BRPI1106599A2

BRPI1106599A2 - Oligonucleotides, use, method and kit for detecting yeast contamination of samples

Info

Publication number: BRPI1106599A2
Application number: BRPI1106599-0A
Authority: BR
Inventors: Gildo Almeida Da Silva
Original assignee: Brasil Pesquisa Agropec
Priority date: 2011-09-26
Filing date: 2011-09-26
Publication date: 2015-09-01
Also published as: BR112014004755A2; WO2013044336A1

Abstract

Oligonucleotídeos, uso, método e kit para detecção de contaminação de amostras por leveduras. A presente invenção descreve oligonucleotídeos, uso, método e kit para detecção de contaminação de amostras por leveduras. A invenção está relacionada com a identificação taxonômica e detecção de leveduras em bebidas.Oligonucleotides, use, method and kit for detecting yeast contamination of samples. The present invention describes oligonucleotides, use, method and kit for detecting yeast contamination of samples. The invention relates to taxonomic identification and detection of yeast in beverages.

Description

OLIGONUCLEOTÍDEOS, USO, MÉTODO E KIT PARA DETECÇÃO DE CONTAMINAÇÃO DE AMOSTRAS POR LEVEDURASOLIGONUCLEOTIDS, USE, METHOD AND KIT FOR DETECTION OF SAMPLE CONTAMINATION BY Yeast

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção descreve oligonucleotídeos universais, uso, método e kit para detecção de contaminação de amostras por leveduras. A presente invenção se situa no campo industrial.FIELD OF THE INVENTION The present invention describes universal oligonucleotides, use, method and kit for detecting yeast contamination of samples. The present invention is in the industrial field.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O processo de detecção de leveduras é efetuado por plaqueamento em meios próprios e por meio de técnicas de biologia molecular. Entre estas últimas, a PCR e suas variações têm sido amplamente empregadas. O par de oligonucleotídeos da presente invenção foi desenhado para detectar qualquer gênero de levedura e ser empregado como controle positivo de amplificação em PCR. Desta forma, os oligos da presente invenção auxiliam na verificação da eficácia de diferentes processos de extração de DNA, em produtos alimentícios e em bebidas, especialmente vinho, cerveja e cidra.BACKGROUND OF THE INVENTION The yeast detection process is carried out by plating on proprietary media and by molecular biology techniques. Among the latter, PCR and its variations have been widely employed. The oligonucleotide pair of the present invention was designed to detect any genus of yeast and to be employed as a positive PCR amplification control. Thus, the oligos of the present invention assist in verifying the effectiveness of different DNA extraction processes in food products and beverages, especially wine, beer and cider.

Existem muitos oligos para detectar leveduras específicas como os descritos em WO 2007132589 (grupo de primers utilizados para detectar D.anômala, D.bruxellensis, D.custersiana ou B.naardenensis), WO 2008/006985 (kit para detecção de contaminação por leveduras Brettanomyces), US 2004/0166492 (novos oligonucleotídeos capazes de se ligar à região do espaçador transcrito interno de Dekkera bruxellensis, entre outros, sendo útil para a identificação de microorganismos relacionados à fermentação), FR 2908786 (kit para detecção de contaminação de leveduras Brettanomyces), WO 2007/021027 (oligonucleotídeos, arranjos contendo esses oligos, aparato, método e kit de detecção de microorganismos, incluindo Dekkera), US 20080268430 (métodos e kits relacionados a detecção, identificação e quantificação de leveduras em vinho, cerveja e sucos). No entanto, poucos documentos mostram oligos universais para identificação de leveduras sem a detecção de outros microorganismos.There are many oligos for detecting specific yeasts such as those described in WO 2007132589 (group of primers used to detect D. anomala, D.bruxellensis, D.custersiana or B.naardenensis), WO 2008/006985 (Brettanomyces yeast contamination detection kit ), US 2004/0166492 (novel oligonucleotides capable of binding to the internal transcribed spacer region of Dekkera bruxellensis, among others, being useful for the identification of fermentation-related microorganisms), FR 2908786 (Brettanomyces yeast contamination detection kit) , WO 2007/021027 (oligonucleotides, arrangements containing such oligos, apparatus, method and kit for the detection of microorganisms, including Dekkera), US 20080268430 (methods and kits related to the detection, identification and quantification of yeast in wine, beer and juices). However, few documents show universal oligos for yeast identification without detection of other microorganisms.

Andorrà et al. (Andorrà, i.; Landi, s.; Mas, a; Guillamón, j.m.; Esteve-zarzoso, h. Effect of oenological practices on microbial populations using culture-independent techniques. Food microbiol, 25(7): 849—856, 2008) utilizaram PCR em processos de avaliação de populações de leveduras, bactérias lácticas e acéticas em vinho para evitar o emprego de técnicas dependentes de meios de cultura. A PCR aliada a outras técnicas tem sido empregada para caracterizar leveduras, presentes em presunto (Andrade, m.j.; Rodríguez, m.; Casado, e.; Córdoba, j.j. Efficiency of mitochondrial dna restriction analysis and rapd-pcr to characterize yeasts growing on dry-cured iberian ham at the different geographic areas of ripening. Meat Science, 84(3): 377 — 383, 2010), entereococos de queijos (Andrighetto, c.; Psomas, e.; Tzanetakis, n.; Suzzi, g.; Lombardi. A randomly amplified polymorphic DNA (rapd) PCR for the Identification of yeasts isolated from dairy products. Lett appl microbiol 30(1): 5—9, 2000; Andrighetto, c.; Knijff, e.; Lombardi, a; Torriani, s.; Vancanneyt, m.; Kersters, k.; Swings, j.; Dellaglio, f. Phenotypic and genetic diversity of enterococci isolated from italian cheeses. j dairy res, (68)(2): 303—316, 2001) e lactobacilos em produtos cárneos (Andrighetto, c.; Zampese, 1.; Lombardi. A rapd-pcr characterization of lactobacilli isolated from artisanal meat plants and traditional fermented sausages of veneto region (italy)., lett appl microbiol, 33(1): 26—30, 2001a) . A diversidade microbiana de queijos também foi determinada por técnicas associadas a PCR (andrighetto, et al. 2004). lactobacilos termofílicos foram identificados por amplificação por PCR, utilizando primers espécie-específicos para amplificar segmento da região do gene 16s rRNA (andrighetto et al., 1998). Há processos que envolvem PCR na identificação de leveduras (De barros lopes, m.; Soden, a.; Henschke, p.a.; Langridge, p. PCR differentiation of commercial yeast strains using intron splice site primers. appl environ microbiol, 62: 4514—4520, 1996; De barros lopes. m.; Soden, a.; Martens; a.l; Henschke, p.a.; Langridge, p. Differentiation and species Identification of yeasts using per. int j syst bacteriol, 48: 279—286, 1998; Arroyo-lópez, f.n.; Durán-quintana, m.c.; Ruiz-barba, j.l.; Querol, a.; Garrido- femández, a. Use of molecular methods for the Identification of yeast associated with table olives, food microbiology, 23: 791 — 796, 2006; Borman, a.m.; Linton, c.j; Miles, s.j; Campbell, c.k.; Johnson, e.m. Ultra-rapid preparation of total genomic DNA from isolates of yeast and mould using whatman fia filter paper technology - a reusable dna archiving system. med mycol, 44: 389—398, 2006. Cada um destes trabalhos apresentam procedimentos e possuem detalhes específicos que abrangem desde os primers propriamente ditos, como regiões diferentes do DNA, às condições de técnicas de amplificação. Algums primers são específicos para um determinado gênero ou espécie de leveduras operando com uma variação da técnica denominada PCR aninhada (Tbeas, j.i.; Lozano, i.; Perdigones, f.; Jimenez, j. Detection of dekkera-brettanomyces strains in sherry by a nested {per} method. appl environ microbiol, 62: 998—1003, 1996), outros usam primers derivados de 28 RNA (WO 2007/062442) para a detecção de leveduras e fungos fílamentosos (WO 2007/062442) e, fínalmente, outros ainda são mais gerais pois detectam bactérias, fungos fílamentosos e leveduras com primers e sondas derivados de 16s rRNA e de 18s rDNA (US 2004/0265850) e micro-organismos (WO 2004/009839). Todos estes métodos diferem da presente invenção e se caracterizam por apresentar, além de tudo, procedimentos complexos.Andorrà et al. (Andorrà, i .; Landi, s .; But, a; Guillamón, jm; Esteve-zarzoso, h. Effect of oenological practices on microbial populations using culture-independent techniques. Food microbiol, 25 (7): 849-856, 2008) used PCR in evaluation processes of yeast populations, lactic and acetic bacteria in wine to avoid the use of culture-dependent techniques. PCR combined with other techniques has been employed to characterize yeasts present in ham (Andrade, mj; Rodríguez, m .; Married, e .; Cordoba, j. Efficiency of mitochondrial restriction analysis and rapd-pcr to characterize yeasts growing on dry iberian ham at the different geographic areas of ripening Meat Science, 84 (3): 377-383, 2010), cheese cheeks (Andrighetto, c .; Psomas, e .; Tzanetakis, n .; Suzzi, g. Lombardi A randomly amplified polymorphic DNA (rapd) PCR for the Identification of Yeasts isolated from dairy products Lett appl microbiol 30 (1): 5-9, 2000 Andrighetto, C. Knijff, and Lombardi, a; Torriani, S.; Vancanneyt, M.; Kersters, K.; Swings, J.; Dellaglio, F. Phenotypic and genetic diversity of enterococci isolated from Italian cheeses., Dairy Res, (68) (2): 303-316, 2001) and lactobacilli in meat products (Andrighetto, c .; Zampese, 1 .; Lombardi. Rapp-pcr characterization of lactobacilli isolated from artisanal meat plants and traditional fermented sausages of veneto region (Italy)., lett appl microbiol, 33 (1): 26-30, 2001a). Cheese microbial diversity was also determined by PCR-associated techniques (andrighetto, et al. 2004). Thermophilic lactobacilli were identified by PCR amplification using species-specific primers to amplify segment of the 16s rRNA gene region (andrighetto et al., 1998). There are processes involving PCR in the identification of yeast (De barros lopes, m .; Soden, a .; Henschke, pa; Langridge, P. PCR differentiation of commercial yeast strains using intron splice site primers. Appl environ microbiol, 62: 4514— 4520, 1996; De Barros Lopes, M., Soden, A.; Martens; Al; Henschke, Pa; Langridge, P. Differentiation and species Identification of yeasts using per se systolic bacteriol, 48: 279-286, 1998; Arroyo-lopez, fn; Durán-quintana, mc; Ruiz-barba, jl; Querol, a .; Garrido-femández, a .. Use of molecular methods for the identification of yeast associated with table olives, food microbiology, 23: 791 - 796, 2006; Borman, am; Linton, cj; Miles, sj; Campbell, ck; Johnson, in Ultra-rapid preparation of total genomic DNA from isolates of yeast and mold using whatman fia filter paper technology - a reusable dna archiving system. med mycol, 44: 389—398, 2006. Each of these works have procedures and specific details. These range from primers themselves, such as different regions of DNA, to the conditions of amplification techniques. Some primers are specific to a particular genus or species of yeast operating with a variation of the technique called nested PCR (Tbeas, ji; Lozano, i .; Perdigones, f.; Jimenez, J. Detection of dekkera-brettanomyces strains by sherry. nested {per} method. appl environ microbiol, 62: 998—1003, 1996), others use primers derived from 28 RNA (WO 2007/062442) for the detection of yeast and filamentous fungi (WO 2007/062442) and, finally, others are even more general because they detect bacteria, filamentous fungi and yeast with 16s rRNA and 18s rDNA (US 2004/0265850) primers and probes (WO 2004/009839). All these methods differ from the present invention and are characterized by, above all, complex procedures.

Quando se pretente amplificar um segmento de DNA, o primer desenhado para tal fim é empregado de imediato. Fatores externos podem interferir de tal sorte que a amplificação não se realiza. Surgem dúvidas sobre o primer, as condições de amplificação e as atividades das polimerases (Taq e Thh). A presente tecnologia permite a amplificação de um segmento de aproximadamente 375 pb da região 18S do DNA ribossômico de leveduras. Este par de oligonucleotídeos possui capacidade de amplificar pequenas quantidades de DNA. Por se tratar de um primer que pode ser utilizado para qualquer gênero de levedura, a escolha de um gênero de fácil acesso e de crescimento rápido para testes da eficiência das polimerases torna o processo de otimização da amplificação por PCR com outros primers, mais dinâmico. Assim, a inibição por diferentes compostos da amplificação por PCR e a eficiência de diferentes procedimentos de extração de DNA podem ser facilmente avaliadas. O par de oligonucleotídeos desenvolvido tem se mostrado muito eficiente para trabalhos de extração direta de DNA em ambientes, como vinho, nos quais há potentes inibidores enzimáticos. Amostras de líquidos naturais se caracterizam por possuir um elevado número de compostos químicos, onde alguns atuam como forte inibidores da PCR. O emprego deste par de oligonucleotídeos permite investigar a eficiência dos procedimentos de remoção de tais inibidores das amostras.When a DNA segment is to be amplified, the primer designed for that purpose is employed immediately. External factors can interfere in such a way that amplification does not take place. Doubts arise about the primer, the amplification conditions and the activities of the polymerases (Taq and Thh). The present technology allows the amplification of an approximately 375 bp segment of the 18S region of yeast ribosomal DNA. This pair of oligonucleotides is capable of amplifying small amounts of DNA. Because it is a primer that can be used for any yeast genus, choosing an easily accessible, fast-growing genus for polymerase efficiency testing makes the process of optimizing PCR amplification with other primers more dynamic. Thus, the inhibition by different compounds of PCR amplification and the efficiency of different DNA extraction procedures can be easily assessed. The developed oligonucleotide pair has been shown to be very efficient for direct DNA extraction work in environments such as wine, where there are potent enzyme inhibitors. Natural liquid samples are characterized by having a high number of chemical compounds, some of which act as strong PCR inhibitors. The use of this pair of oligonucleotides allows us to investigate the efficiency of procedures for removing such inhibitors from samples.

Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.From what can be inferred from the researched literature, no documents were found anticipating or suggesting the teachings of the present invention, so that the solution proposed here has novelty and inventive activity in the state of the art.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

Em um aspecto, a presente invenção descreve oligonucleotídeos, seu uso para detecção de leveduras, método e kit compreendendo tais oligonucleotídeos, para serem utilizados para detecção da contaminação por leveduras.In one aspect, the present invention describes oligonucleotides, their use for yeast detection, method and kit comprising such oligonucleotides, to be used for detection of yeast contamination.

De acordo com a primeira concretização da invenção é provido um grupo de oligonucleotídeos para uso na detecção de leveduras, caracterizado por hibridizar especificamente com as seqüências selecionadas do grupo de SEQ ID NO 1 ou SEQ ID N02.According to the first embodiment of the invention there is provided an oligonucleotide group for use in the detection of yeast, characterized by specifically hybridizing to the sequences selected from the group of SEQ ID NO 1 or SEQ ID NO 2.

Uma segunda concretização da invenção diz respeito ao uso ao uso de marcador molecular específico selecionado do grupo descrito em SEQ ID NOl ou SEQ ID N02.A second embodiment of the invention relates to the use of specific molecular marker selected from the group described in SEQ ID NO1 or SEQ ID NO02.

Uma terceira concretização da presente invenção diz respeito a um método de detecção de contaminação por leveduras compreendendo as etapas de: a. realizar a reação de amplificação, de ácido nucléico contido em uma amostra através da utilização de oligonucleotídeos que hibridizam especificamente com a região 18S DNAr de microorganismos; e b. detectar a presença ou ausência de um produto de amplificação, onde a geração de um produto de amplificação indica a presença do microorganismo.A third embodiment of the present invention relates to a method for detecting yeast contamination comprising the steps of: a. carry out the amplification reaction of nucleic acid contained in a sample using oligonucleotides that specifically hybridize to the 18S rDNA region of microorganisms; and b. detect the presence or absence of an amplification product, where generation of an amplification product indicates the presence of the microorganism.

Uma quarta concretização da presente invenção diz respeito a um kit de identificação de microorganismos em uma amostra caracterizado por compreender aparato para realização da reação de amplificação e reagentes de amplificação compreendendo os oligonucleotídeos da presente invenção.A fourth embodiment of the present invention relates to a microorganism identification kit in a sample comprising apparatus for carrying out the amplification reaction and amplification reagents comprising the oligonucleotides of the present invention.

Uma quinta concretização da invenção diz respeito ao uso dos oligonucleotídeos da presente invenção caracterizado por ser na identificação de microorganismos em amostras.A fifth embodiment of the invention relates to the use of the oligonucleotides of the present invention for identifying microorganisms in samples.

Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.These and other objects of the invention will be immediately appreciated by those skilled in the art and companies having an interest in the segment, and will be described in sufficient detail for reproduction in the following description.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Figura 1 — Amplificação de um específico de DNA de 375 bp da região 18S de Dekkera e Saccharomyces: M- 100 bp DNA Ladder; 1- Sacch. cerevisiae — padrão com células lisadas com tampão de lise; 2- D. bruxellensis -padrão com células lisadas com tampão de lise; 3- Sacch. cerevisiae - células lisadas com fervura; 4- D. bruxellensis - células lisadas com fervura; 5 — Sacch. cerevisiae - células lisadas com o processo de congelamento\descongelamento; 6- D. bruxellensis - células lisadas com o processo de congelamento\descongelamento; A- 25 ciclos; B- 30 ciclos; C- 35 ciclos.Figure 1 - Amplification of a 375 bp DNA specific from the 18S region of Dekkera and Saccharomyces: M-100 bp DNA Ladder; 1- Sacch. cerevisiae - standard with lysed buffer lysed cells; 2- D. bruxellensis - cell-lysed standard with lysis buffer; 3- Sacch. cerevisiae - boiled lysed cells; 4- D. bruxellensis - boiled lysed cells; 5 - Sacch. cerevisiae - cells lysed with the freezing / thawing process; 6- D. bruxellensis - cells lysed with the freezing / thawing process; A-25 cycles; B-30 cycles; C- 35 cycles.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃODETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

As leveduras estão presentes em vários tipos de bebidas, como bebidas alcoólicas e refrigerantes. Assim, a presença ou ausência de levedura pode ser utilizada como um indicador do controle de qualidade de vários tipos de bebidas. Assim, o grupo de oligonucleotídeos de acordo com a presente invenção é útil para o controle de qualidade de vários tipos de bebidas (por exemplo, bebidas alcoólicas e refrigerantes, e, particularmente, vinho e cerveja) e do exame de amostras ambientais. A presente invenção está relacionada particularmente ao desenvolvimento de um grupo de oligonucleotídeos para identificação taxonômica de leveduras. A presente invenção também está relacionada com o uso no método de identificação de leveduras em bebidas. O par de oligonucleotídeos desenvolvido tem se mostrado muito eficiente também para trabalhos de extração direta de DNA em ambientes, como vinho, nos quais há potentes inibidores enzimáticos. Amostras de líquidos naturais se caracterizam por possuir um elevado número de compostos químicos, onde alguns atuam como forte inibidores da PCR. O emprego deste par de oligonucleotídeos permite investigar a eficiência dos procedimentos de remoção de tais inibidores das amostras. A presente invenção compreende o uso de oligonucleotídeos capazes de reconhecer a região 18S rDNA de leveduras. A presente invenção também está relacionada com uma metodologia para identificação taxonômica de leveduras por meio da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase utilizando um par de oligonucleotídeos específico baseado na região 18S do DNA ribossômico. A inovação consiste no desenvolvimento de oligonucleotídeos baseados em uma região do DNA ribossômico ainda não utilizada para a detecção de leveduras de uma forma geral, tendo como consequência o desenvolvimento de um método de detecção confiável e viável de ser utilizado na rotina industrial. A vantagem é que permite, com alto grau de confiabilidade, a detecção de várias espécies de leveduras que são contaminantes de bebidas, entre elas o vinho, e que causam perdas econômicas ao setor vinícola ao se desenvolverem no produto final e produzirem quantidade de compostos fenólicos acima do limiar de percepção (LP). Permite a detecção rápida da contaminação por leveduras, possibilitando ações que reduzam as perdas econômicas.Yeasts are present in many types of beverages such as alcoholic drinks and sodas. Thus, the presence or absence of yeast can be used as an indicator of quality control of various types of beverages. Thus, the oligonucleotide group according to the present invention is useful for the quality control of various types of beverages (e.g., alcoholic and soft drinks, and particularly wine and beer) and for the examination of environmental samples. The present invention relates particularly to the development of an oligonucleotide group for taxonomic identification of yeast. The present invention also relates to the use in the beverage identification method of yeast. The developed oligonucleotide pair has also been shown to be very efficient for direct DNA extraction work in environments such as wine, where there are potent enzyme inhibitors. Natural liquid samples are characterized by having a high number of chemical compounds, some of which act as strong PCR inhibitors. The use of this pair of oligonucleotides allows us to investigate the efficiency of procedures for removing such inhibitors from samples. The present invention comprises the use of oligonucleotides capable of recognizing the 18S rDNA region of yeast. The present invention also relates to a methodology for taxonomic identification of yeast by the Polymerase Chain Reaction technique using a specific oligonucleotide pair based on the 18S region of ribosomal DNA. The innovation is the development of oligonucleotides based on a region of ribosomal DNA not yet used for the detection of yeast in general, resulting in the development of a reliable and viable detection method to be used in the industrial routine. The advantage is that it allows, with a high degree of reliability, the detection of various yeast species that are contaminants of beverages, including wine, and which cause economic losses to the wine sector as they develop in the final product and produce phenolic compounds. above the perception threshold (LP). Allows rapid detection of yeast contamination, enabling actions that reduce economic losses.

Na descrição que segue, um número de termos é utilizado extensivamente. As seguintes definições são providas para facilitar o entendimento da invenção. “Sense” significa que a seqüência de polinucleotídeo está na mesma orientação 5’—3’ da seqüência de interesse. “Antisense” significa que a seqüência de polinucleotídeo está na orientação contrária com relação a orientação 5’-3’ da seqüência de interesse. O termo “polinucleotídeo (s)” como usado aqui, significa um polímero de filamento único ou duplo de bases de deoxiribonucleotídeo ou ribonucleotídeo e inclui moléculas correspondentes de RNA e DNA, incluindo moléculas de HnRNA e mRNA, de filamentos tanto “sense” como “antisense”.In the following description, a number of terms are used extensively. The following definitions are provided to facilitate understanding of the invention. "Sense" means that the polynucleotide sequence is in the same 5'-3 'orientation as the sequence of interest. "Antisense" means that the polynucleotide sequence is in the opposite orientation to the 5'-3 'orientation of the sequence of interest. The term "polynucleotide (s)" as used herein means a single or double stranded deoxyribonucleotide or ribonucleotide base polymer and includes corresponding RNA and DNA molecules, including HnRNA and mRNA molecules, from both "sense" and " antisense ”.

Os polinucleotídeos descritos na presente invenção são preferencialmente cerca de 80% puros, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90% puros, e mais preferencialmente pelo menos ccrca de 99% puro. O termo “sonda” utilizado na presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou ácido nucléico, sendo RNA ou DNA, se ocorrendo naturalmente como em uma digestão de enzima de restrição purificada ou produzida sinteticamente, que seja capaz de se anelar com ou especificamente hibridizando com um ácido nucléico contendo seqüências complementares à sonda. Uma sonda pode ser ainda de cadeia simples ou cadeia dupla. O comprimento exato da sonda dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, origem da sonda e uso do método. Por exemplo, dependendo da complexidade da seqüência alvo, a sonda de oligonucleotídeo tipicamente contém 15-25 ou mais nucleotídeos, embora ela possa conter menos nucleotídeos. As sondas aqui são selecionadas para serem complementares para diferenciar cadeias de uma seqüência de um ácido nucléico particular. Isto significa que a sonda pode ser suficientemente complementar para ser capaz de “hibridizar especificamente” ou anelar com suas respectivas cadeias-alvo sob uma série de condições pré-determinadas. Conseqüentemente, a seqüência da sonda não necessita refletir exatamente a seqüência complementar do alvo. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode ser ligado ao final 5’ ou 3’ da sonda, com o restante da seqüência da sonda sendo complementar à cadeia alvo. Alternativamente, bases não complementares ou seqüências longas podem estar intercaladas dentro da sonda se esta tiver complementaridade suficiente com a seqüência do ácido nucléico alvo para anelar especificamente com ele. O termo “primer” como utilizado aqui refere-se a um oligonucleotídeo, sendo RNA ou DNA, cadeia simples ou cadeia dupla, derivado de um sistema biológico, gerado através de digestão com enzimas de restrição, ou produzido sinteticamente que, quando colocado em um ambiente próprio, é capaz de agir funcionalmente como um iniciador de uma síntese de ácido nucléico dependente de molde. Quando apresentado com um molde de ácido nucléico apropriado, trifosfatos nucleosídeos adequados precursores de ácidos nucléicos, uma enzima polimerase, cofatores adequados e condições tais como temperatura e pH adequados, o primer pode ser extendido em seu terminal 3’ pela adição de nucleotídeos pela ação de uma polimerase ou com atividade similar para produzir uma primeira extensão do produto. O ‘primer’ pode variar em comprimento dependendo de condições particulares e requerimentos para aplicação. Por exemplo, em aplicações de diagnósticos, o ‘primer’ oligonucleotídeo possui tipicamente de 15-25 ou mais nucleotídeos em comprimento. O ‘primer’ deve ter complementaridade suficiente com o molde desejado para iniciar a síntese da extensão do produto desejado. Isso não significa que a seqüência do ‘primer’ deva representar um complemento exato do molde desejado. Por exemplo, uma seqüência de nucleotídeo não complementar pode ser ligada ao final 5’ de um ‘primer’ complementar. Altemativamente, bases não complementares podem estar intercaladas dentro da seqüência de oligonucleotídeo do ‘primer’, desde que o ‘primer’ tenha complementaridade suficiente com a seqüência da cadeia molde desejada para prover funcionalmente um complexo molde-primer para a síntese da extensão do produto. O termo “hibridizando especificamente” diz respeito à associação entre duas moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples que possuam seqüências suficientemente complementares para permitir tal hibridização sob condições predeterminadas geralmente descritas no estado da técnica (apostila: Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capitulo 1, 2003) Em particular, o termo se refere à hibridização de um oligonucleotídeo com uma seqüência substancialmente complementar contendo uma molécula de DNA ou RNA de cadeia simples da presente invenção. Condições apropriadas necessárias para realização da hibridização específica entre moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples de complementaridade variada estão bem descritas no estado da técnica (apostila: Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capitulo 4, 2003). Uma fórmula comum para se calcular as condições de estringência requeridas para se ter uma hibridização entre moléculas de ácido nucléico segue abaixo (Sambrook et ah, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press): Tm = 81,5°C + 16,6 Log [Na+] + 0,41 (%G+C) - 0,63 (% formamida)-600/pb no duplex (sonda) Como ilustração da fórmula acima, usando [Na+] = [0,368] e 50% de formamida, com conteúdo de GC de 42% e um tamanho de sonda médio de 200 bases, a Tm será de 57°C.The polynucleotides described in the present invention are preferably about 80% pure, more preferably at least about 90% pure, and most preferably at least about 99% pure. The term "probe" used in the present invention refers to an oligonucleotide, polynucleotide or nucleic acid, being RNA or DNA, if occurring naturally as in a purified or synthetically produced restriction enzyme digestion, which is capable of annealing with or specifically hybridizing to a nucleic acid containing sequences complementary to the probe. A probe may further be single stranded or double stranded. The exact length of the probe will depend on many factors, including temperature, probe origin, and method use. For example, depending on the complexity of the target sequence, the oligonucleotide probe typically contains 15-25 or more nucleotides, although it may contain fewer nucleotides. The probes here are selected to be complementary to differentiate chains of a sequence from a particular nucleic acid. This means that the probe may be sufficiently complementary to be able to "specifically hybridize" or ring to their respective target chains under a number of predetermined conditions. Consequently, the probe sequence need not accurately reflect the complementary sequence of the target. For example, a non-complementary nucleotide fragment may be ligated to the 5 'or 3' end of the probe, with the remainder of the probe sequence being complementary to the target chain. Alternatively, non-complementary bases or long sequences may be interspersed within the probe if it has sufficient complementarity with the target nucleic acid sequence to specifically ring with it. The term "primer" as used herein refers to an oligonucleotide, whether RNA or DNA, single stranded or double stranded, derived from a biological system, generated by restriction enzyme digestion, or synthetically produced which, when placed in a environment, is able to functionally act as an initiator of a mold dependent nucleic acid synthesis. When presented with an appropriate nucleic acid template, suitable nucleoside triphosphates, nucleic acid precursors, a polymerase enzyme, suitable cofactors, and conditions such as appropriate temperature and pH, the primer may be extended at its 3 'terminus by the addition of nucleotides by the action of a polymerase or similar activity to produce a first product extension. The primer may vary in length depending on particular conditions and requirements for application. For example, in diagnostic applications, the oligonucleotide primer is typically 15-25 or more nucleotides in length. The primer must have sufficient complementarity with the desired template to initiate synthesis of the desired product extent. This does not mean that the primer sequence must represent an exact complement of the desired template. For example, a non-complementary nucleotide sequence may be linked to the 5 'end of a complementary primer. Alternatively, non-complementary bases may be interspersed within the primer oligonucleotide sequence, provided that the primer has sufficient complementarity with the desired template chain sequence to functionally provide a template-primer complex for synthesis of product extension. The term "specifically hybridizing" refers to the association between two single-stranded nucleic acid molecules that have sufficiently complementary sequences to permit such hybridization under predetermined conditions generally described in the state of the art (Handout: Recombinant DNA Technology. University of São Paulo, In particular, the term refers to the hybridization of an oligonucleotide to a substantially complementary sequence containing a single stranded DNA or RNA molecule of the present invention. Appropriate conditions necessary for specific hybridization between single-stranded nucleic acid molecules of varying complementarity are well described in the art (Handout: Recombinant DNA Technology. University of Sao Paulo, Chapter 4, 2003). A common formula for calculating stringency conditions required for hybridization between nucleic acid molecules follows below (Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press): = 81.5 ° C + 16.6 Log [Na +] + 0.41 (% G + C) - 0.63 (% formamide) -600 / bp in duplex (probe) As an illustration of the above formula using [Na + ] = [0.368] and 50% formamide, with 42% GC content and an average probe size of 200 bases, Tm will be 57 ° C.

Sondas ou primers são descritos como correspondendo ao polinucleotídeo da presente invenção identificado como SEQ ID NOl ou SEQ ID N02 ou uma variante do mesmo, se a sonda de oligonucleotídeo ou primer, ou seu complemento, estiver contido dentro da seqüência especificada como SEQ ID NOl ou SEQ ID N02, ou uma variante desta. O termo “oligonucleotídeo” refere-se a um segmento relativamente curto de uma seqüência de polinucleotídeo, geralmente compreendendo entre 6 a 60 nucleotídeos. Esses oligonucleotídeos podem ser usados como sondas ou iniciadores (“primers”), onde as sondas podem ser usadas para uso em testes de hibridização e iniciadores para uso na amplificação de DNA por reação de cadeia polimerase. O termo “oligonucleotídeo” é referido aqui como ‘primers’ e ‘sondas’ da presente invenção, e é definido como uma molécula de ácido nucléico compreendendo de dois ou mais ribo ou deoxiribonucleotídeos, preferencialmente mais do que três. O tamanho exato dos oligonucleotídeos dependerá de vários fatores e na aplicação particular e uso dos oligonucleotídeos. Oligonucleotídeos preferidos compreendem 15-50 pares de base consecutivas complementares à SEQ ID NO 1 ou SEQ ID N02. As sondas podem ser facilmente selecionadas usando procedimentos bem descritos no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), levando em consideração estringências de hibridização DNA-DNA, recombinação e temperaturas de fusão, e potencial para formação de laços e outros fatores, que são conhecidos no estado da técnica. A definição dos termos “complemento”, “complemento reverso” e “seqüência reversa”, como usados aqui, é ilustrada pelo seguinte exemplo. Para a seqüência 5’AGTGAAGT3’, o complemento é 3TCACTTCA5’, o complemento reverso é 3’ACTTCACT5’ e a seqüência reversa é 5’TGAAGTGA3’.Probes or primers are described as corresponding to the polynucleotide of the present invention identified as SEQ ID NO1 or SEQ ID NO.2 or a variant thereof, if the oligonucleotide probe or primer, or complement thereof, is contained within the sequence specified as SEQ ID NO1 or SEQ ID NO: 2, or a variant thereof. The term "oligonucleotide" refers to a relatively short segment of a polynucleotide sequence, generally comprising from 6 to 60 nucleotides. Such oligonucleotides may be used as probes or primers, where probes may be used for use in hybridization assays and primers for use in polymerase chain reaction DNA amplification. The term "oligonucleotide" is referred to herein as "primers" and "probes" of the present invention, and is defined as a nucleic acid molecule comprising two or more ribo or deoxyribonucleotides, preferably more than three. The exact size of oligonucleotides will depend on several factors and on the particular application and use of oligonucleotides. Preferred oligonucleotides comprise 15-50 consecutive base pairs complementary to SEQ ID NO 1 or SEQ ID NO02. Probes can be easily selected using state-of-the-art procedures (Sambrook et al "Molecular Cloning, a laboratory manual", CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), taking into account DNA-DNA hybridization stringencies, recombination. and melting temperatures, and potential for bonding and other factors, which are known in the art. The definition of the terms "complement", "reverse complement" and "reverse sequence" as used herein is illustrated by the following example. For the 5'AGTGAAGT3 'sequence, the complement is 3TCACTTCA5', the reverse complement is 3'ACTTCACT5 'and the reverse sequence is 5'TGAAGTGA3'.

Como usado aqui, o termo “variante” ou “substancialmente similar” compreende seqüências de aminoácidos ou nucleotídeos diferentes de seqüências especificamente identificadas, em que um ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos é deletado, substituído ou adicionado. As variantes podem ser variantes alélicas, de ocorrência natural, ou variantes de ocorrência não natural. As seqüências variantes ou substancialmente similares dizem respeito a fragmentos de ácidos nucléicos que podem ser caracterizados pela porcentagem de similaridade de suas seqüências de nucleotídeos com as seqüências de nucleotídeo descritas aqui (SEQ ID NO 1 ou SEQ ID N02), como determinada por algoritmos comuns empregados no estado da técnica. Os fragmentos de ácidos nucléicos preferidos são aqueles cujas seqüências de nucleotídeos têm pelo menos cerca de 40 ou 45% de identidade de seqüência, preferencialmente cerca de 50% ou 55% de identidade de seqüência, mais preferencialmente cerca de 60% ou 65% de identidade de seqüência, mais preferencialmente cerca de 70% ou 75% de identidade de seqüência, mais preferencialmente cerca de 80% ou 85% de identidade de seqüência, mais preferencialmente ainda com cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência quando comparada com a seqüência de referência. A identidade percentual é determinada por alinhamento de duas seqüências a serem comparadas, determinando o número de resíduos idênticos na porção alinhada, dividindo este número pelo número total de resíduos na seqüência pesquisada e multiplicando o resultado por 100. Esse alinhamento pode ser feito através de softwares existentes na internet, um deles é o BLASTN, que está disponível na página do National Center for Biotechnology Information/NCBI (www.ncbi.nlm.nih.govl.As used herein, the term "variant" or "substantially similar" encompasses amino acid sequences or nucleotides other than specifically identified sequences, wherein one or more nucleotides or amino acid residues are deleted, substituted or added. Variants may be allelic, naturally occurring variants, or non-naturally occurring variants. Variant or substantially similar sequences refer to nucleic acid fragments that may be characterized by the percentage similarity of their nucleotide sequences to the nucleotide sequences described herein (SEQ ID NO 1 or SEQ ID NO 2), as determined by common algorithms employed. in the prior art. Preferred nucleic acid fragments are those whose nucleotide sequences have at least about 40 or 45% sequence identity, preferably about 50% or 55% sequence identity, more preferably about 60% or 65% identity. more preferably about 70% or 75% of sequence identity, more preferably about 80% or 85% of sequence identity, more preferably about 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% sequence identity as compared to the reference sequence. Percentage identity is determined by aligning two sequences to be compared by determining the number of identical residues in the aligned portion, dividing this number by the total number of residues in the searched sequence, and multiplying the result by 100. This alignment can be done using software. One of these is BLASTN, which is available on the National Center for Biotechnology Information / NCBI (www.ncbi.nlm.nih.govl).

Aqui, o termo "mutação" significa que os nucleotídeos podem ser os mesmos ou diferentes, podem ser selecionados a partir de uma substituição, uma exclusão, uma inserção e uma adição. Essa mutação pode ser preferencialmente selecionada de "uma substituição de uma base", onde uma certa base é substituída por outra base, “uma base de exclusão", onde uma certa base é excluída, “uma base de inserção", onde uma certa base está inserida, e "uma base de adição", em que uma certa base é adicionada. O número de mutações pode ser 1-6 bases, 1, 2, 3 ou 4, bases, 1 ou 2 bases ou uma base.Here, the term "mutation" means that nucleotides may be the same or different, may be selected from a substitution, deletion, insertion and addition. This mutation may preferably be selected from "a base substitution" where a certain base is replaced by another base, "an exclusion base", where a certain base is excluded, "an insertion base" where a certain base is inserted, and "an addition base", where a certain base is added. The number of mutations can be 1-6 bases, 1, 2, 3 or 4 bases, 1 or 2 bases or one base.

Um polinucleotídeo que constitui o grupo de primers da presente invenção pode ser preparado pela síntese química de um ácido nucléico de acordo com um método comum, como um método de fosfato triéster (Hunkapiller, M. et al. Nature, 310, 105, 1984). Caso contrário, o DNA total de uma cepa como meta de detecção pode ser obtido, e um fragmento de DNA contendo uma seqüência de nucleotídeos de interesse pode ser então obtido, conforme o caso, pelo método de PCR ou similar, com base nas seqüências de nucleotídeos divulgada na presente especificação. Mais especificamente a presente invenção diz respeito ao método de detecção de leveduras do gênero Dekkera e Brettanomyces através da técnica de PCR (Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Hom, K. B. Mullis, and Η. A. Erlich. "Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase." Science 239 (1988): 487-491; United States Patent 5,656,493 Mullis, et al. August 12, 1997: System for automated performance of the polymerase chain reaction).A polynucleotide constituting the primer group of the present invention may be prepared by the chemical synthesis of a nucleic acid according to a common method, such as a triester phosphate method (Hunkapiller, M. et al. Nature, 310, 105, 1984). . Otherwise, the total DNA of a strain as a detection target can be obtained, and a DNA fragment containing a nucleotide sequence of interest can then be obtained, as appropriate, by the PCR method or the like, based on the sequence sequences. nucleotides disclosed in this specification. More specifically the present invention relates to the method of detecting yeast of the genus Dekkera and Brettanomyces by PCR (Saiki, RK, DH Gelfand, S. Stoffel, SJ Scharf, R. Higuchi, Hom Hom, KB Mullis, and Η). A. Erlich. "Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase." Science 239 (1988): 487-491; United States Patent 5,656,493 Mullis, et al. August 12, 1997: System for automated performance of the polymerase chain reaction).

De acordo com a presente invenção, é previsto um método de detectar leveduras compreendendo as seguintes etapas: (a) realizar a reação de amplificação de ácido nucléico contido em uma amostra através da utilização do grupo de primers selecionados do grupo de SEQ ID NOl ou SEQ 1D N02; e (b) detectar a presença ou ausência de um produto de amplificação, onde a geração de um produto de amplificação indica a presença de levedura. O grupo de primers da presente invenção pode ser provido na forma de um kit, isoladamente ou em combinação. Então, de acordo com a presente invenção, é provido um kit para detecção de leveduras, que compreende um grupo de primers selecionados de seqüências de oligonucleotídeos substancialmente similares às seqüências de SEQ ID NOl ou SEQ ID N02 e uma combinação dos mesmos. O kit de acordo com a presente invenção pode compreender reagentes e aparatos, que são necessários para a implementação da reação de amplificação de ácido nucléico pelo método da presente invenção. Os reagentes do kit da presente invenção podem ser enzimas (Taq DNA polimerase, Tth DNA polimerase), solução tampão específicas para enzimas, oligonucleotídeos da presente invenção, desoxirribonucleotídeos trifosfatos, cofator cloreto de magnésio. Os aparatos do kit da presente invenção podem ser, mas não estão limitados a tubo de reação feitos de polipropileno. A reação de amplificação pode ocorrer em aparelhos específicos tais como termocicladores.According to the present invention, there is provided a method of detecting yeast comprising the following steps: (a) performing the nucleic acid amplification reaction contained in a sample using the group of primers selected from the group of SEQ ID NO1 or SEQ 1D NO2; and (b) detecting the presence or absence of an amplification product, where generation of an amplification product indicates the presence of yeast. The primer group of the present invention may be provided as a kit, alone or in combination. Thus, according to the present invention there is provided a yeast detection kit comprising a group of selected primers of oligonucleotide sequences substantially similar to the sequences of SEQ ID NO1 or SEQ ID NO02 and a combination thereof. The kit according to the present invention may comprise reagents and apparatus which are required for the implementation of the nucleic acid amplification reaction by the method of the present invention. Reagents of the kit of the present invention may be enzymes (Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase), enzyme-specific buffer, oligonucleotides of the present invention, deoxyribonucleotide triphosphates, magnesium chloride cofactor. Apparatus of the kit of the present invention may be, but are not limited to reaction tubes made of polypropylene. The amplification reaction may occur in specific apparatus such as thermal cyclers.

Assim, o conjunto de primers e kit de acordo com a presente invenção pode ser usado no controle de qualidade de bebidas alcoólicas (por exemplo, vinho, cerveja, cerveja com baixo teor de malte, vinho de fruta) e / ou de refrigerantes (por exemplo, bebidas espumantes não alcoólicas tais como a soda de limão e água gaseificada), a análise de uma amostra do ambiente (por exemplo, a água das matérias-primas).Thus, the set of primers and kit according to the present invention may be used for the quality control of alcoholic beverages (eg wine, beer, low malt beer, fruit wine) and / or soft drinks (eg non-alcoholic sparkling drinks such as lemon soda and carbonated water), analysis of a sample of the environment (eg raw water).

Dekkera anômala, Dekkera bruxellensis e Dekkera custersiana, podem ser encontradas como espécies de leveduras causadoras da deterioração no processo de produção de cerveja e cerveja com baixo teor de malte ou nos produtos finais dos mesmos. Por isso, os primers da presente invenção e combinação dos mesmos podem ser utilizados em métodos de detecção e quantificação. Este último por meio de Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR) usando qualquer um desses primers (SEQ ID N°1 e SEQ ID N°2), e um kit compreendendo esses grupos de primers. A reação de amplificação de ácido nucléico pelo método da presente invenção pode ser realizada através de métodos de amplificação utilizando reagentes comerciais já existentes no estado da técnica (cloreto de magnésio, Taq DNA polimerase e dNTP nas concentrações adequadas — Invitrogen, Promega). A reação de amplificação de ácido nucléico pode ser realizada, por exemplo, através do DNA da amostra de mistura, uma solução de primer, e reagentes de amplificação (por exemplo, um kit de amplificação de DNA Loopamp fabricado pela Eiken Chemical Co. , Ltd.), em conformidade com as instruções incluídas com o kit, e em seguida, mantendo a mistura obtida em uma determinada temperatura (óO.degree. C. a 65.degree. C.), de modo a reagir por um determinado período de tempo (em geral, uma hora). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tomar errôneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: bebidas) sem danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações.Anomalous Dekkera, Dekkera bruxellensis and Dekkera custersiana can be found as yeast species that cause deterioration in the brewing process and low-malt beer or their final products. Therefore, the primers of the present invention and combination thereof may be used in detection and quantification methods. The latter is via Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) using any of these primers (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2), and a kit comprising such primer groups. The nucleic acid amplification reaction by the method of the present invention may be carried out by amplification methods using prior art commercial reagents (magnesium chloride, Taq DNA polymerase and dNTP at appropriate concentrations - Invitrogen, Promega). The nucleic acid amplification reaction may be performed, for example, by mixing sample DNA, a primer solution, and amplification reagents (eg, a Loopamp DNA amplification kit manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd .), in accordance with the instructions included with the kit, and then keeping the mixture obtained at a certain temperature (óO.degree. C. to 65.degree. C.) in order to react for a certain period of time. time (usually one hour). Polymerase Chain Reaction (PCR) is a very sensitive method of analysis and is therefore performed with great care to avoid contamination that could make the result unfeasible or erroneous. Firstly, one should extract genetic material from the cell or other material to be studied (eg beverages) without damaging it. Normally the extracted material is DNA (DNA), but one can work with RNA (RNA) in an RT-PCR that is a PCR split and has other applications.

Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers também chamados de oligonucleotídeos (ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).After the DNA is extracted, a mixture (also known as a pre-mix) containing dNTPs (deoxyribonucleotides triphosphates), which are the nitrogenous bases linked with a phosphate, also called oligonucleotides (or primers), is added to it. and the DNA polymerase enzyme in a buffer solution. All this mixture is placed in the thermal cycler, which makes pre-set temperature cycles with specific exact times for each reaction (fragment to be amplified).

Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96 °C por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60 °C dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72 °C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2 ciclos. O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente. Este último, no entanto, tem como características o valor mais elevado e a toxicidade antes da polimerização. A reação de amplificação do ácido nucléico pelo método da presente invenção pode ser realizada através das seguintes etapas: (i) Em um primeiro momento é obtida uma amostra de DNA para que se ocorra a reação de amplificação; (ii) Em seguida a amostra é colocada em contato com uma reação de amplificação contendo 0,1 mM de cada dNTP (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), 1,5 U de uma enzima para polimerizar a cadeia de DNA (Taq DNA polimerase, Tth DNA polimerase), 0,8 pmol de cada oligonucleotídeo, 2,5 mM de cloreto de magnésio e uma solução tampão 1 x específica para atuação da enzima em questão; (iii) Na primeira etapa da reação (desnaturação) ocorre a separação das fitas do DNA de interesse através da elevação da temperatura entre 93 a 95°C, preferencialmente 94 °C de 4 a 6 min, preferencialmente 5 minutos; (iv) Na segunda etapa ocorrem de 25-30 ciclos de desnaturação a uma temperatura entre 93°C a 95°C, preferencialmente 94°C em um tempo de 20 segundos a 1 min, preferencialmente 30 segundos; (v) Posteriormente a temperatura é reduzida para 65 a 70°C, preferencialmente 68 °C; (vi) O oligonucleotídeo é então anelado à região 18S do DNAr e a síntese do DNA é extendida pela ação de uma enzima (preferencialmente Taq DNA polimerase, Tth DNA polimerase) a uma temperatura entre 70 a 74°C, preferencialmente 72 °C entre 20 segundos e 1 minutos, preferencialmente 30 segundos; (vii) Uma etapa posterior envolve uma extensão final de 72°C a 5 minutos. A amostra de DNA pode ser obtida por diferentes formas de extração: Processo de fervura; Processo congelamento-descongelamento e Processo de lise. A utilização direta de amostra de bebida vai depender do tipo de bebida. É possível que os especialistas na área realizem a reação de amplificação de ácido nucléico pelo método da presente invenção, fazendo pequenas modificações no processo acima descrito. Os oligonucleotídeos definidos de acordo com a presente invenção também podem ser usados em tal método modificado.In the first stage of the cycle the temperature is raised from 94 to 96 ° C for a short time to separate the double stranded DNA (Denaturation). In the second step, the temperature is reduced by 50 to 60 ° C depending on the amount of C and G found in the primer, so that the primers anneal (stop) with the DNA template (annealing). In the last step of the cycle the temperature is raised to 72 ° C so that the enzyme can function by synthesizing the new molecule (extension), then a new cycle is started. Usually 25 to 40 cycles are performed for each reaction in which the replication rate is exponential 2 cycles. The result is analyzed by agarose or polyacrylamide gel electrophoresis and then interpreted with the help of a competent practitioner. The latter, however, has the highest value and toxicity prior to polymerization. The nucleic acid amplification reaction by the method of the present invention may be performed by the following steps: (i) At first a DNA sample is obtained for the amplification reaction to take place; (ii) The sample is then contacted with an amplification reaction containing 0.1 mM of each dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate), 1.5 U of a DNA strand polymerization enzyme (Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase ), 0.8 pmol of each oligonucleotide, 2.5 mM magnesium chloride and a 1 x buffer specific for the enzyme in question; (iii) In the first step of the reaction (denaturation) the DNA strands of interest are separated by raising the temperature from 93 to 95 ° C, preferably 94 ° C from 4 to 6 min, preferably 5 minutes; (iv) In the second step 25-30 cycles of denaturation occur at a temperature between 93 ° C to 95 ° C, preferably 94 ° C in a time from 20 seconds to 1 min, preferably 30 seconds; (v) Thereafter the temperature is reduced to 65 to 70 ° C, preferably 68 ° C; (vi) The oligonucleotide is then annealed to the 18S region of rDNA and DNA synthesis is extended by the action of an enzyme (preferably Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase) at a temperature between 70 to 74 ° C, preferably 72 ° C between 20 seconds and 1 minutes, preferably 30 seconds; (vii) A later step involves a final extension of 72 ° C to 5 minutes. The DNA sample can be obtained by different extraction forms: Boiling process; Freeze-thaw Process and Lysis Process. The direct use of beverage sample will depend on the type of beverage. It is possible for those skilled in the art to perform the nucleic acid amplification reaction by the method of the present invention, making minor modifications to the above described process. Oligonucleotides defined in accordance with the present invention may also be used in such modified method.

Se a amplificação de ácidos nucleicos é observada, isso significa que um gene-alvo está presente, indicando que a cepa como meta de detecção do conjunto de primers é positiva (+). Ao contrário, se amplificação de tais ácidos nucléicos não for observada, isso significa que um gene-alvo está ausente, indicando que a cepa como meta de detecção do conjunto de primers é negativa (-).If nucleic acid amplification is observed, it means that a target gene is present, indicating that the strain as a target set detection target is positive (+). In contrast, if amplification of such nucleic acids is not observed, it means that a target gene is absent, indicating that the strain as a primer set detection target is negative (-).

Exemplos de uma amostra utilizada como um alvo de detecção do conjunto de oligonucleotídeos e kit de acordo com a presente invenção incluem: bebidas alcoólicas, como vinho, cerveja, cerveja de baixo índice de malte, refrigerantes, como cidra, refrigerante de limão e água gaseificada, amostras ambientais, tais como a água coletada para uso como matéria-prima e produtos semi-acabados coletados a partir do processo de produção de bebidas alcoólicas, refrigerantes, etc.Examples of a sample used as an oligonucleotide set detection target and kit according to the present invention include: alcoholic beverages such as wine, beer, low malt beer, soft drinks such as cider, lemon soda and carbonated water , environmental samples, such as water collected for use as raw material and semi-finished products collected from the production process of alcoholic beverages, soft drinks, etc.

Quando estes produtos são utilizados como amostras para o método da presente invenção, operações como a concentração, separação e cultura de células existentes na amostra, a separação de um ácido nucléico das células, e a concentração do ácido nucleico podem ser realizadas como pré-tratamentos. Métodos de concentração e separação de células existentes na amostra incluem filtragem e centrifugação, e esses métodos podem ser selecionados, conforme o caso. Além disso, as células concentradas e isoladas da amostra podem ser ainda mais cultivadas, de modo a aumentar o número de células. Para a cultura, ágar sólido ou um líquido, que é adequado para a proliferação da levedura alvo, pode ser usado. Além disso, a fim de selecionar a cepa de levedura alvo, um agente como cicloheximida pode ser adicionado. A fim de liberar um ácido nucleico de células existentes em uma amostra de bebida ou uma amostra ambiental ou de culturas de células, um método que utiliza um kit comercialmente disponível ou de um método de tratamento de células com uma solução alcalina e então aquecer as células a 100°C para liberar o ácido nucléico pode ser selecionado, por exemplo. Além disso, se for necessário purificar um ácido nucléico, o ácido nucléico pode ser purificado por um tratamento fenol/clorofórmio, precipitação de etanol, centrifugação, etc, e o ácido nucléico purificado pode ser finalmente re-dissolvido em tampão TE ou semelhantes, de modo que possa ser usado como modelo em testes de DNA (European Brewery Convention: Analytica-Microbiológica-EBC, 2.sup.nd ed 2005, Fachveríag Hans Carl, Nuemberg, Rolf et al:. diagnósticos clínicos e PCR-. pesquisa, Springer-Verlag, Berlin, 1992; Yasuji Oshima et al: Tanpaku Koso Kakusan (proteínas, ácidos nucléicos, enzimas), Vol. 35, 2523-2541, 1990). A detecção da levedura da espécie Dekkera bruxellensis e da levedura da espécie Brettanomyces brwcellensis usando o conjunto de primer e kit de acordo com a presente invenção pode ser feita da seguinte forma, por exemplo.When these products are used as samples for the method of the present invention, operations such as concentration, separation and culture of cells in the sample, separation of a nucleic acid from cells, and concentration of nucleic acid may be performed as pretreatments. . Concentration and cell separation methods in the sample include filtration and centrifugation, and these methods may be selected as appropriate. In addition, concentrated and isolated cells from the sample can be further cultured to increase cell numbers. For culture, solid agar or a liquid, which is suitable for target yeast proliferation, may be used. In addition, in order to select the target yeast strain, an agent such as cycloheximide may be added. In order to release a nucleic acid from cells in a beverage sample or an environmental sample or from cell cultures, a method using a commercially available kit or method of treating cells with an alkaline solution and then heating the cells. at 100 ° C to release nucleic acid may be selected, for example. In addition, if a nucleic acid is to be purified, the nucleic acid may be purified by phenol / chloroform treatment, ethanol precipitation, centrifugation, etc., and the purified nucleic acid may be finally redissolved in TE buffer or the like. so that it can be used as a model in DNA testing (European Brewery Convention: Analytical-Microbiological-EBC, 2.sup.nd ed 2005, Fachveríag Hans Carl, Nuemberg, Rolf et al .: clinical diagnostics and PCR-. research, Springer Verlag, Berlin, 1992; Yasuji Oshima et al: Tanpaku Koso Kakusan (proteins, nucleic acids, enzymes), Vol. 35, 2523-2541, 1990). Detection of Dekkera bruxellensis yeast and Brettanomyces brwcellensis yeast using the primer and kit set according to the present invention can be done as follows, for example.

Primeiro, a levedura da espécie Dekkera bruxellensis e da levedura da espécie Brettanomyces bruxellensis que são consideradas de existir em uma amostra são cultivadas em um meio adequado. Em seguida, o DNA é separado de uma colônia formada em meio ágar, e o método da presente invenção usando os primers definidos de acordo com a presente invenção são aplicados para o DNA, de modo a amplificar as regiões do 18S DNAr da levedura da espécie Dekkera bruxellensis e da levedura da espécie Brettanomyces bruxellensis. O produto de amplificação do gene obtido indica a presença de uma cepa como um alvo do conjunto de primers.First, Dekkera bruxellensis yeast and Brettanomyces bruxellensis yeast that are considered to exist in a sample are grown in a suitable medium. Next, the DNA is separated from an agar colony, and the method of the present invention using the primers defined in accordance with the present invention are applied to the DNA to amplify the 18S rDNA regions of the yeast of the species. Dekkera bruxellensis and yeast of the species Brettanomyces bruxellensis. The gene amplification product obtained indicates the presence of a strain as a target of the primer set.

EXEMPLOSEXAMPLES

Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.The examples shown herein are intended solely to exemplify one of the numerous ways of carrying out the invention, but without limiting the scope thereof.

EXEMPLO 1 - EXTRAÇÃO DE DNAEXAMPLE 1 - DNA EXTRACTION

Processo de Fervura Uma alíquota de 1000 mL de suspensão celular contendo 107 cels/mL de Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxelensis foi transferida para microtubos e incubada a 90°C em um banho de água fervente por 5 min. A suspensão contendo DNA foi vigorosamente homogenizada através de vortex por 10 segundos e o tubo foi congelado no gelo. A amostra de DNA foi estocada a -18 °C.Boiling Process A 1000 mL aliquot of cell suspension containing 107 cels / mL Saccharomyces cerevisiae and Dekkera bruxelensis was transferred to microtubes and incubated at 90 ° C in a boiling water bath for 5 min. The suspension containing DNA was vigorously homogenized by vortexing for 10 seconds and the tube was frozen in ice. The DNA sample was stored at -18 ° C.

Processo congelamento-desconuelamento Uma alíquota de 1000 mL de suspensão celular contendo 107 cels/mL of Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxelensis foi transferida para microtubos e incubadas a -18°C até a formação de gelo. As amostras foram permitidas descongelar a temperatura ambiente e homogeneizadas por vortex por 10 s.Freeze-thaw process A 1000 ml aliquot of cell suspension containing 107 cells / ml of Saccharomyces cerevisiae and Dekkera bruxelensis was transferred to microtubes and incubated at -18 ° C until ice formation. Samples were allowed to thaw at room temperature and vortexed for 10 s.

Processo de Extração de DNA com tampão de lise celular padrão Uma alíquota de 1000 mL de suspensão celular contendo 107 cels/mL of Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxelensis foram cultivadas em meio Agar por 24 a 48 horas a 25 °C e transferidas para microtubos contendo 500 mL de tampão de lise (NaCl 0.15M (Vetec, BR), Tris-HCl 50 mM (Invitrogen Life Technologies, USA), EDTA 10 mM (Sigma-Aldrich CO., USA), SDS 2.0 % (w/v) (Labsynth, BR); pH 8,0). A mistura foi incubada por 1 hora a 60°C em um banho-maria. Um volume igual (500 mL) de tampão saturado com fenol (Sigma Chemical CO., USA) : clorofórmio (Reagen, BR) (1:1) foi adicionado à solução de DNA. A mistura foi vigorosamente misturada em vortex, e centrifugada para fase de separação em uma centrífuga Sorval (Sorval, USA) a 10,000 x g por 15 minutos. A camada superior aquosa (contendo o DNA) foi cuidadosamente transferida para um tubo limpo, evitando a adição da evitando da interface de fenol e volume igual de clorofórmio. A mistura foi vigorosamente misturada por vortex e centrifugada a 10,000 x g por 15 min. A extração de clorofórmio foi repetida. A camada superior aquosa foi transferida para uma centrífuga limpa e volume igual de isopropanol gelado (Chimie Test, BR) foi adicionado à amostra de DNA. A mistura foi vigorosamente misturada por vortex, o tubo foi permitido ficar em um banho de água fria por 30 minutos e então centrifugado a 10,000 x g por 20 min. Para recuperar o DNA precipitado, as amostras foram centrifugadas e o sobrenadante foi descartado. Os pellets foram lavados com etanol gelado a 70%, centrifugado a 10,000 x g por 15 min. O DNA resultante foi secado ao ar e dissolvido em 100 mL de TE (Tris-HCl 10 mM pH 7.6, EDTA 1 mM pH 8.0). A amostra foi estocada a -18 °C.DNA Extraction Procedure with Standard Cell Lysis Buffer A 1000 mL aliquot of cell suspension containing 107 cells / mL of Saccharomyces cerevisiae and Dekkera bruxelensis were cultured in Agar medium for 24 to 48 hours at 25 ° C and transferred to microtubes containing 500 µl. ml lysis buffer (0.15M NaCl (Vetec, BR), 50mM Tris-HCl (Invitrogen Life Technologies, USA), 10mM EDTA (Sigma-Aldrich CO., USA), 2.0% (w / v) SDS ( Labsynth, BR); pH 8.0). The mixture was incubated for 1 hour at 60 ° C in a water bath. An equal volume (500 mL) of phenol saturated buffer (Sigma Chemical CO., USA): chloroform (Reagen, BR) (1: 1) was added to the DNA solution. The mixture was vortexed vigorously, and centrifuged for separation in a Sorval centrifuge (Sorval, USA) at 10,000 x g for 15 minutes. The upper aqueous layer (containing the DNA) was carefully transferred to a clean tube, avoiding the addition of avoiding the phenol interface and equal volume of chloroform. The mixture was vigorously vortexed and centrifuged at 10,000 x g for 15 min. Chloroform extraction was repeated. The aqueous upper layer was transferred to a clean centrifuge and an equal volume of cold isopropanol (Chimie Test, BR) was added to the DNA sample. The mixture was vortexed vigorously, the tube allowed to stand in a cold water bath for 30 minutes and then centrifuged at 10,000 x g for 20 min. To recover the precipitated DNA, the samples were centrifuged and the supernatant discarded. The pellets were washed with ice cold 70% ethanol, centrifuged at 10,000 x g for 15 min. The resulting DNA was air dried and dissolved in 100 mL TE (10 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM EDTA pH 8.0). The sample was stored at -18 ° C.

EXEMPLO 2 - DETECÇÃO DE LEVEDURAS UTILIZANDO OS OLIGOSNUCLEOTÍDEOS DA PRESENTE INVENÇÃOExample 2 - Detection of Yeast Using the Oligosaccharides of the Present Invention

Um par de oligonucleotídeos universal para leveduras foi desenvolvido para uso em Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e identificados como SEQ ID N°1 e SEQ ID N°2. Este par de oligonucleotídeos amplifica um segmento de 375 pb da região 18S do DNA ribossômico. A reação foi preparada para um volume final de 25pL contendo 1,50U de enzima Taq DNA polimerase, tampão da enzima lx, 2,5mM de cloreto de magnésio, 0,8pmol de cada oligonucleotídeo (SEQ ID N°1 e SEQ ID N°2) e l,()pL de DNA extraído de diferentes espécies de leveduras. A condição de amplificação ideal é desnaturação a 94°C/5 minutos, seguida de 25-30 ciclos de desnaturação a 94°C/30 segundos, pareamento a 68°C/45 segundos e extensão a 72°C/30 segundos, e uma extensão final de 72°C/5 minutos. Após a amplificação, o produto da PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1,0% a 80V, revelado com brometo de etídeo e fotografado utilizando transiluminador UV com câmera acoplada. O DNA utilizado como molde de amplificação teve diferentes origens de extração. A extração foi realizada tanto de leveduras crescidas em meio sólido como de vinhos previamente inoculados. A Eigura 1 mostra a amplificação de um específico de DNA de 375 bp da região 18S de Dekkera e Saccharomyces: M- 100 bp DNA Ladder; 1- Sacch. cerevisiae — padrão com células lisadas com tampão de lise; 2- D. bruxellensis -padrão com células lisadas com tampão de lise; 3- Sacch. cerevisiae - células lisadas com fervura; 4- D. bruxellensis -células lisadas com fervura; 5 - Sacch. cerevisiae - células lisadas com o processo de congelamento\descongeIamento; 6- D. bruxellensis - células lisadas com o processo de congelamento\descongelamento; A- 25 ciclos; B- 30 ciclos; C- 35 ciclos.A pair of universal yeast oligonucleotides has been developed for use in Polymerase Chain Reaction (PCR) and identified as SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. This pair of oligonucleotides amplifies a 375 bp segment of the 18S region of ribosomal DNA. The reaction was prepared to a 25pL final volume containing 1.50U Taq DNA polymerase enzyme, 1x enzyme buffer, 2.5mM magnesium chloride, 0.8pmol of each oligonucleotide (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) el, () pL of DNA extracted from different yeast species. The ideal amplification condition is denaturation at 94 ° C / 5 minutes, followed by 25-30 cycles of denaturation at 94 ° C / 30 seconds, pairing at 68 ° C / 45 seconds and extension at 72 ° C / 30 seconds, and a final extension of 72 ° C / 5 minutes. After amplification, the PCR product was submitted to 1.0% agarose gel electrophoresis at 80V, developed with ethidium bromide and photographed using a coupled camera UV transilluminator. The DNA used as an amplification template had different origins of extraction. Extraction was performed from yeast grown in solid medium and from previously inoculated wines. Figure 1 shows the amplification of a 375 bp DNA specific from the 18S region of Dekkera and Saccharomyces: M-100 bp DNA Ladder; 1- Sacch. cerevisiae - standard with lysed buffer lysed cells; 2- D. bruxellensis - cell-lysed standard with lysis buffer; 3- Sacch. cerevisiae - boiled lysed cells; 4- D. bruxellensis - boiled lysed cells; 5 - Sacch. cerevisiae - cells lysed with the process of freezing \ thawing; 6- D. bruxellensis - cells lysed with the freezing / thawing process; A-25 cycles; B-30 cycles; C- 35 cycles.

Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outros variantes, abrangidos no escopo das reivindicações anexas.Those skilled in the art will appreciate the knowledge presented herein and may reproduce the invention in the embodiments presented and in other embodiments within the scope of the appended claims.

Claims

1. Oligonucleotides for identification of microorganisms characterized in that the oligonucleotides or their complements specifically hybridize to the 18S rDNA region of microorganisms.

Oligonucleotides according to claim 1, characterized in that the identified microorganisms are yeast.

Oligonucleotides according to claim 1, characterized in that they are selected from the group consisting of SEQ ID NOS 1 and 2 and their complementary sequences.

4. Method for detecting microorganisms in a sample comprising the steps: a. perform the nucleic acid amplification reaction contained in a sample using oligonucleotides that specifically hybridize to the 18S rDNA region of microorganisms; and b. detect the presence or absence of an amplification product, where generation of an amplification product indicates the presence of the microorganism.

Method according to claim 4, characterized in that the sample is selected from the group of alcoholic beverages, soft drinks, environmental samples, among others.

Method according to claim 4, characterized in that the oligonucleotides are selected from the group of SEQ ID NO1 and SEQ ID NO02 and their complementary sequences.

Method according to claim 4, characterized in that the presence or absence of the amplification product is detected by visualization on agarose gel or acrylamide gel.

Method according to any one of claims 4 to 7, characterized in that the identified microorganisms are yeast.

Method according to any one of claims 4 to 7, characterized in that the amplification reaction comprises the following steps: a. Obtain a DNA sample for the amplification reaction to occur; B. Contact the sample with an amplification reaction containing dNTPs (deoxyribonucleotides triphosphates), an enzyme to polymerize the DNA strand and a specific buffer for the enzyme in question; ç. Raise the temperature from 93 to 95 ° C, preferably 94 ° C from 4 to 6 min, preferably 5 minutes; d. Performing 25-30 cycles of denaturation at a temperature between 93 ° C to 95 ° C, preferably 94 ° C in a time of 20 seconds to 1 min, preferably 30 seconds; and. Thereafter the temperature is reduced to 65 to 70 ° C, preferably 68 ° C; f. The oligonucleotide is then annealed to the 18S region of rDNA and DNA synthesis is extended by the action of an enzyme (preferably Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase) at a temperature between 70 to 74 ° C, preferably 72 ° C within 20 seconds. 1 minute, preferably 30 seconds; g. A later step involves a final extension of 72 ° C to 5 minutes.

Method according to claim 9, characterized in that the annealing temperature of the oligonucleotides depends on the amount of C and G found in the oligonucleotide.

Method according to claim 9, characterized in that the oligonucleotides are selected from the group of SEQ ID NO1 and SEQ ID NO02 and their complementary sequences.

Microorganism identification kit in a sample comprising apparatus for carrying out the amplification reaction and amplification reagents comprising the oligonucleotides according to claim 1.

Kit according to claim 12, characterized in that the reagents are enzymes, buffers, deoxyribonucleotides triphosphates and oligonucleotides according to claim 1.

Use of the oligonucleotides according to claim 1, characterized in that they are for the identification of microorganisms in samples.

Use according to claim 14, characterized in that the identified microorganisms are yeast.

Use according to claim 14, characterized in that the sample is selected from the group of alcoholic beverages, soft drinks, environmental samples, among others.