BRPI0900592B1

BRPI0900592B1 - VACINAL COMPOSITION FOR CANINE PIODERMITE, VACCINATION METHOD FOR CANINE PIODERMITE AND USE OF STAPHYLOCOCCUS INTERMEDIUS TOXOIDS

Info

Publication number: BRPI0900592B1
Application number: BRPI0900592-7A
Authority: BR
Inventors: De Souza Cybelle; Francisco Warth José; Victor Bacila Agottani Jorge
Original assignee: Universidade Federal Do Paraná
Priority date: 2009-02-19
Filing date: 2009-02-19
Publication date: 2017-10-31
Also published as: BRPI0900592A2; WO2010094101A1

Abstract

composição vacinal para piodermite canina, método de vacinação para piodermite canina e uso de toxóides de staphylococçijs intermedius a presente invenção situa-se no campo da biotecnoíogia e diz respeito uma composiç.ão vacinal e a um método de vacinação para prevenção ou tratamento de quadros de piodermite canina. a referida composição compreende toxóides da bactéria s. interrnedius, compostos adjuvantes e carreadores, veículos ou excipientes s. marmaceuticamente aceitáveis. além disso, a invenção descreve o uso de toxóldes des. intermedius para preparação de um medicamento para prevenção ou tratamento de quadros de piodermite canina.Canine Pyoderma Vaccine Composition, Canine Pyoderma Vaccination Method and Use of Staphylococci Intermediate Toxoids The present invention is in the field of biotechnology and relates to a vaccine composition and a method of vaccination for the prevention or treatment of Canine pyoderma. said composition comprises bacterium s toxoids. interrnedius, adjuvant and carrier compounds, vehicles or excipients s. pharmaceutically acceptable. further, the invention describes the use of des toxoids. intermedius for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of canine pyoderma.

Description

“COMPOSIÇÃO VACINAL PARA PIODERMITE CANINA, MÉTODO DE VACINAÇÃO PARA PIODERMITE CANINA E USO DE TOXÓIDES DE STAPHYLOCOCCUS INTERMEDIUS” A presente invenção situa-se no campo da biotecnologia e diz respeito a uma composição vacinai para prevenção ou tratamento de piodermite canina, um método de vacinação para prevenção ou tratamento de piodermite canina e uso de toxóides de S. intermedius para a preparação de um medicamento para prevenção ou tratamento de piodermite canina. A piodermite pode ser definida comc uma condição infecciosa, produtora de pus, de origem bacteriana que acomete o tegumento em quaiquer nível de profundidade. Alguns casos são superficiais, quando o processo infeccioso não atinge a camada basal da epiderme, enquanto outros, por apresentarem destruição dessa camada, são classificados como profundos (Pianta C et al. Pioderma estafilocócico canino: identificação das espécies e sensibilidade aos antimicrobianos. Rev Cien Agrovet 2006;5:60-63)."VACINAL COMPOSITION FOR CANINE PIODERMITE, CANINE PIODERMITE VACCINATION METHOD AND USE OF STAPHYLOCOCCUS INTERMEDIUS TOXIDS" The present invention is in the field of biotechnology and relates to a vaccine composition for the prevention or treatment of canine pyoderma, a method of vaccination. for the prevention or treatment of canine pyoderma and the use of S. intermedius toxoids for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of canine pyoderma. Pyoderma can be defined as an infectious pus-producing condition of bacterial origin that affects the integument at any depth. Some cases are superficial, when the infectious process does not reach the basal layer of the epidermis, while others, due to its destruction, are classified as deep (Pianta C et al. Canine Staphylococcal Pyoderma: species identification and antimicrobial susceptibility. Rev Cien Agrovet 2006; 5: 60-63).

As piodermites superficiais, que são mais prevalentes, englobam o impetigo, a piodermite muco-cutânea, a dermatofilose, a foliculite bacteriana e a piodermite esfoliativa ou superficial disseminada (Larsson CE. Estudo comparativo da eficácia da imunoterapia com bacterina e de dois esquemas de pulsoterapia antibiótica no manejo de piodermites superficiais idiopáticas recidivantes caninas. Dissertação de Mestrado. Universidade de São Paulo. 2008).The most prevalent superficial pyoderma include impetigo, mucocutaneous pyoderma, dermatophyllosis, bacterial folliculitis, and disseminated exfoliative or superficial pyoderma (Larsson CE. Comparative study of the efficacy of bacterin immunotherapy and two pulse therapy regimens). antibiotics in the management of canine recurrent idiopathic superficial pyoderma (Master's Dissertation. University of São Paulo, 2008).

Na maioria das piodermites a participação bacteriana é secundária a fatores predisponentes conhecidos como doenças pré-existentes tais como seborréia, ectoparasitoses, alergias (atopias), doenças endócrinas e distúrbios imunológicos. As piodermites podem ser classificadas ainda como idiopáticas, em que a causa primária não é identificável e as infecções bacterianas pedem ser recidivantes. Portanto, uma vez que a homeostasia cutânea é prejudicada devido a causas primárias, a aderência e colonização de microorganismos virulentos são facilitadas (Ihrke PJ. An overview of bacterial skin disease in the dog. Br Vet J 1987;143:112-118). A piodermite caracteriza-se como uma das doenças mais comuns entre os cães. sendo a doença mais frequente dos mamíferos e a dermatopatia mais comumente diagnosticada na clínica canina. A patogenia da piodermite canina está fundamentada em alguns fatores importantes, eximo a existência de certas diferenças anatômicas da pele do cão comparada com outras espécies. O fino e compacto extrato córneo canino, com seu material intercelular esparso e rico em lipídeos, representa uma barreira epidérmica pouco eficiente contra um potencial invasor entre os folículos pilosos, acarietando uma frequência aumentada da área de infecção bacteriana superficial (Matousek JL, Campbell KL. A comparative review of cutaneous pH. VetDermatol 2002;13:293-300).In most pyoderma, bacterial participation is secondary to predisposing factors known as pre-existing diseases such as seborrhea, ectoparasites, allergies (atopias), endocrine disorders and immunological disorders. Pyoderma may also be classified as idiopathic, in which the primary cause is not identifiable and bacterial infections may be recurrent. Therefore, since cutaneous homeostasis is impaired due to primary causes, adherence and colonization of virulent microorganisms are facilitated (Ihrke PJ. An overview of bacterial skin disease in the dog. Br Vet J 1987; 143: 112-118). Pyoderma is characterized as one of the most common diseases among dogs. being the most common mammalian disease and the most commonly diagnosed dermatopathy in the canine clinic. The pathogenesis of canine pyoderma is based on some important factors, except for the existence of certain anatomical differences in dog skin compared to other species. The thin and compact canine corneal extract, with its sparse, lipid-rich intercellular material, represents an inefficient epidermal barrier against an invasive potential between the hair follicles, causing an increased frequency of the surface bacterial infection area (Matousek JL, Campbell KL. A comparative review of cutaneous pH (VetDermatol 2002; 13: 293-300).

Indivíduos afetados pela piodermite podem desenvolver diversos sinais clínicos dependendo da raça do animal, tipo de infecção (superficial ou profunda), estágio da mesma e doença subjacente envolvida. O prurido pode ser inexistente, moderado ou intenso e as lesões podem ter distribuição localizada ou disseminada, sendo as pápulas, pústulas, crostas, colarinhos epidérmicos, alopécia, descamação e hiperpigmentação os sinais mais comuns (Mason IS. Canine pyoderma. J Small Animal Practice 1991;32:381-386.).Individuals affected by pyoderma may develop various clinical signs depending on the breed of the animal, type of infection (superficial or deep), stage of the disease and underlying disease involved. Itching may be nonexistent, moderate or severe and lesions may have localized or widespread distribution, with papules, pustules, scabs, epidermal collars, alopecia, scaling and hyperpigmentation being the most common signs (Mason IS. Canine pyoderma. J Small Animal Practice 1991; 32: 381-386.).

Até o início dos anos 80, o principal patógeno cutâneo isolado a partir de lesões piogênicas das dermatites na espécie canina era o Stsphylococcus aureus. Entretanto, já na segunda metade da década de setenta, baseado em estudos taxonômicos, uma nova espécie de estaíilococos coagulase positivo foi isolada a partir da pele de várias espécies animais incluindo o cão: o Staphyíococcus intermedius. Alguns anos após, vários estudos confirmaram a posição do S. intermedius como o principal patógeno isolado das piodermites caninas, sendo encontrado em até 91,6% dos casos (Medleau L et al. Frequency and antimicrobial susceptibility of Staphyíococcus species isolated from canine pyodermas. Am J Vet Res 1986;47:229-231).Until the early 1980s, the main cutaneous pathogen isolated from pyogenic dermatitis lesions in the canine species was Stsphylococcus aureus. However, as early as the second half of the 1970s, based on taxonomic studies, a new coagulase-positive staphylococcus species was isolated from the skin of several animal species including the dog: the Staphyiococcus intermedius. Several years later, several studies confirmed the position of S. intermedius as the main pathogen isolated from canine pyoderma, being found in up to 91.6% of cases (Medleau L et al. Frequency and antimicrobial susceptibility of Staphyococcus species isolated from canine pyodermas. Am J Vet Res 1986; 47: 229-231).

Para que se instale, colonize e origine as lesões características, o patógeno geralmente se aproveita das enfermidades de base como as alergopatias tegumentares, as disqueratinizações, as disfunções sebáceas, as enodermatoses foliculares, as endocrinopatias e as acarioses foliculares. Como outros fatores que predispõem a sua instalação, relatam-se as condições pruriginosas de distintas etiologias, os imunocomprometimentos e também, os erros de manejo higiênico (Ihrke PJ. An overview of bacterial skiri disease in the dog. Br Vet J 1987;143:112-118).In order to settle, colonize and originate the characteristic lesions, the pathogen usually takes advantage of the basic diseases such as cutaneous allergies, dyskeratinizations, sebaceous dysfunctions, follicular enodermatoses, endocrinopathies and follicular acaryeses. Other predisposing factors include the pruritic conditions of different etiologies, immunocompromised conditions and hygienic management errors (Ihrke PJ. An overview of bacterial skiri disease in the dog. Br Vet J 1987; 143: 112-118).

Componentes da superfície de estafilococos estão envolvidos na promoção de virulência e indução de doença. A maioria dos estafilococos são capazes de produzir cápsulas que inibem a quimiotaxia e fagocitose, além de facilitar a aderência, levando ao aumento da sobrevivência destes microorganismos. A parede celular, que é largamente constituída por peptideoglicanos, também possui fatores de coagulação (clumping factors) e proteína A nos estafilococos patogênicos (Ltoyd DH. Staphylococcus as a pathogen. International Congress of the Italian Asscciaticn of Companion Animais Veterinarians. 2006). O conhecimento sobre a patogênese da infecção por S. intermedius em cães e outros animais ainda é bastante escasso, portanto, os fatores de virulência, bem como seu papel exato, são pouco compreendidos. Sabe-se que é produzido um arsenal diverso destes fatores e que eles podem possuir papéis comuns, agindo sozinhos ou conjuntamente.Staphylococci surface components are involved in promoting virulence and disease induction. Most staphylococci are capable of producing capsules that inhibit chemotaxis and phagocytosis, as well as facilitating adherence, leading to increased survival of these microorganisms. The cell wall, which is largely made up of peptideoglycans, also has clumping factors and protein A in pathogenic staphylococci (Ltoyd DH. Staphylococcus as a pathogen. International Congress of the Italian Asscciaticn of Companion Veterinary Animals. 2006). Knowledge about the pathogenesis of S. intermedius infection in dogs and other animals is still quite scarce, so virulence factors, as well as their exact role, are poorly understood. It is known that a diverse arsenal of these factors is produced and that they may have common roles acting alone or in concert.

Embora existam vários relatos referentes aos fatores de virulência associados às cepas de S. aureus, há poucas informações concernentes àqueles produzidos por cepas de S. intermedius. Componentes da superfície celular, coagulase, enzimas extracelulares e toxinas têm sido relatados (Greene RT, Lammler C. Staphylococcus intermedius: current knowledge on a pathogen of veterinary importance. J \/et Med 1993;40:206-214). O papel específico de cada um deles na patogênese das piodermites caninas ainda não foi elucidado, mas é provável que a atuação in vivo destes fatores ocorra de maneira sinérgica potencializando a virulência da cepa infectante. Os principais fatores de virulência de S. intermedius conhecidos são: a) Glicocálix: Os patógenos bacterianos extracelulares precisam aderir aos epitélios ou aos componentes da matriz extracelular para iniciar a colonização. A aderência pode ser mediada por cápsula polissacarídica ou adesinas de constituição protéica. KEANE & TAYLOR (1992) investigaram 19 cepas de S. intermedius isoladas de casos de piodermite em cães quanto à produção de glicocálix em ágar congo vermelho. Entre as cepas analisadas, 17 (89%) foram consideradas fortemente positivas e cinco (23,3%) fracamente positivas (Keane KA, Taylor DJ. Slime-producing Staphylococcus species in canine pyoderma. VetRecord 1992,130:75). b) Proteína A: O papel antifagocitico desta proteína está relacionado à sua capacidade de se ligar ao fragmento Fc da imunoglobulina G (IgG) tornado-o indisponível para interagir com seu receptor presente nas células fagocíticas. Esta ligação prejudica a opsonização das células bacíerianas e impede que a fagocitose das mesmas ocorra (Forsgren A, Sjoqvist J. “Protein A” from Staphylococcus aureus. III. Reaction with rabbit gamma globulin. J Immunol 1967;99:19-24). A expressão da proteína A tem sido verificada em cepas de S. intermedius. COX et al. (1986) investigaram a presença e a quantidade de proteína A em 139 cepas de S. intermedius isoladas de cães e gatos utilizando um teste imunoenzimático. A forma extracelular da proteína foi detectada em 118 (84,9%) cepas enquanto que a forma ligada ocorreu em apenas 6 (4,3%) cepas (Cox HU, Schmeer N, Newman SS. Protein A in Staphylococcus intermedius isolates from dogs and cats. Am J Vet Res 1986;47:1881-1884). É sugerido que a expressão da proteína A poderia contribuir para a patogênese das piodermites causadas pelo S. intermedius ao se ligar ao fragmento Fc. c) Coagulases: A coagulase é uma proteína que pode ser produzida nas formas livre e/ou ligada à célula bacteriana cuja ação protrombina-like” transforma o fibrinogênio em fibrina. BERG et al. (1984) pesquisaram a coagulase livre em 70 cepas de S. intermedius e todas foram positivas no teste em tubo com plasma de cão e 4 cepas foram negativas com plasma de coelho (Berg JN, Wendel! DE, Vogelweid C, Fales VVH. Identification of the major coagulase-positive Staphylococcus sp. of dogs as Staphylococcus intermedius. Am J Vet Res 1984;45:1307-1309). COX et al. (1985) avaliaram a utilização de plasma de cão e de coelho para a pesquisa da coagulase em isolamentos de S. intermedius obtidos de casos clínicos em cães. Entre as 105 cepas analisadas, as formas ligada e livre foram detectadas em 103 (98%) e 55 (52,3%) das cepas, respectivamente, quando o plasma de coelho foi utilizado. O plasma de cão foi testado em 101 cepas, detectando 46 (45,5%) e 49 (48,5%) cepas produtoras da coagulase livre e ligada, respectivamente (Cox HU, Newman SS, Roy AF, Hoskins JD. Comparison of coagulase test methods for Identification of S. intermedius from dogs. Am J Vet Res 1985;46). d) Enzimas: A catalase, proteases, nucleases e lipases podem ser produzidas pelo S. intermedius e essas enzimas podem contribuir para o fornecimento de nutrientes requeridos para o crescimento bacteriano facilitando a disseminação do patógeno (Konema 0N, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn Junior WC. The Gram-positive cocci - Part I: Staphylococci and related organisms. In:_____. Color atlas and textbook of diagnostic microbiology. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. p. 539-576). e) Hemolisinas: Cepas de Staphylococcus isoladas de cães com infecções são produtoras principalmente das hemolisinas beta e delta. Estas hemolisinas são responsáveis, respectivamente, pelas hemólises parcial e total em ágar sangue de ovino. DZIEWANOWSKA eí al. (1996) foram os primeiros a relatar a purificação e análise da hemolisina beta produzida por cepas de S. intermedius (Dziewanowska K, Edwards VM, Deringer JR, Bohach GA, Guerra DJ. Comparison of the beta-toxins from Staphylococcus aureus and Staphylococcus intermedius. Arch Biochem Bioph 1996;335:102-108). Os autores compararam suas propriedades àquelas da hemolisina beta de S. aureus. Apesar das similaridades quanto à ação enzimática, especificidade de substratos e parâmetros cinéticos, as proteínas diferiram no tamanho e composição de aminoácidos. As massas moleculares das hemolisinas beta do S. aureus e S. intermedius foram estimadas em 35.5 kDa e 33.5 kDa, respectivamente. SASAKI et al. (2005) analisaram a expressão da hemolisina beta em 96 cepas de S. intermedius isoladas de cães saudáveis e de cães com infecções cutâneas. Destas, 91 (94,8%) se mostraram positivas (Sasaki A, Shimizu A, Kawano J, Wakita Y, Hayashi T, Ootsuki S. Characterisiics of Staphylococcus intermedius isolates from diseased and healthy dogs. J Vet Med Sei 2005;67:103-106). 0 Leucotoxinas: PREVOST et al. (1995) (Prevost G, Bouakham T, Piemont Y, Monteil H. Characterization of a synergohymenotropic toxin produced by Staphylococcus intermedius. FEBS Letters 1995;376:135-140) e FUTAGAWA-SAITO et al. (2004) (Futagawa-Saito K, Sugiyama T, Karube S, Sakurai N, Ba-Thein W. Prevalence and characterization of leukotoxin-producing Staphylococcus intermedius in isolates from dogs and pigeons. J Clin Microbiol 2004;42:5324-5326) identificaram leucotoxinas em cepas de S. intermedius e demonstraram sua ação tóxica para várias células polimorfonucleares. g) Enterotoxinas: Ao contrário dos demais antígenos protéicos, as enterotoxinas escapam do processamento convencional e seletivamente se ligam ao complexo de histocompatibilidade maior da classe II (MHC-II) região V beta e do receptor de célula T (TCR). Tal ligação resulta na ativação policlonal de células T e liberação de grandes quantidades de citocinas. Devido a esta propriedade, as enterotoxinas estafilocócicas são denominadas de superantígenos. EDWARDS et al. (1997) compararam as propriedades moleculares, biológicas e imunológicas da enterotoxina C produzida por três cepas de S. intermedius isoladas de piodermites em cães com outras variantes desta enterotoxina. Os autores concluíram que estas toxinas são altamente conservadas quanto às suas propriedades biológicas e estruturais e que a treqüente associação desta toxina com cepas envolvidas em piodermites caninas sugere sua participação na sobrevivência do microrganismo e na patogênese da infecção (Edwards VM, Deringer JR, Callantine SD, Deobald CF, Berger PH, Kapur V, Síauffacher CV, Bohach GA. Characterization of the canine type C enterotoxin produced by Staphylococcus intermedius pyoderma isolates. Infect Immun 1997;65:2346-2352). h) Toxinas exfoliativas: TERAUCHI et al. (2003) verificaram a presença e a toxicidade da toxina exfoliaíiva produzida por 60 cepas de S. intermedius isoladas de cães. Segundo os autores, estes achados indicam que a toxina exfoliativa pode ser um importante fator de virulência produzido por cepas de S. intermedius envolvidas em piodermites em cães (1'erauchi R, Sato H, Hasegawa T, Yamaguchi T, Aizawa C, Maehara N. Isolation of exfoliative ioxin from Staphylococcus intermedius and its local toxicity in dogs. Vet Microbiol 2003;94:19-29).Although there are several reports regarding virulence factors associated with S. aureus strains, there is little information concerning those produced by S. intermedius strains. Cell surface components, coagulase, extracellular enzymes and toxins have been reported (Greene RT, Lammler C. Staphylococcus intermedius: current knowledge on a pathogen of veterinary importance. J. Med et 1993; 40: 206-214). The specific role of each one in the pathogenesis of canine pyoderma has not yet been elucidated, but it is probable that the in vivo action of these factors occurs synergistically enhancing the virulence of the infecting strain. The main known virulence factors of S. intermedius are: a) Glycocalix: Extracellular bacterial pathogens must adhere to epithelium or extracellular matrix components to initiate colonization. Adherence may be mediated by polysaccharide capsule or protein constitutive adhesins. KEANE & TAYLOR (1992) investigated 19 strains of S. intermedius isolated from cases of pyoderma in dogs for the production of glucochalix in red Congo agar. Among the strains analyzed, 17 (89%) were considered strongly positive and five (23.3%) weakly positive (Keane KA, Taylor DJ. Slime-producing Staphylococcus species in canine pyoderma. VetRecord 1992,130: 75). b) Protein A: The antifagocytic role of this protein is related to its ability to bind to the immunoglobulin G (IgG) Fc fragment making it unavailable to interact with its receptor on phagocytic cells. This binding impairs the opsonization of bacillian cells and prevents their phagocytosis from occurring (Forsgren A, Sjoqvist J. "Protein A" from Staphylococcus aureus. III. Reaction with rabbit gamma globulin. J Immunol 1967; 99: 19-24). Protein A expression has been verified in S. intermedius strains. COX et al. (1986) investigated the presence and amount of protein A in 139 strains of S. intermedius isolated from dogs and cats using an enzyme-linked immunosorbent assay. The extracellular form of the protein was detected in 118 (84.9%) strains while the bound form occurred in only 6 (4.3%) strains (Cox HU, Schmeer N, Newman SS. Protein A in Staphylococcus intermedius isolates from dogs and cats Am J Vet Res 1986; 47: 1881-1884). It is suggested that protein A expression could contribute to the pathogenesis of pyoderma caused by S. intermedius by binding to the Fc fragment. c) Coagulases: Coagulase is a protein that can be produced in free and / or bacterial cell-bound forms whose prothrombin-like action ”transforms fibrinogen into fibrin. BERG et al. (1984) screened for free coagulase in 70 strains of S. intermedius and all were positive in the dog plasma tube test and 4 strains were negative in rabbit plasma (Berg JN, Wendel! DE, Vogelweid C, Fales VVH. of the major coagulase-positive Staphylococcus sp. of dogs as Staphylococcus intermedius (Am J Vet Res 1984; 45: 1307-1309). COX et al. (1985) evaluated the use of dog and rabbit plasma for coagulase research in isolations of S. intermedius obtained from clinical cases in dogs. Among the 105 strains analyzed, bound and free forms were detected in 103 (98%) and 55 (52.3%) of the strains, respectively, when rabbit plasma was used. Dog plasma was tested on 101 strains, detecting 46 (45.5%) and 49 (48.5%) free and bound coagulase producing strains, respectively (Cox HU, Newman SS, Roy AF, Hoskins JD. Comparison of coagulase test methods for Identification of S. intermedius from dogs (Am J Vet Res 1985; 46). d) Enzymes: Catalase, proteases, nucleases and lipases may be produced by S. intermedius and these enzymes may contribute to the supply of nutrients required for bacterial growth by facilitating the spread of the pathogen (Konema 0N, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger). PC, Winn Junior WC The Gram-positive cocci - Part I: Staphylococci and related organisms In: _____ Color atlas and textbook of diagnostic microbiology Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997. pp. 539-576). e) Hemolysins: Staphylococcus strains isolated from dogs with infections are mainly producers of beta and delta hemolysins. These hemolysins are responsible, respectively, for partial and total hemolysis in sheep blood agar. DZIEWANOWSKA et al. (1996) were the first to report the purification and analysis of hemolysin beta produced by S. intermedius strains (Dziewanowska K, Edwards VM, Deringer JR, Bohach GA, War DJ. Comparison of beta-toxins from Staphylococcus aureus and Staphylococcus intermedius Arch Biochem Bioph 1996; 335: 102-108). The authors compared their properties to those of S. aureus hemolysin beta. Despite the similarities in enzymatic action, substrate specificity and kinetic parameters, proteins differed in amino acid size and composition. The molecular masses of beta hemolysins of S. aureus and S. intermedius were estimated at 35.5 kDa and 33.5 kDa, respectively. SASAKI et al. (2005) analyzed the expression of hemolysin beta in 96 strains of S. intermedius isolated from healthy dogs and dogs with skin infections. Of these, 91 (94.8%) were positive (Sasaki A, Shimizu A, Kawano J, Wakita Y, Hayashi T, Ootsuki S. Characteristics of Staphylococcus intermedius isolates from diseased and healthy dogs. J Vet Med Sei 2005; 67: 103-106). Leukotoxins: PREVOST et al. (1995) (Prevost G, Bouakham T, Piedmont Y, Monteil H. Characterization of a synergohymenotropic toxin produced by Staphylococcus intermedius. FEBS Letters 1995; 376: 135-140) and FUTAGAWA-SAITO et al. (2004) (Futagawa-Saito K, Sugiyama T, Karube S, Sakurai N, Ba-Thein W. Prevalence and characterization of leukotoxin-producing Staphylococcus intermedius in isolates from dogs and pigeons. J Clin Microbiol 2004; 42: 5324-5326) identified leukotoxins in S. intermedius strains and demonstrated their toxic action to several polymorphonuclear cells. g) Enterotoxins: Unlike other protein antigens, enterotoxins escape conventional processing and selectively bind to the major histocompatibility complex of class II (MHC-II) V-beta region and T-cell receptor (TCR). Such binding results in polyclonal T cell activation and release of large amounts of cytokines. Because of this property, staphylococcal enterotoxins are called superantigens. EDWARDS et al. (1997) compared the molecular, biological and immunological properties of enterotoxin C produced by three strains of S. intermedius isolated from pyoderma in dogs with other variants of this enterotoxin. The authors concluded that these toxins are highly conserved for their biological and structural properties and that the frequent association of this toxin with strains involved in canine pyoderma suggests their participation in the microorganism survival and infection pathogenesis (Edwards VM, Deringer JR, Callantine SD). , Deobald CF, Berger PH, Kapur V, Sauffacher CV, Bohach GA Characterization of the canine type C enterotoxin produced by Staphylococcus intermedius pyoderma isolates (Infect Immun 1997; 65: 2346-2352). h) Exfoliative toxins: TERAUCHI et al. (2003) verified the presence and toxicity of the exfoliative toxin produced by 60 strains of S. intermedius isolated from dogs. According to the authors, these findings indicate that exfoliative toxin may be an important virulence factor produced by S. intermedius strains involved in pyoderma in dogs (1'erauchi R, Sato H, Hasegawa T, Yamaguchi T, Aizawa C, Maehara N Isolation of exfoliative ioxin from Staphylococcus intermedius and its local toxicity in dogs (Vet Microbiol 2003; 94: 19-29).

De maneira geral, as toxinas estafilocócicas apresentam grande importância no processo inflamatório devido à grande capacidade de infiltração no tecido tegumeníar intercelular ao penetrar nas camadas da pele normal, desorganizando esta estrutura e prejudicando a resposta celular no local da infecção, cujo aspecto citológico das células de defesa é de degeneração celular. O atual estado da técnica descreve para o tratamento da piodermite canina medicamentos tópicos, sistêmicos e vacinas terapêuticas.In general, staphylococcal toxins are of great importance in the inflammatory process due to the great infiltration capacity in the intercellular tegumenary tissue when penetrating the normal skin layers, disrupting this structure and impairing the cellular response at the site of infection. defense is of cellular degeneration. The current state of the art describes for the treatment of canine pyoderma topical, systemic drugs and therapeutic vaccines.

Os medicamentos tópicos incluem xampus, sabonetes anti-sépticos e soluções adstringentes e bactericidas. Dentre os medicamentos sistêmicos incluem-se, principaimente, os agentes aritibacterianos por via oral que possuem ação bactericida e espectro de ação restrito. É comum o emprego de fármacos das famílias das cefalosporinas e das quinolonas, embora inúmeros outros possam ser utilizados. Como complemento à terapia sistêmica, recorre-se, de forma usual, à terapia tópica concomitante, através de banhos regulares com xampus ou sabonetes e aplicações externas de soluções (Larsson CE. Estudo comparativo da eficácia da imunoterapia com bacterina e de dois esquemas de pulsoterapia antibiótica no manejo de piodermites superficiais idiopáticas recidivantes caninas. Dissertação de Mestrado. Universidade de São Paulo. 2008).Topical medications include shampoos, antiseptic soaps, and astringent and bactericidal solutions. Systemic drugs include mainly oral arytibacterial agents that have bactericidal action and restricted spectrum of action. The use of drugs from the cephalosporin and quinolone families is common, although numerous others may be used. As a complement to systemic therapy, concomitant topical therapy is commonly used through regular shampoo or soap baths and external application of solutions (Larsson CE. Comparative study of the efficacy of bacterin immunotherapy and two pulse therapy regimens). antibiotics in the management of canine recurrent idiopathic superficial pyoderma (Master's Dissertation. University of São Paulo, 2008).

Até o momento, não são descritas composições vacinais e métodos de vacinação baseados em toxóides de S. intermedius, com ou sem compostos adjuvantes, que permitem prevenção ou tratamento da piodermite canina sem a utilização concomitante de fármacos antimicrcbianos. Entretanto, o estado da técnica descreve vacinas para o tratamento da piodermite canina, compostas principalmente por bacterinas de S. aureus, que necessitam de tratamento combinado com fármacos antimicrobianos para se alcançar melhora clínica dos animais.To date, no vaccine compositions and vaccination methods based on S. intermedius toxoid, with or without adjuvant compounds, which allow the prevention or treatment of canine pyoderma without the concomitant use of antimicrobial drugs are described. However, the state of the art describes vaccines for the treatment of canine pyoderma, composed mainly of S. aureus bacterins, which require combined treatment with antimicrobial drugs to achieve clinical improvement of the animals.

Bacterina é a denominação dada à preparação de bactérias mortas usadas para imunização. Por outro lado, toxóide é uma toxina bacteriana, geralmente uma exotoxina, cuja toxicidade foi reduzida ou suprimida por meios químicos ou térmicos, enquanto suas propriedades imunogênicas são mantidas. Portanto, toxóides não são considerados material biológico em sua forma natural pelo fato de terem sofrido intervenção humana, por meios físicos ou químicos, para se alcançar redução de sua toxicidade. Toxóides apresentam utilidade em vacinas já que induzem uma resposta imune direcionada para a toxina original ou aumentam resposta imunológica a um cutro antígeno.Bacterine is the name given to the preparation of dead bacteria used for immunization. On the other hand, toxoid is a bacterial toxin, usually an exotoxin, whose toxicity has been reduced or suppressed by chemical or thermal means, while maintaining its immunogenic properties. Therefore, toxoids are not considered biological material in their natural form because they have undergone human intervention, by physical or chemical means, to achieve reduction of their toxicity. Toxoids are useful in vaccines as they induce an immune response directed to the original toxin or increase an immune response to an antigen.

Enfatiza-se, dessa maneira, a diferença conceituai e biológica entre toxóides e bacterinas, bem como a ausência de ocorrência natural dos primeiros na natureza.This emphasizes the conceptual and biological difference between toxoids and bacterins, as well as the absence of natural occurrence of the former in nature.

Entre as vacinas mais conhecidas para o tratamento da piodermite canina idicpática está o Staphage Lysate (SPL®), preparado com cepas de S. aureus dos sorotipos 1 e 3, lisadas por um bacteriófago, sendo do tipo bacterina. As pesquisas demonstraram que cães afetados que receberam o SPL® apresentaram maior controle da doença em comparação ao grupo que recebeu placebo, entretanto, em 5C% dos casos, injeções regulares foram necessárias após 22 meses do teste inicial. Devido ao tratamento com antibacteríano utilizado em todos os grupos de cães no estudo, não foi possível determinar o quanto uma resposta benéfica seria atribuída ao SPL® isoladamente (DeBoer DJ et al. Evaiuation of a commercial staphylococcal bacterin for management of idiopathic recurrent superficial pyoderma in dogs. Am J Vet Res 1990;51:636-639).Among the best known vaccines for the treatment of idiopathic canine pyoderma is Staphage Lysate (SPL®), prepared with strains of S. aureus of serotypes 1 and 3, lysed by a bacteriophage, being of the bacterin type. Research has shown that affected dogs receiving SPL® had better disease control compared to the placebo group, however, in 5C% of cases, regular injections were required after 22 months of the initial test. Due to the antibacterial treatment used in all dog groups in the study, it was not possible to determine how much a beneficial response would be attributed to SPL® alone (DeBoer DJ et al. Evidence from a commercial staphylococcal bacterin for management of idiopathic recurrent superficial pyoderma in dogs (Am J Vet Res 1990; 51: 636-639).

Respostas favoráveis similares foram obtidas em estudos que utilizaram uma composição de bacterinas contendo um conjunto de antígenos da parede celular e derivados toxóides de S. aureus (Staphoid AB®). Os animais foram tratados com antibacterianos sistêmicos orais juntamente com a vacina e os resultados foram considerados favoráveis, apesar da taxa de recaída em 56,25% dos casos, requerendo injeções adicionais (Pukay BP Treatment of canine bacterial hipersensitivity by hyposensitization with Staphylococcus aureus bacterin-toxoid. J Am Anim Hosp Assoe 1985;21:479-483).Similar favorable responses were obtained in studies using a bacterin composition containing a set of cell wall antigens and S. aureus toxoid derivatives (Staphoid AB®). The animals were treated with oral systemic antibacterials along with the vaccine and the results were considered favorable despite the relapse rate in 56.25% of the cases requiring additional injections (Pukay BP Treatment of canine bacterial hypersensitivity with Staphylococcus aureus bacterinolysis). toxoid J Am Anim Hosp Assoe 1985; 21: 479-483).

Em outro estudo para o tratamento da piodermite crônica recidivante, um produto baseado em Propionibacterium acnes (Immunoregulin®) foi desenvolvido, avaliando-se a eficácia do tratamento juntamente com antibacterianos. Os resultados demonstraram remissão completa ou melhora clínica das lesões em 80% dos cães comparado com 38% de melhora em cáes tratados com antibiótico e placebo. Segundo os autores, este microorganismo provoca a estimulação não específica do sistema imune (Becker AM et al. Propionibacterium acnes immunotherapy in chronic recurrent canine pyoderma, an adjunct to antibiotic therapy. J Vet Intem Med 1989;3:26-30). A vacina Estafilin® é uma bacterina composta de cepas de S. aureus e S. intermedius cujo protocolo preconiza o tratamento com fármacos antibacterianos. Os resultados apresentados foram considerados como de remissão plena ou moderada da ordem de 57,2%. Em pouco mais da metade dos casos tratados tornou-se desnecessária a manutenção de antibioticoterapia por longos períodos. Em face da inexistência de relatos sobre esta vacina, não é possível avaliar resultados obtidos relativos à eficácia e segurança do produto (Larsson Jr, CE. Estudo comparativo da eficácia da imunoterapia com bacterina e de dois esquemas de pulsoterapia antibiótica no manejo de piodermites superficiais idiopáticas recidivantes caninas. Dissertação de Mestrado. Universidade de São Paulo. 2008). A vacina Lysigin®, composta de bacterina de S. aureus, originalmente desenvolvida para o tratamento da mastite bovina, demonstrou eficácia no tratamento da piodermite canina, sendo que os autores observaram uma taxa de sucesso total de 90,40%, sem a necessidade de utilização concomitante de antibioticoterapia. De acordo com os autores, a administração intramuscular da bacterina em várias doses repetidas, e não em dose única, pode se apresentar útil como terapia de cães com piodermite recidivante induzida por S. intermedius (Borku MK et al. Efficacy of staphylococcal bacterin for treatment of canine recurrent pyoderma: an open clinicai trial. Rev Med Vet 2007;158:234-238).In another study for the treatment of relapsing chronic pyoderma, a product based on Propionibacterium acnes (Immunoregulin®) was developed, evaluating the efficacy of the treatment together with antibacterials. Results showed complete remission or clinical improvement of lesions in 80% of dogs compared with 38% improvement in antibiotic and placebo treated dogs. According to the authors, this microorganism causes non-specific stimulation of the immune system (Becker AM et al. Propionibacterium acnes immunotherapy in chronic recurrent canine pyoderma, an adjunct to antibiotic therapy. J Vet Intem Med 1989; 3: 26-30). Estafilin® vaccine is a bacterin composed of S. aureus and S. intermedius strains whose protocol recommends treatment with antibacterial drugs. The results presented were considered as full or moderate remission of 57.2%. In just over half of the treated cases, maintenance of antibiotic therapy for long periods was unnecessary. Due to the lack of reports on this vaccine, it is not possible to evaluate results regarding efficacy and safety of the product (Larsson Jr, CE. Comparative study of the efficacy of bacterin immunotherapy and two antibiotic pulse therapy regimens in the management of idiopathic superficial pyoderma canine relapses, Master's Dissertation, University of São Paulo, 2008). The Lysigin® vaccine, composed of S. aureus bacterin, originally developed for the treatment of bovine mastitis, demonstrated efficacy in the treatment of canine pyoderma, and the authors observed a total success rate of 90.40%, without the need for concomitant use of antibiotic therapy. According to the authors, intramuscular administration of bacterin in several repeated doses, rather than single doses, may be useful as therapy for dogs with S. intermedius-induced recurrent pyoderma (Borku MK et al. Efficacy of staphylococcal bacterin for treatment). of canine recurrent pyoderma: an open clinical trial (Rev Med Vet 2007; 158: 234-238).

Em estudo placebo controlado para investigar a eficácia de uma bacterina autógena de S. intermedius no controle da piodermite superficial recidivante idiopática canina, animais que não receberam terapia com a bacterina apresentaram lesões na pele significativamente maiores comparado ao grupo que recebeu a bacterina. Desta forma, os autores sugerem que a utilização de bacterinas autógenas de S. intermedius pode ser um método alternativo no controle da piodermite superficial recidivante idiopática (Curtis CF. et al. Masked, controlled study to investigate the efficacy of a Staphylococcus intermedius autogenous bacterin for the control of canine idiopathic recurrent superficial pyoderma. EurSoc Vet Dermatol 2006;17:163-168). O documento de patente CN1372949A intitulado "MEDICINE FOR TREATING PYODERMA AND ITS PREPARING PROCESS" revela um medicamento na forma de unguento para o tratamento de pioderma preparado através da mistura de vários componentes naturais. As vantagens incluem o alto poder curativo e o curto período de tratamento necessário para resolução do quadro. O documento de patente W09710830A1 intitulado "PRODUIT DE LA REACTION DE L'ARGININE ET DE L'ACIDE P-AMINOBENZOIQUE" descreve o produto da reação entre arginina e ácido p-aminobenzóico (PABA), composições de uso humano e veterinário úteis para o tratamento de uma série de condições dermatológicas, incluindo queimaduras, eczemas, feridas, dermatites e pioderma. O documento de patente UA29449U intitulado "'SILVER OF SHUMERS' COSMETIC THERAPEUTIC GEL” descreve um gel terapêutico cosmético útil para o tratamento ou prevenção de acne pustular ou papular, bem como quadros de pioderma de origem bacteriana. O documento de patente RU2258220C1 intitulado "METHOD FOR PREDICTING THE FLOW OF PYODERMAS" descreve um método através do qual se realiza o isolamento de culturas puras de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis de uma área perifocal para detecção de atividade antilisozima. Para valores menores que 4.5 ± 0.5 mcg/ml, considera-se que existe um fluxo agudo de pioderma, e para valores superiores a 6 ± 0.5 mcg/ml considera-se um fluxo crônico de pioderma. O método sugerido proporciona detectai casos de doenças com pústula na pele, cuiminando com uma maior eficiência para o diagnóstico. O documento de patente WO/2002/074324 intitulado "COLLAGEN-BINDING ADHESIN FROM STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS AND METHOD OF USE" diz respeito a uma adesina ligadora de coiágeno derivada de Staphylococcus epidermidis, em particular ao processo de isolamento e uso da lipase GehD de S. epidermidis que demonstra habilidade de ligação à coiágeno e laminina. A invenção pode ser utilizada para a prevenção e o tratamento de doenças causadas por patógenos estafilocócicos, tais com S. epidermidis. Vários são os pontos deficientes do atual estado da técnica para prevenção e tratamento de casos de piodermite canina. O desenvolvimento de novas estratégias preventivas e terapêuticas para piodermite canina, com eficácia e custo-benefício apropriados, com capacidade de promover proteção efetiva e duradoura dos animais vacinados, com efeitos colaterais reduzidos ou ausentes, ainda é uma necessidade urgente na clínica veterinária. A presente invenção objetiva preencher esta deficiência do estado da técnica.In a placebo-controlled study to investigate the efficacy of an autogenous S. intermedius bacterin in controlling canine idiopathic relapsing superficial pyoderma, animals not receiving bacterin therapy had significantly larger skin lesions compared to the group receiving the bacterin. Thus, the authors suggest that the use of autogenous S. intermedius bacterins may be an alternative method for controlling idiopathic recurrent superficial pyoderma (Curtis CF. et al. Masked, controlled study to investigate the efficacy of Staphylococcus intermedius autogenous bacterin for the control of canine idiopathic recurrent superficial pyoderma (EurSoc Vet Dermatol 2006; 17: 163-168). Patent document CN1372949A entitled "MEDICINE FOR TREATING PYODERMA AND ITS PREPARING PROCESS" discloses an ointment drug for the treatment of pyoderma prepared by mixing various natural components. Advantages include the high healing power and the short treatment period required to resolve the condition. Patent Document W09710830A1 entitled "PRODUIT DE LA REACTION DE L'ARGININE ET DE L'ACIDE P-AMINOBENZOIQUE" describes the product of the reaction between arginine and p-aminobenzoic acid (PABA), compositions useful for human and veterinary use. from a range of dermatological conditions including burns, eczema, wounds, dermatitis and pyoderma. Patent Document UA29449U entitled 'SILVER OF SHUMERS' COSMETIC THERAPEUTIC GEL 'describes a cosmetic therapeutic gel useful for the treatment or prevention of pustular or papular acne, as well as pyoderma frames of bacterial origin. Patent document RU2258220C1 entitled' METHOD FOR PREDICTING THE FLOW OF PYODERMAS "describes a method by which pure cultures of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis are isolated from a peripocal area for detection of antiliszyme activity. For values below 4.5 ± 0.5 mcg / ml, that there is an acute pyoderma flow, and for values greater than 6 ± 0.5 mcg / ml a chronic pyoderma flow is considered.The suggested method provides detection of cases of skin pustule diseases, minimizing the diagnostic efficiency. Patent document WO / 2002/074324 entitled "COLLAGEN-BINDING ADHESIN FROM STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS AND METHOD OF USE" relates to to a Staphylococcus epidermidis-derived collagen-binding adhesin, in particular to the process of isolation and use of S. epidermidis GehD lipase which demonstrates the ability to bind to collagen and laminin. The invention may be used for the prevention and treatment of diseases caused by staphylococcal pathogens such as S. epidermidis. There are several shortcomings in the current state of the art for prevention and treatment of canine pyoderma cases. The development of new effective and cost-effective preventive and therapeutic strategies for canine pyoderma with the ability to promote effective and lasting protection of vaccinated animals with reduced or absent side effects is still an urgent need in the veterinary clinic. The present invention aims to fill this deficiency of the state of the art.

Embora a utilização de antibacterianos seja o tratamento de escolha para as infecções de piodermite canina, os protocolos são longos, alguns animais podem sofrer efeitos colaterais indesejáveis, como vômito, nefrotoxicidade e erosão da cartilagem articular, principalmente associados com a eritromicina, aminogiicosídeos e enrofloxacina, respectivamente (Lorenz MD, Cornelius LM, Ferguson DC.Although the use of antibacterials is the treatment of choice for canine pyoderma infections, protocols are long, some animals may suffer from undesirable side effects such as vomiting, nephrotoxicity and erosion of articular cartilage, especially associated with erythromycin, aminogiicosides and enrofloxacin, respectively (Lorenz MD, Cornelius LM, Ferguson DC.

Dermatological diseases. In:________. Small animal medicai therapeutics. Philadelphia: J. B. Lippincott Company, 1992).Dermatological diseases. In: ________. Small animal medical therapeutics. Philadelphia: J. B. Lippincott Company, 1992).

Além disso, a possibilidade da emergência de cepas resistentes. S. intermedias tem se tornado cada vez mais verificado a uma série de antibióticos. Em estudo de 50 cepas isoladas de cães com piodermite, observou-se a resistência a diversos antimicrobianos tais como oxitetraciclina, cloranfenicol, estreptomicina, clindamicina, gentamicina, enrofloxacin, marbofloxacin, dentre outros. Adicionalmente, aproximadamente 42% das cepas testadas foram simultaneamente resistentes a três ou mais classes de antimicrobianos (Ganiere JP et al. Antimicrobial drug susceptibility of Staphylococcus intermedius clinicai isolates from canine pyoderma. J Vet Med 2005;52:25-31).In addition, the possibility of emergence of resistant strains. S. intermediates have become increasingly checked for a number of antibiotics. In a study of 50 strains isolated from dogs with pyoderma, resistance to several antimicrobial agents was observed, such as oxytetracycline, chloramphenicol, streptomycin, clindamycin, gentamicin, enrofloxacin, marbofloxacin, among others. Additionally, approximately 42% of the strains tested were simultaneously resistant to three or more antimicrobial classes (Ganiere JP et al. Antimicrobial drug susceptibility of Staphylococcus intermedius isolates from canine pyoderma. J Vet Med 2005; 52: 25-31).

Além do risco de falha no tratamento de cães devido à dose e à duração inadequadas do tratamento, ao envolvimento de cepas resistentes aos antibacterianos de escolha, à utilização concomitante de corticóides e ao diagnóstico clínico incorreto, os antimicrobianos podem ainda aumentar o risco de transmissão para humanos em contato com animais doentes. Neste sentido, foi demonstrado que os donos de cães afetados pela piodermite profunda frequentemente possuíam cepas de S. intermedius multiresistentes a antimicrobianos que ocorriam em seus animais, considerando, portanto, o risco da possível transferência de genes resistentes de cepas caninas a estafilococos patogênicos humanos (Guardabassi L et al. Transmission of multiple antimicrobial-resistant Staphylococcus intermedius between dogs affected by deep pyoderma and their owners. Vet Microbiol 2004;98:23-27). A maioria das vacinas comercializadas atualmente é composta por bacterinas de S. aureus ou S. intermedius e preconiza o tratamento prévio ou concomitante com fármacos antibacterianos para um bom índice de remissão de lesões, o que toma esse tratamento combinado propício ao surgimento das complicações derivadas do uso de antibióticos. Além disso, a administração de bacterinas promove a produção de anticorpos direcionados contra a célula bacteriana como um todo, e não contra toxinas que podem eventualmente ser secretadas pela bactéria durante a patogênese da doença. Portanto, os anticorpos produzidos em resposta às vacinas convencionais para piodermite não são capazes de neutralizar toxinas que possuem papel importante no processo inflamatório da piodermite. Outro problema diz respeito ao protocolo longo de administração de algumas vacinas, como o Staphage Lysate (SPL®), de até 22 meses, por exemplo. O conjunto dos fatores deficientes encontrados no estado da técnica para prevenção e tratamento da piodermite canina levou os pesquisadores da presente invenção a desenvolver uma nova composição vacinai útil para prevenção ou tratamento da piodermite canina, bem como um novo método de vacinação para prevenção ou tratamento da piodermite canina, baseados na utilização de toxóides de S. intermedius, seus análogos ou derivados, juntamente com compostos adjuvantes e carreadores, veículos ou exciplentes farmaceuticamente aceitáveis. üs pesquisadores da presente invenção descobriram que animais diagnosticados com piodermite canina mostraram marcante melhora clínica após a utilização da composição vacina! e do método de vacinação reivindicados neste pedido de patente. Além disso, foi descoberto que a composição vacinai e o método de vacinação desenvolvidos são úteis para a prevenção de quadros de piodermite canina. A vacina pode ser utilizada de forma preventiva ou curativa e dispensa a administração diária de antibacterianos orais ou injetáveis para o controle de episódios da infecção por S. intermedius.In addition to the risk of failure to treat dogs due to inadequate dose and duration of treatment, involvement of the antibacterial resistant strains of choice, concomitant use of corticosteroids, and incorrect clinical diagnosis, antimicrobials may also increase the risk of transmission to humans in contact with sick animals. In this sense, it was shown that dog owners affected by deep pyoderma often had multidrug-resistant S. intermedius strains that occurred in their animals, therefore considering the risk of possible transfer of resistant genes from canine strains to human pathogenic staphylococci ( Guardabassi L. Transmission of multiple antimicrobial-resistant Staphylococcus intermedius between dogs affected by deep pyoderma and their owners (Vet Microbiol 2004; 98: 23-27). Most vaccines currently marketed are composed of S. aureus or S. intermedius bacterins and recommend prior or concomitant treatment with antibacterial drugs for a good rate of lesion remission, which makes this combined treatment favorable to the emergence of complications derived from the disease. use of antibiotics. In addition, bacterin administration promotes the production of antibodies directed against the bacterial cell as a whole, and not against toxins that may eventually be secreted by the bacterium during the pathogenesis of the disease. Therefore, antibodies produced in response to conventional pyoderma vaccines are unable to neutralize toxins that play an important role in the inflammatory process of pyoderma. Another problem concerns the long protocol for administration of some vaccines, such as Staphage Lysate (SPL®), up to 22 months, for example. The set of deficient factors found in the prior art for canine pyoderma prevention and treatment has led the researchers of the present invention to develop a novel vaccine composition useful for canine pyoderma prevention or treatment, as well as a new vaccination method for the prevention or treatment of canine pyoderma. canine pyoderma, based on the use of S. intermedius toxoids, analogues or derivatives thereof, together with pharmaceutically acceptable adjuvants and carriers, vehicles or excipients. Researchers of the present invention found that animals diagnosed with canine pyoderma showed marked clinical improvement after the use of the vaccine composition! and the method of vaccination claimed in this patent application. Furthermore, it has been found that the developed vaccine composition and method of vaccination are useful for the prevention of canine pyoderma. The vaccine can be used preventively or curatively and does not require daily administration of oral or injectable antibacterial agents to control episodes of S. intermedius infection.

Um dos objetos da presente invenção consiste em uma nova composição vacinai que utiliza toxóides de S. intermedius, seus análogos ou derivados, compostos adjuvantes e carreadores, veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis, para prevenção ou tratamento de quadros de piodermite canina.One object of the present invention is a novel vaccine composition utilizing S. intermedius toxoids, their analogs or derivatives, pharmaceutically acceptable adjuvants and carriers, vehicles or excipients, for the prevention or treatment of canine pyoderma.

Um outro objeto desta invenção consiste em um novo método de vacinação para a prevenção ou tratamento de quadros de piodermite canina que utiliza a referida composição vacinai.Another object of this invention is a novel vaccination method for the prevention or treatment of canine pyoderma that utilizes said vaccine composition.

Um outro objeto da presente invenção consiste no uso de toxóides de Staphylococcus intermedius, seus análogos ou derivados para a preparação de um medicamento para prevenção ou tratamento de quadros de piodermite canina. A FIGURA 01 apresenta o perfil eletroforético do filtrado protéico submetido à técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). A coluna da esquerda indica os marcadores moleculares em kDa e a coluna da direita representa o filtrado protéico com suas bandas em kDa. A FIGURA 02 mostra a apresentação de um cão doente antes das imunizações (A e B) e após as imunizações, 12 dias depois (C e D).Another object of the present invention is the use of Staphylococcus intermedius toxoids, analogs or derivatives thereof for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of canine pyoderma. FIGURE 01 shows the electrophoretic profile of the protein filtrate submitted to the polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) technique. The left column indicates the molecular markers in kDa and the right column represents the protein filtrate with its kDa bands. FIGURE 02 shows the presentation of a diseased dog before immunizations (A and B) and after immunizations, 12 days later (C and D).

As formas alternativas e modificações dentro do escopo da presente invenção se tornarão facilmente detectáveis por alguém conhecedor do estado da técnica a partir da leitura das especificações a seguir e das referências de suporte apresentadas.Alternative forms and modifications within the scope of the present invention will become readily apparent to one of ordinary skill in the art from reading the following specifications and the support references provided.

De acordo com a presente invenção, para se alcançar a nova composição vacinai para piodermite canina, um filtrado protéico é obtido a partir do isolamento de exoproteínas de uma cepa de Staphylococcus intermedius foite produtora de hemolisina beta. Tal isolamento pode ser alcançado utilizando-se eletroforese em gel de poliacrilamida, por exemplo, não limitante.According to the present invention, to achieve the novel canine pyoderma vaccine composition, a protein filtrate is obtained from the isolation of exoproteins from a hemolysin beta-producing Staphylococcus intermedius foite strain. Such isolation can be achieved using, for example, non-limiting polyacrylamide gel electrophoresis.

As massas moleculares das proteínas do filtrado variam de 19 a 102 kDa, com valores de 19, 23.1, 28.3, 29.6, 34.2, 35.9, 44.7, 53.8, 71.2, 83.5 e 102 kDa. Essas proteínas compreendem, pelo menos, a hemolisina beta (34.2 kDa), proteína A (44.7 kDa) e enterotoxina C (28.3 e 29.6 kDa). Ligeiras variações desses valores de massa molecular para as proteínas do filtrado podem ser encontradas. A dosagem protéica do filtrado situa-se na faixa de 4.0-10.0 g/L, preferencialmente 6.3 g/L e apresenta UH na faixa de 10.0-22.0, preferencialmente 16 UH. Em um perfil de eletroforese em gel de poliacrilamida, o filtrado protéico compreende 11 bandas, conforme apresentado na figura 01, com proteínas com massa molecular entre 19 e 102 kDa. Essas proteínas são inativadas através de meios químicos, como solução fenolada, por exemplo. Análogos e/ou derivados das proteínas do filtrado obtido são contemplados no escopo de proteção da presente invenção. Os termos "análogos" ou "derivados" incluem fragmentos, partes, porções, equivalentes químicos, mutantes ou homólogos de origem natural, sintética ou recombinante.The molecular masses of the filtrate proteins range from 19 to 102 kDa, with values of 19, 23.1, 28.3, 29.6, 34.2, 35.9, 44.7, 53.8, 71.2, 83.5 and 102 kDa. These proteins include at least hemolysin beta (34.2 kDa), protein A (44.7 kDa) and enterotoxin C (28.3 and 29.6 kDa). Slight variations of these molecular mass values for filtrate proteins can be found. The protein dosage of the filtrate is in the range of 4.0-10.0 g / l, preferably 6.3 g / l and has UH in the range of 10.0-22.0, preferably 16 UH. In a polyacrylamide gel electrophoresis profile, the protein filtrate comprises 11 bands, as shown in Figure 01, with proteins with molecular mass between 19 and 102 kDa. These proteins are inactivated by chemical means, such as phenol solution, for example. Analogs and / or protein derivatives of the obtained filtrate are contemplated within the scope of protection of the present invention. The terms "analogs" or "derivatives" include fragments, parts, portions, chemical equivalents, mutants or homologues of natural, synthetic or recombinant origin.

Compostos adjuvantes conhecidos no estado da técnica são adicionados à composição vacinai. Adjuvantes são incluídos ou adicionados a vacinas e outras formulações imunogênicas com o intuito de potencializar e, em alguns casos, direcionar a resposta imune. Conhecedores do estado da técnica observarão que qualquer adjuvante padrão bem conhecido pode ser utilizado na presente invenção. Adjuvantes adequados para uso nas vacinas da presente invenção incluem, mas não se limitam a, sais de alumínio insolúveis, particulannente as formas hidróxido e fosfato (coletivamente, “alum”), adjuvante incompleto de Freund, adjuvante completo de Freund, polissacarídeos iônicos, como o grupo dietil-aminoetil (“DEAE”), dextran sulfato, saponinas, complexos imunoestimulantes e/ou combinações destes. Em uma composição preferível, adjuvantes que causam nenhum ou apenas leve efeito colateral são utilizados. Outros compostos adjuvantes adequados para uso em presente invenção incluem, mas não se limitam a, aqueles descritos no Depósito Internacional N° PCT/AU99/01167, publicado em 21 de Janeiro de 1999 como W099/02180 e no Depósito Internacional N° PCT/AU98/00532, publicado em 20 de Julho de 2000 como WO 99/41720, os quais são citados neste texto como referência. Para aumentar a imunogenicidade da composição, os toxóides podem ser conjugados com outras moléculas como proteínas, polipeptídeos ou peptídeos, como albumina, hemocianina, tireoglobulina e seus derivados, bem como polissacarídeos, carboidratos, polímeros, ou qualquer outro composto imunogênico conhecido no estado da técnica.Adjuvant compounds known in the art are added to the vaccine composition. Adjuvants are included or added to vaccines and other immunogenic formulations to enhance and, in some cases, direct the immune response. Those skilled in the art will appreciate that any well known standard adjuvant may be used in the present invention. Suitable adjuvants for use in the vaccines of the present invention include, but are not limited to, insoluble aluminum salts, particularly hydroxide and phosphate forms (collectively, "alum"), incomplete Freund's adjuvant, complete Freund's adjuvant, ionic polysaccharides such as diethyl aminoethyl group ("DEAE"), dextran sulfate, saponins, immunostimulating complexes and / or combinations thereof. In a preferred composition, adjuvants that cause no or only slight side effects are used. Other adjuvant compounds suitable for use in the present invention include, but are not limited to, those described in International Depot No. PCT / AU99 / 01167, published January 21, 1999 as W099 / 02180 and International Depot No. PCT / AU98 / 00532, published July 20, 2000 as WO 99/41720, which are cited herein by reference. To enhance the immunogenicity of the composition, toxoids may be conjugated to other molecules such as proteins, polypeptides or peptides such as albumin, hemocyanin, thyroglobulin and derivatives thereof, as well as polysaccharides, carbohydrates, polymers, or any other immunogenic compound known in the art. .

Carreadores, veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis são utilizados na presente composição vacinai para piodermite canina. Carreadores, veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antifúngicos ou antibacterianos, agentes isotônicos ou retardadores de absorção, entre outros, não limitante. O carreador, veículo ou excipiente pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e glicol polietilenc líquido e outros, não limitante), misturas apropriadas destas e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento como a lecitina. Exceção deve ser feita para agentes que não são compatíveis com estabilidade da composição vacinai em questão. Ingredientes ativos suplementares podem também ser incorporados na composição. A prevenção da ação de microorganismos na solução pode ser alcançada através do uso de agentes antifúngicos e antibacterianos, tais como, parabenos, clorobutanol, fenóis, ácido sórbico, timerosal e outros, não limitante. Em vários casos, torna-se preferível a utilização de agentes isotônicos, por exemplo, carboidratos ou cloreto de sódio. Absorção prolongada ou retardada das composições injetáveis podem ser alcançadas através do uso de ferramentas de liberação controlada. Vários fatores contribuem para a seleção de uma determinada ferramenta para liberação controlada. A reprodutibilidade da síntese do material, o processo de encapsulamento, o custo dos materiais e do processo de encapsulamento, o perfil toxicológico, a cinética de liberação desejada e a compatibilidade físico-química do material com as proteínas são fatores que devem cuidadosamente avaliados. Exemplo de moléculas úteis para serem utilizadas em ferramentas de liberação controlada incluem policarbonatos, poliésteres, poliuretanos, poliortoésteres, poliamidas, PLGA e outros polímeros biodegradáveis, moléculas de ciclodextrina, lipossomas ou géis. O método de vacinação da presente invenção utiliza a composição vacinai referida anteriormente e é aplicada em uma quantidade efetiva para promover prevenção ou tratamento de quadros de piodermite canina. O método é capaz de elevar a titulação de anticorpos de hemolisina beta nos animais vacinados. Os animais são imunizados com pelo menos uma dose da composição vacinai para prevenção ou tratamento de quadros de piodermite canina. Doses subsequentes podem ser empregadas caso haja necessidade, de acordo com o caso.Pharmaceutically acceptable carriers, vehicles or excipients are used in the present canine pyoderma vaccine composition. Pharmaceutically acceptable carriers, vehicles or excipients include all non-limiting solvents, dispersion media, coatings, antifungal or antibacterial agents, isotonic agents or absorption retarders. The carrier, vehicle or excipient may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (e.g. glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol and others, non-limiting), appropriate mixtures thereof and vegetable oils. Proper flowability may be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin. Exception should be made for agents that are not compatible with the stability of the vaccine composition in question. Supplementary active ingredients may also be incorporated into the composition. Prevention of the action of microorganisms in the solution can be achieved through the use of non-limiting antifungal and antibacterial agents such as parabens, chlorobutanol, phenols, sorbic acid, thimerosal and others. In many cases, it is preferable to use isotonic agents, for example carbohydrates or sodium chloride. Prolonged or delayed absorption of injectable compositions can be achieved through the use of controlled release tools. Several factors contribute to the selection of a particular tool for controlled release. The reproducibility of the material synthesis, the encapsulation process, the cost of the materials and the encapsulation process, the toxicological profile, the desired release kinetics and the physicochemical compatibility of the material with proteins should be carefully evaluated. Examples of molecules useful for use in controlled release tools include polycarbonates, polyesters, polyurethanes, polyorthoesters, polyamides, PLGA and other biodegradable polymers, cyclodextrin molecules, liposomes or gels. The vaccination method of the present invention utilizes the vaccine composition referred to above and is applied in an effective amount to promote prevention or treatment of canine pyoderma. The method is capable of elevating hemolysin beta antibody titration in vaccinated animals. Animals are immunized with at least one dose of the vaccine composition for prevention or treatment of canine pyoderma. Subsequent doses may be employed as required, as appropriate.

Formas de administração adequadas da composição vacinai incíuem, de forma não limitante, as vias tópica, ora!, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intranasal ou intradérmica.Suitable administration forms of the vaccine composition include, but are not limited to, the topical, sometimes anal, vaginal, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intranasal or intradermal routes.

As formulações farmacêuticas apropriadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. Essas soluções devem ser física e quimicamente estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento e devem ser preservadas contra a ação contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos.Pharmaceutical formulations suitable for injectable use include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile powders for the preparation of sterile injectable solutions or dispersion. These solutions must be physically and chemically stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi.

Os exemplos seguintes são fornecidos com o intuito de ilustrar os principais aspectos da presente invenção. Deve-se ressaltar que, para aqueles que conhecem o estado da técnica, as descrições apresentadas a seguir, utilizadas pelos inventores desta invenção, podem ser consideradas como uma das várias formas pelas quais a invenção pode ser alcançada. É compreendido que mudanças empregadas na invenção podem ser efetivadas e ainda se obter resultados iguais ou similares aos descritos no escopo desta invenção. A invenção é adicionalmente explicada por meio dos seguintes exemplos: EXEMPLO 01: Origem da cepa de S. intermedius Para a realização dos experimentos foi escolhida uma cepa de S. intermedius forte produtora de hemolisina beta em ágar sangue de carneiro isolada de cão com piodermite e identificada inicialmente pelas morfologias colonial e celular, expressão da dupla hemólise em ágar sangue de carneiro, crescimento em ágar Manítol (não fermentadora em 24 horas) e pela produção de catalase. Colônias brancas com aproximadamente 1 a 2 mm de diâmetro após 24 horas de incubação a 37°C foram submetidas ao exame bacterioscópico revelando cocos Gram-positivos. A cepa escolhida foi denominada S. iníermedius Cy66 e apresentou as seguintes características fenotípicas apresentadas na Tabela 01.The following examples are provided to illustrate the main aspects of the present invention. It should be noted that for those skilled in the art, the following descriptions used by the inventors of this invention may be considered as one of several ways in which the invention may be achieved. It is understood that changes employed in the invention may be effected and still obtain the same or similar results as those described within the scope of this invention. The invention is further explained by means of the following examples: EXAMPLE 01: Origin of the S. intermedius strain For carrying out the experiments, a strong hemolyzin-producing S. intermedius strain was selected on isolated sheep blood agar from pyoderma and initially identified by colonial and cellular morphologies, expression of double hemolysis in sheep blood agar, growth in Mannitol agar (non - fermenting in 24 hours) and catalase production. White colonies approximately 1 to 2 mm in diameter after 24 hours of incubation at 37 ° C were submitted to bacterioscopic examination revealing Gram-positive cocci. The chosen strain was named S. iníermedius Cy66 and presented the following phenotypic characteristics presented in Table 01.

Tabela 01: Características fenotípicas da cepa Cy66 de S. intermedius. EXEMPLO 02: Obtenção do toxóide O filtrado protéico foi obtido após o cultivo da cepa Cy66 em 400 mL de caldo BHI (“Brain Heart Infusion”) isotônico (NaCI a 0.8õ%) suplementado ccm glicose a 2% incubado a 37°C durante 7 dias, sendo a hemolisina beta escolhida como marcadora da expressão fenotípica de virulência tóxica. Após este período, o cultivo foi centrifugado a 6000 r.p.m. durante 15 minutos obtendo-se sobrenadante límpido o qual foi filtrado em membrana de nitrocelulose de 0.45 pm. A dosagem protéica correspondeu a 6.3 g/L. A titulação da hemolisina beta foi realizada utilizando hemácias de carneiro (sangue de carneiro desfibrinado, Newprov) como indicadoras da atividade hemolítica. Um volume de 0,25 mL de solução fisiológica foi adicionado em uma série de 6 tubos de ensaio de 10 x 75 mm. Em seguida, 0.25 mL do filtrado foi acrescentado no primeiro tubo e, após homogeneização, 0.25 mL foi transferido para o segundo tubo e assim sucessivamente até serem obtidas diluições seriadas de até 1:64. De cada tubo foram removidos 25 pL da diluição e acrescentados 25 pL de uma solução de hemácias de carneiro a 5% cuja concentração final se tornou a 0,5%. A seguir, cs tubos foram incubados durante 36 horas em banho-maria a 37°C. Em seguida, a atividade hemolítica total da hemolisina beta foi verificada agitando-se os tubos e incubando-os em temperatura de geladeira a 4°C durante 4 horas, tendo em vista o fenômeno de “hot-cold" (Smyth CJ, Moliby R, Wadstrom T. Phenomenon of hot-cold hemolysis: chelator-induced lysis of sphingomyelinase-treated erythrocytes. Infection and Immunity 1975;12:1104-1111). Após este período, a leitura da atividade hemolítica foi realizada identificando-se os tubos que apresentaram hemólise total evidenciada pela ausência da formação do botão de hemácias no fundo do tubo. O título da atividade hemolítica obtido correspondeu ao inverso da diluição do último tubo que apresentou as características citadas, ou seja, 16 UH (Unidades Hemolíticas). Como controle positivo utilizou-se hemolisina beta comercial (Beta toxin, Hardy Diagnostics, USA) com título de 32 e como controle negativo caldo BHI estéril.Table 01: Phenotypic characteristics of the Cy66 strain of S. intermedius. EXAMPLE 02: Obtaining the Toxoid Protein filtrate was obtained after culturing the Cy66 strain in 400 ml isotonic BHI (Brain Heart Infusion) broth (0.8% NaCI) supplemented with 2% glucose incubated at 37 ° C for 7 days, being the hemolysin beta chosen as a marker of the toxic virulence phenotypic expression. After this time, the culture was centrifuged at 6000 rpm for 15 minutes to give clear supernatant which was filtered through 0.45 pm nitrocellulose membrane. The protein dosage corresponded to 6.3 g / L. Hemolysin beta titration was performed using sheep red blood cells (defibrinated sheep blood, Newprov) as indicators of hemolytic activity. A volume of 0.25 mL of physiological solution was added in a series of 6 10 x 75 mm test tubes. Then 0.25 mL of the filtrate was added to the first tube and, after homogenization, 0.25 mL was transferred to the second tube and so on until serial dilutions of up to 1:64 were obtained. From each tube, 25 µl of the dilution was removed and 25 µl of a 5% ram red blood cell solution whose final concentration became 0.5% was added. The tubes were then incubated for 36 hours in a 37 ° C water bath. Subsequently, the total hemolytic activity of hemolysin beta was verified by shaking the tubes and incubating them at 4 ° C in a refrigerator for 4 hours in view of the hot-cold phenomenon (Smyth CJ, Moliby R , Wadstrom T. Phenomenon of hot-cold hemolysis: chelator-induced lysis of sphingomyelinase-treated erythrocytes (Infection and Immunity 1975; 12: 1104-1111) After this period, the reading of the hemolytic activity was performed by identifying the tubes that showed total hemolysis evidenced by the absence of red cell button formation at the bottom of the tube.The obtained hemolytic activity titer corresponded to the inverse of the dilution of the last tube which presented the mentioned characteristics, ie, 16 UH (Hemolytic Units). Commercial beta hemolysin (Beta toxin, Hardy Diagnostics, USA) with a titer of 32 and negative sterile BHI broth was used.

Um volume de 150 mL do filtrado foi submetido à eletroforese pela técnica de SDS-PAGE (“Sodium Dodecyl Sulfate-Poiyacrylamide Gel Electrophoresis’) utilizando cuba vertical (Amersham Biosciences). Para a precipitação das proteínas do filtrado foram adicionados 70% de uma solução liipersaturada de sulfato de amônio, sob agitação. O volume total foi centrifugado a 10000 r.p.m. durante 30 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o “pellet” ressuspendido com PBS (“Phosphate Buffer Solution”). Οε 3.0 mL obtidos foram acondicionados em saco para diálise com 21 mm de diâmetro e poros de 12 kDa (SIGMA) e dialisados em 2 litros de PBS em câmara fria, sob agitação. Foram realizadas quatro trocas do PBS, a primeira após 48 horas e as demais a cada 12 horas. Após a diálise, 30 pL da amostra foram diluídos em 30 pL de solução tampão com mercaptoetanol e fervidos durante 5 minutos. Foram aplicados no gel 25 pL da amostra diluída (1:2) e marcadores de massas moleculares com 20 a 220 kDa (Bench Marck®, Invitrogen). As exoproteínas estafilocócicas foram separadas em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes em 15% de poliacrilamida e em 5% de gel concentrador com sistema descontínuo, de acordo com LAEMMLI (1970). O tampão de corrida foi o tris-glicina e a eletroforese foi submetida a 70 V durante aproximadamente 90 minutos. As proteínas obtidas no gel foram coradas em solução de azul de Coomassie durante 60 minutos e o gel foi descorado com solução descorante. A estimativa das massas moleculares foi realizada com o auxílio do “software” Gel-proanalyser® versão 4.0.A 150 mL volume of the filtrate was electrophoresed by the SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Poiyacrylamide Gel Electrophoresis') technique using a vertical pan (Amersham Biosciences). To precipitate the protein from the filtrate, 70% of a lysersaturated ammonium sulfate solution was added under stirring. The total volume was centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes. The supernatant was discarded and the pellet resuspended with PBS (Phosphate Buffer Solution). The obtained 3.0 mL were packed in a dialysis bag with 21 mm diameter and 12 kDa pores (SIGMA) and dialyzed in 2 liters of PBS in a cold chamber under agitation. Four PBS changes were performed, the first after 48 hours and the other every 12 hours. After dialysis, 30 µl of the sample was diluted in 30 µl of mercaptoethanol buffer and boiled for 5 minutes. 25 µl of the diluted sample (1: 2) and 20 to 220 kDa molecular mass markers (Bench Marck®, Invitrogen) were applied to the gel. Staphylococcal exoproteins were separated on polyacrylamide gel under denaturing conditions in 15% polyacrylamide and 5% discontinuous concentrating gel according to LAEMMLI (1970). The running buffer was tris-glycine and the electrophoresis was subjected to 70 V for approximately 90 minutes. Proteins obtained on the gel were stained in Coomassie blue solution for 60 minutes and the gel was bleached with bleach solution. Molecular masses were estimated using Gel-proanalyser® version 4.0 software.

Um volume de 200 mL do filtrado foi fracionado em alíquotas de 5 ml. as quais foram submetidas à liofilização utilizando-se liofilizador (modelo Chamber RC300, Edward) sendo estocado a 4°C para os experimentos in vitro e in vivo.A 200 mL volume of the filtrate was fractionated into 5 mL aliquots. which were subjected to lyophilization using a lyophilizer (Chamber RC300 model, Edward) being stored at 4 ° C for in vitro and in vivo experiments.

Para a obtenção do conjunto dos toxóides um volume de 45 mL do filtrado descrito foi inativado utilizando-se 5 mL de solução fenolada a 6% e incubado a 37°C durante 5 dias. Após este período, a verificação da inativação da hemolisina beta foi realizada utilizando discos de papel filtro estéreis embebidos com 50 pL do filtrado, sendo os mesmos depositados sobre a superfície de placas de ágar sangue de carneiro. As placas foram incubadas a 37°C em câmara úmida durante 48 horas, sendo analisadas diariamente para verificação da presença do halo de hemólise parcial. Em seguida, a atividade hemolítica total da hemolisina beta foi verificada incubando-se as placas em geladeira a 4°C por 4 horas, tendo em vista o fenômeno de “hot-cold”. Como controles positivos da expressão da hemolisina beta foram utilizados o filtrado protéico liofilizado obtido e a hemolisina beta comercial (Beta toxin. Hardy Diagnostics®, USA) com título de 64. O teste de esterilidade do toxóide foi realizado inoculando-se 1.0 mL do toxóide em profundidade e em superfície de 5 tubos de caldo Thioglicolato sendo incubados a 37eC por 5 dias. A esterilidade foi verificada pela ausência de turbidade no caldo tanto na superfície quanto em profundidade. O teste de inocuidade foi realizado inoculando-se 0.25 mL do toxóide em 6 camundongos pela via subcutânea. A inocuidade foi verificada pela ausência de abscessos subcutâneos, óbitos e manutenção da vitalidade natural sendo acompanhados por 21 dias. A dosagem protéica do filtrado correspondeu a 6.3 g/L e apresentou 16 UH. Ao ser submetido à técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) mostrou perfil eletroforético mostrado na Figura 1, com 11 bandas, confirmando a presença de várias exoproteínas. As massas moleculares das proteínas do filtrado variaram de 19 a 102 kDa. A hemolisina beta apresentou-se com 34.2 kDa, situando-se logo abaixo de outra banda com 35.9 kDa. Segundo Dziewanowska et al. (1996), a hemolisina beta de cepas de S. intermedius apresenta 33.5 kDa (Dziewanowska K, Edwards VM, Deringer JR, Bohach GA, Guerra DJ. Comparison of the beta-toxins from Staphylococcus aureus and Staphylococcus intermedius. Arch Bioch Bioph 1996;335:102-108). Verificou-se a presença de banda com 44.7 kDa, massa molecular aproximada da proteína A a qual apresenta 42 kDa (Huang SH, Chang TC. Detection of Staphylococcus aureus by a sensitive immuno-PCR assay. Clin Chem 2004;50:1673-1674). Observou-se a presença de duas bandas de 28.3 e 29.6 kDa cujas massas moleculares são compatíveis coin aquelas apresentadas por cepas produtoras de enterotoxinas (Kotb M. Bacterial pyrogenic exotoxins as superantigens. Clin Microbiol 1995;8:411-426). EXEMPLO 03: Imunizações de cães saudáveis da raça Beagle Quatorze cães saudáveis da raça Beagle foram escolhidos para o experimento de verificação das respostas imunes humorais pós-vacinais. Dez animais foram imunizados. Os animais foram imunizados duas vezes com intervalos de 21 dias nas doses de 0.25 mL e 0.5 ml_, respectivamente, pela via subcutânea com a composição vacinai obtida. Quatro animais foram mantidos como controle, tendo recebido igual volume de solução fisiológica estéril. Antes da imunização, foram colhidas amostras de 5 mL de sangue total de cada animal. Vinte e um dias após a imunização, foram colhidos, assepticamente, 5 mL de sangue total sendo deixado em repouso para a perfeita coagulação e obtenção de soro límpido. Após a coagulação, o soro obtido foi centrifugado a 4.000 r.p.m. durante 10 minutos para eliminação tota! das hemácias.To obtain the toxoid pool a volume of 45 mL of the filtrate described was inactivated using 5 mL of 6% phenol solution and incubated at 37 ° C for 5 days. After this period, hemolysin beta inactivation was checked using sterile filter paper discs soaked with 50 µL of the filtrate and deposited on the surface of mutton blood agar plates. The plates were incubated at 37 ° C in a humid chamber for 48 hours and analyzed daily for the presence of the partial hemolysis halo. Subsequently, the total hemolytic activity of hemolysin beta was verified by incubating the plates in a refrigerator at 4 ° C for 4 hours, in view of the hot-cold phenomenon. Positive controls for the expression of hemolysin beta were the lyophilized protein filtrate obtained and commercial beta hemolysin (Beta toxin. Hardy Diagnostics®, USA) with a titer of 64. The toxoid sterility test was performed by inoculating 1.0 mL of the toxoid. depth and surface of 5 Thioglycolate broth tubes being incubated at 37 ° C for 5 days. Sterility was verified by the absence of turbidity in the broth at both surface and depth. The safety test was performed by inoculating 0.25 mL of the toxoid in 6 mice subcutaneously. The safety was verified by the absence of subcutaneous abscesses, deaths and maintenance of natural vitality being followed for 21 days. The protein dosage of the filtrate was 6.3 g / L and was 16 UH. When submitted to the technique of polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) showed electrophoretic profile shown in Figure 1, with 11 bands, confirming the presence of several exoproteins. Molecular masses of the filtrate proteins ranged from 19 to 102 kDa. Hemolysin beta was 34.2 kDa, just below another 35.9 kDa band. According to Dziewanowska et al. (1996), hemolysin beta of S. intermedius strains has 33.5 kDa (Dziewanowska K, Edwards VM, Deringer JR, Bohach GA, War DJ. Comparison of beta-toxins from Staphylococcus aureus and Staphylococcus intermedius. Arch Bioch Bioph 1996; 335: 102-108). The presence of 44.7 kDa band, approximate molecular weight of protein A which has 42 kDa (Huang SH, Chang TC. Detection of Staphylococcus aureus by a sensitive immuno-PCR assay. Clin Chem 2004; 50: 1673-1674) ). The presence of two bands of 28.3 and 29.6 kDa whose molecular masses are compatible with those presented by enterotoxin-producing strains (Kotb M. Bacterial pyrogenic exotoxins as superantigens. Clin Microbiol 1995; 8: 411-426). EXAMPLE 03: Immunizations of Healthy Beagle Dogs Fourteen healthy Beagle dogs were chosen for the post-vaccine humoral immune response testing experiment. Ten animals were immunized. The animals were immunized twice at 21-day intervals at the doses of 0.25 mL and 0.5 mL, respectively, by subcutaneous route with the obtained vaccine composition. Four animals were kept as controls and received the same volume of sterile saline solution. Prior to immunization, 5 ml whole blood samples were taken from each animal. Twenty-one days after immunization, 5 ml of whole blood were aseptically collected and allowed to stand for perfect coagulation and clear serum. After coagulation, the obtained serum was centrifuged at 4,000 rpm for 10 minutes for complete elimination. of red blood cells.

Inicialmente um volume de 0.25 mL de solução fisiológica foi adicionado em uma série de 10 tubos de ensaio 10 x 75 mm. Em seguida, 0 25 mL do soro de cão a ser titulado, previamente submetido à inativação do complemento (58°C durante 30 minutos em banho-maria), foi acrescentado ao primeiro tubo e, após homogeneização, 0,25 mL deste foi transferido para o segundo tubo e assim sucessivamente até serem obtidas diluições seriadas de 1:2 até 1:1024. A próxima etapa consistiu em acrescentar 0.25 mL do filtrado protéico (contendo 16 UH de hemolisina beta) em cada tubo contendo as diluições seriadas previamente realizadas. Após incubação em banho-maria a 37°C por uma hora, de cada tubo foram removidos 50 pL e substituídos por 50 pL de uma solução de hemácias de carneiro a 5% obtendo-se concentração final de 0.5%. Os tubos de ensaio foram mantidos tampados parciaimente com papel alumínio e incubados por 36 horas em banho-maria a 37°C. A seguir, os tubos foram submetidos a 4°C durante 4 horas em ambiente de geladeira tendo em vista o fenômeno de “hot-coíd”. A leitura da atividade neutralizante dos soros foi realizada após este período identificando-se as diluições dos tubos que apresentaram sobrenadantes límpidos (sem hemólise) e com a presença do botão de hemácias no fundo do tubo. O título neutralizante correspondeu ao inverso da última diluição que apresentou as características citadas. Como controle positivo utilizou-se soro de coelho imunizado com o filtrado protéico cujo título era de 1024 e como controle negativo, soro de coelho não imunizado.Initially a volume of 0.25 mL of physiological solution was added in a series of 10 10 x 75 mm test tubes. Then, 25 ml of the dog serum to be titrated, previously submitted to complement inactivation (58 ° C for 30 minutes in a water bath), was added to the first tube and, after homogenization, 0.25 ml of it was transferred. to the second tube and so on until serial dilutions of 1: 2 to 1: 1024 are obtained. The next step was to add 0.25 mL of the protein filtrate (containing 16 UH hemolysin beta) to each tube containing the serial dilutions previously made. After incubation in a 37 ° C water bath for one hour, 50 µl of each tube was removed and replaced with 50 µl of a 5% sheep red blood cell solution to give a final concentration of 0.5%. The test tubes were kept partially capped with aluminum foil and incubated for 36 hours in a 37 ° C water bath. Next, the tubes were subjected to 4 ° C for 4 hours in a refrigerator environment in view of the “hot coid” phenomenon. Serum neutralizing activity was read after this period by identifying the dilutions of the tubes that showed clear supernatants (without hemolysis) and the presence of the red cell button at the bottom of the tube. The neutralizing titer corresponded to the inverse of the last dilution that presented the characteristics mentioned. As a positive control, rabbit serum immunized with the 1024 titer protein filtrate was used and as negative control unimmunized rabbit serum.

Os animais a serem imunizados e os mantidos como controle apresentaram títulos anti-hemolisina beta variando entre 04 e 32. Após a primeira imunização, os títulos de todos os animais apresentaram elevação e variaram de 16 a 128. Após a segunda imunização, os soros de todos os cães apresentaram títulos mais elevados variando entre 128 a 1024. EXEMPLO 04: Avaliações clínicas da eficácia terapêutica da imunização em casos de piodermite canina em animais de abrigo Foram selecionados para o experimento de eficácia terapêutica da composição vacinai 10 cães abandonados na Sociedade Protetora dos Animais de Curitiba, com diferentes apresentações clínicas de piodermites. O pré-requisito para a inclusão dos animais no programa de imunização foi o isolamento de S. intermedius como único agente etiológico envolvido na dermatopatia. Portanto, os raspados de pele e pêlos colhidos foram simultaneamente encaminhados para o laboratório de Microbiologia para a realização dos exames bacteriológico, micológico e parasitológicc. Cada animal apresentava uma ficha na qual foram registrados dados tais como identificação, idade, sexo, tipo e distribuição das lesões, resultados dos exames laboratoriais e datas das imunizações. Fotos foram obtidas antes das imunizações e após a melhora clínica. Os animais foram imunizados uma a duas vezes com intervalos de 21 dias nas doses de 0.25 mL e 0.5 mL, respectivamente peia via subcutânea com a composição vacinai obtida. Considerou-se como melhora clínica as alterações do estado inicial da pele tais como áreas alopécicas, prurido, pêlos sem brilho e com descamação seca, lesões exsudativas, pápulas, eritema, pústulas, crostas e melhorias no estado geral do paciente. Os 10 cães com diferentes manifestações clínicas de piodermite, submetidos ao protocolo terapêutico com o toxóide, apresentaram notável melhora clínica poucos dias a em média três semanas após as imunizações (Figura 02).The animals to be immunized and those kept as controls showed antihemolysin beta titers ranging from 04 to 32. After the first immunization, the titers of all animals increased and ranged from 16 to 128. After the second immunization, the sera from all dogs had higher titers ranging from 128 to 1024. EXAMPLE 04: Clinical Evaluations of the Therapeutic Efficacy of Immunization in Canine Pyoderma in Shelter Animals Ten dogs abandoned in the US Protective Society were selected for the vaccine efficacy trial. Curitiba animals, with different clinical presentations of pyoderma. The prerequisite for the inclusion of animals in the immunization program was the isolation of S. intermedius as the only etiological agent involved in dermatopathy. Therefore, skin scrapes and harvested hair were simultaneously sent to the Microbiology laboratory for bacteriological, mycological and parasitological examinations. Each animal had a form in which data such as identification, age, sex, type and distribution of lesions, results of laboratory tests and dates of immunizations were recorded. Photos were taken before immunizations and after clinical improvement. The animals were immunized once or twice at 21 day intervals at 0.25 mL and 0.5 mL doses, respectively subcutaneously with the obtained vaccine composition. Clinical improvement was considered as changes in the initial state of the skin such as alopecic areas, pruritus, dull and dry-peeling hair, exudative lesions, papules, erythema, pustules, scabs and improvements in the patient's general condition. The 10 dogs with different clinical manifestations of pyoderma, submitted to the toxoid therapeutic protocol, showed remarkable clinical improvement a few days to an average of three weeks after immunizations (Figure 02).

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. VACINAL CANINE PIODERMITE COMPOSITION characterized in that it comprises Staphylococcus intermedius toxoids, pharmaceutically acceptable adjuvants and carriers, carriers or excipients, with a molecular weight between 19 and 102 kDa, preferably with values 19, 23.1, 28.3, 29.6, 34.2, 35.9 , 44.7, 53.8, 71.2, 83.5 and / or 102 kDa.

VACINAL COMPOSITION FOR CANINE PIODERMITE according to claim 01, characterized in that the toxoids comprise virulence factors such as protein A, coagulases, enzymes, hemolysins, leukotoxins, enterotoxins and / or exfoliative toxins.

VACINAL CANINE PIODERMITE COMPOSITION according to claim 02, characterized in that the hemolysin comprises the beta type.

VACINAL CANAL PIODERMITE COMPOSITION according to claim 02, characterized in that the enterotoxin comprises type C.

Canine PIODERMITE VACINAL COMPOSITION according to Claim 01, characterized in that the adjuvant compounds comprise aluminum salts, Freund's adjuvants, ionic polysaccharides, dextran sulfate, saponins, immunostimulatory complexes and / or other immunomodulatory substances.

VACINAL CANAL PIODERMITE COMPOSITION according to Claim 01, 02, 03, 04 and 05, characterized in that it is used for the prevention or treatment of canine pyoderma.

7. USE OF STAPHYLOCOCCUS INTERMEDIUS TOXOIDS, characterized in that it is in the preparation of a medicament for the prevention or treatment of canine pyoderma.