BRPI1006508B1

BRPI1006508B1 - Método de seleção de uma planta de milho

Info

Publication number: BRPI1006508B1
Application number: BRPI1006508-3A
Authority: BR
Inventors: Adriana Tomas; Dario Prada; Kevin Simcox; Stanley Luk
Original assignee: E. I Du Pont De Nemours And Company, Empresa Americana
Priority date: 2009-04-13
Filing date: 2010-04-13
Publication date: 2019-02-26
Also published as: BRPI1006508B8; ZA201106656B; CN102395687B; CN102395687A; CN104862416B; US20100263086A1; MX2011010736A; WO2010120727A1; US20140237679A1; CA2755552A1; CA2755552C; EP2419528A1; US8697942B2; US9551041B2; CN104862416A; BRPI1006508A2

Abstract

método de seleção de uma planta de milho a presente invenção refere-se a métodos e composições para identificação e seleção de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga fusarium. as plantas de milho geradas por meio dos métodos de acordo com a presente invenção também são uma característica da presente invenção.

Description

“MÉTODO DE SELEÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO ”

Referência Cruzada a Pedido Relacionado [001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Norte-Americano n° 61/168.779, depositado em 13 de abril de 2009, que é integralmente incorporado como referência.

Campo da Invenção [002] O presente relatório descritivo refere-se a composições e métodos úteis no aumento da resistência ao fungo da espiga Fusarium em plantas de milho.

Antecedentes da Invenção [003] Fungo da espiga Fusarium (também denominado ferrugem da espiga Fusarium) é uma doença devastadora de milho causada por espécies do complexo de Gibberella fujikuroi, nomeadamente F. verticillioides, F. proliferatum e/ou F. subglutinans. Ele é encontrado predominantemente no sudeste dos Estados Unidos, sul da Europa, México, Brasil, Argentina e África do Sul e afeta o rendimento e a qualidade dos grãos. Fungo da espiga Fusarium também resulta em contaminação por diversas micotoxinas, incluindo fumonisinas (FUM), moniliformina (MON) e/ou beauvericina, que aparentemente causam uma série de doenças humanas e animais. Fumonisinas, por exemplo, estão relacionadas com diversas toxicoses animais, incluindo leucoencefalomalacia (Marasas et al (1988), Onderstepoort J. Vet. Res. 55: 197-204; Wilson et al (1980), Associação Norte-Americana de Laboratórios de Diagnóstico Veterinário, Anais da 33^a Reunião Anual, Denver, Colo., Madison, Wis., Estados Unidos) e edema pulmonar suíno (Colvin et al (1992), Mycopathologia 117: 79-82). Fumonisinas também são suspeitos de carcinogenicidade (Geary et al (1971), Coord. Chem. Rev. 7: 81; Gelderblom et al (1991), Carcinogenesis 12: 1247-1251; Gelderblom et al

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2/93 (1992), Carcinogenesis 13: 433-437) e foram relacionadas a defeitos de nascença em seres humanos (Missmer et al (2006), Environ. Health Perspect. 114: 237-41).

[004] A etiologia de fungo da espiga Fusarium é mal compreendida, embora as lesões físicas à espiga e certas condições ambientais possam contribuir com a sua ocorrência (Nelson et al (1992), Mycopathologia 117: 29-36). Quando as condições de crescimento fúngico forem ideais, não há práticas de cultivo suficientes para minimizar os níveis de micotoxina até um nível considerado “seguro” pela Administração de Alimentos e Drogas. Foi identificada resistência genética ao fungo da espiga Fusarium (Gendloff et al (1986), Phytopathology 76: 684-688; Holley et al (1989), Plant Dis. 73: 578-580) e diversos esforços de cultivo levaram à identificação de germoplasma de milho com resistência hereditária a fungo da espiga Fusarium. A incorporação dessa resistência em linhagens congênitas de milho, entretanto, é difícil. O uso de seleção fenotípica para introgressão de resistência é demorado e difícil e, como o fungo da espiga de Fusarium é sensível a condições ambientais, a seleção em busca de resistência de ano para ano com base apenas no fenótipo comprovou ser inconfiável. Além disso, locais de seleção de doenças especializados podem apresentar operação cara e as plantas devem ser cultivadas até amadurecerem a fim de classificar a resistência ou susceptibilidade.

[005] Seleção utilizando marcadores moleculares associados à resistência ao fungo de espiga Fusarium possui a vantagem de permitir pelo menos alguma seleção com base apenas na composição genética da prole. Além disso, a resistência a fungo da espiga Fusarium pode ser determinada muito cedo no ciclo de vida da planta, até mesmo no estágio de semente. A maior ve/oc/dade de seleção que pode ser obtida por meio do uso de marcadores moleculares associados com a característica de

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3/93 resistência a fungo da espiga Fusaríum indica que o cultivo vegetal para resistência a fungo da espiga Fusaríum pode ocorrer mais rapidamente, de forma a gerar plantas resistentes comercialmente aceitáveis em um período de tempo relativamente curto. Desta forma, é desejável fornecer composições e métodos de identificação e seleção de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo de espiga Fusaríum. Essas plantas podem ser utilizadas em programas de cultivo para gerar híbridos de alto rendimento com resistência ao fungo de espiga Fusaríum.

Descrição Resumida da Invenção [006] São fornecidos métodos e composições de identificação e seleção de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusaríum.

[007] Em uma realização, são fornecidos métodos de seleção de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusaríum. Nesses métodos, obtém-se DNA e é detectada a presença de pelo menos um alelo marcador. O alelo marcador pode incluir qualquer alelo marcador que seja ligado e associado a qualquer um dos alelos marcadores a seguir: “T” em PHM8211-16, “C” em PHM8711-14, “T” em PHM14506-7, “C” em PHM1934-37, “C” em PHM8711-17, “C” em

PHM1754-20,	«γ»	em	PHM3951-25, “C”	em	PHM6929-3,	“A”	em
PHM10054-14,	“A”	em	PHM10721-9, “A”	em	PHM10721-16,	“G”	em
PHM15661-21,	“G”	em	PHM9362-8, “G”	em	PHM1147-16,	«γ»	em
PHM11850-3,	“C”	em	PHM 11850-6, “A”	em	PHM13773-6,	“C”	em
PHM 13773-11,	“A”	em	PHM16422-11, “T”	em	PHM1147-19,	“G”	em

PHM5280-41, “T” em PHM9301-37 e “T” em PHM4423-4. Uma planta de milho que possui o alelo marcador ligado e associado a qualquer um dos alelos marcadores relacionados acima é selecionada em seguida como possuindo resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusaríum.

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4/93 [008] Em outras realizações, o alelo marcador pode ser ligado a qualquer um dos alelos marcadores a seguir: “T” em PHM8211-16, “C” em PHM8711-14, “T” em PHM14506-7, “C” em PHM1934-37, “C” em

PHM8711-17, “C”	em	PHM1754-20,	«γ»	em	PHM3951-25,	“C”	em
PHM6929-3, “A”	em	PHM10054-14,	“A”	em	PHM10721-9,	“A”	em
PHM10721-16, “G’	I, em	PHM15661-21,	, “G’	’ em PHM9362-8,	“G”	em
PHM1147-16, “T”	em	PHM11850-3,	“C”	em	PHM11850-6,	“A”	em
PHM13773-6, “C”	em	PHM13773-11,	“A”	em	PHM16422-11,	«γ»	em
PHM 1147-19, “G”	em	PHM5280-41, “	T” em PHM9301-37 e	«γ»	em
PHM4423-4 em 30 cM, 25, 20, 15, 10, 9,	8, 7,	6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,9,	0,8,	0,7,
0,6, 0,5, 0,4, 0,3,	0,2 ou 0,1 cM, ou pode ser qualquer um dos alelos
marcadores a seguir: “T	” em PHM8211-	16, ¹¹	C” em PHM8711-14, “T”	em
PHM 14506-7, “C”	em	PHM1934-37,	“C”	em	PHM8711-17,	“C”	em
PHM 1754-20, “T”	em	PHM3951-25,	“C”	em	PHM6929-3,	“A”	em
PHM10054-14, “A”	em	PHM10721-9,	“A”	em	PHM10721-16,	“G”	em
PHM 15661-21, “G	err	ι PHM9362-8,	“G”	em	PHM1147-16,	«γ»	em
PHM 11850-3, “C”	em	PHM11850-6,	“A”	em	PHM13773-6,	“C”	em
PHM 13773-11, “A”	' em	PHM16422-11,	«γ»	em	PHM1147-19,	“G”	em

PHM5280-41, “T” em PHM9301-37 e “T” em PHM4423-4.

[009] Em uma realização, são fornecidos métodos de identificação de plantas de milho com resistência aprimorada a fungo da espiga Fusarium por meio da detecção de um locus marcador no genoma da planta de milho utilizando a sequência do locus marcador, uma parte da sequência do locus marcador ou um complemento da sequência do locus marcador, ou uma de suas partes, como sonda marcadora. A sonda marcadora hibridiza-se sob condições estringentes no DNA contíguo entre SEQ ID N° 41 ou uma sequência de nucleotídeos que é 95% idêntica a SEQ ID N° 41 com base no método de alinhamento Clustal V e SEQ ID N° 47 ou uma sequência de nucleotídeos que é 95% idêntica a SEQ ID N° 47 com

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5/93 base no método de alinhamento Clustal V, inclusive, e o locus marcador compreende pelo menos um alelo que é associado ao aumento da resistência a fungo de espiga Fusaríum. As plantas de milho identificadas por meio deste método também são de interesse.

[010] Em uma outra realização, são fornecidos métodos de identificação de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusaríum por meio da detecção de pelo menos um alelo marcador associado ao aumento da resistência no germoplasma de uma planta de milho. O locus marcador pode ser selecionado a partir de qualquer um dos loci marcadores a seguir: os marcadores PHM e SSR PHM6929, bnlg1007, PHM8711, bnlg1083, PHM8211, PHM14506, PHM1754, PHM3951,

PHM1934, PHM10054, PHM10721 e PHM15661; e os marcadores SNP PHM8211-16-1, PHM8711-14-U, PHM14506-7-U, PHM1934-34-U,

PHM8711-17-U, PHM1754-20-U, PHM3951-25-U, PHM6929-3-U,

PHM10054-14-U, PHM10721-9-U, PHM10721-16-U e PHM15661-21-U; bem como qualquer outro marcador que seja ligado a esses marcadores. O locus marcador pode também ser encontrado dentro do intervalo sobre cromossomo 1 que compreende e é ladeado por:

i. PHM6929 e PHM1934; ou ii. PHM6929 e PHM14506.

[011] O locus marcador compreende pelo menos um alelo que é associado ao aumento da resistência ao fungo da espiga Fusaríum. As plantas de milho identificadas por meio desse método também são de interesse.

[012] Em uma outra realização, são fornecidos métodos de identificação de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusaríum por meio de detecção de um haplótipo no germoplasma da planta de milho que é associado ao aumento da resistência ao fungo da

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6/93 espiga Fusaríum. O haplótipo compreende alelos em um ou mais loci marcadores, em que o um ou mais loci marcadores são encontrados no intervalo sobre o cromossomo 1 que compreende e é ladeado por:

i. PHM6929 e PHM1934; ou ii. PHM6929 e PHM14506.

[013] O haplótipo pode compreender pelo menos um dos alelos a seguir: “T” em PHM8211-16, “C” em PHM8711-14, “T” em PHM14506-7, “C” em PHM1934-37, “C” em PHM8711-17, “C” em PHM1754-20, “T” em PHM3951-25, “C” em PHM6929-3, “A” em PHM 10054-14, “A” em PHM10721-9, “A” em PHM10721-16 e “G” em PHM 15661-21. O haplótipo pode também constituir:

i. “C” em PHM6929-3, “T” em PHM8211-16 e “T” em PHM14506-7;

ii. “A” em PHM10054-14 e “A” em PHM10721-9; e iii. “A” em PHM10054-14, “T” em PHM8211-16 e “A” em PHM10721-9. As plantas de milho identificadas por meio desse método também são de interesse.

[014] Em uma outra realização, são fornecidos métodos de seleção de plantas com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium. Em um aspecto, é obtida uma primeira planta de milho que possui pelo menos um alelo de um locus marcador, em que o alelo é associado ao aumento da resistência. O locus marcador pode ser encontrado dentro do intervalo sobre o cromossomo 1 que compreende e é ladeado por:

i. PHM6929 e PHM1934; ou ii. PHM6929 e PHM14506.

[015] A primeira planta de milho pode ser cruzada em seguida com uma segunda planta de milho e as plantas de prole

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7/93 resultantes do cruzamento podem ser avaliadas para determinar o alelo da primeira planta de milho. As plantas de prole que possuem o alelo da primeira planta de milho podem ser selecionadas como possuindo resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium. As plantas de prole selecionadas por meio deste método também são de interesse.

[016] Em uma outra realização, são fornecidos métodos de seleção de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium. Em um aspecto, é obtida uma primeira planta de milho que possui “C” em PHM6929-3, “T” em PHM8211-16 e “T” em PHM145067; “A” em PHM10054-14 e “A” em PHM10721-9; ou “A” em PHM10054-14, “T” em PHM8211-16 e “A” em PHM10721-9. A primeira planta de milho pode ser cruzada com uma segunda planta de milho e as plantas de prole resultantes do cruzamento podem ser avaliadas para determinar os mencionados alelos. As plantas de prole que possuem os mencionados alelos podem ser selecionadas como possuindo resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium. Plantas de prole selecionadas por meio desse método também são de interesse.

[017] Em uma outra realização, são fornecidos métodos de identificação de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium por meio de detecção de um locus marcador no genoma da planta de milho utilizando a sequência do locus marcador, uma parte da sequência do locus marcador ou um complemento da sequência do locus marcador, ou uma de suas partes, como sonda marcadora. A sonda marcadora hibridiza-se sob condições estringentes no DNA contíguo entre SEQ ID N° 48 ou uma sequência de nucleotídeos que é 95% idêntica a SEQ ID N° 48 com base no método de alinhamento Clustal V e SEQ ID N° 55 ou uma sequência de nucleotídeos que é 95% idêntica a SEQ ID N° 55 com base no método de alinhamento Clustal V, inclusive, e o locus

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8/93 marcador compreende pelo menos um alelo que é associado ao aumento da resistência ao fungo da espiga Fusarium. Plantas de milho identificadas por meio desse método também são de interesse.

[018] Em uma outra realização, são fornecidos métodos de identificação de plantas de milho com resistência aprimorada a fungo da espiga Fusarium por meio da detecção de pelo menos um alelo marcador associado ao aumento da resistência no germoplasma de uma planta de milho. O locus marcador pode ser selecionado a partir de qualquer um dos loci marcadores a seguir: os marcadores de PHM e SSR PHM4423, bnlg1732, PHM9362, PHI445613, PHM1147, PHM11850, PHM9301, umc1762, PHM5280, PHM13773 e PHM16422; e os marcadores de SNP PHM9362-8-U, PHM1147-16-U, PHM11850-3-U, PHM11850-6-U, PHM13773-6-U, PHM13773-11-U, PHM16422-11-U, PHM1147-19-U, PHM5280-41-U, PHM9301-37-U e PHM4423-4-U, bem como qualquer outro marcador que seja ligado a esses marcadores. O locus marcador pode ser encontrado dentro do intervalo sobre o cromossomo 6 que compreende e é ladeado por PHM4423 e PHM 16422. O locus marcador compreende pelo menos um alelo que é associado ao aumento da resistência ao fungo da espiga Fusarium. As plantas de milho identificadas por meio desse método também são de interesse.

[019] Em uma outra realização, são fornecidos métodos de identificação de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium por meio da detecção de um haplótipo no germoplasma da planta de milho. O haplótipo compreende alelos em um ou mais loci marcadores, em que o um ou mais loci marcadores são encontrados dentro do intervalo sobre o cromossomo 6 que compreende e é ladeado por PHM4423 e PHM16422. O haplótipo é associado ao aumento da resistência ao fungo da espiga Fusarium e pode compreender pelo menos

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9/93 um dos alelos a seguir: “G” em PHM9362-8, “G” em PHM1147-16, “T” em PHM11850-3, “C” em PHM11850-6, “A” em PHM13773-6, “C” em PHM13773-11, “A” em PHM16422-11, “T” em PHM1147-19, “G” em PHM5280-41, “T” em PHM9301-37 e “T” em PHM4423-4. O haplótipo pode também constituir:

i. “T” em PHM4423-4, “T” em PHM11850-3 e “A” em PHM13773-6; ou ii. “G” em PHM9362-8 e “A” em PHM 13773-6. As plantas de milho identificadas por meio desse método também são de interesse.

[020] Em uma outra realização, são fornecidos métodos de seleção de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium. Em um aspecto, é obtida uma primeira planta de milho que possui pelo menos um alelo ou locus marcador, em que o alelo é associado ao aumento da resistência. O locus marcador pode ser encontrado dentro do intervalo cromossômico que compreende PHM4423 e PHM16422 e é ladeado por ele. A primeira planta de milho pode ser cruzada em uma segunda planta de milho e as plantas de prole resultantes do cruzamento podem ser avaliadas para determinar o alelo da primeira planta de milho. Plantas de prole que possuem os alelos da primeira planta de milho podem ser selecionadas como possuindo resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium. As plantas de prole selecionadas por meio deste método também são de interesse.

[021] Em uma outra realização, são fornecidos métodos de seleção de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium. Em um aspecto, é obtida uma primeira planta de milho que possui “T” em PHM4423-4, “T” em PHM11850-3 e “A” em PHM13773-6 ou “G” em PHM9362-8 e “A” em PHM 13773-6. A primeira planta de milho pode ser cruzada em uma segunda planta de milho e as plantas de prole

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10/93 resultantes do cruzamento podem ser avaliadas nos mencionados alelos. As plantas de prole que possuem os mencionados alelos podem ser selecionadas como possuindo resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusaríum. As plantas de prole selecionadas por meio deste método também são de interesse.

[022] Em uma outra realização, são fornecidos métodos de identificação de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusaríum por meio da detecção de alelos em dois loci marcadores separados, designados no presente locus marcador 1 e locus marcador 2, no germoplasma da planta de milho. O locus marcador 1 está localizado dentro de um intervalo sobre o cromossomo 1 que compreende e é ladeado por:

i. PHM6929 e PHM1934; ou ii. PHM6929 e PHM14506; e o locus marcador 2 está localizado dentro de um intervalo sobre o cromossomo 6 que compreende e é ladeado por PHM4423 e PHM16422. Cada locus marcador compreende pelo menos um alelo que é associado ao aumento da resistência ao fungo da espiga Fusaríum. As plantas de milho identificadas por meio deste método também são de interesse.

[023] Em uma outra realização, são fornecidos métodos de identificação de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusaríum por meio de detecção do germoplasma do haplótipo 1 e haplótipo 2 da planta de milho. O haplótipo 1 e o haplótipo 2 compreendem alelos em um ou mais loci marcadores. Para o haplótipo 1, os loci marcadores estão localizados dentro de um intervalo sobre o cromossomo 1 que compreende e é ladeado por:

i. PHM6929 e PHM1934; ou ii. PHM6929 e PHM14506; e

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11/93 para o haplótipo 2, os loci marcadores estão localizados dentro de um intervalo sobre o cromossomo 6 que compreende e é ladeado por PHM4423 e PHM16422. Os dois haplótipos são associados ao aumento da resistência a fungo da espiga Fusaríum. O haplótipo 1 pode compreender:

i. “C” em PHM6929-3, “T” em PHM8211-16 e “T” em PHM14506-7;

ii. “A” em PHM10054-14 e “A” em PHM10721-9; ou iii. “A” em PHM 10054-14, “T” em PHM8211-16 e “A” em PHM10721-9;e o haplótipo 2 pode compreender:

i. “T” em PHM4423-4, “T” em PHM 11850-3 e “A” em PHM13773-6; ou ii. “G” em PHM9362-8 e “A” em PHM13773-6. As plantas de milho identificadas por meio deste método também são de interesse.

[024] Em uma outra realização, são fornecidos métodos de seleção de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusaríum. Em um aspecto, é obtida uma primeira planta de milho que possui pelo menos um alelo de um primeiro locus marcador e pelo menos um alelo de um segundo locus marcador. O primeiro locus marcador está localizado dentro de um intervalo sobre o cromossomo 1 que compreende e é ladeado por:

i. PHM6929 e PHM1934; ou ii. PHM6929 e PHM14506; e o segundo locus marcador está localizado dentro de um intervalo sobre o cromossomo 6 que compreende e é ladeado por PHM4423 e PHM16422. O pelo menos um alelo do primeiro locus marcador e o pelo menos um alelo do segundo locus marcador são associados ao aumento

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12/93 da resistência ao fungo da espiga Fusarium. A primeira planta de milho pode ser cruzada em uma segunda planta de milho e as plantas de prole resultantes do cruzamento podem ser avaliadas para determinar os alelos da primeira planta de milho. As plantas de prole que possuem os alelos da primeira planta de milho podem ser selecionadas como possuindo resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium. Também são de interesse plantas de prole selecionadas por meio deste método.

[025] Em uma outra realização, são fornecidos métodos de seleção de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium. Em um aspecto, é obtida uma primeira planta de milho que possui um haplótipo no cromossomo 1 QTL que é associado ao aumento da resistência ao fungo da espiga Fusarium e um haplótipo no cromossomo 6 QTL que é associado ao aumento da resistência ao fungo da espiga Fusarium. A primeira planta de milho pode ser cruzada em uma segunda planta de milho e as plantas de prole resultantes do cruzamento podem ser avaliadas para determinar os mencionados alelos. As plantas de prole que possuem os mencionados alelos podem ser selecionadas como possuindo resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium. As plantas de prole selecionadas por meio deste método também são de interesse.

Breve Descrição das Figuras e Listagens de Sequências [026] A presente invenção pode ser compreendida mais completamente a partir da descrição detalhada a seguir e das figuras e Listagem de Sequências anexas que fazem parte do presente pedido. A Listagem de Sequências contém o código de uma letra para caracteres de sequência de nucleotídeos e os códigos de três letras de aminoácidos conforme definido de acordo com os padrões IUPAC-IUBMB descritos em Nucleic Acids Research 13: 3021-3030 (1985) e no Biochemical Journal 219 (n° 2): 345-373 (1984), que são integralmente incorporados ao

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13/93 presente como referência. Os símbolos e o formato utilizados para dados de sequências de aminoácidos e de nucleotídeos atendem às regras descritas em 37 C. F. R. § 1.822.

[027] As Figs. 1A-C exibem a disposição de mapa físico de BACs sequenciados (obtidos por meio do Navegador de Genoma de Milho, que é disponível ao público na Internet; http://www.maizesequence.org) sobre o cromossomo 1 que se reúnem na região definida por PHM6929 (SEQ ID N° 41) e PHM1934 (SEQ ID N° 47), inclusive. São indicadas as posições dos marcadores PHM e SSR descritas no presente; os SEQ ID N° das sequências de referência de PHM são indicados nas figuras.

[028] As Figs. 2A e 2B exibem a disposição de mapa físico de BACs sequenciados (obtida por meio do Navegador de Genoma de Milho, que é disponível ao público na Internet; http://www.maizesequence.org) sobre o cromossomo 6 que é montado sobre a região definida por PHM4423 (SEQ ID N° 48) e PHM 16422 (SEQ ID N° 55), inclusive. São indicadas as posições dos marcadores PHM e SSR descritos no presente; SEQ ID N° das sequências de referência de PHM são indicados nas figuras.

[029] A Fig. 3 exibe uma comparação entre PHG61, a linhagem com alta resistência, e 1047, uma linhagem susceptível.

[030] A Fig. 4 exibe a escala FUSERS utilizada como guia de avaliação de infecção por fungo da espiga Fusarium.

[031] As Figs. 5A e 5B exibem os SEQ ID N° dos oligos e sondas projetados para uso com reações Invader Plus® na haplotipificação de plantas individuais nos intervalos genômicos que contêm o fungo de espiga Fusarium QTL1.

[032] As Figs. 6A e 6B exibem SEQ ID N° para os oligos e sondas projetados para uso com reações Invader Plus® na haplotipificação de plantas individuais no intervalo genômico que contém fungo da espiga Fusarium QTL6.

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14/93 [033] As Figs. 7A, 7B e 7C exibem SEQ ID N° para os oligos e sondas projetadas para uso com reações Invader Plus® na haplotipificação de plantas individuais no intervalo genômico que contém o fungo da espiga Fusarium QTL5, QTL7 e QTL8, respectivamente.

[034] A Fig. 8 exibe os dados de conversão de PHCA5.

[035] A Fig. 9 exibe os dados de conversão de PH51H.

[036] A Fig. 10 exibe os dados de conversão de PH70R.

[037] A Fig. 11 exibe os dados de conversão de PH87H.

[038] A Fig. 12 exibe os dados de conversão de PHFCJ.

[039] A Fig. 13 exibe os dados de conversão de PH890.

[040] A Fig. 14 exibe os dados de conversão de PHB1V.

[041] A Fig. 15B exibe os resultados fenotípicos do uso de uma linhagem convertida como parental em um cruzamento híbrido em comparação com o uso de uma linhagem não convertida.

[042] A Fig. 16 exibe associações entre loci marcadores sobre o cromossomo 1 e a resistência ao fungo da espiga Fusarium em uma subpopulação de hastes não rígidas.

[043] SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 2 são os primers do marcador AFLP I77.

[044] SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4 são os primers do marcador AFLP T292.

[045] SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 são os primers do marcador AFLP D166.

[046] SEQ ID N° 7 e SEQ ID N° 8 são os primers do marcador AFLP C116.

[047] SEQ ID N° 9 e SEQ ID N° 10 são os primers do marcador SSR bnlg1953.

[048] SEQ ID N° 11 e SEQ ID N° 12 são os primers do

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15/93 marcador SSR LGI112958.

[049] SEQ ID	N°	13	e	SEQ	ID	N°	14	são	os	primers	do
marcador SSR PHI445613.
[050] SEQ ID	N°	15	e	SEQ	ID	N°	16	são	os	primers	do
marcador SSR PHI364545.
[051] SEQ ID	N°	17	e	SEQ	ID	N°	18	são	os	primers	do
marcador SSR bnlg1732.
[052] SEQ ID	N°	19	e	SEQ	ID	N°	20	são	os	primers	do
marcador SSR umc1762.
[053] SEQ ID	N°	21	e	SEQ	ID	N°	22	são	os	primers	do

marcador SSR bnlg1007.

[054] SEQ ID N° 23 e SEQ ID N° 24 são os primers de SSR bnlg1083.

[055] SEQ ID N° 25 e SEQ ID N° 26 são os primers do marcador de SSR PHI256546.

[056] SEQ ID N° 27 e SEQ ID N° 28 são os primers de SSR bnlg1174.

[057] SEQ ID N° 29 e SEQ ID N° 30 são os primers de SSR umc1805.

[058] SEQ ID N° 31 e SEQ ID N° 32 são os primers de SSR umc1462.

[059] SEQ ID N° 33 é a sequência do primer externo frontal PHM8211.

[060] SEQ ID N° 34 é a sequência do primer interno frontal PHM8211.

[061] SEQ ID N° 35 é a sequência do primer interno reverso PHM8211.

[062] SEQ ID N° 36 é a sequência do primer externo reverso

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16/93

ΡΗΜ8211.

[063] SEQ ID N° 37 é a sequência do primer externo frontal PHM1934.

[064] SEQ ID N° 38 é a sequência do primer interno frontal PHM1934.

[065] SEQ ID N° 39 é a sequência do primer interno reverso PHM1934.

[066] SEQ ID N° 40 é a sequência do primer externo reverso

PHM1934.

	[067]	SEQ	ID	N°	41	é	a	sequência	de	referência	de
PHM6929.
	[068]	SEQ	ID	N°	42	é	a	sequência	de	referência	de
PHM8711.
	[069]	SEQ	ID	N°	43	é	a	sequência	de	referência	de
PHM8211.
	[070]	SEQ	ID	N°	44	é	a	sequência	de	referência	de
PHM14506.
	[071]	SEQ	ID	N°	45	é	a	sequência	de	referência	de
PHM1754.
	[072]	SEQ	ID	N°	46	é	a	sequência	de	referência	de
PHM3951.
	[073]	SEQ	ID	N°	47	é	a	sequência	de	referência	de
PHM1934.
	[074]	SEQ	ID	N°	48	é	a	sequência	de	referência	de
PHM4423.
	[075]	SEQ	ID	N°	49	é	a	sequência	de	referência	de
PHM9362.
	[076]	SEQ	ID	N°	50	é	a	sequência	de	referência	de

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17/93

ΡΗΜ1147.

	[077]	SEQ	ID	N°	51	é	a	sequência	de	referência	de
PHM11850.	[078]	SEQ	ID	N°	52	é	a	sequência	de	referência	de
PHM9301.	[079]	SEQ	ID	N°	53	é	a	sequência	de	referência	de
PHM5280.	[080]	SEQ	ID	N°	54	é	a	sequência	de	referência	de
PHM13773.	[081]	SEQ	ID	N°	55	é	a	sequência	de	referência	de
PHM 16422.	[082]	SEQ	ID	N°	56	é	a	sequência	de	referência	de
PHM9009.	[083]	SEQ	ID	N°	57	é	a	sequência	de	referência	de
PHM3171.	[084]	SEQ	ID	N°	58	é	a	sequência	de	referência	de
PHM3860.	[085]	SEQ	ID	N°	59	é	a	sequência	de	referência	de
PHM7942.	[086]	SEQ ID N	⁰ 60 é a sequência de referência de PHM678.
	[087]	SEQ	ID	N°	61	é	a	sequência	de	referência	de
PHM8358.	[088]	SEQ	ID	N°	62	é	a	sequência	de	referência	de
PHM16415.	[089]	SEQ ID N	⁰ 63 é a sequência de referência de PHM737.
	[090]	SEQ	ID	N°	64	é	a	sequência	de	referência	de
PHM9092.	[091]	SEQ	ID	N°	65 é	a	sequência do	primer frontal	de

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18/93

PHM6929-3-U.

[092] SEQ ID N° 66 é a sequência do primer reverso de PHM6929-3-U.

[093] SEQ ID N° 67 é a sequência de PHM6929-3-U, sonda 1.

[094] SEQ ID N° 68 é a sequência de PHM6929-3-U, sonda

2.

[095] SEQ ID N° 69 é a sequência de PHM8711 -14-U, primer frontal.

[096] SEQ ID N° 70 é a sequência de PHM8711 -14-U, primer reverso.

[097] SEQ ID N° 71 é a sequência de PHM8711-14-U, sonda 1.

[098] SEQ ID N° 72 é a sequência de PHM8711 -14-U, sonda

2.

[099] SEQ ID N° 73 é a sequência de PHM8211-16-1, primer frontal.

[0100] SEQ ID N° 74 é a sequência de PHM8211-16-1, primer reverso.

[0101] SEQ ID N° 75 é a sequência de PHM8211-16-1, sonda 1.

[0102] SEQ ID N° 76 é a sequência de PHM8211-16-1, sonda

2.

[0103]	SEQ	ID	N°	77	é	a	sequência	de	PHM14506-7-U,
primer frontal.
[0104]	SEQ	ID	N°	78	é	a	sequência	de	PHM14506-7-U,
primer reverso.
[0105]	SEQ	ID	N°	79	é	a	sequência	de	PHM14506-7-U,

Petição 870180156716, de 29/11/2018, pág. 34/148

19/93 sonda 1.

	[0106]	SEQ	ID	N°	80	é	a	sequência	de	PHM14506-7-U,
sonda 2.	[0107]	SEQ	ID	N°	81	é	a	sequência	de	PHM1754-20-U,
primer frontal.
	[0108]	SEQ	ID	N°	82	é	a	sequência	de	PHM1754-20-U,
primer reverso.
	[0109]	SEQ	ID	N°	83	é	a	sequência	de	PHM1754-20-U,
sonda 1.	[0110]	SEQ	ID	N°	84	é	a	sequência	de	PHM1754-20-U,
sonda 2.	[0111]	SEQ	ID	N°	85	é	a	sequência	de	PHM3951-25-U,
primer frontal.
	[0112]	SEQ	ID	N°	86	é	a	sequência	de	PHM3951-25-U,
primer reverso.
	[0113]	SEQ	ID	N°	87	é	a	sequência	de	PHM3951-25-U,
sonda 1.	[0114]	SEQ	ID	N°	88	é	a	sequência	de	PHM3951-25-U,
sonda 2.	[0115]	SEQ	ID	N°	89	é	a	sequência	de	PHM1934-37-U,
primer frontal.
	[0116]	SEQ	ID	N°	90	é	a	sequência	de	PHM1934-37-U,
primer reverso.
	[0117]	SEQ	ID	N°	91	é	a	sequência	de	PHM1934-37-U,
sonda 1.	[0118]	SEQ	ID	N°	92	é	a	sequência	de	PHM1934-37-U,

sonda 2.

[0119] SEQ ID N° 93 é a sequência de PHM4423-4-U, primer

Petição 870180156716, de 29/11/2018, pág. 35/148

20/93 frontal.

[0120] reverso.

[0121]

1.

[0122]

2.

[0123] frontal.

[0124] reverso.

[0125]

1.

[0126] sonda 2.

[0127] primer frontal.

[0128] primer reverso.

[0129] sonda 1.

[0130] sonda 2.

[0131] primer frontal.

[0132] primer reverso.

[0133] é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência

SEQ ID N° 94 é a sequência de PHM4423-4-U, primer

SEQ ID N° 95 é a sequência de PHM4423-4-U, sonda

SEQ ID N° 96 é a sequência de PHM4423-4-U, sonda

SEQ ID N° 97 é a sequência de PHM9362-8-U, primer

SEQ ID N° 98 é a sequência de PHM9362-8-U, primer

SEQ ID N° 99 é a sequência de PHM9362-8-U, sonda

SEQ ID N° 100 é a sequência de PHM9362-8-U,

SEQ ID N° 101

SEQ ID N° 102

SEQ ID N° 103

SEQ ID N° 104

SEQ ID N° 105

SEQ ID N° 106

SEQ ID N° 107 de PHM1147-16-U, de PHM1147-16-U, de PHM1147-16-U, de PHM1147-16-U, de PHM1147-19-U, de PHM1147-19-U, de PHM1147-19-U, é a sequência

Petição 870180156716, de 29/11/2018, pág. 36/148

21/93 sonda 1.

[0134] sonda 2.

[0135] primer frontal.

[0136] primer reverso.

[0137] sonda 1.

[0138] sonda 2.

[0139] primer frontal.

[0140] primer reverso.

[0141] sonda 1.

[0142] sonda 2.

[0143] primer frontal.

[0144] primer reverso.

[0145] sonda 1.

[0146] sonda 2.

[0147] é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência

SEQ ID N° 108

SEQ ID N° 109

SEQ ID N° 110

SEQ ID N° 111

SEQ ID N° 112

SEQ ID N° 113

SEQ ID N° 114

SEQ ID N° 115

SEQ ID N° 116

SEQ ID N° 117

SEQ ID N° 118

SEQ ID N° 119

SEQ ID N° 120

SEQ ID N° 121 de PHM1147-19-U, de PHM11850-3-U, de PHM11850-3-U, de PHM11850-3-U, de PHM11850-3-U, de PHM11850-6-U, de PHM11850-6-U, de PHM11850-6-U, de PHM11850-6-U, de PHM9301-37-U, de PHM9301-37-U, de PHM9301-37-U, de PHM9301-37-U, de PHM5280-41-U, é a sequência

Petição 870180156716, de 29/11/2018, pág. 37/148

22/93 primer frontal.

[0148] primer reverso.

[0149] sonda 1.

[0150] sonda 2.

[0151] primer frontal.

[0152] primer reverso.

[0153] sonda 1.

[0154] sonda 2.

[0155] primer frontal.

[0156] reverso.

[0157] sonda 1.

[0158] sonda 2.

[0159] primer frontal.

[0160] reverso.

[0161] é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência

SEQ ID N° 122

SEQ ID N° 123

SEQ ID N° 124

SEQ ID N° 125

SEQ ID N° 126

SEQ ID N° 127

SEQ ID N° 128 de PHM5280-41-U, de PHM5280-41-U, de PHM5280-41-U, de PHM13773-6-U, de PHM13773-6-U, de PHM13773-6-U, de PHM13773-6-U,

SEQ ID N° 129 é a sequência de PHM13773-11-U,

SEQ ID N° 130 é a sequência de PHM13773-11-U, primer

SEQ ID N° 131 é a sequência de PHM13773-11-U,

SEQ ID N° 132 é a sequência de PHM13773-11-U,

SEQ ID N° 133 é a sequência de PHM16422-11-U,

SEQ ID N° 134 é a sequência de PHM16422-11-U, primer

SEQ ID N° 135 é a sequência de PHM16422-11-U,

Petição 870180156716, de 29/11/2018, pág. 38/148

23/93 sonda 1.

[0162] sonda 2.

[0163] primer frontal.

[0164] primer reverso.

[0165] sonda 1.

[0166] sonda 2.

[0167] primer frontal.

[0168] primer reverso.

[0169] sonda 1.

[0170] sonda 2.

[0171] primer frontal.

[0172] primer reverso.

[0173] sonda 1.

[0174] sonda 2.

[0175]

SEQ

SEQ ID N°

SEQ ID N° 149

ID N° 136 é a sequência de PHM 16422-11-U,

137

138

139

140

141

142

143

144

145

146

147

148 é a sequência de PHM9009-13-U, de PHM9009-13-U, de PHM9009-13-U, de PHM9009-13-U, de PHM3171-5-U, de PHM3171-5-U, de PHM3171-5-U, de PHM3171-5-U, de PHM3860-43-U, de PHM3860-43-U, de PHM3860-43-U, de PHM3860-43-U, de PHM7942-12-U, é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência

Petição 870180156716, de 29/11/2018, pág. 39/148

24/93 primer frontal.

	[0176]	SEQ	ID	N°	150	é	a	sequência	de	PHM7942-12-U
primer reverso.
	[0177]	SEQ	ID	N°	151	é	a	sequência	de	PHM7942-12-U
sonda 1.
	[0178]	SEQ	ID	N°	152	é	a	sequência	de	PHM7942-12-U
sonda 2.
	[0179]	SEQ	ID	N°	153	é	a	sequência	de	PHM678-22-U

primer frontal.

[0180]	SEQ	ID	N°	154	é	a	sequência	de	PHM678-22-U
primer reverso.
[0181]	SEQ	ID	N°	155	é	a	sequência	de	PHM678-22-U
sonda 1.
[0182]	SEQ	ID	N°	156	é	a	sequência	de	PHM678-22-U

sonda 2.

[0183] primer frontal.

[0184] primer reverso.

[0185] sonda 1.

[0186] sonda 2.

[0187] primer frontal.

[0188] primer reverso.

[0189]

SEQ ID N° 157

SEQ ID N° 158

SEQ ID N° 159

SEQ ID N° 160

SEQ ID N° 161

SEQ ID N° 162

SEQ ID N° 163 é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência de PHM8358-17-U, de PHM8358-17-U, de PHM8358-17-U, de PHM8358-17-U, de PHM16415-8-U, de PHM16415-8-U, de PHM16415-8-U, é a sequência

Petição 870180156716, de 29/11/2018, pág. 40/148

25/93 sonda 1.

[0190] sonda 2.

[0191] primer frontal.

[0192] primer reverso.

[0193] sonda 1.

[0194] sonda 2.

[0195] primer frontal.

[0196] primer reverso.

[0197] sonda 1.

[0198] sonda 2.

[0199]

PHM10054.

[0200]

PHM10721.

[0201]

PHM15661.

[0202]

PHM12872.

[0203]

SEQ ID N° 164 SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° SEQ ID N° é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência é a sequência de de de de de de de de de

PHM16415-8-U,

PHM737-215-U,

PHM737-215-U, PHM737-215-U,

PHM737-215-U,

PHM9092-11-U,

PHM9092-11-U, de referência de de referência de de referência de de referência de

165

166

167

168

169

170

171

172

173

174

175

176

177 é a sequência de PHM8711-17-U,

Petição 870180156716, de 29/11/2018, pág. 41/148

26/93 primer frontal.

[0204]	SEQ	ID	N°	178	é	a	sequência	de	PHM8711-17-U,
primer reverso.
[0205]	SEQ	ID	N°	179	é	a	sequência	de	PHM8711-17-U,
sonda 1.
[0206]	SEQ	ID	N°	180	é	a	sequência	de	PHM8711-17-U,

sonda 2.

[0207] SEQ ID N° 181 é a sequência de PHM10054-14-U, primer frontal.

[0208] SEQ ID N° 182 é a sequência de PHM10054-14-U, primer reverso.

[0209] SEQ ID N° 183 é a sequência de PHM10054-14-U, sonda 1.

[0210] SEQ ID N° 184 é a sequência de PHM10054-14-U, sonda 2.

[0211] SEQ ID N° 185 é a sequência de PHM10721-9-U, primer frontal.

[0212] SEQ ID N° 186 é a sequência de PHM10721-9-U, primer reverso.

[0213] SEQ ID N° 187 é a sequência de PHM10721-9-U, sonda 1.

[0214] SEQ ID N° 188 é a sequência de PHM10721-9-U, sonda 2.

[0215] SEQ ID N° 189 é a sequência de PHM10721-16-U, primer frontal.

[0216] SEQ ID N° 190 é a sequência de PHM10721-16-U, primer reverso.

[0217] SEQ ID N° 191 é a sequência de PHM10721-16-U,

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27/93 sonda 1.

[0218] SEQ ID N° 192 é a sequência de PHM10721-16-U, sonda 2.

[0219] SEQ ID N° 193 é a sequência de PHM15661-21-U, primer frontal.

[0220] SEQ ID N° 194 é a sequência de PHM15661-21-U, primer reverso.

[0221] SEQ ID N° 195 é a sequência de PHM15661-21-U, sonda 1.

[0222] SEQ ID N° 196 é a sequência de PHM15661-21-U, sonda 2.

Descrição Detalhada da Invenção [0223] A presente invenção fornece composições alélicas em milho e métodos de identificação e seleção de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium. As definições a seguir são fornecidas na forma de auxílio para a compreensão da presente invenção.

[0224] O termo “alelo” designa uma ou mais sequências de nucleotídeos diferentes que ocorrem em um locus específico.

[0225] “Frequência de alelo” designa a frequência (proporção ou percentual) em que um alelo está presente em um locus dentro de um indivíduo, dentro de uma linhagem ou dentro de uma população de linhagens. Para um alelo “A”, por exemplo, indivíduos diploides do genótipo “AA”, “Aa” ou “aa” possuem frequências de alelos de 1,0, 0,5 ou 0,0, respectivamente. Pode-se estimar a frequência de alelos em uma linhagem calculando-se a média das frequências de alelos de uma amostra de indivíduos daquela linhagem. De forma similar, pode-se calcular a frequência de alelos em uma população de linhagens

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28/93 calculando-se a média das frequências de alelos de linhagens que compõem a população. Para uma população com quantidade finita de indivíduos ou linhagens, uma frequência de alelos pode ser expressa na forma de contagem de indivíduos ou linhagens (ou qualquer outro agrupamento especificado) que contêm o alelo.

[0226] “Amplicon” é um ácido nucléico amplificado, tal como um ácido nucléico que é produzido por meio da amplificação de um ácido nucléico modelo por meio de qualquer método de amplificação disponível (tal como PCR, LCR, transcrição ou similares).

[0227] O termo “amplificação”, no contexto de amplificação de ácido nucléico, é qualquer processo por meio do qual são produzidas cópias adicionais de um ácido nucléico selecionado (ou uma de suas formas transcritas). Métodos de amplificação típicos incluem diversos métodos de reprodução com base em polimerase, que incluem a reação em cadeia de polimerase (PCR), métodos mediados por ligase tais como a reação em cadeia de ligase (LCR) e métodos de amplificação com base em polimerase de RNA (tal como por meio de transcrição).

[0228] O termo “conjunto” aplica-se a BACs e sua propensão de reunir-se para formar estiramentos contíguos de DNA. Um BAC forma “conjunto” em um contíguo com base em alinhamento de sequências, caso o BAC seja sequenciado, ou por meio do alinhamento da sua impressão digital de BAC com as impressões digitais de outros BACs. Os conjuntos podem ser encontrados utilizando o Navegador de Genoma de Milho, que é disponível ao público na Internet.

[0229] Um alelo é “associado a” uma característica quando for ligado a ela e quando a presença do alelo for um indicador de que a característica ou forma de característica desejada ocorrerá em uma planta que compreende o alelo.

[0230] “BAC”, ou cromossomo artificial bacteriano, é um

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29/93 vetor de clonagem derivado do fator F de ocorrência natural de Escheríchia coli. BACs podem aceitar grandes insertos de sequência de DNA. Em milho, diversos BACs, ou cromossomos artificiais bacterianos, cada qual contendo um grande inserto de DNA genômico de milho, foram montados em contíguos (fragmentos genéticos contíguos sobrepostos, ou “DNA contíguo”).

[0231] “Retrocruzamento” designa o processo por meio do qual a prole híbrida é cruzada repetidamente com um dos pais. Em um esquema de retrocruzamento, o pai “doador” designa a planta parental com o locus ou gene desejado a sofrer introgressão. O pai “receptor” (utilizado uma ou mais vezes) ou o pai “recorrente” (utilizado duas ou mais vezes) designa a planta parental na qual o gene ou locus está sofrendo introgressão. Vide, por exemplo, Ragot, M. et al (1995), Marker-Assisted Backcrossing: a Practical Example em Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques, Vol. 72, págs. 45-56, e Openshaw et al (1994), Marker-Assisted Selection in Backcross Breeding, Analysis of Molecular Marker Data, págs. 41-43. O cruzamento inicial causa a geração F1; o termo “BC1” designa, portanto, o segundo uso do pai recorrente, “BC2” designa o terceiro uso do pai recorrente e assim por diante.

[0232] Centimorgan (“cM”) é uma unidade de medida da frequência de recombinação. Um cM é igual a 1% de possibilidade de que um marcador em um locus genético seja separado de um marcador em um segundo locus devido ao cruzamento em uma única geração.

[0233] Da forma utilizada no presente, a expressão “intervalo cromossômico” designa uma extensão linear contígua de DNA genômico que reside na planta em um único cromossomo. Os elementos genéticos ou genes localizados em um único intervalo cromossômico são fisicamente ligados. O tamanho de um intervalo cromossômico não é particularmente

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30/93 limitado. Em alguns aspectos, os elementos genéticos localizados em um único intervalo cromossômico são geneticamente ligados, tipicamente com uma distância de recombinação genética, por exemplo, menor ou igual a 20 cM ou, alternativamente, menor ou igual a 10 cM. Isso significa que dois elementos genéticos em um único intervalo cromossômico sofrem recombinação em frequência menor ou igual a 20% ou 10%.

[0234] “Cromossomo” pode também ser denominado “grupo de ligação”.

[0235] A expressão “ligado de perto”, no presente pedido, indica que a recombinação entre dois loci ligados ocorre com frequência menor ou igual a cerca de 10% (ou seja, eles são separados em um mapa genético em não mais de 10 cM). Em outras palavras, os loci ligados de perto cossegregam-se em pelo menos 90% do tempo. Os loci marcadores são especialmente úteis na presente invenção quando demonstram uma probabilidade significativa de cossegregação (ligação) com uma característica desejada (tal como resistência patogênica). Loci ligados de perto tais como um locus marcador e um segundo locus podem exibir uma frequência de recombinação inter-/ocus de 10% ou menos, preferencialmente cerca de 9% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 8% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 7% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 6% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 5% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 4% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 3% ou menos e, de preferência ainda maior, cerca de 2% ou menos. Em realizações de alta preferência, os loci relevantes exibem uma frequência de recombinação de cerca de 1% ou menos, tal como cerca de 0,75% ou menos, de maior preferência cerca de 0,5% ou menos ou, de preferência ainda maior, cerca de 0,25% ou menos. Também se afirma que dois /oc/que estão localizados

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31/93 sobre o mesmo cromossomo e em uma distância tal que a recombinação entre os dois loci ocorra em uma frequência de menos de 10% (tal como cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% ou menos) encontram-se “próximos” entre si. Em alguns casos, dois marcadores diferentes podem possuir as mesmas coordenadas de mapa genético. Neste caso, os dois marcadores encontram-se em tal proximidade entre si que a recombinação ocorre entre eles com frequência tão baixa que não pode ser detectada.

[0236] O termo “complemento” designa uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma dada sequência de nucleotídeos, ou seja, as sequências são relacionadas pelas regras de emparelhamento de bases.

[0237] A expressão “DNA contíguo” designa fragmentos genéticos contíguos sobrepostos.

[0238] Ao referir-se ao relacionamento entre dois elementos genéticos, tais como um elemento genético que contribui com a resistência e um marcador próximo, ligação de fases de “acoplamento” indica o estado em que o alelo “favorável” no locus de resistência é associado fisicamente sobre a mesma fita de cromossomo do alelo “favorável” do locus marcador ligado correspondente. Na fase de acoplamento, os dois alelos favoráveis são herdados juntos pela prole que herda aquela fita de cromossomo.

[0239] O termo “cruzado” ou “cruzamento” indica a fusão de gametas por meio de polinização para produzir prole (tal como células, sementes ou plantas). O termo engloba cruzamentos sexuais (a polinização de uma planta por outra) e individuais (autopolinização, tal como quando o pólen e o óvulo são da mesma planta). O termo “cruzamento” designa o ato de fusão de gametas por meio de polinização para produzir prole.

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32/93 [0240] Uma planta denominada no presente “diploide” possui dois conjuntos (genomas) de cromossomos.

[0241] “Resistência a doença” é uma característica de uma planta, em que a planta evita os sintomas de doença que são o resultado de interações entre planta e patógeno, tais como interações entre milho e as espécies de Fusarium F. verticillioides, F. proliferatum e/ou F. subglutinans. Isso significa que se evita que os patógenos causem doenças das plantas e os sintomas de doenças associados ou, alternativamente, os sintomas de doenças causados pelo patógeno são minimizados ou reduzidos. Os técnicos no assunto apreciarão que as composições e os métodos descritos no presente podem ser utilizados com outras composições e métodos disponíveis na técnica para a proteção de plantas contra ataque de patógenos.

[0242] Uma planta denominada no presente “haploide dobrado” é desenvolvida por meio de dobra do conjunto haploide de cromossomos. Uma planta haploide dobrada é considerada uma planta homozigótica.

[0243] Uma “linhagem de elite” é qualquer linhagem que tenha resultado do cultivo e seleção em busca de desempenho agronômico superior.

[0244] “Resistência aprimorada” designa um nível mais alto de resistência contra um patógeno específico, um amplo espectro de patógenos ou uma infecção causada pelo(s) patógeno(s). Nível mais alto de resistência contra os patógenos fúngicos Fusarium verticillioides (Fv), Fusarium proliferatum (Fp) e Fusarium subglutinans (Fs), por exemplo, constitui resistência fúngica “aprimorada” ou melhorada. As realizações da presente invenção aprimorarão ou melhorarão a resistência a patógenos vegetais fúngicos, de tal forma que a resistência da planta a um ou mais

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33/93 patógenos fúngicos aumentará, o que, por sua vez, aumentará a resistência à doença causada pelo patógeno fúngico. O termo “aprimorar” designa melhorar, aumentar, amplificar, multiplicar, elevar, levantar e similares. No presente, as plantas de acordo com a presente invenção são descritas como possuindo “resistência aprimorada” às espécies de Fusarium F. verticillioides, F. proliferatum e F. subglutinans e/ou ao fungo da espiga causado por estes patógenos, como resultado de alelos específicos no locus da presente invenção.

[0245] “Linhagem de milho exótica” ou “germoplasma de milho exótico” é uma linhagem ou germoplasma derivada de um milho não pertencente a uma linhagem de milho de elite disponível ou linhagem de germoplasma. No contexto de um cruzamento entre duas plantas de milho ou linhagens de germoplasma, um germoplasma exótico não é relacionado de perto pela descendência ao germoplasma de elite com o qual é cruzado. Mais comumente, o germoplasma exótico não é derivado de nenhuma linhagem de elite de milho conhecida, mas sim é selecionado para introduzir elementos genéticos inovadores (tipicamente alelos inovadores) em um programa de cultivo.

[0246] F. verticillioides, F. proliferatum e F. subglutinans são os patógenos fúngicos que induzem fungo da espiga Fusarium (ou ferrugem da espiga) em milho. Os patógenos fúngicos também são denominados coletivamente no presente Fusarium.

[0247] Um “alelo favorável é o alelo em um locus específico que confere um fenótipo agronomicamente desejável ou contribui com ele, tal como resistência aprimorada a ferrugem da espiga Fusarium. Um alelo favorável de um marcador é um alelo de marcador que se segrega com o fenótipo favorável.

[0248] “Fragmento” destina-se a indicar uma parte de uma

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34/93 sequência de nucleotídeos. Os fragmentos podem ser utilizados como sondas de hibridização ou primers de PCR empregando os métodos descritos no presente.

[0249] Da forma utilizada no presente, “resistência fúngica” designa aumento da resistência ou tolerância a um patógeno fúngico em comparação com o de uma planta do tipo selvagem. Os efeitos podem variar de um leve aumento da tolerância aos efeitos do patógeno fúngico (tal como inibição parcial) até a total resistência, de tal forma que a planta não seja afetada pela presença do patógeno fúngico.

[0250] “Fungo da espiga Fusaríurrí’, às vezes denominado ferrugem da espiga Fusaríurrí’, é a doença causada pelas espécies do complexo de Gibberella fujikuroi, nomeadamente F. verticillioides, F. proliferatum e/ou F. subglutinans.

[0251] “Mapa genético” é uma descrição das relações de ligação genética entre os loci sobre um ou mais cromossomos em uma dada espécie, ilustradas de forma geral em forma tabular ou de diagrama. Para cada mapa genético, as distâncias entre os loci são medidas pelas frequências de recombinação entre eles e as recombinações entre loci podem ser detectadas utilizando uma série de marcadores genéticos moleculares (também denominados marcadores moleculares). Um mapa genético é um produto da população de mapeamento, tipos de marcadores utilizados e potencial polimórfico de cada marcador entre diferentes populações. A ordem e as distâncias genéticas entre os loci podem diferir de um mapa genético para outro. 10 cM sobre o mapa genético derivado internamente (também denominado no presente “PHB” para Pioneer Hi-Bred), por exemplo, são aproximadamente equivalentes a 25-30 cM no mapa de quadros vizinhos IBM2 2005 (um mapa de alta resolução disponível em MaizeGDB). As informações podem ser correlacionadas de um mapa para outro, entretanto, utilizando uma

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35/93 estrutura geral de marcadores comuns. Os técnicos comuns no assunto podem utilizar a estrutura de marcadores comuns para identificar as posições de marcadores e outros loci de interesse em cada mapa genético individual.

[0252] “Local de mapa genético” é um local em um mapa genético relativo a marcadores genéticos vizinhos sobre o mesmo grupo de ligação em que um marcador especificado pode ser encontrado em uma dada espécie.

[0253] “Mapeamento genético” é o processo de definição das relações de ligação de loci por meio do uso de marcadores genéticos, populações que segregam em busca dos marcadores e princípios genéticos padrão de frequência de recombinação.

[0254] “Marcadores genéticos” são ácidos nucleicos que são polimórficos em uma população e em que os seus alelos podem ser detectados e diferenciados por um ou mais métodos analíticos, tais como RFLP, AFLP, isozima, SNP, SSR e similares. A expressão também designa sequências de ácidos nucleicos complementares às sequências genômicas, tais como ácidos nucleicos utilizados como sondas. Os marcadores correspondentes a polimorfismos genéticos entre membros de uma população podem ser detectados por meio de métodos bem estabelecidos na técnica. Estes incluem, por exemplo, métodos de amplificação específicos de sequências com base em PCR, detecção de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), detecção de marcadores de isozimas, detecção de polimorfismos de polinucleotídeos por meio de hibridização específica de alelos (ASH), detecção de sequências variáveis amplificadas do genoma vegetal, detecção de reprodução de sequências autossustentada, detecção de repetições de sequências simples (SSRs), detecção de polimorfismos de nucleotídeos isolados (SNPs) ou detecção de polimorfismos de comprimento de fragmentos (AFLPs). Também são

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36/93 conhecidos métodos bem estabelecidos de detecção de marcas de sequências expressas (ESTs) e marcadores de SSR derivados de sequências de EST e DNA polimórfico aleatoriamente amplificado (RAPD).

[0255] “Frequência de recombinação genética” é a frequência de cruzamento sobre eventos (recombinação) entre dois loci genéticos. A frequência de recombinação pode ser observada seguindo-se a segregação de marcadores e/ou características após a meiose.

[0256] “Genoma” designa o DNA total ou o conjunto completo de genes conduzido por um cromossomo ou conjunto de cromossomos.

[0257] O termo “genótipo” é a construção genética de um indivíduo (ou grupo de indivíduos) em um ou mais loci genéticos, ao contrário da característica observável (o fenótipo). O genótipo é definido pelo(s) alelo(s) de um ou mais loci conhecidos herdado pelo indivíduo dos seus pais. O termo genótipo pode ser utilizado para designar a constituição genética de um indivíduo em um único locus, em diversos loci ou, mais geralmente, o termo genótipo pode ser utilizado para designar a composição genética de um indivíduo para todos os genes no seu genoma.

[0258] “Germoplasma” designa material genético de um indivíduo (tal como uma planta), um grupo de indivíduos (tal como uma linhagem, variedade ou família de plantas) ou um clone derivado de uma linhagem, variedade, espécie ou cultivo. O germoplasma pode ser parte de um organismo ou célula ou pode ser separado do organismo ou célula. Geralmente, o germoplasma fornece material genético com uma composição molecular específica que fornece bases físicas para algumas ou todas as qualidades hereditárias de um organismo ou cultivo celular. Da forma utilizada no presente, germoplasma inclui células, sementes ou tecidos dos quais podem ser cultivadas novas plantas ou partes de plantas, tais como folhas, hastes, pólen ou células que podem ser cultivadas em uma planta inteira.

[0259] Uma planta denominada “haploide” possui um único

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37/93 conjunto (genoma) de cromossomos.

[0260] Um “haplótipo” é o genótipo de um indivíduo em uma série de loci genéticos, ou seja, uma combinação de alelos. Tipicamente, os loci genéticos descritos por um haplótipo são física e geneticamente ligados, ou seja, sobre o mesmo segmento de cromossomo. O termo “haplótipo” pode designar polimorfismos em um locus específico, tal como um locus marcador isolado, ou polimorfismos em diversos loci ao longo de um segmento cromossômico.

[0261] O termo “heterogeneidade” é utilizado para indicar que indivíduos dentro do grupo diferem de genótipo em um ou mais loci específicos.

[0262] Um “grupo heterótico” compreende um conjunto de genótipos que apresentam bom desempenho quando cruzado com genótipos de um grupo heterótico diferente (Hallauer et al (1998), Corn Breeding, págs. 463-564 em G. F. Sprague e J. W. Dudley (Ed.), Corn and Corn Improvement). Linhagens congênitas são classificadas em grupos heteróticos e são adicionalmente subdivididas em famílias em um grupo heterótico, com base em diversos critérios tais como pedigree, associações com base em marcadores moleculares e desempenho em combinações híbridas (Smith et al (1990), Theor. Appl. Gen. 80: 833-840). Os dois grupos heteróticos mais amplamente utilizados nos Estados Unidos são denominados “Sintético de Haste Rígida de lowa” (BSSS) e “Lancaster” ou “Safra Segura de Lancaster” (às vezes denominada NSS, ou Haste Não Rígida).

[0263] O termo “heterozigótico” indica uma condição genética na qual diferentes alelos residem em loci correspondentes sobre cromossomos homólogos.

[0264] O termo “homogeneidade” indica que membros de um

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38/93 grupo possuem o mesmo genótipo em um ou mais loci específicos [0265] O termo “homozigótico” indica uma condição genética na qual alelos idênticos residem em loci correspondentes sobre cromossomos homólogos.

[0266] O termo “híbrido” designa a prole obtida entre o cruzamento de pelo menos dois pais geneticamente dissimilares.

[0267] “Hibridização” ou “hibridização de ácido nucleico” designa o emparelhamento de fitas de DNA e RNA complementares, bem como o emparelhamento de fitas isoladas de DNA complementares.

[0268] O termo “hibridizar-se” indica a formação de pares de bases entre regiões complementares de fitas de ácido nucleico.

[0269] “Mapa genético IBM” designa qualquer um dos mapas a seguir: IBM, IBM2, vizinhos de IBM2, IBM2 FPC0507, vizinhos de IBM2 2004, vizinhos de IBM2 2005 ou quadro de vizinhos de IBM2 2005. Os mapas genéticos IBM são baseados em uma população de B73 x Mo17 na qual a prole do cruzamento inicial foi acasalada aleatoriamente por diversas gerações antes de construir linhagens congênitas recombinantes para mapeamento. Versões mais novas refletem a adição de loci mapeados por BAC e genéticos, bem como refinamento de mapas aprimorado devido à incorporação das informações obtidas de outros mapas genéticos.

[0270] O termo “congênito” indica uma linhagem que tenha sido cultivada para homogeneidade genética.

[0271] O termo “indel” designa uma inserção ou exclusão, em que uma linhagem pode ser indicada como possuindo uma inserção com relação a uma segunda linhagem ou a segunda linhagem pode ser indicada como possuindo uma exclusão com relação à primeira linhagem.

[0272] O termo “introgressão” designa a transmissão de um

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39/93 alelo desejado de um locus genético de um fundo genético para outro. A introgressão de um alelo desejado em um locus especificado, por exemplo, pode ser transmitida para pelo menos uma prole por meio de cruzamento sexual entre dois pais da mesma espécie, em que pelo menos um dos pais possui o alelo desejado no seu genoma. Alternativamente, por exemplo, a transmissão de um alelo pode ocorrer por meio de recombinação entre dois genomas doadores, tal como em um protoplasta fundido, em que pelo menos um dos protoplastas doadores possui o alelo desejado no seu genoma. O alelo desejado pode ser, por exemplo, um alelo selecionado de um marcador, QTL, um transgene ou similar. Em qualquer dos casos, a prole que compreende o alelo desejado pode ser retrocruzada repetidamente em uma linhagem que possui um antecedente genético desejado e selecionada em busca do alelo desejado, para resultar na fixação do alelo em um antecedente genético selecionado. O locus do cromossomo 1 e/ou o locus do cromossomo 6 descritos no presente, por exemplo, podem sofrer introgressão em um pai recorrente que não é resistente ou é apenas parcialmente resistente à espécie de Fusarium que causa fungo de espiga e/ou ao próprio fungo de espiga. A linhagem parental recorrente com o gene ou locus que sofreu introgressão possui então resistência aprimorada à espécie de Fusarium que causa fungo da espiga e/ou o próprio fungo da espiga.

[0273] O processo de “introgressão” é frequentemente denominado “retrocruzamento” quando o processo é repetido por duas ou mais vezes.

[0274] “Linhagem” ou “linha” é um grupo de indivíduos com parentela idêntica que geralmente são congênitos até certo grau e que são geralmente homozigóticos e homogêneos na maior parte dos loci (isogênicos ou quase isogênicos). “Sublinhagem” designa um subconjunto

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40/93 congênito de descendentes que são geneticamente distintos de outros subconjuntos congênitos de forma similar que descendem do mesmo progenitor.

[0275] Da forma utilizada no presente, o termo “ligação” é utilizado para descrever o grau com que cada locus marcador é associado a um outro locus marcador ou algum outro locus (tal como um locus de resistência a fungo da espiga de Fusaríum). O relacionamento de ligação entre um marcador molecular e um fenótipo é fornecido como “probabilidade” ou “probabilidade ajustada”. A ligação pode ser expressa na forma de faixa ou limite desejado. Em algumas realizações, por exemplo, qualquer marcador é ligado (genética e fisicamente) a qualquer outro marcador quando os marcadores forem separados em menos de 50, 40, 30, 25, 20 ou 15 unidades de mapa (ou cM). Em alguns aspectos, é vantajoso definir uma faixa de ligação indicada, tal como de 10 a 20 cM, 10 a 30 cM ou de 10 a 40 cM. Quanto mais próximo um marcador for ligado a um segundo locus, melhor se torna o indicador para o segundo locus. Desta forma, “loci com ligação próxima”, tais como um locus marcador e um segundo locus, exibem uma frequência de recombinação inter-/ocus de 10% ou menos, preferencialmente cerca de 9% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 8% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 7% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 6% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 5% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 4% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 3% ou menos e, de preferência ainda maior, cerca de 2% ou menos. Em realizações de alta preferência, os loci relevantes exibem uma frequência de recombinação de cerca de 1% ou menos, tal como cerca de 0,75% ou menos, de maior preferência cerca de 0,5% ou menos ou, de preferência ainda maior, cerca de 0,25% ou menos. Também se afirma que dois loci

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41/93 que se encontram no mesmo cromossomo e em uma distância tal que a recombinação entre os dois loci ocorra em uma frequência de menos de 10% (tal como cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% ou menos) são “próximos” entre si. Como um cM é a distância entre dois marcadores que exibe frequência de recombinação de 1%, qualquer marcador é ligado de perto (genética e fisicamente) a qualquer outro marcador que se encontre em boa proximidade, tal como a 10 cM de distância ou menos. Dois marcadores ligados de perto sobre o mesmo cromossomo podem ser posicionados a 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5 ou 0,25 cM ou menos entre si.

[0276] A expressão “desequilíbrio de ligação” designa uma segregação não aleatória de loci ou características genéticas (ou ambos). Em qualquer dos casos, o desequilíbrio de ligação indica que os loci relevantes encontram-se em suficiente proximidade física ao longo de um comprimento de cromossomo para que se segreguem juntos com frequência maior que a aleatória (ou seja, não aleatória) (no caso de características não segregantes, os loci subjacentes às características encontram-se em proximidade suficiente entre si). Os marcadores que exibem desequilíbrio de ligação são considerados ligados. Os loci ligados cossegregam-se por mais de 50% do tempo, tal como cerca de 51 % a cerca de 100% do tempo. Em outras palavras, dois marcadores que se cossegregam possuem uma frequência de recombinação de menos de 50% (e, por definição, são separados em menos de 50 cM sobre o mesmo cromossomo). Da forma utilizada no presente, a ligação pode ser realizada entre dois marcadores ou, altemativamente, entre um marcador e um fenótipo. Um locus marcador pode ser “associado” (ligado) a uma característica, tal como resistência ao fungo da espiga Fusarium. O grau de ligação de um marcador molecular a uma característica fenotípica é medido, por exemplo, na forma de probabilidade estatística de cossegregação daquele marcador molecular com o fenótipo.

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42/93 [0277] O desequilíbrio de ligação é mais comumente determinado utilizando a medida r², que é calculada utilizando a fórmula descrita por Hill, W. G. e Robertson, A., Theor. Appl. Genet. 38: 226-231 (1968). Quando r² = 1, existe LD completo entre os dois loci marcadores, o que significa que os marcadores não foram separados por meio de recombinação e possuem a mesma frequência de alelo. Valores de r² acima de 1/3 indicam LD suficientemente forte para que sejam úteis para mapeamento (Ardlie et al, Nature Reviews Genetics 3: 299-309 (2002)). Desta forma, os alelos encontram-se em desequilíbrio de ligação quando os valores r² entre os loci marcadores em pares forem maiores ou iguais a 0,33, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0.

[0278] Da forma utilizada no presente, “equilíbrio de ligação” descreve uma situação na qual dois marcadores segregam-se independentemente, ou seja, são selecionados aleatoriamente entre a prole. Marcadores que exibem equilíbrio de ligação são considerados não ligados (repousem ou não sobre o mesmo cromossomo).

[0279] “locus” é uma posição sobre um cromossomo na qual está localizado um gene ou marcador.

[0280] O “logaritmo de valores ímpares (LOD)” ou “avaliação LOD” (Risch, Science 255: 803-804 (1992)) é utilizado em mapeamento de intervalos para descrever o grau de ligação entre dois loci marcadores. Avaliação LOD de três entre dois marcadores indica que a ligação é mil vezes mais provável que a ausência de ligação, enquanto avaliação LOD de dois indica que a ligação é cem vezes mais provável que a ausência de ligação. Avaliações LOD maiores ou iguais a dois podem ser utilizadas para detectar ligação.

[0281] “Milho” designa uma planta de Zea mays L. SSP. mays.

[0282] A expressão “planta de milho” inclui: plantas de milho

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43/93 inteiras, células de plantas de milho, protoplasta de plantas de milho, cultivos de tecido de milho ou células de plantas de milho dos quais podem ser regeneradas plantas de milho, calos de plantas de milho e células de plantas de milho que são intactas em plantas de milho ou partes de plantas de milho, tais como sementes de milho, sabugos de milho, flores de milho, cotilédones de milho, folhas de milho, hastes de milho, botões de milho, raízes de milho, pontas de raízes de milho e similares.

[0283] “Marcador” é uma sequência de nucleotídeos ou seu produto codificado (tal como uma proteína) utilizado como ponto de referência. Para que os marcadores sejam úteis na detecção de recombinações, eles necessitam detectar diferenças ou polimorfismos na população sendo monitorada. Para marcadores moleculares, isso significa diferenças no nível de DNA devido a diferenças de sequências de polinucleotídeos (tais como SSRs, RFLPs, FLPs, SNPs). A variabilidade genômica pode ser de qualquer origem, tais como inserções, exclusões, duplicações, elementos repetitivos, mutações pontuais, eventos de recombinação ou a presença e sequência de elementos transponíveis. Marcadores moleculares podem ser derivados de ácidos nucleicos genômicos ou expressos (tais como ESTs) e podem também designar ácidos nucleicos utilizados como sondas ou pares de primers capazes de amplificar fragmentos de sequências utilizando métodos com base em PCR. Um grande número de marcadores moleculares de milho é conhecido na técnica e publicado ou disponível por meio de diversas fontes, tais como o recurso da Internet MaizeGDB e o recurso da Internet do Instituto Genômico do Arizona mantido pela Universidade do Arizona.

[0284] Os marcadores correspondentes a polimorfismos genéticos entre membros de uma população podem ser detectados por meio de métodos bem estabelecidos na técnica. Estes incluem, por

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44/93 exemplo, sequenciamento de DNA, métodos de amplificação específica de sequência com base em PCR, detecção de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), detecção de marcadores de isozimas, detecção de polimorfismos de nucleotídeos por meio de hibridização específica de alelos (ASH), detecção de sequências variáveis amplificadas do genoma vegetal, detecção de reprodução de sequências autossustentada, detecção de repetições de sequência simples (SSRs), detecção de polimorfismos de nucleotídeos isolados (SNPs) ou detecção de polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados (AFLPs). Também são conhecidos métodos bem estabelecidos de detecção de marcas de sequência expressas (ESTs) e marcadores de SSR derivados de sequências de EST e DNA poliamórfico aleatoriamente amplificado (RAPD).

[0285] Um “alelo marcador”, alternativamente um “alelo de um locus marcador”, pode designar um dentre uma série de sequências de nucleotídeos polimórficas encontradas em um locus marcador em uma população que é polimórfica para o locus marcador.

[0286] “Seleção assistida por marcador” (de MAS) é um processo por meio do qual os fenótipos são selecionados com base em genótipos marcadores.

[0287] “Contrasseleção assistida por marcador” é um processo por meio do qual são utilizados genótipos marcadores para identificar plantas que não serão selecionadas, permitindo que elas sejam removidas de um programa de cultivo ou plantio.

[0288] “Haplótipo marcador” designa uma combinação de alelos em um locus marcador.

[0289] “locus marcador” é um local de cromossomo específico no genoma de uma espécie na qual pode ser encontrado um

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45/93 marcador específico. Pode-se utilizar um locus marcador para rastrear a presença de um segundo locus ligado, tal como um locus ligado que codifica ou contribui com a expressão de uma característica fenotípica. Pode-se utilizar, por exemplo, um locus marcador para monitorar a segregação de alelos em um locus, tal como QTL ou um gene isolado, que são genética ou fisicamente ligados ao locus marcador.

[0290] Uma “sonda marcadora” é uma sequência de ácido nucléico ou molécula que pode ser utilizada para identificar a presença de um locus marcador, tal como uma sonda de ácido nucléico que é complementar a uma sequência de locus marcador, por meio de hibridização de ácido nucléico. Sondas marcadoras que compreendem trinta ou mais nucleotídeos contíguos do locus marcador (“toda ou uma parte” da sequência de locus marcador) podem ser utilizadas para hibridização de ácidos nucleicos. Alternativamente, em alguns aspectos, uma sonda marcadora designa uma sonda de qualquer tipo que é capaz de diferenciar (ou seja, genotipificar) o alelo específico que está presente em um locus marcador.

[0291] A expressão “marcador molecular” pode ser utilizada para designar um marcador genético, conforme definido acima, ou um de seus produtos codificados (tal como uma proteína) utilizado como ponto de referência ao identificar-se um locus ligado. Um marcador pode ser derivado de sequências de nucleotídeos genômicos ou de sequências de nucleotídeos expressas (tal como de um RNA dividido, cDNA etc.) ou de um polipeptídeo codificado. A expressão também designa sequências de ácidos nucleicos complementares ou laterais às sequências marcadoras, tais como ácidos nucleicos utilizados como sondas ou pares de primers capazes de amplificar a sequência marcadora. “Sonda marcadora molecular” é uma sequência de ácido nucléico ou molécula que pode ser

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46/93 utilizada para identificar a presença de um locus marcador, tal como uma sonda de ácido nucléico que é complementar a uma sequência de locus marcador. Alternativamente, em alguns aspectos, uma sonda marcadora designa uma sonda de qualquer tipo que é capaz de diferenciar (ou seja, genotipificar) o alelo específico que está presente em um locus marcador. Ácidos nucleicos são “complementares” quando se hibridizam especificamente em solução, tal como de acordo com as regras de emparelhamento de bases de Watson-Crick. Alguns dos marcadores descritos no presente também são denominados marcadores de hibridização quando localizados sobre uma região indel, tal como a região não colinear descrita no presente. Isso ocorre porque a região de inserção é, por definição, um polimorfismo com relação a uma planta sem a inserção. Desta forma, o marcador necessita indicar apenas se a região indel está presente ou ausente. Qualquer tecnologia de detecção de marcadores apropriada pode ser utilizada para identificar esse marcador de hibridização; utiliza-se, por exemplo, tecnologia SNP nos exemplos fornecidos no presente.

[0292] Um alelo correlaciona-se “negativamente” com uma característica quando for relacionado a ela e quando a presença do alelo for um indicador de que uma forma de característica ou característica desejada não ocorrerá em uma planta que compreende o alelo.

[0293] “Sequência de nucleotídeos”, “polinucleotídeo”, “sequência de ácidos nucleicos” e “fragmento de ácido nucléico” são utilizados de forma intercambiável e designam um polímero de RNA ou DNA que possui fita simples ou dupla, opcionalmente contendo bases de nucleotídeos sintéticas, não naturais ou alteradas. “Nucleotídeo” é uma unidade monomérica a partir da qual são construídos polímeros de DNA ou RNA e consiste de uma base de purina ou pirimidina, pentose e um grupo ácido fosfórico. Nucleotídeos (normalmente

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47/93 encontrados na sua forma de 5’-monofosfato) são designados pela sua denominação de letra única conforme segue: “A” para adenilato ou desoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), “C” para citidilato ou desoxicitidilato, “G” para guanilato ou desoxiguanilato, “U” para uridilato, “T” para desoxitimidilato, “R” para purinas (A ou G), Ύ” para pirimidinas, (C ou T), “K” para G ou T, “H” para A, C ou T, “I” para inosina e “N” para qualquer nucleotídeo.

[0294] As expressões “fenótipo”, “característica fenotípica” ou “característica” designam uma ou mais características de um organismo. O fenótipo pode ser observável a olho nu ou por qualquer outro meio de avaliação conhecido na técnica, tal como microscopia, análise bioquímica ou teste eletromecânico. Em alguns casos, um fenótipo é controlado diretamente por um único gene ou locus genético, ou seja, uma “característica de gene isolado”. Em outros casos, um fenótipo é o resultado de diversos genes.

[0295] Um marcador com a designação “PHM” seguido por um número (tal como PHM6929) representa dois conjuntos de primers (externo e interno que, quando utilizados em um PCR abrigado, amplificam um pedaço específico de DNA. O conjunto externo é utilizado na primeira rodada de PCR, após o quê as sequências internas são utilizadas para uma segunda rodada de PCR sobre os produtos da primeira rodada. Isso aumenta a especificidade da reação. A temperatura de combinação para os marcadores de PHM (que consistem de dois conjuntos de primers) é de 55 °C. SNPs são identificados e recebem a designação “PHM” seguida pelo número do marcador. Marcadores de alto rendimento podem ser desenvolvidos para polimorfismos de SNP úteis empregando qualquer plataforma de alto rendimento, incluindo, mas sem limitações, a plataforma Invader® (Third Wave Technologies), Invader Plus® ou tecnologias de sequenciamento lllumina. Marcadores de SNP de alto rendimento descritos no presente recebem a designação PHM seguida por: número do marcador de PHM,

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48/93 travessão, número de identificação de SNP, outro travessão e, em seguida, uma letra que indica a tecnologia utilizada.

[0296] “Mapa físico” do genoma é um mapa que exibe a ordem linear de marcas identificáveis (incluindo genes, marcadores etc.) sobre DNA de cromossomo. Ao contrário de mapas genéticos, entretanto, as distâncias entre as marcas são absolutas (medidas, por exemplo, em pares de base ou fragmentos genéticos contíguos isolados e sobrepostos) e não se baseiam em recombinação genética.

[0297] “Planta” pode ser uma planta inteira, qualquer de suas partes ou um cultivo de tecido ou célula derivado de uma planta. Desta forma, o termo “planta” pode designar qualquer um dentre: plantas inteiras, componentes ou órgãos da planta (tais como folhas, hastes, raízes etc.), tecidos vegetais, sementes, células de plantas e/ou sua prole. Uma célula vegetal é uma célula de uma planta, tomada de uma planta ou derivada através de cultivo de uma célula tomada de uma planta.

[0298] Um alelo correlaciona-se “positivamente” com uma característica quando é ligado a ela e quando a presença do alelo for um indicador de que a característica ou forma de característica desejada ocorrerá em uma planta que compreende o alelo.

[0299] “Polimorfismo” é uma variação no DNA que é comum demais para dever-se meramente a uma nova mutação. Um polimorfismo deve possuir uma frequência de pelo menos 1% em uma população. Um polimorfismo pode ser um polimorfismo de nucleotídeo isolado, SNP ou um polimorfismo de inserção ou exclusão, também denominado no presente “indel”.

[0300] O “valor de probabilidade” ou “valor p” é a probabilidade estatística de que a combinação específica de um fenótipo e a presença ou ausência de um alelo marcador específico é aleatória. Desta forma, quanto mais

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49/93 baixa a avaliação de probabilidade, maior a probabilidade de que um fenótipo e um marcador específico se cossegreguem. Em alguns aspectos, a avaliação de probabilidade é considerada “significativa” ou “não significativa”. Em algumas realizações, uma avaliação de probabilidade de 0,05 (p = 0,05 ou probabilidade de 5%) de atribuição aleatória é considerada indicação significativa de cossegregação. Uma probabilidade aceitável pode ser, entretanto, qualquer probabilidade de menos de 50% (p = 0,5). Uma probabilidade significativa pode ser, por exemplo, menos de 0,25, menos de 0,20, menos de 0,15, menos de 0,1, menos de 0,05, menos de 0,01 ou menos de 0,001.

[0301] O termo “prole” designa a ninhada gerada de um cruzamento.

[0302] “Planta de prole” é gerada de um cruzamento entre duas plantas.

[0303] A expressão “locus de característica quantitativa” ou “QTL” designa um locus genético polimórfico com pelo menos um alelo que se correlaciona com a expressão diferencial de uma característica fenotípica em pelo menos um antecedente genético, tal como em pelo menos uma prole ou população de cultivo. QTL pode agir por meio de um único mecanismo genético ou de um mecanismo poligênico.

[0304] Os QTLs sobre o cromossomo 1 e o cromossomo 6 são indicados no presente “QTL1” e “QTL6”, respectivamente.

[0305] “Sequência de referência” é uma sequência definida utilizada como base de comparação de sequências. A sequência de referência é obtida por meio de genotipificação de uma série de linhagens no locus, alinhamento das sequências de nucleotídeos em um programa de alinhamento de sequências (tal como Sequencher) e, em seguida, obtenção da sequência de consenso do alinhamento. Um exemplo de sequência de referência é a sequência de referência PHM6929. O

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50/93 marcador PHM6929 foi genotipificado em uma série de linhagens e as sequências foram alinhadas para a obtenção da sequência de consenso do alinhamento, denominada no presente “sequência de referência”.

[0306] Em ligação de fases de “repulsa”, o alelo “favorável” no locus de interesse é ligado fisicamente a um alelo “desfavorável” no locus marcador próximo e os dois alelos “favoráveis” não são herdados juntos (ou seja, os dois loci encontram-se “fora de fase” entre si).

[0307] Um “teste de cruzamento superior” é um teste de prole derivado por meio do cruzamento de cada pai com a mesma linhagem em teste, normalmente uma linhagem homozigótica. O pai sendo testado pode ser uma variedade polinizada aberta, um cruzamento ou uma linhagem congênita.

[0308] A expressão “sob condições estringentes” designa condições sob as quais uma sonda ou polinucleotídeo hibridizar-se-á em uma sequência de ácido nucleico específica, tipicamente em uma mistura complexa de ácidos nucleicos, mas essencialmente nenhuma outra sequência. Condições estringentes são dependentes de sequências e serão diferentes em diferentes circunstâncias.

[0309] Sequências mais longas hibridizam-se especificamente sob temperaturas mais altas. Geralmente, são selecionadas condições estringentes como sendo cerca de 5 a 10 °C mais baixas que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica em um pH com resistência iônica definida. A Tm é a temperatura (sob resistência iônica, pH e concentração de ácido nucleico definidos) à qual 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam-se na sequência alvo em equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, à Tm, 50% das sondas são ocupadas em equilíbrio). Condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é de menos de cerca de 1,0

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M de íons de sódio, tipicamente concentração de íons de sódio (ou outros sais) de cerca de 0,01 a 1,0 M sob pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é de pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (tais como de dez a cinquenta nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sondas longas (tais como mais de cinquenta nucleotídeos). As condições estringentes podem também ser atingidas com a adição de agentes desestabilizantes tais como formamida. Para hibridização específica ou seletiva, um sinal positivo é de pelo menos duas vezes, preferencialmente dez vezes a hibridização antecedente. Exemplos de condições de hibridização estringente são frequentemente: 50% de formamida, 5x SSC e 1% SDS, incubação a 42 °C ou 5x SSC, 1% SDS, incubação a 65 °C, com lavagem em 0,2x SSC e 0,1% SDS a 65 °C. Para PCR, temperatura de cerca de 36 °C é típica para amplificação de baixa estringência, embora as temperaturas de combinação possam variar de cerca de 32 °C a 48 °C, dependendo do comprimento de primer. Orientações adicionais de determinação de parâmetros de hibridização são fornecidas em numerosas referências.

[0310] “Alelo desfavorável” de um marcador é um alelo marcador que segrega com o fenótipo vegetal desfavorável, de forma a fornecer o benefício de identificação de plantas que podem ser removidas de um programa de cultivo ou plantio.

[0311] O termo “rendimento” designa a produtividade por unidade de área de um produto vegetal específico de valor comercial. O rendimento de milho é comumente medido, por exemplo, em bushels de sementes por acre ou toneladas de sementes por hectare por estação. O rendimento é afetado por fatores genéticos e ambientais. “Agronômicos”, “características agronômicas” e “desempenho agronômico” designam as características (e elementos genéticos subjacentes) de uma dada variedade de planta que contribuem com o rendimento ao longo da estação

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52/93 de cultivo. Características agronômicas individuais incluem vigor de emergência, vigor vegetativo, tolerância à tensão, tolerância ou resistência a doenças, resistência a herbicidas, formação de ramos, floração, estabelecimento de sementes, tamanho de sementes, densidade de sementes, capacidade de manter-se em pé, capacidade de debulhamento e similares. O rendimento é, portanto, o ápice de todas as características agronômicas.

[0312] Cálculos de percentual de identidade e alinhamentos de sequências podem ser determinados utilizando uma série de métodos de comparação projetados para detectar sequências homólogas incluindo, mas sem limitações, o programa MEGALIGN® da suíte de computação bioinformática LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison Wl). A menos que indicado em contrário, alinhamento múltiplo das sequências fornecidas no presente foi realizado utilizando o método de alinhamento Clustal V (Higgins e Sharp, CABIOS. 5: 151-153 (1989)) com os parâmetros padrão (PENALIDADE DO INTERVALO = 10, PENALIDADE DO COMPRIMENTO DE INTERVALO = 10). Os parâmetros padrão de alinhamentos em pares e cálculo do percentual de identidade de sequências de proteínas utilizando o método Clustal V são ALINHAMENTO EM DIAGONAIS = 1, PENALIDADE DO INTERVALO = 3, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 5 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 5. Para ácidos nucléicos, estes parâmetros são ALINHAMENTO EM DIAGONAIS = 2, PENALIDADE DO INTERVALO = 5, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 4 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 4. Após alinhamento das sequências, utilizando o programa Clustal V, é possível obter valores de “percentual de identidade” e “divergência” observando-se a tabela de “distâncias de sequência” sobre o mesmo programa; a menos que indicado em contrário, os percentuais de identidade e divergências

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53/93 fornecidos e reivindicados no presente foram calculados desta forma.

[0313] Os métodos de clonagem molecular e DNA recombinante padrão utilizados no presente são bem conhecidos na técnica e descritos mais completamente em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual', Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (a seguir, “Sambrook”).

[0314] Antes de descrever a presente invenção em detalhes, dever-se-á compreender que a presente invenção não se limita a realizações específicas. Também se deverá compreender que a terminologia utilizada no presente destina-se ao propósito de descrever realizações específicas e não se destina a ser limitadora. Da forma utilizada no presente e nas reivindicações anexas, termos no singular e as formas no singular “um”, “uma” e “o/a”, por exemplo, incluem referências ao plural ao menos que o conteúdo indique claramente o contrário. Desta forma, por exemplo, referência a “planta”, “a planta” ou “uma planta” também inclui uma série de plantas. Dependendo do contexto, o uso do termo “planta” pode também incluir prole geneticamente similar ou idêntica daquela planta. O uso da expressão “um ácido nucléico” inclui opcionalmente muitas cópias daquela molécula de ácido nucléico.

[0315] Voltando agora às realizações:

Resistência ao fungo da espiga Fusarium [0316] Fungo de espiga Fusarium (também denominado ferrugem de espiga Fusarium) é uma doença devastadora de milho causada por espécies do complexo de Gibberella fujikuroi, nomeadamente F. verticillioides, F. proliferatum e/ou F. subglutinans. A identificação de marcadores moleculares e alelos de marcadores moleculares que são associados à resistência ao fungo da espiga Fusarium permite a seleção de resistência com base unicamente na composição genética da prole.

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Métodos de identificação e seleção de plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium por meio da avaliação da composição genética (conforme determinado utilizando marcadores moleculares e seus alelos) são apresentados no presente.

Mapeamento genético [0317] Reconheceu-se por algum tempo que os loci genéticos específicos correlacionados com fenótipos específicos, tais como resistência a fungos da espiga Fusarium, podem ser mapeados no genoma de um organismo. O cultivador de planas pode utilizar convenientemente marcadores moleculares para identificar indivíduos desejados por meio da detecção de alelos marcadores que exibem uma probabilidade estatisticamente significativa de cossegregação com um fenótipo desejado, manifestado como desequilíbrio de ligação. Identificando um marcador molecular ou conjuntos de marcadores moleculares que se cossegregam com uma característica de interesse, o cultivador é capaz de selecionar rapidamente um fenótipo desejado por meio da seleção do alelo marcador molecular apropriado (um processo denominado seleção assistida por marcador, ou MAS).

[0318] São disponíveis diversos métodos bem conhecidos na técnica de detecção de marcadores moleculares ou conjuntos de marcadores moleculares que se cossegregam com uma característica de interesse, tal como resistência ao fungo de espiga Fusarium. A ideia básica subjacente a esses métodos é a detecção de marcadores, para os quais genótipos alternativos (ou alelos) possuem fenótipos médios significativamente diferentes. Desta forma, realiza-se uma comparação entre loci marcadores da magnitude de diferença entre genótipos alternativos (ou alelos) ou o nível de significado daquela diferença. Deduzse que os genes de características localizam-se mais próximos do(s)

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55/93 marcador(es) que possui(em) a maior diferença genotípica associada.

[0319] Dois desses métodos utilizados para detectar loci de características de interesse são: 1) análise de associação com base na população e 2) análise de ligação tradicional. Em uma análise de associação com base na população, são obtidas linhagens de populações pré-existentes com diversos fundadores, tais como linhagens de cultivo de elite. Análises de associação com base na população dependem da queda do desequilíbrio de ligação (LD) e da idéia de que, uma população desestruturada, apenas correlações entre genes que controlam uma característica de interesse e marcadores ligados de perto a esses genes permanecerão após muitas gerações de acasalamento aleatório. Na verdade, a maior parte das populações pré-existentes possui subsestrutura populacional. Desta forma, o uso de uma abordagem de associação estruturada ajuda a controlar a estrutura da população alocando indivíduos a populações utilizando dados obtidos de marcadores distribuídos aleatoriamente ao longo do genoma, de forma a minimizar o desequilíbrio devido à estrutura populacional nas populações individuais (também denominadas subpopulações). Os valores fenotípicos são comparados com os genótipos (alelos) em cada locus marcador para cada linhagem na subpopulação. Uma associação de característica e marcador significativa indica a boa proximidade entre o locus marcador e um ou mais loci genéticos que estão envolvidos na expressão daquela característica.

[0320] Os mesmos princípios subjacentes à análise de ligação tradicional; LD, entretanto, é gerado por meio da criação de uma população de um pequeno número de fundadores. Os fundadores são selecionados para maximizar o nível de polimorfismo dentro da população construída e locais polimórficos são determinados pelo seu nível de cossegregação com um dado fenótipo. Diversos métodos estatísticos vêm

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56/93 sendo utilizados para identificar associações de marcador e característica significativas. Um desses métodos é uma abordagem de mapeamento de intervalos (Lander e Botstein, Genetics 121: 185-199 (1989), em que cada uma das muitas posições ao longo de um mapa genético (digamos em intervalos de 1 cM) é testada para determinar a probabilidade de que um gene que controla uma característica de interesse está localizado naquela posição. Os dados de genótipo e fenótipo são utilizados para calcular para cada posição de teste uma avaliação LOD (logaritmo da razão de probabilidade). Quando a avaliação LOD exceder um valor limite, existe evidência significativa do local de um gene que controla a característica de interesse naquela posição sobre o mapa genético (que se enquadrará entre dois loci marcadores específicos).

[0321] A presente invenção fornece loci marcadores de milho que demonstram cossegregação estatisticamente significativa com resistência ao fungo da espiga Fusarium, conforme determinado por meio de análise de ligação tradicional. A detecção desses loci ou loci ligados adicionais pode ser utilizada em programas de cultivo de milho assistido por marcador para produzir plantas com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium.

Composições marcadoras [0322] Os marcadores associados à resistência ao fungo da espiga Fusarium são identificados no presente. Os métodos envolvem a detecção da presença de um ou mais alelos marcadores associados à resistência aprimorada no germoplasma de uma planta de milho. A planta de milho pode ser um híbrido ou congênito.

[0323] Para o QTL identificado sobre o cromossomo 1, o locus marcador pode ser selecionado a partir de qualquer um dos loci marcadores fornecidos nas Figs. 1A a 1C, Tabela 2A ou Tabela 3, incluindo

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57/93 os marcadores PHM e SSR PHM6929, bnlg1007, PHM8711, bnlg1083, PHM8211, PHM14506, PHM1754, PHM3951, PHM1934, PHM10054, PHM10721 e PHM15661; e os marcadores SNP PHM8211-16-1, PHM871114-U, PHM14506-7-U, PHM1934-37-U, PHM8711-17-U, PHM1754-20-U, PHM3951-25-U, PHM6929-3-U, PHM10054-14-U, PHM10721-9-U,

PHM10721-16-U e PHM15661-21-U; bem como qualquer outro marcador ligado a esses marcadores (os marcadores ligados podem ser determinados a partir do recurso MaizeGDB).

[0324] Para o QTL identificado sobre o cromossomo 8, o locus marcador pode ser selecionado a partir de qualquer um dos loci marcadores fornecidos nas Figs. 2A e 2B ou Tabela 2B, incluindo os marcadores PHM e SSR PHM4423, bnlg1732, PHM9362, PHI445613, PHM1147, PHM11850, PHM9301, umc1762, PHM5280, PHM13773 e PHM16422; e os marcadores SNP PHM9362-8-U, PHM1147-16-U, PHM11850-3-U, PHM11850-6-U, PHM13773-6-U, PHM13773-11-U,

PHM16422-11-U, PHM1147-19-U, PHM5280-41-U, PHM9301-37-U e

PHM4423-4-U; bem como qualquer outro marcador ligado a esses marcadores (os marcadores ligados podem ser determinados a partir do recurso MaizeGDB).

Locais de mapas físicos de QTLs [0325] Os elementos genéticos ou genes localizados em uma extensão linear de DNA genômico sobre um cromossomo isolado são fisicamente ligados.

[0326] Na análise de mapeamento de ligações, descobriu-se que PHM8211 e PHM1934 delineiam um locus de resistência a fungos da espiga Fusarium sobre o cromossomo 1. PHM6929-3 também se cossegrega, entretanto, com a resistência aprimorada em uma série de linhagens e PHM6929-3 repousa fora do intervalo PHM8211-PHM1934. Desta forma, o intervalo QTL do

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58/93 cromossomo 1 pode ser expandido para incluir qualquer marcador que repouse entre o intervalo que compreende e é ladeado por PHM6929 e PHM1934 (Figs. 1A a 1C). Qualquer polinucleotídeo que se reúna no DNA contíguo entre SEQ ID N° 41 (a sequência de referência para PHM6929) ou uma sequência de nucleotídeos que seja 95% idêntica a SEQ ID N° 41 com base no método de alinhamento Clustal V e SEQ ID N° 47 (a sequência de referência para PHM1934) ou uma sequência de nucleotídeos que é 95% idêntica a SEQ ID N° 47 com base no método de alinhamento Clustal V, inclusive, pode abrigar loci marcadores que são associados à característica de resistência ao fungo da espiga Fusaríum. As Figs. 1A a 1C exibem a disposição de mapa físico dos BACs sequenciados que compõem o estiramento contíguo de DNA entre PHM6929 e PHM1934, inclusive. As lacunas (representadas por linhas pontilhadas) não são lacunas no estiramento contíguo de DNA intrinsecamente, mas sim áreas onde BACs que não tenham sido sequenciados reúnem-se no mapa físico.

[0327] Na análise de mapeamento de ligações, concluiu-se que bnlg1732 e umc1762 delineiam um locus de resistência ao fungo da espiga Fusaríum sobre o cromossomo 6. PHM4423-4 e PHM13773-6 também se cossegregam, entretanto, com a resistência aprimorada em uma série de linhagens e PHM4423-4 e PHM 13773-6 repousam fora do intervalo bnlg1732-umc1762. Além disso, PHM16422 e PHM13773 possuem ligação próxima. Desta forma, o intervalo QTL do cromossomo 6 pode ser expandido para incluir qualquer marcador que repouse no intervalo que compreende e é ladeado por PHM4423 e PHM16422. Qualquer polinucleotídeo que se reúne no DNA contíguo entre SEQ ID N° 48 (a sequência de referência para PHM4423) ou uma sequência de nucleotídeos que é 95% idêntica a SEQ ID N° 48 com base no método de alinhamento Clustal V e SEQ ID N° 55 (a sequência de referência para PHM 16422) ou uma sequência de nucleotídeos que é 95% idêntica a SEQ

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ID N° 55 com base no método de alinhamento Clustal V, inclusive, pode abrigar loci marcadores que são associados à característica de resistência ao fungo da espiga Fusaríum. As Figs. 2A e 2B exibem a disposição de mapa físico dos BACs sequenciados que compõem o estiramento contíguo de DNA entre PHM4423 e PHM 16422, inclusive. As lacunas (representadas por linhas pontilhadas) não são lacunas no estiramento contíguo de DNA intrinsecamente, mas são áreas em que os BACs que não foram sequenciados são montados no mapa físico.

Relações de ligação [0328] Uma medida comum de ligação é a frequência com a qual as características se cossegregam. Isso pode ser expresso como percentual de cossegregação (frequência de recombinação) ou em centiMorgans (cM). O cM é uma unidade de medida de frequência de recombinação genética. Um cM é igual a 1% de possibilidade de que uma característica em um locus genético será separado de uma característica em um outro locus devido ao cruzamento em uma única geração (o que significa que as características segregam-se juntas em 99% do tempo). Como a distância cromossômica é aproximadamente proporcional à frequência de cruzamento ao longo de eventos entre as características, existe uma distância física aproximada que se correlaciona com a frequência de recombinação.

[0329] Os loci marcadores são, por si próprios, características e podem ser determinados de acordo com análise de ligação padrão por meio de rastreamento dos loci marcadores durante a segregação. Desta forma, 1 cM é igual a 1% de possibilidade de que um locus marcador seja separado de outro locus, devido ao cruzamento em uma única geração.

[0330] Quanto mais próximo um marcador estiver de um

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60/93 gene que controla uma característica de interesse, mais eficaz e vantajoso é aquele marcador como indicador da característica desejada. Loci ligados de perto exibem uma frequência de cruzamento inter-/ocus de cerca de 10% ou menos, preferencialmente cerca de 9% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 8% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 7% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 6% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 5% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 4% ou menos, de preferência ainda maior cerca de 3% ou menos e, de preferência ainda maior, cerca de 2% ou menos. Em realizações altamente preferidas, os loci relevantes (tais como um locus marcador e um locus alvo) exibem uma frequência de recombinação de cerca de 1% ou menos, tal como cerca de 0,75% ou menos, de maior preferência cerca de 0,5% ou menos ou, de preferência ainda maior, cerca de 0,25% ou menos. Desta forma, os loci encontram-se a cerca de 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,75 cM, 0,5 cM, 0,25 cM ou menos de distância. Em outras palavras, afirma-se que dois loci que estejam localizados no mesmo cromossomo e em uma distância tal que a recombinação entre os dois loci ocorra em uma frequência de menos de 10% (tal como cerca de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25% ou menos) são “próximos” entre si.

[0331] Embora alelos marcadores específicos possam exibir cossegregação com o fenótipo de resistência ao fungo da espiga Fusarium, é importante observar que o locus marcador não é necessariamente responsável pela expressão do fenótipo de resistência ao fungo da espiga Fusarium. Não é necessário, por exemplo, que a sequência de polinucleotídeo marcador seja parte de um gene que fornece resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium (que, por exemplo, seja parte do quadro de leitura aberta do gene). A associação entre um alelo marcador específico e o fenótipo de resistência aprimorada ao fungo da

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61/93 espiga Fusaríum deve-se à fase de ligação de “acoplamento” original entre o alelo marcador e o alelo na linhagem de milho ancestral da qual se originou o alelo. Eventualmente, com recombinação repetida, eventos de cruzamento entre o locus marcador e genético podem mudar essa orientação. Por esta razão, o alelo marcador favorável pode mudar, dependendo da fase de ligação que existe no pai resistente utilizado para criar populações de segregação. Isso não altera o fato de que o marcador pode ser utilizado para monitorar a segregação do fenótipo. Ele somente altera qual alelo marcador é considerado favorável em uma dada população em segregação.

[0332] Para QTL sobre o cromossomo 1, os marcadores relacionados nas Figs. 1A a 1C, Tabela 2A ou Tabela 3 podem ser utilizados para prever o estado da característica de resistência ao fungo da espiga Fusaríum em uma planta de milho. Isso inclui qualquer marcador em até 50 cM dos marcadores PHM e SSR PHM6929, bnlg1007, PHM8711, bnlg1083, PHM8211, PHM14506, PHM1754, PHM3951, PHM1934,

PHM10054, PHM10721 e PHM15661; bem como os marcadores SNP PHM8211-16-1, PHM8711-14-U, PHM14506-7-U, PHM1934-37-U,

PHM8711-17-U, PHM1754-20-U, PHM3951-25-U, PHM6929-3-U,

PHM10054-14-U, PHM10721-9-U, PHM10721-16-U e PHM15661-21-U.

[0333] Para o QTL sobre o cromossomo 6, os marcadores relacionados nas Figs. 2A e 2B ou na Tabela 2B podem ser utilizados para prever o estado da característica de resistência ao fungo da espiga Fusaríum em uma planta de milho. Isso inclui qualquer marcador em até 50 cM do PHM e os marcadores SSR PHM4423, bnlg1732, PHM9362, PHI445613, PHM1147, PHM11850, PHM9301, umc1762, PHM5280, PHM13773 e PHM16422; e os marcadores SNP PHM9362-8-U, PHM114716-U, PHM11850-3-U, PHM11850-6-U, PHM13773-6-U, PHM13773-11-U, PHM16422-11-U, PHM1147-19-U, PHM5280-41-U, PHM9301-37-U e

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PHM4423-4-U.

Intervalos cromossõmicos [0334] São fornecidos intervalos cromossõmicos que se correlacionam com resistência a fungos da espiga Fusarium. Diversos métodos bem conhecidos na técnica são disponíveis para identificar intervalos cromossõmicos. As fronteiras desses intervalos cromossõmicos são desenhadas para englobar marcadores que serão ligados ao gene que controla a característica de interesse. Em outras palavras, o intervalo cromossômico é projetado de tal forma que qualquer marcador que repouse naquele intervalo (incluindo os marcadores terminais que definem as fronteiras do intervalo) possa ser utilizado como marcador da resistência ao fungo da espiga Fusarium. Cada intervalo compreende pelo menos um QTL e, além disso, pode compreender mais de um QTL. Boa proximidade de diversos QTL no mesmo intervalo pode ofuscar a correlação de um marcador específico com um QTL específico, pois um marcador pode demonstrar ligação a mais de um QTL. Por outro lado, por exemplo, caso dois marcadores em boa proximidade exibam cossegregação com a característica fenotípica desejada, às vezes é incerto se cada um desses marcadores identifica o mesmo QTL ou dois QTLs diferentes. Independentemente disso, o conhecimento de quantos QTLs encontram-se em um intervalo específico não é necessário para elaborar ou praticar a presente invenção.

[0335] Os intervalos descritos abaixo exibem um conjunto de marcadores que se cossegregam com a resistência ao fungo da espiga Fusarium. Essa formação de conjunto de marcadores ocorre em domínios relativamente pequenos sobre os cromossomos, o que indica a presença de um ou mais QTLs nessas regiões cromossômicas. O intervalo foi projetado para englobar marcadores que se cossegregam com a

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63/93 resistência ao fungo da espiga Fusarium. Os intervalos são definidos pelos marcadores sobre os seus terminais, em que o intervalo engloba marcadores que mapeiam no interior do intervalo bem como os marcadores que definem os terminais. Um intervalo descrito pelos marcadores terminais que definem os pontos finais do intervalo incluirá os marcadores terminais e qualquer marcador localizado dentro daquele domínio cromossômico, sejam esses marcadores atualmente conhecidos ou não.

[0336] Para o QTL no cromossomo 1, um intervalo pode ser definido pelos marcadores a) PHM6929 e PHM1934; ou b) PHM6929 e PHM14506, inclusive. Para o QTL sobre o cromossomo 6, pode ser definido um intervalo por PHM4423 e PHM16422, inclusive. Qualquer marcador localizado dentro desses intervalos encontra uso como marcador para resistência ao fungo da espiga Fusarium.

[0337] Intervalos cromossômicos podem também ser definidos por marcadores que são ligados a (exibem desequilíbrio de ligação com) um marcador QTL e r² é uma medida comum do desequilíbrio de ligação (LD) no contexto de estudos de associação. Caso o valor r² de LD entre um locus marcador de cromossomo 1 localizado no intervalo de PHM6929 a PHM1934, por exemplo, e um outro locus marcador de cromossomo 1 em boa proximidade seja maior que 1/3 (Ardlie et al, Nature Reviews Genetics 3: 299-309 (2002)), os loci encontram-se em desequilíbrio de ligação entre si.

Alelos marcadores e combinações haplotípicas [0338] Um marcador de acordo com a presente invenção pode também ser uma combinação de alelos em um ou mais loci marcadores. Os alelos descritos abaixo poderão ser utilizados isoladamente ou em combinação para identificar e selecionar plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium.

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64/93 [0339] Alelos de SNP favoráveis (ou seja, associados à resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium) no QTL sobre o

cromossomo 1 foram identificados no presente e incluem:	«p	em
PHM8211-16, “C” em PHM8711-14, “T” em PHM14506-7,	“C”	em
PHM1934-37, “C” em PHM8711-17, “C” em PHM1754-20,	«p	em
PHM3951-25, “C” em PHM6929-3, “A” em PHM 10054-14,	“A”	em
PHM10721-9, “A” em PHM10721-16 e “G” em PHM15661-21.

[0340] Alelos de SNP favoráveis (ou seja, associados à resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium) no QTL sobre o cromossomo 6 foram identificados no presente e incluem: “G” em PHM9362-8, “G” em PHM1147-16, “T” em PHM11850-3, “C” em PHM 11850-6, “A” em PHM 13773-6, “C” em PHM 13773-11, “A” em PHM16422-11, “T” em PHM1147-19, “G” em PHM5280-41, “T” em PHM9301-37 e “T” em PHM4423-4.

[0341] Embora um haplótipo associado à resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium possa compreender qualquer um dos alelos descritos acima, os haplótipos a seguir são ligados à resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium e podem ser utilizados em uma seleção assistida por marcador para selecionar plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium:

a.	“C”	em	PHM6929-3, “T”	em	PHM8211-16	e	«p	em
PHM14506-7;
b.	«p	em	PHM4423-4, “T”	em	PHM 11850-3	e	“A”	em
PHM13773-6;
c.	“A”	em PHM10054-14 e “A”	em PHM10721-9;
d.	“A”	em	PHM10054-14, “T	” em	PHM8211-16	e	“A”	em

PHM10721-9;

e. “G” em PHM9362-8 e “A” em PHM 13773-6.

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65/93 [0342] Os técnicos no assunto esperariam que pudesse haver locais polimórficos adicionais nos loci marcadores nos e em volta dos marcadores do cromossomo 1 e do cromossomo 6 identificados no presente, em que um ou mais locais polimórficos encontram-se em desequilíbrio de ligação (LD) com um alelo em um ou mais dos locais polimórficos no haplótipo. Afirma-se que dois alelos específicos em locais polimórficos diferentes encontram-se em LD caso a presença do alelo em um dos locais tenda a prever a presença do alelo no outro local sobre o mesmo cromossomo (Stevens, Mol. Diag. 4: 309-17 (1999)).

[0343] Os técnicos no assunto compreenderíam que a frequência alélica (e, portanto, a frequência de haplótipos) pode diferir de um conjunto de germoplasmas para outro. Os conjuntos de germoplasmas variam devido a diferenças de maturidade, agrupamentos heteróticos, distribuição geográfica etc. Como resultado, SNPs e outros polimorfismos podem não ser informativos em alguns conjuntos de germoplasmas.

Seleção assistida por marcadores [0344] Os marcadores moleculares podem ser utilizados em uma série de aplicações de cultivo de plantas (vide, por exemplo, Staub et al (1996), Hortscience 31: 729-741; Tanksley (1983), Plant Molecular Biology Repórter, 1: 3-8). Uma das principais áreas de interesse é o aumento da eficiência de retrocruzamento e introgressão de genes utilizando seleção assistida por marcadores (MAS). Um marcador molecular que demonstra a ligação com um locus que afeta uma característica fenotípica desejada fornece uma ferramenta útil de seleção da característica em uma população vegetal. Isso é particularmente verdadeiro quando o fenótipo for de difícil teste, tal como muitas características de resistência a doenças, ou quando ocorrer em um estágio posterior do desenvolvimento da planta, tais como características de

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66/93 sementes. Como os testes marcadores de DNA são muito menos trabalhosos e ocupam menos espaço físico que a fenotipificação de campo, podem ser testadas populações muito maiores, aumentando as possibilidades de encontrar um recombinante com o segmento alvo da linhagem doadora movido para a linhagem receptora. Quanto mais próxima a ligação, mais útil o marcador, pois a recombinação é menos propensa a ocorrer entre o marcador e o gene que causa a característica, o que pode resultar em falsos positivos. Ter marcadores laterais reduz as possibilidades de ocorrência de seleção de falsos positivos, pois seria necessário um evento de recombinação dupla. A situação ideal é ter um marcador no próprio gene, de tal forma que a recombinação não possa ocorrer entre o marcador e o gene. Esse marcador é denominado “marcador perfeito”.

[0345] Quando um gene sofrer introgressão por MAS, não é apenas o gene que é introduzido, mas também as regiões laterais (Gepts (2002), Crop Sei. 42: 1780-1790). Este é denominado “arrasto de ligação”. Caso a planta doadora seja altamente não relacionada com a planta receptora, essas regiões laterais conduzem genes adicionais que podem codificar características agronomicamente indesejáveis. Esse “arrasto de ligação” pode também resultar na redução do rendimento ou outras características agronômicas negativas mesmo após diversos ciclos de retrocruzamento na linhagem de milho de elite. Este também é denominado às vezes “arrasto de rendimento”. O tamanho da região lateral pode ser reduzido por retrocruzamento adicional, embora isso nem sempre seja bem sucedido, pois os cultivadores não têm controle sobre o tamanho da região ou os pontos de rompimento de recombinação (Young et al (1998), Genetics 120: 579-585). Em cultivo clássico, normalmente é apenas por acaso que são selecionadas recombinações que contribuem com a redução do tamanho do segmento doador (Tanksley et al (1989), Biotechnology 7: 257-264). Mesmo após

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67/93 vinte retrocruzamentos deste tipo, pode-se esperar encontrar um pedaço dimensionável do cromossomo doador ainda ligado ao gene sendo selecionado. Com marcadores, entretanto, é possível selecionar os raros indivíduos que experimentaram recombinação perto do gene de interesse. Em 150 plantas retrocruzadas, existe uma possibilidade de 95% que pelo menos uma planta terá experimentado um cruzamento em até 1 cM do gene, com base em uma distância de mapa de meiose isolada. Os marcadores permitirão a identificação inequívoca desses indivíduos. Com um retrocruzamento adicional de trezentas plantas, havería 95% de possibilidade de um cruzamento em uma única distância de mapa de meiose de até 1 cM do outro lado do gene, gerando um segmento em volta do gene alvo de menos de 2 cM com base em uma única distância de mapa de meiose. Isso pode ser realizado em duas gerações com marcadores, enquanto teriam sido necessárias em média cem gerações sem marcadores (vide Tanksley et al, acima). Quando a localização exata de um gene for conhecida, marcadores laterais em volta do gene podem ser utilizados para selecionar em busca de recombinações em diferentes tamanhos de população. Em tamanhos de população menores, por exemplo, pode-se esperar recombinações mais para longe do gene, de tal forma que seriam necessários marcadores laterais mais distantes para detectar a recombinação.

[0346] A disponibilidade de mapas de ligação integrados do genoma de milho contendo densidades crescentes de marcadores de milho públicos facilitou o mapeamento genético de milho e MAS. Vide, por exemplo, os mapas Vizinhos de IBM2, que são disponíveis online no website MaizeGDB.

[0347] Os principais componentes da implementação de MAS são: (i) definição da população na qual será determinada a associação entre marcador e característica, que pode ser uma população em segregação ou uma população aleatória ou estruturada; (ii) monitoramento da segregação ou associação de

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68/93 marcadores polimórficos com relação à característica e determinação da ligação ou associação utilizando métodos estatísticos; (iii) definição de um conjunto de marcadores desejáveis com base nos resultados da análise estatística; e (iv) uso e/ou extrapolação dessas informações para o conjunto atual de germoplasma de cultivo para permitir a tomada de decisões de seleção com base em marcadores. Os marcadores descritos no presente relatório descritivo, bem como outros tipos de marcadores tais como SSRs e FLPs, podem ser utilizados em protocolos de seleção assistida por marcadores.

[0348] SSRs podem ser definidos como conduções relativamente curtas de DNA repetido em conjunto com comprimentos de 6 bp ou menos (Tautz (1989), Nucleic Acid Research 17: 6463-6471; Wang et al (1994), Theoretical and Applied Genetics, 88: 1-6). Os polimorfismos surgem devido à variação do número de unidades de repetição, provavelmente causada por variações durante a reprodução de DNA (Levinson e Gutman (1987), Mol. Biol. Evol. 4: 203-221). A variação do comprimento de repetição pode ser detectada projetando-se primers de PCR para as regiões laterais não repetitivas conservadas (Weber e May (1989), Am. J. Hum. Genet. 44: 388-396). SSRs são altamente apropriados para mapeamento e MAS, pois eles são multialélicos, codominantes, reproduzíveis e propensos a automação de alto rendimento (Rafalski et al (1996), Generating and Using DNA Markers in Plants em Non-Mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press, págs. 75-135).

[0349] Podem ser gerados diversos tipos de marcadores de SSR e perfis de SSR de linhagens resistentes podem ser obtidos por meio de eletroforese de gel dos produtos de amplificação. A avaliação de genótipo marcador é baseada no tamanho do fragmento amplificado. Um serviço de SSR para milho é disponível ao público em base contratual pela DNA Landmarks de Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, Canadá.

[0350] Podem também ser gerados diversos tipos de

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69/93 marcadores de FLP. Mais comumente, são utilizados primers de amplificação para gerar polimorfismos de comprimento de fragmentos. Esses marcadores de FLP são em muitas formas similares a marcadores de SSR, exceto pelo fato de que a região amplificada pelos primers não seja tipicamente uma região altamente repetitiva. Ainda assim, a região amplificada, ou amplicon, terá variabilidade suficiente entre o germoplasma, frequentemente devido a inserções ou exclusões, de tal forma que os fragmentos gerados pelos primers de amplificação possam ser diferenciados entre indivíduos polimórficos e sabe-se que esses indels ocorrem frequentemente em milho (Bhattramakki et al (2002), Plant Mol. Biol. 48, 539-547; Rafalski (2002b), acima).

[0351] Os marcadores de SNP detectam substituições de nucleotídeos de pares de bases isolados. De todos os tipos de marcadores moleculares, SNPs são os mais abundantes e, portanto, possuem o potencial de fornecer a resolução de mapa genético mais alta (Bhattramakki et al, 2002, Plant Molecular Biology 48: 539-547). SNPs podem ser testados em um nível ainda mais alto de rendimento que SSRs, na chamada forma de “ultra-alto rendimento”, pois eles não necessitam de grandes quantidades de DNA e a automação do teste pode ser direta. SNPs também possuem a promessa de serem sistemas de custo relativamente baixo. Estes três fatores juntos tornam SNPs altamente atrativos para uso em MAS. Diversos métodos são disponíveis para genotipificação de SNP, incluindo, mas sem limitações, hibridização, extensão de primers, ligação de oligonucleotídeos, divisão de nuclease, minissequenciamento e esferas codificadas. Esses métodos foram analisados em Gut (2001), Hum. Mutat. 17, págs. 475-492; Shi (2001), Clin. Chem. 47, págs. 164-172; Kwok (2000), Pharmacogenomics 1, págs. 95100; Bhattramakki e Rafalski (2001), Discovery and Application of Single

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Nucleotide Polymorphism Markers in Plants em R. J. Henry, Ed., Plant Genotyping: The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, Wallingford. Uma ampla variedade de tecnologias disponíveis comercialmente utiliza estes e outros métodos para interrogar SNPs, incluindo Masscode® (Qiagen), Invader® (Third Wave Technologies) e Invader Plus®, SnapShot® (Applied Biosystems), Taqman® (Applied Biosystems) e Beadarrays® (lllumina).

[0352] Diversos SNPs em conjunto com uma sequência ou através de sequências ligadas podem ser utilizados para descrever um haplótipo para qualquer genótipo específico (Ching et al (2002), BMC Genet. 3: 19, Gupta et al, 2001, Rafalski (2002b), Plant Science 162: 329333). Os haplótipos podem ser mais informativos que SNPs isolados e podem ser mais descritivos de qualquer genótipo específico. Um SNP isolado, por exemplo pode ser alelo “T” para uma linhagem ou variedade específica com resistência ao fungo da espiga Fusarium, mas o alelo “T” poderá também ocorrer na população de cultivo de milho sendo utilizada para pais recorrentes. Neste caso, um haplótipo, tal como uma combinação de alelos em marcadores de SNP ligados, poderá ser mais informativo. Após a atribuição de um haplótipo exclusivo a uma região cromossômica doadora, aquele haplótipo pode ser utilizado naquela população ou qualquer de seus subconjuntos para determinar se um indivíduo possui um gene específico. Vide, por exemplo, WO 2003/054229. O uso de plataformas de detecção de marcador de alto rendimento automáticas conhecidas dos técnicos comuns no assunto possibilita que este processo seja altamente eficiente e eficaz.

[0353] Muitos dos marcadores de PHM podem ser facilmente utilizados como marcadores de FLP para selecionar os loci genéticos sobre os cromossomos 1 e 6, devido à presença de polimorfismos de inserção e

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71/93 exclusão. Primers para os marcadores PHM podem também ser utilizados para converter esses marcadores em SNP ou outros marcadores estrutural mente similares ou funcionalmente equivalentes (SSRs, CAPs, indels etc.) nas mesmas regiões. Uma abordagem muito produtiva de conversão de SNP é descrita por Rafalski (2002a), Current Opinion in Plant Biology 5 (2): 94-100 e também em Rafalski (2002b), Plant Science 162: 329-333. Utilizando PCR, os primers são utilizados para amplificar segmentos de DNA de indivíduos (preferencialmente congênitos) que representam a diversidade na população de interesse. Os produtos de PCR são sequenciados diretamente em uma ou nas duas direções. As sequências resultantes são alinhadas e os polimorfismos são identificados. Os polimorfismos não se limitam a polimorfismos de nucleotídeos isolados (SNPs), mas também incluem indels, CAPS, SSRs e VNTRs (número variável de repetições conjuntas). Especificamente com relação às informações de mapa fino descritas no presente, pode-se facilmente utilizar as informações fornecidas no presente para obter SNPs polimórficos adicionais (e outros marcadores) na região amplificada pelos primers relacionados no presente relatório descritivo. Marcadores dentro da região de mapa descrita podem ser hibridizados em BACs ou outras bibliotecas genômicas ou alinhados eletronicamente com sequências de genoma, para encontrar novas sequências no mesmo local aproximado dos marcadores descritos.

[0354] Além de SSRs, FLPs e SNPs, conforme descrito acima, outros tipos de marcadores moleculares também são amplamente utilizados, incluindo, mas sem limitações, marcas de sequência expressas (ESTs), marcadores de SSR derivados de sequências de EST, DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) e outros marcadores com base em ácido nucléico.

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72/93 [0355] Perfis de isozimas e características morfológicas relacionadas podem, em alguns casos, também ser indiretamente utilizadas como marcadores. Muito embora elas não detectem diretamente diferenças de DNA, elas são frequentemente influenciadas por diferenças genéticas específicas. Marcadores que detectam variação de DNA são, entretanto, muito mais numerosos e polimórficos que marcadores de isozima ou morfológicos (Tanksley (1983), Plant Molecular Biology Repórter 1: 3-8).

[0356] Alinhamentos de sequências ou contíguos podem também ser utilizados para encontrar sequências acima ou abaixo no fluxo dos marcadores específicos relacionados no presente. Essas novas sequências, próximas dos marcadores descritos no presente, são utilizadas em seguida para descobrir e desenvolver marcadores funcionalmente equivalentes. Diferentes mapas físicos e/ou genéticos são alinhados, por exemplo, para localizar marcadores equivalentes não descritos no presente relatório descritivo, mas que se encontram em regiões similares. Estes mapas podem encontrar-se dentro da espécie de milho ou mesmo em outras espécies que tenham sido genética ou fisicamente alinhadas com milho, tais como arroz, trigo, cevada ou sorgo.

[0357] Geralmente, MAS utiliza marcadores polimórficos que tenham sido identificados como possuindo probabilidade significativa de cossegregação com um fenótipo, tal como resistência ao fungo da espiga Fusarium. Presume-se que esses marcadores mapeiem perto de um ou mais genes que forneçam à plana o seu fenótipo de resistência ao fungo da espiga Fusarium e são considerados indicadores da característica desejada ou marcadores. As plantas são testadas para determinar a presença de um alelo desejado no marcador e se espera que plantas que contêm um genótipo desejado em um ou mais loci transfiram o genótipo

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73/93 desejado, junto com um fenótipo desejado, para a sua prole. O meio de identificar plantas de milho que possuem resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium identificando plantas que possuem um alelo associado à resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium em qualquer um dos loci marcadores do cromossomo 1 descritos no presente, incluindo os marcadores PHM e SSR PHM6929, bnlg1007, PHM8711, bnlg1083, PHM8211, PHM14506, PHM1754, PHM3951, PHM1934, PHM10054, PHM10721 e PHM15661; e os marcadores SNP PHM8211-16-1, PHM871114-U, PHM14506-7-U, PHM1934-37-U, PHM8711-17-U, PHM1754-20-U, PHM3951-25-U, PHM6929-3-U, PHM10054-14-U, PHM10721-9-U,

PHM 10721-16-U e PHM 15661-21-U e/ou em qualquer um dentre os loci marcadores de cromossomo 6 descritos no presente, incluindo os marcadores PHM e SSR PHM4423, bnlg1732, PHM9362, PHI445613, PHM1147, PHM11850, PHM9301, umc1762, PHM5280, PHM13773 e PHM16422; e os marcadores SNP PHM9362-8-U, PHM1147-16-U, PHM11850-3-U, PHM11850-6-U, PHM13773-6-U, PHM13773-11-U,

PHM16422-11-U, PHM1147-19-U, PHM5280-41-U, PHM9301-37-U e

PHM4423-4-U; são apresentados no presente.

[0358] Os intervalos apresentados no presente encontram uso em MAS para selecionar plantas que demonstram resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium. Qualquer marcador que mapeie no intervalo de cromossomo 1 definido por:

i. PHM6929 e PHM1934; ou ii. PHM6929 e PHM14506;

inclusive, pode ser utilizado com este propósito. De forma similar, qualquer marcador que mapeie no intervalo do cromossomo 6 definido por PHM4423 e PHM 16422, inclusive, pode ser utilizado com este propósito.

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74/93 [0359] Haplótipos podem também ser utilizados em MAS para introduzir resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium em linhagens ou variedades de milho susceptíveis. Um haplótipo pode

compreender pelo menos um dos alelos marcadores a seguir:	tíTJJ T em
PHM8211-16,	“C”	em	PHM8711-14, “T”	em	PHM14506-7,	“C”	em
PHM1934-37,	“C”	em	PHM8711-17, “C”	em	PHM1754-20,	«γ»	em
PHM3951-25,	“C”	em	PHM6929-3, “A”	em	PHM10054-14,	“A”	em
PHM10721-9,	“A”	em	PHM10721-16, “G”	em	PHM15661-21,	“G”	em
PHM9362-8,	“G”	em	PHM 1147-16, “T”	em	PHM11850-3,	“C”	em
PHM11850-6,	“A”	em	PHM 13773-6, “C”	em	PHM13773-11,	“A”	em
PHM 16422-11	ÍÍTJJ	em	PHM1147-19, “G	em	PHM5280-41,	«γ»	em
PHM9301-37	e “T”	em	PHM4423-4. Além	disso,	, os haplótipos	a seguir

podem ser utilizados em seleção assistida por marcador para selecionar plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium-,

a. “C”	em	PHM6929-3, “T”	em	PHM8211-16	e	«γ»	em
PHM14506-7;
b. “T”	em	PHM4423-4, “T”	em	PHM11850-3	e	“A”	em
PHM13773-6;
c. “A”	em PHM10054-14 e “A”	em	PHM10721-9;
d. “A”	em	PHM10054-14, “Τ’	’ em	PHM8211-16	e	“A”	em

PHM10721-9;

e. “A” em PHM9362-8 e “A” em PHM13773-6.

Exemplos [0360] Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar, mas sem limitações, a presente invenção. Compreende-se que os exemplos e realizações descritos no presente destinam-se apenas a fins ilustrativos e os técnicos no assunto reconhecerão diversos reagentes ou parâmetros que podem ser alterados sem abandonar o espírito da presente

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75/93 invenção ou o escopo das reivindicações anexas.

Exemplo 1 Mapeamento de QTLs de grande efeito para resistência ao fungo da espiga Fusarium

População de mapeamento [0361] Uma população de mapeamento que consiste de 360 linhagens congênitas recombinantes F7:6 (RILs) foi derivada de um cruzamento entre PHG61, uma linhagem com alta resistência no grupo de haste não rígida, e 1047, um congênito de haste rígida susceptível (a Fig. 3 exibe uma comparação entre espigas da linhagem resistente PHG61 e espigas da linhagem susceptível 1047). O isolamento sequencial das famílias foi realizado em ambientes não seletivos. Normalmente, as cinco primeiras plantas em cada fileira foram isoladas e as espigas das duas plantas mais próximas do centro da fileira foram colhidas. Naturalmente, algumas linhagens que produziram espigas estéreis foram perdidas.

Genotipificação [0362] DNA foi extraído de amostras de folhas liofilizadas de mudas F7:6 e dados genotípicos foram recolhidos em cada um dos 533 marcadores de AFLP, cobrindo um total de 1380,6 cM, com distância média entre os marcadores de 2,6 cM.

Fenotipificação [0363] As linhagens na população de RIL foram avaliadas para determinar fungo da espiga visual sob condições de infecção natural em dois locais de teste nos Estados Unidos, Winterville (WT), Condado de Pitt, Carolina do Norte e Walnut Grove (CA), Condado de San Joaquin, Califórnia, em 1998 e 1999. Crescimento fúngico e listras brancas sobre o pericarpo, correndo paralelamente ao eixo longo da semente, foram considerados sinais e sintomas de fungo da espiga. Pilhas de espigas

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76/93 foram avaliadas para determinar fungo da espiga visual de acordo com a escala de 1 a 9 exibida na Fig. 4.

Mapeamento de QTL [0364] Realizou-se análise de QTL sobre dados não transformados utilizando o pacote de software PLABQTL (Utz e Melchinger (1996), J. Quant. Trait Loci 2 (1)), versão 1.1, publicado em 1999. Mapeamento de intervalos compostos (comando cov SEL) foi utilizado para detectar supostos QTLs. Um QTL foi declarado real se houver sido detectado nos dois lugares e se fosse significativo em pelo menos um local. Análise de QTL identificou os principais QTLs para resistência a fungo da espiga Fusarium sobre os cromossomos 1, 5, 6, 7 e 8. O QTL sobre o cromossomo 1 é denominado no presente QTL1 e repousa entre os marcadores de AFLP I77 e T292. O QTL sobre o cromossomo 6 é denominado no presente QTL6 e repousa entre os marcadores AFLP D166 e C116. SEQ ID N° 1 a 8 são as sequências de primers para os marcadores de AFLP que delineiam QTL1 e QTL6.

Exemplo 2

Validação e mapeamento fino de QTL1 e QTL6 [0365] A fim de testar o efeito e a utilidade dos QTLs identificados, linhagens quase isogênicas (NILs) foram desenvolvidas em três antecedentes genéticos susceptíveis: 1047 (descrito acima), PH24E e PH1BC. PHG61 possui avaliação do fungo da espiga Fusarium histórico de 8 a 9 (com base na escala de 1 a 9); enquanto 1047, PH24E e PH1BC possuem avaliações históricas de 3 a 4, 4,0 e 5,0.

[0366] RILs do Exemplo 1 que conduziram QTL1 ou QTL6 foram retrocruzados para o pai susceptível original 1047 por duas vezes, seguido por isolamento sequencial por três gerações, de forma a criar linhagens BC3S3.

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77/93 [0367] NILs foram também gerados por meio de cruzamento do pai resistente PHG61 para dois outros congênitos susceptíveis (PH24E e PH1BC). Para cada cruzamento, indivíduos da população F1 foram retrocruzados no pai recorrente correspondente para gerar uma população de BC2 e isolamento sequencial das famílias BC2 foi realizado em seguida por três gerações.

[0368] Utilizou-se seleção assistida por marcadores (MAS) no desenvolvimento dos NILs para selecionar a região QTL correspondente em cada geração. Foi utilizado um conjunto de 76 SSRs para MAS. Quatro dos SSRs foram utilizados para selecionar QTL1 ou QTL6 (derivado de PHG61), enquanto os 72 restantes foram utilizados para seleção contra PHG61. Especificamente, bnlg1953 foi utilizado para seleção de QTL1, enquanto LGI112958, PHI445613 e PHI364545 foram utilizados para seleção de QTL6. As posições desses marcadores sobre o último mapa de IBM2, em conjunto com as suas sequências de primers correspondentes, são encontradas na Tabela 1.

TabelaI

SSRs Utilizados para Seleção de Regiões QTL1 e QTL6 de PHG61

Marcador	Cromossomo	IBM2 2008	Primers
bnlg1953	1	170	SEQ ID N°9e 10
LG1112958	6	n/a	SEQ IDN°11 e 12
PHI445613	6	375,8	SEQ ID N°13e14
PHI364545	6	428,4	SEQ ID N°15e16

[0369] Foram identificados em seguida recombinantes

BC3S3 (para os NILs desenvolvidos em antecedentes 1047) e BC2S3 (para os NILs desenvolvidos em antecedentes PH24E e PH1BC) homozigóticos. Os recombinantes homozigóticos foram avaliados para

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78/93 determinar fungo da espiga visual sob condições de infecção natural em quatro locais de teste nos Estados Unidos: Camden, Condado de Camden, Carolina do Norte; Cairo, Condado de Grady, Geórgia; Woodland, Condado de San Joaquin, Califórnia; e Waimea, Kauai, Havaí, utilizando a escala da Fig. 4. Em comparação com os pais recorrentes 1047, PH24E e PH1BC, NILs que contêm QTL1 aumentaram as avaliações de fungo da espiga Fusarium em um a dois pontos (em escala de 1 a 9; Fig. 4), enquanto NILs contendo QTL6 aumentaram as avaliações de fungo da espiga Fusarium em dois a quatro pontos.

[0370] Foi utilizado um mapa genético e físico integrado de milho para identificar todos os contíguos de BAC localizados nas regiões QTL1 e QTL6. Sequências terminais de BAC com baixo número de cópias e marcadores PHM desses contíguos foram utilizadas para desenvolver marcadores de CAPS e/ou marcadores SNP para uso com a tecnologia Invader® ou Invader Plus®. Os recombinantes homozigóticos foram determinados em uma série de posições marcadoras nas duas regiões. Para QTL1, os dados de recombinação colocaram QTL1 na região definida pelos marcadores PHM8211 (SEQ ID N° 33 a 36) e PHM1934 (SEQ ID N° 37 a 40), inclusive, enquanto QTL6 foi colocado na região do cromossomo 6 definida pelos marcadores bnlg1732 (SEQ ID N° 17 e 18) e umc1762 (SEQ ID N° 19 e 20), inclusive.

Exemplo 3

Conversões de congênitos de elite:

[0371] Apesar de abrigar alelos de resistência para fungo da espiga Fusarium, PHG61 apresenta mau desempenho agronômico. Como resultado, diversos congênitos de elite foram “convertidos” como possuindo resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium por meio da introgressão de QTL1 e/ou QTL6 de PHG61. As conversões poderão ser utilizadas em seguida por

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79/93 cultivadores para mover o(s) QTL(s) de PHG61 para o seu germoplasma de cultivo. Foram realizadas conversões dos congênitos de elite PHCA5, PH51H, PH70R, PH87H, PHFCJ, PH890 e PHB1V por meio do cruzamento de PHG61 (o pai doador) em cada congênito correspondente (os pais recorrentes). A prole foi retrocruzada em seguida no pai recorrente por cinco vezes e isolada em seguida por três gerações. Em cada população de BC, foram utilizados marcadores SSR para selecionar as regiões QTL. As seleções de QTL1 foram realizadas utilizando bnlg1007 (SEQ ID N° 21 e 22), bnlg1083 (SEQ ID N° 23 e 24) e PHI256546 (SEQ ID N° 25 e 26) e seleções de QTL6 foram realizadas utilizando bnlgl 174 (SEQ ID N° 27 e 28) e umc1805 (SEQ ID N° 29 e 30). Na população BC5 e nas populações BC5F2, entretanto, foram realizadas seleções de QTL6 utilizando umc1462 (SEQ ID N° 31 e 32) e PHI445613 (SEQ ID N° 13 e 14). Indivíduos BC5F3 foram selecionados em seguida utilizando marcadores SNP no lugar de SSRs. Para QTL1, os alelos selecionados foram: “T” em PHM8211-16, “C” em PHM8711-14, “T” em PHM14506-7 e “C” em PHM1934-37. Para QTL6, os alelos selecionados foram: “G” em PHM9362-8, “G” em PHM1147-16, “C” em PHM11850-6, “C” em PHM13773-11 e “A” em PHM16422-11. Vide as Figs. 5A e 5B (para QTL1) e as Figs. 6A e 6B (para QTL6) para as informações de marcador para cada um desses SNPs.

[0372] Sementes dos indivíduos BC5F3 selecionados e dos congênitos não convertidos correspondentes foram plantadas em pontos divididos com genótipos (QTL) abrigados em congênitos. Houve três réplicas em cada um dentre três locais (Cremona, Itália; Cairo GA e Woodland CA); os locais em Cairo GA e Cremona, Itália, entretanto, não apresentaram pressão de doença e não puderam ser avaliados. Em Woodland CA, a pressão de doença foi boa ao longo dos campos, mas diversos congênitos foram estéreis ou continham grãos dispersos. Idealmente, o fenótipo seria medido por meio da avaliação de notas de pilhas de espigas que contêm seis ou mais espigas com uma avaliação de

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80/93 enchimento de grãos de três ou mais. Devido às questões de grãos dispersos, entretanto, foram tomadas avaliações sobre pilhas de espigas muito ruins e muitas não puderam ser avaliadas. PHB1V continha boas pilhas de espigas e a avaliação foi suficiente. Realizou-se avaliação fenotípica utilizando a escala fornecida na Fig. 4 e a genotipificação foi realizada nos marcadores PHM8711-17, PHM8211-16, PHM1754-20 e PHM3951-25 para QTL12 e nos marcadores PHM9362-8, PHM1147-16, PHM1147-19, PHM11850-6, PHM5280^1 e PHM9301-37 para QTL6. Vide as Figs. 5A, 5B, 6A e 6B para as informações do marcador SNP; especificamente, as figuras relacionam os identificadores SEQ ID para cada uma das sequências de primer e sonda. Diversos outros marcadores foram calculados para determinar se os outros QTLs identificados (vide o Exemplo 1) entraram em conflito com os resultados fenotípicos. Esses marcadores foram: PHM9009-13, PHM3171-5 e PHM3860^3 para QTL5; PHM7942-12, PHM678-22 e PHM8358-17 para QTL7; e PHM16415-8, PHM737-215 e PHM9092-11 para QTL8. Vide as Figs. 7A a 7C para as sequências de primer e de sonda para uso com a plataforma Invader Plus®. As Figuras 8 a 14 exibem os resultados das conversões de congênitos de elite. Em cada tabela, “corr_vearmold” é uma avaliação corrigida de pilhas de espigas que contêm seis ou mais espigas com enchimento de grão suficiente, “stddev” indica desvio padrão. Células destacadas em cinza escuro indicam o alelo PHG61 e as células destacadas em cinza claro indicam que o locus marcador é segregado naquele alelo ou que a tecnologia utilizada para detectar o SNP não pôde determinar qual alelo estava presente. São exibidos apenas os SI_IDs (Números de Identificação do Inventário de Sementes; indica a fonte de semente) para os quais foram obtidos dados fenotípicos. “EQV” indica que o polimorfismo não pôde ser chamado; “NF” indica que os dados não foram encontrados.

[0373] PHCA5, PH51H, PH70R e as suas conversões correspondentes possuíam questões severas com grãos espalhados, o que toma a

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81/93 avaliação extremamente difícil.

[0374] PHCA5 possui uma avaliação de fungo da espiga Fusarium histórica de 4,0; neste experimento, entretanto, ele não pôde ser avaliado. PHG61 e PHGCA5 não são polimórficos em PHM8711-17, PHM1754-20, PHM1147-16, PHM3171-5, PHM678-22 e PHM9092-11. 11510073 e 11710277 aparentemente segregam em QTL1 e possivelmente possuíam o QTL6 derivado de PHG61. 11510073 e 11710277 possuíam avaliações de 4 e 5,5, respectivamente. 11510074 e 11710275, ambos com avaliações 4, possuíam QTL1 derivado de PHG61 mas não QTL6.11510082, com avaliação de 4,0, não possuía QTL1 derivado de PHG61 e possivelmente possuía QTL6. A Fig. 8 exibe os dados de conversão de PHCA5.

[0375] PH51H possui uma avaliação de fungo da espiga Fusarium de 3,6; neste experimento, entretanto, possuía avaliação de 4,7. PHG61 e PH51H não são polimórficos a PHM5280-41, PHM3171-5, PHM3860^3, PHM678-22 e PHM737-215. 11066837, 11066811, 11066836 e 11066839 aparentemente possuem dados fenotípicos conflitantes, devido à interferência de QTL7. 11066837, com avaliação de 5,0, foi propenso a segregar QTL1, possivelmente possuía QTL6 e aparentemente possui QTL7. 11066809, com avaliação de 5,5, provavelmente segrega em QTL1 e possivelmente possuía o QTL6 derivado de PHG61.11066839, com avaliação de 6,0, aparentemente segrega em QTL1, não possuía QTL6 e aparentemente possuía QTL7. 11066838, com avaliação de 6,3, segregou QTL1 e QTL7 e possivelmente possuía o QTL6 derivado de PHG61. 11066841, com avaliação de 6,7, e 11066811, com avaliação de 7,5, não possuía QTL1 e aparentemente segrega em QTL6 e QTL7. As avaliações das conversões, em comparação com PH51H, aumentaram significativamente como resultado da presença de QTL1, QTL6 e/ou QTL7. A Fig. 9 exibe os dados de conversão de PH51H.

[0376] PH70R possui avaliação de fungo da espiga Fusarium histórica de 3,6; neste experimento, entretanto, possuía avaliação de 3,0. PHG61 e

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PH70R não são polimórficos em PHM8711-17, PHM1754-20, PHM3951-25, PHM11850-6, ΡΗΜ5280^1, PHM9301-37, PHM3171-5, PHM3860-43, PHM67822, PHM16415-8, PHM737-215 e PHM9092-11. 11067135, com avaliação de 3,0, não possuía QTL1 e provavelmente possuía QTL6 derivado de PHG61. 11067046 possuía avaliação de 3,0 e aparentemente possui QTL1 derivado de PHG61. 11067168, com avaliação de 4,0, aparentemente segrega em QTL1 e QTL6. 11067139, 11067095 e 11062329 possuíam avaliações de 3,5, 4,7 e 5,0, respectivamente, e todos aparentemente possuem QTL1 derivado de PHG61 e segregavam QTL6. 11067060, 11067174 e 11067126 possuíam avaliações de 5,0, 5,0 e 5,5, respectivamente, e aparentemente possuem QTL1 derivado de PHG61 e possivelmente QTL6. A Fig. 10 exibe os dados de conversão de PH70R.

[0377] PH87H, PHFCJ, PH890 e as suas conversões correspondentes possuíam problemas de grãos espalhados, embora menos severos.

[0378] PH87H possui uma avaliação de fungo da espiga Fusarium histórica de 5,0; neste experimento, entretanto, possuía avaliação de 5,5. PHG61 e PH87H não são polimórficos a PHM8711-17, PHM1147-16, PHM678-22 e PHM9092-11. 11066328, com avaliação de 3,7, possuía QTL1 e QTL5 derivado de PHG61 e aparentemente segrega em QTL6 e QTL8. 11066329, com avaliação de 4,0, aparentemente segrega em QTL1 e QTL8 e possivelmente possuía QTL6 derivado de PHG61. 11066314, com avaliação de 4,0, possuía QTL1 e QTL5 derivado de PHG61 e possivelmente QTL6 e QTL8. 11066230, com avaliação de 4,3, não possuía QTL1 ou QTL6 derivado de PHG61, mas possivelmente possuía QTL5. 11066235 e 11066277, ambos com avaliações de 6,0, não possuíam QTL6 derivado de PHG61, mas possivelmente possuía QTL1 e QTL8. 11066377, com avaliação de 6,0, aparentemente segrega em QTL1 e QTL5 e, possivelmente, possuía QTL6 derivado de PHG61.11062279, com avaliação de 6,0, possuía QTL1 e QTL5 derivado de PHG61 e possivelmente QTL6. 11066321, com avaliação de

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6,0, possuía QTL1 derivado de PHG61 e aparentemente segrega em QTL5, QTL6 e QTL8. A Fig. 11 exibe os dados de conversão de PH87H.

[0379] PHFCJ possui uma avaliação de fungo da espiga Fusaríum histórica de 4,0; neste experimento, entretanto, possuía avaliação de 5,3. PHG61 e PHFCJ não são polimórficos em PHM8211-16, PHM9362-8, PHM1147-16, PHM9301-37, PHM8358-17, PHM16415-8 e PHM737-215. 11066486, com avaliação de 3,7, aparentemente segrega em QTL1 e possuía o QTL6 derivado de PHG61. 11066514, com avaliação de 4,0, possuía QTL6 derivado de PHG61 e, possivelmente, QTL1. 110665522, com avaliação de 4,0, aparentemente segrega em QTL1 e QTL6. A Fig. 12 exibe os dados de conversão de PHFCJ.

[0380] PH890 possui avaliação de fungo de espiga Fusaríum histórica de 4,5; neste experimento, entretanto, possuía avaliação de 3,5. PHG61 e PHG890 não são polimórficos em PHM8711-17, PHM1754-20, PHM1147-16 e PHM9092-11. 11066544, com avaliação de 4,4, não possuía QTL6 derivado de PHG61 e possivelmente possuía QTL1. 11062297, com avaliação de 4,0, não possuía QTL1 derivado de PHG61 e aparentemente segrega em QTL6. 11066659 e 11066639 possuíam avaliações de 3,0 e 4,0, respectivamente, e não possuía QTL1 derivado de PHG61 mas possuía QTL6. 11062294 possuía avaliação de 5,0 e possuía QTL6 e QTL1 derivado de PHG61. 11066672 possuía avaliação de 3,7 e aparentemente segrega em QTL1. 11066707, 11066601, 11066680 e 11066565 com avaliações de 2,5,4,0,4,0 e 5,0, respectivamente, possuíam QTL1 derivado de PHG61 e aparentemente segregam em QTL6. 11066600, com avaliação de 4,5, possuía QTL1 e QTL6 derivado de PHG61. A Fig. 13 exibe os dados de conversão de PH890.

[0381] PHB1V possui uma avaliação de fungo de espiga Fusaríum histórica; neste experimento, entretanto, possuía avaliação de 4,2. PHG61 e PHB1V não são polimórficos em PHM11850-6, PHM5280^1, PHM9301-37, PHM3171-5, PHM3860-43, PHM8358-17, PHM16415-8 e PHM737-215. 11066911 e 11066896

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84/93 possuíam avaliações de 4,0 e 4,4, respectivamente, nem possuíam QTL1 nem QTL6 derivado de PHG61. 11066988, com avaliação de 6,0, não possuía QTL1 derivado de QTL1 e possivelmente possuía QTL6.11066895,11066923,11067017 e 11067023 possuíam avaliações de 4,0, 5,3, 6,6 e 6,8, respectivamente, e possuíam QTL1 derivado de PHG61, mas não QTL6. 11066930 possuía avaliação de 5,0 e possuía QTL1 derivado de PHG61. 11066981 possuía avaliação de 7,0, aparentemente segrega em QTL1 e possivelmente possuía QTL6 derivado de PHG61. 11067002 possuía avaliação de 8,0, QTL1 derivado de PHG61 e possivelmente segregava em QTL6. A Fig. 14 exibe os dados de conversão de PHB1V.

Exemplo 4 Eficácia em híbridos [0382] Conversões de PHFCJ, PH70R, PH890 e PH51H foram cruzadas em linhagens congênitas para criar híbridos e comparadas em seguida com cruzamentos similares nos quais as linhagens congênitas de PHFCJ, PH70R, PH890 e PH51H não convertidas foram utilizadas como pais. Vide as Figs. 15A e 15B para uma comparação entre as avaliações de fungo da espiga Fusarium entre as linhagens que possuem “bom” haplótipo de resistência (similar a PHG61) e as linhagens que não possuem o “bom” haplótipo de resistência. Os marcadores que foram determinados para QTL1 incluem: PHM6929-3, PHM8211-16 e PHM14506-

7. Os marcadores que foram determinados para QTL6 incluem: PHM44234, PHM9362-8, PHM1147-19 e PHM11850-6.

[0383] Quando uma linhagem PHFCJ não convertida foi cruzada com PH1JC, o híbrido resultante possuía avaliação de fungo da espiga Fusarium média de 2,8. Para plantas decorrentes dos cruzamentos entre as linhagens de conversão de PHFCJ e PH1JC, PHM9362-8 e PHM1147-19 geraram resultados alélicos inesperados e PHM8211-16 não

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85/93 foi informativo. 12022402 e 12022385, com avaliações de 3,2 e 3,5, respectivamente, possuíam, entretanto, QTL6, enquanto 12022384 possuía avaliação de 3,3 e aparentemente possuía QTL1.

[0384] Quando uma linhagem PH70R não convertida foi cruzada com PH3RC, o híbrido resultante possuía uma avaliação média de fungo da espiga Fusarium de 5,5. Nos cruzamentos entre as linhagens de conversão PH70R e PH3RC, as avaliações médias de todos os cruzamentos exceto um foram maiores ou iguais a 5,5 como resultado de ter um ou ambos QTLs. 12022393 e 12022394 possuíam avaliações de 5,5 e 6,2, respectivamente, presumivelmente devido à presença de QTL1. 12022395, com avaliação de 7,2, possuía QTL6 e possivelmente QTL1. 12022396, 12022397 e 12022398 possuíam avaliações de 5,0, 7,2 e 5,5, respectivamente, e todos os três possuíam QTL1 e QTL6.

[0385] Quando uma linhagem PH890 não convertida foi cruzada com PH4CN, o híbrido resultante possuía avaliação de fungo da espiga Fusarium média de 3,8. Nos cruzamentos entre linhagens de conversão de PH890 e PH4CN, as avaliações médias dos cruzamentos foram maiores ou iguais a 3,8. 12022391 possuía apenas QTL6 e possuía avaliação de 3,8.12022387, 12022388, 12022389 e 12022390 possuíam QTL1 e QTL6, o que resulta em avaliações de 5,8, 4,7, 5,5 e 4,8, respectivamente.

[0386] Quando uma linhagem PH51H não convertida foi cruzada com PHEKJ, o híbrido resultante possuía uma avaliação de fungo da espiga Fusarium média de 2,0. Nos cruzamentos entre linhagens de conversão de PH51H e PHEKJ, as avaliações médias dos cruzamentos foram de mais de 2,0. Um cruzamento possuía avaliação de 3,3 e possivelmente possuía QTL6. Os outros dois cruzamentos possuíam avaliações de 6,0 e 5,0, respectivamente, e aparentemente possuíam QTL1 e, possivelmente, QTL6.

[0387] Quando uma linhagem PH51H não convertida foi cruzada com PHF1J, o híbrido resultante possuía uma avaliação de fungo

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86/93 da espiga Fusarium média de 7,3, o que indica um nível já alto de resistência. Nos cruzamentos entre linhagens de conversão PH51H e PHF1J, um cruzamento possuía avaliação média de 7,0 e possivelmente conduzia QTL1. Um outro cruzamento possuía avaliação média de 7,3 e possivelmente ambos, QTL1 e QTL6. Um terceiro cruzamento também possuía avaliação média de 7,3 e possuía QTL1 e, possivelmente, QTL6.

[0388] Quando uma linhagem PH51H não convertida foi cruzada com PH1W2, o híbrido resultante possuía avaliação de fungo da espiga Fusarium média de 5,3. Nos cruzamentos entre linhagens de conversão PH51H e PH1W2, cada cruzamento possuía avaliação média de mais de 5,3 e possuía QTL1 e, possivelmente, QTL6.

Exemplo 5

Identificação de marcadores de alto rendimento para uso em seleção assistida POR MARCADORES DE PLANTAS RESISTENTES AO FUNGO DA ESPIGA FUSARIUM [0389] Marcadores com ligação próxima que possuem alelos em desequilíbrio de ligação com um alelo de resistência em QTL1 e/ou QTL6 podem ser efetivamente utilizados para selecionar plantas de prole com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium. Os marcadores descritos no presente, bem como outros marcadores genética ou fisicamente mapeados para o mesmo segmento cromossômico, podem ser utilizados para selecionar plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium. As Tabelas 2A e 2B exibem os marcadores descritos no presente e suas posições sobre um mapa genético derivado internamente (PHB) e um mapa IBM2 (as regiões em cinza indicam onde estão localizados os QTLs). As Figs. 1A a 1C e 2A a 2B exibem os mapas físicos da região QTL1 e da região QTL6, respectivamente; os SEQ ID N° para cada uma das sequências de referência PHM são exibidos nas figuras.

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87/93

Tabela 2 A

Região QTL1 em Ordem de Mapa Físico

Marcador	PHB	IBM2
bnlg1953	70,45	170
PHM6929	76,12	183,8
bnlg1007	76,93	139,7
PHM8711	79,68	198,4
bnlg1083	80,54	201,3
PHM 10054	80,33	n/a
PHM8211	78,3	n/a
PHM 12872	81,72	n/a
PHM10721	80,77	198,4
PHM15661	84,31	n/a
PHM 14506	81,86	201,5
PHM 1754	83,76	198,4
PHM3951	84,39	226,4
PHM 1934	84,39	198,4
PHI256546	90,98	226,4

Tabela 2B

Região de QTL6 em Ordem de Mapa Físico

Marcador	PHB	IBM2
LG1112958	90,14	n/a
bnlg1174	92,95	315,4
umc1462	102,39	325,1
umc1805	103,35	332,2
PHM4423	106,52	342,7
bnlg1732	116,22	373,8

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88/93

Marcador	PHB	IBM2
PHM9362	115,07	391,4
PHI445613	117,71	375,8
PHM1147	120,91	394,1
PHM11850	122,52	388,7
PHM9301	124,25	394,1
umc1762	123,96	394,1
PHM5280	123,6	394,1
PHM13773	128,59	400,3
PHM 16422	128,28	400,3
PHI364545	139,37	428,4

[0390] Tipicamente, será utilizado um conjunto desses marcadores (tais como dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais) na região lateral acima do gene e um conjunto similar na região lateral abaixo do gene. Opcionalmente, conforme descrito acima, pode também ser utilizado um marcador no interior do locus e/ou gene real. Os pais e sua prole são selecionados para determinar esses conjuntos de marcadores e os marcadores que são polimórficos entre os dois pais são utilizados para seleção. Os marcadores polimórficos mais próximos do gene ou locus são utilizados para selecionar o gene ou locus e os marcadores polimórficos mais distantes são utilizados para selecionar contra o gene ou locus. Em um programa de introgressão, isso permite a

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89/93 seleção do genótipo de locus ou gene nos marcadores polimórficos mais próximos e a seleção do genótipo parental recorrente nos marcadores polimórficos mais distantes.

[0391] Nem todos os marcadores mapeados genética e fisicamente para o mesmo segmento cromossômico de QTL1 ou QTL6 podem ser utilizados para selecionar plantas de milho com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusarium porque o marcador pode não ser suficientemente informativo em uma população específica.

Exemplo 6

Pesquisa de germoplasma [0392] 884 linhagens congênitas de conjuntos de germoplasma separados que cobrem uma faixa ampla de maturidades foram selecionadas para determinar a resistência ao fungo da espiga de Fusarium entre 2003 e 2005 em Cairo GA e em Woodland CA.

[0393] As linhagens podem ser genotipificadas em QTL1 utilizando, por exemplo, PHM6929-3-U, PHM8211-16-1 e PHM14506-7-U. Das 884 linhagens, 542 possuem dados fenotípicos e dados genotípicos para esses marcadores de QTL1. Vinte e quatro linhagens possuem “C” em PHM6929-3, “T” em PHM8211-16 e “T” em PHM14506-7 e uma avaliação FUSERS média de 5,3 em comparação com avaliação média de 4,7 para linhagens que não possuem esse haplótipo. PHM10054-14-U, PHM8211-16-1 e PHM10721-9-U podem também ser utilizados para genotipificar o QTL sobre o cromossomo 1. 505 linhagens possuem dados genotípicos em PHM10054-14-U, PHM8211-16I e PHM10721-9-U bem como dados fenotípicos para FUSERS. Das 505 linhagens, sete possuem “A” em PHM 10054-14, “T” em PHM8211-16 e “A” em PHM10721-9. Estas sete linhagens possuem avaliação FUSERS média de 6,1. As linhagens restantes (que não possuem o genótipo “ATA”) possuem avaliação média de 4,7.

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90/93 [0394] As linhagens podem ser genotipificadas a QTL6 utilizando, por exemplo, PHM4423-4-U, PHM11850-3-U e PHM13773-6-U. Para QTL6, apenas 125 das 884 linhagens congênitas possuem dados fenotípicos e genotípicos. Somente um possui um “T” em PHM4423-4, “T” em PHM11850-3 e “A” em PHM13773-6 e essa linhagem possui avaliação FUSERS média de 8,4. Linhagens que não possuem este haplótipo possuem avaliação FUSERS média de 4,8. PHM9362-8 e PHM13773-6 podem também ser utilizados para genotipificar o QTL sobre o cromossomo 6. Quarenta e quatro linhagens possuem “G” em PHM9362-8 e “A” em PHM13773-6 e este conjunto possui avaliação média de 5,4. As linhagens restantes sem esse haplótipo possuem avaliação média de 4,7.

Exemplo 7 Detecção de QTL1 por meio de análise de mapeamento de associação [0395] Uma coleção de 489 linhagens de milho foi submetida a análise de mapeamento de associação. As linhagens englobaram congênitos Pioneer patenteados de elite com maturidade intermediária a inicial.

[0396] Foram obtidas avaliações fenotípicas utilizando uma escala FUSERS similar à fornecida na Fig. 4. Uma avaliação média de cada linhagem foi atribuída com base em dados recolhidos ao longo de dois anos em três locais perto de Afumati, Romênia, sob condições de infecção natural.

[0397] Foi conduzida uma análise de associação com base em estrutura utilizando métodos de mapeamento de associação padrão, em que a estrutura da população é controlada utilizando dados de marcadores. O software de análise de conjuntos com base em modelos, Structure, desenvolvido pela Pritchard et al (Genetics 155: 945-959 (2000)), foi utilizado com dados SNP em duzentos marcadores para estimar coeficientes de mistura e atribuir os congênitos a duas subpopulações. Isso reduz a ocorrência de falsos positivos que podem surgir devido ao efeito da estrutura da população

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91/93 sobre estatísticas de mapeamento de associação. A estatística de Kuiper para testar se duas distribuições são idênticas foi utilizada para testar um dado marcador para associação entre haplótipo e fenótipo em uma dada subpopulação (Press et al, Numerical Recipes in C, segunda edição, Cambridge University Press, Nova Iorque (2002)).

[0398] As duas subpopulações identificadas corresponderam a uma classe de haste rígida que incluiu 234 linhagens e uma classe de haste não rígida que incluiu 255 linhagens. Dentro desta última subpopulação, 250 linhagens possuíam dados suficientes para análise adicional.

[0399] Foi identificado um pico de associação de característica e marcador altamente significativa no cromossomo 1 dentro da subpopulação de haste não rígida. A Tabela 3 fornece uma relação dos marcadores de milho associados significativamente ao fenótipo de resistência ao fungo da espiga Fusarium no nível p < 0,001, o que representa um intervalo de 3,6 cM sobre o mapa genético derivado internamente. As posições são fornecidas em cM, em que a posição zero é o primeiro marcador (mais distante do centrômero) conhecido no início do cromossomo. As posições de mapa na Tabela 3 não são absolutas e representam uma estimativa da posição de mapa com base no mapa genético derivado internamente (PHB).

Tabela3

Marcadores de Cromossomo 1 Significativamente Associados à Resistência ao

Fungo da Espiga Fusarium em p < 0,001 no Grupo de Subpopulação Não de Haste Rígida

Nome do marcador	Posição de mapa relativa (cM) sobre o mapa PHB	Valor P
PHM8711-17-U	79,68	2,28 x1o-⁴

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92/93

Nome do marcador	Posição de mapa relativa (cM) sobre o mapa PHB	Valor P
PHM8711-14-U	79,68	4,80x10'⁵
PHM 10054-14-U	80,33	4,60x10'⁵
PHM 10721-9-U	80,77	1,16x10'⁷
PHM10721-16-U	80,77	3,80x10'⁷
PHM15661-21-U	84,31	2,14x1o-⁴

[0400] Havia dois haplótipos principais na subpopulação de haste não rígida conforme definido pelos marcadores PHM 10054-14-U e PHM-10721-9-U. 202 linhagens possuíam “A” em PHM10054-14, “A” em PHM10721-9 e avaliação FUSERS média de 6,1. Dezoito linhagens possuíam “G” em PHM10054-14, “G” em PHM10721-9 e avaliação FUSERS média de 4,5. Cinco linhagens possuíam outros haplótipos e 25 linhagens possuíam dados faltantes ou possuíam avaliação heterozigótica em um dos marcadores e não puderam receber um haplótipo. A Tabela 4 fornece uma decomposição de haplótipos presentes na subpopulação.

Tabela 4

Haplótipos Presentes na População de Haste Não Rígida e Avaliações de Resistência ao Fungo da Espiga Fusaríum Média para Cada Classe de

Haplótipo

	PHM 10054- 14	PHM 10721-9	Número de linhagens com haplótipo	Avaliação FUSERS média
Hap 1	A	A	202	6,1
Hap 2	G	G	18	4,5
Hap 3	A	G	1	5,3

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Hap 4	G	A	4	5,6
Não atribuído	-	-	25	6,0
Total			250

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Claims

Reivindicações

1. MÉTODO DE SELEÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO, com resistência aprimorada ao fungo da espiga Fusaríum, caracterizado por compreendera obtenção de DNA acessível para análise edetecção na planta de milho de pelo menos um alelo de um locus marcador, em que o alelo está associado com resistência aprimorada ao fungo Fusaríum, em que:

1. o locus marcador pode ser encontrado dentro do intervalo do cromossomo 1 que compreende e é ladeado pelos marcadores PHM6929, em que a sequência de referência para PHM6929 é a SEQ ID NO: 41, e PHM1934, em que a sequência de referência para PHM 1934 é a SEQ ID NO: 47; e ii. o alelo é ou está ligado por menos que ou igual a 2 cM ao alelo “T” em PHM8211-16, em que a sequência de referência para PHM8211 é a SEQ ID NO: 43 e PHM8211-16 é obtida com primers de SEQ ID NOs: 73 e 74, e mencionado “T” é identificável utilizando-se uma sonda de SEQ ID NO: 75;

e seleção da mencionada planta de milho que possui o alelo.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a detecção de um alelo de um locus marcador adicional, em que o alelo é:

i. um “C” em PHM8711-14, em que a sequência de referência para PHM8711 é a SEQ ID NO: 42 e PHM8711-14 é obtida com primers de SEQ ID NOs: 69 e 70, e mencionado “C” é identificável utilizando-se uma sonda de SEQ ID NO: 72;

ii. um “T” em PHM 14506-7, em que a sequência de referência para PHM 14506 é a SEQ ID NO: 44 e PHM 14506-7 é obtida com primers de SEQ ID NOs: 77 e 78, e mencionado “T” é identificável utilizando-se uma sonda de SEQ ID NO: 80;

iii. um “C” em PHM1934-37, em que a sequência de referência para PHM1934 é a SEQ ID NO: 47 e PHM1934-37 é obtida com primers de

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2/3

SEQ ID NOs: 89 e 90, e mencionado “C” é identificável utilizando-se uma sonda de SEQ ID NO: 91;

iv. um “C” em PHM8711-17, em que a sequência de referência para PHM8711 é a SEQ ID NO: 42 e PHM8711-17 é obtida com primers de SEQ ID NOs: 177 e 178, e mencionado “C” é identificável utilizando-se uma sonda de SEQ ID NO: 180;

v. um “C” em PHM 1754-20, em que a sequência de referência para PHM1754 é a SEQ ID NO: 45 e PHM1754-20 é obtida com primers de SEQ ID NOs: 81 e 82, e mencionado “C” é identificável utilizando-se uma sonda de SEQ ID NO: 83, vi. um “T” em PHM3951-25, em que a sequência de referência para PHM3951 é a SEQ ID NO: 46 e PHM3951-25 é obtida com primers de SEQ ID NOs: 85 e 86, e mencionado “T” é identificável utilizando-se uma sonda de SEQ ID NO: 88;

vii. um “C” em PHM6929-3, em que a sequência de referência para PHM6929 é a SEQ ID NO: 41 e PHM6929-3 é obtida com primers de SEQ ID NOs: 65 e 66, e mencionado “C” é identificável utilizando-se uma sonda de SEQ ID NO: 68;

viii. um “A” em PHM 10054-14, em que a sequência de referência para PHM10054 é a SEQ ID NO: 173 e PHM10054-14 é obtida com primers de SEQ ID NOs: 181 e 182, e mencionado “A” é identificável utilizando-se uma sonda de SEQ ID NO: 184;

ix. um “A” em PHM10721-9, em que a sequência de referência para PHM 10721 é a SEQ ID NO: 174 e PHM 10721-9 é obtida com primers de SEQ ID NOs: 185 e 186, e mencionado “A” é identificável utilizando-se uma sonda de SEQ ID NO: 187;

x. um “A” em PHM 10721-16, em que a sequência de referência para PHM10721 é a SEQ ID NO: 174 e PHM10721-16 é obtida com primers de

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3/3

SEQ ID NOs: 189 e 190, e mencionado “A” é identificável utilizando-se uma sonda de SEQ ID NO: 191; ou xi. um “G” em PHM15661-21, em que a sequência de referência para PHM15661 é a SEQ ID NO: 175 e PHM15661-21 é obtida com primers de SEQ ID NOs: 193 e 194, e mencionado “G” é identificável utilizando-se uma sonda de SEQ ID NO: 196.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo locus marcador estar localizado em um intervalo cromossômico que compreende e é ladeado por PHM6929, em que a sequência de referência para PHM6929 é a SEQ ID NO: 41, e PHM14506, em que a sequência de referência para PHM14506 é a SEQ ID NO: 44.