BRPI0912041A2 - composição e métodos para a detecção de aberrrações cromossômicas com tampões de hibridização - Google Patents

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Steen Hauge Matthiesen
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Tim Svenstrup Poulsen
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Abstract

COMPOSIÇÕES, SEU USO E KIT COMPREENDENDO AS MESMAS, BEM COMO MÉTODO DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU PARA A DETECÇÃO DE ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS A presente invenção refere-se a composições e métodos para a detecção de sequências de ácido nucleico associadas com aberrações cromossômicas. A invenção pode, por exemplo, eliminar o uso de, ou reduzir a dependência de formamida em hibridização. Composições para uso na invenção incluem uma composição aquosa compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico e pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo.

Description

: Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- É ÇÕES, SEU USO E KIT COMPREENDENDO AS MESMAS, BEM COMO f MÉTODO DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU PARA A DETECÇÃO DE ABER- RAÇÕES CROMOSSÔMICAS".
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se geralmente a composições e mé- todos para detectar aberrações cromossômicas in vivo, in vitro, e in situ. À presente invenção também se refere a composições compreendendo sondas moleculares para a detecção de sequências de nucleotídeo particulares (in- —cluindo sequências normais e aquelas associadas com aberrações cromos- sômicas e/ou doença infecciosa) e composições aquosas compreendendo pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade suficiente para desnaturar sequência de nucleotídeo de filamento duplo para uso em hibridi- zação, particularmente para uso em hibridização in situ (ISH).
Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a sondas moleculares para uso, por exemplo, nos campos de citologia, histologia, e biologia molecular, e a kits compreendendo tais sondas moleculares. Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a métodos de detecção de aberrações cromossômicas ou doença infecciosa usando tais sondas mo- leculares, métodos de diagnosticar um defeito genético ou estado de doença usando tais sondas moleculares, e métodos de fornecimento de um prognós- tico usando tais sondas moleculares.
ANTECEDENTES E DESCRIÇÃO Muitas condições patológicas, tanto defeitos congênitos quanto doenças adquiridas, estão associadas com aberrações cromossômicas tais como amplificações, aneuploidia, rupturas potenciais, inserções, inversões, deleções, duplicações, redisposições, e translocações. Além disso, infec- ções patogênicas geralmente resultam na presença de sequência de ácido nucleicos da bactéria infectante, vírus, ou fungos no organismo infectado.
A estabilização da presença ou ausência de uma sequência de nucleotídeo associada com um defeito congênito, doença adquirida, ou pa- tógeno infeccioso, por meio de análise in vivo, in vitro, ou in situ de DNA ge- nômico, cromossomas, fragmentos de cromossoma, ou genes, pode auxiliar um médico na realização de um diagnóstico apropriado. Por exemplo, a ex- . pansão de uma repetição de trinucleotídeo de CGG na 5'UTR (Região Não Transladada) de MRNA do gene de retardo-1 mental (FMR1) X frágil permite ' o médico diagnosticar a síndrome X frágil. Esta expansão induz ao silencia- mento transcricional do gene. Entretanto, outros mecanismos, por exemplo, deleções de FMR1 e mutações, podem também causar a síndrome X frágil.
- O resultado, ausência ou quantidades reduzidas do produto de gene, FMRP, induzindo à doença, são iguais tanto para o silenciamento causado por ex- pansão, quanto para deleção de gene. Um exemplo de uma condição cau- sada por uma anomalia numérica é a Síndrome de Down, também conheci- 2 da como Trisomia 21 (um indivíduo com a Síndrome de Down tem três copi- as de cromossoma 21, em vez de duas). Síndrome de Turner é um exemplo , de uma monosomia onde o indivíduo é nascido com apenas um cromosso- ma de sexo, um X. Outros exemplos incluem síndrome de Wolf-Hirschhorn, que6é causada por deleção parcial da ramificação curta do cromossoma 4, e síndrome de Jacobsen, também chamada o distúrbio de deleção de 11q terminal. Algumas síndromes, tais como doença de Charcot-Marie-Tooth tipo B 1A, pode ser causada por duplicações, por exemplo, do gene codificando a : proteína 22 de mielina periférica (PMP22) no cromossoma 17. Em outras síndromes, tais como translocação Robertsoniana, um cromossoma inteiro ligou-se a outro no centrômero. Translocações Robertsoniana podem ape- nas ocorrer com cromossomas 13, 14, 15, 21 e 22 e a progênie de veículo heterozigotode uma translocação Robertsoniana pode, por exemplo, herdar uma trissomia 21 desequilibrada, que causa a Síndrome de Down.
A estabilização da presença ou ausência de uma sequência de nucleotídeo associada com um defeito congênito, doença adquirida, ou pa- tógeno infeccioso, por meio de análise in vivo, in vitro, ou in situ de DNA ge- nômico, cromossomas, fragmentos de cromossoma, ou genes, pode tam- bém ser inestimável para o médico na seleção de um curso de tratamento apropriado onde um estado de doença foi diagnosticado. Por exemplo, um paciente de câncer de mama em que o gene HER?2 foi amplificado pode be-
neficiar-se de tratamento com Herceptin& (trastuzumab), um anticorpo mo- - noclonal que reconhece a proteina HER2. Em outro exemplo, um médico pode escolher prescrever Erbitux& (cetuximab) ou Vectibix& (panitumumab) ' (anticorpos monoclonais terapêuticos que especificamente reconhecem o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR)) para um paciente de câncer colorretal em quem o gene EGFR é amplificado.
A estabilização da presença ou ausência de uma sequência de nucleotídeo associada com um defeito congêntico, doença adquirida, ou pa- tógeno infeccioso, por meio de análise in vivo, in vitro, ou in situ de DNA ge- —nômico, cromossomas, fragmentos de cromossoma, ou genes, pode tam- 2 bém ajudar um médico no fornecimento de um prognóstico. Desse modo, pacientes de câncer de mama em quem o gene TOP2A é amplificado ou s deletado têm um prognóstico pior do que aqueles em quem não é. A detecção da presença ou ausência de uma sequência de nu- cleotíideo geralmente vincula o reconhecimento da sequência por hibridiza- ção, ou estabilização de uma estrutura de hélice dupla de nucleotídeo por ligação de hidrogênio entre bases sobre filamentos opostos (A+T ou G+C). Em um exemplo básico de hibridização, fragmentos ou sequências de ácido nucleico ligam-se a um fragmento ou sequência de ácido nucleico comple- mentar. A detecção por hibridização geralmente envolve o uso de sondas de ácido nucleico designadas para ligarem-se a, ou "hibridizarem-se" com, um alvo de ácido nucleico tal como, por exemplo, uma sequência de DNA ou RNA.
Técnicas bem conhecidas existem na arte de biologia molecular paraa detecção de aberrações de cromossoma. Até agora, entretanto, um teste rápido, conveniente, barato, e agradável ao usuário que provê a detec- ção difundida e de rotina de aberrações de cromossoma não está disponível.
A eficiência e precisão de ensaios de hibridização de ácido nu- cleico depende primariamente de pelo menos um dos três fatores: a) condi- ções de desnaturação (isto é, separação de, por exemplo, dois filamentos de ácido nucleico), b) condições de renaturação (isto é, retemperamento de, por exemplo, dois filamentos de ácido nucleico), e c) condições de lavagem pós- . hibridização.
Experimentos de hibridização tradicional, tais como ensaios de : ISH, usam um tampão contendo formamida para desnaturar cadeias de áci- do nucleico de filamento duplo. Formamida é um solvente que tem um efeito de desestabilização sobre o estado helicoidal de, por exemplo, DNA, RNA, e - análogos dos mesmos, deslocando livremente e uniformemente moléculas de hidrato ligadas. Além disso, formamida estabiliza o estado de espiral de DNA, RNA, e análogos dos mesmos por formamidação' dos sítios de liga- ção Watson-Crick das bases. 2 A etapa de desnaturação é seguida pelo retemperamento de dois filamentos complementares de cadeias de ácido nucleico, que é por “ grande diferença o aspecto mais demorado de um ensaio usando hibridiza- ção. Por exemplo, em um protocolo de hibridização de fluorescência tradi- cional in situ (FISH), o retemperamento leva 14 a 24 horas, e pode mesmo levar até 72 horas. Exemplos de tempos de hibridização tradicionais são mostrados nas figuras 1 e 2. Até agora acredita-se que o uso de agentes caotrópicos, tais : como formamida (outros agentes caotrópicos incluem hidrogênio de guanidí- nioeureia), que interfere com os sítios de ligação Watson-Crick de bases de ácido nucleico e desse modo atrapalha as ligações de hidrogênio entre ba- ses de ácido nucleico complementares, foi o único meio de reduzir a tempe- ratura de fusão (Tm) das cadeias complementares, como é necessário para a etapa de desnaturação. Entretanto, embora o uso de agentes caotrópicos reduzaa Tm, estes agentes parecem significantemente prolongar o tempo de hibridização, quando comparado à hibridização em uma solução aquosa sem um agente caotrópico.
Formamida tem desvantagens além de um longo tempo de pro- cessamento. A formamida é um material tóxico, perigoso, submetido a regu- lações rigorosas para uso e excreção. Além disso, o uso de uma alta con- centração de formamida parece incorrer em destruição morfológica de estru-
tura celular, nuclear, e/ou cromossômica. “ As composições aquosas descritas aqui permitem a detecção de sequência de ácidos nucleicos sob condições que têm diversas vantagens Ú potenciais sobre a técnica anterior, tais como tempos de hibridização mais 5 rápidos, menores temperaturas de hibridização, e composições de hibridiza- ção menos tóxicas. . SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece composições e métodos para a de- tecção de sequência de ácidos nucleicos associados com aberrações cro- —mossômicas. As composições e métodos da invenção são aplicáveis a qual- xs quer técnica de hibridização, e a qualquer sistema molecular que hibridiza ou liga-se usando pareamento de base, tal como, por exemplo, DNA, RNA, 7 PNA, LNA, e análogos sintéticos e naturais dos mesmos. As composições e métodos da invenção permitem detecção altamente sensível, tecnicamente fácil, flexível, segura, e/ou rápida de sequência de ácido nucleico associada com aberrações cromossômicas. Em uma modalidade, a invenção fornece a capacidade de adaptar o tempo de hibridização variando a temperatura da Ú reação de hibridização para um grau muito maior do que está disponível u- sando métodos da técnica anterior. As composições de hibridização e méto- dosda invenção preserve a morfologia de uma amostra biológica, fornecem um procedimento e composição de hibridização não tóxica, fornecem uma técnica de hibridização de baixa evaporação, reduzem e/ou removem a ne- cessidade de bloqueio de ligação não específica, e/ou permitem o uso de sondas heterogêneas sem a necessidade de bloquear, remover, ou de outro modo incapacitar a ligação de, por exemplo, sequências repetitivas em uma amostra biológica.
Em uma modalidade, a invenção fornece a composição compre- endendo uma primeira sonda molecular que detecta uma sequência de nu- cleotídeo associada com uma aberração cromossômica, e uma composição aquosa compreendendo pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo.
Em outra modalidade, a invenção fornece a kit compreendendo tal o composição.
Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um kit compre- endendo uma primeira composição compreendendo uma primeira sonda ' molecular que detecta uma sequência de nucleotídeo associada com uma aberração cromossômica, e uma segunda composição, em que a segunda composição é uma composição aquosa compreendendo pelo menos um sol- * vente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo.
As composições e kits fornecidos aqui são úteis para a análise in vivo, in vitro, e/ou in situ de ácidos nucleicos, tal como, por exemplo, DNA o genômico, cromossomas, fragmentos de cromossoma, e genes usando téc- nicas tais como PCR, PCR in situ, northem blot, Southern blot, citometria de “ fluxo, autoradiografia, microscopia por fluorescência, quimioluminescência, imunoistoquímica, cariótipo virtual, ensaio de gene, microdisposição de DNA (por exemplo, hibridização genômica comparativa de disposição (disposição CGH)), representação de expressão de gene, Gene ID, disposição Tiling, eletroforese de gel, eletroforese capilar, e hibridizações in situ tais como FI- SH, SISH, CISH.
Em uma modalidade, as composições e kits são úteis para a análise in vivo, in vitro, ou in situ de ácidos nucleicos para aberrações cro- —mossômicas tais como aneuploidia, ruptura potencial, inserção, inverção, deleção, duplicação, amplificação de gene, redisposição, e translocação as- sociada com uma condição ou doença normal (tal como, por exemplo, uma doença congênita, câncer, ou infecção). As composições e kits fornecidos aqui são também úteis para a detecção de mudanças em níveis de expres- são de RNA, por exemplo, MRNA e seu DNA complementar (CDNA). As composições e kits da invenção podem ser usadas em amostras in vitro, in vivo, ou in situ (incluindo, por exemplo, amostras mamíferas tais como, por exemplo, amostras humanas) tais como esfregaços da medula óssea, esfre- gaços sanguíneos, preparações de tecido embutidas em parafina, amostras de tecido enzimaticamente dissociadas, medula óssea, amniócitos, prepara- ções de citospina, impressões, etc.
Outros uso incluem ensaios de hibridização com base em solu- ção usando FRET e outras técnicas de saciamento; detecção de rótulos de biotina com conjugados de estrepavidina, por exemplo, usando o sistema de ' detecção amplificado in situ Dako GenPointº ou o sistema de Tyramida Sinal Amplification (TSA) (K0620, Dako); ou rotulagem direta com metais, por e- xemplo, ouro e prata. . Em uma modalidade, a invenção fornece um método de detectar um alvo em DNA cromossômico compreendendo: — fornecer pelo menos uma sonda molecular que hibridiza para o alvo em DNA cromossômico, E. — fornecer DNA cromossômico, — fornecer uma composição de hibridização que compreende pe- : lo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desna- turar sequências de nucleotídeo de filamento duplo, em que o solvente apró- tico polar não é sulfóxido de dimetila (DMSO), — combinar a sonda molecular, o DNA cromossômico e a com- posição de hibridização durante pelo menos um período de tempo suficiente ' para hibridizar a sonda molecular para o alvo, e — detectar o alvo.
Em outra modalidade, a invenção fornece um método de deter- minar a presença de uma aberração cromossômica em uma sequência de ácido nucleico, o método compreendendo: — fornecer pelo menos uma sonda molecular, — fornecer a sequência de ácido nucleico, — fornecer uma composição de hibridização que compreende pe- lo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desna- turar sequências de nucleotídeo de filamento duplo, em que o solvente apró- tico polar não é sulfóxido de dimetila (DMSO), — combinar a sonda molecular e a sequência de ácido nucleico e a composição de hibridização durante pelo menos um período de tempo su- ficiente para hibridizar a sonda molecular e a sequência de ácido nucleico, e
— detectar a pelo menos uma sonda molecular, : — e determinar a presença da aberração cromossômica.
- Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um método de ' determinar a presença de uma aberração cromossômica em uma sequência ea 5 deácidonucleico, o método compreendendo: -— fornecer a sequência de ácido nucleico, . - fornecer uma composição de hibridização que compreende pelo menos uma sonda molecular e pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo, E , — — aplicara composição de hibridização para o referido ácido nucleico durante pelo menos um período de tempo suficiente para hibridizar : a sonda molecular e sequência de ácido nucleico, e - detectar a pelo menos uma sonda molecular, - e determinar a presença da aberração cromossômica, em que o solvente aprótico polar não é sulfóxido de dimetila (DMSO).
: Em outra modalidade, a invenção fornece um método de deter- minar a presença de uma aberração cromossômica em uma sequência de ácidonucleico, o método compreendendo: - fornecer a sequência de ácido nucleico, - aplicar a composição de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 50 à referida sequência de ácido nucleico durante pelo me- nos um período de tempo suficiente para hibridizar a sonda molecular e se- —quênciade ácido nucleico, e - determinar se a aberração cromossômica está presente na sequência de ácido nucleico.
Em um outra modalidade, a invenção fornece um método de di- agnosticar um distúrbio genético congênito, câncer, ou infecção associada com uma aberração cromossômica, o método compreendendo o fornecimen- to de uma amostra de tecido de um indivíduo, em que a amostra de tecido compreende a sequência de ácido nucleico, determinar se uma aberração “ cromossômica está presente na sequência de ácido nucleico, e diagnosticar o distúrbio genético congênito, câncer, ou infecção se a aberração cromos- " sômica estiver presente na amostra de tecido. A amostra pode ser uma a- . 5 mostramamífera. Em uma modalidade, a amostra é uma amostra humana. As composições de hibridização e métodos da invenção podem, . por exemplo, eliminar o uso de, ou reduzir a dependência de, formamida. Por exemplo, os métodos e composições da invenção podem reduzir a bar- reira de energia para hibridização sem o uso de formamida. A barreira de energia menor pode reduzir o tempo e/ou a temperatura necessária para a 2 hibridização. Por exemplo, a invenção pode permitir a hibridização em tem- peraturas menores, incluindo temperatura ambiente, ou pode permitir rápida hibridização em temperaturas mais elevadas. Desse modo, em alguns as- pectos, a presente invenção supera uma etapa mais demorada em ensaios de hibridização.
Um aspecto da invenção é uma composição ou solução para uso em hibridização. Composições para uso na invenção incluem uma com- : posição aquosa compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucle- ico e pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo. Uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo é uma quantidade que possibilita hibridização. Por exemplo, um meio de testar se a quantidade de solvente aprótico polar que é eficaz para possibilitar a hibridi- zação é para determinar se o solvente aprótico polar, quando usado nos mé- todos de hibridização e composições descritos aqui, tal como o exemplo 1, produz um sinal detectável e/ou um produto de ácido nucleico amplificado. Exemplos não limitantes de quantidades eficazes de solventes apróticos polares incluem, por exemplo, cerca de 1% a cerca de 95% (v/v). Em algumas modalidades, a concentração de solvente aprótico polar é de 5%a60% (v/v). Em outras modalidades, a concentração de solvente apróti- co polar é de 10% a 60% (v/v). Em ainda outras modalidades, a concentra-
ção de solvente aprótico polar é de 30% a 50% (v/v). Concentrações de 1% - a 5%, 5% a 10%, 10%, 10% a 20%, 20% a 30%, 30% a 40%, 40% a 50%, ou 50% a 60% (v/v) são também adequadas. Em algumas modalidades, o 7 solvente aprótico polar estará presente em uma concentração de 0,1%, BR 5 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, ou 5% (v/v). Em outras modalidades, o sol- vente aprótico polar estará presente em uma concentração de 7%, 7,5%, - 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5%, ou 20% (v/v).
10 De acordo com outro aspecto da presente invenção a composi- 2 ção aquosa compreendendo um solvente aprótico polar tem toxicidade redu- zida. Por exemplo, uma composição menos tóxica do que soluções de hibri- à dização tradicionais pode compreender uma composição com a condição de que a composição não contenha formamida, ou com a condição de que a composição contenha menos do que 10%, ou menos do que 5%, ou menos do que 2%, ou menos do que 1%, ou menos do que 0,5%, ou menos do que 0,1%, ou menos do que 0,05%, ou menos do que 0,01% de formamida. Uma Ú composição menos tóxica pode também compreender uma composição com a condição de que a composição não contenha sulfóxido de dimetila (DM- SO), oucom a condição de que a composição contenha menos do que 10%, 5%, 2%, ou menos do que 1%, ou menos do que 0,5%, ou menos do que 0,1%, ou menos do que 0,05%, ou menos do que 0,01% DMSO. Em um aspecto da invenção, solventes apróticos polares ade- quados para uso na invenção podem ser selecionados com base em seus Parâmetros de Solubilidade Hansen. Por exemplo, solventes apróticos pola- res adequados podem ter um parâmetro de solubilidade de dispersão entre 17,7 a 22,0 MPa'?, um parâmetro de solubilidade polar entre 13 a 23 MPa“? e um parâmetro de solubilidade em ligação a hidrogênio entre 3 a 13 MPa'?. De acordo com um aspecto da presente invenção, solventes a- próticos polares adequados para uso na invenção são compostos cíclicos. Um composto cíclico tem uma estrutura de base cíclica. Exemplos incluem os compostos cíclicos descritos aqui. Em outras modalidades, o solvente - aprótico polar pode ser escolhido de fórmulas 1 a 4 abaixo : Formula 1 Formula 2 Formula 3 Formula 4 ' KO XxX Oo í
CO SC RO * R R-Cc==N ' , , , OU onde X é O e R1 é alquildi-íla. De acordo com outro aspecto da invenção, solventes apróticos polares adequados para uso na invenção podem ser escolhidos da fórmula 5 2 abaixo: Formula 5 i KO NZ o XY onde X é opcional e se presente, é escolhido de O ou S; onde Z é opcional e se presente, é escolhido de O ou S; onde A e B independentemente são O ou N ou S ou parte da al- quildi-íla ou uma amina primária; : onde R é alquildi-ila; e onde Yé O ou Sou C. Exemplos de solventes apróticos polares adequados de acordo comafórmula 5 são fornecidos nas fórmulas 6 a 9 abaixo:
w - o = E É 3 = i 3,8 h Ee E má “= as SE E 8 o So SS 8 Ss E GO - E vEQUEOS Ss BOVUODODEDO OxX<«C> ONYX = o
D E
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De acordo com ainda outra modalidade da invenção o solvente ' aprótico polar tem funcionalidade de lactona, sulfona, nitrila, sulfito, ou car- . bonato.
Tais compostos são ditinguidos por suas constantes dielétricas rela- tivamente elevadas, momentos dipolo elevados, e solubilidade em água. ' 5 De acordo com outro aspecto da invenção o solvente aprótico polar tendo funcionalidade lactona é y-butirolactona (GBL), o solvente apróti- ' co polar tendo funcionalidade sulfona é o sulfolano (SL), o solvente aprótico polar tendo funcionalidade nitrila é acetonitrila (AN), o solvente aprótico polar tendo funcionalidade de sulfito é sulfito de glicol/sulfito de etileno (GS), e o solvente aprótico polar tendo funcionalidade de carbonato é carbonato de C etileno (EC), carbonato de propileno (PC), ou tiocarbonato de etileno (ETC). : BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Ú A figura 1 representa um curso de tempo típico para detecção de único loco com sondas FISH rotuladas primárias em porções de tecido em- —butidas em parafina fixada por formaldeído (espécimes histológicas). As bar- ras representam a hibridização realizada usando uma solução tradicional : (topo) e um curso de tempo típico para a hibridização realizada usando a composição da invenção (base). A primeira barra à esquerda em cada curso : do tempo representa a etapa de desparafinação; a segunda barra representa a etapa de pré-tratamento térmico; a terceira barra representa a etapa de digestão; a quarta barra representa a etapa de desnaturação e hibridização; a quinta barra representa a etapa de lavagem rigorosa; e a sexta barra re- presenta a etapa de montagem.
A figura 2 representa um curso de tempo típico para detecção de —únicoloco com sondas FISH rotuladas primárias em espécimes citológicas.
As barras representam a hibridização realizada usando uma solução tradi- cional (topo) e um curso de tempo típico para a hibridização realizada usan- do a composição da invenção (base). A primeira barra à esquerda em cada curso do tempo representa a etapa de fixação; a segunda barra representa a etapade desnaturação e hibridização; a terceira barra representa a etapa de lavagem rigorosa; e a quarta barra representa uma etapa de montagem.
DESCRIÇÃO DETALHADA , |. Definições : No contexto da presente invenção os seguintes termos devem ser entendidos como se segue: ' 5 "Amostra biológica" deve ser entendida como qualquer amostra in vivo, in vitro, ou in situ de uma ou mais células ou fragmentos celulares. ' Isto pode, por exemplo, ser um organismo unicelular ou multicelutar, porção de tecido, amostra citológica, disseminação de cromossoma, sequência de ácidos nucleicos purificada, sequência de ácido nucleicos artificialmente preparadas, por exemplo, preparadas por um sistema com base biológica ou É por síntese química, microdisposição, ou outra forma de lasca de ácido nu- . cleico. Em uma modalidade, uma amostra é uma amostra mamífera, tal co- ' mo, por exemplo, uma amostra humana, murina, felina, rato, ou canina. "Ácido nucleico," "cadeia de ácido nucleico," e "sequência de á- cido nucleico" significam qualquer coisa que se liga ou hibridiza usando pa- reamento de base incluindo, oligômeros ou polímeros tendo um esqueleto : formado de análogos de ácidos nucleicos e/ou nucleotídeos de ocorrência natural compreendendo nucleobases não padrões e/ou esqueletos não pa- . drões (por exemplo, um ácido nucleico de peptídeo (PNA) ou ácido nucleico trancado (LNA)), ou qualquer forma derivada de um ácido nucleico. Como aqui usado, o termo "ácido nucleico de peptídeo" ou "PNA" significa um polímero sintético tendo um esqueleto de poliamida com nucleobases pendentes (de ocorrência natural e modificadas), incluindo, po- rém não limitado a, qualquer dos segmentos de oligômero ou polímero refe- rentea,ou reivindicado como ácidos nucleicos de peptídeo, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos Nos. 5.539.082, 5.527.675, 5.623.049,
5.714.331, 5.718.262, 5.736.336, 5.773.571, 5.766.855, 5.786.461,
5.837.459, 5.891.625, 5.9/2.610, 5.986.053, 6.107.470, 6.201.103,
6.228.982 e 6.357.163, WOS96/04000, todas as quais são aqui incorporadas por referência, ou qualquer das referências citadas aqui. A nucleobase pen- dente, tal como, por exemplo, uma base purina ou pirimidina em PNA pode ser conectada ao esqueleto por meio de um ligador tal como, por exemplo, ' um dos ligadores ensinados em PCT/US02/30573 ou qualquer das referên- : cias citadas aqui. Em uma modalidade, o PNA tem um esqueleto de N-(2- aminoetil)-glicina). Os PNAs podem ser sintetizados (e opcionalmente rotu- 7] 5 lados) como ensinado no PCT/US02/30573 ou qualquer das referências ci- tadas aqui. PNAs hibridizam firmemente, e com alta especificidade de se- ' quência, com DNA e RNA, por que o esqueleto de PNA é inalterado. Desse modo, onda curta de PNAs pode exibir especificidade comparável a sondas de DNA ou RNA mais longas. Sonda de PNAs pode também mostrar especi- ficidade maior em ligação ao DNA e RNA complementar. - Como aqui usado, o termo "ácido nucleico trancado" ou "LNA" : significa um oligâmero ou polímero compreendendo pelo menos uma ou ] mais subunidades de LNA. Como aqui usado, o termo "Subunidade de LNA" significa um ribonucleotídeo contendo uma ponte de metileno que conecta o 2'-oxigênio da ribose com o 4'-carbono. Vide geralmente, Kurreck, Eur. J. Biochem., 270:1628-44 (2003). : Exemplos de ácidos nucleicos e análogos de ácido nucleico também incluem polímeros de monômeros de nucleotídeo, incluindo deoxiri- - bonucleotídeos de filamento duplo e único (DNA), ribonucleotídeos (RNA), formas a-anoméricas dos mesmos, análogos sintéticos e naturais dos mes- mos, e os similares. A cadeia de ácido nucleico pode ser composta totalmen- te de deoxiribonucleotídeos, ribonucleotídeos, ácidos nucleicos de peptídeo (PNA), ácidos nucleicos trancados (LNA), análogos sintéticos ou naturais dos mesmos, ou misturas dos mesmos. DNA, RNA, ou outros ácidos nuclei- cos como definido aqui podem ser usados no método e composições da in- venção.
"Solvente aprótico polar" refere-se a um solvente orgânico tendo um momento dipolo de cerca de 2 unidades debye ou mais, uma solubilida- de em água de pelo menos cerca de 5% (volume) em ou quase na tempera- tura ambiente, isto é, cerca de 20ºC, e que não sofre significante permuta de hidrogênio em pH aproximadamente neutro, isto é, na faixa de 5 a 9, ou na faixa de 6 a 8. Solventes apróticos polares incluem aqueles definidos de a- ' cordo com os Parâmetros de Solubilidade Hansen descritos abaixo. ' "Alquildi-íla" refere-se a uma cadeia saturada, ou insaturada, ramificada, linear ou radical hidrocarboneto cíclico tendo dois centros de ra- * 5 dical monovalente derivados pela remoção de um átomo de hidrogênio de cada de dois diferentes átomos de carbono de um alcano, alceno, ou alquina : origem.
"Solução aquosa" deve ser entendido como uma solução con- tendo água, mesmo quantidades pequenas de água. Por exemplo, uma so- lução contendo 1 de água deve ser entendida como uma solução aquosa. 7 "Hibridização" deve ser entendida incorporar ambas as etapas : de desnaturação e retemperamento do procedimento de hibridização a me- nos que de outro modo especificado.
"Composição de Hibridização" refere-se a uma solução aquosa da invenção para realizar um procedimento de hibridização, por exemplo, para ligar uma sonda a uma sequência de ácido nucleico. Composições de . hibridização podem compreender, por exemplo, pelo menos um solvente aprótico polar, pelo menos uma sequência de ácido nucleico, e uma solução : de hibridização. Composições de hibridização não compreendem enzimas ou outros componentes, tais como trifosfatos de deoxinucleosídeo (dNTP's), para amplificar ácidos nucleicos em uma amostra biológica.
"Solução de hibridização" refere-se a uma solução aquosa para uso em uma composição de hibridização da invenção. Soluções de hibridi- zação são descritas em detalhes abaixo e pode compreender, por exemplo, agentes de tamponamento, agentes de aceleração, agentes de quelação, sais, detergentes, e agentes de bloqueio.
"Composição PCR" refere-se a uma solução aquosa da inven- ção para realizar um procedimento de hibridização para amplificar a sequên- cia de ácido nucleico. Composições PCR podem compreender, por exemplo, pelomenos um solvente aprótico polar, pelo menos uma enzima para ampli- ficar ácidos nucleicos, uma série de iniciadores de oligonucleotídeo de ácido nucleico, uma mistura de dNTPs, e uma solução PCR. ' "Solução PCR" refere-se a uma solução aquosa para uso na : composição PCR da invenção.
As soluções PCR podem compreender, por exemplo, agentes de tamponamento, agentes de aceleração, agentes de - 5 quelação,sais,e detergentes.
O termo "detectar," como usado, por exemplo, no contexto de ' uma sonda molecular detectando uma sequência de nucleotídeo associada com uma aberração cromossômica, significa que a sonda molecular hibridiza para pelo menos uma porção da sequência de nucleotídeo ou uma sequên- ciade nucleotideo em proximidade a tal sequência, que permitiria um usuá- -” rio determinar a presença ou ausência da sequência. . O termo "marcador," tal como um marcador para uma aberração ' cromossômica, é qualquer sequência que é associada com uma aberração cromossômica que pode ser usada para detectar a presença ou ausência de uma aberração cromossômica com, ou sem, o uso de um ou mais outros marcadores. . "Parâmetros de Solubilidade Hansen" e "HSP" referem-se aos seguintes parâmetros de energia de coesão (solubilidade): (1) o parâmetro . de solubilidade de dispersão (ôp, "Parâmetro D"), que mede interações não polares derivadas de forças atômicas; (2) o parâmetro de solubilidade polar (ôp, "Parâmetro P"), que mede interações dipolo permanente - dipolo perma- nente ; e (3) a ligação de parâmetro de solubilidade de hidrogênio (&u, "Pa- râmetro H"), que mede a permuta de elétron.
Os Parâmetros de Solubilidade Hansen são também definidos abaixo. "Sequências Repetitivas" deve ser entendido como referindo-se a rápido recozimento (aproximadamente 25%) e/ou intermediariamente re- cozendo (aproximadamente 30%) componentes de genomas mamíferos.
Os componentes de rápido recozimento contêm pequenas (alguns nucleotídeos longos) sequências altamente repetitivas usualmente encontradas em tan- dem (por exemplo, DNA satélite), enquanto que os componentes de recozi- mento intermediário contêm DNA repetitivos entremeados.
Sequências repe-
tidas entremeadas são clarificadas como SINEs (sequências de repetição ' entremeadas curtas) ou LINEs (sequências de repetição entremeadas lon- : gas), ambas as quais são classificadas como retrotransposons em primatas.
SINEs e LINEs incluem, porém não estão limitados a, repetições Alu, repeti- ] 5 ções Kpn, repetições de dinucleotídeo, repetições de trinucleotídeo, repeti- ções de tetranucleotídeo, repetições pentanucleotídeo e repetições de hexa- ' nucleotídeo.
Repetições Alu criam a maioria das SINEs humanas e são ca- racterizadas por uma sequência de consenso de aproximadamente 280 a 300 bp que consiste em duas sequências similares dispostas como um dí- mero da cabeça à cauda.
Além disso, para SINEs e LINEs, sequências de 7 repetição também existem em telômeros de cromossoma nas terminações : de cromossomas e centrômeros de cromossoma, que contêm sequências de ] repetição distintas que existem apenas na região central de um cromosso- ma.
Entretanto, ao contrário de SINEs e LINEs, que são dispersas aleatori- amente em todo o genoma inteiro, sequências de repetição de telômero e centrômero são localizadas dentro de uma certa região do cromossoma. : "Não tóxico" e "toxicidade reduzida" são definidos com respeito à rotulagem de toxicidade de formamida de acordo com "Directive 1999/45/EC - do European Parliament e do Council de 31 de maio de 1999 com respeito à aproximação das leis, regulações e provisões administrativas do Member States com relação à classificação, empacotamento, e rotulagem de prepa- rações perigosas" (ecb.jrc.it/legislation/1999L0045EC.pdf) ("Directive"). De acordo com a Diretiva, a toxicidade é definida usando a seguinte ordem de classificação: T+ "muito tóxico"; T "tóxico", C "corrosivo", Xn "nocivo", Xi "irri- tante." Frases de Risco ("frases R") descrevem os riscos da toxicidade clas- sificada.
A formamida é listada como T (tóxica) e R61 (pode causar dano à criança não nascida). Todos os seguintes produtos químicos são classifica- dos como menos tóxicos do que a formamida: acetonitrila (Xn, R11, R20, R21, R22, R36); sulfolano (Xn, R22); y-butirolactona (Xn, R22, R32); e car- —bonato de etileno (Xi, R36, R37, R38). No momento do depósito deste pedi- do, tritiocarbonato de etileno e sulfito de glicol não são no momento rotula-
dos. ' Uma "sonda molecular" refere-se a uma sonda de "ácido nuclei- . co" ou a uma sonda de "análogo de ácido nucleico". Como aqui usado, o termo "sonda" deve ser entendido como uma cadeia de ácido nucleico, que . 5 pode ser composta totalmente de DNA, RNA, PNA, LNA, análogos sintéticos ou naturais dos mesmos, ou misturas dos mesmos, que detecta uma se- ' quência de nucleotídeo particular.
Além disso, as bases em uma sonda po- dem ser unidas por uma ligação exceto uma ligação de fosfodiéster, contan- to que ele não previna a hibridização.
Uma sonda molecular que detecta uma mutação particular é aquela que liga uma sequência alvo característica daquela mutação.
O termo "ligação" é sinônimo de "hibridiza." Quando duas : moléculas hibridizam, elas formam uma combinação das duas moléculas, por meio de um ou mais tipos de ligações de produto químico, por meio de pareamento de base complementar, ou através de formação de ligação de hidrogênio.
O termo "sequência alvo" refere-se à sequência de nucleobase pesquisada para ser determinada. . Uma "aberração cromossômica" ou anormalidade cromossômica é uma variação de uma sequência cromossômica normal, tal como, por e- : xemplo, uma mudança no número de cromossoma (aneuploidia), uma mu- dançaem um número de cópia de gene (amplificação, deleção, duplicação, deleção, duplicação, aneuploidia), ruptura potencial, inserção, inversão, re- disposição, ou translocação.
Il.
Composições A presente invenção fornece composições compreendendo son- das moleculares e composições aquosas (compreendendo pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequên- cias de nucleotídeo de filamento duplo) para uso em hibridização.
Em geral, tais composições podem compreender quaisquer sonda(s) moleculares e quaisquer composições aquosas descritas aqui.
A.
Sondas moleculares Sondas moleculares que são adequadas para uso na invenção são descritas, por exemplo, na Publicação de Patente dos Estados Unidos ' No. 2005/0266459, que é incorporada aqui por referência.
Em general, uma - sonda molecular é tipicamente um ácido nucleico de filamento duplo ou úni- co, incluindo, por exemplo, DNA, RNA, PNA, e LNA.
Uma sonda pode ser de ' 5 qualquer comprimento adequado para a detecção do alvo.
Geralmente, a sonda é preparada de fragmentos menores de tamanhos variáveis (por e- ' xemplo, cerca de 50 bp a cerca de 500 bp cada) tal que a sonda, ao todo, abranja cerca de 30 kb a cerca de 2 Mb.
Por exemplo, uma sonda pode ser 1-100, 1-10, 7-15, 10-200, 10-20, 10-30, 10-50, 20-40, 30-50, 40-60, 50-70, 50-100,50-150, 60-80, 70-90, ou 80-100 kb de comprimento.
As sondas po- r dem ser usadas para detectar, quantificar, identificar, ou analisar moléculas ' de ácido nucleico ou outras moléculas que se ligam às sondas.
Em geral, as sondas podem ser preparadas por síntese química ou por amplificação de uma sequência de DNA específica por clonagem, inserção do DNA em um vetor, e amplificando o vetor uma inserção em célu- las hospedeiras apropriadas.
Os vetores comumente usados incluem plas- : mídeos bacterianos, cosmídeos, cromossomas artificiais bacterianos (BACs), cromossomas artificiais desviados de PI (PACs), ou cromossomas * artificiais de levedura (YACs). O DNA amplificado é então extraído e purifi- cado para uso como uma sonda.
Métodos para preparar e/ou sintetizar son- das são conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito na PCT/US02/30573. As sondas usadas nos métodos e composições da invenção, em uma modalidade, compreenderão tanto fragmentos únicos, bem como frag- mentos repetidos.
Sondas análogas de ácido nucleico, tais como sonda de PNAs, são geralmente mais curtas, sondas bem definidas tipicamene com- preendendo de cerca de 10 a 15 nucleobases.
A sonda de PNA é habitual mente composta de diversas sondas individuais, cada qual tendo 10 a 25 unidades de nucleobase.
Em uma modalidade, a invenção fornece uma sonda molecular simples.
Em outra modalidade, a invenção fornece um par de sondas mole-
culares.
Em outras modalidades, a invenção fornece 2, 3, 4, 5, 10, ou mais : sondas ou pares de sondas.
Em uma modalidade, um par de sondas distin- . tas e equilibradas é usado, como ensinado na Patente dos Estados Unidos No. 6.730.474, que é incorporada aqui por referência.
Cada dos pares de ] 5 sondas distintas e equilibradas pode, por exemplo, hibridizar para diferentes cromossomas envolvidos na translocação, ou flanquear regiões de uma rup- ' tura potencial.
Em outra modalidade, duas séries de sondas de hibridização podem ser empregadas, uma ou mais das quais compreende sonda de PNAs, como na Patente dos Estados Unidos No. 7.105.294, que é incorpo- rada aqui por referência.
Em uma modalidade, pelo menos duas séries de E sondas de hibridização são usadas, pelo menos uma série capaz de hibridi- . zação para sequências específicas de ácido nucleico relacionadas com uma aberração potencial em um cromossoma, e pelo menos outra série capaz de hibridização para sequências de ácido nucleico específicas relacionadas com outraouamesma aberração potencial em um cromossoma.
Existem diversos tipos de sondas que podem ser usados para : hibridização em uma amostra de ácido nucleico (vide Geralmente Szeles, Acta Microbiol.
Immunol.
Hungarica, 49:69-80 (2002)). Estas sondas incluem ] sequências curtas de DNA ou cDNA genômico, quadros de cromossoma totais, repetições de cromossoma, e genomas totais.
No caso de sondas genômicas, frequentemente sequências repetidas em genomas mamíferos têm conservação evolucionária relativamente pequena.
Desse modo, DNA nuclear ou genômico total pode ser usado como uma sonda específica da espécie.
Os quadros de cromossomas são coleções de sequências de DNA derivadas de um tipo de cromosoma simples e podem identificar aquele tipo de cromossoma específico em núcleos de metáfase e interfase.
Diferentes tipos cromossômicos também têm sequências repetidas únicas que podem ser alvejadas para probe de hibridização (vide Cremer e outro, Hum.
Genet., 74:346-52 (1986)). Grandes sondas de inserção que alvejam sequências de cópia simples únicas são outro exemplo de um tipo de sonda que pode ser usado em ensaios de hibridização.
Estas sondas podem ser em cosmídeos,
cromossomas artiviciais bacterianos (BACs), cromossomas artificiais desvia- ' do de PI (PACs), ou cromossomas artificiais de levedura (YACs). Com estas : grandes sondas, a eficiência de hibridização é inversamente proporcional ao tamanho da sonda. Todavia, as sondas tão pequenas quanto 2 kb foram u- ' 5 sadas(videld).
Em geral, o tipo de sonda determina o tipo de característica que ' a sonda pode detectar. As sondas que hibridizam ao longo de um cromos- soma inteiro (quadro de cromossoma total) são usadas para contar o núme- ro de certo cromossoma, mostrar translocações, ou identificar fragmentos extracromossômicos de cromatina. Sondas menores podem também ser C usadas para detectar aberrações tais como deleções, amplificações, inver- . sões, duplicações, e aneuploidia. Em outro exemplo, misturas de sonda es- pecíficas do loco podem ser usadas para detectar e contar cromossomas específicos. Duas ou mais sondas específicas do loco diferentemente colori- das, por exemplo, podem ser usadas para detectar translocações por meio de hibridização de sinal de divisão in situ, e misturas de sonda centroméricas ' específicas de sequência repetitiva podem ser usadas para detectar e contar cromossomas específicos. ' Em geral, a capacidade de discriminar entre sequências intima- mente relacionadas é inversamente proporcional ao comprimento da sonda de hibridização por que a diferença em estabilidade térmica diminui entre complexos tipo selvagem e mutantes quando o comprimento da sonda au- menta. As sondas maiores do que 10 bp de comprimento são geralmente requeridas para obter a diversidade de sequência necessária para correta- mente identificar um único organismo ou condição clínica de interesse. Por exemplo, as sequências de DNA específicas, tais como o gene ABL, podem ser seguras manchadas usando sondas que tem 15 kb de comprimento. Por outro lado, diferenças de sequência tão sutis quanto uma base única (muta- ção de ponto) em oligômeros muito curtos (<10 pares de base) podem ser suficientes para possibilitar a discriminação da hibridização para sequências alvo de ácido nucleico complementares quando comparadas com sequên-
cias não-alvo. ' Em uma modalidade, pelo menos um grupo das sondas de hibri- : dização in situ pode compreender uma ou mais sondas de PNAs, como des- crito na Patente dos Estados Unidos No. 7.105.294. PNA é um polímero ten- " 5 doum peptídeo (Esqueleto de N-(2-aminoetil)-glicina) com bases de purina purine e pirimidina pendentes.
Por que o esqueleto de PNA é inalterado, ao : contrário de interações de DNA e RNA, PNA/DNA e PNA/RNA são mais for- tes do que as correspondentes interações de DNA/DNA ou DNA/RNA seri- am.
Consequentemente, sonda de PNAs pode ser mais curta do que as sondas de DNA ou RNA, ao mesmo tempo que mantendo a especificidade SC similar.
Sonda de PNAs também mostram maior especificidade em ligação : ao DNA e RNA complementar, visto que pareamentos errôneos de base PNA/DNA (or PNA/RNA) são mais desestabilizantes do que os pareamentos errôneos similares em um dúplex de DNA/DNA (ou RNA/RNA). Além disso, osPNAs são relativamente resistentes à degradação enzimática por protea- ses e nucleases. ' Alternativamente, ou além disso, pelo menos uma série das sondas de hibridização em qualquer das técnicas descritas acima pode * compreender uma ou mais sondas trancadas de ácido nucleico (LNA), como descrito no WO 99/14226, que é incorporado aqui por referência.
LNAs con- têm uma ligação em ponte adicional entre o carbonos 2' e 4', resultando em uma conformação 3'-endo rígida e consequente pré-organização do esquele- to de nucleotídeo para hibridização.
As interações LNA/DNA e LNA/RNA são mais fortes do que as correspondentes interações DNA/DNA e DNA/RNA, como indicado por uma temperatura de fusão mais elevada.
Desse modo, os métodos e composições da invenção, que diminuem a energia requerida para hibridização, são particularmente úteis para hibridizações com sondas de LNA.
Em uma modalidade, uma sonda pode compreender um rótulo detectável (uma molécula que fornece um sinal analiticamente identificável que permite a detecção do híbrido alvo-sonda). Como aqui usado, um rótulo detectável refere-se a porções que podem ser ligadas diretamente ou indire- ' tamente a um oligômero ou polímero para desse modo tornar o oligômero ou . polímero detectável por um instrumento ou método. Qualquer método de rotulagem conhecido por aqueles na técnica, incluindo processos enzimáti- ' 5 cose químicos, podem ser usados para rotular sondas usadas nos métodos e composições da invenção.
' Em uma modalidade, um rótulo detectável pode ser diretamente ligado a uma sonda. Em outra modalidade, um rótulo detectável pode ser indiretamente ligado a uma sonda, por exemplo, usando um ligador. Em ou- tras modalidades, as sondas não são rotuladas. Í Um rótulo detectável pode ser, por exemplo, um fluorocromo, um : cromóforo, um rótulo giratório, um radioisótopo, uma enzima, um hapteno, Quantum Dot, contas, aminoexila, pireno, e um composto de quimiolumines- cência, tal como laranja acridina. Fluorocromos que podem ser usados no método da presente invenção incluem, porém não estão limitados a, pigmen- tos IR, pigmentosDiômicos, ficoeritrina, azul cascata, verde Oregon 488, azul : pacífico, verde rodamina, 5(6)-carboxifluoresceíina, pigmentos cianina (isto é, Cy2, Cy3, Cy 3,5, Cy5, Cy 5,5, Cy 7) (dieti-amino)cumarina, fluoresceína " (isto é, FITC), tetrametilrodamina, lissamina, Vermelho Texas, AMCA, TRITC, e pigmentos Alexa. Haptenos que podem ser usados na presente invenção incluem, porém não estão limitados a, 5(6)-carboxifluoresceína, 2, 4-dinitrofenila, digoxigenina, rodamina, bromodeóxi uridina, acetilaminoflu- reno, trinitrofenol de mercúrio, estradiol, e biotina. Enzimas que podem ser usadas na presente invenção incluem, porém não estão limitadas a, soja peroxidase, fosfatase alcalina, e rábano picante peroxidase. Em uma moda- lidade, o rótulo pode ser um rótulo radioativo tal como, por exemplo, *'P, *P, ou ?S. Em outra modalidade, uma sonda pode ser rotulada com um hapte- no, tal como, por exemplo, digoxigenina ou biotina. Uma sonda pode tam- bém ser rotulada com partículas de metal pesado ou com uma enzima tendo substratos cromogênicos ou fluorogênicos. Uma sonda pode também ser rotulada com qualquer outro rótulo conhecido por aqueles versados na técni-
ca. ] Onde mais do que uma sonda está presente, cada sonda pode . ser rotulada com um rótulo distinto. Por exemplo, em uma modalidade, onde FISH é realizado e a mistura de hibridização contém séries de pares de son- . 5 da distintos e equilibrados, como descrito na Patente dos Estados Unidos No. 6.730.474. As sondas podem ser rotuladas com rótulos distintos de in- : tensidade comparável.
Em uma modalidade usando hibridização cromogênica in situ (CISH), a mistura de hibridização pode conter pelo menos uma série de son- das configuradas por detecção com um ou mais cromógenos orgânicos con- - vencionais, e para hibridização de prata in situ (SISH), a mistura de hibridi- : zação pode conter pelo menos um grupo de sondas configuradas para de- tecção com partículas de prata, como descrito em Powell RD e outros, "Me- tallographic in situ hibridization," Hum. Pathol., 38:1145-59 (2007).
Em uma modalidade, a formação de um híbrido de sequência de sonda de ácido nucleico é detectada na adição de um reagente de visualiza- . ção, tal como, por exemplo, um anticorpo (que pode ser monoclilonal, e que pode em si compreender um rótulo), um substrato fluorogênico ou cromogê- . nico para uma enzima, ou qualquer outro reagente de visualização adequa- do conhecido pelo técnico versado.
Em algumas modalidades, as sondas podem ser usadas para detectar mudanças em estrutura cromossômica detectando-se uma mudan- ça no padrão de manchamento da amostra em comparação com a amostra de controle normal. Exemplos não exaustivos de alterações cromossômicas que podem ser detectadas com sondas moleculares include aneuploidia, amplificações de gene, deleções incluindo deleções de gene, fusões de ge- ne, translocações, duplicações, inserções, ou inversões. Como aqui usado, aneuploidia refere-se a qualquer desvio do estado euploide normal ou a condição de ter menos do que ou mais do que o número diploide normal de — cromossomas. Como aqui usado, uma amplificação refere-se a um aumento no número de cópias de um fragmento de DNA específico. Tais fragmentos de DNA incluem, por exemplo, um gene ou um cromossoma inteiro.
Como ' aqui usado, a deleção refere-se a um evento genético em que a sequência : de ácido nucleico foi removida de um cromossoma.
Como aqui usado, uma fusão de gene refere-se a uma união acidental do DNA de dois genes.
As . 5 fusões de gene podem ocorrer por translocações ou inversões e podem dar origem a proteínas híbridas ou a regulação errônea da transcrição de um ] gene devido à justaposição de elementos cis regulatórios (por exemplo, real- çadores ou promotores) de outro gene.
Como aqui usado, a translocação refere-se a um evento genético em que a parte da sequência de ácido nucle- icodeum cromossoma é removida daquele cromossoma e ligada a um dife- - rente cromossoma.
Como aqui usado, a duplicação refere-se à repetição de : uma sequência de nucleotíideo em um cromossoma ou um segmento de cromossoma.
A duplicação pode resultar na repetição de uma sequência de nucleotídeo em justaposição linear à sequência duplicada.
Como aqui usa- do, uma inserção refere-se a um evento genético em que a sequência de ácido nucleico foi introduzida entre dois pontos em um cromossoma.
Como : aqui usado, uma inversão é um evento genético em que uma orientação da sequência de ácido nucleico em um cromossoma foi invertida.
Como aqui : usado, uma ruptura cromossômica refere-se a uma localização no cromos-
soma onde o cromossoma rompe-se em duas partes.
Em algumas modalidades, as sondas moleculares podem flan- quear regiões, por exemplo, cerca de 500.000 bp sobre cada lado do gene.
Um exemplo de sondas para o marcador TYMS compreendendo regiões de flanqueamento de cerca de 500.000 bp são: CTD-2304H22; RP11-841C6; RP11-464L8;RP11-631M21; CTD-2573M23; CTD-3162G8G8; CTD-3232F7; RP11-170J2; RP11-252G7; RP11-699P24; RP11-805B24; CTD-3237F7; RP11-230P17; CTD-2359H18; RP11-1120H10; CTD-2509F1; RP11-431C15; RP11-36106; RP11-1066C16; CTD-2359H18; RP11-1066G14; RP11- 1034P14; RP11-1034P22; CTD-3114P12; RP11-787A12; RP11-787C12; CTD-3149J12; RP11-195P12; CTD-2595P20; CTD-2168E8; RP11-621G7; CTD-3023M8; RP11-748B19; CTD-2064P19; RP11-461K16; RP11-630F5;
CTD-3021E11; CTD-302817; RP11-1021K17; RP11-729G15; RP11-10415; ' RP11-595D13; RP1143607; CTD-2646F10; RP11-104A15; CTD-2024F12; . CTD-2169M24; RP11-140D22; RP11-848A7; CTD-2060D6; CTD-2298K5; CTD-3022J6; RP11-29P22; RP11-790010; RP11-89P6; RP11-9118; RP11- * 5 G694N4; RP11-752111; RP11-324G2; CTA-186D6; RP11-88C10; RP11- 608N7; RP11-732L14; RP11-324G2; RP11-70501; RP11-839023; RP11- Ú 683J11; RP11-815L4; RP11-720L2; RP11-179K3; RP11-778P8; RP11- 823F8; RP11-791M5; RP11-672L10; RP11-827M19; RP11-19J12; RP11- 607C2; RP11-267C19; CTD-3214N24; RP11-1035E2; CTD-2004F18; CTD- 3155L20; CTD-2281A22; CTD-3231123; CTD-2014P18; RP11-1150C18; 7 RP11-170J1; CTC-79019; RP11-76H24; RP11-48/121; CTC-775A10; CTD- : 2034018; RP11-431C11; RP11-50C2; CTD-2208G7; CTD-2345G8; RP11- ' 797C9; RP11-133D9; RP11-655D4; RP11-14P20; RP11-103B23; RP11- 806L2; RP11-145B19; CTD-2593J12; CTD-321517; RP11-381D10; RP11- 76908; RP11-95H4; RP11-552E8; RP11-914P23; RP11-904F1; RP11- 164C14; CTD-3040A20; RP11-1152E8; CTD-3065D24; CTD-3243B17; CTD- : 3243D18; CTD-3243D19; CTD-3113H2; RP11-1120E20; CTD-3046116; RP11-635J20; RP11-114M20; RP11-1018M4; CTA-344N3; RP11-137K7; : RP11-689C9; RP11-1005B18; RP11-126M20; CTD-2134/3; RP11-701F4; CTD-3236J23; CTD- 3047L19; CTD-3240G16; CTD-3148N6; RP11-22J24; RP11-1094D2; CTD-2182K19; RP11-107A13; RP11-134P22; RP11-636P15; RP11-78F17; CTD-2221P22; CTD-2011M14; RP11-626B11; e RP11-27K24. Em outras modalidades, as sondas podem ligar-se dentro de uma região cromossômica codificando um gene ou não codificando um ge- ne.
Por exemplo, as sondas podem ligar-se a regiões cromossômicas asso- ciadas com a série de reação 5-FU incluindo timidilato sintase (TYMS), di- hidrofolato redutase (DHFR), timidina fosforilase (TP), di-hidropirimidina de- sidrogenase (DPD), metilenotetra-hidrofolato redutase (MTHFR), timidina cinase (TK), e 5-metiltetra-hidrofolato-homocisteína metiltransferase (metio-
ninasintase, MTR). Em uma modalidade, uma sonda molecular detecta um distúrbio genético congênito tal como, por exemplo, síndrome X frágil. Outros distúr- ' bios genéticos congênitos que podem ser detectados incluem, por exemplo, . síndrome de Down, síndrome de Turner, síndrome de Wolf-Hirschhorn, sín- drome Jacobsen, doença de Charcot-Marie-Tooth tipo 1A, e translocação ' 5 —Robertsoniana.
Em uma modalidade, uma sonda molecular detecta uma condi- ] ção cancerosa tal como, por exemplo, um tumor sólido incluindo, por exem- plo, câncer de bexiga, mama, cervical, colorretal, fígado, pulmão, pancreáti- co, próstata, pele, ou uterino. Em uma modalidade, a sonda molecular detec- ta uma malignidade hematopoiética, tal como, por exemplo, leucemia linfo- ” blástica aguda, leucemia linfocítica crônica, linfoma, mieloma múltiplo, ou ' linfoma de não-Hodgkin. Em uma modalidade, a sonda molecular detecta i uma malignidade de célula B ou uma malignidade de célula-T. Em outra modalidade, uma sonda molecular detecta um patóge- no infeccioso, tal como, por exemplo, uma bactéria, vírus, ou fungo. Por e- xemplo, o patógeno pode ser, por exemplo, vírus Epstein-Barr, papiloma ví- . rus humano, ou herpes simples vírus. Em outro exemplo, o patógeno pode ser, por exemplo, Escherichia coli, Klebsiella phneumoniae, Pseudomonas ' aeruginosa, Helicobacter pylori, Histoplasma capsulatum, Blastomyces der- matitidis, espécies Coccidioides, Cryptococeus neoformans, Cryptococcus gattii, ou herpes simples vírus.
Em uma modalidade, a sonda molecular detecta aberrações (in- cluindo, por exemplo, redisposições, amplificações, ou deleções) de ALK, BCL2, BCL3, BCL6, BCL10, BCL12, BCR (22911), CCND1, cyclinD1 (11923), E2A(19p13), EGFR (7p11.2), ETV6 (TEL) (12p13), FIPIL1, HER2 (ERBB2) (17921.1), IGH (14932), IGK (2p11), /GL (22911), MALT1, MLL (ALL-1, HTRX1, HRX) (11923), MYC (c-Myc) (8924), PAX5, PDGFRA, PDGFRB, SIL, TCF3 (E2A, ITF1), TCL1A, TCRAD, TCRB, TCRG, telômero, TLX1, TLX3 (HOX11L2, RNX), ou TOP2A. Por exemplo, As sondas podem ser usadas para detectar uma redisposição de gene comum em câncer da infância caracterizado pela fusão de ETV6 e AML1 (também conhecido co-
mo RUNX1 e CBFA2).
: Em uma modalidade (incluindo, por exemplo, no contexto de . uma malignidade hematopoiética), uma sonda molecular detecta a translo- cação, tal como, por exemplo, a translocação escolhido de t(1;14) (934:911), ' 5 t(1;19) (923:p13), t(2;5), t(2;18) (912;921), t(2;8), t(4;11), t(4;11) (921;923), t(6;11) (927;923), t(7;22) (p22;:912), t(8;14), t(8;22), t(9;11) (p22;923), t(9;22) ' (g34:911), t(10;14) (924;:911), t(11;14), t((11;14) (p13;911), t(11;19) (9023;p13), t(14;18) (923;921), t(14;18), t(18;22) (921;911), e t(21;22) (922:9412). Em ou- tra modalidade, uma sonda molecular detecta a deleção, tal como um dele- çãode TAL1. Em ainda outra modalidade, uma sonda molecular detecta a o | amplificação de gene, tal como uma amplificação de EGFR, MYC, TOP2A, : ou HER2. Em tais casos, uma sonda pode ser pareada com uma sonda de referência. Por exemplo, uma sonda que detecta EGFR pode ser pareada com uma sonda que detecta CEN-7, uma sonda que detecta MYC pode ser pareada com uma sonda que detecta CEN-8, e uma sonda que detecta HER2 pode ser pareada com uma sonda que detecta CEN-17. . Alvos exemplares para sondas que podem ser usadas nas com- posições e métodos da invenção para detectar doenças não-hematológicas 7 incluem, por exemplo, BASE, BRCA1, CCND1, CCNE1, DCD, E2F3, n- MYC/MYCN, COX-2/PTGS2, LRIG1, ERa, hTERT, MLN64/ STARD3, PGR, SNAI1, SRC, TOP1, TUBB1, AIB1, DLC-1, EDD, Pip4k2b/5k, Sil, TBX2, c- Kit, VEGF, VCAM-1, Tie-1, Ts/TYMS, PSMA, PSA, PAP, P15, P16, BCL1, BCL2, MTOR, TIMP1, ESR1, PTEN, MDM2/CDK4, MET, C-MET, ERB1, FGFR1, IGF1IR, NET, FGFR3, ABCB1, TMPRSS2, BRCA2, TOP2B, ERCC1, AKT1, AKT2, AKT3, HRAS, NRAS, RAF1, HER3, HER4, ENT1, RRM1, R- RM2, RRM2B, PIK3SCA, AURKA4, AURKB, AURKC, MAPT/tau, TTBKI1, TUBB, VEGFR, CCND3, CDK6, CDK2, CDC2, HDAC, ESR2, SCUBE?2Z, BIRC5, FASN, DHFR, TP/ECGF1, TYMP, DPYD, TK1, HMGIC, ABCA?2, ABCB11, ABCC1, ABCC2, ABCC3, ABCCA, ABCC5, ABCG2, MVP, ATP7A, ATP7B, SLC29A1, SLC28A1, SLC1I9A1, TUBBA4, TUBA, MAP4, MAPY7, STMN1, KIF5B, HSPA5, PSMD14, FPGS, GSTP1, GPX, GCLC, GGT2, MT,
AKR1IB1, HMGB1, HMGB2, XPA, XPD, MSH2, MLH1, PMS2, APEX1, ' MGMT, GLO1, RB1, GML, CDKN1A, CDKN2A, CDKN1B, ERBB2, KRAS?2, ITGB1, JUN, FOS, NFKB1, TP53, TP73, BCL2L1, MCL1, BAX, BIRCA, TN- FRSF6, CASP3, CASP8, HSPB1, MALAT 1(alfa) t(11;19)(911;913.4), MHLB1 . 5 t(11;19)(911;9134), COLIA1 t(17;22)(922;:913), PDGFB t(17;22)(922;913), FKHR t(2;13) & t(1;13), ETV6 t(12;15)(p13;925), NTRK3 t(12;15)(p13;925), ' TLS/FUS t(12;16)(913;p11), cHOP t(12;16)(913;p11), EWS t(12;22)(913;912), EWS/FLI1 t(11;22)(924;912), e FLI t(11;22)(924;912). Alvos exemplares para sondas que podem ser usadas nas com- posições e métodos da invenção para detectar doenças hematológicas in- Cc cluem, por exemplo, sondas para detectar alvos de doenças mieloproliferati- . vas crônicas tais como, por exemplo, ABL t(9;22)(a34;:911), PRDM16 del(1p36.32), del(21922.12), RUNX1I/AML1 del(1p36.32), del(21922.12), CEP8, PDGFRB, NUP98, FGFR1, e ASS; sondas para detectar alvos de leucemia mieloide aguda, tal como, por exemplo, ETO t(8;21)(922;922), A- ML1 t(8;21)(922;,922), CBFbeta inv(16)(p13922) ou t(16;16)(D13;922), M- . YH11 inv(16)(D13922) ou t(16;16)(D13;922)) AF9 t(9:11),) PML t(15;17)(922:921), PLZF t(11;17)(923;921), NUMA t(11;17)(913;921), NPM " t(5;17)(923;912), RAR alfa t(15;17)(922:921) t(11;17)(923;921) t(11;:17)(913;921) t(5;17)(923;921), EVI1 t(3;v)(926;v), GR6 t(3;3)(921;926), RPN1 t(3;3)(921;926), DEK t(6;9), CAN t(6;9), MLF1 t(3;5)(...;923), FUS t(16;21), ERG t(16;21), NUP98 t(7;11), HOX9A t(7;11), MOZ/IMYST3 t(8;16)(pD11;p13), CBP t(8;16)(p11:p13), p300 t(8;22)(p11;913), TIF2/GRIP- 1/NCoA-2 inv(8)(p11913), e MKL1; sondas para detectar alvos de precurso- res de neoplasmas de célula B e T , tal como, por exemplo, PBX1 t(1;19)(923;:p13.3) + var., ABL t(9;22)(934;:911), AF4/AFF1 t(4;:11)(921;923), AML1I/RUNX1 t(12;21)(p13;922), I1L3 t(5;14)(931;9432), HLF t(17;19), IKZF1 del(7)(pD12.2), CDKN2A/CDKN2B del(9)(p21.3), aberrações de TAL1 1p32, LMO2 t(11;14)(pD13;911) + var, LMO1 t(11;14)(pD15;:911), HOX11 t(10;:14)(924;:911) + var., TAL2 t(7;9)(934;:932), e TAN1 t(7;9)(934;934); son- das para detectar alvos de neoplasmas de célula B madura, tais como, por exemplo, CEP12, ATM, D13S25, D13S319, TP53, P53, TNFAIP3 , del(6)(923.3-924.1) CDK6 BCL1 t(11;14)(913;9632) + var, IRF4 t(6;14)(p25;432), C-MAF t(14;16)(932;923), FGFR3 t(4:14)(D16;932), e MUMZ2/3 t(1;14)(921;,932); e sondas para detectar alvos de neoplasmas de - 5 célulaTe célula NK maduros, tal como, por exemplo, NPM t(2;5)(p23;935), ASS, RB1, e ATM.
' Alvos exemplares para sondas que podem ser usadas nas com- posições e métodos da invenção para detectar centrômeros incluem, por exemplo, CEP1, CEP2, CEP3, CEP4, CEP5, CEP6, CEP7, CEP8, CEP9, CEP10, CEP11, CEP12, CEP13, CEP14, CEP15, CEP16, CEP17, CEP18, - CEP19, CEP20, CEP21, CEP22, CEP23, CEP X, e CEP Y.
. Alvos exemplares para sondas que podem ser usadas nas com- ' posições e métodos da invenção também incluem, por exemplo, CEP 18 (18p11.1-911.1) , CEP X (Xp11.1-911.1), CEP Y (Yp11.1-911.1), LSI 13 (13914), LSI 21 (21922.13-922.2), CEP 3 (3p11.1-911.1), CEP 7 (7p11.1-
911.1), LSI (p16 9p21), CEP 17 (17p11.1-911.1), CEP 1 (D1Z5) 1p11.1- : 911.1, CEP 1 1912, CEP 2 (D2Z1) 2p11.1-911.1, CEP 3 (D3Z1) 3p11.1- q11.1, CEP 4 4p11-911, CEP 6 (D62Z1) 6p11.1-911, CEP 6 (D621) 6p11.1- - q911.1, CEP 7 (D7Z1) 7p11.1-911.1, CEP 8 (D822) 8p11.1-911.1, CEP 9 9p1i1-911, CEP 10 10p11.1-911.1, CEP 11 (D11Z1) 11p11.11-911.11, CEP 11 (D11Z1) 11p11.11-911, CEP 12 (D12Z3) 12p11.1-911, LSI 13 (13914), LSI 13 (RB1), CEP 15 (D15Z1) 15p11.2, CEP 15 (D15Z4) 15p11.1-911.1, CEP 16 (D16Z23) 16911.2, CEP 17 (D17Z1) 17p11.1-911.1, CEP 18 (D1821) 18p11.1-911.1, CEP 20 (D20Z1) 20p11.1-911.1, LSI 21, LSI 22 (BCR), CEP X(DXZ1) Xp11.1-911.1, CEP X (DXZ1)/Y (DYZ1)* Xp11.1-911.1 Yg12, CEP X (DXZ1)/Y (DYZ3) Xp11.1-911.1 Yp11.1-911.1, CEP Y (DYZ1) Yq12, CEP Y (DYZ1), CEP Y (DYZ3) Yp11.1-911.1, LSI 1p36 / LSI 1925 e LSI 19g913/19p13, LSI 4912, LSI 9934, LSI 13 (RB1) 13914, LSI 13 (RB1), LSI (13934), LS! 13 (13914), LSI 21, LSI 22 (BCR), LSI ALK, LSI AML1I/ETO, LSI —Androgen Receptor Gene (Xg12), LSI API2/"MALT1 t(11;18) (921;921), LSI ATM (11922.3), LSI ATM / CEP 11, LSI BCL2, LSI BCR/ABL + 9934, LSI
BCR/ABL, LS! CBFB, LSI CCND1 (11913), LSI CHOP (12913), LSI CSFIR ' (5933-934) / D5S23,D5S721, LSI C-MYC (8924.12-924.13), LSI Cyclin D1 (11913) / CEP 11, LSI D13S25 (13914.3), LSI D13S319 (13914.3), LSI D13S319 (13914.3) / LSI 13934, LSI D20S108 (20912), LSI D5S23/D5S721, - 5 CEP9,CEP15,LSID7S486(7931)/CEP7,LSID7S522 (7931) / CEP 7, LSI EGFR / CEP 7, LS! EGR1 (5931) / D5S23, D5S721, LS! ETV6 (TEL) ' (12p13), LSI EWSR1 (22912), LSI FKHR (13914), LSI FUS (16p11), LSI |- GH, LSI IGH/BCL2, LS! IGH/ICCND1, LSI IGH/FGFR3, LSI IGH/MAF, LSI IGH/MALT1 t(14:18) (932:921), LS! IGHIMYC, CEP 8, LS! MALT1 (18921), LSI MLL, LSI MYB (6923), LSI MYC, LSI N-MYC (2p241), LSI N- í MYC(2p24)/CEP 2 S, LSI p16 (9p21) /CEP 9, LSI p53 (17p13.1), LSI p53 / : LSI ATM e LSI D138319 / LSI 13934 / CEP 12, LSI PML/RARA, LSI PTEN ' (10923) / CEP 10, LSI RARA, LSI SYT (18911.2), LSI TEL/AMLA1, LSI TCF3/PBX1, LSI TCR alfa/deita, LSI TOP2A, LSI TP53 / CEP 17, LSI ZNF217 (209132), LSI p58 (1p36) LSI 1925, LSI D5S23, D5S721, LSI E- GR1/LSI D5823, D58S721, LSI N25/ARSA, LSI TUPLE 1/LSI ARSA, LSI TU- : PLE1 (HIRAYTelVysion 22q9 S, LSI KAL/CEP X, LSI LIS1/LSI RARA, LSI D1I5S10/CEP 15 (DI5Z1)/PML, LSI DI5S11/CEP 15 (D15Z1), LSI GA- - BRB3/CEP 15 (D15Z1), LSI SNRPN/CEP 15 (D15Z1)/LS| PML, LSI SMS Region/LSI RARA, LSI NSD1 (5935), LSI SRY/CEP X, LSI SRY, LSI STS/LSI CEP X, LS! ELNe/LSI D7S486, D7S522, LSI WHS/CEP 4, CEB108/T7 1p, VIJ2yRM2052 (U32389) 2p, 3PTEL25 (D3S4559) 3p, 4p022 (D4S3359, 6244599) 4p, C84c11/T7 5p, GPTEL48 Gp, VIJ2ayRM2185 (G31341) 7p, AFM 197XG5 (D8S504, 199153) 8p, 305J7-T7 9p, 10p006 (Z96139) 10p, VIJ2 (D11S2071, U12896) 11p, VIJ3 (sAVH27,U57865) 12p, STSG608831 STSGGE0N8938 16p, 282M16/SP6 17p, VIJlayRM2102 (D18S552) 189, 129FI6G/SP6 19p, 20p18 (D20S1157) 20p, DXYS129,DXYS153 Xp/Yp, VIJ2yRM2123 1QTEL10 (D1S3738, 9043912) 1q, VIJ2yRM2112 (D2S447) 20TEL47 29, 3QTELOS (D3S4560) 3g, AFM AP24XH1 (D4S2930) 49, GS3508/T7 5QTEL702 (D5S2907) 5q, VIJ2yRM2158 6q, VIJ2yRM2185 (STS 2000H, G31341) 7a, VIJ2yRM2053
8q, VIJ2yRM2241 (D9S325) 9q, 10QTEL24 (D10S2490, 6244631) 10a, ' D1181037 11g9, VIJ2ayRM2196 129, VIJ2yRM2002 (D13S327) 13qg, . D14S1420 14qg, WI-5214 (D15S396) (GO4801) 159, 169013 (Z96319) 16qg, D17S928 Z23646 179, VIJ2yRM2050 18Q0TEL11 STSG193 AFM254VD5 : 5 CU18-010L/CU18-010R STS-FO4195 TIGR-AONO8P37 STSG52963 18qg, D19S238E 199, 20QTEL14 20g, VIJ2yRM2029 21g, MS607 (XK58044) ACR ' 229, e EST Cdy 16c07 para SYBL1 - mapas dentro do cosmídeo C8.2 (Z43206) Xq/Ya. Sondas exemplares que podem ser usadas nas composições e métodos da invenção também incluem, por exemplo, sondas que se ligam í dentro da região IN do gene POL dos subtipos A, B, C, D, AE, E, AG, Ge O . de HIV; sondas que se ligam dentro do gene PR e da região RT do gene ' POL de HIV-1; e probes para detectar o plasmídeo críptico de Chlamydia trachomatis; sondas para detectar o gene Opa de Neisseria gonorrhoeae; sondas que se ligam aos subtelômeros p e q de cromossomas 1-12 e 16-20, subtelômeros q dos cromossomas acrocêntricos 13, 14, 15, 21, e 22, e sub- : terômeros de região pseudo-autossômica de Xp/Yp e Xq/Yq; sondas que se ligam em Exons 2 ou 3 de HLA-A; sondas que se ligam em Exons 2 ou 3 de , HLA-B; sondas que se ligam em Exons 2 ou 3 de HLA-C; sondas que se |i- gamem Exon2 de HLA-DRB1; sondas que se ligam em Exon 2 de HLA- DPB1; e sondas que se ligam em Exon 2 de HLA-DQB1. B. Composições aquosas (1) Seleção de Solvente Solventes apróticos polares adequados para uso na invenção podem ser selecionados com base em seus Parâmetros de Solubilidade Hansen. Métodos para experimentalmente determinar e/ou calcular o HSP para um solvente são conhecidos na técnica, e O HSP foi reportado para mais de 1200 produtos químicos. Por exemplo, o Parâmetro D pode ser calculado com precisão — razoável com base em índice refrativo, ou pode ser derivados de diagramas por comparação com solventes conhecidos de similar tamanho, forma, e
NE composição após estabelecer uma temperatura e volume molar.
O parâme- ' tro P pode ser estimado de momentos dipolo conhecidos (vide, por exemplo, . McClellan A.L., Tabelas de Momentos Dipolo Experimentais (W.H.
Freeman 1963)) usando a equação 1: Equação 1: ôp = 37, A(Momento Dipolo)/V'? onde V é o volume molar.
Não existe nenhuma equação para ' calcular o Parâmetro H.
Em vez disso, o Parâmetro H é geralmente determi- nado com base nas contribuições do grupo.
As caracterizações HSP são convenientemente visualizadas u- sando uma representação esférica, com o HSP de um solvente de referência a” adequado experimentalmente determinado no centro da esfera.
O raio da . esfera (R) indica a variação tolerável máxima do HSP do solvente de refe- rência que também permite uma "boa" interação ocorrer.
Bons solventes estão dentro da esfera e os ruins estão fora.
A distância, Ra, entre dois sol- ventes com base em seus respectivos valores HSP podem ser determinados usando a equação 2: Equação 2: (Ra)? = 4(ôp1 - ôp2)? + (Sp - Spa)? (SH - Sha)? onde o subscrito 1 indica a amostra de referência, o subscrito 2 O indica o produto químico teste, e todos os valores são em MPa'?, Boa solu- bilidade requer que R, seja menor do que o raio experimentalmente determi- nado da esfera de solubilidade R.. A diferença de energia relativa entre dois solventes, isto é, número RED, pode ser calculada tomando-se a relação de Ra para Ro, como mostrado na equação 3. Equação 3: RED = R3/R, Números RED menores do que 1,0 indicam alta afinidade; nú- meros RED iguais ou próximos a 1,0 indicam condições limites; e números RED progressivamente maiores indicam afinidades progressivamente meno- res.
Em algumas modalidades, os parâmetros D dos solventes apró- ticos polares da invenção são entre 17,7 a 22,0 MPa'?. Tais parâmetros D relativamente elevados estão geralmente associados com solventes tendo estruturas cíclicas e/ou estruturas com enxofre ou halogênios. Compotos ' lineares não são prováveis de estar entre os solventes mais adequados para . uso na invenção, podem ser considerados se seus parâmetros P e H estive- rem dentro das faixas como descrito abaixo. Visto que o parâmetro D é mul- - 5 tiplicado por 4 na Equação 2, os limites são metade de R,. Além disso, deve ser observado que os valores D de cerca de 210u maiores são frequente- ' mente característicos de um sólido. Em algumas modalidades, os parâmetros P dos solventes apró- ticos polares da invenção são entre 13 a 23 MPa'?. Tais parâmetros P ex- cepcionalmente elevados estão geralmente associados com solventes tendo ” um Momento Dipolo elevado e presumivelmente também um volume mole- . cular relativamente baixo. Por exemplo, para V próximo de 60 cc/mole, o ] Momento Dipolo deve ser entre 4.5 e 3.1. para V próximo de 90 cc/mole, o Momento Dipolo deve ser entre 5.6 e 3.9.
Em algumas modalidades, os parâmetros H dos solventes apró- ticos polares da invenção são entre 3 a 13 MPa'?. Geralmente, solventes : apróticos polares tendo um grupo álcool não são úteis nas composições e métodos da invenção, visto que os parâmetros H de tais solventes seriam = bastante elevados.
O volume molar do solvente aprótico polar pode também ser re- levante, visto que ele entra na avaliação de todos os três Parâmetros de So- lubilidade Hansen. Quando o volume molar torna-se menor, os líquidos ten- dem a evapora-se rapidamente. Quando o volume molar torna-se mior, os líquidos tendem a entrar na região sólida na faixa de parâmetros D e P cita- dos acima. Desse modo, os solventes apróticos polares da invenção são de preferência próximos ao limite líquido/sólido no espaço de HSP.
Em algumas modalidades, os solventes apróticos polares da in- venção têm funcionalidade lactona, sulfona, nitrila, sulfito, e/ou carbonato. Tais compostos são ditinguidos por suas constantes dielétricas relativamente elevadas, momentos dipolo elevados, e solubilidade em água. Um solvente aprótico polar exemplar com funcionalidade de lactona é y-butirolactona (G-
BL), um solvente aprótico polar exemplar com funcionalidade de sulfona é o ' sulfolano (SL; dióxido-sulfeto de tetrametileno), um solvente aprótico polar : exemplar com funcionalidade de nitrila é acetonitrila (AN), um solvente apró- tico polar exemplar com funcionalidade de sulfito é sulfito de glicol/sulfito de . 5 etileno (GS), e um solvente aprótico polar exemplar com funcionalidade de carbonato são carbonato de etileno (EC), carbonato de propileno (PC), ou : tritiocarbonato de etileno (ETC). A estruturas destes solventes exemplares são fornecidas abaixo e seus parâmetros de Solubilidade Hansen, números RED, e volumes molares são dados na tabela 1. o JS À À Õ SL À Ao o “o o “o o & : A O UU : Ha de etileno | de glicol | butirolactona | no de etileno carbonato Tabela1
EEE EEE oO cm3/mol ess ct Pro E | Ro =3.9 lee — 200 180 at —joeos les2z =| lee = 14 7 | 61 fog 6650 | n/a = não disponível. Outros solventes apróticos polares adequados que podem ser usados na invenção são compostos cíclicos tal como, por exemplo, e€- caprolactona e N-metilpirrolidona. Além disso, pirrolidinonas substituídas e estruturas relacionadas com nitrogênio em um anel de 5 ou 6 membros, e , estruturas cíclicas com dois grupos nitrila, ou um grupo bromo e um nitrila, podem também ser adequados para uso na invenção. Outros solventes a- próticos polares adequados podem conter um grupo uretano de anel (NH- . 5 COO-). Entretanto, nem todos os tais compostos são adequados, visto que 1,3-dimetil-2-imidazolidinona não produz nenhum sinal quando usado nas ' composições de hibridização da invenção. Alguém versado na técnica pode avaliar quanto aos compostos úteis nas composições e métodos da inven- ção como descrito aqui. Produtos químicos exemplares que podem ser ade- quados para uso na invenção são mencionados nas tabelas 2 e 3 abaixo.
c Tabela 2 2 semente bp TR ho | | : O [BWtadenodióxido — = [183 [1a je2r | | 2-Clorociclo-nexanona — [165 ———l1309 [514 | |erotontastona — => 1n9o = jis [8 | |1,2-Diniobenzeno — /oo08 —==Ú/27 dsa |
|[sowvene — == o p | | : * | 24-Dinitotoveno — [200 = [181 ão | |pirenisurona — lona dna 34 | | | Etanossutfonittareto — az7 =——lo 6 | [Fuoar [186 duo 515 | o Jerenma li so | 8 | | : Jasdidomaeico — 1202 — fi 168 | O [amensoaso [164 [148 jns | : | 8.10-Fenantrenoguinona fans fara ag >| | suona 1,3propano — —l184 ———l160 so |2-Pirordona — [isa dra [18 |
[sowente ho o i : ' hexanona | A tabela 2 menciona uma lista exemplar de produtos químicos 7 potenciais para uso nas composições e métodos da invenção com base em : seus Parâmetros de Solubilidade Hansen.
Outros compostos podem, de fa- to, também atender a estes requisitos.
Alguns destes produtos químicos fo- ram usados em hibridização e/ou Solução PCRs na técnica anterior (por e- xemplo, sulfóxido de dimetila (DMSO) foram usados em hibridização e Solu- ção PCRs, e sulfolano (SL) foram usados em Solução PCRs), porém a maio- O ria não.
Entretanto, a técnica anterior não reconheceu que estes compostos podem ser vantajosamene usados para diminuir os tempos e/ou temperatu- o 10 rasde hibridização, como descrito neste pedido.
Tabela 3 | Produto químico (Momento Dipoto) [RED — Ponto defusão“c | [nono ce damatamtaaa fase | nemTerazarçãas das | | [remetem amã E [mmeumosesmençsa — 1 | ponta — | | Prasmeen me ds
| Produto químico (Momento Dipolo) [RED — Pontodefusãoc | O [aTiowaea e o NM 1 1 | 1-Nitroso-2-pirofidiaa — faz | | enssmens — | - Js-cianogTiowan 6199 BP) 80
: | Metil alfa Bromo Tetronato (6.24) fo : | Picotinonitrita (2-cianopiridina) (629) Joao —|2628(8P212215) | Lsatnaçzsy | —Jiagses = = | Nenisidnona (6.65) =. Cs a NOTA: não solúvel a 40%
Nem todos os produtos químicos listados nas tabelas 2 e 3 são adequados para uso nas composições e métodos da invenção.
Por exemplo, embora DMSO seja listado na tabela 2 por que seus Parâmetros de Solubili- dade Hansen (HSPs) incluem-se nas faixas citadas acima, DMSO não fun-
ciona para diminuir tempos e/ou temperaturas de hibridização nas composi- ções e métodos da invenção.
Desse modo, em algumas modalidades, a composição aquosa não contém DMSO como um solvente aprótico polar.
Entretanto, inclui-se bem na experiência do técnico habitual para avaliar quanto a compostos adequados usando a orientação fornecida aqui incluin-
dotestede um composto em um dos exemplos fornecidos.
Por exemplo, em algumas modalidades, solventes apróticos polares adequados terão HSPs dentro das faixas citadas acima e uma estrutura mostrada nas fórmulas 1 a 9 acima. : (2) Composições, Tampões, e Soluções (a) Soluções de hibridização Soluções de hibridização tradicionais são conhecidas na técnica. - 5 Tais soluções podem compreender, por exemplo, agentes de tamponamen- to, agentes de aceleração, agentes de quelação, sais, detergentes, e agen- Ú tes de bloqueio.
Por exemplo, os agentes de tamponamento podem incluir SSC, HEPES, SSPE, PIPES, TMAC, TRIS, SET, fosfato de potássio, ácido cítrico, pirrofosfato de sódio, etc.
Os agentes de tamponamento podem estar pre- - sentes em concentrações de 0,5x a 50x.
Tipicamente, os agentes de tampo- . namento estão presentes em concentrações de 2x a 10x. ' Os agentes de aceleração podem incluir polímeros tais como FICOLL, PVP, heparina, sulfato de dextrana, proteínas tais como BSA, gli- coistais como etileno glicol, glicerol, 1,3 propanodiol glicerol, propileno glicol, ou dietileno glicol, combinações dos mesmos tais como solução de Der- o nhardt e BLOTTO, e solventes orgânicos tais como formamida, dimetilfor- mamida, DMSO, etc.
O agente de aceleração podem estar presentes em o concentrações de 1% a 80% ou 0,1x a 10x.
Tipicamente, a formamida é pre- sente em concentrações de 25% a 75%, ao mesmo tempo que DMSO, sulfa- to de dextrana, e glicol estão presentes em concentrações de 5% a 10%. Os agentes de quelação podem incluir EDTA, EGTA, etc.
Os agentes de quelação podem estar presentes em concentrações de 0,1 mM a 10 mM.
Tipicamente, os agentes de quelação estão presentes em concen- traçõesde0,5mMa5mM.
Os sais podem incluir cloreto de sódio, fosfato de sódio, fosfato de magnésio, etc.
Os sais podem estar presentes em concentrações de 1 mM a 750 mM.
Tipicamente, os sais estão presentes em concentrações de 10 MM a 500 mM.
Os detergentes podem incluir Tween, SDS, Triton, CHAPS, áci- do deoxicólico, etc.
O detergente pode estar presente em concentrações de
0,01% a 10%. Tipicamente, os detergentes estão presentes em concentra- " ções de 0,1% a 1%. : Os agentes de bloqueio de ácido nucleico podem incluir, tRNA de levedura, DNA de homopolímero, DNA de esperma de salmão desnatu- - 5 — rado, DNA de esperma de arenque, DNA humano total, COT1 DNA, etc. Os ácidos nucleicos de bloqueio podem estar presentes em concentrações de 1 0,05 mg/mL a 100 mg/mL. Uma grande variação existe na literatura com respeito a solu- ções de hibridização tradicionais. Por exemplo, uma solução de hibridização tradicional pode compreender 5x ou 6x SSC, 0,01 M EDTA, 5x solução de - Dernhardt, 0,5% SDS, e 100 mg/mL de DNA de esperma de salmão desna- . turado, cisalhado. Mais solução de hibridização tradicional pode compreen- ' der 50 mM HEPES, 0,5 M NaCl, e 0,2 mM EDTA. Uma solução de hibridiza- ção típica para FISH em espécimens biológicas para detecção de RNA pode compreender, por exemplo, 2x SSC, 10% de sulfato de dextrana, 2 mM complexo de vanadil-ribonucleosídeo a 2 mM, 50% de formamida, 0,02% ' BSA livre de RNAse, e 1 mg/mL E. coli tRNA. Uma solução de hibridização típica para FISH em espécimens biológicas for DNA detecttion pode com- : preender, por exemplo, 2x SSC, 10% de sulfato de dextrana, 50% de for- mamida, e por exemplo, 0,3 mg/ml DNA de esperma de salmão ou 0,1 mg/mL COT1 DNA. Outras soluções de hibridização típicas pode compreen- der 40% de formamida, 10% de sulfato de dextrana, NaCl a 30 mM, tampão de fosfato a 5 mM, blocking-PNA ou DNA de COT-1, e em alguns casos 0,1 ug/ul de DNA humano total (THD).
As composições da invenção podem compreender uma solução de hibridização compreendendo quaisquer dos componentes de soluções de hibridização tradicionais citados acima em combinação com pelo menos um solvente aprótico polar. Os componentes tradicionais podem estar presentes nas mesmas concentrações como usado nas soluções de hibridização tradi- cionais, ou pode estar presentes em maiores ou menores concentrações, ou pode ser omitidos completamente.
Por exemplo, se as composições da invenção compreenderem NaCl e/ou tampão de fosfato, elas podem estar presentes em concentrações de 0-1200 mM NaCl e/ou 0-200 mM tampão de fosfato. Em algumas modali- dades, as concentrações de sais podem ser, por exemplo, 300 mM NaCl e tampão de fosfato a 5 MM, ou NaCl a 600 mM e tampão de fosfato a 10 mM. Se as composições da invenção compreenderem agentes de aceleração tais como sulfato de dextrana, glicol, ou DMSO, o sulfato de dex- trana podem estar presentes em concentrações de 5% a 40%, o glicol po- dem estar presentes em concentrações de 0,1% a 10%, e o DMSO pode ser de0,1%a10%. Em algumas modalidades, a concentração de sulfito de dex- trana pode ser 10% ou 20% e a concentração de etileno glicol, 1,3 propano- diol, ou glicerol pode ser 1% a 10%. Em algumas modalidades, a concentra- ção de DMSO pode ser 1%. Em algumas modalidades, a composição aquo- sa não compreende DMSO como um agente de aceleração. Em algumas modalidades, a composição aquosa não compreende formamida como um agente de aceleração, ou compreende formamida com a condição de que a composição contenha menos do que 10%, ou menos do que 5%, ou menos do que 2%, ou menos do que 1%, ou menos do que 0,5%, ou menos do que 0,1%, ou menos do que 0,05%, ou menos do que 0,01%. Se as composições da invenção compreenderem ácido cítrico, as concentrações podem variar de 1 mM a 50 mM e o pH pode variar de 5,0 a 8,0, Em algumas modalidades a concentração de ácido cítrico pode ser 10 mM e o pH pode ser 6,2.
As composições da invenção podem compreender agentes que reduzem ligação não específica a, por exemplo, a membrana celular, tais como esperma de salmão ou pequenas quantidades de DNA humano total ou, por exemplo, podem compreender agentes de bloqueio para bloquear a ligação de, por exemplo, sequências de repetição ao alvo tais como maiores quantidades de DNA humano total ou DNA enriquecido por repetição ou a- gentes de bloqueio específicos tais como fragmentos e sequências de PNA ou LNA. Estes agentes podem estar presentes em concentrações de 0,01-
| 44 100 ug/ul ou 0,01-100 uM.
Por exemplo, em algumas modalidades, estes ' agentes serão 0,1 ug/nl. de DNA humano total, ou 0,1 ug/nl de DNA não : humano, tais como esperma de arenque, esperma de salmão, ou DNA de timo de bezerro, ou 5 uM de PNA de bloqueio. . 5 Um aspecto da invenção é uma composição ou solução para uso em hibridização.
Composições para uso na invenção incluem uma com- o posição aquosa compreendendo a sequência de ácido nucleico e pelo me- ] nos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar ' sequências de nucleotídeo de filamento duplo.
Uma quantidade eficaz para —desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo é uma quantidade - que possibilita hibridização.
Por exemplo, um meio de testar se a quantidade . de solvente aprótico polar que é eficaz para possibilitar a hibridização é para ' determinar se o solvente aprótico polar, quando usado nos métodos de hi- bridização e composições descritos aqui, tal como o exemplo 1, produz um sinal detectável e/ou um produto de ácido nucleico amplificado.
Exemplos não limitantes de quantidades eficazes de solventes o apróticos polares include, por exemplo, cerca de 1% a cerca de 95% (v/v). Em algumas modalidades, a concentração de solvente aprótico polar é de O 5% a 60% (v/v). Em outras modalidades, a concentração de solvente apróti- co polar é de 10% a 60% (v/v). Em ainda outras modalidades, a concentra- ção de solvente aprótico polar é de 30% a 50% (v/v). Concentrações de 1% a 5%, 5% a 10%, 10%, 10% a 20%, 20% a 30%, 30% a 40%, 40% a 50%, ou 50% a 60% (v/v) são também adequadas.
Em algumas modalidades, o solvente aprótico polar estará presente em uma concentração de 0,1%, 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, ou 5% (v/v). Em outras modalidades, o sol- vente aprótico polar estará presente em uma concentração de 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5%, 10%, 10,5%, 11%, 11,5%, 12%, 12,5%, 13%, 13,5%, 14%, 14,5%, 15%, 15,5%, 16%, 16,5%, 17%, 17,5%, 18%, 18,5%, 19%, 19,5%, ou 20% (vv). Onde uma ou mais sondas de ácido nucleico are present nas composições da invenção, as sondas pode ser diretamente ou indiretamente AR |
| as | | rotulada com compostos detectáveis (tal como, por exemplo, enzimas, cro- ' moforos, fluorocromos, e haptenos), como descrito supra. o sondas de DNA . podem estar presentes em concentrações de 0,1 a 100 ng/ul.
Por exemplo, em algumas modalidades, as sondas podem estar presentes em concentra- | ' 5 çõesde1al10ng/ul.As sondas de PNA podem estar presentes em con- centrações de 0,5 a 5000 nM.
Por exemplo, em algumas modalidades, as o sondas podem estar presentes em concentrações de 5 a 1000 nM.
Em uma modalidade, a composição da invenção compreende ' uma mistura de 40% solvente aprótico polar (v/v) (por exemplo, carbonato de etileno, "EC"), 10% de sulfato de dextrana, NaCl a 300 mM, tampão de fosfa- - to a 5 mM, e 1-10 ng/ul de sonda.
Outra composição exemplar da presente : invenção compreende uma mistura de 15% de EC, 20% de sulfato de dex- trana, NaCl a 600 mM, tampão de fosfato a 10 mM, e 0,1 ug/ul de DNA hu- mano total.
Yet outra composição exemplar compreende 15% de EC, 20% de sulfato de dextrana, NaCl a 600 mM, 10 mM ácido cítrico pH 6.2, e 0,1 ug/ul de DNA não humano (por exemplo, esperma de arenque, esperma de oo salmão, ou timo de bezerro) ou 0,5% de formamida ou 1% de glicol (por e- xemplo, etileno glicol, 1,3 propanodiol, ou glicerol). o (b) Solvente(s) aprótico(s) polar(es)
Diferentes solventes apróticos polares podem conferir diferentes propriedades on as composições da invenção.
Por exemplo, a escolha de solvente aprótico polar pode contribuir para a estabilidade da composição, visto que certos solventes apróticos polares podem degradar-se tempo pro- longado.
Por exemplo, o solvente aprótico polar carbonato de etileno esgota-
seem etileno glicol, que é uma molécula relativamente estável, e dióxido de carbono, que pode interagir com água para formar ácido carbônico, alteran- do a acidez das composições da invenção.
Sem ser ligado pela teoria, acre- dita-se que a mudança em pH em esgotamento de carbonato de etileno tor- na as composições da invenção menos eficaz para hibridização.
Entretanto,
— estabilidade pode ser melhorada reduzindo o pH da composição, adicionan- do ácido cítrico como um tampão em pH 6,2 em lugar do tampão de fosfato tradicional, que é tipicamente usado em cerca de pH 7,4, e/ou adicionando ' etileno glicol em concentrações, por exemplo, entre 0,1% a 10%, ou entre . 0,5% a 5%, tal como, por exemplo, 1%, 2%, 3%, etc.
Por exemplo, com tam- pão de citrato a 10 MM, as composições da invenção são estáveis at 2-8ºC * 5 for aproximadamente 8 meses.
Estabilidade pode também ser melhorada se as composições são armazenadas em baixas temperaturas (por exemplo, - ' 20ºC). Além disso, certos solventes apróticos polares podem causar as composições da invenção separarem-se em sistemas de múltiplas fases sob certas condições.
As condições sob as quais sistemas de múltiplas fases 7 são obtidos podem ser diferentes para diferentes solventes apróticos pola- : res.
Geralmente, Entretanto, as a concentração de solvente aprótico polar ' aumenta, o número de fases aumenta.
Por exemplo, composições compre- endendo baixas concentrações carbonato de etileno (isto é, menos do que 20%) podem existir como uma fase, ao mesmo tempo que composições compreendendo maiores concentrações de carbonato de etileno podem se- co pararem-se em duas, ou ainda três fases.
Por exemplo, composições com- preendendo 15% de carbonato de etileno existem como uma fase única em .” temperatura ambiente, ao mesmo tempo que composições compreendendo 40% de carbonato de etileno consistem de uma fase inferior viscosa (apro- ximadamente 25% do volume total) e uma fase superior menos viscosa (a- proximadamente 75% do volume total) em temperatura ambiente.
Por outro lado, alguns solventes apróticos polares podem existir em duas fases em temperatura ambiente mesmo em baixas concentrações.
Por exemplo, sulfolano, y-butirolactona, tritiocarbonato de etileno, sulfito de glicol, e carbonato de propileno existe como duas fases em concentrações de 10, 15, 20, ou 25% (20% de sulfato de dextrana, NaCl a 600 mM, tampão de citrato a 10 mM) em temperatura ambiente.
Pode também ser possível alterar o número de fases ajustando atemperatura das composições da invenção.
Geralmente, quando a tempe- ratura aumenta, o número de fases diminui.
Por exemplo, a 2-8ºC, composi-
ções compreendendo 40% de carbonato de etileno podem separarem-se em ' um sistema de três fases. : Pode também ser possível alterar o número de fases ajustando a concentração de sulfato de dextrana e/ou sal na composição.
Falando de . 5 modo geral, diminuindo a concentração de sulfato de dextrana (concentra- ção tradicional é 10%) e/ou concentração de sal pode reduzir o número de : fases.
Entretanto, dependendo do solvente aprótico polar particular e sua concentração na composição, fases únicas pode ser produzidas até mesmo com maiores concentrações de sal e sulfato de dextrana.
Por exemplo, a composição compreendendo baixas quantidades de EC (por exemplo, 15%, 10%, 5%) podem trabalhar bem aumentando o sulfato de dextrana e concen- : trações de sal, ao mesmo tempo que ainda mantendo um sistema de uma Ú fase.
Em uma modalidade particular, composições compreendendo uma sonda de DNA de gene HER2, uma sonda de PNA de CEN7, 15% de EC, 20% de sulfato de dextrana, NaCl a 600 mM, e tampão de fosfato a 10 mM existem como uma fase mesmo a -20ºC.
Em outras modalidades, as compo- 2 sições são líquidas a -20ºC.
Alguns solventes apróticos polares podem produzir sinais mais o fortes em uma fase ou outra.
Por exemplo, 40% sulfito de glicol produz sinais fortes na fase inferior e nenhum sinal na fase superior.
Similarmente, certos tipos de sondas podem produzir sinais mais fortes em uma fase ou outra.
Por exemplo, sondas de PNA tendem a mostrar sinais mais fortes na fase inferior do que na fase superior.
Consequentemente, os sistemas de múltiplas fases da invenção pode ser usado para convenientemente examinar diferentes aspectos de uma amostra.
Por exemplo, um sistema de duas fases pode ser usado para separar amostras rotuladas com sondas de PNA de amostras rotuladas com sondas de DNA.
Outros usos incluem isolação de uma fase específica exi- bindo, por exemplo, certas vantagens de hibridização tal que a fase isolada — podem ser usadas como um sistema de fase única.
A sonda e/ou amostra pode ser adicionada antes de, ou após isolação de uma fase particular.
Hibridizações podem ser realizadas com uma composição da in- ' venção de uma fase, com fases individuais da composição da invenção de . múltiplas fases, ou com misturas de qualquer uma ou mais das fases em uma composição da invenção de múltiplas fases. Por exemplo, in um siste- ' 5 made uma fase, um volume da amostra pode ser extraído para uso na hibri- dização. Em um sistema de múltipla fase, um pode extrair um volume de ' amostra da fase de interesse (por exemplo, a fase superior, inferior ou medi- ana) para usar na hibridização. Alternativamente, as fases em um sistema de múltiplas fases podem ser misturadas antes da extração de um volume da amostra misturada para uso na hibridização. Entretanto, o sistema de 7 múltiplas fases pode produzir forte e irregular manchamento de base local . dependendo da composição. Enquanto que a adição de baixas quantidades de formamida reduzirá a base em um sistema de uma fase, ele tem pequeno efeito sobre um sistema de múltiplas fases com altas concentrações (por exemplo, 40%) de um solvente aprótico polar. Além disso, quando a concen- tração de formamida aumenta, maiores concentrações de sonda e/ou maior 2 tempo de hibridizações são requeridos para manter forte intensidade de si- nal. « (c) Otimização para Pedidos Particulares As composições da invenção podem ser variadas a fim de otimi- zar resultados para um pedido particular. Por exemplo, a concentração de solvente aprótico polar, sal, agente de aceleração, agente de bloqueio, e íons de hidrogênio (isto é pH) pode ser variada a fim de melhorar resultados para um pedido particular.
Por exemplo, a concentração de solvente aprótico polar pode ser variada a fim de melhorar intensidade de sinal e manchamento de base. Ge- ralmente, as a concentração de solvente aprótico polar aumenta, intensidade de sinal aumenta e manchamento de base diminui. Por exemplo, composi- ções compreendendo 15% de EC tendem a mostrar sinais mais fortes e me- nos base que composições compreendendo 5% de EC. Entretanto, intensi- dade de sinal pode ser melhorada para composições tendo baixas concen-
trações de solvente aprótico polar (por exemplo, 0% a 20%) se as concen- : trações de sal e/ou sulfato de dextrana forem aumentadas. Por exemplo, . sinais fortes podem ser observados com 5% a 10% de EC quando a concen- tração de sal é elevada aproximadamente 8 a 16 vezes a concentração tra- . 5 dicionalde sais (isto é, aproximadamente NaCl a 1200 mM, tampão de fosfa- to a 20 mM). Igualmente, as menores concentrações de solvente aprótico ] polar são usadas, maiores concentrações de sulfato de dextrana são geral- mente requeridas para manter bom sinal e intensidade de base. Consequentemente, as concentrações de sal e sulfato de dex- trana podem também ser variadas a fim de melhorar intensidade de sinal e - manchamento de base. Geralmente, quando as concentrações de sal e sul- R fato de dextrana aumentam, a intensidade de sinal aumenta e a base dimi- ' nui. Por exemplo, concentrações de sal que são aproximadamente duas a quatro vezes concentrações tradicionais (isto é, 300 mM NaCl tampão de fosfato a5 mM) produz sinais fortes e baixa base. Surpreendentemente, En- tretanto, hibridização ocorre usando as composições da invenção mesmo na o ausência completa de sal. Intensidades de sinal pode ser melhorada sob condições de nenhum sal aumentando as concentrações de agente de ace- -” leração e/ou solvente aprótico polar.
Igualmente, intensidade de sinal aumenta a concentração de sul- fato de dextrana aumenta de 0% a 20%. Entretanto, bons sinais podem ain- da ser observados na concentração de sulfato de dextrana de 0%. A intensi- dade de sinal pode ser melhorada sob baixas condições de sulfato de dex- trana aumentando o solvente aprótico polar e/ou concentrações de sal.
Além disso, os tipos de sondas usado nas composições da in- venção podem ser variadas para melhorar os resultados. Por exemplo, em alguns aspectos da invenção, combinações de sondas de DNA/DNA podem mostrar menos base do que as combinações de sondas de DNA/PNA nas composições da invenção ou vice-versa. Por outro lado, sondas de PNA tendem a mostrar sinais mais fortes do que as sondas de DNA sob baixas concentrações de sal e/ou solvente aprótico polar. De fato, as sondas de
PNA também mostram sinais quando nenhum solvente aprótico polar está : presente, enquanto que as sondas de DNA mostram fracos ou nenhum sinal sem solvente aprótico polar.
1. Kits * 5 A presente invenção também fornece kits compreendendo com- posições da invenção. Desse modo, um kit pode compreender uma ou mais ' sondas moleculares (como elaborado supra) e uma composição aquosa (como elaborado supra). Em uma modalidade, a sonda não é facilmente vi- sualizada (por exemplo, porque ela não é rotulada com um fluoroforo ou cromoforo), e o kit também compreende um reagente de visualização, tal 7 como, por exemplo, um anticorpo (que pode ser monoclonal, e que pode ser : rotulada com um rótulo detectável), um substrato de enzima fluorogênica ou ] cromogênica, um conjugado de estreptavidina, ou qualquer outro reagente de visualização adequado conhecido pelo versado na técnica. Em uma modalidade, o kit também compreende outros reagen- tes e/ou composições que podem ser usados para detectar uma aberração 2 cromossômica. Em uma modalidade, um kit pode também compreender uma protease, tal como, por exemplo, pepsina ou proteinase K. Em uma modali- -” dade, um kit pode também compreender um ou mais de uma solução de pré- tratamento, protease, tampão de lavagem rigorosa, meio de montagem de fluorescência, tampão de lavagem, solução de amplificação de sinal, e se- lante de lamínula. Por exemplo, em uma modalidade, um kit FISH de citolo- gia pode também compreender um ou mais de tampão de lavagem, tampão de rigorosidade, meio de montagem de fluorescência, e selante de lamínula. Em uma modalidade, um kit FISH de histologia pode também compreender um ou mais de solução de pré-tratamento, pepsina, tampão de lavagem, tampão de rigorosidade, meio de montagem de fluorescência, e selante de lamínula. Em uma modalidade, um kit CISH pode também compreender blo- co de peroxidase, mistura de anticorpo CISH, um tampão de substrato ver- melho, um tampão de substrato azul, um cromógeno vermelho, e um cromó- geno azul. Em outra modalidade, um kit pode também compreender instru-
ções. : Ill. Aplicações, Métodos e Usos : A invenção também fornece métodos de uso das composições e kits descritos acima para a detecção de aberrações cromossômicas, diag- . 5 nóstico de doença, monitoração do progresso de tratamento terapêutico, monitorando um paciente que completou o tratamento para recorrência da ' doença. Em geral, tais métodos usam uma ou mais das condições de hibri- dização descritas infra. Por exemplo, a invenção fornece de uma aberração cromossô- mica usando composições da invenção. A detecção pode ser relevante para - o diagnóstico, seleção de um tratamento apropriado, e/ou a monitoração de ' um paciente, quanto à recorrência da doença. Em uma modalidade, a inven- ' ção fornece método de determinar se uma aberração cromossômica está presente em uma sequência de ácido nucleico, o método compreendendo: — fornecer uma sonda molecular que detecta a aberração cro- mossômica, oo — fornecer a sequência de ácido nucleico, — fornecer uma composição aquosa compreendendo 1% (v/v) a o 95% (v/v) de pelo menos um solvente aprótico polar, — combinar a sonda molecular e a sequência de ácido nucleico e a composição aquosa durante pelo menos um período de tempo suficiente para hibridizar a sonda molecular e a sequência de ácido nucleico, e — determinar se a sonda molecular hibridizou para a sequência de ácido nucleico, desse modo, determinar se uma aberração cromossômica está presente na sequência de ácido nucleico.
Em outra modalidade, a invenção fornece método de determinar se uma aberração cromossômica está presente em uma sequência de ácido nucleico, o método : — — fornecer a sequência de ácido nucleico, — — aplicar uma composição aquosa compreendendo uma son-
da molecular que detecta a aberração cromossômica e 1% (v/v) a 95% (v/v) , de pelo menos um solvente aprótico polar para o referido ácido nucleico du- . rante pelo menos um período de tempo suficiente para hibridizar a sonda molecular e sequência de ácido nucleico, e . 5 — — determinar se a sonda molecular hibridizou para a sequên- cia de ácido nucleico, ' desse modo determinando se a aberração cromossômica está presente na sequência de ácido nucleico. Em outra modalidade, a invenção fornece o método de determi- narse uma aberração cromossômica está presente na sequência de ácido - nucleico, o método compreendendo: . — — fornecer a sequência de ácido nucleico, ] — — aplicar uma composição aquosa da invenção compreen- dendo pelo menos um solvente aprótico polar e uma sonda molecular que detecta a aberração cromossômica para a referida sequência de ácido nu- cleico durante pelo menos um período de tempo suficiente para hibridizar a a sonda molecular e sequência de ácido nucleico, e — — determinar se a sonda molecular hibridizou para a sequên- O cia de ácido nucleico, desse modo determinando se a aberração cromossômica está presente na sequência de ácido nucleico.
A invenção também fornece método de diagnosticar um distúrbio genético congênito, câncer, ou infecção associado com uma aberração cro- mossômica, — — fornecer uma amostra de tecido de um indivíduo, em que a amostra de tecido compreende a sequência de ácido nucleico, — — determinar se uma aberração cromossômica está presente em uma sequência de ácido nucleico, de acordo com os métodos da inven- ção, e — — diagnosticar o distúrbio genético congênito, câncer, ou in- fecção se a aberração cromossômica estiver presente na amostra de tecido.
Em uma modalidade, os métodos da invenção podem ser usa- , dos para determinar se um paciente se beneficiaria de um tratamento parti- cular. Por exemplo, um paciente de câncer de mama em quem HER? é am- plificado pode beneficiar-se de tratamento com Herceptin& (trastuzumab) e . 5 um paciente de câncer colorretal em quem EGFR é superexpresso pode be- neficiar-se do tratamento com Erbitux& (cetuximab) ou Vectibix& (panitu- ' muma)b).
Em uma modalidade, os métodos da invenção podem ser usa- dos para monitorar a progressão ou remissão da doença. Em outra modali- dade,os métodos da invenção podem ser usados para estimar um prognós- - tico do paciente. Por exemplo, os métodos da invenção podem ser usados, . juntamente com dados clinicopatológicos, para estimar um prognóstico do paciente. Em uma modalidade, os métodos podem ser usados para determi- nar a presença de amplificação de gene HER2, e para usar aquela informa- ção para fornecer um prognóstico para um paciente de câncer de mama de nodo positivo, estágio Il. A presença de deleções ou amplificações de 2 TOP2A pode também ser usada para estimar o prognóstico de pacientes de câncer de mama.
O A. Amostras analíticas Os métodos e composições da invenção podem ser usados to- talmente ou parcialmente em todos os tipos de aplicações de hibridização nos campos de citologia, histologia, ou biologia molecular. De acordo com uma modalidade, a primeira ou a segunda sequência de ácido nucleico nos métodos da invenção é presente em uma amostra biológica. Exemplos de tais amostras incluem amostras de tecido, preparações celulares, prepara- ções de fragmento celular, e isoladas e enriquecidas preparações de com- ponente celular. A amostra pode originar-se de vários tecidos tal como, por exemplo, mama, pulmão, colorretal, próstata, pulmão, cabeça e pescoço, estômago, pâncreas, esôfago, fígado, e bexiga, ou outros tecidos relevantes e neoplasiados mesmos, qualquer suspensão celular, amostra de sangue, aspiração por agulha fina, fluido de ascites, esputo, lavagem de peritôneo,
lavagem de pulmão, urina, fezes, esfoladura celular, esfregaço celular, citos- , pina ou células citoprep. . A amostra pode ser isolada e processada usando protocolos pa- drões.
Preparações de fragmento celular podem, por exemplo, ser obtidas . 5 porhomogeneização celular, tratamento de congelamento-descongelamento ou lise celular.
A amostra isolada pode ser tratada de muitas diferentes ma- ' neiras dependendo do propósito de obtenção da amostra e dependendo da rotina no sítio.
Frequentemente a amostra é tratada com vários reagentes para preservar o tecido para posterior análise da amostra, alternativamente a amostra pode ser analisada diretamente.
Exemplos de métodos amplamente 7 usados para preservar amostras são fixados por formalina seguidos por em- . butimento em parafina e crio-preservação. ] Citologia envolve o exame de células individuais e/ou dissemi- nações de cromossoma de uma amostra biológica.
O exame citológico de uma amostra inicia-se com a obtenção uma espécimen de células, que pode tipicamente ser feito por raspagem, esfregação ou escovação de uma área, oo como no caso de espécimens cervicais, ou coletando fluidos corporais, tais como aqueles obtidos da cavidade toráxica, bexiga, ou coluna espinhal, ou .” por aspiração por agulha fina ou biópsia por agulha fina, como no caso de tumores internos.
Em uma preparação citológica manual convencional, a amostra é transferida para um material de suspensão líquido e as células no fluido são então transferidas diretamente ou por etapas de processamento com base em centrifugação em um slide de microscópio de vidro para ob- servação.
Em uma preparação citológica automatizada típica, uma monta- gem de filtro é colocada na suspensão líquida e a montagem de filtro tanto dispersa as células quanto captura as células no filtro.
O filtro é então remo- vido e colocada em contato com um slide de microscópio.
As células são então fixadas no slide de microscópio antes de análise por quaisquer das técnicas descritas abaixo.
Para a amplitude de metáfase, culturas celulares são geralmente tratadas com colcemid, ou outro agente de rompimento de polo de fuso ade-
quado, para parar o ciclo celular em metáfase. As células são então fixadas ' e manchadas sobre slides de microscópio, tratada com formaldeído, lava- . das, e desidratadas em etanol. Sondas são então adicionadas e as amostras são analisadas por quaisquer das técnicas descritas abaixo. * Em um experimento de hibridização tradicional usando uma a- mostra citológica, slides contendo a espécimen são imersos em um tampão Ú de formaldeído, lavadas, e então desidratadas em etanol. As sondas são então adicionada e a espécimen é coberta com uma lamínula. O slide é in- cubado em uma temperatura suficiente para desnaturar qualquer ácido nu- cleicoina espécimen (por exemplo, 5 minutos a 82ºC) e então incubado em - uma temperatura suficiente para permitir hibridização (por exemplo, durante . a noite a 45ºC). Após hibridização, as lamínulas são removidas e as espéci- ] mens são submetidas a uma lavagem de alta rigorosidade (por exemplo, 10 minutos a 65ºC) seguidos por uma série de lavagens de baixa rigorosidade (por exemplo, 2 x 3 minutos em temperatura ambiente). As amostras são então desidratadas e montadas para análise.
a. Histologia envolve o exame de células em fatias finas de tecido. Para preparar uma amostra de tecido para examinação histológica, pedaços o do tecido são fixados em um fixador adequado, tipicamente um aldeído tal como formaldeído ou glutaraldeído, e então embutidos em cera de parafina derretida. O bloco de cera contendo a amostra de tecido é então cortado em um micrótomo para produzir fatias finas de parafina contendo o tecido, tipi- camente de 2 a 10 mícrons de espessura. A fatia de espécimen é então apli- cada a um slide de microscópio, secada a ar, e aquecida para causar a es- pécimen aderir ao slide de vidro. Parafina residual é então dissolvida com um solvente adequado, tipicamente xileno, tolueno, ou outros. Estes assim chamados solventes de desparafinização são então removido com um rea- gente do tipo desidratação por lavagem antes de análise da amostra por quaisquer das técnicas descritas abaixo. Alternativamente, fatias podem ser preparadas de espécimens de congelamento, brevemente fixadas em 10% de formalina ou outros fixativos adequados, e em seguida infundidas com reagente de desidratação antes de análise da amostra. ' Em um experimento de hibridização tradicional usando uma a- . mostra histológica, espécimes de tecido embutidas em parafina fixadas por formalina são cortadas em seções de 2 a 6 um e coletadas em slides.
A pa- - 5 rafina é derretida (por exemplo, 30 a 60 minutos a 60ºC) e então removido (desparafinada) por lavagem com xileno (ou um substituto de xileno), por ' exemplo, 2 x 5 minutos.
As amostras são reidratadas, lavadas, e em seguida pré-tratada (por exemplo, 10 minutos a 95 a 100ºC). Os slides são lavados e então tratados com pepsina ou outro permeabilizante adequado, por exem- plo 3a15 minutos a 37ºC.
Os slides são lavados (por exemplo, 2 x 3 minu- tos), desidratados, e a sonda é aplicada.
As espécimens são cobertas com . uma lamínula e o s/ide é incubado em uma temperatura suficiente para des- naturar qualquer ácido nucleico em uma espécimen (por exemplo 5 minutos a 82ºC), seguidos por incubação em uma temperatura suficiente para permi- tir hibridização (por exemplo, durante a noite a 45ºC). Após hibridização, as lamínulas são removidas e as espécimens são submetidas a uma lavagem a de alta rigorosidade (por exemplo, 10 minutos a 65ºC) seguidos por uma série de lavagens de baixa rigorosidade (por exemplo, 2 x 3 minutos em .* temperatura ambiente). As amostras são então desidratadas e montadas para análise.
B.
Hibridização Técnicas As composições e métodos da presente invenção podem ser usadas totalmente ou parcialmente em todos os tipos de técnicas de hibridi- zação de ácido nucleico conhecidas na técnica para amostras citológicas e histológicas.
Tais técnicas incluem, por exemplo, hibridização in situ (ISH), hibridização fluorescente in situ (FISH; incluindo FISH multi cores, Fiber- FISH, etc.), hibridização cromogênica in situ (CISH), hibridização de prata in situ (SISH), hibridização de genoma comparativo (CGH), pinturas de cro- mossomo, e disposições in situ.
Em geral, hibridização técnicas tais como CGH, FISH, CISH, e SISH, empregam sondas grandes, principalmente inespecíficas de ácido nucleico que hibridizam com rigorosidade variável para genes ou fragmentos Í de gene nos cromossomas celulares. Tais sondas podem ser derivadas de clones cósmicos, clones YAC, ou outros fragmentos de DNA clonados. O | uso de sondas grandes torna a técnica de hibridização in situ muito sensível. * 5 Entretanto, o uso bem sucedido de sondas genômicas grandes em ensaios tradicionais de hibridização depende do bloqueio do manchamento indeseja- do de base derivadas de, por exemplo, sequências repetitivas que estão presentes em todo o genoma. Tais etapas de bloqueio são demoradas e ca- ras. Como descrito aqui, os métodos e composições da invenção vantajo- —samente reduzem e/ou eliminam a necessidade de tais etapas de bloqueio. Entretanto, em uma modalidade, sequências repetitivas podem ser suprimi- das de acordo com os métodos conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito em PCT/US02/30573.
Sondas ligadas podem ser detectadas em amostras citológicas e histológicas diretamente ou indiretamente com fluorocromos (por exemplo, FISH), cromógenos orgânicos (por exemplo, CISH), partículas de prata (por o exemplo, SISH), ou outras partículas metálicas (por exemplo, hibridização por fluorescência facilitada por ouro in situ, GOLDFISH). Desse modo, de- : pendendo do método de detecção, populações celulares obtidas de uma amostra a ser testada podem ser visualizadas por meio de microscopia por fluorescência ou microscopia de luz de campo brilhante convencional. Ensaios de hibridização em amostras citológicas e histológicas são ferramentas importantes para a determinação do número, tamanho, e/ou localização de sequências específicas de DNA. Por exemplo, em CGH, ge- —nomas totais são manchados e comparados com genomas de referência normais para a detecção de regiões com número de cópia aberrante. Tipi- camente, DNA de tecido objeto e de tecido de controle normal é rotulado com diferentes sondas coloridas. Os lagos de DNA são misturados e adicio- nados a uma disseminação de metáfase de cromossomas normais (ou a uma lasca de microdisposição, para CGH de disposição ou matriz). As rela- ções de cores são então comparadas para identificar regiõêês com número de cópia aberrante.
' FISH é tipicamente usado quando imageamento de múltiplas co- res é requerido e/ou quando o protocolo reúne a quantificação de sinais. À técnica geralmente vincula a preparação de uma amostra citológica, sondas * 5 de rotulagem, cromossomas alvo desnaturantes e a sonda, hibridização da sonda para a sequência alvo, e detecção do sinal. Tipicamente, a reação de o hibridização fluorescentemente mancha as sequências alvejadas de modo que sua locação, tamanho, ou número possa ser determinado usando mi- : croscopia por fluorescência, citometria de fluxo, ou outra instrumentação a- dequada. Sequências de DNA variando de genomas inteiros até diversos 7 kilobases podem ser estudadas usando FISH. FISH pode também ser usado : em amplitude de núcleos de metáfase e interfase.
FISH foi usado bem sucedidamente para mapear sequências de DNA repetitivas e de única cópia em cromossomas de metáfase, núcleos de interfase, fibras de cromatina, e moléculas de DNA nuas, e para identificação de cromossoma e análise de cariótipo por meio da localização de grandes o famílias repetidas, tipicamente os DNAs ribossômicos e famílias de disposi- ção tandem maiores. Uma das mais importantes aplicações para FISH foi na O detecção de sequências de DNA de única cópia, Em particular genes rela- —cionados com doença em humanos e outras espécies de modelo eucariótico, e a detecção de agentes infecciosos. FISH pode ser usado para detectar, por exemplo, aneuploidia cromossômica em diagnósticos prenatais, cânce- res hematológicos, e tumores sólidos; anormalidades de gene tais como amplificações de oncogene, deleções de gene, ou fusões de gene; anorma- lidades estruturais cromossômicas tais como translocations, duplicações, inserções, ou inversões; síndromes de gene contíguas tais como síndrome de microdeleção; os efeitos genéticos de várias terapias; ácidos nucleicos virais em células somáticas e sítios de integração viral em cromossomas; etc. Em multicores de FISH, cada cromossoma é manchado como uma cor separada, possibilitando alguém determinar os cromossomas nor- E e MM | mais dos quais os cromossomas anormais são derivados.
Tais técnicas in- cluem FISH multiplex (m-FISH; Speicher e outros Nat.
Genet., 12:368-75 (1996)), cariotipagem espectral (SKY; Schrock e outros, Science, 273:494-97 (1996)), rotulagem de relação binária combinada (COBRA; Tanke e outros, * 5 Eur dJ Hum.
Genet. 7:2-11 (1999)), cariotipagem por mudança de cor (He- negariu e outros, Nat.
Genet., 23:263-64 (1999)), faixa de cor de espécies É cruzadas (Muller e outros, Hum.
Genet., 100:271-78 (1997)), faixa multicolor de resolução elevada (Chudoba e outros, Cytogenet.
Cell Genet., 84:156-60 (1999)), multiplex FISH telomérico (TM-FISH; Henegariu e outros, Lab.
In- 10 vest, 81:483-91(2001)), FISH de Sinal de divisão(ssFISH), e FISH de sinal o de fusão.
CISH e SISH podem ser usado para muitas das mesmas aplica- ções como FISH, e têm a vantagem adicional de prover a análise da morfo-
logia de tecido subjacente, por exemplo em aplicações de histopatologia.
As composições da invenção podem também ser usadas total- 15 mente ou parcialmente em todos os tipos de técnicas de biologia molecular envolvendo hibridização, incluindo manchamento e sondagem (por exemplo, Southem, Northern, etc.), disposições, e técnicas de amplificação incluindo PCR tradicional, RT-PCR, PCR mutacional, PCR assimétrico, PCR de partida -” quente, PCR inversa, PCR multiplex, PCR aninhada, PCR quantitiativa, e PCR in situ, PCR in situ é uma reação de cadeia de polimerase que ocorre dentro de uma célula sobre um s/ide, por exemplo, as amostras de citologia e histologia descritas acima.
Tipicamente, após aderir a amostra a um slide de microscópio, as células são reidratadas e permeabilizadas, e então com- binadas com uma mistura apropriada de reagentes PCR incluindo polimera- se, dNTPs,e iniciadores.
A PCR pode ser realizada em um instrumento de- dicado, tais como o GeneAmp PCR in situ System 1000 (Perkin Elmer Bi- osystems, Foster City, CA), e o produto amplificado pode ser detectado u- sando sondas rotuladas ou incorporando dNTP'ss rotuladas durante a amplifi- cação.
As composições da invenção melhorarão a eficiência de análise de PCR tradicional e in situ, por exemplo, reduzindo as temperaturas de desna- turação e hibridização e/ou o tempo requerido a fim de realizar os ciclos de
' , 60 amplificação. ' C. Condições de Hibridização | : Os métodos de hibridização usando as composições da inven- ção podem envolver a aplicação das composições a uma amostra compre- ' 5 endendo uma sequência alvo de ácido nucleico, mais provavelmente em uma forma de filamento duplo. Habitualmente, a fim de assegurar o acesso o para a sonda hibridizar com a sequência alvo, a amostra e composição são aquecidas para desnaturar os ácidos nucleicos alvo. Durante a desnaturação '. o solvente aprótico polar interage com a sequência e facilita a desnaturação doalvoe o retemperamento da sonda para o alvo. Os solventes apróticos 7 polares especificados na presente invenção aceleram este processo consi- . deravelmente e reduzem a severidade e toxicidade das condições de hibridi- zação em comparação com a formamida. Hibridizações usando as composições da invenção podem ser realizadas usando a mesma metodologia de ensaio como para hibridizações realizadas com soluções tradicionais. Entretanto, as composições da inven- oo ção permitem tempo mais curto de hibridizações. Por exemplo, o pré- tratamento térmico, etapas de digestão, desnaturação, hibridização, lava- O gem, e montagem podem usar as mesmas condições em termos de volu- mes, temperaturas, reagentes e tempos de incubação como para as solu- ções tradicionais. Uma grande variação existe nos protocolos de hibridização tradicionais conhecidos na técnica. Por exemplo, alguns protocolos especifi- cam uma etapa de desnaturação separada de nucleotídeos de filamento du- plo potenciais sem sonda presente, antes da seguinte etapa de hibridização. As composições da invenção podem ser usadas em qualquer dos protocolos de hibridização tradicionais conhecidos na técnica.
Alternativamente, ensaios usando as composições da invenção podem ser mudados e otimizados a partir de metodologias tradicionais, por exemplo, diminuindo o tempo de hibridização, aumentando ou diminuindo as temperaturas de desnaturação e/ou hibridização, e/ou aumentando ou dimi- nuindo os volumes de hibridização. | | ! PSsssssmm——nn
Por exemplo, em algumas modalidades, as composições da in- : venção produzirão sinais fortes quando a temperatura de desnaturação du- rante 60 a 100ºC e a temperatura de hibridização é de 20 a 60ºC. Em outras i modalidades, as composições da invenção produzirão sinais fortes quando a * 5 temperaturade desnaturação durante 60 a 70ºC, 70 a 80ºC, 80 a 90ºC ou 90 a 100ºC, e a temperatura de hibridização é de 20 a 30ºC, 30 a 40ºC, 40 a ' 50ºC, ou 50 a 60ºC. Em outras modalidades, as composições da invenção produzirão sinais fortes quando a temperatura de desnaturação durante 72, 82, ou 92ºC, e a temperatura de hibridização é de 40, 45, ou 50ºC. Em outras modalidades, as composições da invenção produzirão sinais fortes quando o tempo de desnaturação durante O a 10 minutos e o : tempo de hibridização durante O minuto a 24 horas. Em outras modalidades, as composições da invenção produzirão sinais fortes quando o tempo de desnaturação durante O a 5 minutos e o tempo de hibridização durante de O minutoa8 horas. Em outras modalidades, as composições da invenção pro- duzirão sinais fortes quando o tempo de desnaturação durante O, 1, 2,3, 4, o ou 5 minutos, e o tempo de hibridização durante O minuto, 5 minutos, 15 mi- nutos, 30 minutos, 60 minutos, 180 minutos, ou 240 minutos. Será entendido O por aqueles versados na técnica que em alguns casos, por exemplo, detec- çãodeRNA,a etapa de desnaturação não é requerida.
Consequentemente, hibridizações usando as composições da invenção podem ser realizadas em menos do que 8 horas. Em outras moda- lidades, a hibridização é realizada em menos do que 6 horas. Em ainda ou- tras modalidades, a hibridização é realizada dentro de 4 horas. Em outras modalidades, a hibridização é realizada dentro de 3 horas. Em ainda outras modalidades, a hibridização é realizada dentro de 2 horas. Em outras moda- lidades, a hibridização é realizada dentro de 1 hora. Em ainda outras moda- lidades, a hibridização é realizada dentro de 30 minutos. Em outras modali- dades, a hibridização pode ocorrer dentro de 15 minutos. A hibridização po- de ainda ocorrer dentro de 10 minutos ou em menos do que 5 minutos. As figuras 1 e 2 ilustram um curso de tempo típico para hibridizações realizadas em amostras histológicas e citológicas, respectivamente, usando as compo- ' sições da invenção comparadas com as hibridizações usando as soluções tradicionais. i Quando o tempo de hibridização muda, a concentração de son- 7 5 da pode também ser variada a fim de produzir sinais fortes e/ou reduzir a base. Por exemplo, quando o tempo de hibridização diminui, a quantidade ' de sonda pode ser aumentada a fim de melhorar intensidade de sinal. Por outro lado, quando o tempo de hibridização diminui, a quantidade de sonda pode ser diminuída a fim de melhorar o manchamento de base. As composições da invenção surpreendentemente eliminam a 7 necessidade de uma etapa de bloqueio durante a hibridização melhorando a . intensidade de sinal e de base bloqueando a ligação de, por exemplo, se- ] quências repetitivas ao alvo DNA. Desse modo, não existe nenhuma neces- sidade de usar DNA humano total, PNA de bloqueio, DNA de COT-1, ou DNA de qualquer outra fonte como um agente de bloqueio. Entretanto, os níveis de base podem ser também reduzidos adicionando-se agentes que ao reduzem a ligação não específica, tal como a uma membrana celular, tal como pequenas quantidades de DNA humano total ou DNA de origem não - humana (por exemplo, DNA de esperma de salmão) para uma reação de hibridização usando as composições da invenção.
As composições aquosas da invenção também fornecem a pos- sibilidade de consideravelmente reduzir a concentração de sequência de ácido nucleicos incluída na composição. Geralmente, a concentração de sondas pode ser reduzida de 2 a 8 vezes em comparação com as concen- trações tradicionais. Por exemplo, se as sondas HER2 de DNA e sondas CEN17 de PNA são usadas nas composições da invenção, suas concentra- ções podem ser reduzidas em %4 e %, respectivamente, em comparação com suas concentrações em soluções de hibridização tradicionais. Este aspecto, juntamente com a ausência de qualquer requisito para bloqueio de DNA, tal —como PNA de bloqueio ou COT1, permite um volume de sonda aumentado em sistemas de instrumento automatizados, em comparação com o volume tradicional de 10 ul. usado em sistemas de composições tradicionais, que ' reduzem a perda devido à evaporação, como descrito em maiores detalhes abaixo. i A redução da concentração de sonda também reduz a base.
En- * 5 tretanto, aredução da concentração de sonda está inversamente relaciona- da com o tempo de hibridização, isto é, quando menor a concentração, mai- ' or o tempo de hibridização requerido.
Apesar disso, mesmo quando concen- trações de sonda extremamente baixas são usadas com as composições aquosas da invenção, o tempo de hibridização for ainda mais curto do que com tradicional soluções. ” As composições da invenção frequentemente permitem melho- . res relações de sinal-para-ruído do que as soluções de hibridização tradicio- ' nais.
Por exemplo, com certas sondas, uma hibridização de uma hora com as composições da invenção produzirão similar base e sinais mais fortes do que um hibridização durante a noite em uma solução tradicional.
A base não é observada quando nenhuma sonda é adicionada. o.
Métodos de ensaio tradicionais podem também ser mudados e otimizados quando usando as composições da invenção dependendo de se O o sistema é manual, semiautomatizado, ou automatizado.
Por exemplo, um sistema semi ou automatizado beneficiar-se-á do curto tempo de hibridiza- ções obtido com as composições da invenção.
O curto tempo de hibridiza- ção pode reduzir as dificuldades encontradas quando soluções tradicionais são usadas em tais sistemas.
Por exemplo, um problema com sistemas semi e automatizados é que significante evaporação da amostra pode ocorrer du- rantea hibridização, visto que tais sistemas requerem pequenos volumes de amostra (por exemplo, 10-150 uL), temperaturas elevadas, e tempos de hi- bridização prolongados (por exemplo, 14 horas). Desse modo, as propor- ções dos componentes em soluções de hibridização tradicionais são razoa- velmente invariáveis.
Entretanto, visto que as composições da invenção permitem hibridizações mais rápidas, a evaporação é reduzida, permitindo flexibilidade aumentada nas proporções dos componentes em composições de hibridização usadas em sistemas semi e automatizados. : Por exemplo, dois instrumentos automatizados foram usados pa- . ra realizar hibridizações usando as composições da invenção.
Composições compreendendo 40% de carbonato de etileno foram usadas no aparato des- * 5 critono pedido PCT DK2008/000430, e composições compreendendo 15% de carbonato de etileno foram usadas no HYBRIMASTER HS-300 (Aloka ' CO.
LTD, Japão). Quando as composições da invenção são usadas no HY- BRIMASTER HS-300, o instrumento pode realizar rápida hibridização FISH com água em lugar da tradicional mistura de formamida tóxica, desse modo melhorando a segurança e reduzindo a evaporação.
Se faixas umectadas - com água forem ligadas à tampa da parte interna da unidade de reação do . instrumento Aloka (câmara de hibridização) como descrito no Pedido de Pa- tente dos Estados Unidos Pub.
No. 2005/0281711, a evaporação é reduzida ainda mais.
Outro problema com análise de imageamento automatizado é o número de imagens necessárias, a quantidade gigantesca de local para ar- 2 mazenagem requerida, e o tempo requerido para fazer as imagens.
As com- posições da invenção tratam este problema produzindo sinais muito fortes o em comparação com tradicionais soluções.
Por causa dos sinais muito fortes produzidos pelas composições da invenção, o imageamento pode ser feito em menor magnificação do que a requerida para soluções tradicionais e po- de também ser detectado e analisado, por exemplo, por algorítmos.
Visto que o plano focal torna-se mais amplo com menor magnificação, as compo- sições da invenção reduzem ou eliminam a necessidade de tomar seções seriais de uma amostra.
Como um resultado, o imageamento total é muito mais rápido, visto que as composições da invenção requerem seções menos ou nenhuma secção serial e cada imagem abrange área muito maior.
Além disso, o tempo total para a análise é mais rápido, visto que os arquivos de imagem totais são muito menores.
Desse modo, as composições e métodos da invenção solucio- nam muitos dos problemas associados com tradicional hibridização soluções e métodos. ' A descrição pode ser entendida mais claramente com o auxílio ' dos exemplos não limitantes que seguem, que constituem modalidades pre- feridas das composições de acordo com a descrição. Exceto nos exemplos, 7 5 ou ondede outromodo indicado, todos os números expressando quantida- des de ingredientes, condições de reação, e assim em diante, usados na ] especificação e reivindicações devem ser entendidos como sendo modifica- dos em todos os casos pelo termo "cerca de". Consequentemente, a menos que indicado ao contrário, os parâmetros numéricos mencionados na seguin- te especificação e reivindicações anexas são aproximações que podem vari- ” ar dependendo das propriedades pesquisadas desejadas a serem obtidas . aqui. Verdadeiramente, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da i doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações cada parâmetro nu- mérico deve ser construído considerando o número de dígitos significantes e aproximações arredondadas habituais. Não obstante que as faixas numéricas e parâmetros mencionan- a. do o amplo escopo são aproximações, os valores numéricos mencionados no exemplo específico são reportados tão precisamente quanto possível. -” Qualquer valor numérico, entretanto, inerentemente contém certos erros ne- cessariamente resultantes do desvio padrão encontrado em suas medições de teste respectivas. Os exemplos que seguem ilustram a presente invenção e não devem de modo algum ser considerados como limitantes da invenção.
EXEMPLOS Referência será agora feita em detalhes às modalidades especí- ficas da invenção. Ao mesmo tempo em que a invenção será descrita em conjunto com estas modalidades, entende-se que eles não se destinam a limitar a invenção àquelas modalidades. Ao contrário, a invenção é destina- se a abranger alternativas, modificações, e equivalentes, que podem ser in- cluídos na invenção, como definido pelas reivindicações anexas. Os reagentes usados nos seguintes exemplos são de Dako's Histologia FISH Accessory Kit (K5599) e Citologia FISH Accessory Kit
(K5499) (Dako Denmark A/S, Glostrup Denmark). Os kits contêm todos os ' reagentes essenciais, exceto para sonda, requeridos para completar um : procedimento FISH para espécimes de porção de tecido embutidas em para- fina, fixadas por formalina. Todas as amostras foram preparadas de acordo - 5 coma descrição do fabricante. O Hibridizador Dako (S2450, Dako) foi usado para as etapas de digestão, desnaturação, e hibridização.
' Avaliação de slides FISH foi realizada dentro de uma semana após a hibridização usando um microscópio de fluorescência Leica DMG6000B, equipado com Filtros simples DAPI, FITC, Vermelho Texas e filtro duplo FITC/Vermelho Texas sob a objetiva de óleo de 10x, 20x, 40x, e 100x. . A avaliação de slides CISH foi realizada usando um microscópio . de luz Olympus BX51, sob a objetiva de 4x, 10x, 20x, 40x, e 60x. Nos exemplos que seguem, "sulfato de dextrana" refere-se ao sal de sódio de sulfato de dextrana (D8906, Sigma) tendo um peso molecu- . 15 lar M, > 500,000, Todas as concentrações de solventes apróticos polares são fornecidas como percentagens v/v. Tampão de fosfato refere-se a uma 2 solução tamponada por fosfato contendo NaH2PO,,, 2H2O (di-hidrato dibási- co de fosfato de sódio) e Na2HPO,, H7O (mono-hidrato monobásico de fosfa- O to de sódio). Tampão de citrato refere-se a uma solução tamponada por ci- trato contendo citrato de sódio (Na3CgHsO;, 2H20; 1,06448, Merck) e mono- hidrato de ácido cítrico (CGH3O7, H2O; 1,00244, Merck). Procedimento FISH/CISH de histologia geral (Exemplos 1 a 20) Os slides com porções de humanos (amígdalas, carcinoma de mama, rim e cólon) de múltiplas disposições de tecido embutidas em parafi- nafixada por formalina (FFPE) cortadas foram cozidos a 60ºC durante 30 a 60 minutos, desparafinados em banhos de xileno, reidratados em banhos de etanol e em seguida transferidos para Tampão de Lavagem. As amostras foram em seguida pré-tratadas em Solução de Pré-tratamento em um míni- mo de 95ºC durante 10 minutos e lavadas 2 x 3 min. As amostras foram em seguida digeridas com Pepsin RTU a 37ºC durante 3 minutos, lavadas 2 x 3 minutos, desidratadas em uma série de evaporações de etanol, e secadas por ar.
As amostras foram em seguida incubadas com 10 ul de sonda FISH ' como descrito sob os experimentos individuais.
As amostras foram em se- : guida lavadas por Lavagem Rigorosa a 65ºC 10 minutos, em seguida lava- das 2 x 3 minutos, em seguida desidratadas em uma série de evaporações * 5 de etanol, e secadas por ar.
Finalmente, os s/ides foram montados com 15 ul de Meio de Montagem Antidesbotamento.
Quando o manchamento foi : completado, observadores treinados para estimar a intensidade de sinal, morfologia, e base dos slides manchados realizaram a classificação.
Procedimento FISH de citologia geral (Exemplos 21 a 22) Slides com preparação de metáfases foram fixados em 3,7% de ” formaldeído durante 2 minutos, lavados 2 x 5 minutos, desidratados em uma . série de evaporações de etanol, e secados por ar.
As amostras foram em seguida incubadas com 10 ul. de sonda FISH como descrito sob os experi- mentos individuais.
As amostras foram em seguida lavadas por Lavagem Rigorosa a 65ºC 10 minutos, em seguida lavadas 2 x 3 minutos, em seguida desidratadas em uma série de evaporações de etanol, e secadas por ar.
Fi- 2 nalmente, os slides foram montados com 15 ul. de Meio de Montagem Anti- desbotamento.
Quando o manchamento foi completado, observadores trei- -” nados para estimar a intensidade de sinal e base dos slides manchados rea- lizaram a classificação como descrito na classificação para normas para por- ções de tecido.
Normas de classificação de porções de tecido As intensidades de sinal foram avaliadas em uma escala de 0 a 3 com O significando nenhum sinal e 3 equiparando-se a um sinal forte.
As estruturas célula/tecido são avaliadas em uma escala de O a 3 com O signifi- cando nenhuma estrutura e nenhum limite de núcleos e 3 equiparando-se à estrutura intacta e limites claros de núcleos.
Entre 0 e 3 existem graus adi- cionais 0,5 a parte do que o observador pode estimar intensidade de sinal, estrutura de tecido, e base.
A intensidade de sinal é classificada após um sistema graduado em uma escala de 0 a 3.
O Nenhum sinalé observado. ' 1 Aintensidade de sinal é fraca. . 2 Aintensidade de sinal é moderada. 3 Aintensidade de sinal é forte. " O sistema de classificação permite o uso de 4 graus.
A estrutura de tecido e nuclear é classificada após um sistema ' graduado em uma escala de 0 a 3. o As estruturas de tecido e limites nucleares são completa- mente destruídos. 1 As estruturas de tecido e/ou limites nucleares são ruins. 7 Este grau inclui situações onde algumas áreas têm núcleos vazios. . 2 As estruturas de tecido e/ou limites nucleares são obser- ' vados, porém os limites nucleares não são claros.
Este grau inclui situações onde alguns núcleos são vazios. 3 As estruturas de tecido e limites nucleares são intactos e claros. oo O sistema de classificação permite o uso de % grau.
A base é classificada após um sistema graduado em uma esca- o lade0a3. O Poucaa nenhuma base é observada. 1 Alguma base. 2 Basemoderada. 3 Base elevada.
O sistema de classificação permite o uso de % graus.
Exemplo1 Este exemplo compara a intensidade de sinal e morfologia celu- lar de amostras tratadas com as composições da invenção ou soluções de hibridização tradicionais como uma função de temperatura de desnaturação.
Composição de sonda FISH |: 10% de sulfato de dextrana, NaCl! a300mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de formamida (15515-026, Invi- trogen), 5 uM blocking PNAs (vide Kirsten Vang Nielsen e outro, PNA Sup-
pression Method Combined with Fluorescence In situ Hybridisation (FISH) ' Technique inPRINS e PNA Technologies in Chromosomal Investigation, Ca- : pítulo 10 (Franck Pellestor ed.) (Nova Science Publishers, Inc. 2006)), 10 ng/ul. de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas * 5 (RP11-1143E20,tamanho 192 kb). Composição de sonda FISH Il: 10% de sulfato de dextrana, NaCl ' a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de etileno (03519, Fluka), 5 uM de PNAs de bloqueio, 10 ng/ul de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas (RP11-1143E20, tamanho 192 kb). Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram misturadas “ antes do uso.
As sondas FISH foram desnaturadas como indicado durante 5 . minutos e hibridizadas a 45ºC durante 60 minutos. ' Resultados: Temperatura de desna- Formamida | EC ” Be o e ea Bo | oC Sinais classificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objeti- vade20x Exemplo 2 Este exemplo compara a intensidade de sinal e manchamento de base de amostras tratadas com as composições da invenção ou soluções de hibridização tradicionais como uma função de tempo de hibridização.
Composição de sonda FISH |: 10% de sulfato de dextrana, NaCl a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de formamida, 5 uM de PNAs de bloqueio, 10 ng/uL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Verme- lho Texas.
Composição de sonda FISH Il: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a300mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de etileno, 5 uM de
PNAs de bloqueio, 10 ng/ul. de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada ' com Vermelho Texas. . Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram misturadas antes do uso.
As sondas FISH foram incubadas a 82ºC durante 5 minutos e * 5 emseguidaa45ºC durante 14 horas, 4 horas, 2 horas, 60 minutos, 30 minu- tos, 15 minutos, O minuto. ' Resultados: Tempo de hibridiza- Formamida | EC ' : | [soma do Bs do = | [min jo ao ko x | o em | Sinais classificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objetiva o de 20x.
Exemplo3 Este exemplo compara a intensidade de sinal de amostras trata- das com as composições da invenção tendo diferentes solventes apróticos polares ou soluções de hibridização tradicionais.
Composição de sonda FISH |: 10% de sulfato de dextrana, NaCl a300mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de formamida, 5 uM de PNAs de bloqueio, 10 ng/ul de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Verme- lho Texas.
Composição de sonda FISH II: 10% de sulfato de dextrana, NaCl a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de etileno (EC), 5 uMde PNAs de bloqueio, 10 ng/ul de sonda de DNA de gene CCND1 rotu- lada com Vermelho Texas.
Composição de sonda FISH Ill: 10% de sulfato de dextrana, Na- ] CI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de propileno BR (PC) (540013, Aldrich), 5 uM de PNAs de bloqueio, 10 ng/ul. de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas. 15 Composição de sonda FISH IV: 10% de sulfato de dextrana, NaCl a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% Sulfolano (SL) (T22209, ] Aldrich), 5 uM de PNAs de bloqueio, 10 ng/ul. de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas.
Composição de sonda FISH V: 10% de sulfato de dextrana, Na- Cla300mM, tampão de fosfato a 5 MM, 40% Aceto nitrila (AN) (CO2CIIX, ” Lab-Scan), 5 uM de PNAs de bloqueio, 10 ng/uL de sonda de DNA de gene BR CCND1 rotulada com Vermelho Texas.
Composição de sonda FISH VI: 10% de sulfato de dextrana, NaCl a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% y-butirolactona (GBL) (B103608, Aldrich), 5 uM de PNAs de bloqueio, 7,5 ng/uL de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas. 2 Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram misturadas antes do uso.
As sondas FISH foram incubadas a 82ºC durante 5 minutos e OU em seguida a 45ºC durante 60 minutos.
Resultados: Formamida EC PC SL AN GBL Sinais classificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objetiva de 20x.
Exemplo 4 Este exemplo compara a intensidade de sinal de amostras trata- das com as composições da invenção tendo diferentes concentrações de solvente aprótico polar.
Composição de sonda FISHs: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 10-60% de carbonato de etileno (co- ' mo indicado), 5 uM de PNAs de bloqueio, 7,5 ng/ul. de sonda de gene de : DNA constante de IGK rotulada por Vermelho Texas ((CTD-3050E15, RP11- 1083E8; tamanho 227 kb) e 7,5 ng/ul de sonda de DNA de gene variável * 5 porliGK rotulada por FITC (CTD-2575M21, RP11-122B6, RP11-316G9; ta- manho 350 e 429 kb).
' Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram misturadas antes do uso. As sondas FISH foram incubadas a 82ºC durante 5 minutos e em seguida a 45ºC durante 60 minutos.
Resultados: : de Sinal Texas Sinais classificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objetiva s de 20x. Exemplo 5 o Este exemplo compara a intensidade de sinal e intensidade de base de amostras tratadas com as composições com e sem bloqueio de PNA. Composição de sonda FISHs: 10% de sulfato de dextrana, NaCl a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de etileno, 7,5 ng/ul de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas. Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram misturadas antes do uso. As sondas FISH foram incubadas a 82ºC durante 5 minutos e em seguida a 45ºC durante 60 minutos.
Resultados: . ' Sinais classificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objetiva i de 20x.
Exemplo 6 Este exemplo compara a intensidade de sinal de amostras trata- das com as composições da invenção como uma função de concentração de 7 sonda e tempo de hibridização. - Composição de sonda FISHs: 10% de sulfato de dextrana, NaCl a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de etileno, e 10, 7,5,50u2,5ng/ul de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Verme- lho Texas (como indicado). Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram misturadas SS antes do uso.
As sondas FISH foram incubadas a 82ºC durante 5 minutos e em seguida a 45ºC durante 3 horas, 2 horas e 1 hora. “15 Resultados: Tempo de hi- 10 ng/ul 7,5ng/ul | 5 no/ul. | 2,5 no/ul Sinais classificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objetiva de 20x.
Exemplo 7 Este exemplo compara a intensidade de sinal de amostras trata- dascomas composições da invenção como uma função de concentrações de sal, fosfato, e tampão.
Composição de sonda FISHs: 10% de sulfato de dextrana, ([Na- ' CI], [tampão de fosfato], ([Tampão TRIS] como indicado em Resultados), 40% . de carbonato de etileno, 7,5 ng/ulL de sonda de DNA de gene CCND1 rotu- lada com Vermelho Texas. "s Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram misturadas antes do uso. As sondas FISH foram incubadas a 82ºC durante 5 minutos e ' em seguida a 45ºC durante 60 minutos. Resultados: "E E | soomm | 1o0mm | omm | | . fosfato [0 mM | fosfato [5 mM ms A fosfato [35 mM — eee CA [5 TRIS [40 mM CU Sinais classificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objetiva de20x Exemplo 8 Este exemplo compara a intensidade de sinal de amostras trata- das com as composições da invenção como uma função de concentração de sulfato de dextrana.
Composição de sonda FISHs: O, 1, 2, 5, ou 10% de sulfato de dextrana (como indicado), NaCl a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de etileno, 5 ng/ulL de sonda de DNA de gene SIL-TAL1 rotu- lada por Vermelho Texas (RP1-278013; tamanho 67 kb) e 6 ng/uL FITC SIL- TAL1 (ICRFc112-112C1794, RP11-184J23, RP11-8J9, CTD-2007B18, 133B9; tamanho 560 kb).
Fases de viscosidade diferente, se presentes, foram misturadas antes do uso.
As sondas FISH foram incubadas a 82ºC durante 5 minutos e ' em seguida a 45ºC durante 60 minutos.
Nenhum bloqueio. . Resultados: ' Sonda Vermelho Texas FITC Probe ' | NOTA: este experimento não produziu resultados classificados como "3" por : 5 quea sonda rotulada por Vermelho Texas SIL-TAL1 é apenas 67 kb e foi de uma preparação não otimizada.
Exemplo 9 Este exemplo compara a intensidade de sinal de amostras trata- das com as composições da invenção como uma função de concentrações - * 10 desulfatodedextrana, sal, fosfato, e solvente aprótico polar.
Composição de sonda FISH la: 34% de sulfato de dextrana, Na- o Cl a O MM, tampão de fosfato a O MM, 0% de carbonato de etileno, 10 ng/ul de sonda de DNA de gene HER?2 rotulada com Vermelho Texas (tamanho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.
Composição de sonda FISH lb: 34% de sulfato de dextrana, Na- CI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 0% de carbonato de etileno, 10 ng/ul de sonda de DNA de gene HER?2 rotulada com Vermelho Texas (ta- manho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.
Composição de sonda FISH lc: 34% de sulfato de dextrana, Na- Cla600mM, tampão de fosfato a 10 mM, 0% de carbonato de etileno, 10 ng/ul. de sonda de DNA de gene HER?2 rotulada com Vermelho Texas (ta- manho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.
Composição de sonda FISH lla: 32% de sulfato de dextrana, NaCl a O mM, tampão de fosfato a O mM, 5% de carbonato de etileno, 10 ng/uL de sonda de DNA de gene HER?2 rotulada com Vermelho Texas (ta- ' manho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM. . Composição de sonda FISH Illb: 32% de sulfato de dextrana, NaCl a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 5% de carbonato de etileno, 10 * 5 ng/ul de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas (ta- manho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.
Composição de sonda FISH llc: 32% de sulfato de dextrana, NaCl a 600 mM, tampão de fosfato a 10 mM, 5% de carbonato de etileno, 10 ng/ul de sonda de DNA de gene HER?2 rotulada com Vermelho Texas (ta- —manho 218 kb)e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM. 7 Composição de sonda FISH Illa: 30% de sulfato de dextrana, . NaCl a O mM, tampão de fosfato a O MM, 10% de carbonato de etileno, 10 ng/ul de sonda de DNA de gene HER?2 rotulada com Vermelho Texas (ta- manho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.
Composição de sonda FISH Illb: 30% de sulfato de dextrana, NaCl a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 10% de carbonato de etileno, 10 o ng/ul. de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas (ta- manho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM. o Composição de sonda FISH Illlc: 30% de sulfato de dextrana, —NaCla600 mM, tampão de fosfato a 10 mM, 10% de carbonato de etileno, 10 ng/ul de sonda de DNA de gene HER?2 rotulada com Vermelho Texas (tamanho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.
Composição de sonda FISH IVa: 28% de sulfato de dextrana, NaCl a O mM, tampão de fosfato a O MM, 15% de carbonato de etileno, 10 —ng/ul de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas (ta- manho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.
Composição de sonda FISH IVb: 28% de sulfato de dextrana, NaCl a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 15% de carbonato de etileno, 10 ng/ul. de sonda de DNA de gene HER?2 rotulada com Vermelho Texas (ta- —manho218 kb)e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.
Composição de sonda FISH IVc: 28% de sulfato de dextrana,
NaCl a 600 mM, tampão de fosfato a 10 mM, 15% de carbonato de etileno, ' 10 ng/ul. de sonda de DNA de gene HER?2 rotulada com Vermelho Texas . (tamanho 218 kb) e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM. Referência V de sonda FISH: Frasconete de venda padrão de 7 5 misturadesonda PharmDx HER2 (K5331, Dako) contendo PNA de bloqueio. Hibridização durante a noite durante 20 horas.
' Todas as composições estavam presentes como uma fase úni- ca. As sondas FISH foram incubadas a 82ºC durante 5 minutos e em segui- da a 45ºC durante 60 minutos sem nenhum bloqueio, exceto para Referên- ciaV de sonda FISH, que tinha bloqueio de PNA e foi hibridizada durante 20 7 horas.
' Resultados: o mesdadedesma ==> | sondadennas [sondadernas — | | composigao a fo [composição fo .. Teemposiçãa tm | NOTA: composição IVa forneceu fortes sinais de DNA sem nenhum sal. Isto não é possível com composições FISH padrões, onde a ligação de DNA é dependente do sal.
Exemplo 10 , Este exemplo compara a intensidade de sinal de amostras trata- . das com as composições da invenção como uma função de solvente apróti- co polar e concentração de sulfato de dextrana sob condições de sal elevado * 5 (4xonomal.
Composição de sonda FISH |: 0% de carbonato de etileno, 29% ' de sulfato de dextrana, NaCl a 1200 mM, tampão de fosfato a 20 mM, 10 ng/OL de sonda de DNA de gene HER?2 rotulada com Vermelho Texas e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.
A composição foi uma faseúnica. 7 Composição de sonda FISH Il: 5% de carbonato de etileno, 27% . de sulfato de dextrana, NaCl a 1200 mM, tampão de fosfato a 20 mM, 10 ng/ul de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.
A composição foi uma faseúnica.
Composição de sonda FISH Ill: 10% de carbonato de etileno, + 25% de sulfato de dextrana, NaCl a 1200 mM, tampão de fosfato a 20 mM, 10 ng/ul de sonda de DNA de gene HER?2 rotulada com Vermelho Texas e O sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.
A composição foi uma faseúnica.
Composição de sonda FISH IV (não testada): 20% de carbonato de etileno, 21% de sulfato de dextrana, NaCl a 1200 mM, tampão de fosfato a 20 mM, 10 ng/uL de sonda de DNA de gene HER?2 rotulada com Vermelho Texas e sonda de PNA CEN-7 rotulada com FITC a 50 nM.
A composição tinhaduas fases.
Resultados: | Imensiadedesnar =— ==> | | ———— sondadennas [sondadePNAs |
LT eomposigaa tv . NOTA: composição !l forneceu bons sinais de DNA com apenas 5% de EC e fortes sinais de DNA com 10% de EC. " Exemplo 11 Este exemplo compara a intensidade de sinal e base de amos- “65 trastratadas com diferentes fases das composições da invenção.
Composição de sonda FISH: 10% de sulfato de dextrana, NaCl a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% de carbonato de etileno, 8 ng/ul de sonda de DNA de gene HER2 rotulada com Vermelho Texas e sonda de 7 PNA CEN-17 rotulada com FITC a 600 nM.
As sondas FISH foram incuba- .- 10 dasa82ºC durante 5 minutos e em seguida a 45ºC durante 60 minutos.
Ne- nhum bloqueio.
Resultados: Fr “““O sas ga ” CU Mistura de Fases | 2% 3 + Superior e Inferi- or NOTA: a fase superior teve mais base do que a fase inferior nestes experi- mentos.
Exemplo 12 Este exemplo é similar ao exemplo anterior, porém usa uma dife- rente sonda de DNA e GBL em lugar de EC.
Composição de sonda FISH: 10% de sulfato de dextrana, NaCl a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% GBL, 10 ng/ul de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas e sonda de PNA CEN-17 rotulada com FITC a 600 nM.
As sondas FISH foram incubadas a 82ºC durante 5 minutos e em seguida a 45ºC durante 60 minutos. Nenhum bloqueio. ] Resultados:
LEE : | Exemplo 13 Este exemplo examina o número de fases nas composições da invenção como uma função de solvente aprótico polar e concentração de ' sulfato de dextrana. s Composição de sonda FISHs: 10 ou 20% de sulfato de dextrana; NaCl a 300 mM; tampão de fosfato a 5 mM; O, 5, 10, 15, 20, 25, 30% de EC; ng/ulL de sonda. 10 Resultados: o 10% de Dextrana 20% de Dextrana Po | o e eo o | NOTA: 15% de EC, 20% de sulfato de dextrana produz as intensidades de sinal elevadas mais agudas da solução de uma fase acima. Duas fases 20% de EC têm intensidades de sinal ainda maiores do que 15%. (Dados não mostrados). Exemplo 14 Este exemplo compara a intensidade de sinal e base de amos- tras tratadas com diferentes composições da invenção como uma função de concentração de sonda e tempo de hibridização. ' Composição de sonda FISH |: 10 ng/ulL de sonda de DNA HER2 . rotulada por TxRed (concentração padrão) e concentração padrão de sonda de PNA CENZ7 rotulada por FITC (50 nM); 15% de EC; 20% de sulfato de 7" 5 dextrana; NaCla600 mM; tampão de fosfato a 10 mM.
Composição de sonda FISH II: 5 ng/ul de sonda de DNA HER2 rotulada por TxRed (1/2 de concentração padrão) e concentração padrão (50 nM) de sonda de PNAs CENT? rotulada por FITC; 15% de EC; 20% de sulfato de dextrana; NaCl a 600 mM; tampão de fosfato a 10 mM.
Composição de sonda FISH Ill: 2,5 ng/ul. de sonda de DNA 7 HER?2 rotulada por TxRed (1/4 de concentração padrão) e % da concentra- - ção padrão (25 nM) de sonda CEN7 de PNAs; 15% de EC; 20% de sulfato de dextrana; NaCl a 600 mM; tampão de fosfato a 10 mM.
Composições |-1ll existiram como uma fase única.
As sondas FI- SHforam incubadas a 82ºC durante 5 minutos e em seguida a 45ºC durante 3 horas, 2 horas e 1 hora. 2 Resultados: Tempo — de DNA PNA B.G. | DNA PNA B.G. |DNA PNA BG.
Sinais classificados como "3" ficaram claramente visíveis em uma objetiva de 20x.
B.G.: Base.
Exemplo15 Este exemplo compara a intensidade de sinal e base de amos- tras tratadas com as composições da invenção como uma função de agente de bloqueio.
Composição de sonda FISHs: 15% de EC; 20% de sulfato de —dextrana; NaCl a 600 mM; tampão de fosfato a 10 mM; 2,5 ng/uL de sonda de DNA HER?2 rotulada por TxRed (1/4 de concentração padrão) e % da ' concentração padrão (300 nM) FITC rotulada CEN17 sonda de PNA.
As a- . mostras foram bloqueadas com: (a) Nenhum; (b) 0,1 uo/ul de COT1 (15279- 011, Invitrogen); (c) 0,3 ug/yul. de COT1; ou (d) 0,1 ug/ul de DNA humano 7 5 Ttotalantesda hibridização usando as composições da invenção.
Todas as amostras estavam presentes como uma fase única.
As sondas FISH foram incubadas a 82ºC durante 5 minutos e em seguida a 45ºC durante 60 minutos.
Resultados: : DNA PNA : | mano total - * 10 NOTA: Os níveis de base sem bloqueio são significantemente menores do que o que é normalmente observado por FISH padrão sem nenhum bloquei- o o.
Ao contrário, se uma composição padrão FISH não contém um agente de bloqueio.
Os sinais normalmente não podem ser lidos.
Exemplo 16 Este experimento compara diferentes modos de remover man- chamento de base usando as composições da invenção.
Todas as composições continham 15% de EC, 20% de sulfato de dextrana, NaCl a 600 mM, tampão de fosfato a 10 mM, 2,5 ng/ulL. sonda HER?2 de DNAs (1/4 de concentração padrão), sonda CEN17 de PNA a 300 nM (1/2 de concentração padrão), e um dos seguintes agentes de redução de base: A) 5 uM PNA de bloqueio (vide Kirsten Vang Nielsen e outro, PNA Suppression Method Combined with Fluorescence In situ Hybridisation (FISH) Technique in PRINS e PNA Technologies in Chromosomal Investiga-
tion, Capítulo 10 (Franck Pellestor ed.) (Nova Science Publishers, Inc. 2006)) ' B) 0,1 ug/ul de COT-1 DNA ' C) 0,1 ua/ul de DNA humano total (THD) (THD não rotulado tra- tado com ondas sonoras) a D) 0,1 ug/ul. de DNA de esperma de salmão cisalhado (AM9680, Ambion) E) 0,1 ug/ul. de DNA de timo de bezerro (D8661, Sigma) F) 0,1 ug/ul. de DNA de esperma de arenque (D7290, Sigma) G) 0,5% de formamida H) 2% de formamida ' 1) 1% de etileno glicol (1,09621, Merck) . J) 1% de glicerol (1,04095, Merck) K) 1% de 1,3-propanodiol (533734, Aldrich) L) 1% de H20 (controle) Todas as amostras estavam presentes como uma fase única.
As sondas foram incubadas a 82ºC durante 5 minutos e em seguida a 45ºC em oo porções de tecido FFPE durante 60 e 120 minutos.
Resultados: i ao/min DNA PNA |PNAdebloqueio — ——>>jeo | x ja 26 1% eort ow mm | a 26 | mo le o ja 3 | Esperma de DNA de salmão (60 > |+o |3 3 | | DNA de Timo de Bezero — 60 — xo |25 3 | ãomin DNA PNA - — |pNAdeespermade arenque 60 = xo [3 3 "> [os%defomamidta — —jeo —1xo | 25 3 | O [e%defomamida — >> o =| 25 3 | | 156 Emeno Glicor — —>úleo ls | as 3 | : “+ j1%degieero je | os 3 | : | 1% de 1,3-Propanodiot — eo —=úbxo d3 25 | [Nenhum — > | | bãs as | o NOTA: todos os agentes de redução de base, exceto para PNA de bloqueio, . mostraram um efeito em redução de base.
Desse modo, bloqueio específico i contra sequências de DNA repetitivas não é requerido.
Exemplo 17 Este experimento compara a intensidade de sinal das fases su- perior e inferior usando dois diferentes solventes apróticos polar.
Composição de sonda FISH |: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% tritiocarbonato de etileno (ET) (E27750, Aldrich), 5 uM de PNAs de bloqueio, 10 ng/uL de sonda de DNA de geneCCNDI1 rotulada com Vermelho Texas.
Composição de sonda FISH Il: 10% de sulfato de dextrana, NaCI a 300 mM, tampão de fosfato a 5 mM, 40% sulfito de glicol (GS) (G7208, Aldrich), 5 uM de PNAs de bloqueio, 10 ng/ul de sonda de DNA de gene CCND1 rotulada com Vermelho Texas.
As sondas FISH foram incubadas a 82ºC durante 5 minutos e em seguida a 45ºC durante 60 minutos. ] Resultados:
CEE | Fasesuweor a o | | Fase inferir TR | Exemplo 18. Este experimento examina a capacidade de vários solventes a- : 5 próticos polar para formar um sistema de uma fase. ' Todas as composições continham: 20% de sulfato de dextrana, : NaCl a 600 mM, tampão de fosfato a 10 mM, e 10, 15, 20, ou 25% de um dos seguintes solventes apróticos polares: Sulfolano B-Butirolactona Tritiocarbonato de etileno O Sulfito de glicol Carbonato de propileno O Resultados: todos os solventes apróticos polares em todas as concentrações examinadas produziram pelo menos um sistema de duas fa- ses nas composições usadas. Entretanto, isto não exclui que estes compos- tos podem produzir um sistema de uma fase sob outras condições de com- posição. Exemplo 19 Este experimento examina o uso das composições da invenção em análise (CISH) de hibridização in situ cromogênica em porções de tecido multi FFPE. Composição de sonda FISH |: 4.5 ng/uL. sonda TCRAD de DNA de gene rotulado FITC (1/4 de concentração padrão) (RP11-654A2, RP11- 24602, CTP-2355L21, RP11-158G6, RP11-780M2, RP11-481C14; tamanho 1018 kb); 15% de EC; 20% de sulfato de dextrana; NaCl a 600 mM; tampão de citrato a 10 MM, pH 6,0, ' Composição de sonda FISH Il: 4.5 ng/ulL TCRAD sonda de DNA . de gene rotulado FITC (1/4 de concentração padrão) (tamanho 1018 kb); 15% de EC; 20% de sulfato de dextrana; NaCl a 600 mM; tampão de citrato 7 5 a10mM pH6,0;0,1ug/ul esperma de DNA de salmão cisalhado.
Composição de sonda FISH Ill: 300 nM de cada sonda CEN17 ] de PNA rotulada por FITC individual (1/2 de concentração padrão); 15% de EC; 20% de sulfato de dextrana; NaCl a 600 mM; tampão de citrato a 10 mM, pH 6,0, Todas as amostras foram analisadas usando o protocolo Duo- 7 CISH Dako (SK108) e composições para dividir sondas, com a exceção de . que a lavagem rigorosa foi conduzida durante 20 minutos em lugar de 10 minutos, e sem usar a etapa de cromógeno vermelho DuoCISH.
Resultados: a a A a a Rg | NOTA: As intensidades de sinal foram muito fortes.
Devido aos ní- veis elevados de base, não foi possível discriminar se a adição de DNA de esperma de salmão na composição |l reduziu a base.
Os sinais foram clara- mente visíveis usando uma objetiva 10x, por exemplo, em amígdalas, que em geral tiveram menos base.
Se tecidos possuíram base elevada, os sinais foram claramente visíveis usando uma objetiva de 20x.
Exemplo 20 Este exemplo compara a intensidade de sinal e base de porções de tecido FFPE tratada com as composições da invenção com duas sondas de DNAs.
Composição de sonda FISH |: 9 ng/uL IGH sonda de DNA de gene rotulado FITC (RP11-151B17, RP11-112H5, RP11-101G24, RP11-
12F16, RP11-47P23, CTP-3087C18; tamanho 612 kb); 6.4 nog/ul sonda
1 MYC de DNA rotulada com Tx Red (CTD-2106F24, CTD-2151C21, CTD-
. 2267H22; tamanho 418 kb); 15% de EC; 20% de sulfato de dextrana; NaCl a 600 mM; tampão de citrato a 10 mM, pH 6,0,
Ns) composição de sonda FISH ll: 9 ng/ul.
Sonda de DNA de gene IGH rotulada com FITC; 6,4 ng de sonda MYC de DNA rotulada por TxRed;
] 15% de EC, 20% de sulfato de dextrana; NaCl a 600 mM; tampão de citrato a 10 mM, pH 6,0; 0,1 ug/ul. de DNA de esperma de salmão cisalhado. [o imenstededesiar [| ode dez er les | : NOTA: a base elevada foi provavelmente devido ao fato de que concentra- 10 çõesde sonda padrão foram usadas.
Exemplo 21 Este experimento examina o uso das composições da invenção eo em amostras citológicas.
Composição de sonda FISH: 15% de EC; 20% de sulfato de dex- trana; NaCl a 600 mM; tampão de fosfato a 10 mM; 5 ng/ul de sonda de DNA HER? rotulada por TxRed (1/2 de concentração padrão) e % da con- centração padrão de CEN7 (25 nM). As sondas FISH foram incubadas em dispersões de cromosso- ma de metáfase a 82ºC durante 5 minutos, em seguida a 45ºC durante 30 minutos, todas sem bloqueio.
Resultados: Nenhuma associação de cromossoma (Padrão de associação R) foi observada com as composições da invenção, ao contrário das soluções de ISH tradicionais, que tipicamente mostram Associação R.
Um baixo man-
chamento de base homogeneamente vermelho dos núcleos de interface e ' cromossomas de metáfase foi observado. . Exemplo 22 Este exemplo compara a intensidade de sinal e base de sonda 7 5 deDNAsem amostras de citologia, amplitude de metáfase, com e sem blo- queio.
Composição de sonda FISH |: 6 ng/ulL de sonda de DNA de ge- ne rotulado TCRAD Vermelho Texas (concentração padrão) (CTP- 31666K20, CTP-2373N7; tamanho 301 kb) e 4,5 ng/ul. de sonda de DNA de gene rotulado FITC (1/4 de concentração padrão); 15% de EC, 20% de sul- 7 fato de dextrana; NaCl a 600 mM; tampão de citrato a 10 MM, pH 6,0, ' Composição de sonda FISH Il: 6 ng/ul de sonda de DNA de ge- i ne rotulado TORAD Vermelho Texas (concentração padrão) (tamanho 301 kb) e 4.5 ng/ulL de sonda de DNA de gene rotulado FITC (1/4 de concentra- ção padrão); 15% de EC, 20% de sulfato de dextrana; NaCl a 600 mM; tam- pão de citrato a 10 mM, pH 6,0; 0,1 ug/uL de DNA de esperma de salmão . cisalhado. As sondas FISH foram incubadas em amplitude de metáfase a CU 82ºC durante 5 minutos, em seguida a 45ºC durante 60 minutos. Resultados: Tx Red FITC Novamente, nenhuma associação de cromossoma (Padrão de associação R) foi observada com as composições da invenção. Além disso, nenhum manchamento de base dos núcleos de interface ou cromossomas de metáfase foram observados.
OUTRAS MODALIDADES Modalidade 1. Uma composição de hibridização compreenden- do:
(a) uma primeira sonda molecular que detecta a sequência de ' nucleotídeo associada com uma aberração cromossômica, : (b) pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo, e a (c) uma solução de hibridização, em que a sequência de nucleotídeo é um marcador para uma aberração cromossômica, e em que o solvente aprótico polar não é sulfóxido de dimetila (DMSO).
Modalidade 2.
A composição de hibridização de acordo com a modalidade 1, 7 em que a aberração cromossômica é aneuploidia, ruptura potencial, inser- . ção, inversão, deleção, duplicação, amplificação de gene, redisposição, ou translocação.
Modalidade 3. A composição de hibridização de acordo com as modalidades 1 a2,em que a aberração cromossômica está associada com um distúrbio genético congênito, câncer, ou infecção. .«. Modalidade 4. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 3, em que a aberração cromossômica está associada com cân- o cer. Modalidade 5. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 4, em que a primeira sonda molecular detecta ALK, BCL2, B- CL3, BCL6, BCL10, BCL12, BCR, CCND1, E2A, EGFR, ETV6, FIP1IL1, HER2, IGH, IGK, IGL, MALT1, MLL (ALL-1, HTRX1, HRX), MYC (c-Myc), PAX5, PDGFRA, PDGFRB, SIL, TCF3 (E2A, ITF1), TCL1A, TCRAD, TCRB, TCRG,telômero, TLX1, TLX3 (HOX11L2, RNX), ou TOP2A.
Modalidade 6. A composição de hibridização de acordo com qualquer das modalidades 1 a 4, em que a primeira sonda molecular detecta um alvo para uma doença não hematológica selecionada do grupo que con- siste em: BASE, BRCA1, CCND1, CCNE1, DCD, E2F3, n-MYC/MYCN, COX-2/PTGS2, LRIG1, ER a, NTERT, MLN64/ STARD3, PGR, SNAI1, SRC, TOP1, TUBB1, AIB1, DLC-1, EDD, Pip4k2b/5k, Sil, TBX2, c-Kit, VEGF,
VCAM-1, Tie-1, Ts/TYMS, PSMA, PSA, PAP, P15, P16, BCL1, BCL2, : MTOR, TIMP1, ESR1, PTEN, MDM2/CDKA4, MET, C-MET, ERB1, FGFR1, . IGFIR, NET, FGFR3, ABCB1, TMPRSS2, BRCA2, TOP2B, ERCC1, AKT1, AKT2, AKT3, HRAS, NRAS, RAF1, HER3, HER4, ENT1, RRM1, RRM2, 7 5 RRM2B, PIK3CA, AURK4, AURKB, AURKC, MAPT/tau, TTBK1, TUBB, VEGFR, CCND3, CDK6, CDK2, CDC2, HDAC, ESR2, SCUBE2, BIRCS5, i FASN, DHFR, TP/ECGF1, TYMP, DPYD, TK1, HMGIC, ABCA2, ABCB11, ABCC1, ABCC2, ABCC3, ABCCA4, ABCC5, ABCG2, MVP, ATP7A, ATP7B, SLC29A1, SLC28A1, SLC19A1, TUBB4, TUBA, MAP4, MAP7, STMN1, KIF5B, HSPAS5, PSMD14, FPGS, GSTP1, GPX, GCLC, GGT2, MT, AKR1B1, 7 HMGB1, HMGB2, XPA, XPD, MSH2, MLH1, PMS2, APEX1, MGMT, GLO1, . RB1, GML, CDKN1A, CDKN2A, CDKN1B, ERBB2, KRAS2, ITGB1, JUN, i FOS, NFKB1, TP53, TP73, BCL2L1, MCL1, BAX, BIRC4, TNFRSF6, CASP3, CASP8, HSPB1, MALAT1(alfa) t(11;19)(911:;913.4), MHLB1 t(11;19)(911;9413.4), COLIA1 t(17;22)(922;913), PDGFB t(17;22)(922;913), FKHR t(2;13) & t(1;13), ETV6 t(12;15)(D13;925), NTRK3 t(12;15)(p13;925), ... TLS/FUS t(12;16)(913;p11), CHOP t(12;16)(913;p11), EWS t(12;22)(913;912), EWS/FLI t(11;22)(924;912), e FLI t(11;22)(924;912). o Modalidade 7. A composição de hibridização de acordo com qualquer das modalidades 1-4, em que a primeira sonda molecular detecta um alvo para uma doença hematológica selecionada do grupo que consiste em: ABL t(9;22)(934:911), PRDM16 del(1p36.32) del(21922.12), RUNX1/AML1 del(1p36.32) del(21922.12), CEP8, PDGFRB, NUP98, FG- FR1, ASS, ETO t(8;21)(922;,922), AML1 t(8;21)(922:;922), CBFbeta inv(16)(pD13922) t(16;16)(p13;922), MYH11 inv(16)(p13922) t(16;16)(pD13;922), — AF9 — t(9:11),) PML t(15;17)(922:921)) PLZF t(11;17)(923;921), NuMA t(11;17)(913;921), NPM t(5;17)(923;9412), RAR alfa t(15;17)(922;921) t(11;17)(923;921) t(11;17)(913;921) t(5;17)(923;921), EVII t(3;v)(g26;v), GR6 t(3;3)(921;426), RPN1 t(3;3)(921;926), DEK t(6;9), CAN t(6;9) MLF1 t(3;5)(...;923), FUS t(16;21), ERG t(16;21), NUP98 t(7;11), HOX9A t(7;11), MOZMYST3 t(8;16)(p11:;p13), CBP t(8;16)(p11:;p13), p300 t(8;22)(PD11;913), TIF2/GRIP-1/NCoA-2 inv(8)(p11913), MKL1, PBX1 i t(1;19)(923;:p13.3) + var., ABL t(9;22)(g934;:911), AF4/AFF1 t(4;:11)(921;923), . AML1I/RUNX1 t(12;21)(p13;922), IL3 t(5;14)(931;,932), HLF t(17;19), IKZF1 del(7)(p12.2), CDKN2A/CDKN2B del(9)(p21.3), TAL1 1p32 aberrations, 7 5 LMO2 t(11;14)(D13.911) + var, LMO1 t(11;14)(D15;,911), HOX11 t(10;14)(924:;911) + var, TAL2 t(7;9)(934:9432),] TAN1I t(7;9)(934;934), CEP12, ATM, D13S25, D138319, TP53, P53, TNFAIP3 del(6)(923.3-924.1), CDK6 BCL1 t(11;14)(913;932) + var, IRF4 t(6;:14)(025;932), C-MAF t(14;16)(932;923), FGFR3 t(4;14)(D16;9432), MUM2/3 t(1;14)(921;932), NPM t(2:5)(023;935), ASS, RB1, e ATM. ' Modalidade 8. A composição de hibridização de acordo com . qualquer das modalidades 1 a 4, em que a primeira sonda molecular detecta um centrômero selecionado do grupo que consiste em: CEP1, CEP2, CEP3, CEP4, CEP5, CEP6, CEP7, CEP8, CEP9, CEP10, CEP11, CEP12, CEP13, CEP14, CEP15, CEP16, CEP17, CEP18, CEP19, CEP20, CEP21, CEP22, CEP23, CEP X, e CEP Y. o. Modalidade 9. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 4, em que o câncer é carcinoma acrenocortical, câncer de bexi- o ga, câncer cerebral, câncer de queimadura, câncer de mama, câncer cervi- cal, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer retal, câncer endometrial, câncer esofágico, câncer do rim (renal), leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão, câncer gástrico, glioma, câncer hematológico, câncer da cabeça e pescoço, melanoma, linfoma, leucemia, linfoma de não Hodgkin, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de próstata, retinoblastoma, sarcoma, câncer de pele (não melanoma), câncer testicular, câncer de tireoide, ou câncer uterino.
Modalidade 10, A composição de hibridização de acordo com a modalidade 9, em que o câncer é câncer de mama e a primeira sonda mole- cular detecta HER2.
Modalidade 11. A composição de hibridização de acordo com a - —modalidade9,em que o câncer é câncer colorretal e a primeira sonda mole-
cular detecta EGF2. ] Modalidade 12. A composição de hibridização de acordo com a . modalidade 4, em que o câncer é uma malignidade hematopoiética. Modalidade 13. A composição de hibridização de acordo com a * 5 modalidade12, em que a primeira sonda molecular detecta uma aberração cromossômica escolhida de t(1;14) (a34;:911), t(1;19) (q23:p13), t(2;5), ' t(2;18) (912;921), t(2;8), t(4:11), t(4;:11) (921;923), t(6;11) (927;,923), t(7;22) (p22;:912), t(8;14), t(8;22), t(9;11) (p22:923), t(9;22) (g34;:911), t(10;14) (a924;:911), t(11;14), t(11;14) (p13;911), t(11;19) (923:p13), t(14;18) (423;:921), t(14:18),t(18;22) (921;911), e t(21;22) (922;:912). í Modalidade 14. A composição de hibridização de acordo com z qualquer uma das modalidades 1 a 13, também compreendendo uma se- gunda sonda molecular. Modalidade 15. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 14, em que a segunda sonda molecular detecta uma sequência de referência. e Modalidade 16. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 15, em que a sequência de referência é uma sequência de cen- o trômero. Modalidade 17. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 16, em que a sonda molecular é definida na modalidade 8.
Modalidade 18. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 14, em que a primeira sonda molecular e a segunda sonda mo- lecular detectam sequências flanqueando ou dentro de uma ou mais ruptu- ras potenciais.
Modalidade 19. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 14 a 18, também compreendendo uma ter- ceira sonda molecular.
Modalidade 20. A composição de hibridização de acordo com — qualquer uma das modalidades 1 a 19, em que a primeira sonda molecular é uma sonda de DNA, uma sonda de PNA, ou uma sonda LNA.
Modalidade 21. A composição de hibridização de acordo com ' qualquer uma das modalidades 14 a 20, em que a segunda sonda molecular . é uma sonda de DNA, uma sonda de PNA, ou uma sonda LNA.
Modalidade 22. A composição de hibridização de acordo com * 5 qualquer das modalidades 19 a 21, em que a terceira sonda molecular é uma sonda de DNA, uma sonda de PNA, ou uma sonda LNA.
' Modalidade 23. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 22, em que a sonda molecular também compreende um rótulo.
Modalidade 24. A composição de hibridização de acordo com a 7 modalidade 23, em que o rótulo é um cromóforo, fluoróforo, biotina, DIG, ; anticorpo hapteno, pigmento, ou enzima.
Modalidade 25. A composição de hibridização de acordo com qualquer das modalidades 1 a 24, em que a concentração de solvente apró- tico polar em uma composição de hibridização varia de 1% (v/v) a 95% (v/v). Modalidade 26. A composição de hibridização de acordo com . qualquer uma das modalidades 1 a 25, em que a concentração de solvente aprótico polar em uma composição de hibridização varia de 5% (v/v) a 10% o (v). Modalidade 27. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 25, em que a concentração de solvente aprótico polar em uma composição de hibridização varia de 10% (v/v) a 20% (uy). Modalidade 28. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 25, em que a concentração de solvente aprótico polar em uma composição de hibridização varia de 20% (v/v) a 30% (vv). Modalidade 29. A composição de hibridização de acordo com qualquer das modalidades 1 a 28, em que o solvente aprótico polar é não tóxico.
Modalidade 30. A composição de hibridização de acordo com qualquer das modalidades 1 a 29, com a condição de que a composição de ' hibridização não contém formamida. . Modalidade 31. A composição de hibridização de acordo com qualquer das modalidades 1 a 30, com a condição de que a composição de 7 5 hibridização contém menos do que 10% de formamida. Modalidade 32. A composição de hibridização de acordo com ' qualquer das modalidades 1 a 31, em que o solvente aprótico polar tem fun- cionalidade de lactona, sulfona, sulfito, nitrila e/ou carbonato. Modalidade 33. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 32, em que o solvente aprótico polar tem " um parâmetro de solubilidade de dispersão variando de 17,7 MPa"? a 22,0 . MPa“?, um parâmetro de solubilidade polar variando de 13 MPa'? a 23 i MPa'?, e um parâmetro de solubilidade em ligação a hidrogênio variando de 3 MPa“? a 13 MPa'?. Modalidade 34. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 33, em que o solvente aprótico polar tem . uma estrutura de base cíclica. Modalidade 35. — A composição de hibridização de acordo com oO qualquer uma das modalidades 1 a 34, em que o solvente aprótico polar é selecionado do grupo que consiste em: x o x o 7
É CÊ E CA RO * CÃ RF C==N onde X é O e R1 é alquildi-ila, e Ko NZ
NA onde X é opcional e se presente, é escolhido de O ou S, onde Z é opcional e se presente, é escolhido de O ou S, onde A e B independentemente são O ou N ou S ou parte da al-
quildi-ila ou uma amina primária, onde R é alquildi-ila, e . onde Yé O ou Sou C.
Modalidade 36. A composição de hibridização de acordo com 7 5 qualquer uma das modalidades 1 a 35, em que o solvente aprótico polar é selecionado do grupo que consiste em: acetanilida, acetonitrila, N-acetil pir- ] rolidona, 4-amino piridina, benzamida, benzimidazol, 1,2,3-benzotriazol, bu- tadienodióxido, carbonato de 2,3-butileno, y-butirolactona, caprolactona (ép- silon), anidrido cloro maleico, 2-clorociclo-hexanona, carbonato de cloroetile- no, cloronitrometano, anidrido citracônico, crotonlactona, 5-ciano-2-tiouracila, 7 ciclopropilnitrila, sulfato de dimetila, dimetil sulfona, 1,3-dimetil-5-tetrazol, , 1,5-dimetil tetrazol, 1,2-dinitrobenzeno, 2,4-dinitrotolueno, difenil sulfona, 1,2-dinitrobenzeno, 2, ,4-dinitrotolueno, difenil sulfona, épsilon-caprolactam, etanossulfonilcloreto, fosfinato de etil etila, N-etil tetrazol, carbonato de etile- no, tritiocarbonato de etileno, sulfato de etileno glicol, sulfito de etileno de glicol, furfural, 2-furonitrila, 2-imidazol, isatina, isoxazol, malononitrila, ben- . zonitrila de 4-metóxi, 1-metóxi-2-nitrobenzeno, alfa bromo tetronato de meti- la, 1-metil imidazol, N-metil imidazol, 3-metil isoxazol, N-metil morfoli- oO na-N-óxido, metil fenil sulfona, N-metil pirrolidinona, metil sulfolano, me- til4-toluenossulfonato, 3-nitroanilina,y nitrobenzimidazol, —2-nitrofurano, 1-nitroso-2-pirrolidinona, 2-nitrotiofeno, 2-oxazolidinona, 9,10-fenantrenoquinona, N-fenil sidnona, anidrido ftálico, picolinonitrila (2-cianopiridina), 1,3-propano sultona, B-propiolactona, propileno carbonato, 4H-piran-4-tiona, 4H-piran-4-ona (B-pirona), piridazina, 2-pirrolidona, sacari- na, succinonitrila, sulfanilamida, sulfolano, 2,2,6,6-tetraclorociclo-hexanona, óxido de tetra-hidrotiapirano, tetrametileno sulfona (sulfolano), tiazol, 2-tiouracila, 3,3,3-tricloro propeno, 1,1,2-tricloro propeno, 1,2,3-tricloro pro- peno, dióxido-sulfeto de trimetileno, e suilfito de trimetileno.
Modalidade 37. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 35, em que o solvente aprótico polar é selecionado do grupo que consiste em:
o je 1 À À o “o o o Õ Sos tv ? : CA VU H3C . : .e . - Modalidade 38. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 35, em que o solvente aprótico polar é: : Modalidade 39. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 38, também compreendendo pelo menos um componente adicional selecionado do grupo que consiste em: agentes de tamponamento, sais, agentes de aceleração. Agentes de quelação, de- tergentes, e agentes de bloqueio. OU Modalidade 40. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 39, em que o agente de aceleração é sulfato de dextrana e os - 10 saissão cloreto de sódio e/ou fosfato de sódio.
Modalidade 41. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 40, em que o sulfato de dextrana está presente em uma concen- tração de 5% a 40%, o cloreto de sódio está presente em uma concentração de O mM a 1200 mM, e/ou o fosfato de sódio está presente em uma concen- traçãode O MM a 50 mM.
Modalidade 42. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 41, em que o sulfato de dextrana está presente em uma concen- tração de 10% a 30%, o cloreto de sódio está presente em uma concentra- ção de 300 mM a 1200 mM, e/ou o fosfato de sódio está presente em uma concentração de 5 mM a 20 mM.
Modalidade 43. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 39, em que o agente de aceleração é selecionado do grupo que consiste em: formamida, glicerol, propileno glicol, 1,2-propanodiol, dietileno ' glicol, etileno glicol, glicol, e 1,3 propanodiol, e o agente de tamponamento é . tampão de ácido cítrico.
Modalidade 44. A composição de hibridização de acordo com a 7 5 modalidade43,em que a formamida está presente em uma concentração de 0,1 a 5%, o glicerol, propileno glicol, 1,2-propanodiol, dietileno glicol, etileno glicol, glicol, e 1,3 propanodiol estão presentes em uma concentração de 0,1% a 10%, e o tampão de ácido cítrico está presente em uma concentra- ção de 1 mM a 50 mM.
Modalidade 45. A composição de hibridização de acordo com a 7 modalidade 39, em que o agente de bloqueio é selecionado do grupo que ' consiste em: DNA humano total, DNA de esperma de arenque, DNA de es- perma de salmão, e DNA de timo de bezerro.
Modalidade 46. A composição de hibridização de acordo com a modalidade 45, em que o DNA humano total, DNA de esperma de arenque, DNA de esperma de salmão, e DNA de timo de bezerro estão presentes em - uma concentração de 0,01 a 10 ug/ul.
Modalidade 47. A composição de hibridização de acordo com OU qualquer uma das modalidades 1 a 46, compreendendo 40% de pelo menos um solvente aprótico polar, 10% de sulfato de dextrana, cloreto de sódio a 300 mM, e fosfato de sódio a 5 mM.
Modalidade 48. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 46, compreendendo 15% de pelo menos um solvente aprótico polar, 20% de sulfato de dextrana, cloreto de sódio a 600mM, fosfato de sódio a 10 mM, e 0,1 ug/ul de DNA humano total.
Modalidade 49. A composição de hibridização de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 46, compreendendo 15% de pelo menos um solvente aprótico polar, 20% de sulfato de dextrana, cloreto de sódio a 600 mM, tampão de ácido cítrico a 10 mM pH 6,2, e 0,1 ug/ul de DNA de esperma de arenque, ou DNA de esperma de salmão, ou DNA de timo de bezerro, ou 0,5% de formamida, ou 1% etileno glicol, ou 1% 1,3 propanodiol,
ou 1% de glicerol. ' Modalidade 50. A composição de hibridização de acordo com . qualquer uma das modalidades 1 a 49, em que a composição aquosa com- preende mais do que uma fase em temperatura ambiente. Do5 Modalidade 51. A kit compreendendo a composição de qualquer uma das modalidades 1 a 41. : Modalidade 52. Um kit compreendendo: (a) uma primeira sonda molecular que detecta a sequência de nucleotídeo associada com uma aberração cromossômica, e (b) uma composição de hibridização que compreende pelo me- 7 nos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar - sequências de nucleotídeo de filamento duplo, ' em que o solvente aprótico polar não é sulfóxido de dimetila (DMSO). Modalidade 53. Kit de acordo com qualquer das modalidades 51 e 52, também compreendendo um reagente de visualização. «o. Modalidade 54. Kit de acordo com qualquer das modalidades 51 e 52, em que o kit é designado para uso em citologia. OU Modalidade 55. Kit de acordo com qualquer das modalidades 51 e52,emque o kité designado para uso em histologia.
Modalidade 56. Kit de acordo com a modalidade 52, em que o solvente aprótico polar é definido de acordo com qualquer das modalidades 25a38.
Modalidade 57. Kit de acordo com qualquer das modalidades 51 a56,emqueo kit é designado para uso em experimentos FISH ou CISH.
Modalidade 58. Método de detectar um alvo em DNA cromos- sômico compreendendo — fornecer pelo menos uma sonda molecular que hibridiza para o alvo em DNA cromossômico, — fornecer DNA cromossômico, — fornecer uma composição de hibridização que compreende pe-
lo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desna- ] turar sequências de nucleotídeo de filamento duplo, em que o solvente apró- . tico polar não é sulfóxido de dimetila (DMSO), — combinar a sonda molecular, o DNA cromossômico e a com- * 5 posição de hibridização durante pelo menos um período de tempo suficiente para hibridizar a sonda molecular para o alvo, e — detectar o alvo.
Modalidade 59. Um método de determinar a presença de uma aberração cromossômica em uma sequência de ácido nucleico, o método compreendendo: 7 — fornecer pelo menos uma sonda molecular, . — fornecer a sequência de ácido nucleico, — fornecer uma composição de hibridização que compreende pe- lo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desna- turar sequências de nucleotídeo de filamento duplo, em que o solvente apró- tico polar não é sulfóxido de dimetila (DMSO), . — combinar a sonda molecular e a sequência de ácido nucleico e a composição de hibridização durante pelo menos um período de tempo su- DO ficiente para hibridizar a sonda molecular e a sequência de ácido nucleico, e — detectar a pelo menos uma sonda molecular, — e determinar a presença da aberração cromossômica.
Modalidade 60. Um método de determinar a presença de uma aberração cromossômica em uma sequência de ácido nucleico, o método compreendendo: — — fornecer a sequência de ácido nucleico, — — fornecer uma composição de hibridização que compreende pelo menos uma sonda molecular e pelo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo, — aplicara composição de hibridização ao referido ácido nu- cleico durante pelo menos um período de tempo suficiente para hibridizar a sonda molecular e sequência de ácido nucleico, e ' — — detectarapelomenos uma sonda molecular, . — —edeterminara presença da aberração cromossômica, em que o solvente aprótico polar não é sulfóxido de dimetila * 5 (DMSO). Modalidade 61. Método de acordo com qualquer das modalida- des 58 a 60, em que o solvente aprótico polar é definido de acordo com qualquer uma das modalidades 25 a 38. Modalidade 62. Um método de determinar a presença de uma aberração cromossômica em uma sequência de ácido nucleico, o método 7 compreendendo: — — fornecer a sequência de ácido nucleico, — aplicar a composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 50 à referida sequência de ácido nucleico durante pelo me- nos um período de tempo suficiente para hibridizar a sonda molecular e se- quência de ácido nucleico, e os — —determinarse a aberração cromossômica está presente na sequência de ácido nucleico. , Modalidade 63. Método de acordo com qualquer das modalida- des58a62,em que é fornecida uma quantidade suficiente de energia para hibridizar o primeiro e segundo ácidos nucleicos . Modalidade 64. Método de acordo com a modalidade 63, em que a energia é fornecida por aquecimento da composição de hibridização e se- quência de ácido nucleico.
Modalidade 65. Método de acordo com a modalidade 64, em que a etapa de aquecimento é realizada pelo uso de micro-ondas, banhos quen- tes, placas quentes, fio quente, elemento peltier, indução de aquecimento ou lâmpadas quentes.
Modalidade 66. Método de acordo com qualquer uma das moda- lidades 58 a65,em que a sequência de ácido nucleico é de filamento duplo e a sonda molecular é de filamento único, a sequência de ácido nucleico é de filamento duplo e a sonda molecular é de filamento duplo, a sequência de ' ácido nucleico é de filamento único e a sonda molecular é de filamento úni- . co, ou a sequência de ácido nucleico é de filamento único e a sonda molecu- lar é de filamento duplo. ss Modalidade 67. Método de acordo com qualquer uma das moda- lidades 58 a 66, em que as etapas de desnaturação e hibridização ocorrem separadamente. Modalidade 68. Método de acordo com qualquer uma das moda- lidades 58 a 67, em que a etapa de hibridização inclui as etapas de aqueci- mento e resfriamento da composição de hibridização, sonda molecular, e í sequência de ácido nucleico. . Modalidade 69. Método de acordo com qualquer uma das moda- lidades 58 a 68, em que a etapa de hibridização leva menos do que 8 horas. Modalidade 70. Método de acordo com a modalidade 69, em que aetapade hibridização leva menos do que 1 hora.
Modalidade 71. Método de acordo com qualquer uma das moda- - lidades 58 a 70, em que a etapa de resfriamento leva menos do que 1 hora.
Modalidade 72. Método de acordo com a modalidade 71, em que o a etapa de resfriamento leva menos do que 30 minutos.
Modalidade 73. Método de acordo com qualquer uma das moda- lidades 58 a 72, em que a sequência de ácido nucleico é em uma amostra biológica.
Modalidade 74. Método de acordo com a modalidade 73, em que a amostra biológica é uma amostra de tecido.
Modalidade 75. Método de acordo com qualquer uma das moda- lidades 58 a 74, em que a composição aquosa compreende uma fase em temperatura ambiente.
Modalidade 76. Método de acordo com qualquer uma das moda- lidades 58 a 74, em que a composição aquosa compreende múltiplas fases emtemperatura ambiente.
Modalidade 77. Método de acordo com a modalidade 76, em que as camadas da composição aquosa são misturadas. : Modalidade 78. Método de acordo com qualquer uma das moda- . lidades 58 a 77, também compreendendo uma etapa de bloqueio.
Modalidade 79. um método de diagnosticar um distúrbio genéti- 7 5 co congênito, câncer, ou infecção associada com uma aberração cromos- sômica, o método compreendendo Ú — — fornecer uma amostra de tecido de um indivíduo, em que a amostra de tecido compreende a sequência de ácido nucleico, — — determinar se uma aberração cromossômica está presente na sequência de ácido nucleico, de acordo com o método de qualquer das 7 modalidades 58 a 78, e . — — diagnosticar o distúrbio genético congênito, câncer, ou in- fecção se a aberração cromossômica estiver presente na amostra de tecido.
Modalidade 80. Uso de uma composição compreendendo uma sonda molecular que detecta uma sequência de nucleotídeo associada com uma aberração cromossômica e uma composição de hibridização que com- os preende 1% (v/v) a 95% (v/v) de pelo menos um solvente aprótico polar em um ensaio de hibridização para detectar a sequência de nucleotídeo associ- OU ada com uma aberração cromossômica.
Modalidade 81. Uso de acordo com a modalidade 80, de uma composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 50,

Claims (21)

. REIVINDICAÇÕES
1. Método de hibridização in situ para detecção de pelo menos À uma sonda molecular, e determinar a presença de uma aberração cromos- sômico em DNA cromossômico, caracterizado pelo fato de que compreende: —fornecer pelo menos uma sonda molecular que hibridiza para o alvo em DNA cromossômico, —fornecer DNA cromossômico, —fornecer uma composição de hibridização que compreende pe- lo menos um solvente aprótico polar em uma quantidade eficaz para desna- turar sequências de nucleotídeo de filamento duplo, em que o solvente apró- tico polar não é sulfóxido de dimetila (DMSO), —combinar a sonda molecular, o DNA cromossômico e composi- ção de hibridização durante pelo menos um período de tempo suficiente pa- ra hibridizar a sonda molecular com o alvo, e —detectar o alvo.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita composição de hibridização compreende pelo menos uma sonda molecular.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado —pelofatode que o solvente aprótico polar é como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 20.
4. Método de acordo com a qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a etapa de hibridização leva menos que 8 horas, menos que 1 hora, menos que 30 minutos.
5. Método para diagnosticar uma desordem genética congênita, câncer ou infecção associada com aberração cromossômica, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma amostra de tecido de um sujeito, em que a amos- tra de tecido compreende uma sequência de ácido nucleico; —determinar se a aberração cromossômica está presente na se- quência de ácido nucleico, de acordo com o método de qualquer uma das reivindicações 1 a 4; e
. —diagnosticar a desordem genética congênita, câncer ou infec- ção se aberração cromossômica estiver presente na amostra de tecido.
6. Uso de uma composição compreendendo uma sonda molecu- lar que detecta uma sequência de nucleotídeo associada com uma aberra- ção cromossômica e uma composição de hibridização que compreende 1% (v/v) a 95% (v/v) de pelo menos um solvente aprótico polar de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 20, caracterizado pelo fato de ser em um ensaio de hibridização para detectar a sequência de nucleotídeo associ- ada com uma aberração cromossômica.
7. Composição de hibridização, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma primeira sonda molecular que detecta uma sequência de nucleotídeo associada com uma aberração cromossômica, (b) pelo menos um solvente aprótico polar possuindo uma es- trutura base cíclica em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo, e (c) uma solução de hibridização, em que o solvente aprótico polar não é sulfóxido de dimetila (DMSO).
8. Composição de hibridização de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a aberração cromossômica é aneuploidia, ruptura potencial, inserção, inversão, deleção, duplicação, amplificação de gene, redisposição ou translocação.
9. Composição de hibridização de acordo com a reivindicação 7 ouB, caracterizada pelo fato de que a primeira sonda molecular detecta ALK, BCL2, BCL3, BCL6, BCL10, BCL12, BCR, CCND1, E2A, EGFR, ETV6, FIP1L1, HER2, IGH, IGK, IGL, MALT1, MLL (ALL-1, HTRX1, HRX), MYC (c- Myc), PAX5, PDGFRA, PDGFRB, SIL, TCF3 (E2A, ITF1), TCL1A, TCRAD, TCRB, TCRG, telômero, TLX1, TLX3 (HOX11L2, RNX), ou TOP2A.
10. Composição de hibridização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que a primeira sonda molecular detecta uma aberração cromossômica escolhida de t(1;14)
. (a34;911), t(1;19) (923;p13), t(2;5), t(2;18) (912;:921), t(2;8), t(4;11), t(4;11) (q21;:923), t(6;11) (q27;:9423), t(7;22) (p22;:912), t(8;14), t(8;22), t(9;11) É (p22;923), t(9;22) (934;:911), t(10;14) (924;:911), t(11;14), t(11;14) (p13;:911), t(11;19) (923:p13), t(14;18) (923;921), t(14;18), t(18;22) (921:911), e t(21;22) (922:912).
11. Composição de hibridização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada pelo fato de que compreendendo ainda uma segunda sonda molecular, preferencialmente a segunda sonda molecular detecta uma sequência de referência.
12. Composição de hibridização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizada pelo fato de que a primeira sonda molecular e a segunda sonda molecular detectam sequências flanqueando ou dentro de uma ou mais rupturas potenciais.
13. Composição de hibridização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizada pelo fato de que a sonda molecular compreende ainda um rótulo.
14. Composição de hibridização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 13, caracterizada pelo fato de que a concentração de solvente aprótico polar na composição de hibridização varia de 1% (vv) a 95% (vv) ou de 10% (v/v) a 20% (vv).
15. Composição de hibridização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 14, caracterizada pelo fato de que o solvente aprótico polar tem funcionalidade de lactona, sulfona, sulfito, nitrila e/ou carbonato.
16. Composição de hibridização de acordo com qualquer uma dasreivindicações 7 a 15, caracterizada pelo fato de que o solvente aprótico polar tem um parâmetro de solubilidade de dispersão variando de 17,7 MPa'*? a 22,0 MPa"?, um parâmetro de solubilidade polar variando de 13 MPa“? a 23 MPa'?, e um parâmetro de solubilidade em ligação a hidrogênio variando de 3 MPa"? a 13 MPa'?.
17. Composição de hibridização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 16, caracterizada pelo fato de que o solvente aprótico polar é selecionado do grupo que consiste em:
: x o x o q
ANSA A RÓ S a R-C=N onde X é O e R1 é alquildi-ila, e Ke NÊ
O onde X é opcional e se presente, é escolhido de O ou S, onde Z é opcional e se presente, é escolhido de O ou S, onde A e B independentemente são O ou N ou S$ ou parte da al- quildi-ila ou uma amina primária, onde R é alquildi-ila, e onde Yé O ou Sou C.
18. Composição de hibridização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 17, caracterizada pelo fato de que o solvente aprótico polar é selecionado do grupo que consiste em: o s n A A Õ e as o “o 0 “o 9 A de TE:
HC
19. Composição de hibridização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 18, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um solvente aprótico apolar, sulfato de dextrana e um tampão.
20. Composição de hibridização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 18, caracterizada pelo fato de que compreende 15% de pelo menos um solvente aprótico apolar, 20% de sulfato de dextrana, 600mM de cloreto de sódio, 10mM de tampão de ácido cítrico pH 6,2.
21. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma primeira sonda molecular que detecta a sequência de nucleotídeo associada com uma aberração cromossômica, e (b) uma composição de hibridização que compreende pelo me-
nos um solvente aprótico polar como definido em qualquer uma das reivindi- cações 7 a 20 em uma quantidade eficaz para desnaturar sequências de nucleotídeo de filamento duplo, em que o solvente aprótico polar não é sulfóxido de dimetila 5 (DMSO)
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