvolvimento usando um líquido aquoso, tal como água ou uma solução de nutriente isotônico, e passados através de uma série de peneiras. Durante o peneiramento, os embriões podem ser novamente pulverizados com o líquido aquoso para facilitar a remoção e a lavagem de qualquer material indesejado, tais como embriões, tecidos, e massas de suspensão embriogênicas residuais menores do que o normal. Os embriões individuais fragmentados podem ser subseqüentemente colocados em um substrato poroso para outro processamento.
No final do processo de fragmentação automatizado, tanto os embriões quanto o substrato poroso possuem líquido livre nas suas superfícies. E importante remover o líquido residual do contato com os embriões por que o líquido em contato com os embriões pode ter efeitos prejudiciais profundos na osmolalidade e potencial de água do embrião. Por exemplo, se líquido é deixado em contato com o embrião, a mudança resultante no potencial de água do embrião pode resultar em um esverdeamento e alongamento prematuros indesejáveis.
Como descrito acima, é importante tanto na etapa de plaqueamento dos embriões pré-cotiledonários no meio de desenvolvimento, quanto na etapa de fragmentação dos embriões cotiledonários, removerem o líquido livre da superfície dos embriões dispostos e do substrato poroso no os embriões estão dispostos. Os presentes inventores descobriram métodos de remover o líquido da superfície dos embriões de plantas e um substrato poroso no qual os embriões da planta estão dispostos que resultam na remoção mais completa e consistente do líquido do que outros métodos conhecidos na técnica (por exemplo, uso de um funil de Buchner, sucção, drenagem, manchamento, etc.).
A presente invenção fornece os métodos de remover líquido de um substrato poroso no qual os embriões da planta estão dispostos. Os métodos da invenção incluem as etapas de: (a) fornecer um substrato poroso tendo uma superfície de topo e uma superfície de fundo; (b) arranjar os embriões de planta na superfície de topo do substrato poroso; (c) fornecer um orifício de entrada em comunicação com uma fonte de vácuo, em que a área transversal do orifício de entrada é menor que a área de superfície de topo do substrato poroso; (d) levar o orifício de entrada e uma porção da superfície de fundo do substrato poroso tendo embriões de plantas dispostos na superfície de topo correspondente em proximidade umas com as outras de modo que o orifício de entrada está em comunicação com a fonte de vácuo, deste modo aplicando um vácuo à porção da superfície de fundo do substrato poroso em proximidade ao orifício de entrada; e (e) mover o orifício de entrada e a superfície de fundo do substrato poroso em relação uns aos outros enquanto o orifício de entrada está em comunicação com a fonte de vácuo até substancialmente toda de uma área da superfície de fundo do substrato poroso estar em proximidade do orifício de entrada, deste modo removendo o líquido da área desejada do substrato poroso no qual os embriões de plantas estão dispostos.
Em uma forma de realização, o método da invenção também compreende a etapa de repetir as etapas de (d) e (e) até substancialmente toda a superfície de fundo do substrato poroso estar em proximidade do orifício de entrada de modo que o orifício de entrada está em comunicação com a fonte de vácuo.
Em uma forma de realização, o orifício de entrada está em comunicação contínua com a fonte de vácuo de modo que o orifício de entrada e a superfície de fundo do substrato poroso são movidos em relação uns aos outros. Em uma forma de realização, o orifício de entrada está de maneira intermitente em comunicação com a fonte de vácuo de modo que o orifício de entrada e a superfície de fundo do substrato poroso são movidos em relação uns aos outros. Em uma forma de realização, o orifício de entrada permanece
estacionária e o substrato poroso é movido através do orifício de entrada. Em uma forma de realização, o substrato poroso permanece estacionário e o orifício de entrada é movido através da superfície de fundo do substrato poroso. Em uma forma de realização, o orifício de entrada está substancialmente em contato com a superfície de fundo do substrato poroso.
Em uma forma de realização, o método da invenção também compreende a etapa de retirar uma convecção de ar no e em torno dos embriões dispostos na superfície de topo do substrato poroso, de modo que o orifício de entrada e a superfície de fundo da membrana porosa são movidos em relação uns aos outros enquanto o orifício de entrada está em comunicação com a fonte de vácuo, deste modo facilitando a remoção do líquido da superfície dos embriões dispostos por intermédio da evaporação.
Os substratos porosos que são úteis na prática da presente invenção possuem um diâmetro de poro na faixa de cerca de 5 mícrons a cerca de 1200 mícrons, tais como de cerca de 50 mícrons a cerca de 500 mícrons, tais como de cerca de 70 a cerca de 150 mícrons, tal como cerca de 100 mícrons. O substrato poroso pode ser de qualquer forma e dimensão desejadas. A forma e a dimensão do substrato poroso são escolhidas para facilitar a manipulação e adequabilidade para outro processamento dos embriões dispostos. As formas adequadas incluem as formas quadradas, retangulares, ou circulares. As dimensões exemplares são de uma área de superfície de cerca de 4 polegadas quadradas (26 cm2) a 28(181 cm2) polegadas quadradas ou maior, tal como 50 polegadas quadradas (322 cm2), 100 polegadas quadradas (644 cm2) até 500 polegadas quadradas (3226 cm2) ou maior. Os substratos porosos preferidos são esterilizáveis e suficientemente fortes para resistir à ruptura. Os exemplos de substratos porosos úteis incluem membranas, fibras de náilon, malha trançada (por exemplo, náilon, aço inoxidável ou plástico), fibras naturais (por exemplo, algodão), papel, e fibras poliméricas. Em uma forma de realização, o substrato poroso é uma membrana polimérica. Em uma forma de realização, o substrato poroso é uma membrana de náilon.
Para facilitar o manuseio e fornecer suporte, o substrato poroso pode ser montado em uma estrutura. A estrutura pode ser de qualquer material adequado tal como plástico ou metal. Em uma forma de realização, o substrato poroso é uma membrana de náilon e é composta de alumínio.
O orifício de entrada, tendo uma abertura, pode ser coberta por um alojamento de qualquer tamanho e forma adequados, tal como um alojamento retangular tendo uma abertura alongada ou um bocal. Em uma forma de realização, a extensão da abertura no alojamento é substancialmente igual a uma dimensão, por exemplo, extensão ou comprimento, do substrato poroso. Tipicamente, a extensão da abertura no alojamento pode variar de cerca de 0,001 polegada (0,00254 cm) a uma polegada ou maior, tal como de cerca de 0,001 (0,00254 cm) polegada a cerca de 0,1 polegada (0,254 cm), tal como de cerca de 0,001 polegada (0,00254 cm) a cerca de 0,01 polegada (0,0254 cm). Em uma forma de realização, o alojamento é uma estrutura retangular tendo uma abertura alongada tendo um comprimento de cerca de 5,25 polegadas (13,33 cm) e uma largura de cerca de 0,002 polegada (0,005 cm). Outras larguras de abertura no alojamento podem ser adequadas, dependendo das dimensões do substrato poroso.
Os embriões de plantas podem ser dispostos no substrato poroso em qualquer arranjo e podem ser distribuídos sobre qualquer quantidade da área de superfície do substrato poroso. Tipicamente, os embriões de plantas podem ser distribuídos sobre uma área de cerca de 30 % a cerca de 90 % ou mais da área de superfície do substrato poroso, tal como sobre uma área de cerca de 55 % a cerca de 85 % da área de superfície do substrato poroso.
Um exemplo representativo de um sistema útil na prática dos métodos da presente invenção é apresentado na FIGURA 1. Se referindo a FIGUREI, o sistema automatizado 10 compreende uma plataforma20 dividida em duas seções; um substrato poroso 30 suportado por uma estrutura adjacente, o substrato 30 tendo uma superfície de topo, na qual os embriões estão dispostos, e uma superfície de fundo; um braço mecânico corrediço 40, conduzido por um motor (não mostrado), para empurrar contra o lado adjacente da estrutura do substrato; um alojamento de vácuo 50, que está localizada entre as duas seções da plataforma 20, tendo uma abertura estreita alongada 60; um gerador ou bomba de vácuo 70 conectados à caixa de vácuo 50 por intermédio de tubos 80; e um controlador 90. Na prática de uma forma de realização do método da invenção,
um substrato poroso 30 é colocado em uma seção da plataforma 20. Os embriões de plantas podem ser dispensados no substrato poroso 30 antes de ser colocado na plataforma 20 ou após o substrato poroso 30 ser colocado na plataforma 20. O braço mecânico corrediço 40 empurra o substrato poroso 30 através do alojamento de vácuo 50. De modo que o substrato poroso 30 se move através do alojamento de vácuo 50, a superfície de fundo do substrato poroso 30 está em contato com a abertura 60 do alojamento de vácuo 50 enquanto a abertura 60 está em comunicação com o vácuo 70, resultando no líquido sendo removido do substrato poroso 30 e o ar sendo retirado sobre e em torno dos embriões dispostos na superfície do substrato poroso 30 e através do substrato poroso 30.
A FIGURA 2 ilustra de maneira esquemática o substrato poroso 30 que se move da seção da plataforma 20, através da abertura 60 do alojamento de vácuo 50, para a seção no outro lado da plataforma 20.
Em algumas formas de realização, a pressão negativa gerada pela bomba de vácuo usada na prática da invenção pode variar de cerca de -0,5 psi (-3,45 kPa) a cerca de -15 psi (-103,5 kPa), tal como de cerca de -5 psi (-34,5 kPa) a cerca de -12 psi (-82,8 kPa). Em uma forma de realização, a pressão negativa é de cerca de -10 psi. Em algumas formas de realização, a pressão negativa gerada pela fonte de vácuo é constante de modo que o orifício de entrada está em comunicação com a fonte de vácuo. Em algumas formas de realização, a pressão negativa gerada pela fonte de vácuo varia de modo que o orifício de entrada está em comunicação com a fonte de vácuo.
Em algumas formas de realização, o substrato poroso e o orifício de entrada se movem em relação uns aos outros em uma velocidade na faixa de cerca de 1 milímetro por segundo a cerca de 45 milímetros por segundo, tal como de cerca de 1 milímetro por segundo a cerca de milímetros por segundo. Em uma forma de realização, o substrato poroso e o orifício de entrada se movem em relação uns aos outros em uma velocidade de cerca de 3 milímetros por segundo.
Em uma forma de realização, o alojamento de vácuo 50 com abertura alongada 60 é de em forma retangular (por exemplo, em forma de barra) e tem um tamanho que depende do tamanho do substrato poroso, tal que o alojamento de vácuo 50 com abertura alongada 60, quando usada nos métodos da invenção, estará em contato com substancialmente toda de uma área de uma seção transversal do substrato poroso, mas não estará em contato com a área inteira do substrato poroso em qualquer tempo. Em uma forma de realização, o alojamento de vácuo 50 com abertura alongada 60 tem tamanho e forma tal que o alojamento de vácuo 50 com abertura alongada 60, quando usada nos métodos da invenção, estará em contato com menos do que 1 % da área inteira do substrato poroso em qualquer tempo, tal como de cerca de 0,01 % a cerca de 0.1 %, tal como cerca de 0,02 % a cerca de 0,05 %, tal como cerca de 0,04 %.
Os métodos da presente invenção focam intensamente um fluxo de ar a vácuo e relacionado na área específica do substrato poroso que está em proximidade com, ou substancialmente em contato com, a abertura no orifício de entrada de modo que a abertura está em comunicação com uma fonte de vácuo. Focar intensamente o vácuo nas áreas ou bandas próximas ao substrato poroso de modo que o orifício de entrada e substrato poroso são movidos em relação uns aos outros até substancialmente todo o substrato poroso estar em contato com o orifício de entrada e vácuo resulta na remoção mais consistente do líquido através da superfície inteira do substrato poroso. Além disso, os métodos da invenção removem os líquido de um substrato poroso no qual os embriões de plantas estão dispostos sem deslocar os embriões.
Os métodos da presente invenção estão em contraste com os outros métodos de remover líquidos por intermédio de um sistema de vácuo a partir do substrato porosos no qual os embriões estão dispostos, tal como o uso um funil de Buchner, em que outros métodos operam tal que o líquido é simultaneamente retirado através dos da área porosa inteira, o que pode resultar na remoção irregular de líquidos através da área porosa e/ou deslocamento dos embriões. Além disso, a presente invenção permite a remoção mais rápida do líquido da superfície do substrato porosos e da superfície dos embriões dispostos do que os métodos anteriores. Por exemplo, os métodos anteriores precisavam de 1,5 a 7 minutos para remover de maneira adequada o líquido de superfície por substrato poroso, considerando que o líquido de superfície pode ser removido usando os métodos da invenção em menos do que um minuto por substrato poroso. Os métodos atuais produzem um aumento significante nas eficiências, dada a necessidade de um ajuste de produção para processar centenas a milhares de embriões.
Além disso, embora o uso dos métodos da presente invenção possa remover o líquido das superfícies dos embriões dispostos, é importante que os métodos da presente invenção não afetem substancialmente o teor de umidade ou potencial de água dos embriões dispostos.
Uma vez que o líquido residual foi removido do substrato poroso em que os embriões estão dispostos, os embriões podem ser submetidos a outro tratamento ou processamento.
Em uma forma de realização, os embriões de plantas são embriões pré-cotiledonários. Em uma forma de realização, os métodos da invenção incluem as etapas de: (a) cultivar a massa de suspensão embrionária em ou no meio de multiplicação para formar os embriões pré-cotiledonários; (b) fornecer um substrato poroso tendo uma superfície de topo e uma superfície de fundo; (c) dispensar os embriões pré-cotiledonários formados na etapa (a) na superfície de topo do substrato poroso; (d) fornecer um orifício de entrada em comunicação com uma fonte de vácuo, em que a área transversal do orifício de entrada é menor do que a superfície de fundo da área do substrato poroso; (e) levar o orifício de entrada e uma porção da superfície de fundo do substrato poroso tendo os embriões pré-cotiledonários dispostos a superfície de topo correspondente em proximidade umas com as outras de modo que o orifício de entrada está em comunicação com a fonte de vácuo, deste modo aplicando um vácuo à porção da superfície de fundo do substrato poroso em proximidade ao orifício de entrada; e (f) mover o orifício de entrada e a superfície de fundo do substrato poroso em relação uns aos outros enquanto o orifício de entrada está em comunicação com a fonte de vácuo até substancialmente toda a área desejada da superfície de fundo do substrato poroso estar em proximidade com o orifício de entrada, deste modo removendo o líquido da área desejada do substrato poroso no qual os embriões pré-cotiledonários estão dispostos.
Em uma forma de realização, os métodos da invenção também compreendem a etapa de transferir os embriões pré-cotiledonários dispostos no substrato poroso a partir do qual o líquido deve ser removido de acordo com a etapa (f) ao meio de desenvolvimento.
Em uma forma de realização, os embriões de plantas são os embriões cotiledonários. Em uma forma de realização, os métodos da invenção incluem as etapas de: (a) cultivar os embriões pré-cotiledonários em ou no meio de desenvolvimento para formar os embriões cotiledonários; (b) fragmentar os embriões cotiledonários produzidos na etapa (a); (c) fornecer um substrato poroso tendo uma superfície de topo e uma superfície de fundo; (d) dispensar os embriões cotiledonários fragmentados na etapa (b) na superfície de topo do substrato poroso; (e) fornecer um orifício de entrada em comunicação com uma fonte de vácuo, em que a área transversal do orifício de entrada é menor do que a área da superfície de fundo do substrato poroso; (f) levar o orifício de entrada e uma porção da superfície de fundo do substrato poroso tendo embriões cotiledonários dispostos na superfície de topo correspondente em proximidade uns aos outros de modo que o orifício de entrada esteja em comunicação com a fonte de vácuo, deste modo aplicando um vácuo à porção da superfície de fundo do substrato poroso em proximidade ao orifício de entrada; e (g) mover o orifício de entrada e a superfície de fundo do substrato poroso com relação uns aos outros enquanto o orifício de entrada está em comunicação com a fonte de vácuo até substancialmente toda a área da superfície de fundo do substrato poroso estar em proximidade com o orifício de entrada, deste modo removendo o líquido da área desejada do substrato poroso no qual os embriões cotiledonários estão dispostos.
Em uma forma de realização, os métodos da invenção também compreendem a etapa de submeter os embriões cotiledonários dispostos no substrato poroso a partir do qual o líquido foi removido de acordo com a etapa (g) a um ou mais outros tratamentos, tais como estratificação, disposição em sementes fabricadas, e germinação.
As etapas no processo de embriogênese somática de
desenvolvimento, estratificação, e germinação são conhecidas na técnica. Os meios e condições exemplares para cada etapa são divulgados, por exemplo, na Patente U.S. Nfi 7.785.884. Os métodos da invenção podem ser usados em qualquer etapa no processo de embriogênese somática onde é desejável remover o líquido da superfície dos embriões e/ou de um substrato poroso no qual os embriões estão dispostos.
Os embriões de plantas adequados para o uso nos métodos da invenção podem ser de qualquer espécie vegetal, tais como plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas, gimnospermas, etc, Os embriões coníferos são adequados para o uso nos métodos da invenção e podem ser de qualquer espécie conífera, incluindo, mas não limitando a, pinheiro de Loblolly e abeto de Douglas.
Enquanto as formas de realização foram ilustradas e descritas, será apreciado que várias mudanças podem ser feitas sem romper com o espírito e escopo da invenção.
Claims (20)
1. Método para remover líquido de um substrato poroso em que os embriões de plantas são dispostos, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) fornecer um substrato poroso que possui uma superfície de topo e uma superfície de fundo; (b) dispor os embriões de plantas na superfície de topo do substrato poroso; (c) fornecer um orifício de entrada em comunicação com uma fonte de vácuo, em que a área transversal do orifício de entrada é de menos do que a área de superfície de fundo do substrato poroso; (d) levar o orifício de entrada e uma porção da superfície de fundo do substrato poroso tendo embriões de plantas dispostos na superfície de topo correspondente em proximidade umas com as outras de modo que o orifício de entrada está em comunicação com a fonte de vácuo, deste modo aplicando um vácuo à porção da superfície de fundo do substrato poroso em proximidade ao orifício de entrada; e (e) mover o orifício de entrada e a superfície de fundo do substrato poroso em relação uns aos outros enquanto o orifício de entrada está em comunicação com a fonte de vácuo até substancialmente toda de uma área desejada da superfície de fundo do substrato poroso estar em proximidade com o orifício de entrada, deste modo removendo o líquido da área desejada do substrato poroso no qual os embriões de plantas estão dispostos.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o orifício de entrada está em comunicação substancial com a porção da superfície de fundo do substrato poroso tendo embriões de plantas dispostos na superfície de topo correspondente de modo que o orifício de entrada está em comunicação com a fonte de vácuo.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende repetira as etapas (d) e (e) até substancialmente toda a superfície de fundo do substrato poroso estar em proximidade ao orifício de entrada de modo que o orifício de entrada está em comunicação com a fonte de vácuo.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o orifício de entrada está em comunicação contínua com a fonte de vácuo de modo que o orifício de entrada e a superfície de fundo do substrato poroso são movidos em relação uns aos outros.
5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o orifício de entrada está intermitentemente em comunicação com a fonte de vácuo de modo que o orifício de entrada e a superfície de fundo do substrato poroso são movidos em relação uns aos outros.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o orifício de entrada permanece estacionário e o substrato poroso é movido através do orifício de entrada.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato poroso permanece estacionário e o orifício de entrada é movido através da superfície de fundo do substrato poroso.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que também compreende a etapa de puxar uma convecção de ar sobre e em torno dos embriões dispostos na superfície de topo do substrato poroso de modo que o orifício de entrada e a superfície de fundo da membrana porosa sejam movidos em relação uns aos outros de modo que o orifício de entrada esteja em comunicação com a fonte de vácuo, facilitando deste modo a remoção do líquido da superfície dos embriões dispostos por intermédio da evaporação
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o orifício de entrada é coberto por um alojamento tendo uma abertura.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a abertura no alojamento tem uma largura de cerca de 0,001 polegada (0,00254 cm) a cerca de 0,01 polegada (0,0254 cm).
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o orifício de entrada está em comunicação com uma fonte de vácuo tendo uma pressão negativa na faixa de cerca de -0,5 psi (3,45 kPa) a cerca de -15 psi (103,5 kPa).
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a pressão negativa da fonte de vácuo é constante de modo que o orifício de entrada esteja em comunicação com a fonte de vácuo.
13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a pressão negativa da fonte de vácuo varia de modo que o orifício de entrada esteja em comunicação com a fonte de vácuo.
14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o orifício de entrada e o substrato poroso se movem em relação uns aos outros em uma velocidade de cerca de 1 milímetro por segundo a cerca de 45 milímetros por segundo.
15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato poroso é uma membrana polimérica.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a membrana polimérica é uma membrana de náilon.
17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os embriões de plantas são embriões pré-cotiledonários.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreender transferir os embriões pré-cotiledonários ao meio de desenvolvimento.
19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os embriões de plantas são embriões cotiledonários.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que também compreender submeter os embriões cotiledonários a um ou mais dos tratamentos de estratiíicação, inserção na semente fabricada, e germinação.
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