BRPI1004299B1

BRPI1004299B1 - mrp1 protein activity inhibiting composition, mrp1 protein activity inhibiting method, method of treating proliferative disorders and method of treating tumors

Info

Publication number: BRPI1004299B1
Application number: BRPI1004299-7A
Authority: BR
Inventors: Rocha Gattass Cerli; Da Graça Rocha Gleice; Auxiliadora Coelho Kaplan Maria; Simões Marisol; Rodrigues Oliveira Rodrigo
Original assignee: Univ Rio De Janeiro
Priority date: 2010-02-05
Filing date: 2010-02-05
Publication date: 2019-10-29
Also published as: BRPI1004299A2

Abstract

composição inibidora da atividade da proteína mrp1, método de inibição da atividade da proteína mrp1, método de tratamento de desordens proliferativas e método de tratamento de tumores. esta invenção pertence à área farmoquímica e refere-se a uma composição inibidora da atividade da proteína mrp1 contendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais triterpenos isolados ou não isolados, que pode ser empregada de forma sozinha ou associada aos quimioterápicos pertencentes ao estado da técnica; essa invenção também se refere ao método de inibição da atividade de proteínas mrp1, ao método de tratamento e/ou prevenção de desordens proliferativas tais como tumores resistentes a múltiplas drogas (mdr).mrp1 protein activity inhibiting composition, mrp1 protein activity inhibiting method, method of treating proliferative disorders and method of treating tumors. This invention pertains to the pharmochemical field and relates to a mrp1 protein activity inhibiting composition containing a pharmaceutically effective amount of one or more isolated or uninsulated triterpenes, which may be employed alone or in combination with prior art chemotherapeutic agents. ; This invention also relates to the method of inhibiting mrp1 protein activity, the method of treating and / or preventing proliferative disorders such as multidrug resistant (mdr) tumors.

Description

A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica contendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais triterpenos não isolados ou isolados, com capacidade de inibir a proteína associada à resistência a múltiplas drogas, a qual é expressa em diversas linhagens tumorais e diferentes tipos de microorganismos. São descritos ainda métodos para o tratamento de tumores e para o tratamento de desordens proliferativas. ANTECEDENTES DA INVENÇÃOThe present invention relates to a pharmaceutical composition containing a pharmaceutically effective amount of one or more non-isolated or isolated triterpenes, capable of inhibiting the protein associated with resistance to multiple drugs, which is expressed in several tumor lines and different types of microorganisms. Methods for the treatment of tumors and for the treatment of proliferative disorders are also described. BACKGROUND OF THE INVENTION

A expressão do fenótipo de Resistência a Múltiplas Drogas (MDR) é um dos principais empecilhos no sucesso da quimioterapia do câncer. A observação de que cerca de 50% dos pacientes que inicialmente respondem a quimioterapia recidivam e morrem por metástases generalizadas, tem sido atribuída ao desenvolvimento do fenótipo MDR. Clinicamente, a MDR é definida pela resistência cruzada a diversos quimioterápicos não relacionados, que divergem entre si quanto à estrutura, modo de ação e alvo celular. Portanto, a maioria dos medicamentos disponíveis é ineficaz contra tumores que expressam esse fenótipo. Além do câncer a expressão do fenótipo MDR também pode ser responsável pela resistência ao tratamento em outras doenças como infecções bacterianas, fúngicas e parasitárias (T.cruzi, leishmania, malária, etc).The expression of the Multiple Drug Resistance (MDR) phenotype is one of the main obstacles to the success of cancer chemotherapy. The observation that about 50% of patients who initially respond to chemotherapy relapse and die from generalized metastases, has been attributed to the development of the MDR phenotype. Clinically, MDR is defined by cross-resistance to several unrelated chemotherapeutic agents, which differ in structure, mode of action and cellular target. Therefore, most available drugs are ineffective against tumors that express this phenotype. In addition to cancer, the expression of the MDR phenotype may also be responsible for resistance to treatment in other diseases such as bacterial, fungal and parasitic infections (T. cruzi, leishmania, malaria, etc.).

Embora a MDR possa ser mediado por vários mecanismos, um dos mais estudados é o resultante da superexpressão de glicoproteínas pertencentes à superfamília ABC de transportadores como as glicoproteínas P-gp/ABCB1, MRP1/ABCC1 e BCRP/ABCG2. Estas proteínas funcionam como bombas de extrusão, diminuindo a concentração intracelular do quimioterápico e impedindo que ele atinja sua concentração letal.Although MDR can be mediated by several mechanisms, one of the most studied is the result of overexpression of glycoproteins belonging to the ABC superfamily of transporters such as glycoproteins P-gp / ABCB1, MRP1 / ABCC1 and BCRP / ABCG2. These proteins function as extrusion pumps, decreasing the intracellular concentration of the chemotherapy and preventing it from reaching its lethal concentration.

Drogas empregadas no tratamento de diferentes tipos de neoplasias como o etoposídeo, doxorrubicina, daunorrubicina e topotecan interagem comDrugs used to treat different types of neoplasms such as etoposide, doxorubicin, daunorubicin and topotecan interact with

2/19 as proteínas P-gp/ABCB1, MRP1/ABCC1 e BCRP/ABCG2 que as transportam para o meio extracelular impedindo desse modo, que as drogas atuem sobre seu alvo intracelular. Portanto a inibição da atividade dessas proteínas pode ser útil no tratamento de doenças cuja resistência é mediada pela expressão do fenótipo MDR.2/19 the proteins P-gp / ABCB1, MRP1 / ABCC1 and BCRP / ABCG2 that transport them to the extracellular environment, thus preventing the drugs from acting on their intracellular target. Therefore, the inhibition of the activity of these proteins can be useful in the treatment of diseases whose resistance is mediated by the expression of the MDR phenotype.

A busca de inibidores das proteínas MDR, iniciada após a descoberta da P-gp/ABCB1 em 1976, continua sendo de grande interesse para a indústria farmacêutica. Entretanto, além da maioria dos inibidores serem ativos contra a P-gp/ABCB1, eles também são capazes de interagir com outras proteínas ABC. Assim, numa revisão publicada recentemente (Sharon, 2008) foi mostrado que a P-gp/ABCB1 pode ser inibida por uma série de compostos tais como verapamil, ciclosporina A, tamoxifem, valspodar, biricodar, zosuquidar, tariquidar, elacridar e ontogen. A MRP1/ABCC1 pode ser inibida pelo biricodar e ο MK571 enquanto elacridar, pantoprazol, tariquidar, biricodar, gefitinibe, imatinibe e quercetina inibem a BCRP/ABCG2.The search for inhibitors of MDR proteins, initiated after the discovery of P-gp / ABCB1 in 1976, continues to be of great interest to the pharmaceutical industry. However, in addition to most inhibitors being active against P-gp / ABCB1, they are also able to interact with other ABC proteins. Thus, in a recently published review (Sharon, 2008) it was shown that P-gp / ABCB1 can be inhibited by a series of compounds such as verapamil, cyclosporine A, tamoxifen, valspodar, biricodar, zosuquidar, tariquidar, elacridar and ontogen. MRP1 / ABCC1 can be inhibited by biricodar and ο MK571 while elacridar, pantoprazole, tariquidar, biricodar, gefitinib, imatinib and quercetin inhibit BCRP / ABCG2.

No estado da técnica é amplamente conhecida a utilização de compostos e abordagens visando inibir o fenótipo MDR. O pedido de patente W02008093331, por exemplo, descreve anticorpos conjugados capazes de inibir a ação de proteínas da família ABC, revertendo assim, a resistência a múltiplas drogas.In the state of the art, the use of compounds and approaches to inhibit the MDR phenotype is widely known. Patent application W02008093331, for example, describes conjugated antibodies capable of inhibiting the action of proteins of the ABC family, thus reversing resistance to multiple drugs.

O documento W02008105872 descreve uma composição farmacêutica contendo um xanteno e um quimioterápico pertencente ao estado da técnica voltada para o tratamento de tumores MDR.Document W02008105872 describes a pharmaceutical composition containing a xanthene and a chemotherapeutic agent belonging to the state of the art for the treatment of MDR tumors.

O pedido de patente WO01036477 reivindica um método de inibição dos transportadores ABC por peptídeos análogos aos domínios peptídicos transmembrana das proteínas do sistema ABC, descrevendo peptídeos análogos às proteínas P-gp, MRP1, MRP2 e outras.Patent application WO01036477 claims a method of inhibiting ABC transporters by peptides analogous to the transmembrane peptide domains of proteins in the ABC system, describing peptides analogous to proteins P-gp, MRP1, MRP2 and others.

As patentes US6376514, US7135483 e US7476680, pertencentes à mesma família de patentes, descrevem compostos químicos contendo 6 heterocíclos substituídos capazes de inibir as proteínas P-gp e MRP1.US6376514, US7135483 and US7476680, which belong to the same patent family, describe chemical compounds containing 6 substituted heterocycles capable of inhibiting the P-gp and MRP1 proteins.

A empresa Ely Lilly Company é detentora de uma série de documentos de patentes relativos a compostos tricíclicos capazes de inibir a ação da glicoproteína MRP1, revertendo assim o fenótipo MDR. Dentre estes documentos de patente citamos os pedidos internacionais W00200624,The Ely Lilly Company holds a series of patent documents relating to tricyclic compounds capable of inhibiting the action of the MRP1 glycoprotein, thus reversing the MDR phenotype. Among these patent documents we mention international applications W00200624,

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WO0196346, CZ20003689, CZ20003688, WO9951228 e WO9951227, os dois últimos possuem pedidos de patente brasileiros correspondentes, a saber, o PI9910112-2 e PI9909497-5 respectivamente.WO0196346, CZ20003689, CZ20003688, WO9951228 and WO9951227, the latter two have corresponding Brazilian patent applications, namely PI9910112-2 and PI9909497-5 respectively.

Por último citamos o documento de patente US20020016293 que descreve o uso do flavopiridol capaz de inibir proteínas das famílias ABCC1, ABCB1, ABCB2, além de outras proteínas indutoras do fenótipo MDR.Finally, we cite the patent document US20020016293 which describes the use of flavopiridol capable of inhibiting proteins of the families ABCC1, ABCB1, ABCB2, in addition to other proteins inducing the MDR phenotype.

Na literatura científica, Rocha et al (Bioorg. Med. Chem. 15:7355, 2007) trabalhando com diversos triterpenos isolados da planta Cecropia lyratiloba, mostrou que esses compostos apresentavam toxidez semelhante para linhagens leucêmicas sensível e resistente a múltiplas drogas.In the scientific literature, Rocha et al (Bioorg. Med. Chem. 15: 7355, 2007) working with several triterpenes isolated from the Cecropia lyratiloba plant, showed that these compounds showed similar toxicity for sensitive leukemic strains and resistant to multiple drugs.

Fernandes e Gattass (J. Med. Chem. 52: 1214, 2009) trabalhando na elucidação dos mecanismos de transporte das proteínas da família MRP1/ABCC1 demonstraram que esta proteína é capaz de transportar moléculas com tamanhos entre 170 a 216 Angstrons de TPSA (área da superfície polar topológica) sendo, entretanto incapaz de transportar moléculas com valores de TPSA reduzidos. Os dados utilizados foram obtidos de trabalhos realizados com quimioterápicos usuais e moléculas pertencentes ao estado da técnica como a glutationa s-transferase (GST) e outras.Fernandes and Gattass (J. Med. Chem. 52: 1214, 2009) working on the elucidation of the transport mechanisms of the MRP1 / ABCC1 family proteins demonstrated that this protein is capable of transporting molecules with sizes between 170 to 216 Angstrons of TPSA (area of the topological polar surface) being, however, unable to transport molecules with reduced TPSA values. The data used were obtained from studies carried out with usual chemotherapeutic agents and molecules belonging to the state of the art, such as glutathione s-transferase (GST) and others.

No entanto, até hoje, nenhum composto inibidor específico para os transportadores ABC foi aprovado para uso clínico. As características mais procuradas nos inibidores de proteínas MDR são a capacidade de reverter a resistência aos quimioterápicos comumente em uso na clínica e a alta especificidade para as células tumorais que expressam a proteína MDR. Diferentemente da P-gp, para a qual já foram identificados numerosos inibidores, apenas um pequeno número de compostos mostrou especificidade para a MRP1 e destes, apenas o VX-710 (biricodar) ainda está em testes clínicos (Sharon, 2009). A ausência de inibidores específicos para a MRP1 também é um empecilho na caracterização do mecanismo de transporte de drogas por essa proteína e, consequentemente, no desenvolvimento de drogas capazes de reverter esse transporte. A presente invenção visa solucionar estes problemas pertencentes ao estado da técnica.However, to date, no specific inhibitor compounds for ABC transporters have been approved for clinical use. The most sought after characteristics in MDR protein inhibitors are the ability to reverse resistance to chemotherapeutic drugs commonly used in the clinic and the high specificity for tumor cells that express the MDR protein. Unlike P-gp, for which numerous inhibitors have already been identified, only a small number of compounds showed specificity for MRP1 and of these, only VX-710 (biricodar) is still in clinical trials (Sharon, 2009). The absence of specific inhibitors for MRP1 is also an obstacle in the characterization of the drug transport mechanism by this protein and, consequently, in the development of drugs capable of reversing this transport. The present invention aims to solve these problems pertaining to the state of the art.

SUMÁRIO DA INVEÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION

O primeiro objeto desta invenção trata de uma composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1, que compreende uma quantidadeThe first object of this invention is a composition that inhibits the activity of the MRP1 / ABCC1 protein, which comprises a quantity

4/19 farmaceuticamente eficaz de um ou mais compostos inibidores da atividade da MRP1 e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.4/19 pharmaceutically effective of one or more compounds that inhibit MRP1 activity and pharmaceutically acceptable adjuvants.

O segundo objeto da presente invenção trata da composição antitumoral contendo uma quantidade farmaceuticamente efetiva de compostos inibidores da proteína MRP1 em associação a um composto antiproliferativo e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis voltado para o tratamento de desordenes proliferativo em um animal mamífero.The second object of the present invention deals with the antitumor composition containing a pharmaceutically effective amount of MRP1 protein inhibitor compounds in association with an antiproliferative compound and pharmaceutically acceptable adjuvants aimed at the treatment of proliferative disorders in a mammalian animal.

A presente invenção também se refere ao método de inibição da atividade da proteína MRP1 da família MRP/ABCC, baseado na administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de composto inibidor da MRP1 em um animal mamífero portador de uma desordem proliferativa.The present invention also relates to the method of inhibiting the activity of the MRP1 protein of the MRP / ABCC family, based on the administration of a pharmaceutically effective amount of MRP1 inhibiting compound to a mammalian animal with a proliferative disorder.

É ainda um objeto da invenção um método de tratamento de desordens proliferativas baseado na administração de uma composição inibidora da MRP1 em um animal mamífero portador de uma desordem proliferativa.It is also an object of the invention a method of treating proliferative disorders based on the administration of an MRP1 inhibitory composition in a mammalian animal with a proliferative disorder.

O último objeto da invenção refere-se ao método de tratamento de tumores baseado na administração conjunta de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição inibidora da MRP1 e um composto antiproliferativo em um animal mamífero.The last object of the invention relates to the method of treating tumors based on the joint administration of a therapeutically effective amount of an MRP1 inhibitory composition and an antiproliferative compound in a mammalian animal.

DESCRIÇÃO DAS FIGURASDESCRIPTION OF THE FIGURES

Figura 1. Efeito de diferentes concentrações de 3AT sobre o acúmulo de rhodamina 123 pela Lucena 1. Resultados expressos como media de intensidade de fluorescência (unidade arbitraria).Figure 1. Effect of different concentrations of 3AT on the accumulation of rhodamine 123 by Lucena 1. Results expressed as mean fluorescence intensity (arbitrary unit).

Figura 2. Efeito de 50pg/ml de verapamil (VP), MK571 ou de 25pg/ml de ácido euscáfico (EA), tormentico (AT), 2acetiltormentico (2AT), 3acetiltormentico (3AT), isoarjunólico (ISO), partição (PT) e extrato (EXT 1:500) sobre o acúmulo de rhodamina 123 pela Lucena 1. Resultados expressos como razão do acumulo na presença do tratamento em relação ao controle.Figure 2. Effect of 50pg / ml of verapamil (VP), MK571 or 25pg / ml of euscic acid (EA), tormentic (AT), 2acetiltormentico (2AT), 3acetiltormentico (3AT), isoarjunolic (ISO), partition (PT ) and extract (EXT 1: 500) on the accumulation of rhodamine 123 by Lucena 1. Results expressed as a reason for the accumulation in the presence of the treatment in relation to the control.

Figura 3: Comparação do efeito do 3AT e verapamil sobre diferentes linhagens celulares. 3A - Efeito do 3AT sobre o acúmulo de rhodamina sobre a linhagem celular lucena 1. FIGURA 3B. Efeito do 3AT sobre o acúmulo de rhodamina 123 sobre a linhagem celular K562/DOX. Foram empregados 25pg/ml do 3AT em comparação com o 50 pg/ml de verapamil.Figure 3: Comparison of the effect of 3AT and verapamil on different cell lines. 3A - Effect of 3AT on rhodamine accumulation on the Lucena 1 cell line. FIGURE 3B. Effect of 3AT on rhodamine 123 accumulation on the K562 / DOX cell line. 25pg / ml of 3AT was used compared to 50 pg / ml of verapamil.

Figura 4. Comparação entre o efeito de 50μΜ MK571 e diferentes concentrações de 3AT sobre o acúmulo de CFDA pela linhagem celularFigure 4. Comparison between the effect of 50μΜ MK571 and different concentrations of 3AT on the accumulation of CFDA by the cell line

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B16/F10. Resultados expressos como media de intensidade de fluorescência (unidade arbitraria).B16 / F10. Results expressed as mean fluorescence intensity (arbitrary unit).

Figura 5. Comparação entre o efeito de 50μΜ MK571 com o efeito de 25pg/mL 3AT sobre o acúmulo de CFDA pela linhagem celular GBV. Resultados expressos como media de intensidade de fluorescência (unidade arbitraria).Figure 5. Comparison between the 50μΜ MK571 effect with the 25pg / mL 3AT effect on the accumulation of CFDA by the GBV cell line. Results expressed as mean fluorescence intensity (arbitrary unit).

Figura 6. Comparação entre o efeito de 50μΜ MK571 e diferentes concentrações de 3AT sobre o acúmulo de CFDA pela A549.Figure 6. Comparison between the effect of 50μΜ MK571 and different concentrations of 3AT on the accumulation of CFDA by A549.

Figura 7: Efeito do 3AT sobre a expressão da proteína MRP1/ABCC1 na linhagem B16F10. Células foram plaqueadas e tratadas com meio (controle) ou 12.5pg/mL de 3AT por 48h. A fluorescência intracelular foi medida por citometria de fluxo.Figure 7: Effect of 3AT on the expression of the MRP1 / ABCC1 protein in the B16F10 strain. Cells were plated and treated with medium (control) or 12.5pg / mL of 3AT for 48h. Intracellular fluorescence was measured by flow cytometry.

Figura 8: Comparação entre o efeito de 50pg/ml de MK571 e 25pg/ml de cada um dos seguintes triterpenos: ácido euscáfico (EA), tormentico (AT), 2acetiltormentico (2AT), 3-acetiltormentico (3AT), isoajurnólico (ISO), partição (PT) e extrato (EXT 1:500) sobre o acúmulo de CFDA pela B16F10.Figure 8: Comparison between the 50pg / ml effect of MK571 and 25pg / ml of each of the following triterpenes: euscic acid (EA), tormentic (AT), 2acetyltormentic (2AT), 3-acetyltormentic (3AT), isoajurnolic (ISO ), partition (PT) and extract (EXT 1: 500) on the accumulation of CFDA by B16F10.

Figura 9: Percentual de viabilidade celular em um experimento com o triterpeno 3-acetil tormentico (3AT) sobre linfócitos normais estimulados com PHA 5pg/ML. Dados demonstrando % de células vivas.Figure 9: Percentage of cell viability in an experiment with the 3-acetyl tormental triterpene (3AT) on normal lymphocytes stimulated with PHA 5pg / ML. Data showing% of living cells.

Figura 10: Inibição da viabilidade celular em células HL60.Figure 10: Inhibition of cell viability in HL60 cells.

Figura 11: Inibição da viabilidade celular em células A549.Figure 11: Inhibition of cell viability in A549 cells.

Figura 12: Inibição da viabilidade celular em células GBV.Figure 12: Inhibition of cell viability in GBV cells.

Figura 13: Inibição da viabilidade celular em células B16/F10. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃOFigure 13: Inhibition of cell viability in B16 / F10 cells. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Somente para fins desta invenção teceremos algumas definições com o intuito de auxiliar a definição mais objetiva dos objetos descritos. Inicialmente, o termo “inibir” ou “inibição” são empregados com o significado de impedir, aliviar ou atenuar a ação, restringir ou abrandar especificamente a ação extrusora de uma proteína causadora da resistência a múltiplas drogas em células proliferativas.Only for the purposes of this invention will we make some definitions in order to assist the more objective definition of the described objects. Initially, the term "inhibit" or "inhibition" is used with the meaning of preventing, alleviating or attenuating the action, specifically restricting or slowing down the extruder action of a protein that causes resistance to multiple drugs in proliferative cells.

Desordem proliferativa pode ser qualquer distúrbio ou disfunção relacionada à multiplicação indesejada de células no organismo de um animal mamífero, incluindo o ser humano, podendo ser relacionada à multiplicaçãoProliferative disorder can be any disorder or dysfunction related to the unwanted multiplication of cells in the body of a mammalian animal, including humans, which can be related to multiplication

6/19 indesejada de células de parasitas uni- ou pluricelulares, bem como à proliferação indesejada de células tumorais.6/19 of unwanted cells from single- or multicellular parasites, as well as to unwanted proliferation of tumor cells.

Preferencialmente, para esta invenção, o termo desordem proliferativa refere-se à proliferação indesejada de células tumorais em tecidos, glândulas e/ou órgãos de mamíferos, pertencentes ao grupo compreendido de: sistema nervoso, pele, pulmão, testículos, próstata, adrenal, rim, bexiga, fígado, pâncreas, ovários, ossos, mama, tireóide, hipófise, estomago, intestino delgado, intestino grosso, sangue, cérebro. Mais preferencialmente ainda, o termo desordem proliferativa significa a proliferação indesejada de células tumorais no pulmão, rim, bexiga, fígado, pâncreas, estômago, ovário, testículo, sangue, cérebro, pele, ossos e mama.Preferably, for this invention, the term proliferative disorder refers to the unwanted proliferation of tumor cells in tissues, glands and / or organs of mammals, belonging to the group comprised of: nervous system, skin, lung, testicles, prostate, adrenal, kidney , bladder, liver, pancreas, ovaries, bones, breast, thyroid, pituitary, stomach, small intestine, large intestine, blood, brain. Most preferably, the term proliferative disorder means the unwanted proliferation of tumor cells in the lung, kidney, bladder, liver, pancreas, stomach, ovary, testis, blood, brain, skin, bones and breast.

A composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1, compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais compostos inibidores da atividade da MRP1 e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, sendo o dito composto inibidor da MRP1 um ou mais triterpenos isolados ou não isolados, pertencente ao estado da técnica. O triterpeno empregado é um inibidor específico da uma proteína da família MRP1/ABCC1, mais especificamente da MRP1.The MRP1 / ABCC1 protein activity inhibiting composition comprises a pharmaceutically effective amount of one or more MRP1 activity inhibiting compounds and pharmaceutically acceptable adjuvants, said MRP1 inhibiting compound being one or more isolated or not isolated triterpenes belonging to the state of the technique. The triterpene used is a specific inhibitor of a protein of the MRP1 / ABCC1 family, more specifically of MRP1.

Os triterpenos não isolados que podem ser encontrado na dita composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1 referem-se a uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um extrato alcoólico da planta Cecropia lyratiloba rico em triterpenos não isolados inibidores da atividade da MRP1. O referido extrato alcoólico encontra-se, neste objeto, associado a adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis formando a dita composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC, sendo a atividade inibidora, mais especificamente observada em proteínas MRP1.The non-isolated triterpenes that can be found in said MRP1 / ABCC1 protein activity inhibiting composition refer to a pharmaceutically effective amount of an alcoholic extract from the Cecropia lyratiloba plant rich in non-isolated triterpenes inhibiting MRP1 activity. Said alcoholic extract is, in this object, associated with pharmaceutically acceptable adjuvants forming the said inhibitory composition of the activity of the MRP1 / ABCC protein, the inhibitory activity being more specifically observed in MRP1 proteins.

A composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1 pode ainda compreender uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um ou mais triterpenos isolados pertencentes ao grupo consistido de: 3-beta acetil tormêntico (3AT); ácido 2-alfa acetil tormêntico (2-AT); ácido tormêntico; ácido euscáfico (AE); ácido isoajurnólico (ISO); um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável dos mesmos.The MRP1 / ABCC1 protein activity inhibiting composition may further comprise a pharmaceutically effective amount of one or more isolated triterpenes belonging to the group consisting of: 3-beta-acetyl tortic (3AT); 2-alpha acetyl tartaric acid (2-AT); tortic acid; euscic acid (AE); isoajurnolic acid (ISO); a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.

O efeito inibidor da composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1, doravante chamada somente de composição, sobre a proteínaThe inhibitory effect of the MRP1 / ABCC1 protein activity inhibiting composition, hereinafter referred to only as composition, on the protein

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MRP1 foi confirmado em ensaios onde foram utilizadas linhagens leucêmicas que expressam a proteína P-gp/ABCB1 (Lucena 1 e K562/DOX), linhagens que expressam a MRP1 como a B16F10 e a GBV, além de a linhagem celular A549 que expressa diferentes membros da família MRP/ABCC, mais precisamente, esta linhagem expressa as proteínas MRP1 a MRP5.MRP1 was confirmed in assays using leukemic lines that express the protein P-gp / ABCB1 (Lucena 1 and K562 / DOX), lines that express MRP1 such as B16F10 and GBV, in addition to the A549 cell line that expresses different members from the MRP / ABCC family, more precisely, this strain expresses the MRP1 to MRP5 proteins.

A análise do efeito da composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1 sobre a expressão das proteínas MDR foi feita por citometria de fluxo, utilizando anticorpos específicos para as proteínas P-gp e MRP1. Seu efeito sobre a atividade de bomba das proteínas foi avaliado pela capacidade da composição em interferir com o transporte de substratos específicos para a P-gp (Rhodamina 123) e MRP (CFDA).The analysis of the effect of the MRP1 / ABCC1 protein inhibitory composition on the expression of MDR proteins was performed by flow cytometry, using specific antibodies for the P-gp and MRP1 proteins. Its effect on protein pump activity was evaluated by the composition's ability to interfere with the transport of specific substrates for P-gp (Rhodamine 123) and MRP (CFDA).

A medição do acúmulo de Rho 123 em células de Lucena 1 e K562/DOX mostrou que o tratamento destas células com verapamil, um conhecido inibidor da P-gp, causava aumento de aproximadamente 5 vezes no acúmulo de Rho 123 citoplasmática, enquanto que o tratamento com a composição ou o extrato causava apenas um pequeno efeito, inferior a 2 vezes, no acúmulo citoplasmático do substrato, indicando que essa composição não tem efeito sobre a atividade da P-gp/ABCB1.Measurement of Rho 123 accumulation in Lucena 1 and K562 / DOX cells showed that treatment of these cells with verapamil, a known P-gp inhibitor, caused an approximately 5-fold increase in cytoplasmic Rho 123 accumulation, while treatment with the composition or extract it caused only a small effect, less than 2 times, in the cytoplasmic accumulation of the substrate, indicating that this composition has no effect on the activity of P-gp / ABCB1.

Em experimento realizado com a linhagem celular B16F10, que expressa MRP1, foi demonstrado que o tratamento com a composição induz ao aumento do acúmulo do substrato transportado (CF) ainda maior que o obtido com o tratamento com ο MK571 (inibidor comercial da MRP1), demonstrando um efeito inibidor da composição sobre essa proteína. Resultados semelhantes foram obtidos com a linhagem de glioblastoma multiforme (GBV), um tumor de sistema nervoso central grau IV.In an experiment carried out with the cell line B16F10, which expresses MRP1, it was demonstrated that the treatment with the composition induces an increase in the accumulation of the transported substrate (CF) even greater than that obtained with the treatment with ο MK571 (commercial MRP1 inhibitor), demonstrating an inhibitory effect of the composition on this protein. Similar results were obtained with the lineage of glioblastoma multiforme (GBV), a grade IV central nervous system tumor.

Em outro experimento, realizado com a linhagem celular A549 que expressa diferentes proteínas da família MRP/ABCC, foi demonstrado que enquanto o tratamento com MK571, um inibidor comercial da família MRP, resulta em um grande aumento no acúmulo do substrato (CF) em aproximadamente 12 vezes, o tratamento com a composição, objeto desta invenção, só induz um pequeno aumento de acúmulo do substrato sugerindo que esse composto iniba a MRP1, mas não tenha efeito sobre as outras MRPs presentes na A549.In another experiment, carried out with the cell line A549 that expresses different proteins of the MRP / ABCC family, it was demonstrated that while treatment with MK571, a commercial inhibitor of the MRP family, results in a large increase in the substrate accumulation (CF) in approximately 12 times, the treatment with the composition, object of this invention, only induces a small increase in the accumulation of the substrate suggesting that this compound inhibits MRP1, but has no effect on the other MRPs present in A549.

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Como mostrado na tabela 1 o efeito da composição sobre a atividade da proteína MRP1 é ainda maior do que o efeito inibidor da MK571. Portanto, além de não ter efeito sobre a atividade da P-gp/ABCB1, a composição utilizada é um potente inibidor da MRP1.As shown in Table 1, the effect of the composition on the activity of the MRP1 protein is even greater than the inhibitory effect of MK571. Therefore, in addition to having no effect on P-gp / ABCB1 activity, the composition used is a potent MRP1 inhibitor.

Os triterpenos, preferencialmente, empregados na composição inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1 desta invenção, pertencem ao grupo consistido de: 3-beta acetil tormêntico (3AT); ácido 2-alfa acetil tormêntico (2AT); ácido tormêntico; ácido euscáfico (AE); ácido isoajurnólico (ISO); um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável dos mesmos; uma mistura destes triterpenos, ou ao extrato alcoólico de Cecropia lyratiloba. Mais preferencialmente ainda, para esta invenção o composto inibidor da MRP1 é o 3AT e/ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do 3AT.The triterpenes, preferably used in the composition that inhibits the activity of the MRP1 / ABCC1 protein of this invention, belong to the group consisting of: 3-beta acetyl tortic (3AT); 2-alpha acetyl tartaric acid (2AT); tortic acid; euscic acid (AE); isoajurnolic acid (ISO); a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof; a mixture of these triterpenes, or to the alcoholic extract of Cecropia lyratiloba. Most preferably, for this invention the MRP1 inhibiting compound is 3AT and / or a pharmaceutically acceptable salt or solvate of 3AT.

A quantidade farmaceuticamente eficaz do composto inibidor da MRP1 é aquela quantidade compreendida entre 1 a 1000 μg/ml, preferencialmente entre 10 a 500 μg/ml do composto inibidor da MRP1 desta invenção.The pharmaceutically effective amount of the MRP1 inhibiting compound is that amount comprised between 1 to 1000 μg / ml, preferably between 10 to 500 μg / ml of the MRP1 inhibitor compound of this invention.

A tabela 1 mostra comparativamente o efeito cumulativo da carboxifluoresceína pela célula após o tratamento de culturas celulares com triterpenos inibidores da MRP1 ou MK571.Table 1 shows comparatively the cumulative effect of carboxyfluorescein by the cell after treating cell cultures with MRP1 or MK571 inhibitory triterpenes.

Tabela 1: Efeito do triterpeno no acúmulo do substrato para MRP1.Table 1: Effect of triterpene on the accumulation of the substrate for MRP1.

Carregamento Loading R* R * CF CF 1 1 CF + MK571 (50 μΜ) CF + MK571 (50 μΜ) 10.45 ± 1.67 10.45 ± 1.67 CF + triterpeno (11,8 μΜ) CF + triterpene (11.8 μΜ) 5.56 ± 1.16 5.56 ± 1.16 CF + triterpeno (23,51 μΜ) CF + triterpene (23.51 μΜ) 11.35 ± 1.31 11.35 ± 1.31 CF + triterpeno (47,02μΜ) CF + triterpene (47.02μΜ) 20.86 ±3.39 20.86 ± 3.39

R*: Razão entre o acúmulo de substrato (CF) em células incubadas com meio e em células incubadas com o triterpeno ou o inibidor MK571.R *: Ratio between the accumulation of substrate (CF) in cells incubated with medium and in cells incubated with triterpene or MK571 inhibitor.

Avaliação da expressão da MRP1 demonstrou que o triterpeno empregado não interfere nos níveis de expressão das proteínas MRP.Evaluation of MRP1 expression demonstrated that the triterpene employed does not interfere with the expression levels of MRP proteins.

Os adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis desta invenção podem ser quaisquer adjuvantes farmacêuticos conhecidos pelos versados nas artes farmacêuticas, como por exemplo: conservantes, flavorizantes, tamponantes, umectantes, solventes, corantes, acidulantes, alcalinizantes, adsorventes, edulcorantes e outros. Os adjuvantes preferencialmente empregados nestaThe pharmaceutically acceptable adjuvants of this invention can be any pharmaceutical adjuvants known to those skilled in the pharmaceutical arts, for example: preservatives, flavorings, buffers, humectants, solvents, dyes, acidulants, alkalizers, adsorbents, sweeteners and others. The adjuvants preferably employed in this

9/19 invenção são aqueles voltados para obtenção de formas farmacêuticas líquidas, sólidas ou semi-sólidas.9/19 invention are those aimed at obtaining liquid, solid or semi-solid pharmaceutical forms.

Preferencialmente, a forma farmacêutica desta invenção é liquida ou sólida, podendo ser encontrada na forma de soluções, dispersões, emulsões, suspensões, loções, alcoolatos, alcoolaturas, colutórios, elixires, clisteres, poções, tinturas, ampolas, aeorossóis, comprimidos, cápsulas, drágeas, hóstias, efervescentes, óvulos, implantações, papéis, pérolas, pílulas, pós e supositórios, nanopartículas, mas não limitadas a estas preparações.Preferably, the pharmaceutical form of this invention is liquid or solid, and can be found in the form of solutions, dispersions, emulsions, suspensions, lotions, alcoholates, alcoholates, mouthwashes, elixirs, enemas, potions, tinctures, ampoules, aeorosols, tablets, capsules, dragees, wafers, effervescents, ova, implantations, papers, pearls, pills, powders and suppositories, nanoparticles, but not limited to these preparations.

A composição inibidora da atividade das proteínas MRP/ABCC desta invenção além de possuir a capacidade de inibir a proteína MRP1, também é capaz de induzir a apoptose de células que expressam essa proteína, provavelmente por ser capaz de ativar a cascata de caspases, que é uma importante via apoptótica.The activity inhibiting composition of the MRP / ABCC proteins of this invention, in addition to having the ability to inhibit the MRP1 protein, is also capable of inducing the apoptosis of cells that express this protein, probably because it is able to activate the caspase cascade, which is an important apoptotic route.

É ainda um objeto desta invenção, uma composição antitumoral contendo entre 3 a 400pg/ml de compostos inibidores da proteína MRP1 associada a um composto antiproliferativo pertencente ao estado da técnica e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Esta composição antitumoral possibilita a ação sinérgica dos compostos inibidores da proteína MRP1 com o dito composto antiproliferativo, permitindo que sejam aplicadas concentrações menores tanto deste objeto da invenção, como do composto antiproliferativo a ele associado. O sinergismo ocorre, pois, a composição inibidora desta invenção possui a capacidade de sensibilizar tumores que expressam à proteína MRP favorecendo a otimização da absorção dos compostos ativos administradas conjuntamente à dita composição inibidora.It is also an object of this invention, an antitumor composition containing between 3 to 400pg / ml of MRP1 protein inhibiting compounds associated with an antiproliferative compound belonging to the state of the art and pharmaceutically acceptable adjuvants. This antitumor composition enables the synergistic action of the MRP1 protein inhibitor compounds with said antiproliferative compound, allowing lower concentrations to be applied to both this object of the invention and the associated antiproliferative compound. Synergism occurs, therefore, the inhibitory composition of this invention has the ability to sensitize tumors that express to the MRP protein, favoring the optimization of the absorption of active compounds administered together with said inhibitory composition.

Os compostos inibidores da proteína MRP1 que podem ser empregados neste objeto são triterpenos isolados e não isolados capazes de inibir a ação inibidora da atividade da proteína MRP1/ABCC1.The MRP1 protein inhibitory compounds that can be used in this object are isolated and non-isolated triterpenes capable of inhibiting the activity inhibiting action of the MRP1 / ABCC1 protein.

Estes compostos inibidores da MRP1 não isolados que são empregados neste objeto são: o extrato alcoólico da planta Cecropia lyratiloba rico em triterpenos não isolados inibidores da atividade da MRP1 e/ou um ou mais triterpenos isolados pertencentes ao grupo consistido de: 3-beta acetil tormêntico (3AT); ácido 2-alfa acetil tormêntico (2-AT); ácido tormêntico; ácido euscáfico (AE); ácido isoajurnólico (ISO); um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável dos mesmos.These non-isolated MRP1 inhibiting compounds that are used in this object are: the alcoholic extract of the plant Cecropia lyratiloba rich in non-isolated triterpenes that inhibit MRP1 activity and / or one or more isolated triterpenes belonging to the group consisting of: 3-beta acetyl torméntico (3AT); 2-alpha acetyl tartaric acid (2-AT); tortic acid; euscic acid (AE); isoajurnolic acid (ISO); a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.

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Os compostos antiproliferativos ao quai este objeto se refere são quimioterápicos pertencentes ao domínio público pertencem ao grupo compreendido de: cisplatina, topotecam, irinotecam, vinblastina, vincristina, daunorubicina, doxorubicina, paclitaxel, docetaxel, etoposideo, teniposidio, mitoxantrona, bisantreno, metotrexato, flavopiridol, verapamil, tamoxifen, imatinib, quercetina e gefitinib.The antiproliferative compounds to which this object refers are chemotherapeutic agents belonging to the public domain belong to the group comprised of: cisplatin, topotecan, irinotecam, vinblastine, vincristine, daunorubicin, doxorubicin, paclitaxel, docetaxel, etoposide, teniposidio, mitoxanotantranoxananthyroxantran, bisitoxanoxan, methoxanthyrotoxin, bisitoxanthyrate, bishoxidine, mitoxanthyrate, bishoxidine, mitoxanthyrate, bishoxidine, mitoxanthyridine, mitoxanthyridine, mitoxanthyridine, mitoxanthyridine, mitoxanthyridine, mitoxanthyridine, mitoxanthyridine, mitoxanthyridine, mitoxanthyramidine, mitoxanthyridine, mitoxanthyramidine. , verapamil, tamoxifen, imatinib, quercetin and gefitinib.

A comprovação do sinergismo ocorrido entre os compostos inibidores da MRP1 e o composto antiproliferativo pertencente ao estado da técnica, pode ser verificada pela tabela 2 que expressa os dados obtidos nos testes realizados utilizando a linhagem B16F10 que é resistente a baixas concentrações de doxorubicina (DOX).The proof of synergism between MRP1 inhibitor compounds and the antiproliferative compound belonging to the state of the art can be seen in Table 2, which expresses the data obtained in tests performed using the B16F10 strain that is resistant to low concentrations of doxorubicin (DOX) .

Tabela 2: Tratamento empregando-se a composição inibidora da proteína MRP (composição) sensibiliza a linhagem celular B16F10 ao quimioterápico Doxorubicina ou Co-tratamento de B16F10 com Doxorubicina.Table 2: Treatment using the MRP protein inhibitory composition (composition) sensitizes the B16F10 cell line to the chemotherapy drug Doxorubicin or Co-treatment of B16F10 with Doxorubicin.

TRATAMENTO TREATMENT SUB-G1 SUB-G1 G1 G1 S s G2 G2 Controle Control 1,6% ±0,83 1.6% ± 0.83 59,8% ± 0,28 59.8% ± 0.28 11,4% ±0,3 11.4% ± 0.3 16,8% ±0,82 16.8% ± 0.82 Composição 6,25μg/ml Composition 6.25μg / ml 1,3% ±0,28 1.3% ± 0.28 59,4% ± 4,24 59.4% ± 4.24 11,1% ±0,14 11.1% ± 0.14 17% ±0,35 17% ± 0.35 Composição 12,5pg/ml Composition 12.5pg / ml 1,2% ±0,17 1.2% ± 0.17 56,5% ± 3,89 56.5% ± 3.89 11,6% ± 0,85 11.6% ± 0.85 17,1% ± 1,43 17.1% ± 1.43 DOX 0,1 μΜ DOX 0.1 μΜ 1,8% ±0,64 1.8% ± 0.64 54,6% ± 4,81 54.6% ± 4.81 7,6% ± 0,85 7.6% ± 0.85 22,3% ± 3,25 22.3% ± 3.25 Composição 6,25pg/ml + DOX 0,1 μΜ Composition 6.25pg / ml + DOX 0.1 μΜ 1,6% ± 0,47 1.6% ± 0.47 44,1% ±2,69 44.1% ± 2.69 6,2% ± 0,71 6.2% ± 0.71 31,9% ±4,03 31.9% ± 4.03 Composição 12^ig/ml + DOX 0,1 μΜ Composition 12 µg / ml + DOX 0.1 μΜ 1,8% ±0,57 1.8% ± 0.57 30,4% ± 1,84 30.4% ± 1.84 5,5% ± 0,42 5.5% ± 0.42 39,8% ± 3,39 39.8% ± 3.39

*Células de B16F10 foram co-tratadas com concentrações subletais de 3AT e doxorubicina por 48 horas e a percentagem de células em cada fase do clico celular foi avaliada por citometria de fluxo. Sub-G1 (apoptose), G1 (fase G1), S (fase S), G2M (passagem G2 para M)* B16F10 cells were co-treated with sublethal concentrations of 3AT and doxorubicin for 48 hours and the percentage of cells in each phase of the cell cycle was assessed by flow cytometry. Sub-G1 (apoptosis), G1 (phase G1), S (phase S), G2M (passage G2 to M)

Durante o co-tratamento das células B16F10 com doxorubicina e o primeiro objeto desta invenção, foi verificado, utilizando-se um citômetro de fluxo, a indução da parada do ciclo celular desta linhagem na fase de controle G2/M. Esse efeito citostático demonstra que, ao inibir a MRP, o primeiro objeto desta invenção sensibiliza uma linhagem resistente a drogas anti-neoplásicas.During the co-treatment of B16F10 cells with doxorubicin and the first object of this invention, it was verified, using a flow cytometer, the induction of the cell cycle arrest of this line in the G2 / M control phase. This cytostatic effect demonstrates that, by inhibiting MRP, the first object of this invention sensitizes a strain resistant to anti-neoplastic drugs.

Preferencialmente, esta composição antitumoral emprega entre 3 a 25C^g/ml dos compostos inibidores da proteína MRP1 associada a um composto antiproliferativo pertencente ao estado da técnica. AindaPreferably, this antitumor composition employs between 3 to 25C Âµg / ml of the MRP1 protein inhibitory compounds associated with an antiproliferative compound belonging to the prior art. Still

11/19 preferencialmente, o composto antiproiiferativo deste objeto da invenção é um quimioterápico empregado no tratamento de neoplasias hematológicas (leucemias, linfomas, mielomas etc), do sistema nervoso, pele, pulmão, testículos, próstata, adrenal, rim, bexiga, fígado, pâncreas, ovários, ossos, mama, tireóide, hipófise, estomago, intestinos delgado e grosso, de tecido mole (sarcomas), carcinoma e outros tumores sólidos.11/19 preferably, the anti-proliferative compound of this object of the invention is a chemotherapy used in the treatment of hematological neoplasms (leukemias, lymphomas, myelomas, etc.), of the nervous system, skin, lung, testicles, prostate, adrenal, kidney, bladder, liver, pancreas, ovaries, bones, breast, thyroid, pituitary, stomach, small and large intestines, soft tissue (sarcomas), carcinoma and other solid tumors.

Esta invenção se refere ainda ao método de inibição da atividade de proteínas MRP1, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição inibidora da proteína MRP1, em um animal mamífero portador de uma desordem proliferativa indesejada. O dito método de inibição de proteínas da família MRP1/ABCC1 atua especificamente na inibição da MRP1, objetivando, dessa forma, a diminuição desta proteína que é superexpressa durante o processo de proliferação incontrolada de células tumorais. A composição inibidora empregada no presente método pode conter entre 1 a 1000 pg/ml de um triterpeno isolado ou não isolado capaz de inibir as proteínas MRP1.This invention also relates to the method of inhibiting MRP1 protein activity, which comprises administering a therapeutically effective amount of an MRP1 protein inhibitory composition, to a mammalian animal carrying an unwanted proliferative disorder. Said method of inhibiting proteins of the MRP1 / ABCC1 family acts specifically in the inhibition of MRP1, aiming, in this way, to decrease this protein that is overexpressed during the process of uncontrolled proliferation of tumor cells. The inhibitory composition employed in the present method can contain between 1 and 1000 pg / ml of an isolated or non-isolated triterpene capable of inhibiting MRP1 proteins.

Preferencialmente, a composição inibidora deve conter preferencialmente entre 10 a 500 pg/ml de um ou mais triterpenos isolados compreendido dentre o grupo consistido de: o ácido 3-beta acetil tormêntico (3TA); ácido 2-alfa acetil tormêntico (2AT); ácido tormêntico; ácido euscáfico (AE); ácido isoajurnólico (ISO); um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Ainda preferencialmente, a composição inibidora pode ser consistida d uma concentração compreendida entre 10 a 500 pg/ml de um extrato alcoólico de C. lyratiloba rico em triterpenos não isolados. Mais preferencialmente ainda, a composição utilizada pelo método de inibição da MRP contém entre 10 a 500 pg/ml de um triterpeno isolado, seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável. Tal método de inibição é mais efetivo e apresenta menos efeitos adversos que os usuais métodos empregados na inibição da MRP1.Preferably, the inhibitory composition should preferably contain between 10 to 500 pg / ml of one or more isolated triterpenes, comprised of the group consisting of: 3-beta acetyl-tortic acid (3TA); 2-alpha acetyl tartaric acid (2AT); tortic acid; euscic acid (AE); isoajurnolic acid (ISO); a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof. Even more preferably, the inhibitory composition may consist of a concentration comprised between 10 to 500 pg / ml of an alcoholic extract of C. lyratiloba rich in non-isolated triterpenes. Most preferably, the composition used by the MRP inhibition method contains between 10 to 500 pg / ml of an isolated triterpene, its pharmaceutically acceptable salt or solvate. Such an inhibition method is more effective and has fewer adverse effects than the usual methods used to inhibit MRP1.

Este método para inibir a atividade de proteínas MRP1 não impede a entrada do composto inibidor, bem como, de outros compostos químicos no interior das células. Os efeitos alcançados por este método são primeiramente impedir que tanto o composto inibidor, como os demais compostos químicos que foram absorvidos pela célula sejam expulsos da célula.This method of inhibiting the activity of MRP1 proteins does not prevent the entry of the inhibitor compound, as well as other chemical compounds into the cells. The effects achieved by this method are primarily to prevent both the inhibitory compound and the other chemical compounds that have been absorbed by the cell from being expelled from the cell.

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O método de tratamento de desordens proliferativas baseado na administração de uma composição inibidora das proteínas da família MRP1/ABCC1 em um animal mamífero portador de uma desordem resultante da proliferação indesejada de células é também um objeto desta invenção.The method of treating proliferative disorders based on the administration of an inhibitory composition of the MRP1 / ABCC1 family proteins to a mammalian animal with a disorder resulting from unwanted cell proliferation is also an object of this invention.

Desordem proliferativa pode ser qualquer tipo de neoplasias localizadas em tecidos, glândulas e/ou órgãos de mamíferos, tais como sistema hematopoiético (leucemias, linfomas mielomas, etc), tecidos moles (sarcomas), sistema nervoso, pulmão, testículos, próstata, adrenal, rim, bexiga, fígado, pâncreas, ovários, ossos, mama, tireóide, hipófise, estomago, intestinos delgado e grosso, sangue. Mais preferivelmente ainda, o termo desordem proliferativa significa a proliferação indesejada de células tumorigênicas no pulmão, rim, bexiga, fígado, pele, pâncreas, estômago, ovário, testículo, sangue, cérebro, ossos e mama.Proliferative disorder can be any type of neoplasms located in tissues, glands and / or organs of mammals, such as hematopoietic system (leukemias, lymphomas, myelomas, etc.), soft tissues (sarcomas), nervous system, lung, testicles, prostate, adrenal, kidney, bladder, liver, pancreas, ovaries, bones, breast, thyroid, pituitary, stomach, small and large intestines, blood. Most preferably, the term proliferative disorder means the unwanted proliferation of tumorigenic cells in the lung, kidney, bladder, liver, skin, pancreas, stomach, ovary, testis, blood, brain, bones and breast.

Este método baseia-se na administração, a um animal mamífero, de uma composição inibidora da MRP1 capaz de induzir apoptose e de sensibilizar células que expressam o fenótipo MDR mediado pela superexpressão da proteína MRP1/ABCC1 aos quimioterápicos pertencentes ao estado da técnica.This method is based on the administration to a mammalian animal of an MRP1 inhibiting composition capable of inducing apoptosis and of sensitizing cells that express the MDR phenotype mediated by the overexpression of the MRP1 / ABCC1 protein to prior art chemotherapeutic agents.

A composição inibidora deste método deve conter entre 1 a 1000 pg/ml de um triterpeno isolado ou não isolado capaz de inibir as proteínas MRP1. Preferencialmente, a composição inibidora deve conter preferencialmente entre 10 a 500 pg/ml de um ou mais triterpenos isolados pertencentes ao grupo consistido de: ácido 3-beta acetil tormêntico (3TA); ácido 2-alfa acetil tormêntico (2AT); ácido tormêntico (AT); ácido euscáfico (AE); e ácido isoajurnólico (ISO) um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável dos mesmos.The inhibitory composition of this method must contain between 1 and 1000 pg / ml of an isolated or non-isolated triterpene capable of inhibiting MRP1 proteins. Preferably, the inhibitory composition should preferably contain between 10 to 500 pg / ml of one or more isolated triterpenes belonging to the group consisting of: 3-beta acetyl-tortic acid (3TA); 2-alpha acetyl tartaric acid (2AT); tortic acid (AT); euscic acid (AE); and isoajurnolic acid (ISO) a pharmaceutically acceptable salt or solvate thereof.

Opcionalmente, de forma preferencial, a composição inibidora, utilizada pelo método de tratamento de desordenes proliferativa descrito, é consistida pelo extrato alcoólico de C. lyratiloba rico em triterpenos não isolados. Tal método de tratamento e/ou prevenção possui a capacidade induzir a morte ou de sensibilizar células que expressam o fenótipo MDR mediado pela expressão da proteína MRP1/ABCC1 ao quimioterápico pertencente ao estado da técnica. Tal método de inibição é mais efetivo e apresenta menos efeitos adversos que os usuais métodos de inibição da MRP, especialmente, a MRP1.Optionally, preferably, the inhibitory composition, used by the described proliferative disorder treatment method, consists of the alcoholic extract of C. lyratiloba rich in non-isolated triterpenes. Such a method of treatment and / or prevention has the capacity to induce death or to sensitize cells that express the MDR phenotype mediated by the expression of the MRP1 / ABCC1 protein to the chemotherapy belonging to the state of the art. Such an inhibition method is more effective and has fewer adverse effects than the usual methods of inhibiting MRP, especially MRP1.

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Este método é bastante efetivo e específico, pois, o triterpeno contido na composição inibidora apresenta elevada especificidade para as proteínas da família MRP/ABCC, especialmente, a MRP1/ABCC1.This method is very effective and specific, since the triterpene contained in the inhibitory composition has high specificity for the proteins of the MRP / ABCC family, especially MRP1 / ABCC1.

É ainda um objeto desta invenção o método de tratamento de tumores resistentes a múltiplas drogas (MDR), baseado na administração conjunta de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição inibidora de proteínas da família MRP1/ABCC1 em associação a um quimioterápico pertencente ao estado da técnica a um animal mamífero portador de um tumor resistente a múltiplas drogas.It is also an object of this invention the method of treating multi-drug resistant tumors (MDR), based on the joint administration of a therapeutically effective amount of a protein inhibitor composition of the MRP1 / ABCC1 family in association with a prior art chemotherapeutic agent. to a mammalian animal with a tumor resistant to multiple drugs.

Esse método possibilita o tratamento de tumores MDR devido a capacidade do triterpeno, contido na composição inibidora, de sensibilizar um tumor que expressa MRP associado a um quimioterápico ao qual ele é resistente. Tal capacidade foi comprovada em testes realizados, onde a linhagem celular B16F10 foi co-tratada com uma composição contendo um triterpeno e um quimioterápico pertencente ao estado da técnica. Esse cotratamento foi capaz de induzir o fim da proliferação celular indesejada em células tumorais, devido à parada do ciclo celular das células tratadas na fase G2/M do ciclo. Esse efeito citostático, ou seja, a interrupção do ciclo celular é clinicamente interessante, pois impede o crescimento do tumor. Além disso, em alguns casos, esse efeito pode possibilitar dentre outras coisas, a remoção cirúrgica do tumor.This method allows the treatment of MDR tumors due to the ability of the triterpene, contained in the inhibitory composition, to sensitize a tumor that expresses MRP associated with a chemotherapy to which it is resistant. Such capacity was proven in tests carried out, where the cell line B16F10 was co-treated with a composition containing a triterpene and a chemotherapy belonging to the state of the art. This co-treatment was able to induce the end of unwanted cell proliferation in tumor cells, due to the cell cycle arrest of the cells treated in the G2 / M phase of the cycle. This cytostatic effect, that is, the interruption of the cell cycle is clinically interesting, as it prevents the growth of the tumor. In addition, in some cases, this effect may enable, among other things, surgical removal of the tumor.

O método de tratamento de neoplasias MDR com a composição inibidora de proteínas MDR, por sensibilizar as células resistentes ao efeito do quimioterápico, possibilita ainda a prevenção do desenvolvimento do fenótipo de resistência, caso venha a ser administrado a um mamífero portador de uma neoplasia, desde o inicio do tratamento quimioterápico que o mesmo vier a ser submetido. Desta forma, a administração conjunta da composição inibidora e do quimioterápico atuará no combate tanto das células do tumoral sensíveis ao dito agente quimioterápico, como sobre as células já resistentes a múltiplas drogas existentes no tumor.The method of treating MDR neoplasms with the inhibitory composition of MDR proteins, by sensitizing cells resistant to the effect of chemotherapy, also makes it possible to prevent the development of the resistance phenotype, in case it is administered to a mammal with a neoplasm, since the beginning of chemotherapy treatment that the same undergoes. In this way, the joint administration of the inhibitory composition and the chemotherapy will act in the fight both of the tumor cells sensitive to said chemotherapeutic agent, and on the cells already resistant to multiple drugs existing in the tumor.

Este método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição inibidora contendo preferencialmente entre 3 a 40(Xg/ml de um ou mais triterpenos, não isoladosThis method comprises the administration of a therapeutically effective amount of an inhibitory composition preferably containing from 3 to 40 (Xg / ml of one or more triterpenes, not isolated

14/19 ou isolados, em conjunto com uma quantidade reduzida de um quimioterápico usualmente empregado no tratamento de neoplasias malignas.14/19 or isolated, together with a reduced amount of a chemotherapy agent usually used in the treatment of malignant neoplasms.

Finalmente, esta invenção refere-se a um método de tratamento de tumores baseado na administração conjunta de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição inibidora de proteínas da família MRP1/ABCC1 em associação a um quimioterápico pertencente ao estado da técnica a um animal mamífero portador de um tumor resistente a múltiplas drogas.Finally, this invention relates to a method of treating tumors based on the joint administration of a therapeutically effective amount of an inhibitory composition of proteins of the MRP1 / ABCC1 family in association with a chemotherapeutic agent belonging to the prior art to a mammalian animal carrying a tumor resistant to multiple drugs.

Os quimioterápicos pertencentes ao domínio público que podem ser empregados conjuntamente com a composição inibidora desta invenção os compostos pertencentes ao grupo compreendido de: cisplatina, topotecam, irinotecam, vinblastina, vincristina, daunorubicina, doxorubicina, paclitaxel, docetaxel, etoposideo, teniposidio, mitoxantrona, bisantreno, metotrexato, flavopiridol, verapamil, tamoxifenr, valspodar, biricodar, zosuquidar, tariquidar, elacridar, ontogen, elacrida, imatinib, quecertina e gefitinib.Chemotherapeutics belonging to the public domain that can be used in conjunction with the inhibitory composition of this invention the compounds belonging to the group comprised of: cisplatin, topotecan, irinotecam, vinblastine, vincristine, daunorubicin, doxorubicin, paclitaxel, docetaxel, etoposide, teniposidio, mitoxantrantrone , methotrexate, flavopyridol, verapamil, tamoxifenr, valspodar, biricodar, zosuquidar, tariquidar, elacridar, ontogen, elacrida, imatinib, quecertina and gefitinib.

Para este objeto da invenção, vemos que a composição inibidora das proteínas MRP1/ABCC1 deve ser empregada conjuntamente com um quimioterápico pertencente ao estado da técnica. Quando utilizada em conjunto com um quimioterápico pertencente ao estado da técnica, a dita composição inibidora atuará de forma sinérgica ao dito quimioterápico permitindo que sejam aplicadas concentrações menores tanto deste objeto da invenção, como do quimioterápico a ele associado sem que ocorra a redução da eficácia terapêutica, quando em comparação com o tratamento antitumoral tanto da composição inibidora desta invenção como do quimioterápico empregado.For this object of the invention, we see that the inhibitory composition of the MRP1 / ABCC1 proteins must be used in conjunction with a chemotherapeutic agent belonging to the state of the art. When used in conjunction with a chemotherapeutic agent belonging to the state of the art, said inhibitor composition will act synergistically to said chemotherapeutic agent, allowing lower concentrations of both this object of the invention and the associated chemotherapeutic agent to be applied without reducing the therapeutic efficacy. , when compared to the antitumor treatment of both the inhibitory composition of this invention and the chemotherapy used.

Os exemplos fornecidos têm a mera função de ilustrar as concretizações realizadas pelos inventores, não devendo ser empregados na delimitação de seus direitos.The examples provided have the sole function of illustrating the achievements made by the inventors, and should not be used in the delimitation of their rights.

Exemplos 1: Investigação da ação do triterpeno 3AT:Examples 1: Investigation of the action of the 3AT triterpene:

A atividade anti-MDR do composto 3p-acetil tormêntico (3AT) foi investigada utilizando as linhagens leucêmicas Lucena 1 (Rumjanek et al., 2001) e K562/DOX (Tang et al., 2004) que expressam P-gp/ABCB1, o melamona murino B16F10 e o neuroblastoma humano GBV, que expressam MRP1/ABCC1 e a linhagem de câncer de pulmão humano, A549, que expressa diferentes proteínas da família MRP (MRP1-5). Ο 3AT induz a apoptose dasThe anti-MDR activity of the compound 3p-acetyl tortic (3AT) was investigated using the leukemic strains Lucena 1 (Rumjanek et al., 2001) and K562 / DOX (Tang et al., 2004) that express P-gp / ABCB1, murine melamine B16F10 and human neuroblastoma GBV, which express MRP1 / ABCC1, and the human lung cancer strain, A549, which expresses different proteins of the MRP family (MRP1-5). AT 3AT induces apoptosis of

15/19 linhagens de maneira dose-dependente. O efeito do 3AT sobre a expressão da proteína MRP1 foi feito por citometria de fluxo utilizando anticorpos específicos para a proteína. Seu efeito sobre a atividade de bomba das proteínas foi avaliado pela capacidade do composto em interferir com o transporte de substratos específicos para a P-gp (Rhodamina 123) e MRP1 (CFDA). Medida de acúmulo de Rho 123 em células expressando P-gp, Lucena 1 e K562/DOX (fig. 1 e fig.3) mostrou que o tratamento com verapamil, um conhecido inibidor da P-gp, induzia um grande aumento no acúmulo desse composto enquanto o tratamento com o triterpeno ou o extrato causava apenas um pequeno efeito no acúmulo do substrato indicando que nem o triterpeno nem o extrato tem efeito sobre a atividade da P-gp/ABCB1.15/19 strains in a dose-dependent manner. The effect of 3AT on the expression of the MRP1 protein was done by flow cytometry using specific antibodies to the protein. Its effect on protein pump activity was evaluated by the compound's ability to interfere with the transport of specific substrates for P-gp (Rhodamine 123) and MRP1 (CFDA). Measurement of Rho 123 accumulation in cells expressing P-gp, Lucena 1 and K562 / DOX (fig. 1 and fig.3) showed that treatment with verapamil, a well-known P-gp inhibitor, induced a large increase in the accumulation of this compound while treatment with triterpene or extract caused only a small effect on substrate accumulation indicating that neither triterpene nor extract has an effect on P-gp / ABCB1 activity.

Experimento realizado com a linhagem celular B16F10 demonstrou que o tratamento com o triterpeno induz o aumento do acúmulo do substrato (CFDA) superior ao obtido com tratamento com MK571, um inibidor comercial específico de MRP, indicando que o triterpeno inibe a atividade da MRP1 (figura 4). De fato, como mostrado na tabela 1 à inibição da MRP1 obtida com 47.00 μΜ de 3AT é aproximadamente duas vezes a observada com 50 μΜ de MK571 indicando este triterpeno é um inibidor da MRP1/ABCC1 mais potente que ο MK571. Portanto, apesar dos dois inibidores, 3AT e MK571 apresentarem um efeito pequeno sobre a atividade da P-gp/ABCB1, o triterpeno utilizado deve ser considerado um potente inibidor da MRP1/ABCC1. Experimento realizado com a GBV, outra linhagem que expressa MRP1/ABCC1, também mostrou efeito inibitório do 3AT sobre essa proteína (figura 5).An experiment carried out with the B16F10 cell line demonstrated that treatment with triterpene induces an increase in substrate accumulation (CFDA) higher than that obtained with treatment with MK571, a specific commercial MRP inhibitor, indicating that triterpene inhibits MRP1 activity (figure 4). In fact, as shown in table 1, the inhibition of MRP1 obtained with 47.00 μΜ of 3AT is approximately twice that observed with 50 μΜ of MK571 indicating this triterpene is a more potent MRP1 / ABCC1 inhibitor than ο MK571. Therefore, although the two inhibitors, 3AT and MK571 have a small effect on the activity of P-gp / ABCB1, the triterpene used must be considered a potent inhibitor of MRP1 / ABCC1. An experiment carried out with GBV, another strain that expresses MRP1 / ABCC1, also showed an inhibitory effect of 3AT on this protein (figure 5).

Em outro experimento, realizado com a linhagem celular A549 que expressa diferentes proteínas da família MRP/ABCC, foi demonstrado que enquanto o tratamento com MK571, um inibidor comercial específico da MRP, aumenta significativamente o acúmulo do substrato (CFDA), o tratamento com o triterpeno só induz um pequeno aumento de acúmulo desse substrato, sugerindo que esse composto iniba a MRP1, mas não tenha efeito sobre as outras MRPs presente na A549 (fig. 5).In another experiment, carried out with the cell line A549 that expresses different proteins of the MRP / ABCC family, it was demonstrated that while the treatment with MK571, a specific commercial MRP inhibitor, significantly increases the substrate accumulation (CFDA), the treatment with the triterpene only induces a small increase in the accumulation of this substrate, suggesting that this compound inhibits MRP1, but has no effect on the other MRPs present in A549 (fig. 5).

A atividade anti-MDR do composto 3p-acetil tormêntico (3AT) foi investigada utilizando as linhagens leucêmicas Lucena 1 (Rumjanek et al., 2001) e K562/DOX (Tang et al., 2004) que expressam P-gp/ABCB1, oThe anti-MDR activity of the compound 3p-acetyl tortic (3AT) was investigated using the leukemic strains Lucena 1 (Rumjanek et al., 2001) and K562 / DOX (Tang et al., 2004) that express P-gp / ABCB1, O

16/19 melamona murino B16F10 e o glioblastoma multiforme humano GBV, que expressam MRP1/ABCC1 e a linhagem de câncer de pulmão humano, A549, que expressa diferentes proteínas da família MRP (MRP1-5). Ο 3AT induz a apoptose das linhagens de maneira dose-dependente. O efeito do 3AT sobre a expressão da proteína MRP1 foi feito por citometria de fluxo utilizando anticorpos específicos para a proteína. Seu efeito sobre a atividade de bomba das proteínas foi avaliado pela capacidade do composto em interferir com o transporte de substratos específicos para a P-gp (Rhodamina 123) e MRP1 ( CFDA). Medida de acúmulo de Rho 123 em células expressando P-gp, Lucena 1 e K562/DOX (fig.1 e fig.3) mostrou que o tratamento com verapamil, um conhecido inibidor da P-gp, induzia um grande aumento no acúmulo desse composto enquanto o tratamento com o triterpeno ou o extrato causava apenas um pequeno efeito no acúmulo do substrato indicando que nem o triterpeno nem o extrato tem efeito sobre a atividade da P-gp/ABCB1.16/19 murine melamona B16F10 and human glioblastoma multiforme GBV, which express MRP1 / ABCC1 and the human lung cancer strain, A549, which expresses different proteins of the MRP family (MRP1-5). AT 3AT induces apoptosis of the strains in a dose-dependent manner. The effect of 3AT on the expression of the MRP1 protein was done by flow cytometry using specific antibodies to the protein. Its effect on protein pump activity was evaluated by the compound's ability to interfere with the transport of specific substrates for P-gp (Rhodamine 123) and MRP1 (CFDA). Measurement of Rho 123 accumulation in cells expressing P-gp, Lucena 1 and K562 / DOX (fig.1 and fig.3) showed that treatment with verapamil, a well-known P-gp inhibitor, induced a large increase in the accumulation of this compound while treatment with triterpene or extract caused only a small effect on substrate accumulation indicating that neither triterpene nor extract has an effect on P-gp / ABCB1 activity.

Experimento realizado com a linhagem celular B16/F10 demonstrou que o tratamento com o triterpeno induz o aumento do acúmulo do substrato (CFDA) superior ao obtido com tratamento com MK571, um inibidor comercial específico de MRP, indicando que o triterpeno inibe a atividade da MRP1 (figura 4). De fato, como mostrado na tabela 1 a inibição da MRP1 obtida com 25 μΜ de 3AT é aproximadamente duas vezes a observada com 50 μΜ de MK571 indicando este triterpeno é um inibidor da MRP1/ABCC1 mais potente que ο MK571. Portanto, apesar dos dois inibidores, 3AT e MK571 apresentarem um efeito pequeno sobre a atividade da P-gp/ABCB1, o triterpeno utilizado deve ser considerado um potente inibidor da MRP1/ABCC1. Experimento realizado com a GBV, outra linhagem que expressa MRP1/ABCC1, também mostrou efeito inibitório do 3AT sobre essa proteína (figura 5).Experiment carried out with the B16 / F10 cell line demonstrated that treatment with triterpene induces an increase in the substrate accumulation (CFDA) higher than that obtained with treatment with MK571, a specific commercial MRP inhibitor, indicating that triterpene inhibits MRP1 activity (figure 4). In fact, as shown in Table 1, the MRP1 inhibition obtained with 25 μΜ of 3AT is approximately twice that observed with 50 μΜ of MK571 indicating this triterpene is a more potent MRP1 / ABCC1 inhibitor than ο MK571. Therefore, although the two inhibitors, 3AT and MK571 have a small effect on the activity of P-gp / ABCB1, the triterpene used must be considered a potent inhibitor of MRP1 / ABCC1. An experiment carried out with GBV, another strain that expresses MRP1 / ABCC1, also showed an inhibitory effect of 3AT on this protein (figure 5).

Em outro experimento, realizado com a linhagem celular A549 que expressa às diferentes proteínas da família MRP/ABCC, foi demonstrado que enquanto o tratamento com MK571, um inibidor comercial específico da MRP, aumenta significativamente o acúmulo do substrato (CFDA), o tratamento com o triterpeno só induz um pequeno aumento de acúmulo desse substrato, sugerindo que esse composto iniba a MRP1, mas não tenha efeito sobre as outras MRPs presente na A549 (fig. 6).In another experiment, carried out with the cell line A549 that expresses the different proteins of the MRP / ABCC family, it was demonstrated that while treatment with MK571, a specific commercial MRP inhibitor, significantly increases the substrate accumulation (CFDA), treatment with triterpene only induces a small increase in the accumulation of this substrate, suggesting that this compound inhibits MRP1, but has no effect on the other MRPs present in A549 (fig. 6).

17/1917/19

Tabela 1: Efeito do triterpeno no acúmulo do substrato para MRP1:Table 1: Effect of triterpene on MRP1 substrate accumulation:

Carregamento Loading R* R * CF CF 1 1 CF + MK571 25,7pg/mL CF + MK571 25.7pg / mL 10.45 ± 1.67 10.45 ± 1.67 CF + 3AT 6,25 pg/mL CF + 3AT 6.25 pg / mL 5.56 ± 1.16 5.56 ± 1.16 CF + 3AT 12,5 pg/mL CF + 3AT 12.5 pg / mL 11.35 ± 1.31 11.35 ± 1.31 CF + 3AT 25 pg/mL CF + 3AT 25 pg / mL 20.86 ± 3.39 20.86 ± 3.39

R*: Razão entre o acúmulo de substrato (CF) em células incubadas com meio e em células incubadas com o triterpeno ou o inibidor MK571R *: Ratio between substrate accumulation (CF) in cells incubated with medium and cells incubated with triterpene or MK571 inhibitor

Avaliação da expressão da MRP1/ABCC1 em células B16F10 demonstrou que ο 3AT não interfere nos níveis desta proteína (Figura 7) Exemplo 2: Efeito do co-tratamento de 3AT com Doxorubicina ao quimioterápico:Evaluation of MRP1 / ABCC1 expression in B16F10 cells demonstrated that ο 3AT does not interfere with the levels of this protein (Figure 7) Example 2: Effect of co-treatment of 3AT with Doxorubicin on chemotherapy:

O efeito inibitório do 3AT sobre a MRP1 também foi avaliado por sua capacidade em sensibilizar um tumor que expressa essa proteína a um quimioterápico ao qual o tumor é resistente. Utilizando a linhagem B16F10, que é resistente a baixas concentrações de doxorubicina, observamos que o cotratamento com 3AT e doxorubicina induz uma parada do ciclo celular em G2/M nesta linhagem (tabela 2). Esse efeito citostático demonstra que, ao inibir a MRP1/ABCC1, ο 3AT sensibiliza uma linhagem resistente a drogas antineoplásicas.The inhibitory effect of 3AT on MRP1 was also assessed for its ability to sensitize a tumor that expresses this protein to a chemotherapeutic to which the tumor is resistant. Using the B16F10 strain, which is resistant to low concentrations of doxorubicin, we observed that co-treatment with 3AT and doxorubicin induces a cell cycle arrest in G2 / M in this strain (table 2). This cytostatic effect demonstrates that, by inhibiting MRP1 / ABCC1, ο 3AT sensitizes a strain resistant to antineoplastic drugs.

Tabela 2: Co-tratamento com 3AT sensibiliza a de B16F10 ao quimioterápico Doxorubicina ou Co-tratamento de B16F10 com 3AT e DoxorubicinaTable 2: Co-treatment with 3AT sensitizes B16F10 to chemotherapy Doxorubicin or Co-treatment of B16F10 with 3AT and Doxorubicin

TRATAMENTO TREATMENT SUB-G1 SUB-G1 G1 G1 S s G2 G2 Controle Control 1,6% ±0,83 1.6% ± 0.83 59,8% ± 0,28 59.8% ± 0.28 11,4% ± 0,3 11.4% ± 0.3 16,8% ±0,82 16.8% ± 0.82 3AT 6,25pg/ml 3AT 6.25pg / ml 1,3% ±0,28 1.3% ± 0.28 59,4% ± 4,24 59.4% ± 4.24 11,1% ± 0,14 11.1% ± 0.14 17% ±0,35 17% ± 0.35 3AT 12,5pg/ml 3AT 12.5pg / ml 1,2% ±0,17 1.2% ± 0.17 56,5% ± 3,89 56.5% ± 3.89 11,6% ±0,85 11.6% ± 0.85 17,1% ± 1,43 17.1% ± 1.43 DOX 0,1 μΜ DOX 0.1 μΜ 1,8% ±0,64 1.8% ± 0.64 54,6% ± 4,81 54.6% ± 4.81 7,6% ± 0,85 7.6% ± 0.85 22,3% ± 3,25 22.3% ± 3.25 3AT 6,25pg/ml + DOX 0,1 μΜ 3AT 6.25pg / ml + DOX 0.1 μΜ 1,6% ± 0,47 1.6% ± 0.47 44,1% ±2,69 44.1% ± 2.69 6,2% ± 0,71 6.2% ± 0.71 31,9% ±4,03 31.9% ± 4.03 3AT 12^g/ml + DOX 0,1 μΜ 3AT 12 ^ g / ml + DOX 0.1 μΜ 1,8% ± 0,57 1.8% ± 0.57 30,4% ± 1,84 30.4% ± 1.84 5,5% ± 0,42 5.5% ± 0.42 39,8% ± 3,39 39.8% ± 3.39

Células de B16F10 foram co-tratadas com concentrações subletais de 3AT e doxorubicina por 48 horas e a percentagem de células em cada fase do cilco celular foiB16F10 cells were co-treated with sublethal concentrations of 3AT and doxorubicin for 48 hours and the percentage of cells in each cell cycle phase was

18/19 avaliada por citometria de fluxo. Sub-G1 (apoptose), G1 (fase G1), S (fase S), G2M (passagem G2 para M)18/19 assessed by flow cytometry. Sub-G1 (apoptosis), G1 (phase G1), S (phase S), G2M (passage G2 to M)

Os dados obtidos mostram que ο 3AT não tem efeito sobre a Pgp/ABCB1, mas é um potente inibidor da MRP1/ABCC1. Portanto, além de seu possível uso como quimioterápico no tratamento de tumores MDR (que expressam P-gp/ABCB1 e MRP1/ABCC1) ο 3AT também pode ser usado como co-adjuvante no tratamento de neoplasias resistentes que expressam MRP1/ABCC1, assim como outras doenças que expressem este fenótipo de resistência, ou como uma ferramenta para o estudo do mecanismo de transporte mediado pela MRP1/ABCC1.The data obtained show that ο 3AT has no effect on Pgp / ABCB1, but is a potent inhibitor of MRP1 / ABCC1. Therefore, in addition to its possible use as a chemotherapy in the treatment of MDR tumors (which express P-gp / ABCB1 and MRP1 / ABCC1) ο 3AT can also be used as a co-adjuvant in the treatment of resistant neoplasms that express MRP1 / ABCC1, as well as other diseases that express this resistance phenotype, or as a tool for studying the transport mechanism mediated by MRP1 / ABCC1.

A tabela 2 apresenta dados relativos ao efeito do 3AT e/ou Doxorubicina sobre as fases do ciclo celular da linhagem de melanoma B16F10 (que expressa MRP1/ABCC1), com o objetivo de avaliar se ο 3AT poderia atuar como co-adjuvante na atividade citotóxica da doxorubicina, um quimioterápico substrato para a MRP1/ABCC1.Table 2 presents data related to the effect of 3AT and / or Doxorubicin on the phases of the cell cycle of the melanoma line B16F10 (which expresses MRP1 / ABCC1), with the objective of evaluating whether ο 3AT could act as a co-adjuvant in cytotoxic activity doxorubicin, a chemotherapeutic substrate for MRP1 / ABCC1.

As células (1x10⁴ / poço) foram plaqueadas e, após 24h, incubadas com diferentes concentrações de 3AT (6.25 e 12.5 pg/mL) e/ou DOX (0.1 μΜ) por 48h. Após esse tempo, as células foram incubadas com o tampão HFS (contendo 50 pg/ml de PI) por 1h a 4°C. As porcentagens de células no pico sub-G1 e em cada fase do ciclo celular (G1, S e G2) foram quantificadas por citometria de fluxo (10.000 eventos; canal FL-2A). Os resultados expressam a média ± DP de dois experimentos diferentes realizados em triplicatas.The cells (1x10 ⁴ / well) were plated and, after 24h, incubated with different concentrations of 3AT (6.25 and 12.5 pg / mL) and / or DOX (0.1 μΜ) for 48h. After that time, the cells were incubated with HFS buffer (containing 50 pg / ml of PI) for 1h at 4 ° C. The percentages of cells in the sub-G1 peak and in each phase of the cell cycle (G1, S and G2) were quantified by flow cytometry (10,000 events; channel FL-2A). The results express the mean ± SD of two different experiments carried out in triplicates.

Exemplo 3: Inibição da viabilidade celular pela composição inibidora da atividade das proteínas MRP.Example 3: Inhibition of cell viability by the composition inhibiting the activity of MRP proteins.

Exemplo 3.1: Células sanguíneas.Example 3.1: Blood cells.

Células sanguíneas (linfócitos) foram plaqueados e incubados com PHA por 24 horas, após esse tempo, ocorreu a incubação com diferentes concentrações da composição inibidora das proteínas MRP, contendo o triterpeno isolado 3AT por mais 48 horas. Ao final desse período é acrescentada uma pequena concentração do MTT. Segui-se a incubação por 4 horas e leitura da cor em um leitor de ELISA.Blood cells (lymphocytes) were plated and incubated with PHA for 24 hours, after which time, incubation with different concentrations of the inhibitory composition of the MRP proteins occurred, containing the isolated 3AT triterpene for another 48 hours. At the end of that period, a small concentration of MTT is added. This was followed by incubation for 4 hours and color reading on an ELISA reader.

Os resultados estão demonstrados na tabela 3 e figura 9 na forma de % de INIBIÇÃO da viabilidade (mostra % de células NÃO viáveis).The results are shown in Table 3 and Figure 9 in the form of% viability INHIBITION (shows% of cells NOT viable).

19/1919/19

% viabilidade % viability 3AT25 3AT25 85,3 85.3 3AT 37,5 3AT 37.5 88,8 88.8 3AT 42,5 3AT 42.5 57,7 57.7 3 AT 50 3 AT 50 64,9 64.9

Tabela 3: Percentual de linfócitos estimulados com PHA vivos após o tratamento com diferentes concentrações do triterpeno 3AT isolado.Table 3: Percentage of lymphocytes stimulated with PHA alive after treatment with different concentrations of triterpene 3AT alone.

Exemplo 3.2: Células de pulmão, melanoma, leucemia mielóide aguda e glioma.Example 3.2: Lung cells, melanoma, acute myeloid leukemia and glioma.

As células das seguintes linhagens (A549, B16, HL-60 E GBV) foram plaqueadas em placas de múltiplos poços (10⁴ cels/poço), após 24 horas diferentes concentrações do composto foram adicionadas e incubadas por 48 10 horas. Ao final desse período, o MTT foi acrescentado em pequena concentração, sendo incubado por 4 horas. A leitura da cor em um leitor de Elisa. Os resultados estão demonstrados na nas figuras 10 a 13, forma de % de INIBIÇÃO da viabilidade (mostra % de células NÃO viáveis).The cells of the following strains (A549, B16, HL-60 AND GBV) were plated on multiple well plates (10 ⁴ cells / well), after 24 hours different concentrations of the compound were added and incubated for 48 hours. At the end of this period, MTT was added in small concentration, being incubated for 4 hours. The reading of color in an Elisa reader. The results are shown in figures 10 to 13, form of% viability INHIBITION (shows% of cells NOT viable).

Claims

1. Pharmaceutical composition that inhibits the activity of the MRP1 / ABCC1 protein, characterized by having as active the isolated triterpenes belonging to the group formed by the 3-beta-acetyl-tortic acid in formulations containing the excipients dimethylsulfoxide (DMSO), sodium chloride, potassium chloride, disodium phosphate, sodium phosphate and / or distilled water associated with 6.25pg / ml_; 12.5pg / ml_ and 25pg / ml_ of the 3-beta-acetyl-thoracic acid triterpene with the antiproliferative compound doxorubicin in pharmaceutically acceptable concentrations for administration in tumor-bearing mammals.

Pharmaceutical composition according to claim 1, characterized in that a set of isolated triterpenes belonging to the group consisting of 3-beta-acetyl tortic acid is used as the MRP1 / ABCC1 protein inhibitor triterpene, dissolved and diluted in a solution containing dimethylsulfoxide (DMSO) and the sodium chloride, potassium chloride, disodium phosphate, sodium phosphate and / or distilled water salts.

Pharmaceutical composition according to claims 1 and 2, characterized in that the MRP1 inhibiting agent is the alcoholic extract of the plant Cecropia lyratiloba rich in non-isolated triterpenes, in formulations containing the excipients dimethylsulfoxide (DMSO), sodium chloride, potassium chloride, disodium phosphate, sodium phosphate and / or distilled water.

Pharmaceutical composition according to claims 1 to 3, characterized in that it has concentrations of 6.25 pg / ml; 12.5pg / ml_; 25pg / ml_, 37.5pg / ml_, 50pg / ml_ and 100pg / ml_ of the MRP1 / ABCC1 protein inhibitor triterpene

Petition 870190070004, of 07/23/2019, p. 7/8

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Use of the pharmaceutical composition according to claims 1 and 2, characterized in that it prepares an active formulation of the protein-inhibiting triterpene concentration between 1 to 100pg / Kg of body weight for the treatment of a tumor-bearing animal.

6. Pharmaceutical composition characterized by combining 6.25pg / ml_; 12.5pg / ml_ and 25pg / ml_ of the triterpene 3-beta-acetyl-tartaric acid with the antiproliferative compound doxorubicin in pharmaceutically acceptable concentrations for administration in tumor-bearing mammals.