BRPI1006104B1

BRPI1006104B1 - gene isolado que codifica glucoquinase humana, vetor recombinante, hospedeiro, e, composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI1006104B1
Application number: BRPI1006104-5A
Authority: BR
Inventors: Haidong Huang
Original assignee: Haidong Huang
Priority date: 2009-01-07
Filing date: 2010-01-06
Publication date: 2021-04-20
Also published as: EP2388317B1; KR101300540B1; WO2010078842A1; ES2649021T3; HUE035110T2; JP5721637B2; IL213750A; KR20110099057A; EA024878B1; IL213750A0; AU2010204379B2; JP2012514463A; AU2010204379A1; DK2388317T3; EA201170917A1; BRPI1006104B8; CA2749180C; EP2388317A1; CN102272296B; PT2388317T

Abstract

GENE QUE CODIFICA GLUCOQUINASE HUMANA MUTANTE, GLUCOQUINASE HUMANA MUTANTE, VETOR RECOMBINANTE, HOSPEDEIRO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UM GENE, DE UMA GLUCOQUINASE HUMANA MUTANTE, DE UM VETOR RECOMBINANTE, DE UM HOSPEDEIRO E DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA O gene que codifica a glucoquinase humana mutante é fornecido. O gene tem a sequência de nucleotídeo escolhida da sequência de nucleotídeo listada como SEQ ID NO: 2 e a sequência de nucleotídeo em que a região da ORF codifica a mesma sequência de aminoácido como aquela codificada pela região da ORF (posição 487 a 1884) da SEQ ID NO: 2 e a região restante é a mesma como a região que não da ORF da SEQ ID NO: 2. A glucoquinase humana mutante codificada pelo gene, os vetores recombinantes que carregam o gene, os hospedeiros que compreendem os vetores, composições farmacêuticas destes, seu uso, e métodos para tratar e prevenir doenças pelo uso do mesmo são fornecidos. A glucoquinase humana mutante codificada pelo gene tem atividade mais alta do que aquela da glucoquinase humana do tipo selvagem, e assim fornece um novo modo de controlar a glicose sanguínea ou prevenir e tratar distúrbios do metabolismo de carboidrato, especialmente prevenir e tratar a diabete.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A invenção é direcionada a um gene que codifica a glucoquinase humana mutante, uma glucoquinase humana mutante expressada pelo gene, um vetor recombinante que carrega o gene que codifica a glucoquinase humana mutante, um hospedeiro que compreende o vetor recombinante, uma composição farmacêutica que compreende um ou mais selecionados do gene que codifica a glucoquinase humana mutante, a glucoquinase humana mutante, o vetor recombinante e o hospedeiro, uso do gene que codifica a glucoquinase humana mutante, a glucoquinase humana mutante, o vetor recombinante e o hospedeiro na fabricação de um medicamento para controlar a glicose sanguínea ou um medicamento para prevenir e tratar distúrbios do metabolismo de carboidrato, uso do gene que codifica a glucoquinase humana mutante, a glucoquinase humana mutante, o vetor recombinante e o hospedeiro na fabricação de um medicamento para prevenir e tratar a diabete melito, um método para controlar a glicose sanguínea ou prevenir e tratar distúrbios do metabolismo de carboidrato pelo uso deles, e um método para prevenir e tratar a diabete melito pelo uso dos mesmos.

TÉCNICAS FUNDAMENTAIS

[0002] A glucoquinase (GK) é um membro importante da família da hexose cinase, da qual a atividade biológica básica é catalisar a fosforilação da glicose. O gene que codifica a glucoquinase humana está localizado no braço curto do Cromossoma 7 e compreende dez exons. A GK consiste de 465 aminoácidos, está presente especificamente em hepatócitos maduros e células beta das ilhotas, e envolvidas em muitas das etapas chave no glicometabolismo e secreção de insulina.

[0003] No presente, foi mostrado que a intensidade na resposta à secreção da insulina in vivo é proporcional à taxa metabólica para glicose nas células beta da insulina. Assim, a enzima que controla a taxa de influxo de glicose dentro das células é considerada como um sensor de glicose que regula a liberação da insulina, e a GK é o sensor de glicose nas células beta das ilhotas. Quando transferido para dentro de uma célula beta através do transportador 2, a glicose é fosforilada sob a ação da glucoquinase e introduzida no caminho glicolítico para dar ATP, a quantidade do qual é proporcional à quantidade de glicose introduzida na célula beta; ATP pode fechar o canal do íon potássio na membrana plasmática da célula beta, levando à despolarização, que por sua vez resulta no influxo do íon de cálcio e eventualmente secreção de insulina. Visto que a atividade de GK é controlada direta ou indiretamente pela concentração de glicose no sangue, a alteração na taxa metabólica para a glicose dentro da célula beta pode regular a secreção de insulina. Além disso, como a enzima também pode controlar a concentração da glicose sanguínea pela facilitação da síntese de glicogênio hepático e conversão de catalisação da glicose em glicose-6-fosfato, a anormalidade da atividade de GK desempenha um papel na ocorrência e desenvolvimento de distúrbios do metabolismo de carboidrato.

[0004] Foi descoberto por algumas investigações que em pacientes e alguns modelos de animal (por exemplo, ratos jejuando) que sofrem da diabete melito tipo 2, a atividade de GK em hepatócitos de ratos com diabete melito tipo 2 induzido pela dieta de alto teor de gordura é significantemente reduzida quando comparada com o controle normal; Foi demonstrado ainda por outros resultados de investigação que o aumento na atividade de GK pode diminuir o nível de glicose sanguínea significantemente. Foi confirmado no presente estudo que a variação no gene de GK está intimamente associadas com o início de um subtipo de diabete melito tipo 2, isto é, a diabete de início na maturidade do jovem (MODY), em que a mutação do gene desempenha um papel principal no início da MODY.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

[0005] O objetivo técnico a ser resolvido pela presente invenção é como fornecer um gene que codifica a glucoquinase humana mutante a partir do qual a glucoquinase humana mutante é expressada com atividade de GK mais alta do que aquela do tipo selvagem, de modo que um novo caminho para controlar a glicose sanguínea, tratar distúrbios do metabolismo de carboidrato assim como diabete melito, particularmente diabete melito tipo 2 será fornecido.

[0006] A presente invenção fornece um gene que codifica a glucoquinase humana mutante, em que o gene tem: (1) uma sequência de nucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 2; ou (2) uma sequência de nucleotídeo que é idêntica à sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2 exceto a matriz de leitura aberta (ORF) que varia da posição 487 para 1884 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2, e da qual a ORF codifica a mesma sequência de aminoácido como aquela codificada pela ORF da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2.

[0007] Acredita-se no geral na técnica anterior que por causa da mutação de sentido errado, mutação sem sentido, e mutação de mudança de matriz nas bases na ORF de um gene que codifica proteína pode alterar a estrutura primária da sequência de aminoácido de um produto de proteína codificada pelo gene, apenas a mutação que ocorre dentro de um exon do gene que codifica a proteína pode usualmente resultar em mudanças relativamente extraordinárias no desempenho do produto de proteína. Presentemente, a função para um intron do gene que codifica a proteína é ainda incerto, e falando no geral, a alteração no intron dificilmente pode ter um efeito essencial sobre o desempenho do produto de proteína. Os inventores da presente invenção têm inesperadamente encontrado que um gene da glucoquinase humana mutante que tem uma mutação que ocorre dentro de uma região de intron do gene da glucoquinase humana do tipo selvagem pode expressar uma glucoquinase humana mutante que exibe uma atividade de GK significantemente aumentada em comparação com aquela do tipo selvagem.

[0008] A presente invenção também fornece uma glucoquinase humana mutante, em que o gene que codifica a glucoquinase humana mutante é o gene que codifica a glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção.

[0009] A presente invenção também fornece um vetor recombinante que compreende um vetor e um gene de interesse carregado nele, em que o gene de interesse é o gene que codifica a glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção.

[0010] A presente invenção também fornece um hospedeiro, em que o hospedeiro compreende o vetor recombinante apresentado na presente invenção.

[0011] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável e um ou mais selecionados de um gene que codifica a glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, uma glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, um vetor recombinante apresentado na presente invenção, e um hospedeiro apresentado na presente invenção.

[0012] A presente invenção também fornece o uso de um gene que codifica a glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, uma glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, um vetor recombinante apresentado na presente invenção, e um hospedeiro apresentado na presente invenção na fabricação de um medicamento para controlar a glicose sanguínea ou um medicamento para prevenir e tratar distúrbios do metabolismo de carboidrato.

[0013] A presente invenção também fornece o uso do gene que codifica a glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, uma glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, um vetor recombinante apresentado na presente invenção, e um hospedeiro apresentado na presente invenção na fabricação de um medicamento para prevenir e tratar a diabete melito.

[0014] A presente invenção também fornece um método de controlar a glicose sanguínea ou prevenir e tratar distúrbios do metabolismo de carboidrato, em que um agente selecionado do grupo que consiste de um gene que codifica a glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, uma glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, um vetor recombinante apresentado na presente invenção, e um hospedeiro apresentado na presente invenção é administrado a um paciente em necessidade deste.

[0015] A presente invenção também fornece um método de prevenir e tratar a diabete melito, em que um agente selecionado do grupo que consiste de um gene que codifica a glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, uma glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, um vetor recombinante apresentado na presente invenção, e um hospedeiro apresentado na presente invenção é administrado a um paciente em necessidade deste.

[0016] A glucoquinase humana mutante expressada por um gene da presente invenção exibe uma atividade significantemente mais alta do que aquela do tipo selvagem, fornecendo assim um meio novo, eficaz para controlar a glicose sanguínea ou para prevenir e tratar distúrbios do metabolismo de carboidrato, especialmente a diabete melito.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0017] A Figura 1 é a fotografia de eletroforese obtida depois da ligação do plasmídeo pIRES2-EGFP linearizado e o gene de interesse (Exemplo 1).

[0018] A Figura 2 é a curva para a relação funcional entre a unidade de insulina (unidade μ/ml) no eixo X e a contagem de 125I no eixo Y.

[0019] A Figura 3 é uma representação esquemática para a estrutura do vetor plasmídico de pIRES2-EGFP.

[0020] A Figura 4 é a fotografia de eletroforese para a identificação de células min6 transfectadas com êxito com o vetor plasmídico recombinante.

[0021] A Figura 5 é a fotografia microscópica para as células min6 transfectadas com êxito com o vetor plasmídico recombinante.

[0022] A Figura 6 é a fotografia de eletroforese para a identificação do plasmídeo transportador circular recombinante pShuttle2-CMV-G262-IRES2- EGFP ou do plasmídeo transportador circular recombinante pShuttle2-CMV- G261-IRES2-EGFP.

[0023] A Figura 7 é a fotografia de eletroforese para a identificação do adenovírus recombinante pAd-GFP-G261 ou do adenovírus recombinante pAd-GFP-G262.

FORMAS DE REALIZAÇÃO DETALHADAS

[0024] A presente invenção fornece um gene que codifica uma glucoquinase humana mutante, em que o gene tem: (1) uma sequência de nucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 2; ou (2) uma sequência de nucleotídeo que é idêntica à sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2 exceto a matriz de leitura aberta (ORF) que varia da posição 487 para 1884 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2, e da qual a ORF codifica a mesma sequência de aminoácido como aquela codificada pela ORF da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2.

[0025] Preferivelmente, o gene que codifica a glucoquinase humana mutante tem a sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2. Um gene que codifica a glucoquinase humana pode ser isolada de leucócitos de um corpo humano saudável, que tem a sequência de nucleotídeomostrada na SEQ ID NO: 1 da listagem de sequência, e o gene do tipo selvagem que codifica a glucoquinase humana (número de acesso no GenBank BC001890, M88011, NM033508, e NM033507). A sequência de nucleotídeo do gene que codifica a glucoquinase humana mutante de acordo com a presente invenção como mostrada na SEQ ID NO: 2 teve uma deleção de uma base C na posição 2643 em comparação com aquela do gene do tipo selvagem.

[0026] Deve ser entendido que uma pessoa habilitada na técnica pode sintetizar uma sequência de nucleotídeo diferente da SEQ ID NO: 2 enquanto codifica a glucoquinase humana mutante da presente invenção, de acordo com a degenerescência do códon e a tendência do uso de códon em espécies diferentes. Isto é, é uma sequência de nucleotídeo que é idêntica à sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2 exceto a matriz de leitura aberta que varia da posição 487 para 1884 da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2, e da qual a ORF codifica a mesma sequência de aminoácido como aquela codificada pela ORF da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2.

[0027] A presente invenção também fornece uma glucoquinase humana mutante, em que o gene que codifica a glucoquinase humana mutante é o gene que codifica a glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção.

[0028] É bem conhecido na técnica que entre 20 tipos dos aminoácidos diferentes que constituem uma proteína, todos dos outros 18 tipos dos aminoácidos diferentes são codificados individualmente por 2 a 6 dos códons, exceto Met (ATG) ou Trp (TGG) que são codificados individualmente por um único códon (Ver, Apêndice D em Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 950). Em outras palavras, visto que o códon que codifica um aminoácido é mais do que um na maioria dos casos devido à degenerescência genética do códon e substituição do terceiro nucleotídeo em um códon triplo frequentemente não resulta em nenhuma mudança na composição de aminoácido, a sequência de nucleotídeos que codifica proteínas com a sequência de aminoácido idêntica pode ser diferente. De acordo com a tabela de códon bem conhecida, a pessoa habilitada na técnica tem adquirido as sequências de nucleotídeo mencionadas acima da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 2 divulgada de acordo com a invenção, pelos processos biológicos (por exemplo, métodos com base na PCR, métodos de mutação pontual) ou síntese química, e fizeram o uso destes em técnicas recombinantes e terapias de gene, assim esta porção das sequências de nucleotídeo deve ser toda incluída dentro do escopo da presente invenção. Além disso, as sequências de DNA aqui divulgadas também podem ser utilizadas pelos métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo métodos descritos por Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Nova Iorque: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), através da modificação da sequência de ácido nucléico fornecida na presente invenção.

[0029] A presente invenção também fornece um vetor recombinante que compreende um vetor e um gene de interesse carregado nele, em que o gene de interesse é um gene que codifica a glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção.

[0030] Os genes de interesse também podem incluir uma sequência reguladora, por exemplo, um promotor, terminador, e realçador para a expressão de um ou mais dos genes de interesse. O gene de interesse também pode incluir um gene marcador (por exemplo, genes que codificam a β- galactosidase, a proteína fluorescente verde ou outras proteínas fluorescentes) ou um gene cujo produto regula a expressão de outro genes. Além de ser um DNA, o gene de interesse também pode ser mRNA, tRNA, ou rRNA, e também pode incluir a sequência reguladora de transcrição relevante usualmente associada com a transcrição da sequência, tal como, por exemplo, um sinal de terminação transcricional, um sítio de poliadenilação, e um elemento realçador a jusante.

[0031] O vetor pode ser um de vários vetores capazes de carregar o gene de interesse que são habitualmente usados na técnica e vários vetores capazes de carregar o gene de interesse que são disponíveis e melhorados pelo desenvolvimento tecnológico. Por exemplo, o vetor é um de plasmídeos (DNA nu), lipossomas, conjugados moleculares, polímeros e vírus.

[0032] O plasmídeo (DNA nu) pode carregar um gene de interesse, e o plasmídeo que carrega o gene de interesse pode ser injetado diretamente ou introduzido através de técnicas pistola de gene, eletroporação, e eletrofusão dentro das células em um tecido. Além disso, a onda ultrassônica facilita o aumento da eficiência de transferência para o plasmídeo. A onda ultrassônica em combinação com agente de contraste de eco de microbolha pode aumentar a permeabilidade da membrana plasmática, aumentando significantemente deste modo a eficiência de transferência e expressão para o DNA nu. Visto que esta técnica para permeação da membrana plasmática pode transitoriamente fazer poros na superfície da membrana plasmática, o DNA tem uma chance para ser introduzido dentro da célula.

[0033] O lipossoma é uma gotícula que consiste de folíolos bimoleculares lipídicos e pode mediar a entrada do gene de interesse através da membrana plasmática. O lipídeo pode ser um de fosfolipídeos naturais que predominam na lecitina (fosfatidilcolina, PC) e derivado da gema do ovo e feijão de soja; também pode ser um de fosfolipídeos sintéticos, tais como dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), dipalmitoil fosfatidiletanolamina (DPPE), distearoil fosfatidilcolina (DSPC), e assim por diante; e também pode compreender colesterol. O lipossoma preferido é o lipossoma catiônico, que principalmente resulta da mistura dos lipídeos positivamente carregados e os lipídeos neutros auxiliares em equivalentes molares. Um complexo pode ser eficazmente formado entre o lipossoma positivamente carregado e o DNA negativamente carregado, e transferido para dentro das células através da endocitose.

[0034] O polímero é um complexo de polímero/DNA estável formados pela neutralização elétrica devido à ligação das cargas positivas em um polímero catiônico (por exemplo, poli-L-lisina) às cargas negativas no DNA. O complexo resultante do polímero catiônico e do DNA é ainda carregado com cargas positivas, pode ligar-se ao receptor negativamente carregado na superfície da célula, e depois ser introduzido dentro da célula.

[0035] O conjugado molecular é a entidade em que um gene de DNA exógeno de interesse é covalentemente ligado em um ligando, um anticorpo monoclonal, ou uma proteína de envelope viral contra um receptor específico na superfície da célula e o gene exógeno é introduzido em um tipo de célula particular pelas propriedades de ligação específicas.

[0036] Visto que um vírus usualmente pode entrar em um tipo de célula particular com alta eficiência, expressar as suas próprias proteínas, e gerar virions nascentes, assim o vírus modificado serve primeiramente como um vetor para a terapia de gene. Por exemplo, menção pode ser feita de vetor de retrovírus, vetor de adenovírus, vetor de vírus adeno-associado, vetor do vírus simples do herpes, etc. Entre eles, o vírus adeno-associado pertence ao membro não patogênico da família Parvoviridae, que pode ser proliferado exclusivamente dependente de um vírus auxiliar. O vírus adeno-associado tem um genoma muito pequeno. Por exemplo, o vírus adeno-associado tipo 2 tem um genoma de DNA de cadeia única que consiste de 4681 nucleotídeos, que compreendem dois genes, isto é, o gene rep (que codifica proteínas responsáveis pela regulagem da replicação viral, expressão de genes estruturais e integração dentro do genoma do hospedeiro) e o gene cap (que codifica a proteína capsídica estrutural), com uma repetição de terminal de 145 pares de base presentes em um término do genoma. O vírus adeno- associado pode infectar células na fase de divisão e na fase estacionária, ser inserido no cromossoma da célula hospedeira, ou ser estavelmente expressada por um longo período na forma de um DNA concatêmero extracromossômico. Este pode eficazmente transformar tipos de célula do cérebro, músculo esqueletal, fígado e assim por diante, e possui características, tais como, antigenicidade, toxicidade baixa, não patogenicidade, etc.

[0037] Preferivelmente, o vetor é selecionado do grupo que consiste do vetor de clonagem, do vetor de expressão eucariótico, do vetor de expressão procariótico, e do vetor transportador (por exemplo, o plasmídeo transportador pShuttle2) para implementar a amplificação e expressão do gene de interesse. Quando usado na terapia de gene, um vetor de expressão indutível é preferivelmente usado, por exemplo, pIRES2-EGFP. Mais preferivelmente, o vetor é selecionado do grupo que consiste do pIRES2- EGFP, pCMVp-NEO, BAN, pEGFT-Actina, e um vetor de adenovírus. O vetor mais preferido é o vetor de adenovírus. O adenovírus é um vírus não envelopado com um genoma de DNA de filamento duplo linear, existe extensivamente na natureza, e é classificado em pelo menos mais do que 100 sorotipos. O genoma de adenovírus é de cerca de 36 kb no comprimento e tem uma terminação de terminal reverso respectivamente em um de ambos os terminais com um sinal de empacotamento de vírus que é interno. Existe quatro unidades de transcrição inicial (E1, E2, E3 e E4) responsáveis pela regulagem e uma unidade de transcrição tardia responsável pelas proteínas de estrutura viral codificadoras no genoma do adenovírus. Como um vetor para a terapia de gene, o vetor de adenovírus tem as seguintes vantagens: 1) tem capacidade de empacotamento relativamente grandes para um gene exógeno, sendo possível assim inserir um fragmento grande do gene exógeno, até 35 kb no comprimento; 2) tem alta eficiência de infecção, sendo possível assim transduzir eficientemente vários tipos de célula em tecidos humanos com uma eficiência de transdução experimental in vitro de aproximadamente 100 %; 3) pode transduzir as células que não se dividem; 4) produz o vírus recombinante com altos títulos na cultura de célula; 5) entra dentro de uma célula hospedeira sem integração no genoma da célula hospedeira e apenas é transitoriamente expressado, exibindo assim segurança relativamente alta. No presente, a mais nova versão do vetor de adenovírus tem todos (um vetor não viral) ou a maior parte dos genes de adenovírus (um mini-vetor de adenovírus) deletados, e apenas as repetições de terminal reverso e a sequência de sinal de empacotamento retidas, assim um gene de até 35 kb no comprimento pode ser inserido no vetor, uma resposta imune celular mais fraca é evocada pelo vetor, uma região de ligação da matriz nuclear introduzida no vetor pode permitir que o gene exógeno seja expressado por um tempo longo e aumentar a estabilidade do vetor.

[0038] A presente invenção também fornece um hospedeiro, em que o hospedeiro compreende um vetor recombinante apresentado na presente invenção. Por um lado, a transformação de um hospedeiro com o vetor recombinante que compreende o gene que codifica a glucoquinase humana mutante da presente invenção pode ser usada para investigar a relação entre a glucoquinase humana mutante e o glicometabolismo assim como a secreção da insulina, por outro lado pode ser usada para preparar a glucoquinase mutante ativa. É preferido que o hospedeiro seja selecionado de uma ou mais de E. coli, células 239, células min-6, e células beta da ilhota humana. Entre elas, a E. coli como uma cepa de engendramento genético pode compreender tanto o vetor de clonagem recombinante da presente invenção para implementar a amplificação do gene que codifica a glucoquinase humana mutante da presente invenção quanto compreende o vetor de expressão recombinante da presente invenção para implementar a expressão da glucoquinase humana mutante da presente invenção em uma quantidade grande. Quando o vetor recombinante é um vetor de adenovírus recombinante, o vetor pode ser amplificado em células 239. A célula min-6 é uma cepa da célula beta da ilhota de camundongo com capacidade relativamente potente para secretar insulina, e pode atuar como o hospedeiro para o vetor de expressão eucariótico da presente invenção para produzir a glucoquinase humana mutante da presente invenção e testar a sua atividade de GK. A célula beta da ilhota humana pode ser uma linhagem de célula comercialmente disponível e também ser células beta da ilhota humana de indivíduos por exemplo de pacientes com diabete melito. Durante o curso da terapia de gene, é preferido que as células beta da ilhota humana de um indivíduo por si seja retransplantada dentro do indivíduo depois de transduzida com um gene que codifica a glucoquinase humana mutante da presente invenção, para se evitar a rejeição imunológica subsequente.

[0039] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável e um ou mais selecionado de um gene que codifica a glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, uma glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, um vetor recombinante apresentado na presente invenção, e um hospedeiro apresentado na presente invenção.

[0040] O excipiente farmaceuticamente aceitável refere-se a enchedores, diluentes, materiais de revestimento sólidos, semi-sólidos sólidos ou líquidos não tóxicos ou outros agentes auxiliares para as formulações, por exemplo, incluindo, mas não limitado a solução salina, solução salina tamponada, glicose, água, glicerol, etanol, e misturas destes. A composição farmacêutica é adequada para a administração parenteral, sublingual, intracistérnica, intravaginal, intraperitoneal, intrarretal, intrabucal, ou transepidérmica.

[0041] A administração parenteral inclui a injeção intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratoráxica, subcutânea, intra-articular e infusão. A composição farmacêutica adequada para a administração parenteral inclui soluções, dispersões, suspensões ou emulsões aquosas ou não aquosas estéreis, e pós formulados em uma solução ou dispersão injetável estéril imediatamente antes do uso. Os carregadores, diluentes, solventes ou excipientes aquosos ou não aquosos apropriados incluem água, etanol, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, carboximetil celulose, óleos vegetais e ésteres orgânicos injetáveis, tais como, oleato de etila. estas composições também podem compreender preservantes, agentes umectantes, emulsificantes, protetores e auxiliares de dispersão, por exemplo, inositol, sorbitol, e sacarose. É preferido adicionar reguladores osmóticos tal como carboidratos, cloreto de sódio, e cloreto de potássio.

[0042] A administração transepidérmica inclui a administração na pele, mucosa, e na superfície dos pulmões e dos olhos. Uma tal composição farmacêutica inclui pós, unguentos, gotas, emplastros transdérmicos, dispositivos de iontoforese, inalantes, etc. A composição para a administração intrarretal ou intravaginal é preferivelmente um supositório, que pode ser preparado misturando-se o vetor recombinante da presente invenção com excipientes não estimulatórios apropriados, tais como manteiga de cacau, polietileno glicol ou base de cera de supositório, em que o excipiente ou carregador permanecem sólidos na temperatura ambiente e tornam-se líquidos na temperatura corporal, assim sendo fundem no reto ou vagina librando o composto ativo.

[0043] Preferivelmente, as composições farmacêuticas são uma injeção que compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável e um ou mais selecionados de um gene que codifica a glucoquinase humana mutante apresentado na presente invenção e um dos vetores recombinantes apresentados na presente invenção.

[0044] O dito excipiente farmaceuticamente aceitável é um tampão de fosfato com um valor de pH de 4,0 a 9,0; e 102 a 1010 cópias do gene que codifica a glucoquinase humana mutante ou 102 a 1010 cópias do vetor recombinante são compreendidas em um mililitro da injeção.

[0045] A injeção compreende ainda um protetor e/ou um regulador osmótico; o teor do protetor é de 0,01 a 30 % em peso com base na injeção, o protetor é um ou mais selecionados de inositol, sorbitol, e sacarose; o teor do regulador osmótico permite que a pressão osmótica da injeção seja de 200 a 700 mOsm/kg com o regulador osmótico sendo cloreto de sódio e/ou cloreto de potássio.

[0046] Quando a injeção foi usada na administração, o indivíduo foi administrado com a injeção contendo de 102 a 1010 cópias, preferivelmente de 105 a 108 cópias, e mais preferivelmente de 106 a 105 cópias do gene que codifica a glucoquinase humana mutante; ou contendo 102 a 1010 cópias, preferivelmente de 105 a 1010 cópias, e mais preferivelmente de 106 a 1010 cópias do vetor recombinante; É preferido ainda que o vetor recombinante seja um vetor de adenovírus recombinante que é administrado na quantidade que varia de 103 a 1010 unidades formadoras de placa (pfu), preferivelmente de 105 a 1010 pfu, e mais preferivelmente de 106 a 1010 pfu. Quando a composição farmacêutica da presente invenção é injetada, a dosagem de injeção pode ser aquela habitualmente usada na técnica, no máximo 500 μl, tipicamente de 1 a 200 μl, preferivelmente de 1 a 10 μl; entretanto, uma dosagem de até 10 ml também pode ser usada dependendo do local da injeção. Visto que uma pessoa habilitada na técnica é capaz de facilmente determinar a via ideal de administração e dosagem, as vias de administração e dosagem acima são apenas para referência. A dose pode ser determinada de acordo com vários parâmetros, especialmente a idade, peso corporal do paciente a ser tratado, severidade da doença, distúrbio, ou condição assim como a via de administração. A injeção da composição farmacêutica apresentada na presente invenção também pode ser administrada sistemicamente, e a injeção da composição farmacêutica da presente invenção também pode ser injetada em um sítio local (por exemplo, no músculo esqueletal).

[0047] A presente invenção também fornece o uso de um gene que codifica a glucoquinase humana mutante apresentado na presente invenção, uma glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, um vetor recombinante apresentado na presente invenção, e um hospedeiro apresentado na presente invenção na fabricação de um medicamento para controlar a glicose sanguínea ou um medicamento para prevenir e tratar distúrbios do metabolismo de carboidrato.

[0048] A presente invenção também fornece o uso de um gene que codifica a glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, uma glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, um vetor recombinante apresentado na presente invenção, e um hospedeiro apresentado na presente invenção na fabricação de um medicamento para prevenir e tratar a diabete melito.

[0049] A presente invenção também fornece um método de controlar a glicose sanguínea ou prevenir e tratar distúrbios do metabolismo de carboidrato, em que um agente selecionado do grupo que consiste de um gene que codifica a glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, uma glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, um vetor recombinante apresentado na presente invenção, e um hospedeiro apresentado na presente invenção é administrado a um paciente em necessidade deste.

[0050] A presente invenção também fornece um método de prevenir e tratar a diabete melito, em que um agente selecionado do grupo que consiste de um gene que codifica a glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, uma glucoquinase humana mutante apresentada na presente invenção, um vetor recombinante apresentado na presente invenção, e um hospedeiro apresentado na presente invenção é administrado a um paciente em necessidade deste.

[0051] Os seguintes exemplos ilustraram ainda mais a divulgação da presente invenção, e não devem ser interpretados de nenhum modo como limitando a presente invenção. Todas as modificações ou substituições que podem ser feitas aos métodos, etapas ou condições na presente invenção sem divergir do espírito e essência da presente invenção caem dentro do escopo da presente invenção. Os meios técnicos usados nos exemplos são meios convencionais bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica, a menos que de outro modo especificamente estabelecido. Todos os reagentes e meios de cultura usados na presente invenção são produtos comercialmente disponíveis a menos que de outro modo especificamente mencionado.

Exemplo 1: Síntese química de um gene que codifica a glucoquinase humana mutante (G262) da presente invenção

[0052] O gene que codifica a glucoquinase humana mutante com a sequência de nucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 2, tem um tamanho natural de 2748 pares de base. Depois da análise de sequência, foi mostrado que existem três sítios de restrição únicos, HindIII, SacI, e BamHI, que estão localizados nas posições 2443, 1327, e 2250 da SEQ ID NO: 2, respectivamente. A estratégia de síntese foi como segue: síntese dos fragmentos de DNA parciais respectivamente usando o método do triéster de fosforamidita de fase sólida, ligação dos fragmentos sintetizados, sequenciamento e verificação do gene ligado, e correção da ligação errada, em que as etapas detalhadas foram as seguintes: 1. Um fragmento A com um total de 1360 pares de base que variam do terminal 5’ até o sítio de restrição Sac I do gene foi sintetizado; 2. Resultados do sequenciamento e identificação indicaram que o fragmento A inteiro foi obtido da etapa 1, o fragmento inteiro foi submetido à modificação de terminal e depois ligado entre os sítios HindIII/SacI do vetor PCR2.1 (Invitrogen, Co.); 3. Um fragmento B com um total de 939 pares de base que variam do sítio de restrição SacI até o sítio de restrição de BamHI do gene foi sintetizado; 4. Resultados do sequenciamento e identificação indicaram que o fragmento B inteiro foi obtido da etapa 3, o fragmento inteiro foi submetido à modificação de terminal e depois ligado entre os sítios BamHI/SacI do vetor PCR2.1; 5. Um fragmento C com um total de 551 pares de base que variam do sítio de restrição de BamHI até o terminal 3’ do gene foi sintetizado; 6. Resultados do sequenciamento e identificação indicaram que o fragmento C inteiro foi obtido da etapa 5, o fragmento inteiro foi ligado no vetor que compreende o fragmento B, resultando em um fragmento D de um total de 1457 pares de base. 7. Resultados do sequenciamento e identificação indicaram que o fragmento D inteiro foi obtido da etapa 6. Os fragmentos A e D a serem ligados foram digeridos com a enzima de restrição SacI para produzir fragmentos de DNA com uma extremidade coesiva, uma reação de ligação de DNA foi realizada em que a T4 DNA polimerase foi envolvida. O gene que codifica a glucoquinase humana mutante com a sequência de nucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 2, foi obtida consequentemente. Todas as enzimas e tampões usados foram adquiridos da Clontech, Co. e a digestão de restrição e ligação foram realizadas de acordo com o protocolo fornecido pela Clontech, Co.

[0053] Visto que existem algumas sequências protetivas em todos os terminais dos fragmentos sintetizados para facilitar a modificação de terminal dos fragmentos depois de sintetizados, assim o comprimento da sequência sintetizada foi um pouco mais longa do que o comprimento real. A sequência protetiva refere-se a uma sequência protetiva de 8 a 20 bases que é adicionada artificialmente a cada um dos lados de um sítio de restrição de terminal presente na extremidade de um DNA de modo a eliminar a incapacidade de uma enzima de restrição para normalmente ligar-se ao DNA e clivá-lo no sítio de restrição na presença do impedimento estérico, a sequência base protetiva sendo da Clontech Co. o fabricante das enzimas de restrição. Para que os filamentos de DNA fossem degradados primeiro do seu terminal, a presença das bases protetivas pode proteger o sítio de restrição de ser danificado durante a manipulação. A modificação refere-se a um processo em que o fragmento de DNA é enzimaticamente digerido com uma enzima de restrição para remover as bases protetivas. A enzima de restrição e a T4 ligase utilizadas assim como os tampões de reação e sistemas experimentais utilizados foram todos da Clontech Co, que forneceu a introdução dos produtos correspondentes e os protocolos de operação padrão destes no seu sítio da web (http: //www. clontech. cam/).

[0054] A sequência do gene corretamente ligada na etapa 7 foi amplificada pela PCR, e o resultado do sequenciamento do gene foi compatível com a SEQ ID NO: 2. O gene resultante foi armazenado a -20° C para a ligação em um vetor de expressão.

Exemplo Comparativo 1: Preparação de um gene que codifica a glucoquinase humano do tipo selvagem (G261)

[0055] O gene que codifica a glucoquinase humano do tipo selvagem foi preparado de acordo com a sequência de nucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 1 com referência ao protocolo no Exemplo 1.

Exemplo 2: Construção de um vetor de expressão 1-1)Linearização do vetor plasmídico pIRES2-EGFP

[0056] O plasmídeo pIRES2-EGFP é uma estrutura circular (ver, na Figura 3) e necessita ser linearizado antes de transfectado em células. A enzima de restrição BstBI (TTCGAA) (New England Biolabs, NEB Co.) foi selecionado, porque a enzima tem uma única restrição no plasmídeo e assim a digestão de restrição não tem nenhum efeito sobre a expressão da proteína. O IRSE significa um sítio de entrada de ribossoma interno caracterizado em que, quando o IRSE está presente depois de uma ORF, uma outra sequência codificadora a seguir do IRSE é deixada ser traduzida depois que a tradução da ORF teria sido terminada. Assim, os dois genes que codificam as proteínas individualmente tendo uma ORF independente foram expressados como uma proteína de fusão. DNA plasmídico pIRES2-EGFP 10 μg Tampão de digestão de restrição 5 μl Enzima de restrição 10 Unidades Água desionizada constituir o sistema até 50 μl foram incubados a 37° C por 3 horas, submetidos à extração com fenol/ clorofórmio para dar o DNA total, precipitado pelo etanol anidro para produzir uma pelota de DNA. A pelota de DNA foi lavada com 70 % de etanol e re-dissolvido em água desionizada. Uma eletroforese em gel de agarose a 1,2 % foi realizada para detectar o peso molecular do plasmídeo e purificar o vetor plasmídico pIRES2-EGFP linearizado. O plasmídeo purificado foi armazenado a -20° C até usado. 1-2)Ligação do plasmídeo pIRES2-EGFP linearizado e o gene de interesse O vetor plasmídico pIRES2-EGFP 0,3 μg linear recuperado DNA do gene de interesse 3 μg (no Exemplo 1 ou Exemplo Comparativo 1) T4 ligase 10 unidades Tampão de Ligação 1,0 μl Água desionizada constituir o sistema até 10 μl foram incubados a 14° C por 12 h, submetidos à extração com fenol/ clorofórmio para dar o DNA total, precipitado pelo etanol anidro para produzir uma pelota de DNA. A pelota de DNA foi lavada com 70 % de etanol e re-dissolvida em água desionizada. O peso molecular do plasmídeo foi identificado pela eletroforese (ver a Fig. 1 quanto ao resultado da eletroforese do Exemplo 1, em que a linha 1 é o resultado da eletroforese para o DNA total ligado do Exemplo 1, linha 2 é o marcador do tamanho do peso molecular, e a faixa com um peso molecular maior do que 5000 na linha 1 é a faixa ligada com êxito) e os vetores plasmídicos pIRES2-EGFP que carregam os genes de interesse (no Exemplo 1 ou Exemplo Comparativo) foram individualmente purificados e recuperados. O plasmídeo purificado foi armazenado a -20° C até usado.

[0057] A enzima de restrição e a T4 ligase utilizadas assim como os tampões de reação e os sistemas experimentais utilizados foram todos da NEB Co, e manipulados de acordo com a introdução dos produtos correspondentes e os seus protocolos de operação padrão. 2) Construção de um vetor de expressão de adenovírus 2-1)O adenovírus humano sorotipo 5 e o adenovírus deletado em E1/E3 foram escolhidos no Exemplo para construir um vetor plasmídico transportador recombinante nas seguintes etapas. a) um plasmídeo transportador pShuttle2-CMV (BD Co.) foi fornecido (CMV denota o citomegalovírus); b) o plasmídeo na etapa a) foi duplamente digerido com enzimas de restrição EcoRV c) a desfosforilação de terminal foi realizada com fosfatos alcalinos intestinais de bezerro (CIP); d) o fragmento de vetor de 3,4 kb foi recuperado; e) o vetor plasmídico pIRES2-EGFP obtido nas etapas 1-2 acima foi duplamente digerido com enzimas de restrição EcoRV + NotI e o G262-IRES2-EGFP ou G261-IRES2-EGFP resultantes da digestão de restrição foram respectivamente ligados no fragmento de vetor plasmídico transportador obtido na etapa d) na presença de T4 ligase, gerando assim o plasmídeo transportador circular recombinante pShuttle2-CMV-G262-IRES2- EGFP ou o plasmídeo transportador circular recombinante pShuttle2-CMV- 0261-IRES2-EGFP; f) os plasmídeos transportadores obtidos na etapa e) foram digeridos com a enzima de restrição NheI, g) os terminais enzimaticamente clivados na etapa f) foram preenchidos com fragmento de Klenow da DNA polimerase I; h) o fragmento de 4,1 kb foi recuperado (o fragmento é um fragmento de DNA dentro do qual o gene exógeno foi inserido e do qual sequências parciais do vetor foram localizadas em ambos os terminais). 2-2)Identificação do plasmídeo transportador circular pShuttle2-CMV-G262-IRES2-EGFP ou o plasmídeo transportador circular pShuttle2-CMV-G261-IRES2-EGFP obtidos.

[0058] Os plasmídeos transportadores circulares pShuttle2-CMV-G262- IRES2-EGFP ou pShuttle2-CMV-G261-IRES2-EGFP foram enzimaticamente clivados com EcoRI. O produto resultante da digestão de restrição foi identificado em uma eletroforese em gel de agarose a 1,2 %; o clone positivo produziu duas faixas com peso moleculares de 4,7 kb e 2,8 kb, respectivamente, enquanto que o clone negativo produziu apenas uma faixa de 3,4 kb. O resultado de identificação foi mostrado na Fig. 6, em que M é um marcador de tamanho do peso molecular (as faixas na escada de DNA de 1 kb do topo para o fundo foram 8 kb, 7 kb, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1,6 kb, 1 kb, 517 bp, 396 bp, e 230 bp, respectivamente), Linhas 1 a 4 (duas amostras de pShuttle2-CMV-G261-IRES2-EGFP e duas amostras de pShuttle2-CMV- G262-IRES2-EGFP) todos representaram os clones positivos. 2-3)O CMV-GFP-IRES-GFP foi transferido de pShuttleGFP- CMV-TrkC no vetor de adenovírus pAd, gerando o plasmídeo recombinante de adenovírus pAd-GFP-G261 ou pAd-GFP-G262. Todos os plasmídeos em branco usados acima foram vetores comerciais adquiridos da Clontech Co. (http: //www. clontech. comt), e as condições experimentais e os kits usados foram todos kits comerciais. O kit usado na transferência foi O Sistema de Expressão Adeno-X 1 da Clontech (Clontech 631513), e a transferência foi implementada de acordo com o protocolo experimental fornecido pela Clontech Co. 2-4) Identificação dos plasmídeos recombinantes de adenovírus pAd-GFP-G261 e pAd-GFP-G262

[0059] A digestão de restrição com XhoI foi realizada nos plasmídeos recombinantes de adenovírus pAd-GFP-G261 e pAd-GFP-G262, respectivamente. O produto resultante da digestão de restrição foi identificado em uma eletroforese em gel de agarose a 1,2 %; o clone positivo produziu faixas com os seguintes pesos moleculares de 14 kb, 11,8 kb, 4,9 kb, 2,6 kb, 2,47 kb, 1,45 kb, e 0,6 kb, respectivamente, enquanto que o clone negativo produziu faixas com os seguintes pesos moleculares de 14 kb, 11,8 kb, 4 kb, 2,47 kb, 1,45 kb, e 0,6 kb, respectivamente. O resultado de identificação foi mostrado na Fig. 7, em que M é o marcador de tamanho do peso molecular (as faixas na escada de DNA de l kb do topo para o fundo foram 8 kb, 7 kb, 6 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1,6 kb, 1 kb, 517 bp, 396 bp, e 230 bp, respectivamente). As linhas 1 a 5 (duas amostras do plasmídeo recombinante de adenovírus pAd-GFP-G261 e três amostras do plasmídeo recombinante de adenovírus pAd-GFP-G262) todos representaram os clones positivos. 2-5)Empacotamento, amplificação, colheita e purificação do adenovírus recombinante

[0060] O DNA do adenovírus recombinante corretamente identificado na etapa 2-4) foi transfectado em células 239 para ser empacotado e depois o estoque viral foi armazenado. O adenovírus empacotado foi amplificado e depois o estoque viral foi armazenado (estoque viral secundário). Além disso, o estoque viral secundário amplificado foi submetido a dois ciclos de amplificação em escala grande. Depois que a amplificação foi completa, o vírus foi colhido e submetido à centrifugação de gradiente de densidade de CsCl para a purificação, e o CsCl residual na solução viral foi removido pela diálise.

[0061] A manipulação detalhada foi como segue: a) As células 293 (a célula renal embrionária humana transformada por E1) foram semeadas em uma ou duas placas de cultura de célula (60 mm) 24 h antes da transfecção, e cultivadas até a taxa de confluência de 50 a 70 % quando transfectadas; b) Antes da transfecção, o plasmídeo de interesse foi enzimaticamente clivado com PacI (6 μg de DNA para uma placa de cultura de célula de 60 mm). O plasmídeo enzimaticamente clivado foi precipitado pelo etanol e re-dissolvido em 20 μl de água estéril. c) As células foram transfectadas com 6 μg de plasmídeo tratado com PacI usando PE1 ou outros agentes de transfecção. d) Depois de 8 h de transfecção, o líquido misto de transfecção foi removido e 4 ml de meio de cultura completo de DMEM (contendo 10 % de CBS e 1 % de Pen/Estrep) foram adicionados; e) Depois de 7 a 10 dias da transfecção, as células foram retiradas por raspagem da placa de cultura e transferidas em um tubo cônico de 50 ml. Depois de centrifugado, as células foram recolocadas em suspensão em 20 ml de PBS ou o meio de cultura completo. A suspensão foi congelada em nitrogênio líquido e descongelada em um banho de água a 37° C com agitação vigorosa. A etapa foi repetida quatro vezes. Depois da centrifugação, o sobrenadante resultante foi armazenado a -20° C. f) As células 293 foram semeadas em uma placa de cultura de célula de 60 mm, cultivada a uma taxa de confluência de 50 a 70 %, e inoculadas com sobrenadante contendo vírus em porcentagem em volume de 30 a 50 %. A lise celular aparente e o efeito citopático (CPE) foram observados 3 dias após a infecção; g) Quando 1/3 a 1/2 das células descolaram e flutuaram, que foi usualmente 3 a 5 dias após a infecção, o vírus foi coletado. A presença do adenovírus recombinante pode ser confirmado ainda pela Western blot ou PCR (5 μl do sobrenadante contendo vírus foram adicionados em 10 μl de protease K de grau de PCR e incubados a 55° C por 1 h; depois, a amostra mista foi fervida por 5 minutos e centrifugada; 1 a 2 μl do sobrenadante resultante foram usados em uma reação de PCR). h) O sobrenadante contendo vírus foi coletado seguindo o protocolo na etapa f). Neste caso, um estoque viral com um título viral de pelo menos 107 virions/ml (partículas infecciosas/ml) pode tipicamente ser coletado. Cada ciclo da amplificação foi para elevar o título viral uma ordem de magnitude. i) Para mais amplificação, o sobrenadante contendo vírus obtido na etapa h) foi inoculada ainda nas células em uma placa de cultura de célula de 100 mm, o vírus resultante foi coletado de acordo com o protocolo na etapa f) e inoculado nas células 293 em uma placa de cultura de célula de 150 mm para obter quantidade suficiente da progênie viral. j) soluções a 15 % de CsCl e 40 % de CsCl foram sequencialmente adicionadas em um tubo de centrifugação de Beckman para formar uma solução de gradiente de CsCl. k) O sobrenadante contendo vírus com virions consequentemente enriquecidos foi gotejado sobre a solução de gradiente de CsCl. l) Uma ultracentrifugação foi realizada a 30000 rpm a 4° C por 16 h. m) Haviam duas faixas depois da centrifugação. A faixa superior com uma cor mais fraca conteve capsídeos de adenovírus primariamente vazios sem infectividade; enquanto que a faixa mais baixa com uma color mais brilhante conteve virions vivos em necessidade de serem coletados. A faixa mais baixa foi coletada com uma agulha de calibre 16. n) A coleta foi dialisada contra um TBS (10 mM de Tris, 0,9 % de NaCl, pH 8,1) por 1 h e depois contra o TBS contendo 10 % de glicerol duas vezes (uma hora por vez) para remover o CsCl; o) O adenovírus purificado foi aliquotado em tubos EP. p) A quantidade da proteína total no dialisado foi determinada em um espectrofotômetro de Eppendorf (Biofotômetro de Eppendorf) com 1 μg de proteína viral correspondendo a 4 x 109 virions. q) Para a armazenagem de longa duração, armazenado a -70° C, para a armazenagem de curta duração, a 4° C; a quantidade do estoque de reserva não foi menor do que 1E+11 unidades VP/recipiente de alíquota depois da aliquotagem; os meios de amplificação em larga escala descritos acima para atingir a quantidade do vírus acima de 1E+12 unidades VP/recipiente de alíquota. r) Visto que existe diferença na eficiência de infecção do adenovírus para linhas de célula diferentes e o efeito citotóxico do virion é levado em conta, a dosagem viral necessária é determinada usualmente pelo método de diluição de gradiente em série. As células alvo foram infectadas com o virion em quantidade relativa ao número de célula 1:1, 10:1, 100:1, e 1000:1; Polibreno (polimetobrometo de 1,5-dimetil-1,5-diazaundeca- metileno) foi adicionado em volume relativo ao meio 1:1000. A placa foi centrifugada a 37° C por 30 min. s) O meio foi substituído 8 a 12 h após a infecção e o vírus foi coletado. 2-6)Controle de qualidade no empacotamento do adenovírus recombinante. A quantidade total de vírus infeccioso > 1,05 x 1012 PFU/3 ml 2-7)Armazenagem do adenovírus recombinante Tampão de armazenagem: 4 % de sacarose, 2 mM de MgCl2, 10 mM de Tris, pH 8,0 Temperatura de armazenagem: -80° C Exemplo 3: Transfecção da célula min-6 1. O meio basal para as células min-6 DMEM (Gibco 11995) 830 ml FBS (Gibco. US) 150 ml PIS 10 ml Hepes (1M) 10 ml β-mercaptoetanol 10 μl

[0062] As placas de Petri tiveram a sua superfície não tratada para o cultivo de célula e foram todos frascos ficol.condições de incubação 37° C; 5 % de CO2; 95 % de umidade relativa

[0063] Os vetores plasmídicos pIRES2-EGFP preparados no Exemplo 2 que carregam o gene de interesse (Exemplo 1 ou Exemplo Comparativo 1) foram transfectados na linhagem de célula amin6 de acordo com o protocolo da Lipofectamina 2000 (Invitrogen). As etapas foram como segue: Dia 1: As células congeladas em nitrogênio líquido foram revividas e semeadas em um frasco de cultura de 25 cm2. Dia 2: O meio de cultura é substituído. Dia 3: As células foram digeridas com uma solução a 0,2 % de tripsina (Gibco) uma vez cultivado até a taxa de confluência de 90 % e semeada em uma placa de 6 reservatórios a uma densidade de 2 x 105 células/ml (com o antibiótico retirado neste momento). Dia 4: 4 μg dos vetores linearizados, 10 μl de Lipofectamina, e Opti-M até 100 μl foram misturados e deixados sozinhos na temperatura ambiente por 10 minutos. Todas as misturas foram adicionadas no meio de cultura para as células min6 e misturadas suavemente até a homogeneidade. A mistura resultante foi deixada sozinha a 37° C em 5 % de CO2 a 95 % de umidade relativa por 24 h. Ao mesmo tempo, um controle negativo foi montado. Dia 5: O meio de cultura é substituído. (O meio de cultura contendo o antibiótico pode ser usado alternativamente). Dia 6: O meio de cultura é substituído e suplementado com o antibiótico 6418 (400 μg/ml) para triar as linhagens de célula estavelmente transfectadas (ver na Fig. 5, Foi observado sob um campo escuro que a proteína fluorescente verde foi expressada) por 8 dias sucessivos.

[0064] Depois que uma linhagem de célula que expressa estavelmente a proteína GCK exógena foi triada, foi identificada ao seu nível genômico pela PCR. Para este propósito, o inventor da presente invenção designou um par de iniciadores específicos para a sequência de vetor (iniciador avançado: 5’- GCGGAGAAGCCTTGGATATT-3’; iniciador reverso: 5’- TTTGATAGCGTCTCGCAGAA-3’), e foi confirmado pelos experimentos e alinhamento de sequência que os iniciadores foram incapazes de iniciar a amplificação do genoma de uma linhagem de célula min-6, mas capaz de produzir um amplicon do tamanho de 653 pares de base do vetor introduzido. O inventor também designou um par de iniciadores específico para o genoma min-6 (iniciador avançado: 5’-CAAGCCCTGTAAGAAGCCACT-3’; iniciador reverso: 5’-TGCTTCCAGCTACTTGAGGTC-3’), e também foi confirmado pelos experimentos e alinhamento de sequência que os iniciadores foram incapazes de amplificar qualquer produto específico do vetor introduzido e capaz de produzir um produto do tamanho de 956 pares de base do genoma de uma linhagem de célula min-6.

[0065] Portanto, dois produtos amplificados com tamanho diferente pode ser observado depois da amplificação do genoma min-6 que carrega o DNA exógeno (Ver na Fig. 4). Extração de DNA genômico de células min-6 Formulação dos reagentes em necessidade Tampão de lise da proteinase K (Tampão de proteinase K SNET) 20 mmol/L Tris-Cl (pH 8,0) 5 mmol/L de EDTA (pH 8,0) 400 mmol/L de NaCl 1 % (m/v) de SDS 400 μg/ml de Proteinase K

[0066] As células foram digeridas com proteinases pancreáticas antes da extração do DNA genômico de acordo com as seguintes etapas: A A proteinase foi adicionada e incubada a 56° C durante a noite. B Etanol anidro em volumes de duas vezes foi adicionado e agitado uniformemente até a homogeneidade. C A mistura resultante foi deixada sozinha a -80° C em um refrigerador. D A centrifugação a 12000g foi realizada por 15 min E O sobrenadante foi descartado. F A pelota de DNA foi lavada com 75 % de etanol. G A centrifugação a 12000g foi realizada por 10 min. H A pelota de DNA foi lavada com 75 % de etanol. I A centrifugação a 12000g foi realizada por 10 min. J A pelota de DNA foi secada. K A pelota de DNA foi dissolvida em água purificada.

[0067] O DNA foi quantificado com um espectrofotômetro de UV e diluído com água purificada de acordo com a concentração de DNA para fornecer uma concentração de DNA final de 50 ng/μl para uma solução de trabalho. A solução de estoque foi armazenada em um refrigerador a -20° C até pronto para o uso, e a sua diluição foi armazenada, em um refrigerador a 4° C e serviu como um padrão de PCR útil em uma reação de PCR. Sistema de reação de PCR de 10 μl 10x tampão de PCR (isento de Mg2+) 1,0 μl dNTP (25 mM) 0,2 μl MgCl2 (25 mM) 1,0 μl Iniciador 1 (Avançado/Reverso) 1,0 pmol Iniciador 2 (Avançado/Reverso) 1,0 pmol DMSO (Sulfóxido de dimetila) 0,5 μl AmpliTaq Gold DNA polimerase 0,05 μl (5 U/μl) DNA genômico padrão (50 ng/μl) 2,0 μl H2O constituída até 10,0μl do sistema total Programa de reação TouchDown de PCR 1 = 95° C durando 8 min 2 = 94° C durando 30 s 3 = 68° C durando 1 min -1,0° C por ciclo 4 = 72° C durando 45 s 5 = voltar para 2, 12 ciclos 6 = 95° C durando 30 s 7 = 54° C 1 durando 5 s 8 1 s por ciclo 9 = 72° C durando 45 s 10 = voltar para 6, 30 ciclos 11 = 72° C durando 60 min 12 = 4° C durando a manutenção (constantemente)

[0068] O produto amplificado pela PCR foi identificado pela eletroforese em gel de agarose a 1,2 %. O resultado de identificação foi mostrado na Fig. 4, em que a Linha 0 é: plasmídeo G262; Linha 1: genoma de G261min-6, Linha 2: genoma de G261min-6, Linha 3: genoma de G262min- 6, Linha 4: genoma de G262min-6, Linha 5: plasmídeo G261, Linha 6: plasmídeo G261, Linha 7: genoma de min-6 do tipo selvagem, Linha 8: controle negativo (água), Linha 9: controle negativo (água), Linha 10: plasmídeo G262, Linha 11: genoma de min-6 do tipo selvagem, Linha 12: genoma de G261min-6, Linha 13: genoma de G262min-6, e Linha M: DNA marcador de tamanho do peso molecular. 2. As células min-6 foram semeadas uniformemente em uma placa de 12 reservatórios com a replicação em quatro reservatórios por amostra. As células foram sincronizadas pela privação de soro: o sobrenadante de cultura foi retirado por pipetagem, as células foram lavadas duas vezes com tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer isento de açúcar (KRBB) e pré-tratado com KRBB+ 0,1 % de BSA isentos de açúcar por 2 h. a formulação para o meio de KRBB+ 0,1 % de BSA isento de açúcar foi como segue: KRBB 1 L NaCl 6,9496 g KCl 354 mg NaHCO3 420 mg MgSO4 144,4 mg KH2PO4 160,6 mg HEPES 4,766 g CaCl2 anidro 281,915 mg PH 7,4 BSA 0,1 % (concentração final) 3. O sobrenadante de cultura foi retirado por pipetagem, e depois as células foram tratadas com KRBB G2,8+0,1 % de BSA ou KRBB G25 + 0,01 % de BSA por 1 hora, em que o G2,8 indicou a concentração de glicose de 504,448 mg/L e G25 indicou a concentração de glicose de 4,504 g/L. 4. O sobrenadante foi coletado de 3 reservatórios e armazenado a -20° C até ser ensaiado. 5. As células no quarto reservatório foram digeridas com e contadas em um hemocitômetro para calcular estatisticamente o número da célula em cada amostra. 6. As intensidades de secreção de insulina das células min-6 sob a condição de concentrações de glicose altas foram determinadas pelo radioimunoensaio.

[0069] No radioimunoensaio, existe uma relação funcional entre o teor de insulina na amostra e a contagem em cpm de 125I na amostra. Portanto, uma curva padrão deve ser plotada em cada experimento para calcular uma relação funcional entre o teor de insulina e a contagem em cpm de 125I.

[0070] Preparação de uma curva padrão e medição das amostras Tabela 1 Teor de insulina e contagem em cpm de 125I nos padrões

[0071] Como mostrado na Fig. 2, com base no teor de insulina e contagem em cpm de 125I nos padrões, a relação funcional entre a unidade de insulina (μunidade/ml) X e a contagem de 125I Y foi estabelecida como segue: y = -1649,8 Ln (x) + 10590 Fórmula 1 Assim, x = exp[(10590 - y)/1649,8] Fórmula 2

[0072] As contagens em cpm de 125I nos sobrenadantes das culturas do tipo selvagem, G261min-6, e G262min-6 foram de fato determinadas e depois foram convertidas para quantidades da insulina secretada pelo cálculo com a Fórmula 2.Tabela 2A quantidade da insulina secretada

[0073] Pode ser observado da Tabela 2 que o G262 exibe um efeito de promover significantemente a secreção da insulina, que sugere que a atividade da glucoquinase do G262 é significantemente mais alta do que aquela da do tipo selvagem.

Exemplo 4: Experimento in vivo do adenovírus recombinante em animais 1. Criação do animal experimental (rato GK)

[0074] Os ratos GK como o animal experimental foram adquiridos da National Rodent Laboratory Animal Resources, Shanghai Branch, China. Como um animal experimental, os ratos GK, os ratos SLACIGK que sofrem da diabete tipo 2, foram criados em 1975 pela Tohoku University. Eles foram estabelecidos pela triagem de indivíduos hiperglicêmicos dentre os ratos WISTAR híbridos. A fêmea atinge maturação sexual em 8 a 10 semanas de idade e o macho em 10 a 12 semanas de idade. O período de gestação dura de 21 a 23 dias, o tamanho da ninhada é de 7 a 9, a taxa de concepção é de 60 %, e a lactação dura por 28 dias. os ratos GK são amplamente usados na investigação da diabete melito não dependente de insulina (NIDDM, diabete tipo II).

[0075] Depois do início da urina diabética, a hiperglicemia, secreção de insulina atenuada, etc. aparecem rapidamente em ratos GK, que são complicadas pela retinopatia, microangiopatia, neuropatia, nefropatia em estágios posteriores. Ao contrário dos outros modelos de animal roedor de diabete tipo II, o rato GK é um modelo não obeso. 20 dos ratos GK de 10 semanas de idade foram escolhidos no Exemplo e dado acesso ad libitum a alimento e água por uma semana.

2. Administração do adenovírus recombinante do Exemplo 2 (1) Formulação da injeção

[0076] Um conjunto de tampões de fosfato foi formulado respectivamente de acordo com as doses mostradas na Tabela 3, e depois esterilizados a 121° C por 60 min. Sob condição estéril, o estoque de adenovírus recombinante das etapas 2 a 6 no Exemplo 2 foi filtrado com uma membrana de filtro millipore de 0,45 μm. Os fragmentos celulares foram removidos. O filtrado foi coletado em um tubo de centrifugação estéril e centrifugado a 8000 r/min por 1 h. O sobrenadante foi descartado. A pelota viral resultante foi disperso nos tampões de fosfato autoclavados acima com base nos títulos mostrados na Tabela 3, produzindo as injeções da presente invenção. Tabela 3

[0077] O adenovírus recombinante pAd-GFP-G261 ou pAd-GFP-G262 do Exemplo 2 foi respectivamente injetado uma vez ao dia em uma dosagem de 1010 pfu/Kg de peso corporal através da veia caudal por 3 dias sucessivos. Cada formulação foi injetada em dois ratos.

(2) Método para ensaiar a glicose sanguínea

[0078] O ensaio de glicose sanguínea foi realizado em 0,5 ml da amostra de sangue coletada da veia ocular angular de rato, usando o monitor de glicose sanguínea HEA-214 da OMRON de acordo com a instrução do fabricante.

(3) Resultados para a determinação de glicose sanguínea em ratos

[0079] Os animais injetados com o vetor viral recombinante que expressa a glucoquinase do tipo selvagem (G261) foram numerados 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10. Os animais injetados com o vetor viral recombinante que expressa a glucoquinase mutante (G262) foram numerados 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, e 20. As amostras de sangue em branco foram coletadas de todos os ratos e ensaiados quanto ao nível de glicose sanguínea antes da injeção. As amostras de sangue após a injeção foram coletadas 8 vezes em vários estágios e ensaiadas quanto ao nível de glicose sanguínea. Os pontos de tempo para a amostragem e os resultados determinados foram mostrados nas Tabelas 4 e 5.

Pode ser observado a partir dos dados registrados nas Tabelas 4 e 5 que a atividade da glucoquinase humana mutante in vivo da presente invenção para diminuir o nível de glicose sanguínea e a sua estabilidade são muito melhores do que aquelas da glucoquinase humana do tipo selvagem. O nível de glicose sanguínea no modelo de rato de diabete melito tipo II pode ser eficazmente controlado injetando-se no corpo animal o adenovírus recombinante que compreende o gene que codifica a glucoquinase humana mutante da presente invenção, permitindo assim o tratamento da diabete melito através da secreção eficazmente crescente da insulina.

Claims

1. Gene isolado que codifica glucoquinase humana, caracterizado pelo fato de que o dito gene tem a sequência de nucleotídeo como mostrada na SEQ ID NO: 2.

2. Vetor recombinante que compreende um vetor e um gene de interesse carregado nele, caracterizado pelo fato de que o dito gene de interesse é o gene que codifica a glucoquinase humana como definido na reivindicação 1.

3. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito vetor é selecionado do grupo que consiste de um vetor de clonagem, vetor de expressão eucariótica, vetor de expressão procariótica, e vetor transportador.

4. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito vetor é um vetor de adenovírus.

5. Hospedeiro, caracterizado pelo fato de que o dito hospedeiro é ESCHERICHIA COLI QUE compreende o vetor recombinante como definido na reivindicação 4.

6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável e o vetor recombinante como definido na reivindicação 4.

7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica é um fluido de injeção que compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável e o vetor recombinante como definido na reivindicação 4.

8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o dito excipiente farmaceuticamente aceitável é um tampão de fosfato com um valor de pH de 4,0 a 9,0; e 102 a 1010 cópias do dito vetor recombinante são compreendidos em um mililitro do fluido de injeção.

9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o dito fluido de injeção compreende ainda um protetor e/ou um regulador osmótico; o teor do dito protetor é de 0,01 a 30 % em peso com base no fluido de injeção, o dito protetor é um ou mais selecionados de inositol, sorbitol e sacarose; o teor do dito regulador osmótico possibilita que a pressão osmótica da injeção seja de 200 a 700 mOsm/kg com o regulador osmótico sendo cloreto de sódio e/ou cloreto de potássio.

10. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento para prevenir e tratar a diabete melito.

11. Composição farmacêutica de acordo a reivindicação 6 caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento para prevenir e tratar a diabete melito.