BRPI1005033A2

BRPI1005033A2 - Recombinant Peptides, Method and Kit for Visceral Leishmaniasis Immunodiagnosis Test

Info

Publication number: BRPI1005033A2
Application number: BRPI1005033-7A
Authority: BR
Inventors: Moura Fernandes Ana Paula Salles
Original assignee: Univ Minas Gerais
Priority date: 2010-12-13
Filing date: 2010-12-13
Publication date: 2013-04-02
Also published as: BRPI1005033B1

Abstract

Peptídeos Recombinantes, Método e Kit para Teste Imunodiagnástico de Leishmaniose Visceral. A presente invenção descreve um método e kit para diagnosticar Leishmaniose visceral. Mais particularmente, a invenção trata da associação dos antígenos recombinantes definidos rA2, rNH e rLACK ou seus epítopos, peptídeos 47, 17, 18 e 19, permitindo o desenvolvimento de um método diagnóstico com maior especificidade, otimizando, assim, a reatividade dos testes sorológicos.Recombinant Peptides, Method and Kit for Visceral Leishmaniasis Immunodiagnosis Test. The present invention describes a method and kit for diagnosing visceral leishmaniasis. More particularly, the invention deals with the association of the defined recombinant antigens rA2, rNH and rLACK or their epitopes, peptides 47, 17, 18 and 19, allowing the development of a more specific diagnostic method, thus optimizing the reactivity of serological tests. .

Description

Peptídeos Recombinantes, Método e Kit para Teste ImunodiagnósticoRecombinant Peptides, Method and Kit for Immunodiagnosis Test

de Leishmaniose Visceralof Visceral Leishmaniasis

A presente invenção descreve um método e kit para diagnosticar Leishmaniose visceral. Mais particularmente, a invenção trata da associação dos antígenos recombinantes definidos rA2, rNH e rLACK ou seus epítopos, peptídeos 47, 17, 18 e 19, permitindo o desenvolvimento de um método diagnóstico com maior especificidade, otimizando, assim, a reatividade dos testes sorológicos.The present invention describes a method and kit for diagnosing visceral leishmaniasis. More particularly, the invention deals with the association of the defined recombinant antigens rA2, rNH and rLACK or their epitopes, peptides 47, 17, 18 and 19, allowing the development of a more specific diagnostic method, thus optimizing the reactivity of serological tests. .

Espécies do gênero Leishmania são agentes etiológicos das diferentes formas clínicas da Ieishmaniose (visceral, cutânea, mucocutânea e difusa) que, por sua vez, apresentam distribuição geográfica e prevalências distintas. Dentre os 88 países em que é registrada a ocorrência de leishmaniose, 72 são países em desenvolvimento e 13 estão entre os menos desenvolvidos do mundo. Cerca de 90% dos casos de leishmaniose visceral (LV) ocorrem no Brasil, Bangladesh, índia, Nepal e Sudão e 90% dos casos de leishmaniose cutânea (LC) ocorrem no Brasil, Afeganistão, Argélia, Iran, Peru, Arábia Saudita e Síria (World Health Organization. 2002. Leishmaniasis Strategic Direction. "http://www.who.int/tdr/diseases/leish/lifecycle.htm"; Murray, H. W. J. D. Berman. 2005. "Advances in leishmaniasis." Lancet 366(9496): 1561-77). Cabe aqui ressaltar que a LV1 quando não tratada, é normalmente fatal.Species of the genus Leishmania are etiological agents of the different clinical forms of leishmaniasis (visceral, cutaneous, mucocutaneous and diffuse), which, in turn, have distinct geographic distribution and prevalence. Of the 88 countries where leishmaniasis is reported, 72 are developing countries and 13 are among the least developed in the world. About 90% of visceral leishmaniasis (VL) cases occur in Brazil, Bangladesh, India, Nepal and Sudan and 90% of cutaneous leishmaniasis (LC) cases occur in Brazil, Afghanistan, Algeria, Iran, Peru, Saudi Arabia and Syria (World Health Organization. 2002. Leishmaniasis Strategic Direction. "Http://www.who.int/tdr/diseases/leish/lifecycle.htm"; Murray, HWJD Berman. 2005. "Advances in Leishmaniasis." Lancet 366 (9496 ): 1561-77). It should be noted that LV1 when untreated is usually fatal.

Em diferentes regiões geográficas, o ciclo de transmissão da doença se estabelece quando se encontram próximos, em um ambiente favorável, os vetores (fêmeas de flebotomíneos dos gêneros Lutzomiya e Phlebotomus) infectados por formas promastigotas de alguma das várias espécies de Leishmania e o hospedeiro definitivo (mamíferos, sendo o homem hospedeiro acidental). Formas promastigotas, após terem sido introduzidas na pele dos hospedeiros definitivos, são fagocitadas e se transformam em formas amastigotas, que permanecem em contato com o sistema imune do hospedeiro durante a infecção ativa. O cão é considerado o principal reservatório doméstico da LV em nosso meio (Matlashewski, G. 2001. Leishmania infection and virulence: Med Microbiol. Immunol., 190: 37-42). O controle da Ieishmaniose visceral (LV) no Brasil se faz por meio da eliminação dos reservatórios domésticos da doença (cães infectados), controle das populações de vetor e, quando possível, pela prevenção do contato com vetores infectados. Cães infectados, sintomáticos ou não, podem transmitir os parasitas ao inseto vetor (Courtenay, O., R. J. Quinnell, L. M. Garcez, J. J. Shaw, and C. Dye. 2002. infectiousness in a cohort of Brazilian dogs: why culling fails to control visceral Ieishmaniasis in areas of high transmission. J. Infect. Dis. 186:1314-1320). Assim, a prevalência e incidência da infecção canina são parâmetros fundamentais para o controle da transmissão. No entanto, a estimativa das mesmas depende de métodos confiáveis de identificação dos cães infectados (Dye, C., E. Vidor, and J. Deneure. 1993. Serological diagnosis of leishmaniasis: on detecting infection as poço as disease. Epidemiol. Infect. 103:647-656; Dye, C., R. Killick-Kendrick, Μ. M. Vitutia, R. Walton, M. Killick-Kendrick, A. E. Harith, M. W. Guy, M.-C. Canãvate and G. Hasibeder. 1992. Epidemiology of canine leishmaniasis: prevalence, incidence and basic reproduction number calculated from a cross-sectional serological survey on the island of Gozo, Malta. Parasitology 105:35-41; Quinnell, R. J., O. Courtenay, L. Garcez, and C. Dye. 1997. The epidemiology of canine leishmaniasis: transmission rates estimated from a cohort study in Amazonian Brazil. Parasitology 115:143-156). Estudos baseados em modelagem matemática indicam, porém, que medidas de controle baseadas na detecção sorológica dos cães falham devido à alta incidência da infecção em cães, à alta infectividade dos parasitas, à falta de sensibilidade dos testes de diagnóstico sorológico e à demora entre diagnóstico e eliminação dos cães positivos, entre outros aspectos (Courtenay et al. 2002).In different geographic regions, the disease transmission cycle is established when the vectors (females of sandflies of Lutzomiya and Phlebotomus genera) infected by promastigote forms of any of the various Leishmania species and the definitive host are in a favorable environment. (mammals, being the accidental host man). Promastigote forms, after being introduced into the skin of definitive hosts, are phagocytized and become amastigote forms, which remain in contact with the host immune system during active infection. The dog is considered the main domestic reservoir of VL in our country (Matlashewski, G. 2001. Leishmania infection and virulence: Med Microbiol. Immunol., 190: 37-42). Control of visceral leishmaniasis (VL) in Brazil is done by eliminating domestic disease reservoirs (infected dogs), controlling vector populations and, when possible, by preventing contact with infected vectors. Infected dogs, symptomatic or not, can transmit the parasites to the insect vector (Courtenay, O., RJ Quinnell, LM Garcez, JJ Shaw, and C. Dye. 2002. infectiousness in a cohort of Brazilian dogs: why culling fails to visceral control Ieishmaniasis in areas of high transmission (J. Infect. Dis. 186: 1314-1320). Thus, the prevalence and incidence of canine infection are fundamental parameters for the control of transmission. However, their estimation depends on reliable methods of identifying infected dogs (Dye, C., E. Vidor, and J. Deneure. 1993. Serological diagnosis of leishmaniasis: on detecting infection as well as disease. Epidemiol. Infect. 103: 647-656; Dye, C., R. Killick-Kendrick, J. M. Vitutia, R. Walton, M. Killick-Kendrick, A. Harith, MW Guy, M.- C. Canavate and G. Hasibeder. 1992. Epidemiology of canine leishmaniasis: prevalence, incidence and basic reproduction number calculated from a cross-sectional serological survey on the island of Gozo, Malta Parasitology 105: 35-41; Quinnell, RJ, O. Courtenay, L. Garcez, and C. Dye 1997. The epidemiology of canine leishmaniasis: transmission rates estimated from a cohort study in Amazonian Brazil (Parasitology 115: 143-156). However, studies based on mathematical modeling indicate that control measures based on serological detection of dogs fail due to the high incidence of infection in dogs, the high infectivity of parasites, the lack of sensitivity of serological diagnostic tests and the delay between diagnosis and diagnosis. elimination of positive dogs, among other aspects (Courtenay et al. 2002).

A aplicação das medidas de controle da LV no Brasil é extremamente complexa e onerosa, devido ao complexo ciclo de transmissão da doença, que envolve reservatórios domésticos,silvestres e insetos vetores, à precária condição sócio-econômica da população em muitas regiões do país e à urbanização e expansão da doença para áreas onde, até recentemente, ela não era registrada. Outros aspectos referem-se às diferenças ecoepidemiológicas da doença em diferentes regiões do país, à baixa sensibilidade dos testes de diagnóstico sorológicos convencionais, especialmente para a detecção de cães que se encontram nos estágios iniciais da doença, e à demora entre o diagnóstico e a eliminação dos cães infectados. Recentemente, a introdução de uma vacina no mercado contra a LV canina (Leishmune® - FordDodge), constituída de complexo antigênico FML purificado de formas promastigotas, tem dificultado a adoção dessas medidas de controle, uma vez que cães vacinados se tornam soropositivos nos testes convencionais, que empregam antígenos de formas promastigotas dos parasitas. Esse aspecto relaciona-se à presença dos mesmos antígenos na vacina e nos testes de diagnóstico sorológico que empregam formas promastigotas do parasita. Essa dificuldade poderia ser contornada empregando-se vacinas que não induzem soroconversão dos cães nos testes de diagnóstico empregando antígenos de formas promastigotas ou empregando-se nos testes sorológicos antígenos distintos daquelas presentes nas vacinas. Independentemente das características específicas de cada vacina, em um cenário complexo como esse, a introdução de novas ferramentas de controle pressupõe a não interferência com as demais medidas de controle vigentes.The application of VL control measures in Brazil is extremely complex and costly due to the complex cycle of disease transmission, which involves domestic reservoirs, wild and insect vectors, the poor socioeconomic status of the population in many regions of the country and the urbanization and expansion of the disease to areas where until recently it was not registered. Other aspects refer to the ecoepidemiological differences of the disease in different regions of the country, the low sensitivity of conventional serological diagnostic tests, especially for the detection of dogs in the early stages of the disease, and the delay between diagnosis and elimination. of infected dogs. Recently, the introduction of a canine LV vaccine (Leishmune® - FordDodge) consisting of promastigote-purified FML antigen complex has made it difficult to adopt these control measures as vaccinated dogs become seropositive in conventional tests. , which employ antigens of promastigote forms of the parasites. This aspect is related to the presence of the same antigens in the vaccine and in serological diagnostic tests that employ promastigote forms of the parasite. This difficulty could be overcome by employing vaccines that do not induce seroconversion of dogs in diagnostic tests by employing antigens of promastigote forms or by employing antigen antibodies other than those present in vaccines. Regardless of the specific characteristics of each vaccine, in such a complex scenario, the introduction of new control tools presupposes no interference with other control measures in force.

O diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é conduzido por meio de testes sorológicos e parasitológicos em aspirados de baço, medula óssea, biópsia das lesões e Iinfonodos (WHO, 2002; Tavares CA, Fernandes AP, Melo MN. 2003. Molecular diagnosis of leishmaniasis. Expert Rev Mol Diagn. 3(5):657-67). Devido às limitações dos métodos de diagnóstico direto, tais como microscopia, cultura, inoculação em hamsters de amostras de biopsia, a presença de anticorpos contra os parasitas por meio de reação de imunofluorescência ou ELISA empregando antígenos de formas promastigotas de Leishmania sp. é pesquisada rotineiramente como marcador de infecção (Dye et al., 1993; Grimaldi, G., Jr., and R. B. Tesh. 1993. Leishmaniasis of the New World: current concepts and implications for future research. Clin. Microbiol. Rev. 6:230-250; Tavares et al., 2003).The diagnosis of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) is conducted through serological and parasitological tests on spleen, bone marrow, lesion biopsy and lymph node aspirates (WHO, 2002; Tavares CA, Fernandes AP, Melo MN. 2003. Molecular diagnosis of leishmaniasis Expert Rev Mol Diagn. 3 (5): 657-67). Due to the limitations of direct diagnostic methods such as microscopy, culture, hamster inoculation of biopsy samples, the presence of antibodies against parasites by immunofluorescence reaction or ELISA employing antigens of promastigote forms of Leishmania sp. is routinely researched as a marker of infection (Dye et al., 1993; Grimaldi, G., Jr., and RB Tesh. 1993. Leishmaniasis of the New World: current concepts and implications for future research. Clin. Microbiol. Rev. 6 : 230-250; Tavares et al., 2003).

Vários tipos de testes sorológicos e antígenos têm sido avaliados, mas a sorologia é, em geral, menos específica do que a detecção de parasitas em amostras de biópsia, devido à reatividade cruzada com outros agentes como Erlichia canis e riquetsias. Os testes sorológicos disponíveis para o diagnóstico indireto incluem a reação de imunofluorêscencia (IFAT), ELISAs, dot-ELISA, teste de aglutinação direta, Western blotting, e teste imunocromatográfico (Mancianti, F. and N. Meciani. 1988. Specific serodiagnosis of canine Ieishmaniasis by indirect immunofluorescence, indirect hemagglutination, and counter-immunoelectrophoresis. Am. J. Vet. Res. 49:1409-1411; Badaró, R., D. Benson1 M. C. Eulálio, M. Freire, S. Cunha, Ε. M. Neto, D. Pedral-Sampaio, C. Madureira, J. M. Burns, R. L. Houghton, J. R. David, and S. G. Reed. 1996. rK39: a cloned antigen of Leishmania chagasi that predicts active visceral leishmaniasis. J. Infect. Dis. 173:758-761; Vercammen, F., D. Berkvens, J. Brandt, and W. Vansteenkiste. 1998. A sensitive and specific 30-min Dot-ELISA for the detection of anti-leishmania antibodies in the dog. Vet. Parasitol. 79:221-228; Harith, Α., A. H. Kolk, P. A. Kager, J. Leeuwenburg, R. Muigai, S. Kiugu, and J. J. Laarman. 1986. A simple and economical direct agglutination test for serodiagnosis and sero-epidemiological studies of visceral leishmaniasis.Trans. R. Soe. Trop. Med. Hyg. 80:583-587; Aisa, M. J., S. Castillejo, M. Gallego, R. Fisa, M. C. Riera, M. De Colmenares, S. Torras, X. Roura, J. Sentis, and M. Portus. 1998. Diagnostic potential of Western blot analysis of sera from dogs with leishmaniasis in endemic areas and significance of the pattern. Am. J. Trop. Med. Hyg.; 58:154-159; Teodoro da Costa, R., J. C. Franca, W. Mayrink, E. Nascimento, O. Genaro, and A. Campos-Neto. 2003. Standardization of a rapid immunochromatographic test with the recombinant antigens K39 and K26 for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis. Trans. R. Soe. Trop. Med. Hyg. 97:678-682). A avaliação destes testes indica que, em geral, eles apresentam sensibilidade adequada para o sorodiagnóstico da LVC, em cães sintomáticos. Além dos testes sorológicos, testes imunocitoquímicos e moleculares, baseados em reações de PCR, também foram desenvolvidos para detecção de DNA de Leishmania em amostras humanas e de cães (Quinnell, R. J., O. Courtenay, S. Davidson, L. Garcez, B. Lambson, P. Ramos, J. J. Shaw1 M. A. Shaw, and C. Dye. 2001. Detection of Leishmania infantum by PCR, serology and immune response in a cohort study of Brazilian dogs. Parasitology 122:253-261; Reithinger, R., R. J. Quinnell, Β. Alexander1 and C. R. Davies. 2002. Rapid detection of Leishmania infantum infection in dogs: comparative study using an immunochromatographic dipstick test, enzyme-linked immunosorbentassay, and PCR. J. Clin. Microbiol.Several types of serological and antigen tests have been evaluated, but serology is generally less specific than detection of parasites in biopsy specimens due to cross-reactivity with other agents such as Erlichia canis and rickettsiae. Serological tests available for indirect diagnosis include immunofluorescence reaction (IFAT), ELISAs, dot-ELISA, direct agglutination test, Western blotting, and immunochromatographic test (Mancianti, F. and N. Meciani. 1988. Specific serodiagnosis of canine Ieishmaniasis by indirect immunofluorescence, indirect hemagglutination, and counterimmunoelectrophoresis Am J. Vet Res 49: 1409-1411 Badaró R. D. Benson MC Eulalius M. Freire S. Cunha M. Neto, D. Pedral-Sampaio, C. Madureira, JM Burns, RL Houghton, JR David, and SG Reed 1996. rK39: a cloned antigen of Leishmania chagasi that predicts active visceral leishmaniasis J. Infect Dis. 173: 758 -761; Vercammen, F., D. Berkvens, J. Brandt, and W. Vansteenkiste, 1998. A sensitive and specific 30-min Dot-ELISA for detection of anti-leishmania antibodies in the dog. : 221-228 Harith, A., AH Kolk, PA Kager, J. Leeuwenburg, R. Muigai, S. Kiugu, and JJ Laarman 1986. A simple and economical direct agglutination test for serodiagnosis and sero-epidemiological studies of visceral leishmaniasis.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 80: 583-587; Aisa, M. J., S. Castillejo, M. Gallego, R. Fisa, M. C. Riera, M. De Colmenares, S. Torras, X. Roura, J. Sentis, and M. Portus. 1998. Diagnostic potential of Western blot analysis of sera from dogs with leishmaniasis in endemic areas and significance of the pattern. Am. J. Trop. Med. Hyg .; 58: 154-159; Theodore da Costa, R., J. C. Franca, W. Mayrink, E. Nascimento, O. Genaro, and A. Campos-Neto. 2003. Standardization of a rapid immunochromatographic test with the recombinant antigens K39 and K26 for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis. Trans R. Soc. Trop. Med. Hyg. 97: 678-682). The evaluation of these tests indicates that, in general, they present adequate sensitivity for the diagnosis of CVL in symptomatic dogs. In addition to serological tests, PCR-based immunocytochemical and molecular tests have also been developed for detection of Leishmania DNA in human and dog samples (Quinnell, RJ, O. Courtenay, S. Davidson, L. Garcez, B. Lambson, P. Ramos, JJ Shaw, MA Shaw, and C. Dye, 2001. Detection of Leishmania infantum by PCR, serology and immune response in a cohort study of Brazilian dogs, Parasitology 122: 253-261, Reithinger, R., RJ Quinnell, A. Alexander1 and CR Davies 2002. Rapid detection of Leishmania infantum infection in dogs: comparative study using an immunochromatographic dipstick test, enzyme-linked immunosorbentassay, and PCR J. Clin.

40:2352-2356). Entretanto, estes testes são laboriosos e de custo elevado, pois requerem equipamentos especializados e corpo técnico treinado, o que inviabiliza a sua aplicação em muitos casos. Estudos sugerem que a PCR é mais útil para detectar infecção ativa enquanto a sorologia pode ser mais sensível para detecção de todos os animais infectados (Quinnell et al., 2001). O diagnóstico sorológico da LVC por ELISA empregando extrato de40: 2352-2356). However, these tests are laborious and costly because they require specialized equipment and trained staff, which makes their application unfeasible in many cases. Studies suggest that PCR is most useful for detecting active infection while serology may be more sensitive for detecting all infected animals (Quinnell et al. 2001). The serological diagnosis of CVL by ELISA using extract of

promastigotas ou Reação de Imunofluorescência ainda possui limitações relacionadas ao preparo e padronização dos antígenos de formas promastigotas e também pelo fato de requerer pessoal treinado e equipamentos especializados, dificultando sua aplicação rápida. Testes mais rápidos, como a imunocromatografia utilizando antígenos de proteínas recombinantes de L infantum como o K39 (rK39) e rK26, têm auxiliado no diagnóstico de casos de LVC sintomáticos. Notam-se, no entanto, limitações para diferenciar cães assintomáticos de sintomáticos. Outro teste foi introduzido no mercado recentemente pela empresa Biogene, contendo o antígeno recombinante HSP70, denominado S7. No entanto, detecta-se uma escassez de dados da literatura em relação à avaliação de sensibilidade e especificidade e validação desse teste. Resultados preliminares obtidos pelo nosso grupo indicam elevada discordância em relação ao testes convencionais no diagnóstico de cães assintomáticos e sintomáticos. Outro aspecto que deve ser ressaltado refere-se ao fato de que oPromastigotes or Immunofluorescence Reactions still have limitations related to the preparation and standardization of antigens in promastigote forms and also because it requires trained personnel and specialized equipment, hindering their rapid application. Faster tests, such as immunochromatography using L infantum recombinant protein antigens such as K39 (rK39) and rK26, have aided in the diagnosis of symptomatic LVC cases. However, limitations to distinguish asymptomatic from symptomatic dogs are noted. Another test was recently introduced on the market by the company Biogene, containing the recombinant antigen HSP70, called S7. However, there is a scarcity of literature data regarding the sensitivity and specificity evaluation and validation of this test. Preliminary results obtained by our group indicate high disagreement with conventional tests in the diagnosis of asymptomatic and symptomatic dogs. Another aspect that should be emphasized refers to the fact that the

Ministério da Saúde investiu na implantação e capacitação de laboratórios em todo o país para o diagnóstico sorológico da LVC e que esse esforço não deve ser desperdiçado, mas sim aprimorado. Testes de diagnóstico moleculares se apresentam como alternativas devido a sua alta sensibilidade, mas são ainda laboriosos e onerosos. Desta forma, o aprimoramento de testes de diagnóstico sorológico que possam se valer da infra-estrutura e capacitação instaladas tem óbvias vantagens para a aplicação no SUS. O antígeno A2, expresso pelas formas amastigotas de espécies viscerotrópicas, pertence a uma família de proteínas que possui um número variável de repetições de uma unidade de 10 aminoácidos, sendo considerado o primeiro fator de virulência amastigota específico descrito (Charest, H. and G.Ministry of Health has invested in the establishment and training of laboratories throughout the country for the serological diagnosis of CVL and that this effort should not be wasted, but improved. Molecular diagnostic tests are presented as alternatives due to their high sensitivity, but are still laborious and costly. Thus, the improvement of serological diagnostic tests that can take advantage of the installed infrastructure and training has obvious advantages for application in the SUS. The A2 antigen, expressed by the amastigote forms of viscerotropic species, belongs to a protein family that has a variable number of repeats of a unit of 10 amino acids, being considered the first specific amastigote virulence factor described (Charest, H. and G.

Matlashewski. 1994. "Developmental gene expression in Leishmania donovani: differential cloning and analysis of an amastigote-stage-specific gene." Mol Cell Biol 14(5): 2975-84; Zhang, W. W. and G. Matlashewski. 1997. Loss of virulence in Leishmania donovani deficient in an amastigote-specific protein, A2. Proc Natl Acad Sci U S A 94(16): 8807-11). A2 se mostrou reativo em 60 e 82% dos pacientes soropositivos com o kala-azar da índia e do Sudão, respectivamente, no teste de ELISA (Ghedin, E., W. W. Zhang, H. Charest, S. Sundar, R. T. Kenney, and G. Matlashewski. 1997. Antibody response against Leishmania donovani amastigote-stage-specific protein in patients with visceral leishmaniasis. Clin. Diagn.Lab. Immunol. 4:530-535). No Brasil, os anticorpos anti-A2 foram detectados por ELISA em 77% dos soros dos pacientes com LV sintomático e em 87% dos soros dos cães positivos pela IFAT para Leishmania ou na avaliação parasitológica (Carvalho, F. Α. Α., H. Charest, C. A. P. Tavares, G. Matlashewski, Ε. P. Valente, A. Rabello, R. T. Gazinelli, and A. P. Fernandes. 2002. Diagnosis of American visceral leishmaniasis in humans and dogs using the recombinant Leishmania donovani AZ antigen. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 43:289-295). Em um estudo recente, foram avaliados comparativamente antígenos recombinantes parasita-específicos rK39, rK26, e rA2 e o antígeno solúvel (CSA) em testes de ELISA (Porrozzi, R., Μ. V. S. Costa, A. Teva, A., Campos-Neto, A., Fernandes, A.P., Gazzinelli, RT., Grimaldi, G. Jr. 2007. Comparative evaluation of enzime-linked immunosorbent assays based on crude and recombinant Ieishmanial antigens for serodiagnosis of symptomatic and asymptomatic Leishmania infantum visceral infections in dogs. Clinicai and Vaccine Immunology 14:544-548). Os resultados mostraram que estes marcadores apresentam sensibilidade elevada para o diagnóstico da LVC em caes sintomáticos, que apresentam em geral elevados títulos de anticorpos. No entanto, quando foi calculada a razão entre casos sintomáticos e assintomáticos que foram identificados por cada antígeno, A2 foi o antígeno que apresentou o mais alto índice, seguido por K39, K26 e CSA1 sugerindo associação entre resposta a A2 e imunidade protetora. Além disso, a especificidade do teste empregando A2 foi de 96%, enquanto para os outros antígenos variou entre 85 a 90% (Porrozzi et al. 2007). Esses dados sugerem que esses marcadores podem se complementar aumentando a sensibilidade total dos testes de detecção de anticorpos em cães sintomáticos e assintomáticos infectados por espécies de Ieishmania que causam a LVC.Matlashewski. 1994. "Developmental gene expression in Leishmania donovani: differential cloning and analysis of an amastigote-stage-specific gene." Mol Cell Biol 14 (5): 2975-84; Zhang, W. W. and G. Matlashewski. 1997. Loss of virulence in Leishmania donovani deficient in an amastigote-specific protein, A2. Proc Natl Acad Sci US 94 (16): 8807-11). A2 was reactive in 60 and 82% of seropositive patients with Indian and Sudan kala-azar, respectively, in the ELISA (Ghedin, E., WW Zhang, H. Charest, S. Sundar, RT Kenney, and G. Matlashewski 1997. Antibody response against Leishmania donovani amastigote-stage-specific protein in patients with visceral leishmaniasis (Clin. Diagn.Lab. Immunol. 4: 530-535). In Brazil, anti-A2 antibodies were detected by ELISA in 77% of the sera of patients with symptomatic VL and 87% of the sera of dogs positive by IFAT for Leishmania or parasitological evaluation (Carvalho, F. Α. Α., H Charest, CAP Tavares, G. Matlashewski, P. Valente, A. Rabello, RT Gazinelli, and AP Fernandes 2002. Diagnosis of American visceral leishmaniasis in humans and dogs using the recombinant Leishmania donovani AZ antigen Diagnosis Microbiol. Infect Dis, 43: 289-295). In a recent study, rK39, rK26, and rA2 parasite-specific recombinant antigens and soluble antigen (CSA) were evaluated in ELISA (Porrozzi, R., Costa. VS Costa, A. Teva, A., Campos- Neto, A., Fernandes, AP, Gazzinelli, RT., Grimaldi, G. Jr. 2007. Comparative evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays based on crude and recombinant Leishmanial antigens for serodiagnosis of symptomatic and asymptomatic Leishmania infantum visceral infections in dogs. Clinical and Vaccine Immunology 14: 544-548). The results showed that these markers present high sensitivity for the diagnosis of CVL in symptomatic dogs, which generally have high antibody titers. However, when the ratio between symptomatic and asymptomatic cases that were identified by each antigen was calculated, A2 was the antigen with the highest index, followed by K39, K26, and CSA1 suggesting an association between A2 response and protective immunity. In addition, the specificity of the test employing A2 was 96%, while for the other antigens it ranged from 85 to 90% (Porrozzi et al. 2007). These data suggest that these markers may complement each other by increasing the total sensitivity of antibody detection tests in symptomatic and asymptomatic dogs infected with Yeishmania species that cause CVL.

Embora os dados apresentados por Porrozzi et al. (2007) demonstrem uma considerável melhoria na sensibilidade e especificidade de testes com antígenos recombinantes em comparação com testes empregando extrato antigênico, observa-se que ainda existem limitações em relação a uma menor sensibilidade dos testes empregando os antígenos K39, K26 e extrato antigênico em relação ao diagnóstico de cães assintomáticos. Esses animais tendem em geral a apresentar títulos de anticorpos mais baixos, menores que 1:640. No entanto, animais assintomáticos podem apresentar os parasitos na pele e representar uma importante fonte de transmissão dos mesmos para os vetores, resultando na manutenção da transmissão da infecção e sendo um dos fatores importantes para a falência das medidas de controle. Assim, testes mais sensíveis e específicos, capazes de detectar cães assintomáticos e/ou com baixos títulos de anticorpos, se fazem ainda necessários. Considerando que a detecção e o sacrifício de cães com sorologia positiva ainda é adotado no Brasil como medida de controle e que animais com baixos títulos de anticorpos e assintomáticos podem transmitir a infecção, o emprego de testes de diagnóstico com maior sensibilidade para esse tipo de animal pode apresentar impacto favorável sobre as medidas de controle da Ieishmaniose visceral no Brasil.Although data presented by Porrozzi et al. (2007) demonstrate a considerable improvement in the sensitivity and specificity of recombinant antigen tests compared to tests using antigen extract, it is observed that there are still limitations regarding a lower sensitivity of the tests employing K39, K26 and antigen extract antigens. diagnosis of asymptomatic dogs. These animals generally tend to have lower antibody titers less than 1: 640. However, asymptomatic animals may present the parasites in the skin and represent an important source of transmission to the vectors, resulting in the maintenance of infection transmission and being one of the important factors for the failure of control measures. Thus, more sensitive and specific tests capable of detecting asymptomatic dogs and / or with low antibody titers are still needed. Considering that the detection and sacrifice of dogs with positive serology is still adopted in Brazil as a control measure and that animals with low asymptomatic antibody titers can transmit the infection, the use of diagnostic tests with higher sensitivity for this type of animal. may have a favorable impact on visceral heemaniasis control measures in Brazil.

A associação de antígenos definidos é uma estratégia importante para o aprimoramento dos métodos de diagnóstico sorológico, uma vez que antígenos recombinantes, tais como rK39, rK26, e rA2, apesar de apresentarem elevada especificidade, quando empregados isoladamente podem apresentar menor sensibilidade (Carvalho et al. 2002; Porrozi et al., 2007). No entanto, estes marcadores apresentam o potencial de se complementarem, aumentando a sensibilidade total nos testes sorológicos de cães sintomáticos (Porrozzi et al., 2007). Assim, combinações de antígenos podem ser mais sensíveis do que uma única proteína ou epítopo, considerando a heterogeneidade genética das populações caninas. Antígenos recombinantes também podem apresentar especificidade reduzida se epítopos presentes em sua seqüência são também compartilhados por moléculas ortólogas presentes em outros organismos. Usando métodos moleculares, esses problemas podem ser contornados com a remoção destas seqüências, resultando em moléculas otimizadas tanto para sensibilidade quanto especificidade. Instrumentos disponíveis on Iine podem ser úteis para predição de epítopos de células Β. A partir de um antígeno com seqüência conhecida e que tenha apresentado reatividade com soros de cães e pacientes com Ieishmaniose visceral, pode-se identificar as porções da molécula com maior afinidade por anticorpos e sintetizar os peptídeos correspondentes, otimizando em cada molécula a reatividade em testes sorológicos.The association of defined antigens is an important strategy for the improvement of serological diagnosis methods, since recombinant antigens, such as rK39, rK26, and rA2, although presenting high specificity, when used alone may present lower sensitivity (Carvalho et al. 2002; Porrozi et al., 2007). However, these markers have the potential to complement each other, increasing overall sensitivity in serological testing of symptomatic dogs (Porrozzi et al., 2007). Thus, antigen combinations may be more sensitive than a single protein or epitope, considering the genetic heterogeneity of canine populations. Recombinant antigens may also have reduced specificity if epitopes present in their sequence are also shared by orthologous molecules present in other organisms. Using molecular methods, these problems can be circumvented by removing these sequences, resulting in molecules optimized for both sensitivity and specificity. Instruments available on Iine may be useful for predicting Β cell epitopes. From an antigen with a known sequence that has reacted with sera from dogs and patients with visceral leishmaniasis, it is possible to identify the portions of the molecule with higher affinity for antibodies and synthesize the corresponding peptides, optimizing in each molecule the reactivity in tests. serological.

Tal abordagem foi empregada no presente estudo, selecionando-se, a partir das seqüências dos antígenos A2, NH e LACK, peptídeos correspondentes a regiões com características ótimas para reatividade como epítopos para células B. Assim, a presente invenção descreve um método e Kit para diagnosticar Leishmaniose através da associação dos antígenos definidos rA2, rNH e rLACK ou seus epítopos, permitindo o desenvolvimento de um método diagnóstico com maior sensibilidade, otimizando, dessa forma, aSuch an approach was employed in the present study by selecting, from the A2, NH and LACK antigen sequences, peptides corresponding to regions with optimal reactivity characteristics as B cell epitopes. Thus, the present invention describes a method and kit for diagnose Leishmaniasis by associating the defined antigens rA2, rNH and rLACK or their epitopes, allowing the development of a more sensitive diagnostic method, thus optimizing the

reatividade dos testes sorológicos.reactivity of serological tests.

Já se encontram patentes que descrevem o uso de antígenos de Ieishmania e a combinação destes no diagnóstico da Leishmaniose. Dentre os quais podemos citar:There are already patents describing the use of Ieishmania antigens and their combination in the diagnosis of Leishmaniasis. Among which we can mention:

O documento US20100136046- RECOMBINANT POLYPROTEIN VACCINES FOR THE TREATMENT AND DIAGNOSIS OF LEISHMANIASIS- descreve composições e métodos para prevenir, tratar e detectar leishmaniose. As composições geralmente incluem polipeptídeos de fusão compreendendo múltiplos antígenos de Leishmania, em particular, A2 KMPII, SMT, e /ou CBP, ou porções imunogênicas ou variantes das mesmas, bem como polinucleotídeos codificando tais polipeptídeos de fusão.US20100136046 RECOMBINANT POLYPROTEIN VACCINES FOR THE TREATMENT AND DIAGNOSIS OF LEISHMANIASIS describes compositions and methods for preventing, treating and detecting leishmaniasis. Compositions generally include fusion polypeptides comprising multiple Leishmania antigens, in particular, A2 KMPII, SMT, and / or CBP, or immunogenic portions or variants thereof, as well as polynucleotides encoding such fusion polypeptides.

O documento US20060211056- LEISHMANIA ANTIGENS SUITABLE FOR A DIAGNOSTIC KIT OF LEISHMANIA- descreve a obtenção de polipeptídeos de 10 aminoácidos consecutivos purificados a partir de Leishmania infantum. E, ainda, o uso desses polipeptídeos para diagnosticar LV Mediterrânea..US20060211056- LEISHMANIA ANTIGENS SUITABLE FOR A DIAGNOSTIC KIT OF LEISHMANIA- describes obtaining 10 consecutive amino acid polypeptides purified from Leishmania infantum. And yet, the use of these polypeptides to diagnose Mediterranean LV ..

O documento US7740859- POLYPEPTIDES FOR THE DIAGNOSIS AND THERAPY OF LEISHANANIASIS- descreve compostos e métodos para a detecção de anticorpos anti-leishmania em indivíduos suspeitos de infecção com o parasita protozoário do gênero Leishmania, onde o agente infeccioso é uma cepa indiana, semelhante ou muito relacionada à cepa de Leishmania indiana.US7740859 - POLYPEPTIDES FOR THE DIAGNOSIS AND THERAPY OF LEISHANANIASIS - describes compounds and methods for the detection of anti-leishmania antibodies in individuals suspected of infection with the Leishmania protozoan parasite, where the infectious agent is an Indian strain, similar or very similar. related to the strain of Indian Leishmania.

O documento PI9405713-3- DIAGNOSE DA LEISHMANIOSE- descreve um método para o diagnóstico da Ieishmaniose que compreende: (a) obter uma amostra a partir de um paciente sob suspeita de estar infectado com o parasita Leishmania contendo anticorpos do paciente e (b) determinar a presença de anticorpos que se ligam a uma unidade repetitiva do antígeno K39.PI9405713-3- LEISHMANIASIS DIAGNOSIS- describes a method for the diagnosis of leishmaniasis which comprises: (a) obtaining a sample from a patient suspected of being infected with the patient-containing Leishmania parasite and (b) determining the presence of antibodies that bind to a repetitive unit of the K39 antigen.

O documento W02010020028- PEPTÍDEOS SINTÉTICOS E POLÍMERO PARA IMUNIZAÇÃO CONTRA A LEISHMANIOSE- descreve dois peptídeos antigênicos sintéticos (epítopos ou mimotopos) selecionados e o método de conjugação desses peptídeos para formar um polímero. O polímero antigênico formado por esses peptídeos produz imunização contra Ieishmaniose visceral e será usado em método e kit imunodiagnóstico específico para detectar a doença.Document W02010020028- SYNTHETIC PEPTIDES AND POLYMER FOR LEISHMANIOSIS IMMUNIZATION- describes two selected synthetic antigenic peptides (epitopes or mimotopes) and the method of conjugating these peptides to form a polymer. The antigenic polymer formed by these peptides produces immunization against visceral leishmaniasis and will be used in a specific immunodiagnostic method and kit to detect the disease.

Breve Descrição das FigurasBrief Description of the Figures

Figura 1 - Reatividade do peptídeo 47 (1 pg/poço) frente a soros de cães que apresentam altos títulos de anticorpos (>1:640). Observa-se que nessas condições o peptídeo foi capaz de detectar 100% dos cães com altos títulos de anticorpos, apresentando alta sensibilidade e especificidade do peptídeo 47 com soros de cães com altos títulos de anticorpos. Figura 2 - Reatividade do peptideo 47 (1pg/poço) frente a soros de cães sintomáticos e assintomáticos. Observa-se que, nessas condições, o peptideo 47 foi capaz de detectar de forma comparável soros de cães sintomáticos e assintomáticos, representando, portanto, uma otimização da sensiblidade apresentada quando a proteína A2 recombinante foi testada frente aos mesmos soros, como descrito por Porrozzi et. al. (2007). Figura 3 - Reatividade do peptideo 17 (4pg/poço) frente a soros de cães que apresentam altos títulos de anticorpos (>1:640).Figure 1 - Reactivity of peptide 47 (1 pg / well) against dog sera with high antibody titers (> 1: 640). Under these conditions the peptide was able to detect 100% of dogs with high antibody titers, presenting high sensitivity and specificity of peptide 47 with sera from dogs with high antibody titers. Figure 2 - Reactivity of peptide 47 (1pg / well) against sera from symptomatic and asymptomatic dogs. Under these conditions, peptide 47 was able to detect sera from symptomatic and asymptomatic dogs in a comparable way, thus representing an optimization of the sensitivity presented when the recombinant A2 protein was tested against the same sera, as described by Porrozzi. et. al. (2007). Figure 3 - Reactivity of peptide 17 (4pg / well) against dog sera with high antibody titers (> 1: 640).

Figura 4 - Reatividade do peptideo 17 (250 ng/poço) frente a soros de cães sintomáticos e assintomáticos.Figure 4 - Reactivity of peptide 17 (250 ng / well) against sera from symptomatic and asymptomatic dogs.

Figura 5 - Reatividade do peptideo 18 (4pg/poço) frente a soros de cães que apresentam altos títulos de anticorpos (>1:640).Figure 5 - Reactivity of peptide 18 (4pg / well) against dog sera with high antibody titers (> 1: 640).

Figura 6 - Reatividade do peptideo 18 (250 ng/poço) frente a soros de cães sintomáticos e assintomáticos. Figura 7 - Reatividade do peptideo 19 (4pg/poço) frente a soros de cães que apresentam altos títulos de anticorpos (>1:640).Figure 6 - Reactivity of peptide 18 (250 ng / well) against sera from symptomatic and asymptomatic dogs. Figure 7 - Reactivity of peptide 19 (4pg / well) against dog sera with high antibody titers (> 1: 640).

Figura 8 - Reatividade do peptideo 19 (250 ng/poço) frente a soros de cães sintomáticos e assintomáticos.Figure 8 - Reactivity of peptide 19 (250 ng / well) against sera from symptomatic and asymptomatic dogs.

Figura 9 - Reatividade de combinações dos peptídeos 47 e 17 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos.Figure 9 - Reactivity of combinations of peptides 47 and 17 (500 ng / well) against sera from dogs with low (<1: 320) and medium (> 1: 320 <1: 640) antibody titers.

Figura 10 - Reatividade de combinações dos peptídeos 47 e 18 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos.Figure 10 - Reactivity of combinations of peptides 47 and 18 (500 ng / well) against sera from dogs with low (<1: 320) and medium (> 1: 320 <1: 640) antibody titers.

Figura 11 - Reatividade de combinações dos peptídeos 47 e 19 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos.Figure 11 - Reactivity of combinations of peptides 47 and 19 (500 ng / well) against sera from dogs with low (<1: 320) and medium (> 1: 320 <1: 640) antibody titers.

Figura 12 - Reatividade de combinações dos peptídeos 17 e 18 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos. Figura 13 - Reatividade de combinações dos peptídeos 17 e 19 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos.Figure 12 - Reactivity of combinations of peptides 17 and 18 (500 ng / well) against sera from dogs with low (<1: 320) and medium (> 1: 320 <1: 640) antibody titers. Figure 13 - Reactivity of combinations of peptides 17 and 19 (500 ng / well) against sera from dogs with low (<1: 320) and medium (> 1: 320 <1: 640) antibody titers.

Figura 14 - Reatividade de combinações dos peptídeos 18 e 19 (500 ng/poço), frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos.Figure 14 - Reactivity of combinations of peptides 18 and 19 (500 ng / well) against sera from dogs with low (<1: 320) and medium (> 1: 320 <1: 640) antibody titers.

Figura 15 - Dados das reações de ELISA, utilizando-se soro humano, em que os peptídeos foram testados isoladamente na quantidade de 4pg/poço. Figura 16 - Dados das reações de ELISA, utilizando-se soro humano, em que os peptídeos foram testados em associação.Figure 15 - Data from ELISA reactions using human serum, where the peptides were tested alone in the amount of 4pg / well. Figure 16 - Data from ELISA reactions using human serum where peptides were tested in combination.

Descrição Detalhada da InvençãoDetailed Description of the Invention

Na presente invenção foi feita uma combinação de peptídeos correspondentes a regiões com características ótimas para reatividade como epítopos para células B, selecionados a partir das seqüências dos antígenos A2, NH e LACK de leishmania, empregando os critérios descritos na tabela 1. Tais peptídeos foram então testados, isoladamente ou em combinação, frente a soros de cães sintomáticos, assintomáticos e com baixos (< 1:320) e médios (1:320 > 1:640) títulos de anticorpos. Cabe ressaltar que foram empregados nessa análise os mesmos soros categorizados como provenientes de cães sintomáticos e assintomáticos testados previamente por Porrozzi et al. (2007), permitindo a comparação com os mesmos antígenos sob a forma de proteínas recombinantes. Os peptídeos foram testados também frente a soros humanos de pacientes diagnosticados com Ieishmaniose visceral e soros controle de indivíduos hígidos.In the present invention a combination of peptides corresponding to regions with optimal reactivity characteristics such as B-cell epitopes selected from the leishmania A2, NH and LACK antigen sequences was made using the criteria described in Table 1. Such peptides were then tested, alone or in combination, against serum from symptomatic, asymptomatic, low (<1: 320) and medium (1: 320> 1: 640) antibody titers. It should be noted that the same sera categorized as coming from symptomatic and asymptomatic dogs previously tested by Porrozzi et al. (2007), allowing the comparison with the same antigens in the form of recombinant proteins. The peptides were also tested against human sera from patients diagnosed with visceral leishmaniasis and control sera from healthy individuals.

As seqüências das proteínas A2 e LACK e NH foram submetidas aThe A2 and LACK and NH protein sequences were subjected to

análise com programas disponíveis online no site http://www.expasv.org/tools/protscale.html· Os programas aos quais as sequencias foram submetidas geram gráficos e valores de scores que são considerados de acordo com as características ideais para a presença de epítopos de células Β. A seleção das seqüências sintetizadas como peptídeos com características de epítopos de células B obedeceu os seguintes critérios: Tabela 1- Critérios utilizados para seleção das seqüências sintetizadasanalysis with programs available online at http://www.expasv.org/tools/protscale.html· The programs to which the sequences were submitted generate graphs and score values that are considered according to the ideal characteristics for the presence of ep cell epitopes. The selection of sequences synthesized as peptides with B-cell epitope characteristics met the following criteria: Table 1- Criteria used for selection of synthesized sequences.

Característica Referência Valores de Scores Regiões com estrutura Folha beta de acordo com Chou & Fasman deve ser baixo Regiões com estrutura Alfa-hélice / Deleage & Roux deve ser alto Hidrofobicidade / Hopp & Woods deve ser alta Regiões com estrutura Alfa-hélice Chou & Fasman deve ser alto Regiões com estrutura Beta-turn Chou & Fasman deve ser alto Coil Deleage & Roux deve ser baixo Porcentagem de resíduos acessíveis deve ser altaFeature Reference Scores Values Structured regions Beta sheet according to Chou & Fasman should be low Regions with Alpha-helix / Deleage & Roux structure should be high Hydrophobicity / Hopp & Woods should be high Regions with Alpha-helix structure Chou & Fasman should be high be high Beta-turn regions Chou & Fasman must be high Coil Deleage & Roux must be low Percentage of accessible waste must be high

Com base nesses critérios, foram selecionadas as seguintes seqüências: SVGPQSVGPLSVGPQSVGPLSC, correspondendo ao Peptídeo 47(SEQ ID N°1), derivado do antígeno A2, STPAVQKRVKEVGTKPC eBased on these criteria, the following sequences were selected: SVGPQSVGPLSVGPQSVGPLSC, corresponding to Peptide 47 (SEQ ID NO: 1), derived from A2 antigen, STPAVQKRVKEVGTKPC and

STTWGNQTLEKVTC, correspondendo ao Peptídeo 17 e 18 (SEQ ID N°2 e N°3), respectivamente, derivados do antígeno nucleosídeo hidrolase e SWSTSRDGTAISWKC, correspondendo ao peptídeo 19(SEQ ID N°4), derivado do antígeno LACK.STTWGNQTLEKVTC, corresponding to Peptide 17 and 18 (SEQ ID No. 2 and No. 3), respectively, derived from the nucleoside antigen hydrolase and SWSTSRDGTAISWKC, corresponding to peptide 19 (SEQ ID No. 4), derived from the LACK antigen.

A presente invenção será melhor descrita através dos exemplos a seguir. Ressalta-se que esses exemplos não possuem a intenção de limitar a natureza da invenção, mas, ao contrário, ilustram e ajudam na compreensão da tecnologia. Ainda, o teste para imunodiagnóstico de Ieishmaniose pode ser selecionado do grupo compreedendo ELISA, Western blot, dot blot, imunodifusão e imunocromatografia. Nos exemplos que se seguem foi utilizado o teste de ELISA.The present invention will be further described by way of the following examples. It is emphasized that these examples are not intended to limit the nature of the invention, but rather illustrate and aid understanding of the technology. In addition, the Ieishmaniasis immunodiagnosis test can be selected from the group comprising ELISA, Western blot, dot blot, immunodiffusion and immunochromatography. In the following examples the ELISA test was used.

Exemplo 1Example 1

Para testar a reatividade do peptídeo 47 como antígeno em testes de diagnóstico da Ieishmaniose visceral canina, o mesmo foi utilizado para sensibilizar placas de ELISA, de acordo com o protocolo descrito a seguir.To test the reactivity of peptide 47 as an antigen in diagnostic tests for canine visceral leishmaniasis, it was used to sensitize ELISA plates according to the protocol described below.

Placas de 96 poços (Flexible PVC Microplates, flat-bottom, BD Biosciences) foram sensibilizadas com o peptídeo sintético 47, derivado do antígeno A2, diluído em água. Foram testadas variações nas quantidades de peptídeo por poço, dependendo do ensaio (4 ou 1pg/poço ou ainda 0,5 ou 0,250 pg/poço). As placas foram mantidas em estufa até a secagem e depois na geladeira por 18 horas a 4 0C. As placas foram bloqueadas com PBS-2% caseína a 37 0C por 1 hora e incubadas com soros de cães na diluição de 1:100 por 1 hora a 37 0C. Anticorpos marcados com Peroxidase específicos para IgG canina (Sigma, USA) foram diluídos 1:5000 e adicionados aos poços por 1 hora a 37 0C. Após a lavagem das placas, foi adicionado o substrato cromogênico 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) em tampão citrato contendo peróxido de hidrogênio. As reações foram interrompidas pela adição de H2SO4 2N. A densidade ótica foi determinada a 450 nm em leitor de ELISA (BioRad, Model 2550, CA, USA).96-well plates (Flexible PVC Microplates, flat-bottom, BD Biosciences) were sensitized with synthetic peptide 47 derived from A2 antigen diluted with water. Variations in peptide amounts per well were tested depending on the assay (4 or 1 pg / well or 0.5 or 0.250 pg / well). The plates were kept in an oven until dried and then refrigerated for 18 hours at 40 ° C. Plates were blocked with PBS-2% casein at 37 ° C for 1 hour and incubated with dog sera at 1: 100 dilution for 1 hour at 37 ° C. Canine IgG-specific Peroxidase-labeled antibodies (Sigma, USA) were diluted 1: 5000 and added to the wells for 1 hour at 37 ° C. After washing the plates, the chromogenic substrate 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) in citrate buffer containing hydrogen peroxide was added. Reactions were stopped by the addition of 2N H2SO4. Optical density was determined at 450 nm in an ELISA reader (BioRad, Model 2550, CA, USA).

Através da figura 1 pode-se observar que o peptídeo foi capaz de detectar 100% dos cães com altos títulos de anticorpos (>1:640), apresentando a alta sensibilidade e especificidade do peptídeo 47 frente soros de cães com altos títulos de anticorpos.Figure 1 shows that the peptide was able to detect 100% of dogs with high antibody titers (> 1: 640), presenting the high sensitivity and specificity of peptide 47 against sera from dogs with high antibody titers.

Exemplo 2Example 2

Observada a elevada reatividade do peptídeo 47 (4 pg/poço) com soros de cães com títulos altos de anticorpos (> 1:640), verificou-se também a possibilidade do mesmo reagir com soros de cães sintomáticos e assintomáticos, mas empregando-se uma menor quantidade de antígeno (250 ng/poço). Ressalta-se que foram empregados os mesmos soros utilizados por Porrozzi et. al. (2007).Observing the high reactivity of peptide 47 (4 pg / well) with sera from dogs with high antibody titers (> 1: 640), it was also possible to react with symptomatic and asymptomatic dog sera, but employing a smaller amount of antigen (250 ng / well). It is noteworthy that the same sera used by Porrozzi et. al. (2007).

Na figura 2 observa-se que o peptídeo 47 foi capaz de detectar de forma comparável soros de cães sintomáticos e assintomáticos, representando, portanto, uma otimização da sensibilidade apresentada quando a proteína A2 recombinante foi testada frente aos mesmos soros, como descrito por Porrozzi et. al. (2007).Figure 2 shows that peptide 47 was able to detect sera from symptomatic and asymptomatic dogs in a comparable manner, thus representing an optimization of sensitivity when the recombinant A2 protein was tested against the same sera, as described by Porrozzi et al. . al. (2007).

Exemplo 3Example 3

Para testar a reatividade do peptídeo 17, derivado do antígenoTo test the reactivity of peptide 17, derived from antigen

nucleosídeo hidrolase (NH), como antígeno em testes de diagnóstico da Ieishmaniose visceral canina, o mesmo foi utilizado para sensibilizar placas de ELISA, na quantidade de 4Mg/poço, de acordo com o protocolo de reações de ELISA descrito no exemplo 1. Inicialmente o peptídeo 17 foi utilizado na quantidade de 4pg/poço frente a soros de cães com títulos altos (>1:640) de anticorpos.nucleoside hydrolase (NH), as an antigen in diagnostic tests for canine visceral leishmaniasis, was used to sensitize 4Mg / well ELISA plates according to the ELISA reaction protocol described in Example 1. Peptide 17 was used in the amount of 4pg / well against sera from dogs with high titers (> 1: 640) of antibodies.

Na figura 3 observa-se que, nas condições testadas, o peptídeo foi capaz de detectar 80% dos cães com altos títulos de anticorpos, apresentando alta sensibilidade do peptídeo 17 com soros de cães com altos títulos de anticorpos.Figure 3 shows that, under the conditions tested, the peptide was able to detect 80% of dogs with high antibody titers, presenting high sensitivity of peptide 17 with sera from dogs with high antibody titers.

Exemplo 4Example 4

Tendo sido observada elevada reatividade com soros de cães com títulos altos de anticorpos (> 1:640) empregando o peptídeo 17, utilizado como descrito no exemplo 1 para sensibilizar placas de ELISA na quantidade de 4pg/poço, verificou-se a possibilidade do mesmo reagir com soros de cães sintomáticos e assintomáticos, mas empregando uma menor quantidade de antígeno (250 ng/poço). Ressalta-se que foram empregados os mesmos soros utilizados por Porrozzi et. al. (2007).Since high reactivity was observed with sera from dogs with high antibody titers (> 1: 640) employing peptide 17, used as described in example 1 to sensitize ELISA plaques in the amount of 4pg / well, it was found to be possible. react with symptomatic and asymptomatic dog sera but employing a lower amount of antigen (250 ng / well). It is noteworthy that the same sera used by Porrozzi et. al. (2007).

Na figura 4 observa-se que, nas condições testadas, o peptídeo 17 foi capaz de detectar de forma comparável soros de cães sintomáticos e assintomáticos, representando, portanto, uma otimização da sensibilidade por outros testes de diagnóstico que com freqüência não detectam com a mesma sensibilidade a LV em cães sintomáticos e assintomáticos.Figure 4 shows that, under the tested conditions, peptide 17 was able to detect sera from symptomatic and asymptomatic dogs in a comparable way, thus representing an optimization of sensitivity by other diagnostic tests that often do not detect with the same. sensitivity to VL in symptomatic and asymptomatic dogs.

Exemplo 5Example 5

Para testar a reatividade do peptideo 18, derivado do antígenoTo test the reactivity of peptide 18, derived from antigen

nucleosídeo hidrolase (NH)1 como antígeno em testes de diagnóstico da Ieishmaniose visceral canina, o mesmo foi utilizado para sensibilizar placas de ELISA, na quantidade de 4pg/poço, de acordo com o protocolo de reações de ELISA descrito no exemplo 1. Inicialmente o peptideo 18 foi utilizado na quantidade de 4pg/poço frente a soros de cães com títulos altos (>1:640) de anticorposnucleoside hydrolase (NH) 1 as an antigen in diagnostic tests for canine visceral leishmaniasis, it was used to sensitize ELISA plates in the amount of 4pg / well according to the ELISA reaction protocol described in example 1. peptide 18 was used in the amount of 4pg / well against sera from dogs with high titers (> 1: 640) of antibodies

Na figura 5 observa-se que, nas condições testadas, o peptideo 18 foi capaz de detectar 100% dos cães com altos títulos de anticorpos, apresentando alta sensibilidade do peptideo 18 com soros de cães com altos títulos de anticorpos.Figure 5 shows that, under the conditions tested, peptide 18 was able to detect 100% of dogs with high antibody titers, showing high sensitivity of peptide 18 with sera from dogs with high antibody titers.

Exemplo 6Example 6

Tendo sido observada elevada reatividade com soros de cães com títulos altos de anticorpos (> 1:640) empregando-se o peptideo 18, utilizado como descrito no exemplo 1 para sensibilizar placas de ELISA na quantidade de 4pg/poço, verificou-se a possibilidade do mesmo reagir com soros de cães sintomáticos e assintomáticos, mas empregando-se uma menor quantidade de antígeno (250 ng/poço). Ressalta-se que foram empregados os mesmos sorosSince high reactivity was observed with sera from dogs with high antibody titers (> 1: 640) using peptide 18, used as described in example 1 to sensitize ELISA plaques in the amount of 4 pg / well, the possibility was verified. It may be reacted with symptomatic and asymptomatic dog sera, but with a smaller amount of antigen (250 ng / well). It is noteworthy that the same sera were used

utilizados por Porrozzi et. al. (2007).used by Porrozzi et. al. (2007).

Na figura 6 observa-se que, nas condições testadas, o peptideo 18 foi capaz de detectar de forma comparável soros de cães sintomáticos e assintomáticos, representando, portanto, uma otimização da sensibilidade apresentada por outros testes de diagnóstico que, com freqüência, não detectam com a mesma sensibilidade a LV em cães sintomáticos e assintomáticos. Exemplo 7Figure 6 shows that, under the conditions tested, peptide 18 was able to detect sera from symptomatic and asymptomatic dogs in a comparable way, thus representing an optimization of sensitivity presented by other diagnostic tests that often do not detect with the same sensitivity to VL in symptomatic and asymptomatic dogs. Example 7

Para testar a reatividade do peptídeo 19, derivado do antígeno LACK1 como antígeno em testes de diagnóstico da Ieishmaniose visceral canina, o mesmo foi utilizado para sensibilizar placas de ELISA, na quantidade de 4pg/poço, de acordo com o protocolo de reações de ELISA descrito, no exemplo 1. Inicialmente o peptídeo 18 foi utilizado na quantidade de 4pg/poço frente a soros de cães com títulos altos (>1:640) de anticorpos.To test the reactivity of peptide 19, derived from LACK1 antigen as an antigen in diagnostic tests for canine visceral leishmaniasis, it was used to sensitize 4pg / well ELISA plates according to the ELISA reaction protocol described. , in example 1. Initially, peptide 18 was used in the amount of 4pg / well against sera from dogs with high titers (> 1: 640) of antibodies.

Na figura 7 observa-se que, nas condições testadas, o peptídeo foi capaz de detectar 80% dos cães com altos títulos de anticorpos, apresentando alta sensibilidade do peptídeo 19 com soros de cães com altos títulos de anticorpos.Figure 7 shows that under the conditions tested, the peptide was able to detect 80% of dogs with high antibody titers, showing high sensitivity of peptide 19 with dog sera with high antibody titers.

Exemplo 8Example 8

Tendo sido observada elevada reatividade com soros de cães com títulos altos de anticorpos (> 1:640) empregando-se o peptídeo 19, utilizado como descrito no exemplo 1 para sensibilizar placas de ELISA na quantidade de 4pg/poço, verificou-se a possibilidade do mesmo reagir com soros de cães sintomáticos e assintomáticos, mas empregando-se uma menor quantidade de antígeno (250 ng/poço). Ressalta-se que foram empregados os mesmos soros utilizados por Porrozzi et al. (2007). Na figura 8 observa-se que, nas condições testadas, o peptídeo 19 foiSince high reactivity was observed with sera from dogs with high antibody titers (> 1: 640) using peptide 19, used as described in example 1 to sensitize ELISA plaques in the amount of 4 pg / well, the possibility was verified. It may be reacted with symptomatic and asymptomatic dog sera, but with a smaller amount of antigen (250 ng / well). It is noteworthy that the same sera used by Porrozzi et al. (2007). Figure 8 shows that under the conditions tested, peptide 19 was

capaz de detectar de forma comparável soros de cães sintomáticos e assintomáticos, representando, portanto, uma otimização da sensibilidade por outros testes de diagnóstico que com freqüência não detectam com a mesma sensibilidade a LV em cães sintomáticos e assintomáticos.able to detect sera from symptomatic and asymptomatic dogs in a comparable way, thus representing an optimization of sensitivity by other diagnostic tests that often do not detect with the same sensitivity to VL in symptomatic and asymptomatic dogs.

Exemplo 9Example 9

Considerando que a detecção da infecção em cães com baixos títulos de anticorpos também é uma limitação de testes de diagnóstico que empregam os antígenos K39 e K26, como demonstrado por Porrozzi et al. (2007), os peptídeos 47 (derivado de A2), 17 e 18 (derivados de NH) e 19 (derivados de LACK) foram testados isoladamente ou em associação, com o intuito de aumentar a sensibilidade para soros de cães com títulos de anticorpos baixos ou médios. Esses soros são provenientes de animais com exame parasitológico positivo, mas com títulos de anticorpos baixos ou médios, como detectado na reação de imunofluorescência ou em ELISA com extrato antigênico de formas promastigotas do parasita, testes considerados convencionais para o diagnóstico da Ieishmaniose visceral canina. Ressalta-se mais uma vez que, nessa faixa de detecção, os testes sorológicos empregando antígenos definidos como o K39 ou K26 têm limitações de sensibilidade.Considering that detection of infection in dogs with low antibody titers is also a limitation of diagnostic tests employing the K39 and K26 antigens, as demonstrated by Porrozzi et al. (2007), peptides 47 (A2-derived), 17 and 18 (NH-derived) and 19 (LACK-derived) were tested alone or in combination to increase the sensitivity for sera from dogs with antibody titers. low or medium. These sera are from animals with positive parasitological examination but with low or medium antibody titers, as detected in the immunofluorescence reaction or ELISA with antigenic extract of promastigote forms of the parasite, tests considered conventional for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis. Once again, in this detection range, serological tests employing antigens defined as K39 or K26 have sensitivity limitations.

Nas figuras 9, 10,11, 12, 13 e 14 comparam-se os resultados dos testes realizados com os peptídeos 47, 17, 18 e 19 isoladamente ou associados 2 a 2. Cabe mencionar que associações desses peptídeos 3 a 3 não resultaram em dados expressivos, uma vez que quando associados 2 a 2 o limite máximo deFigures 9, 10, 11, 12, 13 and 14 compare the results of the tests performed with peptides 47, 17, 18 and 19 alone or associated 2 to 2. It should be mentioned that associations of these peptides 3 to 3 did not result. expressive data, since when associated 2 to 2 the maximum limit of

sensibilidade do teste foi atingido.test sensitivity has been reached.

A figura 9 compara a reatividade de combinações dos peptídeos 47 e 17 (500 ng/poço) frente a soros de cães com títulos baixos (< 1:320) e médios (>1:320<1:640) de anticorpos. Esses soros são provenientes de animais com exame parasitológico positivo, mas com títulos de anticorpos baixos ou médios, como detectado na reação de imunofluorescência ou em ELISA com extrato antigênico de formas promastigotas do parasita, testes considerados convencionais para o diagnóstico da Ieishmaniose visceral canina. Ressalta-se mais uma vez que, nessa faixa de detecção, os testes sorológicos empregando antígenos definidos como o K39 ou K26 têm limitações de sensibilidade. Observa-se que, nessas condições, a associação do peptídeo 47 com o peptídeo 17 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensibilidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.Figure 9 compares the reactivity of combinations of peptides 47 and 17 (500 ng / well) against sera from dogs with low (<1: 320) and medium (> 1: 320 <1: 640) antibody titers. These sera are from animals with positive parasitological examination but with low or medium antibody titers, as detected in the immunofluorescence reaction or ELISA with antigenic extract of promastigote forms of the parasite, tests considered conventional for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis. Once again, in this detection range, serological tests employing antigens defined as K39 or K26 have sensitivity limitations. Under these conditions, the association of peptide 47 with peptide 17 was able to increase the sensitivity of the test, thus resulting in the optimization of the sensitivity presented by the use of the individual peptides. Similar results were obtained at 250 ng / well.

Na figura 10 observa-se que a associação do peptídeo 47 com o peptídeo 18 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensibilidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.Figure 10 shows that the association of peptide 47 with peptide 18 was able to increase the sensitivity of the test, thus resulting in the optimization of the sensitivity presented by the use of individual peptides. Similar results were obtained at 250 ng / well.

Na figura 11 observa-se que, a associação do peptídeo 47 com o peptídeo 19 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensibilidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.Figure 11 shows that the association of peptide 47 with peptide 19 was able to increase the sensitivity of the test, thus resulting in the optimization of the sensitivity presented by the use of individual peptides. Similar results were obtained at 250 ng / well.

Na figura 12 observa-se que, a associação do peptídeo 17 com o peptídeo 18 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensiblidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.Figure 12 shows that the association of peptide 17 with peptide 18 was able to increase the sensitivity of the test, thus resulting in optimization of the sensitivity presented by the use of individual peptides. Similar results were obtained at 250 ng / well.

Na figura 13 observa-se que, a associação do peptídeo 17 com o peptídeo 19 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensiblidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.Figure 13 shows that the association of peptide 17 with peptide 19 was able to increase the sensitivity of the test, thus resulting in the optimization of the sensitivity presented by the use of individual peptides. Similar results were obtained at 250 ng / well.

Na figura 14 observa-se que, a associação do peptídeo 18 com o peptídeo 19 foi capaz de aumentar a sensibilidade do teste, resultando, portanto, na otimização da sensiblidade apresentada pelo uso dos peptídeos individualmente. Resultados similares foram obtidos com 250 ng/poço.Figure 14 shows that the association of peptide 18 with peptide 19 was able to increase the sensitivity of the test, thus resulting in the optimization of the sensitivity presented by the use of individual peptides. Similar results were obtained at 250 ng / well.

Exemplo 10Example 10

Os peptídeos 47, 17, 18 e 19 foram empregados também em reações de ELISA com soros humanos de pacientes com diagnóstico de Ieishmaniose visceral, tendo como controles soros de indivíduos hígidos. Na figura 15, são apresentados os dados das reações de ELISA em que os peptídeos foram testados isoladamente na quantidade de 4pg/poço. Isoladamente, os peptídeos 17, 18, 19 e 47 apresentaram sensibilidade de 86,6%, 96,6%, 100% e 90%, respectivamente. Esses valores são próximos ou superiores à sensibilidade relatada para testes de diagnóstico da LV humana, tais como as técnicas RIFI (imunofluorescência indireta) (88%), ELISA L. (L.) chagasi 92%, empregando antígenos de formas promastigotas do parasita ou a ELISA empregando o antígeno recombinante rK39 (97%) ou para o teste imunocromatográfico rápido IT-LEISH® (DiaMed IT-LEISH®) (93%) que também emprega o K39 (MachadoPeptides 47, 17, 18 and 19 were also used in ELISA reactions with human sera from patients diagnosed with visceral leishmaniasis, with controls from healthy individuals. Figure 15 shows data from ELISA reactions in which the peptides were tested alone at 4 pg / well. In isolation, peptides 17, 18, 19 and 47 showed sensitivity of 86.6%, 96.6%, 100% and 90%, respectively. These values are close to or greater than the sensitivity reported for human VL diagnostic tests, such as the IFAT (indirect immunofluorescence) (88%), ELISA L. (L.) chagasi 92% techniques, employing antigens of promastigote forms of the parasite or ELISA using the rK39 recombinant antigen (97%) or the IT-LEISH® rapid immunochromatographic test (DiaMed IT-LEISH®) (93%) which also employs the K39 (Machado

de Assis et. al., 2008)de Assis et. al., 2008)

Na figura 16, são apresentados os dados das reações de ELISA em que os peptídeos foram testados em associação. Observa-se aumento de sensibilidade quando o peptídeo 19 foi associado aos peptídeos 47 e 18, alcançando um valor de 100%. Embora o valor de 100% de sensibilidade tenha sido alcançado nos testes em que o peptídeo 19 foi avaliado isoladamente, a sua associação melhorou a sensibilidade do testes empregando os peptídeos 47 e 18, os quais, isoladamente, apresentaram 90 e 96,6% de sensibilidade.Figure 16 shows data from ELISA reactions in which the peptides were tested in combination. Sensitivity increase was observed when peptide 19 was associated with peptides 47 and 18, reaching a value of 100%. Although 100% sensitivity was achieved in tests in which peptide 19 was evaluated alone, its association improved the sensitivity of the tests using peptides 47 and 18, which alone presented 90 and 96.6% of. sensitivity.

Para as outras associações não foram observadas alterações significativas. Considerando a heterogeneidade da condição clínica dos pacientes e da resposta imune humoral dos mesmos, a associação de peptídeos pode ser uma alternativa para o aprimoramento de testes de diagnóstico, uma vez que epítopos adicionais são acrescentados aos testes sorológicos. Esses resultados demonstram a capacidade dos peptídeos testados de otimizar a sensibilidade dos testes para detecção de Ieishmaniose visceral humana.For the other associations no significant changes were observed. Considering the heterogeneity of the patients' clinical condition and their humoral immune response, the association of peptides may be an alternative for the improvement of diagnostic tests, since additional epitopes are added to serological tests. These results demonstrate the ability of the tested peptides to optimize the sensitivity of the tests for detection of human visceral leishmaniasis.

Claims

1. Recombinant Leishmania peptides characterized by consisting of the sequences SEQ ID Nos. 1, 2, 3 and 4.

Recombinant Leishmania peptides according to claim 1, characterized in that they can be modified at their ends.

A method for immunodiagnostic Leishmaniasis testing comprising: (a) binding of Ieishmanial antibodies of a sample to one or more polypeptides, attached to a solid support or a carrier, consisting of the amino acid sequences SEQ ID Nos. 1, 2, 3 and 4 or consisting of the associated defined recombinant proteins rA2, rNH and rLACK, SEQ ID Nos. 5, 6 and 7 respectively. b) contacting the antibodies of step (a) with a secondary antibody or protein, conjugated to an enzyme or marker and binding to the antibodies of step (a) c) detecting antileshmanial antibodies in the above sample by detection of the antibody secondary protein or protein specifically bound to said anti-leishmanial antibody.

Method for the immunodiagnostic test of Leishmaniasis according to claim 3, characterized in that the polypeptides SEQ ID Nos. 1, 2, 3 and 4 may be modified at their ends.

Method for Leishmaniasis Immunodiagnosis Test according to Claim 3, characterized in that the samples are selected from the group consisting of blood, serum, plasma and other body fluid.

Method for immunodiagnostic testing of Leishmaniasis according to claim 3, characterized in that the solid support is selected from a group of materials consisting of nitrocellulose, nylon, latex, polypropylene and polystyrene.

Method for the immunodiagnostic test of Leishmaniasis according to claim 3, characterized in that the carrier is a gold particle.

A method for immunodiagnostic leishmaniasis testing according to claim 3, characterized in that the secondary antibody is selected from a group consisting of IgG1 IgM1 IgA1 IgE and subclasses thereof.

Method for the immunodiagnostic test of Leishmaniasis according to claim 3, characterized in that the protein is selected from a group consisting of Protein A and Protein G.

Method for the immunodiagnostic test of Leishmaniasis according to claim 3, characterized in that the enzyme is selected from the group consisting of alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase, urease, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase.

Method for the immunodiagnostic test of Leishmaniasis according to claim 3, characterized in that the marker is selected from the group consisting of enzymes, radioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescent.

A method for immunodiagnostic testing of Leishmaniasis according to claim 3, characterized in that the anti-Ieshmanial antibody detection step is selected from the group consisting of fluorescence, immunoluminescence, absorbance or radioisotope detection.

13. Leishmaniasis immunodiagnostic test kit, comprising: - peptides consisting of the sequences SEQ ID Nos 1, 2, 3 and 4 associated or isolated or the recombinant proteins defined as rA2, rNH and associated rLACK represented by SEQ ID Nos 5, 6 and 7 respectively; A secondary antibody or protein, wherein the secondary antibody or protein is conjugated to an enzyme or marker, and a reagent for detecting said enzyme or marker.

Leishmaniasis immunodiagnostic test kit according to claim 12, characterized in that the recombinant proteins or peptides are attached to a solid or carrier support.

Leishmaniasis immunodiagnostic test kit according to claim 13, characterized in that the solid support is selected from the group of material consisting of nitrocellulose, nylon, latex, polypropylene and polystyrene.

Leishmaniasis immunodiagnostic test kit according to claim 13, characterized in that the carrier consists of gold particles.

Leishmaniasis immunodiagnostic test kit according to claim 13, characterized in that the secondary antibody is selected from the group consisting of IgG, IgM, IgA, IgE and their subclasses.

Leishmaniasis immunodiagnostic test kit according to claim 13, characterized in that the protein is selected from the group consisting of protein A and protein G.

Leishmaniasis immunodiagnostic test kit according to claim 13, characterized in that said marker is selected from the group consisting of enzymes, redioisotopes, biotin, chromophores, fluorophores and chemiluminescent.

Leishmaniasis immunodiagnostic test kit according to claim 13, characterized in that the enzyme is selected from the group comprising alkaline phosphatase, peroxidase, β-galactosidase, ureaase, xanthine oxidase, glucose oxidase and penicillinase.