BRPI1005702A2 - mÉtodo para aumentar a taxa de implantaÇço de embriÕes no étero materno em mamÍferos, uso de uma quantidade eficaz de uma lectina ligante de beta-galactosÍdeo ou derivados da mesma, lectina ligante de beta-galactosÍodeo ou derivados e produto - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA AUMENTAR A TAXA DE IMPLANTAÇçO DE EMBRIÕES NO éTERO MATERNO EM MAMÍFEROS, USO DE UMA QUANTIDADE EFICAZ DE UMA LECTINA LIGANTE DE BETA-GALACTOSÍDEO OU DERIVADOS DA MESMA, LECTINA LIGANTE DE BETA-GALACTOSÍDEO OU DERIVADOS E PRODUTO. A presente invenção refere-se a um método para aumentar a taxa de implantação de embriões no útero materno em mamíferos, por meio do fornecimento ao útero do mamífero uma quantidade eficaz de uma lectina ligante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma, bem como a um produto compreendendo dita lectina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA AUMENTAR A TAXA DE IMPLANTAÇÃO DE EMBRIÕES NO ÚTE- RO MATERNO EM MAMÍFEROS, USO DE UMA QUANTIDADE EFICAZ DE UMA LECTINA LIGANTE DE BETA-GALACTOSÍDEO OU DERIVA- DOS DA MESMA, LECTINA LIGANTE DE BETA-GALACTOSÍDEO OU DERIVADOS E PRODUTO". Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um método para aumentar a ta- xa de implantação de embriões no útero materno em mamíferos, por meio do fornecimento ao útero do mamífero uma quantidade eficaz de uma Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma, bem como a um pro- duto compreendendo dita lectina. Descrição do estado da técnica

A agropecuária brasileira desempenha um papel importante no cenário econômico nacional, dada a sua representatividade atual no Produto Interno Bruto e contribuição positiva para a balança comercial brasileira.

Para ser rentável no mercado agropecuário, qualquer proprieda- de precisa manter a eficiência reprodutiva dos animais criados a fim de a- tender as exigências dos consumidores por produtos de alta qualidade. Nes- se sentido, a manutenção de índices satisfatórios de nascimentos é o ponto fundamental da cadeia de eventos que resulta no lucro de uma propriedade agropecuária. Manter a reprodução em níveis ideais, todavia, é um processo quase sempre complicado devido às taxas de perdas embrionárias no início da gestação.

A reprodução pode ser definida como a concepção de seres da

mesma espécie após uma seqüência de eventos fisiológicos que, por sua vez, dependem de uma multiplicidade de fatores. A aplicação de biotécnicas de reprodução avançadas no setor agropecuário pode auxiliar no melhora- mento genético animal e, consequentemente, aumentar o potencial de pre- nhez (implantação de embriões no útero materno), de forma a permitir que o animal obtenha o máximo de produtividade durante a sua vida útil. Entretanto, no mundo todo, a perda embrionária é uma das cau- sas mais comuns de prejuízo econômico para os pecuaristas, e prevenir a mortalidade embrionária precoce ainda é um desafio diante dos mecanismos complexos que envolvem o diagnóstico e a manutenção da gestação.

O diagnóstico precoce que identifica a taxa de implantação de

embriões no útero materno em mamíferos é uma ferramenta importante em procedimentos agropecuários, pois viabiliza a tomada de providências futu- ras e minimiza possíveis perdas econômicas. Nesse sentido, novas tecnolo- gias têm sido aperfeiçoadas a partir de um melhor conhecimento da fisiolo- gia reprodutiva ovariana desses animais, visando a atingir melhores resulta- dos reprodutivos e a redução no valor dos tratamentos.

A popularização das biotécnicas de reprodução assistida, a e- xemplo da fertilização de bovinos em laboratório, vem acontecendo de ma- neira gradual e tem sido motivada principalmente por necessidades merca- dológicas. O eficiente desempenho reprodutivo de um animal está direta- mente ligado ao nascimento de um grande número de terneiros (crias de vacas) do sexo feminino em raças com aptidão leiteira e do sexo masculino em raças com aptidão para corte, possibilitando assim o retorno econômico para as propriedades rurais. Outros fatores de mercado, como a forte pressão do consumidor

mundial por qualidade, escala e padronização dos produtos de origem ani- mal, somados à própria competição por espaço entre a pecuária, a agricultu- ra e a bioenergia contribuem para uma maior produtividade, provocando um crescimento acelerado das biotécnicas de reprodução. Nessa lógica que envolve o mercado globalizado de produção e

consumo de produtos primários, a agropecuária brasileira tem nas técnicas de reprodução assistida um forte aliado para elevar a produtividade média dos rebanhos, vez que permitem aumentar substancialmente a quantidade de nascimentos de animais geneticamente superiores. As principais técnicas de reprodução utilizadas nas propriedades

rurais envolvem a (i) monta natural ou reprodução natural, (ii) inseminação artificial, (iii) produção in vivo seguida da transferência de embriões e (iv) produção in vitro seguida da transferência de embriões. Independentemente da técnica empregada, o principal objetivo do método de reprodução é per- mitir o aproveitamento máximo da espécie reprodutora, propiciando resulta- dos positivos.

O montante natural é uma técnica bastante utilizada pelo fato de

incorrer em menos despesas aos proprietários rurais, porém apresenta como limitação a dificuldade no controle de doenças sexualmente transmissíveis e menor velocidade no ganho genético dos rebanhos. Neste procedimento, os embriões gerados são compostos por 50% do material genético do pai (e, portanto, diferente do material genético da mãe), podendo acarretar na for- mação de um número elevado de aloantígenos, o que pode implicar em per- da embrionária caso não haja tolerância materno-fetal.

Aloantígeno é qualquer molécula codificada pelo material genéti- co proveniente de outro organismo de mesma espécie que, por ser diferente e quando introduzido noutro organismo, induz o sistema imunológico deste a produzir uma série de respostas em defesa ao material "estranho". Como exemplo, cita-se o embrião recém-fecundado que contém metade do seu material genético de origem materna e a outra metade de origem paterna, sendo que esta última metade pode ser estranha ao sistema imune da mãe, tornando-se, portanto, vulnerável à rejeição do organismo materno. A au- sência da tolerância imunológica materno-fetal (processo pelo qual o orga- nismo materno reconhece/aceita o feto sem que, para tanto, seja disparada uma resposta contra a sua permanência) é um dos principais motivos que conduzem ao aborto precoce. Outra biotécnica de reprodução bastante utilizada no setor agro-

pecuário é a técnica de inseminação artificial (IA) que, por sua vez, refere-se à deposição do sêmen (espermatozóide/gameta masculino e plasma semi- nal) no aparelho reprodutor feminino de forma artificial, com técnicas especí- ficas desenvolvidas para adequação às particularidades anatômicas de cada fêmea. O sucesso da IA é mensurado pela taxa de prenhez - ou número de fêmeas com gestação positiva em relação ao número de fêmeas insemina- das. Neste procedimento, os embriões gerados também são compostos por 50% do material genético do pai (e, portanto, diferente do material genético da mãe), podendo acarretar na formação de um número elevado de aloantí- genos, implicando, portanto, nos mesmos riscos de perda embrionária caso não haja tolerância materno-fetal.

Adicionalmente, a técnica de produção in vivo seguida da trans-

ferência de embriões (TE) refere-se à biotécnica de reprodução na qual vá- rios embriões são gerados no genital de uma fêmea doadora (aquela que doa o material genético) e transferidos ao útero de fêmeas receptoras da mesma espécie, as que serão responsáveis pela gestação chegar a termo. A geração de embriões no útero das doadoras envolve técnicas de superovu- lação, inseminação artificial e colheita dos embriões. Após a colheita (flu- shing), os embriões serão avaliados e aqueles de boa viabilidade poderão ser inovulados ou criopreservados. A inovulação (deposição) dos embriões produzidos in vivo no útero ou corno uterino das receptoras depende dos processos de sincronização de estro (adaptar o útero da receptora à mesma fase de desenvolvimento ou estágio embrionário). Neste procedimento, os embriões inovulados no organismo das receptoras são compostos por até 100% de aloantígenos (material genético diferente), pois são integralmente oriundos tanto do material genético das doadoras como do material genético paterno, o que pode implicar em maiores riscos de perda embrionária caso não haja tolerância materno-fetal das receptoras.

Por outro lado, a técnica de produção in vitro seguida da transfe- rência de embriões refere-se à geração de embriões em laboratório que se- rão transferidos ao útero de fêmeas receptoras da mesma espécie, as que serão as responsáveis pela gestação chegar a termo. A geração dos embri- ões em laboratório depende (i) da aspiração de oócitos no ovário das doado- ras através de punção folicular guiada por ultrassonografia; (ii) MIV - matura- ção oocitária in vitro seguida de indução in vitro dos mesmos eventos de ma- turação de citoplasma e núcleo oocitário, preparando o óvulo para a fecun- dação; (iii) FIV - fecundação in vitro ou processo de singamia dos oócitos maduros e espermatozoides capacitados; (iv) CIV - cultivo in vitro de embri- ões após a fecundação, até atingirem o estágio (mórula e/ou blastocisto) necessário para a transferência ou inovulação depois de 5-7 dias de cultivo; (v) inovulação, quando após o período de cultivo, os embriões serão avalia- dos e os de boa viabilidade poderão ser inovulados, criopreservados e/ou vitrificados. A inovulação dos embriões produzidos in vitro no útero ou corno uterino das receptoras também depende dos processos de sincronização de estro (adaptar o útero da receptora à mesma fase de desenvolvimento ou estágio embrionário). Neste procedimento, os embriões inovulados no orga- nismo das receptoras são compostos por até 100% de aloantígenos (materi- al genético diferente), pois são integralmente oriundos tanto do material ge- nético das doadoras como do material genético paterno, o que pode implicar em maiores riscos de perda embrionária caso não haja tolerância materno- fetal das receptoras.

Conforme descrito acima, a tolerância materno-fetal é um pro- cesso imunológico que regula a resposta preparada pelo organismo materno contra o embrião ou feto. O sistema imunológico de um organismo é respon- sável por um conjunto complexo de reações a fatores externos e/ou agresso- res que possam perturbar seu estado fisiológico habitual.

As respostas imunorregulatórias durante o período de gestação são eventos decorrentes da ovulação, cópula e até da própria fecundação, visando, sobretudo, o crescimento e o desenvolvimento do concepto (embri- ão ou feto e membranas associadas).

Nesse sentido, Lewis, S.K. et ai, 2007 (em Galectin 15 [LGALS15]: A Gene Uniquely Expressed in the Uteri of Sheep and Goats that Functions in Trophoblast Attachment) observaram que, nos ruminantes, o embrião em estágio de MO (mórula, entre dias 4-6) entra no útero e continua o seu desenvolvimento para o estágio BL (blastocisto, entre os dias 6-7), contendo então uma monocamada de células denominadas de trofectoder- ma. Após o rompimento da zona pelúcida até o dia D12 (12° dia) em ove- lhas, ou D15 (15° dia) em cabras, os embriões permanecem na fase da e- longação. Durante essa fase o trofectoderma produz o interferon tau (IFNT) que, por sua vez, é responsável pela inibição da luteólise (regressão do cor- po lúteo). Estando o corpo lúteo (folículo ovariano) ativo, a produção de pro- gesterona (Ρ4) é mantida e o endométrio (membrana mucosa que reveste a parede uterina) é preparado para uma possível gravidez. O estudo afirma ainda que a P4 e IFNT regulam a transcrição do gene da Galectina 15 no epitélio endometrial. A Galectina 15 teria a ação no ambiente uterino, pois esta Galectina participa da fixação/adesão do trofectoderma do concepto ao endométrio do útero, estimulando assim respostas biológicas como a adesão e a migração, eventos críticos na fase de elongação do blastocisto e, conse- quentemente, na evolução da gestação.

Em um segundo momento, de acordo com o estudo de Farmer, J.L. et al, 2008 (em Galectin 15 (LGALS15) functions in trophectoderm mi- gration and attachment), a Galectina 15 estimularia a proliferação celular e a inibição de apoptose celular, ocorrências também importantes para a fase de implantação. Foi comprovado por estes autores que, muito embora o gene da Galectina 15 esteja presente nas espécies ovina, caprina e bovina, o mRNA (RNA mensageiro) da Galectina 15 é expressado na fase de elonga- ção somente de ovinos e caprinos, cuja expressão varia de acordo com fase do ciclo estral. Adicionalmente, verificou-se que a administração via uterina de IFNT exógeno aumentaria a expressão gênica da Galectina 15 somente se a fêmea recebesse um tratamento com P4, o que comprova a necessida- de conjunta da presença do IFNT e da P4 como indutores da transcrição do mRNA da Galectina 15.

Satterfield, M.C. et al, 2006 (em Progesterone Regulation of Pre- implantation Conceptus Growths and Galectin 15 [LGALS15] in the Ovine Uterus) concluíram que a P4 atua como indutor da expressão gênica de di- versas proteínas secretadas pelo endométrio, dentre elas a Galectina 15 e a Fosfoproteína 1 Secretada (SPP1), estas que são consideradas agentes re- guladores da sobrevivência e do crescimento do concepto, bem como da adesão celular durante a fase de implantação. Nesse sentido, o estudo de Burghardt, R.C. et al, 2009 (em Enhanced focai adhesion assembly reflects increased mechanosensation and mechanotransduction at maternal - con- ceptus interface and uteríne wall during ovine pregnancy) menciona que a SPP1 e a Galectina 15 são mecanossensores da interface entre concepto e ambiente uterino.

Em outra linha de raciocínio, a pesquisa conduzida por Than, N.G. et al, 2008 (em Emergence of hormonal and redox regulation of galec- tin-1 in placental mammals: Implication in maternal-fetal immune tolerance) concluiu que a Galectina 1 apresenta um alto grau de conservação estrutu- ral, dimerização e propriedades de ligação com carboidratos e integrinas (proteínas de adesão), sugerindo que essas propriedades são conservadas entre os vertebrados e que mantêm um padrão de expressão gênicas entre os diferentes tipos de placenta (decíduas ou não). Os autores observaram também que a Galectina 1 pode conferir imunotolerância maternal aos alo- antígenos fetais, regular a ação das células Natural Killer (NK) do útero e agir como agentes reguladores e moderadores das células T (células envol- vidas na imunidade celular). Corroboram ainda com constatação da ação sinérgica da P4 na estimulação da produção de Galectina 1 pelo endométrio. Diante de pesquisas focadas em estudos de fertilidade, é possí-

vel verificar que a participação das Galectinas está associada à modulação de resposta imunológica e a eventos de elongação do embrião e de adesão dele ao endométrio.

As Galectinas são conhecidas como Iectinas de mamíferos Iigan- tes de beta-galactosídeos e podem ser expressas por uma grande variedade de tecidos. Essas Iectinas são geralmente solúveis e não possuem peptídeo sinal, sendo secretadas por mecanismo independente do retículo endoplas- mático e do complexo de Golgi. Até o presente momento foram descritas 15 Galectinas derivadas de mamíferos, todas com domínio de reconhecimento de carboidrato com aproximadamente 130 resíduos de aminoácidos.

É sabido que, no espaço extracelular, a interação das Galectinas com glicanas das superfícies de células do sistema imunológico pode pro- mover a modulação da produção de citocinas e mediadores, adesão celular, apoptose, quimiotaxia e endocitose. Já no ambiente intracelular, as Galecti- nas podem participar de vias de sinalização e modular algumas respostas biológicas, como apoptose, regulação do crescimento celular e "pre-mRNA splicing" (processamento de RNA mensageiro). Farmer, J.L. et al, 2008 (em artigo supracitado) descrevem ainda que, além da Galectina 15 e Galectina 1, outras Galectinas podem ser ex- pressas pelo endométrio e pela placenta dos mamíferos, apresentan- do funções importantes na diferenciação do endométrio, implantação do blastocisto e diferenciação do trofoblasto; do mesmo modo que Poppovich et al, 2005 (em Galectin-9: a new endometrial epithelial marker for the mid- and late- secretory and decidual phases in human) descrevem as propriedades da Galectina 9 e Lee et al, 1998 (em Spatio-temporal pattern for expression of galectin-3 in the murine útero-placental complex? Evidence for differential regulation) referem-se à expressão da Galectinas 3. Ademais, há na literatu- ra, diversos outros artigos reportando o potencial uso terapêutico de Galecti- nas recombinantes ou inibidores específicos dessas proteínas.

A Galectina 1 é uma molécula multifuncional que participa de processos biológicos como adesão, proliferação, diferenciação e ciclo celula- res; apoptose; processamento de RNA; controle do processo inflamatório e da resposta imunológica adaptativa. A expressão da Galectina 1 endógena já foi observada em células epiteliais do timo, células T primadas com antí- geno, macrófagos ativados, células B (células envolvidas na imunidade hu- moral) ativadas, células endoteliais, células do estroma e órgãos Iinfoides murinos como o timo e linfonodo. Em razão de suas propriedades imunorre- gulatórias, a Galectina 1, seja ela endógena ou exógena, é um importante mediador da prevenção da perda fetal e/ou mortalidade embrionária.

A Galectina 1 pode ser obtida de mamíferos (espécie humana, bovina, ovina, caprina, eqüina e/ou suína), por meio de sistema de expres- são heteróloga na forma ativa, estéril, alquilada e livre de endotoxina. A me- todologia para obtenção da Galectina 1 recombinante é amplamente conhe- cida da literatura e geralmente envolve as etapas de (i) obtenção do extrato bruto bacteriano contendo Galectina 1, (ii) purificação da Galectina 1, (iii) preservação da atividade lectínica da Galectina 1 por alquilação com ioada- cetamida, e (iv) remoção de endotoxina bacteriana (LPS) de preparações de Galectina 1 alquiladas por iodoacetamida. Dentre as possibilidades disponí- veis na literatura, para os testes realizados no presente experimento, produ- zimos a Galectina 1 com base nos procedimentos descritos a seguir.

A primeira etapa para a obtenção da Galectina 1 recombinante inicia com a cultura de bactérias (preferencialmente E. coli cepa rosetta), transformadas com vetor de expressão (preferencialmente plasmídio pET29a) contendo o gene completo da Galectina 1, em 200mL de meio LB Broth Base (Invitrogen, Gibco, Carlsbad, CA, EUA) contendo 50pg/mL de ampicilina (USB Corporation, EUA), que é realizada em um agitador orbital a 200rpm, por 16-18 horas a 37°C. Após este período são transferidos 25ml_ desta cultura para 1L de meio LB1 previamente autoclavado contendo 500μ1_ de amplicilina (50pg/mL). Em seguida, esta suspensão bacteriana é nova- mente incubada em agitador orbital a 200rpm por 2 horas a 37°C. A taxa de crescimento bacteriano considerada ótima é aquela que apresentar densida- de óptica (DO), em 600nm, entre a faixa de 0,5-0,5. Em seguida, adiciona-se à cultura 0,36g de isopropil-D-tiogalacto-piranozídeo (IPTG, Promega, Wl, EUA) diluído em 1mL de meio LB, para a indução da expressão da Galectina 1 pelas bactérias transformadas. O cultivo é novamente realizado no agita- dor (37°C - 250 a 300rpm) por 4 horas. Após este período, a suspensão bac- teriana é centrifugada a 5000g por 15-20 minutos a 4°C e o pélete da cultura novamente centrifugado a 3000g por 15-20 minutos a 4°C. Finalmente, o sobrenadante é desprezado e o "pélete" armazenado a - 80°C até o momen- to do uso.

A segunda etapa para obter a Galectina 1 recombinante tem continuidade a partir do pélete bacteriano que é submetido ao descongela- mento em banho de gelo e em seguida ressuspendido em um tampão de Iise contendo 7mL de PBS (Phosphate Buffered SaIine-NaCI (136,8mM), KCI (2,7mM), Na2HP04 (6,4mM), KH2P04 (0,9mM), pH 7,4), 14mM de mercap- toetanol (2-ME) (Merck-Schuchardt, Alemanha), 1 comprimidode inibidores de proteases sem EDTA (Roche Diagnostics GmbH, M1 Alemanha), 1mL de Iisosima -1mg/mL (Roche Diagnostics GmbH, M, Alemanha), 10pL de RNA- se A Tipo 3A - 10mg/mL (Sigma-AIdrich) e 10μί de DNAse I Tipo IV - 10mg/mL (Sigma-AIdrich), e então submetido à incubação por 30 minutos com o tampão de Iise em banho de gelo. Em seguida, a amostra é sonicada em 5 ciclos de 20 segundos cada, na potência de 40W (Sonics Vibra cell; SONICS & MATERIALS INC.), sendo que entre os ciclos, a suspensão é mantida em repouso por 15 segundos. O Iisado bacteriano é então centrifu- gado a IOOOOg por 45 minutos a 4°C. Em seguida, o sobrenadante é coleta- do e submetido à cromatografia de afinidade em coluna de agarose-lactose (Sigma-AIdrich) com 5mL de leito. O material não-ligante é eluído com tam- pão de equilíbrio (PBS, adicionado de 2-ME a 14mM, pH 7,4), sendo coleta- das 20 frações de 2mL. O material Iigante à coluna é eluído com tampão de eluição (tampão de equilíbrio adicionado de Iactose a 100mM, pH 7,4) sendo coletadas 10 frações de 0,5mL. O procedimento cromatográfico é monitora- do pela leitura da absorvância em 280nm (UV Mini 1240, Shimadzu) e por eletroforese em gel de poliacrilamida. As concentrações protéicas das solu- ções de Galectina 1 são determinadas por espectrometria utilizando as leitu- ras de absorvância em 280nm ou por ensaios colorimétricos disponíveis no mercado e expressas em miligramas de proteína por mililitros (mg/mL) As frações cromatográficas obtidas neste procedimento de purificação de Ga- Iectina 1 em agarose-lactose são analisadas por eletroforese (SDS-PAGE - "Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis"). As amostras contidas em tampão redutor e dissociante (volume final 20μΙ_) são aplicadas em gel de poliacrilamida (15%) e submetidas à corrida eletroforética a volta- gem constante (150V). Como amostras utilizam-se as frações cromatográfi- cas do Iisado bacteriano bruto e do material não ligante. Para controle, utili- za-se o padrão de peso molecular conhecido (LMWH - Low Molecular Wei- ght Calibertion kit for Electroforesis - GE, Amersham -Biosciences, Uppasa- Ia1 Suécia). A coloração dos géis é feita com "Coomassie Brillhant Blue". As soluções da Galectina 1 obtida da cromatografia em agarose-lactose são mantidas em tampão de eluição, com a finalidade de preservar a atividade lectínica dessa proteína, e são estocadas a - 80°C até o momento do uso. Para os ensaios, estas soluções são submetidas ao procedimento de desali- nização em cromatografia de exclusão molecular em coluna PD10 conforme instruções do fabricante (Sephadex-G25M; Pharmacia LKB, Uppasala, Sué- cia). As concentrações das soluções desalinizadas da Galectina 1 são de- terminadas por meio de espectrometria ou por reações colorimétricas con- forme já descrito acima. Com o objetivo de avaliar o nível de preservação da atividade lectínica (capacidade da Galectina 1 de reconhecer açúcares) da Galectina 1 purificada em resinas de agarose-lactose, amostras dessa prote- ína são desalinizadas em coluna PD-10 e imediatamente recromatografadas em coluna de agarose-lactose. São coletadas 20 frações de 1 ,OmL cada. O processo de eluição é monitorado pela determinação da concentração pro- téica (mg/mL). Neste último procedimento, a eluição da Galectina 1 com tampão de lavagem é considerada um indicador da perda da propriedade lectínica dessa proteína, pois nestas condições a Galectina 1 não é capaz de reconhecer a Iactose e por isso não é retida na resina de agarose-lactose. A oxidação dos grupos sulfidrílicos da Galectina 1 e sua desnaturação podem promover a perda da atividade lectínica dessa proteína, uma propriedade associada às várias funções dessa molécula. Considerando que as soluções de Galectina 1 purificadas foram estocadas a -80°C, e que deverão ser des- congeladas para uso, deve ser analisado o impacto desses procedimentos na atividade hemaglutinante desta lectina. A hemaglutinação é realizada na presença ou ausência de açúcar-hapteno específico para a Galectina 1, a Iactose (20mM). Somente as preparações de Galectina 1 que apresentarem atividade hemaglutinante nas concentrações iguais ou inferiores a de 2μΜ são utilizadas nos diferentes ensaios.

A terceira etapa para a obtenção da Galectina 1 recombinante envolve o controle da atividade lectínica de preparações alquiladas dessa lectina por hemaglutinação e/ou por outras metodologias que possibilitem a determinação da preservação do caráter lectínico dessas preparações de Galectina 1 recombinante. A oxidação dos grupos sulfidrílicos da Galectina 1 promove a desnaturação e perda da atividade lectínica dessa proteína. As- sim, visando à obtenção de amostras de Galectina 1 com maior estabilidade, preparações dessa lectina são submetidas à alquilação com o uso de iodoa- cetamida, um composto redutor alquilante que reage de modo covalente com os grupos sulfidrílicos, gerando a carboxiamidometil-galectina-1 (Galec- tina 1 alquilada). Em suma, 0,037g de iodoacetamida (Protein- Iodoacetamide1 Sigma-AIdrich; concentração final de 20 μΜ) são diluídos em 1,0ml de uma solução de Galectina 1 purificada, na presença de Iactose a 100mM. Em seguida, esta solução é incubada, em banho de gelo, ao abrigo da luz, por 16-18 horas. Após esta incubação a solução é submetida à cro- matografia de exclusão molecular em PD10 para remoção da iodoacetamida livre e da lactose. A concentração das preparações de Galectina 1 alquilada é determinada por espectrometria e expressa em mg/mL, como descrito an- teriormente.

A quarta etapa para obtenção da Galectina 1 recombinante refe- re-se à remoção de endotoxina bacteriana (LPS). Considerando que Galec- tina 1 tenha sido obtida a partir de bactéria gram-negativa, que possui LPS (lipopolissacarídeo) na composição de sua parede celular, após a etapa de alquilação com iodoacetamida, as preparações de Galectina 1 são submeti- das à cromatografia de afinidade em coluna contendo Polimixina B acoplada à agarose (Detoxi-Gel Endotoxin Removing Gel, Pierce, IL, USA). A eficiên- cia do procedimento de remoção de LPS das preparações de Galectina 1 alquilada é avaliada por meio da quantificação endotoxina LPS com o uso do kit QCL-1000 (Cromogenic Limulus Amebocyte Lysate Assay, Cambrex Company, MD, USA). As preparações de Galectina 1 alquiladas, ativas e livres de endotoxinas são então submetidas ao procedimento de esteriliza- ção por filtragem (membranas de 0,22pm).

Tendo sido descrito um método para obtenção da Galectina 1 recombinante, cumpre observar que qualquer outra Iectina Iigante de beta- galactosídeo, ou derivados da mesma, pode ser obtida por meio de um pro- cedimento bastante similar.

Assim, baseado no conhecimento de que a Galectina 1 desem- penha uma importante função na modulação de distúbios imunológicos, ini- bindo a resposta inflamatória e modulando as funções de células T em sis- temas in vivo e in vitro , o pedido de patente norte-americano US 12/175,227 descreve um método de modular a resposta imunológica da mencionada Iectina a fim de prevenir e tratar distúrbios imunológicos, incluindo o Linfoma de Hodgkin. Em relação ao potencial de interação com outras moléculas e/ou células, sabe-se que na presença da Galectina 1 as células dendríticas tor- nam-se tolerogênicas e podem modular a resposta imunológica em mamífe- ros, evitando assim o desenvolvimento de doenças autoimunes, bem como revertendo a rejeição de transplantes. Nesse sentido, o pedido de patente norte-americano US 12/137,004 descreve um método de preparo de formu- lação compreendendo células dendríticas na presença de tal lectina, cuja finalidade é o tratamento de neoplasias, doenças autoimune e infecciosas.

O estudo de Blois1 S.M. et al, 2007 (em A pivotal role for galec- tin-1 in fetomaternal tolerance) baseou-se nos resultados de um modelo ex- perimental de tratamento com Galectina 1, administrada via intraperitoneal em camundongos isogênicos, a fim de analisar a perda fetal induzida por estresse provocado por exposição a ruído. Constatou-se que a expressão da Galectina 1 no útero de camundongos é altamente sensível às alterações ambientais, comprometendo, portanto, a gestação das fêmeas induzidas ao estresse. Por outro lado, os autores concluíram que o tratamento destes a- nimais com Galectina 1 recombinante reduziu significantemente a perda fe- tal.

É sabido que para a manutenção da gestação, o organismo ma- terno passa por modificações consideráveis, incluindo alterações hormonais e imunológicas. Evidências sugerem que a preparação do endométrio para a implantação do embrião não é meramente uma questão de estimulação hormonal, mas depende da interação entre o blastocisto e endométrio sendo ainda mediada por citocinas, fatores de crescimento, e moléculas de adesão que são produzidas e secretadas pelo endométrio e pelo blastocisto. Ainda assim, existe a possibilidade da interação de diferentes sistemas fisiológicos implicarem em perdas gestacionais que podem deixar de ser explicadas por fatores isolados.

Do ponto de vista do mercado agropecuário, os mecanismos do funcionamento da tolerância imunológica materno-fetal em gestações oriun- das tanto da monta natural como da inseminação artificial ainda constituem um desafio para a medicina reprodutiva veterinária diante da resposta dispa- rada contra os aloantígenos fetais.

Nesse aspecto, cumpre lembrar que perdas gestacionais impli- cam em prejuízo econômico com drásticas conseqüências principalmente para os pecuaristas, que, por sua vez, precisam manter a eficiência reprodu- tiva em níveis satisfatórios a fim de atender as exigências dos consumidores e manter lucrativa a própria propriedade.

Adicionalmente, os pecuaristas de rebanhos com aptidão leiteira e para corte costumam valer-se de biotécnicas de reprodução para garantir a determinação do sexo do embrião após a fecundação. Ocorre, porém, que os embriões produzidos in vitro e em seguida transferidos ao útero materno das receptoras não possuem índices satisfatórios de sobrevivência em razão das mudanças morfológicas e estruturais decorrentes principalmente do meio de manutenção, ocasionando a perda embrionária precoce.

Ademais, uma das limitações para a aplicação comercial das bi- otécnicas de reprodução é a distância a ser percorrida entre os locais de coleta e deposição dos gametas do doador (sêmen) ou da doadora (oócito), ou ainda do embrião produzido in vivo ou in vitro. Sabe-se que a preserva- ção das funções celulares está diretamente ligada à variação de pH e tem- peratura, dentre outras propriedades, e mantê-las em condições ótimas até o efetivo momento da inovulação torna-se um desafio.

Diante de todo o exposto, a presente invenção apresenta uma solução para as atuais dificuldades reprodutivas, encontradas especialmente no mercado agropecuário, tendo como principal objetivo promover o aumen- to da taxa de implantação de embriões no útero materno a partir do forneci- mento ao útero do mamífero uma quantidade eficaz de uma Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma.

Objetivos da invenção

A presente invenção tem por objetivo a utilização de uma quan- tidade eficaz de uma Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma, preferencialmente escolhida dentre Galectina 1, Galectina 3, Galec- tina 9; Galectina 13 ou Galectina 15, ou ainda derivados das mesmas, a fim de aumentar a taxa de implantação de embriões no útero materno em espé- cies bovinas, suínas, ovinas, caprinas, eqüinas, bufalinas, caninas, felinas e humana, entre outras espécies, impedindo assim que embrião seja elimina- do pelo sistema imune materno.

A presente invenção tem também por objetivo o aumento da ta- xa de implantação de embriões no útero materno a partir da inovulação em mamíferos de uma Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma por meio de inseminação artificial, transferência de embriões produ- zidos in vitro ou in vivo, ou processo de reprodução por monta natural.

Ainda, a presente invenção tem por objetivo utilizar uma quanti- dade eficaz de uma Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma a fim de promover a fertilização do (i) sêmen in natura, resfriado ou congelado; (ii) oócito fresco, congelado ou vitrificado; e (iii) embrião fresco, congelado, vitrificado, sendo oriundo de transferência de embrião, fecunda- ção in vitro, clone ouftransgênico. A presente invenção tem também por objetivo fornecer uma Iec-

tina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma para aumentar a taxa de implantação de embriões no útero em mamíferos.

Finalmente, a presente invenção tem como objetivo utilizar um produto que compreende uma quantidade eficaz de uma Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma para aumentar a taxa de implan- tação de embriões no útero em mamíferos. Breve descrição da invenção

Os objetivos da presente invenção são alcançados através de:

(a) um método para aumentar a taxa de implantação de embriões no útero materno em mamíferos que compreende fornecer ao útero do ma- mífero uma quantidade eficaz de uma Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma;

(b) uso de uma quantidade eficaz de uma Iectina Iigante de beta- galactosídeo ou derivados da mesma para aumentar a taxa de implantação

de embriões no útero materno em mamíferos;

(c) Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados usada para aumentar a taxa de implantação de embriões no útero materno em mamífe- ros; e

(d) produto que compreende uma quantidade eficaz de uma Iectina

Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma para aumentar a taxa de implantação de embriões em mamíferos.

Descrição detalhada da invenção

Na presente invenção, entende-se por taxa de implantação os índices que revelam o número de embriões que foram efetivamente aderidos no endométrio de mamíferos após a fecundação (união entre o gameta mas- culino e feminino) gerada a partir da reprodução assistida ou não. Os objetivos da presente invenção são alcançados por meio do

fornecimento ao útero materno do mamífero, via uterina ou vaginal, de uma quantidade eficaz de uma Iectina Iigante de beta-galactosídeos ou derivados da mesma na forma ativa em uma solução tampão convencional, separada- mente ou em mistura com sêmen, oócito ou embrião em meio de manuten- ção.

A solução tamponada objetiva a manutenção, manipulação e i- novulação do sêmen, oócito ou embrião, e é preferencialmente um veículo composto por solução salina tamponada (Phosphate Buffered Saline - PSB) ou soro fisiológico, estéril, estável, livre de endotoxina, isotônico e apresenta pH entre 6,8 e 7,4.

Entende-se por meio de manutenção um meio complexo e livre de soro para a manutenção de embriões em ar atmosférico em tempo variá- vel de acordo com a temperatura. Um meio de manutenção é normalmente composto por solução tampão isotônica que, por sua vez, é provida de ami- noácidos essenciais, fatores de crescimento, enzimas, substratos energéti- cos, nutrientes celulares e antibióticos.

Um exemplo de meio de manutenção pode ser um diluidor, que é um líquido diluente adicionado ou misturado com sêmen para preservar a habilidade de fertilização. Diluidores especiais para congelamento também possuem propriedade criogênica possibilitando transporte, congelamento e descongelamento. Diluidores são constituídos por tampão isotônico, substra- tos energéticos e nutrientes celulares, antibióticos, antioxidantes e crioprote- tores.

Os objetivos da presente invenção podem também ser alcança- dos por meio do fornecimento de uma Iectina Iigante de beta-galactosídeos ou derivados da mesma e sêmen, oócito ou embrião ao útero materno do mamífero simultaneamente ou subseqüentemente (etapas estas que serão definidas mais a diante).

Dentre as vantagens apresentadas pela presente invenção, está o aumento da eficiência reprodutiva dos rebanhos e a melhoria de qualidade da progênie (quali e quantitativa); a redução do tempo para abate; a redução no custo de alimentação; o aumento da possibilidade de heterozigoze; a me- lhoria no manejo e assessoria técnica, sanitária e reprodutiva; dentre outros aspectos descritos mais a frente na presente invenção.

A presente invenção compreende a utilização de uma Iectina Ii- gante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma, preferencialmente a Galectina 1, Galectina 3, Galectina 9, Galectina 13 e Galectina 15, a fim de aumentar a taxa de implantação de embriões no útero materno em mamífe- ros.

O aumento da taxa de implantação de embriões no útero mater- no em mamíferos por meio de biotécnicas de reprodução reflete diretamente a viabilização do uso de tais procedimentos como ferramenta de progresso genético, considerando que eleva o resultado e/ou sucesso das técnicas pa- ra patamares economicamente viáveis.

Adicionalmente, o material genético de indivíduos geneticamente superiores durante as biotécnicas de reprodução é mais bem aproveitado, maximizando a disseminação desses animais e viabilizando, portanto, uma alternativa diante da escassez de indivíduos comprovadamente superiores. Frente às biotécnicas de reprodução, há de se considerar também a redução de intervalo entre gerações.

Além disso, um dos desafios mundiais atuais é vencer a fome em uma condição de área agricultável cada vez menor, com premissas de perspectiva de crescimento populacional de 50% para os próximos 25 anos. Assim, o aumento da taxa de implantação de embriões no útero materno de espécies bovinas, suínas, ovinas, entre outras espécies, significa aumentar a produção de alimentos como um todo, inclusive a produção de carnes cuja procura estima-se que dobre nos próximos 25 anos, atingindo patamares superiores a 127 milhões de toneladas ao ano.

Os resultados provenientes do aumento da taxa de implantação

de embriões no útero materno em mamíferos em rebanhos produtivos pode- rão ser observados nos seguintes aspectos:

Melhoria de qualidade da progênie (quali e quantitativa) - no rebanho de corte peso e qualidade - aumento do ganho de peso diário, me- Ihoria nas qualidades de marmoreio, maciez, sabor da carne, além do me- lhor aproveitamento em cortes nobres, agregando maior valor ao produto final. No rebanho de leite, aumento de produtividade e melhoria de qualidade do leite.

Redução do tempo para abate - com o aumento do ganho diário de peso provindo do melhoramento genético, reduz-se em até 30% o tempo necessário do nascimento ao abate. Aumenta-se sobremaneira a precocida- de de crescimento dos animais.

Redução no custo de alimentação - apesar do maior investimen- to em genética superior, há uma compensação mais do que satisfatória com a redução do custo de produção dos animais, principalmente pelo aumento da precocidade, ou seja, pela redução do tempo para o abate. Reduz-se em pelo menos 10% o custo de produção final do produto.

Aumento da possibilidade de heterozigoze - facilidade do cru- zamento de raças nem sempre adaptadas ao clima tropical brasileiro, mas que agregam muito valor quanto a melhorias na carcaça, na precocidade e prolificidade do rebanho.

Melhoria no manejo e assessoria técnica, sanitária e reprodutiva - o uso das biotécnicas de reprodução é vantajoso sob o aspecto sanitário, pois evita a disseminação de doenças sexualmente transmissíveis ao reba- nho, o que reduz os gastos em medicamentos para tratamento de doenças, ou seja, reduzindo o custo de produção. A presente invenção é resultado, mais particularmente, de testes de transferência de embriões produzidos in vivo em fêmeas bovinas, a fim de comprovar o aumento da taxa de implantação de embriões no útero ma- terno na presença de Galectina 1.

Exemplos

Uma dose única de 100pg em 15-22pL de Galectina 1 humana recombinante, estéril, ativa, alquilida e livre de endotoxina foi administrada via uterina nas receptoras dos embriões. Há que se considerar que a men- cionada dose é drasticamente baixa, comparada ao peso corpóreo bovino (peso vivo), e favorece os aspectos de biossegurança das fêmeas tratadas que, diferentemente de camundongos (normalmente utilizados como animais de experimentação), têm o organismo preparado para uma única gestação por vez.

Para checar os efeitos da Galectina 1 como agente regulador da fertilidade em mamíferos, utilizou-se animais não isogênicos em sistema de confinamento, com condições normais de manejo.

Fêmeas bovinas consideradas doadoras foram então superovu- Iadas e inseminadas no DO (dia zero) da fertilização. Paralelamente, as re- ceptoras foram trabalhadas com protocolos de sincronização de estro para que ovulassem no DO.

No D7 (7o dia) as doadoras foram submetidas à fase de colheita e avaliação de embriões em estágio mórula e/ou blastocisto. Embriões con- siderados ruins (grau 3), bons (grau 2) e excelentes (grau 1) foram envasa- dos a fim de serem inovulados, no mesmo dia, nas receptoras que foram previamente selecionadas de acordo com o desenvolvimento do corpo lúteo.

A classificação embrionária, em geral, é realizada com base em parâmetros morfológicos e abrange três principais estágios identificados de acordo com a sua fase de desenvolvimento. O ideal é que o embrião não tenha fragmentos visíveis e que as células tenham tamanho homogêneo. Cumpre observar ainda que nem todos os embriões com excelente morfolo- gia estão internamente saudáveis, pois estão diretamente ligados a fatores advindos do óvulo, do espermatozoide e do próprio processo de fertilização. Os embriões em uma coluna de meio de manutenção TQC® e a Galectina 1 diluída em soro fisiológico estéril em outra coluna líquida (embri- ão não entra em contato com a solução de Galectina no momento do enva- se) foram envasados em uma mesma palheta e inovulados no útero das re- ceptoras, sincronizadas com as doadoras, com o auxílio de uma pipeta de inseminação. Todo o conteúdo da palheta foi inovulado de uma única vez, sendo que, nesta concretização, os embriões e a Galectina 1 alcançaram o útero da receptora de forma separada e simultânea.

O propósito dos testes foi o de analisar o número de implanta- ções de embriões no útero materno confirmadas aos 30 e 60 dias após a data de inovulação dos embriões em (i) receptoras que receberam o trata- mento local da Galectina 1 e em (ii) receptoras inovuladas sem a presença da Galectina 1. Para tanto, as receptoras inovuladas foram divididas em dois grupos distintos para cada acasalamento (doadora χ sêmen): Grupo Con- trole (embriões sem a presença de Galectina-1) e o Grupo Tratado (embri- ões na presença de Galectina-1).

O diagnóstico de gestação foi realizado, tanto no Grupo Tratado como no Grupo Controle, pelo exame de ultrassonografia em 2 momentos distintos: a primeira mensuração foi realizada 30 dias após a inovulação dos embriões (representada na tabela abaixo por "P30"), e a segunda avaliação da taxa de implantação de embriões no útero materno foi realizada 60 dias após a inovulação dos embriões (representada na tabela abaixo por "P60"). Metodologia:

As fêmeas bovinas selecionadas como receptoras eram fêmeas de boa produção leiteira e com índices reprodutivos conhecidos. As fêmeas bovinas selecionadas como doadoras eram fêmeas da raça holandesa com alto nível de produção leiteira e com índices reprodutivos conhecidos.

O procedimento de seleção dos acasalamentos refere-se à es- colha do reprodutor (doses de sêmen) para cada doadora. Após a coleta e avaliação dos embriões, aproximadamente metade dos embriões gerados foi inovulada no útero de receptoras pertencentes ao GRUPO CONTROLE e a outra metade dos embriões foi inovulada no útero de receptoras pertencen- tes ao GRUPO TRATADO. Houve um esforço em dividir igualitariamente os embriões em função do grau de qualidade apresentado entre o GRUPO CONTROLE e o GRUPO TRATADO, a fim de tornar os grupos comparáveis entre si.

Metodologia: GRUPO CONTROLE

O procedimento de inovulação de embriões do Grupo Controle seguiu a metodologia tradicional para eventos como este, ou seja, a inovula- ção dos embriões ocorreu no corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo (onde ocorreu a ovulação no momento do estro) das receptoras. A palheta utiliza- da, composta por 3 colunas principais, acondicionou uma coluna de meio de manutenção TQC®, seguida por uma coluna de ar, seguida por uma coluna de meio de manutenção TQC® contendo o embrião, seguida de outra coluna de ar, seguida de outra coluna de meio de manutenção TQC®. Todo o con- teúdo da palheta foi inovulado de uma única vez. Metodologia: GRUPO TRATADO

O procedimento de inovulação de embriões do Grupo Tratado seguiu a metodologia tradicional para eventos como este, ou seja, a inovula- ção dos embriões ocorreu no corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo (onde ocorreu a ovulação no momento do estro) das receptoras. A palheta utiliza- da, composta por 3 colunas principais, acondicionou uma coluna de meio de manutenção TQC®, seguida por uma coluna de ar, seguida por uma coluna de meio de manutenção TQC® contendo o embrião, seguida de outra coluna de ar, seguida de outra coluna de meio de manutenção contendo a Galectina 1. Todo o conteúdo da palheta foi inovulado de uma única vez, sendo que, nesta concretização, os embriões e a Galectina 1 alcançaram o útero da re- ceptora de forma separada e simultânea.

Resultados: Nas 2 tabelas ilustradas a seguir, a primeira coluna à esquerda (Repetição) indica as repetições em que foram realizadas as transferências dos embriões gerados por cada fêmea bovina, correspondendo a um total de 12 repetições. Paralelamente, outras 2 colunas estão subdivididas a fim de separarem os resultados obtidos frente ao Grupo Controle e Grupo Tratado, seguidos de 2 outras colunas com a relação entre a porcentagem da taxa de implantação de embriões no útero das receptoras adicional obtido com o uso da Galectina 1 no procedimento.

A coluna correspondente à "Quantidade controle" indica o núme- ro de embriões gerados das inovulações sem a presença de Galectina 1. A coluna subsequente à direita (Controle P30) está subdividida a fim de de- monstrar tanto o número de implantações 30 dias após a inovulação (Quan- tidade 30) quanto à respectiva porcentagem correspondente à taxa de im- plantação durante o mesmo período (T30). O mesmo raciocínio é usado pa- ra a coluna à direita subsequente (Controle P60), subdividida a fim de de- monstrar tanto o número de implantações 60 dias após a inovulação (Quan- tidade 60) quanto à respectiva porcentagem correspondente à taxa de im- plantação durante o mesmo período (T60).

A coluna correspondente à "Quantidade tratado" indica o número de embriões gerados das inovulações na presença de Galectina 1. A coluna subsequente à direita (Tratado P30) está subdividida a fim de demonstrar tanto o número de implantações 30 dias após a inovulação (Quantidade 30) quanto à respectiva porcentagem correspondente à taxa de implantação du- rante o mesmo período (T30). O mesmo raciocínio é usado para a coluna à direita subsequente (Tratado P60), subdividida a fim de demonstrar tanto o número de implantações 60 dias após a inovulação (Quantidade 60) quanto à respectiva porcentagem correspondente à taxa de implantação durante o mesmo período (T60).

A coluna correspondente à "Δ taxa de implantação" está subdividida a fim de indicar a diferença na taxa de implantação obtida frente ao Grupo Controle e Grupo Tratado P30 (Δ30), bem como ao Grupo Controle e Grupo Tratado P60 (Δ60). tn <ο

α>

Xi

co

Δ taxa de im- plantação Δ 30 Δ 60 -4,2% 8,3% 7,9% 17,0% 8,3% -16,7% 35,4% 18,4% 50,0% 50,0% 22,7% -13,6% 19,0% -2,6% 100,0 % 20,8% 4,2% 6,7% 23,3% 40,0% 20,0% 50,0% 50,0% 16,7% 14,1% ο ο to to H OL O "8 ^a ^ ^M (Ο - If σ-3 5 33,3% 8 53,3% 2 50,0% 9 50,0% 7 100,0% 4 36,4% 9 52,9% 2 100,0% 4 66,7% 4 40,0% 1 20,0% 3 50,0% 58 50,0% Tratado Ρ30 Quanti- dade 30 5 33,3% 8 53,3% 3 75,0% 13 72,2% 7 100,0% 8 72,7% 10 58,8% 2 100,0% 5 83,3% 4 40,0% 2 40,0% 3 50,0% 70 60,3% Quantida- de tratado ^ ΙΛ CO ^ T- h-- CM CD ° IO CO to τ— T— o o S £ CL i- Φ o iz .i o c to ° 5 ® O « rt «β σ τι 4 25,0% 4 36,4% 4 66,7% 6 31,6% 3 50,0% 5 50,0% 5 55,6% 5 62,5% 1 16,7% 37 35,9% Controle P30 Quanti- dade 30 l,5U 6 37,5% 5 45,5% 4 66,7% 7 36,8% 3 50,0% 5 50,0% 7 77,8% 1 100,0% 5 62,5% 2 33,3% 45 43,7% Quantida- de controle ^ JI (D ® © ° O) τ— OO CD IO CO CO O τ— Repeti- ção τ- CM CO -si" IO CD h- OOOTOT-CM OOOOOOO OOT-T-T- OOOOOOO OOOOO CCCCCCC CCCCC TOTAL Tabela 1: Resultado da taxa de implantação de embriões de graus 1, 2 e 3 do Grupo Controle (inovulação sem a presença de Galectina 1) e Gru- po Tratado (inovulação na presença de Galectina 1) após 30 e 60 dias respectivamente.

Como pode ser constatada por meio da Tabela 1, a análise do

resultado total demonstra que aos 30 dias após a inovulação dos embriões, O Grupo Tratado apresentou maiores índices de implantação no útero ma- terno, totalizando o percentual de 60,3% frente aos 43,7% alcançados pelo Grupo Controle. Na análise do resultado final aos 60 dias após a inovulação dos embriões, os índices do Grupo Tratado correspondem ao percentual de 50% de implantação no útero materno, frente aos 35,9% alcançados pelo Grupo Controle.

Diante dos resultados apresentados na Tabela 1, é possível constatar que o uso da Galectina 1 aumentou o número de implantação de embriões no útero materno em 16,7 pontos percentuais após 30 dias e em 14,1 pontos percentuais após 60 dias. f νΡ -P -P O νΡ -P -P -P φ fc- Q O CO < 8,4% O- N- CD O- O ο" O- CM δ- O ο" 6,7% O ο" ι O- CD οο" O- CO CO*" ο- Ο ο" O- CO IO Φ N -c— τ— CM IO τ- τ- CM CO IO ^— TJ <Φ 1 (β SZ C -P •νΡ ^P -P -P νΡ νΡ X O ο- ο- ο- ο- O- ο- (0 CO CD ο CD Ο Ο N- ι ι ι O CD N- O IO < < ο" ι IO !θ" σ>" CO ο" IO CD CM co" co" CD ο" IO IO τ- ^ ο -ο -S V? -S -S -ρ ο- -Ρ --S SsP Q O CO I- O- Ν- O- O <5- O ο- LO O ο- Ο ο- Ο O θ S- CD ο- CO ο- Ο 3- CO to ιη ο" ο" xf ο" ο" ο" ο" ο" οο" co" ο" 00 Ο- OO IO IO IO O IO O O CM CO IO Ο Tl « ■ O 4-» 4-· CO (β L- H §| LO CD CM CD T CM IO - - CM -C— CO CO rt «β σ -α νρ -ο Ν? νΟ ν° tf» -P Os* -P Os- -P -P -ο T30 O- Ν- O- O O- O ο- N- O ο- Ο ί- ο ο ο ο- ίΟ ο- N ο- Ο O- 00 O CO CL ιο" CO ο" IO ιο" Ν csT N- ο" O ν- ο" CD ο" CD ο" O ο" ο οο" CM cD" CD θ" LO «ο IO O Τ3 (0 +>* (β ■ o w CO H 15 rt «Β σ τ» IO CD CO OO "3" CO CD T- ^ CM CM ^ CM , o 4-» C (β Φ Τ3 Ό ca ca CM ■sr τ- IO O -C- N CO CM N- 3 σ -P V? V? -P --8 -P Os- -S Q ο- O- Ov ο- ο- Q ο- ο (Ο CO I- CO N CO οο" ο ο" CO co" O ο" CO Οθ" Ο ο" I ο" 1 ι CO CO CL CM CO CD CO IO CO O χ— CO Φ O ré ή C O υ uantid de 60 CO CO CO CM τ- CM ι CQ ι t ι T- CM σ νΡ V? -ρ Vp -P —P -ρ Os* νΟ Ov -P -S ο T30 O- ί- O- O ο- CO ο- Ο ο- CO ο- Ο ο O ο- Ο ο- CO CO CD XT ο" co" ο" co" ο" ο" ο" ο ιθ" T- Ql CO XT CD CO IO CO CD Ci CM Tf φ ο ._L O C co O O = φ § "*> CO CM ^ CO τ— CO - ι ι co CM σ -o ç> (β ο ■σ W 4J CO (Ο C η 3 C O O τ- ν— σ> ιο CM CO IO CO ■"ί- CM y φ TJ I -J O ICQ τ— CM CO ■«ί- IO CD N- CO σ> ο T— CM < H φ O O ο O ο O O O O ο O ο O O O ο ο ο ο ο O ο O W C C C C C £Ζ C C C C C C QC H Tabela 2: Resultado da taxa de implantação considerando apenas as inovulações de embriões de grau 2 do Grupo Controle (inovulação sem a presença de Galectina 1) e Grupo Tratado (inovulação na presença de Galectina 1) após 30 e 60 dias respectivamente.

Os resultados que constam da Tabela 2 comprovam que o Gru-

po Tratado teve maior número de implantações no útero materno, totalizan- do o percentual de 56,8% frente aos 41,3% alcançados pelo Grupo Controle aos 30 dias após a inovulação de embriões grau 2. Na análise do resultado final aos 60 dias após a inovulação dos embriões de grau 2, os índices do Grupo Tratado correspondem ao percentual de 48,6% de implantação no útero materno, frente aos 33,3% alcançados pelo Grupo Controle.

Diante dos resultados apresentados na Tabela 2, é possível constatar que a Galectina 1 fornecida ao útero de receptoras bovinas do Grupo Tratado promoveu o aumento do número de implantações em 15,5 pontos percentuais após 30 dias e em 15,3 pontos percentuais após 60 dias, refletindo favoravelmente nas respectivas taxas de implantações de embri- ões grau 2 no útero materno de vacas.

Considerando que, no presente experimento, a Galectina 1 hu- mana recombinante apresenta função de antígeno no útero materno bovino pelo fato de, principalmente, ser oriunda de espécie diferente, estudos estão sendo desenvolvidos a fim de comprovar (i) uma interação maior entre Ga- Iectinas e glicanas da mesma espécie e, consequentemente, (ii) um melhor desempenho da Galectina 1 no aumento da taxa de implantação de embri- ões no útero materno em mamíferos. Permanecem em estudo os mecanismos fisiológicos desenca-

deados pela Galectina 1 que tornam possível o aumento da taxa de implan- tação de embriões no útero materno em mamíferos, diante do período ainda não finalizado de gestação das receptoras de bovinos que foram inovuladas no presente experimento. Em bovinos, a placenta possui numerosas unidades de tama-

nhos e formatos variados que, por sua vez, consistem em um tufo de vilosi- dades fetais interdigitadas com invaginações criptiformes reunidas no útero. Para a manutenção da gestação, o embrião deve participar enviando a sina- lização de sua existência no ambiente uterino, por meio da produção de IFNT. Dessa forma a luteólise permanece inibida e, consequentemente, os níveis de P4 são mantidos elevados. Assim, tanto o IFNT quanto a P4 esti- mulam o mRNA a aumentar os níveis de Galectinas no útero. Após o reco- nhecimento e a aceitação do embrião pelo ambiente materno, células do trofoblasto se diferenciam e unem-se às células do epitélio uterino entrando em contato direto com os tecidos maternos.

Acredita-se, portanto, que o aumento da taxa de implantação de embriões no útero materno em mamíferos é justificado pela participação da Galectina 1 na regulação dos mecanismos ligados à imunotolerância e/ou por promover o processo de elongação do blastocisto e adesão do embrião no endométrio uterino.

A presente invenção prevê ainda que uma Iectina Iigante de be- ta-galactosídeo ou derivados da mesma, preferencialmente escolhida dentre Galectina 1, Galectina 3, Galectina 9, Galectina 13 ou Galectina 15, ou ainda derivados das mesmas, seja usada para atuar como agente regulador da fertilidade do sêmen, oócitos ou embrião, aumentando assim a taxa de im- plantação de embriões no útero materno em mamíferos. A quantidade da Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou deriva-

dos da mesma fornecida ao útero materno do mamífero pode variar propor- cionalmente de acordo com o peso do corpo da espécie, estando preferenci- almente em uma faixa de concentração que compreende entre 0,0000001 a 1,0 mg por kg de peso do corpo do mamífero. Em uma concretização, a Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou

derivados da mesma é diluída em solução tamponada, preferencialmente tamponada com fosfato (PBS) ou soro fisiológico, e é fornecida por meio de uma palheta convencional ao útero materno em mistura com sêmen, oócito ou embrião mantidos em meio de manutenção (capaz de manter a sobrevi- vência das células e a integridade biológica durante a manipulação, trans- porte, congelação e descongelação), de modo que todo o conteúdo da pa- lheta é fornecido de uma única vez ao útero materno do mamífero. Em uma variação preferencial, a Iectina Iigante de beta- galactosídeo ou derivado da mesma é envasada em 2 etapas, de forma se- parada e subsequente ao sêmen, oócito ou embrião, sendo que, neste pro- cedimento, duas palhetas de envase são utilizadas. Na primeira aplicação, o sêmen, oócito ou embrião é disposto em meio de manutenção e envasado em uma palheta convencional, de modo que todo o seu conteúdo é fornecido ao útero materno do mamífero. Na segunda aplicação, a Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivado da mesma diluída em solução tamponada é envasada em outra palheta e, na seqüência, é fornecida ao útero materno do mamífero. O intervalo de tempo entre o fornecimento da Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma e o fornecimento de sêmen, oóci- to ou embrião dependerá essencialmente da espécie de mamífero manipu- lada e do método de tratamento empregado e poderá estender-se até 17 dias, a depender do tratamento empregado. É ainda previsto que a Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou

derivados da mesma diluída em solução tamponada seja envasada em uma coluna de determinada palheta convencional, intercalada a outra coluna con- tendo sêmen, oócito ou embrião em meio de manutenção, de modo que todo o conteúdo da palheta seja subseqüentemente fornecido ao útero materno do mamífero.

Em todas as variações previstas, a Iectina Iigante de beta- galactosídeo ou derivados da mesma e sêmen, oócito ou embrião são admi- nistrados pela via uterina ou vaginal. O sêmen pode encontrar-se no estado in natura, resfriado ou congelado; o oócito pode encontrar-se fresco, conge- lado ou vitrificado; e o embrião pode encontrar-se fresco, congelado ou vitri- ficado, podendo ainda ser oriundo de transferência de embrião, fecundação in vitro, clone ou transgênico.

Ademais, sabe-se que os programas de produção de embriões in vitro possibilitam a determinação do sexo do embrião após a fecundação, e, portanto, constituem uma importante ferramenta para os pecuaristas de raças bovinas com aptidão leiteira e aptidão para corte. Ocorre, porém, que os embriões produzidos in vitro não possuem índices satisfatórios de sobre- vivência no útero materno. Nesse sentido, a presente invenção surge como uma solução para regular a fertilidade do sêmen, oócito ou embrião e au- mentar a taxa de implantação de embriões no útero materno em mamíferos.

Por outro lado, uma das limitações para a aplicação comercial das biotécnicas de reprodução é a distância a ser percorrida entre os locais de coleta do sêmen, oócito ou embrião do(a) doador(a) e o local onde se encontra a espécie receptora; ou ainda a distância que separa as espécies doadoras daquelas receptoras. Nesse sentido, a criopreservação (processo de congelação) e a vitrificação (método de congelação ultra-rápido) têm se tornado uma prática comum na produção animal. Porém, embora as técnicas de criopreservação e vitrificação apresentem vantagens comerciais, os es- permatozoides, durante o congelamento, podem sofrer alterações na mem- brana, capacitação prematura, alterações no DNA e estresse oxidativo, comprometendo assim a sua fertilidade.

Em uma concretização preferencial, a presente invenção prevê o uso de um produto compreendido por uma quantidade eficaz de uma Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma para aumentar a taxa de implantação de embriões no útero em mamíferos.

Tendo sido descritos exemplos de variações preferidas, deve ser entendido que o escopo da presente invenção abrange outras possíveis va- riações, sendo limitado tão somente pelo teor das reivindicações apensas, aí incluídos os possíveis equivalentes.

Claims (20)

1. Método para aumentar a taxa de implantação de embriões no útero materno em mamíferos, caracterizado pelo fato de que compreende fornecer ao útero do mamífero uma quantidade eficaz de uma Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é administrada em uma quantidade variando de 0,0000001 a 1,0 mg da Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma na forma ativa por kg de peso do corpo do mamífero.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma encontra-se em um veículo estéril, estável, livre de endotoxina, isotônico, e apresentando pH entre 6,8 e 7,4.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o veículo é uma solução tampão.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a solução tampão é escolhida dentre uma solução salina tampo- nada com fosfato (PBS) ou soro fisiológico.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma é escolhida dentre Galectina 1, Galectina 3, Galectina 9, Galectina 13, Galectina 15 ou derivados das mesmas.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados é fornecida ao útero materno do mamífero em mistura com sê- men, oócito ou embrião.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma, e sêmen, oócito ou embrião são fornecidos ao útero materno do mamífero separada e simultaneamente.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma, e sêmen, oócito ou embrião são fornecidos ao útero materno do mamífero separada e subseqüentemente.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que quando a Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma, e sêmen, oócito ou embrião são fornecidos ao útero materno do mamífero subseqüentemente, o intervalo de tempo entre o fornecimento da Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma e o fornecimen- to de sêmen, oócito ou embrião estende-se até 17 dias.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que o sêmen, oócito ou embrião está disposto em um meio de manutenção.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe- lo fato de que o sêmen encontra-se in natura, resfriado ou congelado.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe- Io fato de que o embrião encontra-se fresco, congelado, vitrificado, sendo oriundo de transferência de embrião (TE), fecundação in vitro (FIV), clone ou transgênico.

14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe- lo fato de que o oócito encontra-se fresco, congelado ou vitrificado.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, caracterizado pelo fato de que a Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma, e sêmen, oócito ou embrião são administrados pela via uterina ou vaginal.

16. Uso de uma quantidade eficaz de uma Iectina Iigante de be- ta-galactosídeo ou derivados da mesma, caracterizado pelo fato de ser para aumentar a taxa de implantação de embriões no útero materno em mamífe- ros.

17. Lectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados, caracteri- zada pelo fato de ser usada para aumentar a taxa de implantação de embri- ões no útero materno em mamíferos.

18. Lectina, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pe- lo fato de ser Galectina 1, Galectina 3, Galectina 9, Galectina 13, Galectina -15 ou derivados das mesmas.

19. Produto, caracterizado pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de uma Iectina Iigante de beta-galactosídeo ou derivados da mesma para aumentar a taxa de implantação de embriões em mamíferos.

20. Invenção, caracterizada pelo fato de ser qualquer uma de suas realizações ou categorias de reivindicações englobadas na matéria ini- cialmente descrita no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresen- tados.