BRPI1013470A2 - Peptídeo recombinante da toxina pha1a, composições farmacêuticas contendo pha1a , e uso - Google Patents

Abstract

Peptídeo recombinante da toxina pha1a, composições farmacéuticas contendo pha1a, e uso. A presente invenção compreende o isolamento e obtenção em estado puro da toxina phala, caracterização bioquímica dos aminoácidos constituintes da proteína, obtenção de seu cdna e da toxina recombinante, bem como seu uso em composições farmacêuticas, no tratamento de problemas relacionados a desordens neurológicas e neurodegenerativas induzidas pela isquemia de tecidos, como isquemia de retina, e em processos nociceptivos, atuando como bloqueadora de canais de cálcio. A toxina phala compreende uma sequência de setenta e oito aminoácidos, com peso molecular aproximado de 8,449 da, com capacidade de bloqueio de canais de cálcio no sistema nervoso. A toxina recombinante obtida usando tecnologias de expressão de dna recombinante repete os efeitos neuroprotetores da toxina nativa. Em trabalhos publicados com as ações da toxina phala, ela foi denominada tx3-4. A presente invenção se relaciona ademais a métodos de tratamento de doenças neurológicas e dor através da aplicação da toxina isolada e identificada, provendo efeitos benéficos, bem como sobre certas condições neurológicas incluindo ataques apopléticos, isquemia hipóxica, dor, danos ao sistema nervoso central, desordens neurodegenerativas e distúrbios oculares.

Description

PEPTÍDEO RECOMBINANTE DA TOXINA Pha1A, CDNA DO GENE DA TOXINA

Pha1A, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO PhaiA, E USO A presente invenção compreende o isolamento e obtenção em estado puro da toxina Pha1A, caracterização bioquímica dos aminoácidos constituintes da proteína, obtenção de seu cDNA e da toxina recombinante, bem como seu uso em composições farmacêuticas, no tratamento de problemas relacionados a desordens neurológicas e neurodegenerativas induzidas pela isquemia de tecidos, como isquemia de retina, e em processos nociceptivos, atuando como bloqueadora de canais de cálcio. A toxina PhaiA compreende uma sequência de setenta e oito aminoácidos, com peso molecular aproximado de 8,449 Da, com capacidade de bloqueio de canais de cálcio no sistema nervoso. A toxina recombinante obtida usando tecnologias de expressão de DNA recombinante repete os efeitos neuroprotetores da toxina nativa. Em trabalhos publicados com as ações da toxina Pha-ΐΛ, ela foi denominada Tx3-4. A presente invenção' se relaciona ademais a métodos de tratamento de doenças neurológicas e dor através da aplicação da toxina isolada e identificada, provendo efeitos benéficos, bem como sobre certas condições neurológicas incluindo ataques apopléticos, isquemia hipóxica, dor, danos ao sistema nervoso central, desordens neurodegenerativas e distúrbios oculares. O cálcio celular desempenha papel fundamental em processos fisiológicos relevantes como exocitose, transcrição gênica e sinalização celular, dentre outros, de modo que sua concentração intracelular deve ser extremamente bem regulada. O aumento do cálcio intracelular causado pela ativação dos receptores glutamatérgicos pelo aminoácido excrtatório glutamato, por exemplo, está fortemente envolvido no processo neurodegenerativo mediado por isquemia [Kristián T., Siesjõ B.K. CALCIUM-RELATED DAMAGE IN ISCHEMIA. Life Sci.\ 59 (5-6):357-67, 1996]. Esse aumento do cálcio intracelular ocorre através do influxo de cálcio via canais de cálcio voltagem dependentes (CCDV). Deste modo, bloqueadores de canais de cálcio dependentes de voltagem, especialmente aqueles que bloqueiam o influxo de cálcio e a liberação do neurotransmissor excitatório glutamato, têm grande potencial como agentes neuroprotetores após insulto isquêmico do cérebro. Além disso, recentemente, a contribuição dos CCDVs para os processos nociceptivos tem atraído considerável interesse [Vanegas H., Schaible H. EFFECTS OF ANTAGONISTS TO HIGH-THRESHOLD CALCIUM CHANNELS UPON SPINAL MECHANISMS OF PAIN, HYPERALGESIA AND ALLODYNIA. Pain. Mar; 85(1-2):9-18, 2000].

Os canais de cálcio dependentes de voltagem são classificados como L, N, P/Q, R ou do tipo T, baseado em características biofísicas e nas correntes mediadas pelos mesmos [Dunlap K., Luebke J.I., Turner T.J. EXOCYTOTIC CA2+ CHANNELS IN MAMMALIAN CENTRAL NEURONS. Trends Neurosci.

Feb; 18(2):89-98. 1995; Randall A., Tsien R.W. PHARMACOLOGICAL

DISSECTION OF MULTIPLE TYPES OF CA2+ CHANNEL CURRENTS IN RAT CEREBELLAR GRANULE NEURONS. J Neurosci. Apr; 15(4):2995-3012. 1995], Demonstrou-se que os canais de cálcio dos tipos P/Q contribuem significativamente para a liberação de glutamato in vivo [Valentino K., Newcomb R., Gadbois T., Singh T., Bowersox S., Bitner S., Justice A., Yamashiro D., Hoffman B.B., Ciaranello R„ et ai. A SELECTIVE N-TYPE CALCIUM CHANNEL

ANTAGONIST PROTECTS AGAINST NEURONAL LOSS AFTER GLOBAL CEREBRAL ISCHEMIA. Proc Natl Acad Sei USA. Aug 15;90(16):7894-7, 1993], A toxina PhaiA em experimentos in vitro inibiu o influxo de cálcio [Miranda D.M., Romano-Silva M.A., Kalapothakis E., Diniz C.R., Cordeiro M.N., Santos T.M., Prado M.A., Gomez M.V. PHONEUTRIA NIGRIVENTER TOXINS BLOCK TITYUSTOXIN-INDUCED CALCIUM INFLUX IN SYNAPTOSOMES. Neuroreport.

May 11;9(7):1371-3, 1998; Miranda D.M., Romano-Silva M.A, Kalapothakis E., Diniz C.R., Cordeiro M.N., Moraes-Santos T., De Marco L., Prado M.A., Gomez M.V. SPIDER NEUROTOXINS BLOCK THE BETA SCORPION TOXIN-INDUCED CALCIUM UPTAKE IN RAT BRAIN CORTICAL SYNAPTOSOMES. Brain Res Bull. Mar 15;54(5):533-6, 2001] e a exocitose de terminação nervosa de cérebro de rato (sinaptosomas) atuando em canais de cálcio P/Q [Guatimosim C., Romano-Silva M.A., Cruz J.S., Beirão P.S., Kalapothakis E., Moraes-Santos T., Cordeiro M.N,. Diniz C.R., Gomez M.V., Prado M.A. A TOXIN FROM THE SPIDER

PHONEUTRIA NIGRIVENTER THAT BLOCKS CALCIUM CHANNELS COUPLED TO EXOCYTOSIS. Br J Pharmacol. Oct;122(3):591-7,1997]. A toxina também inibiu a liberação de glutamato em sinaptosomas [Prado M.A., Guatimosim C., Gomez M.V., Diniz C.R., Cordeiro M.N., Romano-Silva M.A. A NOVEL TOOL FOR

THE INVESTIGATION OF GLUTAMATE RELEASE FROM RAT

CEREBROCORTICAL SYNAPTOSOMES: THE TOXIN TX3-3 FROM THE VENOM OF THE SPIDER PHONEUTRIA NIGRIVENTER. Biochem J. Feb 15;314 (Pt 1): 145-50; 1996; Reis H.J., Prado M.A., Kalapothakis E., Cordeiro M.N., Diniz C.R., De Marco L.A., Gomez M.V., Romano-Silva M.A. Biochem J. INHIBITION OF GLUTAMATE UPTAKE ΒΥΆ POLYPEPTIDE TOXIN (PHONEUTRIATOXIN 3-4) FROM THE SPIDER PHONEUTRIA NIGRIVENTER. Oct 15;343 Pt 2:413-8. 1999]. A toxina PhdiA mostrou-se efetiva ao proteger fatias de hipocampo cerebral da degeneração induzida pela isquemia cerebral [Pinheiro A.C., Gomez R.S., Guatimosim C., Silva J.H., Prado M.A., Gomez M.V. THE EFFECT OF

SEVOFLURANE ΟΝ INTRACELLULAR CALCIUM CONCENTRATION FROM CHOLINERGIC CELLS. Brain Res Bull. Mar 31 ;69(2):147-52, 2006; Pinheiro A.C., da Silva A.J., Prado M.A., Cordeiro M.do N., Richardson M., Batista M.C., de Castro Junior C.J., Massensini A.R., Guatimosim C., Romano-Silva M.A., Kushmerick C„ Gomez M.V. PHONEUTRIA SPIDER TOXINS BLOCK ISCHEMIA- INDUCED GLUTAMATE RELEASE, NEURONAL DEATH, AND LOSS OF NEUROTRANSMISSION IN HIPPOCAMPUS. Hippocampus. Nov; 19(11):1123-9, 2009]. Além disso, a toxina foi capaz de inibir a morte celular de células das camadas retinianas induzida pela isquemia (Agostini, R.M., Pinheiro, A.C.N. Binda, N.S., Silva, M.A.R. Cordeiro, M.N. et al. PHONEUTRIA SPIDER TOXINS BLOCK

ISCHEMIA-INDUCED GLUTAMATE RELEASE AND NEURONAL DEATH OF CELLS LAYERS OF THE RETINA. Submetido para publicação na revista Retina, 2010. A ação neuroprotetora da PhoiA manisfestou-se também mesmo quando aplicada até duas horas após a indução do insulto isquêmico de fatias do hipocampo (Pinheiro et a/., 2009) ou de fatias de retina (Agostini et ai, 2010).

Desse modo a PhaiA apresenta grande potencial de ser utilizada, após os testes pré-clínicos, como agente neuroprotetor nas disfunções induzidas pelo choque isquêmico do cérebro ou da retina.

Imunohistoquímica e estudos eletrofisiológicos demonstraram que a maioria dos neurônios expressa múltiplos tipos de canais de cálcio [Lai H.C., Jan L.Y. THE

DISTRIBUTION AND TARGETING OF NEURONAL VOLTAGE-GATED ION CHANNELS. Nat Rev Neurosci. Jul;7(7):548-62. 2006]. Esses canais de cálcio estão localizados nos pré-terminais nervosos, o que é coerente com seu papel fisiológico no desencadeamento da liberação de neurotransmissores e na regulação da plasticidade sináptica. A partir da purificação do veneno da aranha Phoneutria nigriventer obteve- se várias toxinas [Cordeiro M.N., Figueiredo S.G., Valentim A.C., Diniz C.R., Eicksted R.D., Goroy J„ Richardson M. PURIFICATION AND AMINO ACID

SEQUENCES OF SIX TX3 ΤΥΡΕ NEUROTOXINS FROM THE VENOM OF THE BRAZILIAN “ARMED" SPIDER PHONEUTRIA NIGRIVENTER. Toxicon; 31: 35-42, 1993]. A aranha utiliza essas toxinas para imobilizar suas presas e delas se alimentar. O veneno da aranha brasileira Phoneutria nigriventer possui um coquetel de toxinas que modulam os canais iônicos [Gomez M.V., Kalapothakis E., Guatimosim C., Prado M.A.M. PHONEUTRIA NIGRIVENTER VENOM A COCKTAIL OF TOXINS TH AT AFFECT ÍON CHANNELS. Cell Molecular Neurobiol 22:579-587, 2002]. O peptídeo tóxico PhonC, por exemplo, extraído da fração 3 (PhTx3) do veneno de Phoneutria nigriventer (Cordeiro et al., 1993) mostrou ser bloqueador dos canais de cálcio do tipo P/Q [Prado M.A.M., Guatimosim C., Gomez M.V., Diniz C.R., Cordeiro M.N., Romano Silva M.A. A

NOVEL TOOL FOR THE INVESTIGATION OF GLUTAMATE RELEASE FROM

RAT CEREBROCORTICAL SYNAPTOSOMES: THE TOXIN TX3-3 FROM THE VENOM OF THE SPIDER PHONEUTRIA NIGRIVENTER. Biochem J, 314: 145- 150, 1996] e de canais de cálcio do tipo L [Leão R.M., Cruz J.S., Diniz C.R., Cordeiro M.N., Beirão P.S. INHIBITION OF NEURONAL HIGH-VOLTAGE

ACTIVATED CALCIUM CHANNELS BY THE OMEGA-PHONEUTRIA NIGRIVENTER TX3-3 PEPTIDE TOXIN. Neuropharmacology. Jul 24;39(10):1756- 67, 2000]. As toxinas obtidas a partir de venenos de aranhas e caramujos marinhos mostraram potencial terapêutico no alívio da dor em modelos de dor crônica e aguda em roedores [Ekberg J., Adams D.J. NEURONAL VOLTAGE- GATED SODIUM CHANNEL SUBTYPES: KEY ROLES IN INFLAMMATORY AND NEUROPATHIC PAIN. Int J Biochem Cell Biol.\38(12):2005-10. Epub 2006 Jul 12, 2006; Souza A.H., Ferreira J., Cordeiro M.do N., Vieira L.B., De Castro C.J., Trevisan G., Reis H., Souza I.A., Richardson M., Prado M.A., Prado V.F., Gomez M.V. ANALGESIC EFFECT IN RODENTS OF NATIVE AND RECOMBINANT PH

ALPHA 1BETA TOXIN, A HIGH-VOLTAGE-ACTIVATED CALCIUM CHANNEL BLOCKER ISOLATED FROM ARME D SPIDER VENOM. Pain. 2008 Nov 15; 140(1): 115-26. Sep 6, 2008].

Atualmente, encontramos disponíveis algumas patentes relacionadas à presente invenção: A patente US 6.489.298 refere-se ao peptídeo contulakin-G e análogos do mesmo e sua utilização da forma nativa ou em formulações com cDNA, em aplicação em processos de dor associada a trombose, doenças gastrointestinais, analgesia, úlceras e tumores.

Em WO 02079236, um peptídeo denominado alfa-Conotoxina é usado no tratamento e/ou prevenção da dor, na recuperação da lesão do nervo e no tratamento de condições neurológicas dolorosas. Peptídeos de alfa-conotoxina também são descritos na patente US 6.268.473 como sendo úteis para relaxamento muscular, por atuarem como agentes bloqueadores neuromusculares.

Tecnologias relacionadas às toxinas de aranhas também são encontradas no estado da arte. O pedido de patente EP1161951 descreve um peptídeo purificado a partir do veneno da aranha Selenoscomia huwena. Esse peptídeo, capaz de inibir a atividade de canais de cálcio, pode ser aplicado por via parenteral e tópica no tratamento da dor. A patente US 5.281.693 divulga métodos e composições para o bloqueio canais de Ca2+ utilizando oligonucleotídeos obtidos a partir da toxina da aranha Agelenopsis aperta. A patente descreve ainda a utilização desses oligonucleotídeos isolados e identificados no tratamento de distúrbios neurológicos. A patente US 6.410.537 apresenta novos compostos com atividade neuroprotetora e analgésica utilizados no tratamento de danos neuronais, incluindo isquemia cerebral/hipoxia ou aumento de pressão intracraniana como neoplasma, derrame, meningite ou trama e para tratamento da dor. O pedido de patente CA 2145618 descreve um método para redução do dano neuronal, causado por derrame, disfunção cardíaca e outros eventos, através da administração de aminoglicosídeos. O pedido de patente WO 2008061329, intitulado Phaip toxiN, cDNA of Phaip TOXIN GENE, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING Ρ0α1β TOXIN, proceses fortheir obtention and product, refere-se a uma toxina obtida a partir do veneno da aranha Phoneutria nigriventer eficaz no tratamento de diversos tipos de dor. O influxo anormal de cálcio está associado a transtornos do sistema nervoso central (SNC), incluindo acidente vascular cerebral (AVC), epilepsia e morte neuronal associada a epilepsia crônica. A falta de agentes químicos que bloqueiam canais de cálcio do SNC de maneira potente e específica dificulta o desenvolvimento de uma terapêutica medicamentosa efetiva para os problemas neurológicos e nociceptivos prevalentes. Não existem tratamentos efetivos para esse aumento anormal de cálcio que causa uma maior liberação do neurotransmissor excitatório glutamato, ocasionando danos neurológicos e dor inflamatatória de grande intensidade. As drogas usadas atualmente têm efeitos fisiológicos não-específicos, que podem levar a efeitos colaterais indesejados em pacientes. A presente invenção mostrou-se altamente eficaz na redução da isquemia em fatias da retina e em fatias de hipocampo de ratos, além de diminuir a dor inflamatória em ratos diminuindo a liberação do neurotransmissor excitatório glutamato. Além disso, a PhaiA foi capaz de reverter o processo neurodegenerativo mesmo quando aplicada até duas horas após o choque isquêmico do hipocampo ou da retina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA O veneno da aranha Phoneutria nigriventer foi obtido por estimulação elétrica. A toxina Pha-iA foi purificada de forma não limitante por uma combinação passos de cromatografia (de acordo com o método descrito por Cordeiro et al., 1993 envolvendo fracionamento por filtração em gel em colunas Sephadex G-50 Superfine e Superose 12 HR, além de cromatografia fase reversa em sistema FPLC (colunas C2/C18 e C1/C8). A toxina Pha-iA foi identificada através de técnicas de sequenciamento de aminoácidos e análise em espectrômetro de massa, mostrando ser constituída de 78 aminoácidos e com peso molecular de 8,449 Da. A sequência completa de aminoácidos está descrita no anexo de sequências (Seq. ID n°1). O cDNA que codifica a toxina PhaiA foi obtido através da reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando como molde quatro oligonucleotídeos sintéticos sobrepostos (Pha1AA53- SEQ ID N° 02, Pha1AA35-SEQ ID N° 03, Phcc1AB53- SEQ ID N° 04 e Pha1AB35- SEQ ID N° 05) . Estes oligonucleotídeos foram construídos utilizando-se os códons preferenciais da bactéria Escherichia coli. Os oligonucleotídeos Pha1A SUMOF (SEQ ID N° 06) e Pha1A SUMOR (SEQ ID N° 07), foram utilizados como iniciadores, sendo adicionado sítio para divagem pela enzima de restrição Xba I à extremidade 3’. A reação de amplificação continha 0,1 pmol de cada oligonucleotídeo molde, 10μΜ de cada iniciador, 250 pM de cada desoxirribonucleotídeo fosfatado (dNTPs), 10mM MgCh, 2,5pL de tampão 10X e duas unidades da enzima Taq polimerase (Invitrogen). As condições de amplificação consistiram em um período de desnaturação inicial a 94° C por 5 minutos, seguido de quarenta ciclos de desnaturação do DNA a 94° C por 45 segundos, anelamento dos iniciadores a 55° C por 45 segundos e extensão da nova molécula a 72° C por 45 segundos. Por fim, um período final de extensão a 72° C por 5 minutos e estoque a 4o C. O DNA amplificado foi submetido a eletroforese em gel de agarose 1,5% em tampão TAE (Tris-acetato 40 mmol/L pH 8,0 e EDTA 1mmol/L pH 8,0), corado com brometo de etídio e purificado do gel utilizando-se o kit de extração em gel QIAquickTM Gel Extraction kit (Qiagen). O DNA foi então digerido com as enzimas Bsa I (New Engiand) e Xba I (Fermentas) e clonado no vetor pE-SUMO (LifeSensors) através da reação da enzima T4 DNA ligase.

Para a clonagem e expressão da PhaiA foi utilizado o vetor pE-SUMO (LifeSensors). A proteína SUMO de levedura (Smt3), quando ligada à proteína de interesse, aumenta consideravelmente a expressão e promove a solubilização e o correto enovelamento desta proteína. A proteína de interesse é expressa com uma cauda de polihistidina (6xHis), seguida da proteína Smt3 ligada em sua porção N- terminal. A cauda de histidina é utilizada para facilitar a purificação da proteína recombinante. A cauda His-SUMO pode então ser clivada pela enzima SUMO protease.

Bactérias E. coli (DH5a) eletrocompetentes foram transformadas com o plasmídeo PhaiA pE-SUMO e plaqueadas em meio LB ágar contendo 100mg/mL de ampicilina. As colônias foram analisadas através de PCR de colônias e os plasmídeos das colônias positivas foram purificados através do kit QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).

Para a expressão da PhaiA foram utilizadas bactérias BL21 (DE3) eletrocompetentes contendo o plasmídeo pGro7 (TAKARA). O plasmídeo pGro7 possui resistência ao antibiótico cloranfenicol e, na presença de L-arabinose, codifica as proteínas groEs-groEL, chaperonas que auxiliam o enovelamento de proteínas recém-formadas. O plasmídeo recombinante pE-SUMO-Pha1A foi utilizado para transformar bactérias E. coli BL21 (DE3)-pGro7 eletrocompetentes e a expressão da proteína recombinante foi induzida com 0,6mM de IPTG a 37° C por 3 horas. As bactérias foram lisadas sob alta pressão, o iisado foi centrifugado e o sobrenadante purificado através de cromatografia de afinidade em resina ligada a íons níquel. A sequência da proteína recombinante produzida em E. coli está representada na Figura 1. A purificação da proteína está representada na Figura 2.

As proteínas eluídas* foram então dialisadas contra PBS e digeridas pela enzima SUMO protease I por 5 horas a 30° C, para remoção da cauda His-SUMO.

Após a digestão, a protease e a cauda His-SUMO foram removidas por afinidade na resina Ni-NTA agarose e a toxina Pha1 A recombinante foi recuperada. A toxina PhaiA recombinante purificada foi analisada através de Western blotting utilizando anti-veneno total de Phoneurtria nigríventer para confirmarmos sua identidade (Figura 3). Após a eletroforese em gel de poliacrilamida, as proteínas foram transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) a 254 mA por 1 h. Após o bloqueio, a membrana foi incubada por 1h a 4°C com o anticorpo anti-veneno total de Phoneutría nigríventer. Depois da lavagem, a membrana foi incubada nas. mesmas condições com o anticorpo secundário anti- horse ligado a peroxidase e revelada. Como pode ser observado na Figura 3, tanto a proteína de fusão SUMO-Pha1A como a PhaiA recombinante obtida após a digestão como o Fator Xa foram especificamente reconhecidas por anticorpos anti-veneno total. Como controle positivo utilizou-se uma alíquota do veneno total da aranha.

Após a obtenção das toxinas PhaiA recombinantes e nativas, como descrito acima, elas foram liofilizadas e mantidas a -20°C para posterior utilização em modelos de dor e de isquemia in vitro (ver exemplos). No dia do teste as proteínas liofilizadas são dissolvidas em tampão PBS e testadas em modelos de dor e de isquemia. As análises estatísticas dos testes com essa toxina foram realizadas utilizando o teste ANOVA com significância de 95% (p< 0.05).

Os efeitos da toxina PhaiA em diferentes modelos estão detalhados nos exemplos a seguir.

Exemplo 1 - Efeito inibitório da toxina PhaiA sobre a liberação de glutamato em terminações nervosas isoladas do córtex de camundongos.

Os níveis de glutamato foram medidos utilizando a preparação sinaptosomal de córtex de ratos wistar pesando 180 a 200g (metodologia de acordo com (Dunkley, 1997). A medida de glutamato foi calculada por medida da fluorescência produzida por NADPH na presença de glutamato desidrogenase e NADP+ (Nicholls et al., 1987). Para o ensaio foram adicionados NADP+ (1.0 mM) e glutamato desidrogenase (50 U) e após 10 minutos de leitura colocou-se PhaiA na concentração de 20mM em sua forma nativa ou recombinante. Os comprimentos de excitação e emissão utilizados no espectrofluorimetro foram de 360 nm e 450 nm respectivamente. Os resultados demostraram que tanto a toxina PhaiA nativa quanto a recombinante inibem a liberação do neurotransmissor excitatório glutamato, envolvido no processo de nocicepção e de isquemia do sistema nervoso (Figura 4).

Exemplo 2 - Efeito antinociceptivo produzido pela injeção intratecal de PhaiA A capacidade da toxina PhaiA, de reverter um quadro nociceptivo já instalado foi avaliada através de administração intratecal da PhaiA (3-30pmol/sítio) 9 minutos após a injeção de formalina (Figura 5). A administração de PhaiA foi capaz de reduzir a latência de resposta, sendo a resposta significativa apenas para a dose de 30 pmol/sítio. A Dl50 calculada foi de 8 (3 a 22) e inibição de 60±9%(Figura 5A). A capacidade da toxina PhaiA, de reverter um quadro nociceptivo já instalado foi comparado com a capacidade de outras duas toxinas, ω-ctx-MVIIC e ω-ctx-MVIIA, em reverter esse mesmo quadro. A administração intratecal da ω- ctx-MVIIC (0,03-30 pmol/sítio), 9 minutos após a injeção de formalina, foi capaz de reduzir a fase inflamatória (Figura 5B), com DI5o calculada de 0,06 (0,01 a 0,3) e inibição de48±12%. Já a administração da ω-ctx-MVIIA (0,01-1 pmol/sítio) não foi capaz de exercer efeito antinociceptivo como pós-tratamento (Figura 5C). A toxina PhaiA atua, desse modo, inibindo o efeito nociceptivo mesmo quando aplicada após a indução do estímulo nociceptivo.

Exemplo 3 - Efeito protetor da toxina PhaiA contra perda da amplitude dos picos induzida pela isquemia na região CA1 do hipocampo. A amplitude dos picos foi medida antes (Pré) e após (Pós) o tratamento com deprivação de oxigênio e baixa glicose (insulto isquêmico) e logo depois da recuperação das fatias após 4 horas de insulto isquêmico. (A) traços representativos com ou sem fatias sujeitas ao insulto isquêmico na presença ou ausência de PhaiA (B) quantificação de 3 experimentos independentes (Figura 6).

Sham significa o grupo de fatias que não recebeu insulto isquêmico.

Os resultados obtidos mostram que a toxina ao proteger as células da morte neuronal mantém a atividade fisiológica das células estimuladas.

Exemplo 4 - Efeito neuroprotetor da toxina PhaiA após indução de isquemia em cortes de retina de ratos A toxina PhaiA (8.0 nM) foi adicionada às fatias do hipocampo ou da retina 15, 30, 60 ou 90 min após a indução de isquemia por insulto ODLG (“Oxygen deprivation low glucose”). A viabilidade celular foi analisada por microscopia confocal como descrito em Pinheiro et al., 2009 e Agostini et al., 2010. A porcentagem de células vivas e mortas foi determinada através de leitura de fluorescência das células (células vivas apresentam fluorescência verde- calceína - e as mortas, vermelha — homodímero de etídeo). A porcentagem de células mortas é dada pelo número de células mortas nos cortes tratados dividido pelo número de células mortas nos cortes não tratados. A incubação em meio contendo a toxina Pha-iA levou a uma redução significativa (P < 0.05) do dano neuronal induzido por isquemia na retina (Agostini et ai, 2010) e no hipocampo (Pinheiro et ai, 2009) mesmo quando a toxina foi adicionada 90 minutos após a indução de isquemia (Figura 7). A porcentagem de neuroproteção induzida pela Pha-|A adicionada ao meio de incubação após 15, 30, 60 e 90 minutos foi de 77.3% ± 13, 70.8% ± 16.8, 63.7%± 21.0, 58.2% ± 24,2 e 43.4% ± 25, respectivamente. Os resultados expressam a média ± erro padrão de células mortas em 10 campos em pelo menos três experimentos. Estes resultados demonstram claramente que Pha-|A reduz significativamente o dano isquêmico em fatias de retina de ratos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Sequência da proteína de fusão SUMO-Pha1A. Em negrito, seqüência da toxina Pha1 A. Em itálico, sequência da proteína SUMO de levedura (Smt3). No retângulo, cauda 6xHis.

Figura 2: Purificação da toxina recombinante através de cromatografia de afinidade em resina de níquel. SDS-PAGE 4%-20% mostrando as etapas de purificação da toxina recombinante Pha1A SUMO das proteínas da bactéria E. coli. PM: Marcador de peso molecular. Coluna 1: Controle sem indução. Coluna 2: Proteínas insolúveis (pellet). Coluna 3: Proteínas solúveis que não se ligaram à coluna. Coluna 4: Primeira lavagem. Colunas 5-7: Proteínas que saíram nas eluições. As proteínas foram coradas com o reagente RAPIDstain (Calbiochem).

Figura 3: Western blot da toxina Pha1A purificada e digerida pela enzima SUMO protease I. PM: Marcador de peso molecular Precision Plus Protein. Coluna 1: Proteína de fusão Pha1A SUMO sem digestão. Coluna 2: Proteína PhccIA digerida. Coluna 3: Veneno total da Phoneutría nigriventer. Anticorpo: IgG anti- veneno total P. nigriventerrperoxtdase (1:1250). A revelação da membrana foi realizada utilizando-se o ECL Plus Western blotting detection system (Amersham).

Figura 4: Efeito da toxina PhaiA recombinante inibindo a liberação de glutamato em terminações nervosas isoladas do córtex de camundongos. Total de glutamato liberado após despolarização dos sinaptosomas com KCI (30mM). EGTA foi utilizado como controle positivo e PBS como controle negativo.

Figura 5: Efeito antinociceptivo produzido pela injeção intratecal de A) PhaiA (3-30 pmol/sítio, B) ω-ctx-MVIIC (0,03-30 pmol/sítio) e C) ω-ctx-MVIIA (0,01-1 pmol/sítio) 9 minutos após a administração da formalina. Cada barra representa a média ± erro padrão de 8-11 animais.

Figura 6: Pha-iA protege contra perda da amplitude dos picos induzida pela isquemia na região CA1 do hipocampo. (A) Traços representativos das fatias submetidas a OLDG (insulto isquêmico).

Figura 7: Efeito da toxina PhaiA reduzindo a morte de células da retina mesmo aplicada 15, 30, 60 e 90 minutos após a indução da isquemia retiniana.

Claims (13)

1- SEQUÊNCIA DO PEPTÍDEO RECOMBINANTE DA TOXINA PhaiA, caracterizada por ser a Seq ID N° 1.

2- SEQUÊNCIA DE cDNA DO GENE DA TOXINA PhaiA caracterizada por codificar a proteína representada pela Seq ID N° 1

3- COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender a toxina PhaiA, representada pelo peptídeo recombinante Seq ID N° 1, eao menos um excipiente farmacologicamente aceitável.

4- COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pela toxina PhaiA, representada pelo peptídeo recombinante Seq ID N° 1, ser extraída do veneno da aranha Phoneutria nigriventer ou sintetizada a partir da clonagem do DNA ou cDNA em vetores de expressão de proteínas.

5- COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com reivindicação 3, caracterizada pela toxina PhaiA, representada pelo peptídeo recombinante Seq ID N° 1, possuir peso molecular de aproximadamente 8,449 Da.

6- COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com reivindicação 3, caracterizada pela toxina PhaiA, representada pelo peptídeo recombinante Seq ID N° 1, atuar como um bloqueador de canais de cálcio.

7- COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com reivindicação 3, caracterizada pela toxina PhaiA, representada pelo peptídeo recombinante Seq ID N° 1, atuar na redução da liberação do neurotransmissor glutamato.

8- COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com reivindicação 3, caracterizada pela toxina PhaiA, representada pelo peptídeo recombinante Seq ID N° 1, atuar em processos nociceptivos e processos neurológicos.

9- COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com reivindicação 3, caracterizada pela toxina PhotiA, representada pelo peptídeo recombinanteSeq ID N° 1, atuarem processos neurodegenerativos.

10- COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com reivindicação 3, caracterizada pela toxina Pha-tA, representada pelo peptídeo recombinante Seq ID N° 1, atuarem distúrbios oculares.

11- COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as reivindicações 3 a 9 caracterizado por ser administrada preferencialmente por via intratecal,

12- COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com as reivindicações 3 a 9 caracterizado por ser administrada por via intramuscular, intravenosa, tópica ou oral.

13- USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizado por ser na preparação de medicamentos para tratamento de dor, danos neurológicos, neurodegenerativos, distúrbios oculares e isquemia.