BRPI0809594B1 - Polipeptídeo, sequência de ácido nucléico, vetor, processo para a produção de um polipeptídeo, composição farmacêutica, kit e uso de um fragmento n-terminal do domínio extracelular de cd3? de máximo de 27 aminoácidos - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO, SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR, HOSPEDEIRO, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, KIT, E, USO DE UM FRAGMENTO N-TERMINAL DO DOMÍNIO EXTRACELULAR DE CD3 (ÉPSILON) DE MÁXIMO DE 27 ANINOÁCIDOS A presente invenção refere-se a um polipeptídeo que compreende um domínio de ligação humano que pode se ligar a um epítopo de cadeia CD3 (épsilon) de seres humanos e de primatas não-chimpanzés, bem como a um processo para a produção do polipeptídeo mencionado. A invenção também se refere aos ácidos nucléicos que codificam para o polipeptídeo, aos vetores que compreendem os mesmos e às células hospedeiras que compreendem o vetor, Em um outro aspecto, a invenção apresenta uma composição farmacêutica que compreende o polipeptídeo mencionado e usos médicos do polipeptídeo. Em um aspecto adicional, a invenção apresenta um método para a identificação de polipeptídeos que compreende um domínio de ligação específico de espécie de cruzamento que pode se ligar a um epítopo CD3 (CD3 épsilon) de ser humano.

Description

[001] A presente invenção refere-se a um polipeptídeo que compreende um primeiro domínio de ligação humano que é capaz de se ligar a um epítopo de CD3 (épsilon) de ser humano e de primata não-chimpanzé, bem como a um processo para a produção do polipeptídeo mencionado. A invenção também se refere aos ácidos nucléicos que codificam para o polipeptídeo, a vetores que compreendem os mesmos, e a células hospedeiras que compreendem o vetor. Em um outro aspecto, a invenção apresenta uma composição farmacêutica que compreende o polipeptídeo mencionado e usos médicos do polipeptídeo.

[002] O reconhecimento das células T é mediadopelos receptores de células T alfa, beta, gama e delta distribuídos clonotipicamente (TcR) que interagem com as moléculas contendas por peptídeo do peptídeo MHC (pMHC) (Davis & Bjorkman, Nature 334 (1988), 395-402). As cadeias específicasdo antígeno de TcR não têm domínios de sinalização, mas são acopladas preferivelmente ao aparelho de sinalização de multi- subunidade conservada CD3 (Call, Cell 111 (2002), 967-979,Alarcon, Immunol. Rev. 191 (2003), 38-46, Malissen Immunol.Rev. 191 (2003), 7-27). O mecanismo pelo que a ligação de TcRé comunicada diretamente ao aparelho de sinalização permanece uma questão fundamental na biologia das células T (Alarcon, loc. cit.; Davis, Cell 1 10 (2002), 285-287). Parece claro queas respostas sustentadas das células T envolvem o acoplamento do correceptor, a oligomerização de TcR e um arranjo de uma ordem mais elevada dos complexos de TcR-pMHC na sinapse imunológica (Davis & van der Merwe, Curr. Biol. 11 (2001),R289-R291, Davis, Nat. Immunol. 4 (2003), 217-224). No entanto,a sinalização de TcR muito adiantada ocorre na ausência destes eventos e pode envolver uma mudança conformacional induzida por ligando no CD3 epsilon (Alarcon, loc. cit., Davis (2002), loc. cit.,Gil, J. Biol. Chem. 276 (2001), 11174-11179, Gil,Cell 109 (2002), 901-912). As subunidades epsilon, gama, deltae zeta do complexo de sinalização associadas às outras paraformar um heterodímero epsilon-gama CD3, um heterodímero epsilon-delta CD3 e um homodímero zeta-zeta CD3 (Call, loc.cit.). Vários estudos revelaram que as moléculas CD3 são importantes para a expressão apropriada da superfície celular do TcR alfa beta e o desenvolvimento normal das células T (Berkhout, J. Biol. Chem. 263 (1988), 8528-8536, Wang, J. Exp.Med. 188 (1998), 1375-1380, Kappes, Curr. Opin. Immunol. 7(1995), 441-447). A estrutura da solução dos fragmentos doectodomínio do heterodímero epsilon-gama de camundongo CD3 mostrou que as subunidades gama epsilon são domínios de C2-setIg que interagem entre si para formar uma configuração de dímero lateral incomum (Sun, Cell 105 (2001), 913-923). Emborao pedúnculo rico em cisteína pareça desempenhar um papel importante em dirigir a dimerização CD3 (Su, loc. cit., Borroto, J. Biol. Chem. 273 (1998), 12807-12816), a interaçãopor meio dos domínios extracelulares de CD3 epsilon e o gama CD3 é suficiente para o conjunto destas proteínas com o TcR beta (Manolios, Eur. J. Immunol. 24 (1994), 84-92, Manolios &Li, Immunol. Cell. Biol. 73 (1995), 532-536). Embora aindacontroversa, a estequiometria dominante de TcR compreende muito provavelmente um TcR alfa beta, um heterodímero gama CD3 epsilon, um heterodímero epsilon delta CD3 e um homodímero zeta zeta CD3 (Call, loc. cit.). Dado o papel central do heterodímero gama CD3 epsilon humano na imunoresposta, a estrutura de cristal deste complexo ligado ao anticorpo terapêutico OKT3 foi recentemente elucidada (Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680).

[003] Uma série de estratégias terapêuticasmodula a imunidade das células T ao visar a sinalização de TcR, particularmente os anticorpos monoclonais de CD3 anti- humanos (mAbs) que são extensamente utilizados clinicamente em regimes imunossupressores. O camundongo mAb OKT3 específico deCD3 foi o primeiro mAb licenciado para o uso em seres humanos(Sgro, Toxicology 105 (1995), 23-29) e é extensamente utilizadoclinicamente como um agente imunossupressor em transplante (Chatenoud, Clin. Transplant 7 (1993), 422-430, Chatenoud,Rev. Nat. Immunol. 3 (2003), 123-132, Kumar, Transplant. Proc.30 (1998), 1351-1352), diabetes tipo 1 (Chatenoud (2003), loc.cit.) e psoríase (Utset, J. Rheumatol. 29 (2002), 1907-1913).Além disso, os mAbs anti-CD3 podem induzir a sinalização parcial de células T e energia clonal (Smith, J. Exp. Med. 185(1997), 1413-1422). O OKT3 foi descrito na literatura como ummitógeno potente das células T (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980), 2708-18) bem como um assassino potente das células T(Wong, Transplantation 50 (1990), 683-9). O OKT3 exibe ambasestas atividades em uma forma dependente de tempo; após a ativação adiantada das células T que conduz à liberação de citoquinas, quando de uma administração adicional, o OKT3 posteriormente bloqueia todas as funções conhecidas das células T. É devido a este bloqueio posterior da função das células T que o OKT3 encontrou ampla aplicação como um imunossupressor em regimes de terapia para a redução ou mesmo a abolição da rejeição do tecido de enxerto.

[004] O OKT3 inverte a rejeição de tecido deenxerto mais provavelmente ao bloquear a função de todas as células T, que desempenham um papel importante na rejeição aguda. O OKT3 reage com a função do complexo CD3 na membrana das células T humanas e bloqueia a mesma, a qual é associada com a estrutura de reconhecimento do antígeno das células T (TCR) e é essencial para a transdução de sinal. A subunidade de TCR/CD3 que é ligada pelo OKT3 tem sido o objeto de múltiplos estudos. Embora alguma evidência tenha apontado para uma especificidade de OKT3 para a subunidade epsilon do complexo TCR/CD3 (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004), 7675-7680). Uma evidência adicionalmostrou que a ligação de OKT3 do complexo TCR/CD3 requer que outras subunidades deste complexo estejam presentes (Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52).

[005] Outros anticorpos bem conhecidosespecíficos para a molécula CD3 são relacionados em Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50. Conforme indicadoacima, tais anticorpos CD3 específicos podem induzir várias respostas das células T tais como a produção de linfoquinas (Von Wussow, J. Immunol. 127 (1981), 1197; Palacious, J.Immunol. 128 (1982), 337), a proliferação (Van Wauve, J.Immunol. 124 (1980), 2708-18) e a indução de células Tsupressoras (Kunicka, em "Lymphocyte Type M" 1 (1986), 223).Isto é, dependendo das condições experimentais, o anticorpo monoclonal CD3 específico pode inibir ou induzir a citotoxicidade (Leewenberg, J. Immunol. 134 (1985), 3770;Phillips, J. Immunol. 136 (1986) 1579; Platsoucas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 4500; Itoh, Cell. Immunol. 108(1987), 283-96; Mentzer, J. Immunol. 135 (1985), 34; Landegren,J. Exp. Med. 155 (1982), 1579; Choi (2001), Eur. J. Immunol.31, 94-106; Xu (2000), Cell Immunol. 200, 16-26; Kimball(1995), Transpl. Immunol. 3, 212-221).

[006] Embora esteja relatado que muitos dosanticorpos CD3 descritos no estado da técnica reconhecem a subunidade CD3 epsilon do complexo CD3, a maior parte deles se liga, de fato, aos epítopos conformacionais e, desse modo, reconhecem apenas o CD3 epsilon no contexto nativo dos epítopos de TCR. Os epítopos conformacionais são caracterizados pela presença de dois ou mais resíduos de aminoácidos distintos que são separados na seqüência primária, mas vêm juntos na superfície da molécula quando o polipeptídeo se dobra na proteína/antígeno nativo (Sela, (1969) Science 166, 1365 eLaver, (1990) Cell 61, 553-6). Os epítopos conformacionaisligados pelos anticorpos CD3 epsilon descritos no estado da técnica podem ser separados em dois grupos. No grupo principal, os ditos epítopos são formados por duas subunidades CD3, por exemplo, da cadeia CD3 epsilon e da cadeia gama CD3 ou delta CD3. Por exemplo, foi verificado em diversos estudos que os anticorpos monoclonais CD3 epsilon mais extensamente utilizados OKT3, WT31, UCHT1, 7D6 e Leu-4 não se ligaram às células transfectadas unicamente com a cadeia de CD3-epsilon. No entanto, estes anticorpos tingiram as células duplamente transfectadas com uma combinação de CD3 epsilon mais delta CD3 ou gama CD3 (Tunnacliffe, loc. cit.; Law, Int. Immunol. 14 (2002), 389-400; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991), 3047-52;Coulie, Eur. J. Immunol. 21 (1991), 1703-9). Em um segundogrupo menor, o epítopo conformacional é formado dentro da própria subunidade epsilon formada. Um elemento deste grupo é, por exemplo, mAb APA 1/1 que foi criado contra CD3 epsilon desnaturado (Risueno, Blood 106 (2005), 601-8). Considerados conjuntamente, a maior parte dos anticorpos CD3 epsilon descritos no estado da técnica reconhecem os epítopos conformacionais localizados em duas ou mais subunidades de CD3. Os resíduos de aminoácidos distintos que formam a estrutura tridimensional destes epítopos podem ser localizados na própria subunidade CD3 epsilon ou na subunidade CD3 epsilon e em outras subunidades CD3 tais como gama CD3 ou delta CD3.

[007] Outro problema com respeito aos anticorpos CD3 é que foi verificado que muitos anticorpos CD3 aos específicos da espécie. Os anticorpos monoclonais anti-CD3, tal como é geralmente verdadeiro para alguns outros anticorpos monoclonais, funcionam por meio do reconhecimento altamente específico de suas moléculas alvo. Eles reconhecem somente um único sítio ou epítopo, em sua molécula CD3 alvo. Por exemplo, um dos anticorpos monoclonais mais extensamente utilizados e mais bem caracterizados específicos para o complexo CD3 é OKT- 3. Este anticorpo reage com o chimpanzé CD3, mas não com o homólogo CD3 de outros primatas, tais como CD3 de símio ou de cão (Sandusky et al., J. Med. Primatol. 15 (1986), 441-451). O anticorpo monoclonal anti-CD3 UCHT-1 também é reativo com o CD3 de chimpanzé, mas não com o CD3 de símios (dados próprios). Por outro lado, também há exemplos de anticorpos monoclonais que reconhecem antígenos de símios, mas não de suas contrapartes humanas. Um exemplo deste grupo é o anticorpo monoclonal FN-18 dirigido a CD3 de símios (Uda et al., J. Med. Primatol. 30 (2001), 141-147). De maneira interessante, foi verificado que os linfócitos periféricos de aproximadamente 12% dos macacos cinomolgos não tinham reatividade com o anticorpo monoclonal do macaco CD3 anti-rhesus (FN-18) devido a um polimorfismo do antígeno CD3 nos símios. Uda et al. descreveram uma substituição de dois aminoácidos na seqüência CD3 dos macacos cinomolgos, que não são reativos com os anticorpos FN-18, em comparação a CD3 derivado de animais que são reativos com os anticorpos FN-18 (Uda et al., J Med Primatol. 32 (2003), 105-10; Uda et al., J Med Primatol. 33 (2004), 34-7).

[008] No entanto, essa capacidade discriminatória, isto é, a especificidade da espécie, inerente aos anticorpos CD3 e aos fragmentos monoclonal destes, é um impedimento significativo ao seu desenvolvimento como agentes terapêuticos para o tratamento de doenças humanas. A fim de obter a aprovaçã0 do mercado, qualquer nova medicação candidata deve ser submetida a testes rigorosos. Estes testes podem ser subdivididos nas fases pré-clínica e clínica: sendo que esta última que é subdividida adicionalmente nas fases clínicas geralmente conhecidas I, II e III - é executada em pacientes humanos, e a primeira é executada em animais. O objetivo de testes pré-clínicos consiste em provar que a droga candidata tem a atividade desejada e é, acima de tudo, segura. Somente quando a segurança em animais e a eficácia possível da droga candidata são estabelecidas em testes pré-clínicos, esta droga candidata é aprovada para testes clínicos em seres humanos pela respectiva autoridade reguladora. As drogas candidatas podem ser testadas quanto à segurança em animais das três maneiras seguintes, (i) em uma espécie relevante, isto é, em uma espécie onde as drogas candidatas podem reconhecer os antígenos ortólogos, (ii) em um animal transgênico que contém os antígenos humanos e (iii) pelo uso de um substituto para a droga candidata que pode ligar os antígenos ortólogos presentes no animal. As limitações dos animais transgênicos são que esta tecnologia é tipicamente limitada aos roedores. Entre roedores e o homem há diferenças significativas na fisiologia, e os resultados de segurança não podem ser facilmente extrapolados aos seres humanos. As limitações de um substituto para a droga candidata são a composição diferente da matéria em comparação à droga candidata real e freqüentemente os animais utilizados são roedores com a limitação tal como discutido acima. Portanto, os dados pré-clínicos gerados em roedores são de poder preditivo limitado com respeito à droga candidata. A abordagem de escolha para os testes de segurança é o uso de uma espécie relevante, preferivelmente um primata inferior. Agora, a limitação das moléculas de ligação de CD3 apropriadas para a intervenção terapêutica no homem descrita no estado da técnica é que as espécies relevantes são primatas superiores, em particular os chimpanzés. Os chimpanzés são considerados como uma espécie em risco de extinção e, devido à sua natureza similar à humana, o uso de tais animais para os testes de segurança de drogas foi proibido na Europa e é altamente restrito em outros lugares do mundo.

[009] A presente invenção refere-se a um polipeptídeo que compreende um primeiro domínio de ligação, preferivelmente de um ser humano, que pode se ligar a um epítopo da cadeia CD3ε de um ser humano e de um primata (epsilon) não-chimpanzés e um segundo domínio de ligação que pode se ligar a EGFR, a Her2/neu ou a IgE de um ser humano e/ou de um primata não-chimpanzé, em que o epítopo faz parte de uma seqüência de aminoácido compreendida no grupo que consiste nas SEQ ID NO. 2, 4, 6 ou 8. Seqüências tais comoaquelas mostradas nas SEQ ID NO. 2, 4, 6 e 8 e fragmentos dasmesmas são os epítopos CD3 independentes do contexto.

[0010] A vantagem da presente invenção é aprovisão de um polipeptídeo que compreende um domínio de ligação, preferivelmente de um ser humano, que exibe a especificidade de espécies cruzadas à cadeia de um ser humano e de um primata CD3ε (epsilon) não-chimpanzés, que podem ser utilizados para a avaliação pré-clínica de segurança, a atividade e/ou o perfil farmacocinético do mesmo, preferivelmente um ser humano, domínios de ligação em primatas e - de forma idêntica - como drogas em seres humanos. A mesma molécula pode ser utilizada em estudos pré-clínicos em animais bem como em estudos clínicos em seres humanos. Isto conduz a resultados altamente comparáveis e a um poder preditivo dosestudos em animais muito aumentado em comparação às moléculassubstitutas específicas da espécie. Na presente invenção, um fragmento de polipeptídeo do resíduo de 1-27 aminoácidos de N- terminal do domínio extracelular de CD3 epsilon foi surpreendentemente identificado, o qual - por outro lado com todos os epítopos de CD3 epsilon conhecidos restantes descritos no estado da técnica - mantém a sua integridade estruturaltridimensional quando considerado fora de seu ambiente nativono complexo CD3 (e fundido a uma seqüência de aminoácido heteróloga tal como EpCAM ou uma parte de Fc de imunoglobulina).

[0011] A independência do contexto do epítopo CD3provida na presente invenção corresponde aos primeiros 27 aminoácidos de N-terminal de CD3 epsilon ou dos fragmentos funcionais desta extensão de 27 aminoácidos. O termo "independente do contexto", tal como utilizado na presente invenção com relação ao epítopo CD3, significa que a ligação das moléculas da presente invenção aqui descrita de ligação das moléculas/anticorpo não conduz a uma mudança ou a uma modificação da conformação, seqüência ou estrutura que circunda um determinante ou epítopo antigênico. Por outro lado, o epítopo CD3 reconhecido por uma molécula de ligação de CD3 convencional (por exemplo, tal como descrito no Pedido de Patente WO 99/54440 ou no Pedido de Patente WO 04/106380) é localizado no C-terminal de cadeia CD3 epsilon de 1-27 aminoácidos de N-terminal do epítopo independente do contexto, onde somente assume a conformação correta se for encaixado dentro do restante da cadeia epsilon e for mantido na posição correta pela heterodimerização da cadeia epsilon com a cadeia gama ou delta CD3.

[0012] As moléculas de ligação anti-CD3 como parte de uma molécula de ligação biespecífica tal como provido na presente invenção e geradas (e dirigidas) contra um epítopo CD3 independente do contexto conferem uma melhoria clínica surpreendente no que diz respeito à redistribuição das células T e, desse modo, um perfil de segurança mais favorável. Sem ficar limitado pela teoria, uma vez que o epítopo CD3 é independente do contexto, formando um subdomínio auto- suficiente autônomo sem muita influência no restante do complexo CD3, as moléculas de ligação de CD3 providas na presente invenção induzem mudanças menos alostéricas na conformação CD3 do que as moléculas de ligação de CD3 convencionais (como as moléculas providas no Pedido de Patente WO 99/54440), que reconhecem os epítopos CD3 dependentes do contexto.

[0013] A independência do contexto do epítopo CD3 das moléculas de ligação de CD3 da invenção como parte de uma molécula de ligação biespecífica é associada com menos redistribuição das células T durante a fase inicial de tratamento com as moléculas de ligação de CD3 da invenção, resultando em um melhor perfil de segurança das moléculas de ligação de CD3 da invenção em comparação às moléculas de ligação de CD3 convencionais conhecidas no estado da técnica, que reconhecem os epítopos CD3 dependentes do contexto. Particularmente, uma vez que a redistribuição das células T durante a fase inicial de tratamento com as moléculas de ligação de CD3 é um fator de risco principal para eventos adversos do SNC, as moléculas de ligação de CD3 da invenção, ao reconhecer um epítopo CD3 independente do contexto em vez de um epítopo CD3 dependente do contexto, têm uma vantagem substancial de segurança sobre as moléculas de ligação de CD3 conhecidas no estado da técnica. Os pacientes com tais eventos adversos do SNC relacionados à redistribuição das células T durante a fase inicial de tratamento com as moléculas de ligação de CD3 convencionais sofrem geralmente de confusão e desorientação, em alguns casos, também de incontinência urinária. A confusão é uma mudança no status mental em que o paciente não consegue pensar com o seu nível usual de clareza. O paciente tem geralmente dificuldade de concentração e o pensamento, além de confuso e obscuro, também fica freqüentemente significativamente mais lento. Os pacientes com eventos adversos do SNC relacionados à redistribuição das células T durante a fase inicial de tratamento com as moléculas de ligação de CD3 convencionais também podem sofrer de perda de memória. Normalmente, a confusão conduz à perda da capacidade de reconhecer pessoas e/ou lugares ou de dizer a hora e a data. As sensações de desorientação são comuns na confusão e a capacidade de tomar decisões é prejudicada. Os eventos adversos do SNC relacionados à redistribuição das células T durante a fase inicial de tratamento com as moléculas de ligação de CD3 convencionais podem compreender adicionalmente um discurso confuso e/ou dificuldade de expressão. Este distúrbio pode prejudicar ambos, a expressão e a compreensão da língua, bem como a leitura e a escrita. Além da incontinência urinária, também a vertigem e a tontura podem acompanhar os eventos adversos do SNC relacionados à redistribuição das células T durante a fase inicial de tratamento com as moléculas de ligação de CD3 convencionais em alguns pacientes.

[0014] A manutenção da estrutura tridimensional dentro do fragmento mencionado do polipeptídeo de N-terminal do aminoácido 27 de CD3 epsilon pode ser utilizada para a geração de domínios de ligação, preferivelmente seres humanos, que se ligam ao fragmento de polipeptídeo CD3 epsilon de N- terminal in vitro e ao complexo CD3 nativo (a subunidade CD3 epsilon) em células T in vivo com a mesma afinidade de ligação. Estes dados indicam fortemente que o fragmento de N-terminal tal como descrito na presente invenção forma uma conformação terciária, que é similar à estrutura que existe normalmente in vivo. Um teste bastante sensível para a importância da integridade estrutural dos aminoácidos 1-27 do fragmento de polipeptídeo de N-terminal de CD3 epsilon foi executado. Os aminoácidos individuais dos aminoácidos 1-27 do fragmento de polipeptídeo de N-terminal de CD3 epsilon foram alterados para alanina (varredura de alanina) para testar a sensibilidade dos aminoácidos 1-27 do fragmento de polipeptídeo de N-terminal de CD3 epsilon para rompimentos menores. As moléculas do anticorpo específicas de CD3 como parte de uma molécula de ligação biespecífica da invenção foram utilizadas para testar a ligação aos mutantes de alanina dos aminoácidos 1-27 do fragmento depolipeptídeo de N-terminal de CD3 epsilon (vide o Exemplo 5 emanexo). As trocas individuais dos primeiros cinco resíduos deaminoácido na extremidade de N-terminal do fragmento e dois dos aminoácidos nas posições 23 e 25 dos aminoácidos 1-27 dofragmento de polipeptídeo de N-terminal de CD3 epsilon foramcríticas para a ligação das moléculas do anticorpo. A substituição de resíduos de aminoácido na região da posição 15 que compreendem os resíduos Q (Glutamina na posição 1), D (ácido aspártico na posição 2), G (Glicina na posição 3), N (Asparagina na posição 4) e E (Ácido Glutâmico na posição 5) à Alanina aboliu a ligação das moléculas de ligação, preferivelmente humanas, da invenção, ao dito fragmento. Embora para pelo menos parte das moléculas de ligação da invenção, preferivelmente humanas, dois resíduos de aminoácido no C-término do fragmento T mencionado (Treonina na posição 23) e I (Isoleucina na posição 25) reduziram a energia de ligação para as moléculas de ligação da invenção, preferivelmente humanas.

[0015] Inesperadamente, foi verificado que asmoléculas de ligação preferivelmente humanas isoladas dessa maneira não somente reconhecem o fragmento humano de N-terminal de CD3 epsilon, mas também os fragmentos homólogos correspondentes de CD3 epsilon de vários primatas, incluindo os Macacos do Novo Mundo (Sagüi, Callithrix jacchus; Saguinus oedipus; Saimiri sciureus) e os Macacos do Velho Mundo (Macaca fascicularis, também conhecido como Macaco Cinomolgo; ou Macaca mulatta, também conhecido como Macaco Rhesus). Desse modo, a especificidade de multi-primata das moléculas de ligação de CD3 da invenção foi detectada. As seguintes análises de seqüência confirmaram que o ser humano e os primatas compartilham de uma extensão altamente homóloga da seqüência no N-término do domínio extracelular de CD3 epsilon.

[0016] Foi verificado, na presente invenção, que é possível gerar moléculas de ligação preferivelmente humanas específicas para o CD3 epsilon em que a molécula idêntica pode ser utilizada para testes pré-clínicos em animais, bem como estudos clínicos e ainda na terapia em seres humanos. Isto ocorre devido à identificação inesperada de moléculas de ligação preferivelmente humanas, que, além de se ligar ao CD3 epsilon humano (e devido à similaridade genética provavelmente às contrapartes do chimpanzé), também se ligam aos homólogos dos ditos antígenos de primatas não-chimpanzés, incluindo os Macacos do Novo Mundo e os Macacos do Velho Mundo. Conforme mostrado nos Exemplos seguintes, as ditas moléculas de ligação epsilon específicas de CD3 preferivelmente humanas podem ser integradas em anticorpos de cadeia simples biespecíficos a fim de gerar uma terapêutica contra várias doenças, incluindo, mas sem ficar a eles limitadas, o câncer ou distúrbios imunológicos. Desse modo, a necessidade de construir um domínio CD3 de ligação epsilon substituto ou um anticorpo de cadeia simples biespecífico incluindo os mesmos para teste em uma espécie filogenética distante (dos seres humanos) desaparece. Em conseqüência disto, a mesma molécula pode ser utilizada para testes pré-clínicos em animais uma vez que se presta a ser administrada a seres humanos em testes clínicos bem como seguindo a aprovação de mercado e a administração da droga terapêutica. A capacidade de usar a mesma molécula para os testes pré-clínicos em animais que a de uma administração posterior a seres humanos elimina virtualmente ou pelo menos reduz extremamente o perigo de que os dados obtidos em testes pré-clínicos em animais limite a aplicabilidade ao caso humano. Resumidamente, a obtenção de dados pré-clínicos de segurança em animais ao utilizar a mesma molécula que será realmente administrada a seres humanos colabora muito para assegurar a aplicabilidade dos dados a um cenário relevante para seres humanos. Por outro lado, em abordagens convencionais que utilizam moléculas substitutas, as ditas moléculas substitutas têm que ser molecularmente adaptadas ao sistema de teste animal utilizado para a avaliação de segurança pré-clínica. Desse modo, a molécula a ser utilizada na terapia humana de fato difere na seqüência e também provavelmente na estrutura da molécula substituta utilizada, em testes pré-clínicos em parâmetros farmacocinéticos e/ou na atividade biológica, com a conseqüência de que os dados obtidos em testes pré-clínicos em animais têm a aplicabilidade/capacidade de transferência limitada ao caso humano. O uso de moléculas substitutas requer a construção, a produção, a purificação e a caracterização de um construto completamente novo. Isto acarreta custos adicionais e o tempo de desenvolvimento necessário para obter essa molécula. Resumidamente, os substitutos têm que ser desenvolvidos separadamente além da droga real a ser utilizada na terapia humana, de modo que duas linhas de desenvolvimento para duas moléculas têm que ser providas. Portanto, uma vantagem principal da molécula de ligação humana ou dos construtos à base de anticorpo exibirem a especificidade de espécies cruzadas descrita na presente invenção é que a molécula idêntica pode ser utilizada para a terapêutica em seres humanos e em testes pré-clínicos em animais.

[0017] É preferível, para o polipeptídeo da invenção, que o primeiro domínio de ligação que pode se ligar a um epítopo da cadeia de CD3 epsilon de seres humanos e de primatas não-chimpanzés seja de origem humana. Além disso, devido à origem humana das moléculas de ligação humanas da invenção, a geração de uma imunoreação contra as ditas moléculas de ligação é excluída à máxima extensão possível quando da administração das moléculas de ligação aos pacientes humanos.

[0018] Outra grande vantagem das moléculas de ligação humanas específicas de CD3 epsilon preferivelmente humanas como parte de uma molécula de ligação biespecífica da invenção é a sua aplicabilidade em testes pré-clínicos em vários primatas. O comportamento de uma droga candidata em animais deve ser idealmente indicativo do comportamento previsto desta droga candidata quando da administração a seres humanos. Em conseqüência disto, os dados obtidos a partir de tais testes pré-clínicos, portanto, geralmente devem ter um poder preditivo elevado para o caso humano. No entanto, conforme mostrado a partir do resultado trágico da experimentação clínica da Fase I recente em TGN1412 (um anticorpo monoclonal CD28), uma droga candidata pode agir diferentemente em uma espécie de primata do que em seres humanos: uma vez que em testes pré-clínicos do dito anticorpo, nenhum efeito ou somente efeitos adversos limitados foram observados nos estudos animais executados com os macacos cinomolgos, seis pacientes humanos desenvolveram falência de órgãos múltipla quando da administração do dito anticorpo (Lancet 368 (2006), 2206-7). Os resultados destes eventos negativos indesejados sugerem que pode não ser suficiente limitar os testes pré-clínicos a somente uma espécie (de primata). O fato de que as moléculas de ligação de CD3 epsilon específicas humanas da invenção se ligam a uma série de Macacos do Novo Mundo e Macacos do Novo Mundo pode ajudar a superar os problemas enfrentados no caso mencionado acima. Conseqüentemente, a presente invenção apresenta dispositivos e métodos para minimizar as diferenças da espécie nos efeitos quando as drogas para a terapia humana estão sendo desenvolvidas e testadas.

[0019] Com o domínio de ligação CD3 epsilon específico de espécies cruzadas preferivelmente humanas como parte de uma molécula de ligação biespecífica da invenção, também não é mais necessário adaptar o animal do teste à droga candidata pretendida para a administração a seres humanos, tal como, por exemplo, a criação de animais transgênicos. As moléculas de ligação específicas de CD3 epsilon preferivelmente humanas (ou os anticorpos de cadeia simples biespecíficos que contêm as mesmas), que exibem especificidade de espécies cruzadas de acordo com os usos e os métodos da invenção, podem ser diretamente utilizadas para testes pré- clínicos em primatas não-chimpanzés, sem nenhuma manipulação genética dos animais. Também conhecidas pelos elementos versados na técnica, as abordagens em que o animal do teste é adaptado à droga candidata sempre acarretam o risco de que os resultados obtidos em testes pré-clínicos de segurança são menos representativos e preditivos para os seres humanos devido à modificação do animal. Por exemplo, em animais transgênicos, as proteínas codificadas pelos transgenes são freqüentemente altamente superexpressas. Desse modo, os dados obtidos para a atividade biológica de um anticorpo contra este antígeno da proteína podem ser limitados em seu valor preditivo para seres humanos pelo fato de que a proteína é expressa em níveis mais fisiológicos, muito inferiores.

[0020] Uma vantagem adicional dos usos dasmoléculas de ligação de CD3 epsilon específicaspreferivelmente humanas (ou dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos que contêm as mesmas) que exibem especificidade de espécies cruzadas é o fato de que os chimpanzés, tal como uma espécie em risco de extinção, são evitados em testes com animais. Os chimpanzés são os parentes mais próximos dos seres humanos e foram agrupados recentemente na família dos hominídeos com base nos dados de seqüenciação de genoma (Wildman et al., PNAS 100 (2003), 7181). Portanto, os dadosobtidos com os chimpanzés são considerados geralmente como sendo altamente preditivos para seres humanos. No entanto, devido ao seu status como espécie em risco de extinção, o número de chimpanzés que pode ser utilizado para experiências médicas é altamente restrito. Conforme indicado acima, a manutenção dos chimpanzés para testes em animais é, portanto,dispendiosa, e eticamente problemática. Os usos das moléculasde ligação de CD3 epsilon específicas preferivelmente humanasda invenção (ou dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos que contêm as mesmas) evitam objeções éticas e a carga financeira pesada durante os testes pré-clínicos sem prejudicar a qualidade, isto é, a aplicabilidade dos dados obtidos de testes em animais. À luz disso, os usos das moléculas de ligação de CD3 epsilon específicas preferivelmente humanas (ou dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos que contêm as mesmas) oferecem uma alternativa razoável para estudos em chimpanzés.

[0021] Uma vantagem adicional das moléculas deligação de CD3 epsilon específicas preferivelmente humanas da invenção (ou dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos que contêm as mesmas) é a capacidade de extrair múltiplas amostras de sangue ao utilizar as mesmas como parte dos testes pré-clínicos em animais, por exemplo, no curso de estudos farmacocinéticos em animais. A extração de múltiplas amostras de sangue pode obtida muito mais facilmente com um primata não-chimpanzé do que com animais inferiores, por exemplo, um camundongo. A extração de múltiplas amostras de sangue permite o teste contínuo dos parâmetros do sangue para a determinação dos efeitos biológicos induzidos pelas moléculas de ligação preferivelmente humanas da invenção (ou pelo anticorpo de cadeia simples biespecífico). Além disso, a extração de múltiplas amostras de sangue permite que o investigador avalie o perfil farmacocinético das moléculas de ligação preferivelmente humanas (ou do anticorpo de cadeia simples biespecífico), tal como definido na presente invenção. Além disso, os efeitos colaterais potenciais, que podem ser induzidos pelas ditas moléculas de ligação preferivelmente humanas (ou pelo anticorpo de cadeia simples biespecífico) refletidos nos parâmetros do sangue podem ser medidos em amostras de sangue diferentes extraídas durante a administração do dito anticorpo. Isto permite a determinação do perfil potencial de toxicidade das moléculas de ligação preferivelmente humanas (ou do anticorpo de cadeia simples biespecífico), tal como definido na presente invenção.

[0022] As vantagens das moléculas de ligação preferivelmente humanas (ou dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos), tal como definido na presente invenção, que exibem especificidade de espécies cruzadas podem ser resumidamente tal como segue:

[0023] Primeiramente, as moléculas de ligação preferivelmente humanas (ou os anticorpos de cadeia simples biespecíficos), tal como definido na presente invenção, utilizadas em testes pré-clínicos são as mesmas que aquelas utilizadas na terapia em seres humanos. Desse modo, não é mais necessário desenvolver duas moléculas independentes, que podem diferir em suas propriedades farmacocinéticas e atividade biológica. Isto é altamente vantajoso pelo fato de que, por exemplo, os resultados farmacocinéticos são mais diretamente transferíveis e aplicáveis ao ambiente humano do que, por exemplo, nas abordagens do substituto convencional.

[0024] Em segundo lugar, os usos das moléculas de ligação preferivelmente humanas (ou dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos), tal como definido na presente invenção, para a preparação de uma terapêutica em seres humanos é menos custosa e requer menos trabalho do que as abordagens do substituto.

[0025] Em terceiro lugar, as moléculas de ligação preferivelmente humanas (ou anticorpos de cadeia simples biespecíficos), tal como definido na presente invenção, podem ser utilizadas para testes pré-clínicos não somente em uma espécie de primata, mas em uma série de espécies diferentes de primata, limitando desse modo o risco de diferenças potenciais de espécies entre os primatas e os seres humanos.

[0026] Em quarto lugar, o chimpanzé como uma espécie em risco de extinção é evitado para o teste em animais.

[0027] Em quinto lugar, as múltiplas amostras desangue podem ser extraídas para estudos farmacocinéticos extensivos. Em sexto lugar, devido à origem humana das moléculas de ligação preferivelmente humanas de acordo com uma realização preferida da invenção, a geração de uma imunoreação contra as ditas moléculas de ligação é reduzida quando administrada a pacientes humanos. A indução de uma imunoresposta com os anticorpos específicos a uma droga candidata derivada de uma espécie de não-humano tal como, por exemplo, um camundongo, que conduz ao desenvolvimento de anticorpos seres humanos-anti-humanos (HAMAs) contra as moléculas terapêuticas de origem de murino é excluída.

[0028] O termo "proteína" é bem conhecido noestado da técnica e descreve os compostos biológicos. As proteínas compreendem uma ou mais cadeias de aminoácidos (polipeptídeos), por meio de que os aminoácidos são ligados entre uma através de uma ligação de peptídeo. O termo "polipeptídeo", tal como utilizado na presente invenção, descreve um grupo de moléculas que consiste em mais de trinta aminoácidos. De acordo com a invenção, o grupo de polipeptídeos compreende as "proteínas", contanto que as proteínas consistam em um polipeptídeo único. Também de acordo com a definição, o termo "polipeptídeo" descreve fragmentos das proteínas contanto que estes fragmentos consistam em mais de trinta aminoácidos. Os polipeptídeos podem promover multímeros de forma tais como dímeros, trímeros e oligômeros superiores, isto é, que consistem em mais de uma molécula de polipeptídeo. As moléculas do polipeptídeo que formam tais dímeros, trímeros, etc., podem ser idênticas ou não-idênticas. As estruturas correspondentes de uma ordem superior de tais multímeros são denominadas conseqüentemente homo ou heterodímeros, homo ou heterotrímeros, etc. Um exemplo de hereteromultímero é uma molécula de anticorpo, que, em sua forma natural, consiste em duas cadeias de polipeptídeo leves idênticas e em duas cadeias de polipeptídeo pesadas idênticas. Os termos "polipeptídeo" e "proteína" também se referem a polipeptídeos/proteínas naturalmente modificados, em que a modificação é efetuada, por exemplo, por meio de modificações pós-translacionais tais como a glicosilação, a acetilação, a fosforilação, e outras ainda. Tais modificações são bem conhecidas no estado da técnica.

[0029] Conforme utilizado na presente invenção, "ser humano" e "homem" referem-se à espécie Homo sapiens. Com relação aos usos médicos dos construtos descritos na presente invenção, os pacientes humanos devem ser tratados com a mesma molécula.

[0030] O termo "origem humana", tal como utilizado no contexto com as moléculas da invenção, descreve as moléculas deriváveis das bibliotecas humanas ou que têm uma estrutura/seqüência correspondente ao equivalente humano. Conseqüentemente, as proteínas que têm uma seqüência de aminoácido correspondente à seqüência humana análoga, por exemplo, um fragmento do anticorpo que tem seqüências de aminoácido na estrutura que corresponde às seqüências de linhagem de embrião humano, são compreendidas como moléculas de origem humana.

[0031] Conforme utilizado na presente invenção, um "primata não-chimpanzé" ou um "primata não-chimp" ou variantes gramaticais do mesmo referem-se a qualquer primata à exceção do chimpanzé, isto é, com exceção de um animal pertencente ao gênero Pan e incluindo a espécie Pan paniscus e Pan troglodytes, também conhecido como Anthropopithecus troglodytes ou Simia satyrus. Um "primata", "espécie de primata", "primatas", ou variantes gramaticais destes, denotamque uma ordem de mamíferos euterianos se dividiu em duas sub- ordens de pró-símios e antropóides e compreendem o homem, omacaco, chimpanzés e lêmures. Especificamente, os "primatas", tal como utilizado na presente invenção, compreendem a sub- ordem Strepsirrhini (pró-símios não-társios), incluindo a infraordem Lemuriformes (incluindo as superfamíliasCheirogaleoidea e Lemuroidea), a infraordem Chiromyiformes (incluindo a família Daubentoniidae) e a infraordem Lorisiformes (incluindo as famílias Lorisidae e Galagidae). Os "primatas", tal como utilizado na presente invenção, também compreendem a sub-ordem Haplorrhini, incluindo a infraordem Tarsiiformes (incluindo a família Tarsiidae), a infraordem Simiiformes (incluindo Platyrrhini ou Macacos do Novo Mundo e Catarrhini, incluindo Cercopithecidea ou Macacos do Velho Mundo).

[0032] A espécie de primata não-chimpanzé podeser compreendida dentro do significado da invenção como sendo um lêmure, um társio, um gibão, um sagüi (pertencente aos Macacos do Novo Mundo da família Cebidae) ou um Macaco do Velho Mundo (pertencente à superfamília Cercopithecoidea).

[0033] Conforme utilizado na presente invenção,um "Macaco do Velho Mundo" compreende qualquer macaco que se enquadra na superfamília Cercopithecoidea, a própria subdividida nas famílias: Cercopithecinae, que sãoprincipalmente africanos, mas incluem o gênero diverso dos símios que são asiáticos e norte-africanos; e Colobinae, que incluem a maior parte dos gêneros asiáticos, mas também os macacos Colobus africanos.

[0034] Especificamente, dentro da subfamíliaCercopithecinae, um primata não-chimpanzé vantajoso pode ser da Tribo Cercopithecini, dentro do gênero Allenopithecus (Macaco de Allen’s Swamp, Allenopithecus nigroviridis); dentro do gênero Miopithecus (Angolan talapoin, Miopithecus talapoin; Gabon talapoin, Miopithecus ogouensis); dentro do gênero Erythrocebus (Macaco de Patas, Erithorcebus patas); dentro do gênero Chlorocebus (Macaco Verde, Chlorocebus sabaceus; Grivet, Chlorocebus aethiops; Bale Mountains Vervet, Chlorocebus djamdjamensis; Macaco de Tantalus, Chlorocebus tantalus; Macaco de Vervet, Chlorocebus pygerythrus; Malbrouck, Chlorocebus cynosuros); ou dentro do gênero Cercopithecus (Macaco de Dryas ou Macaco de Salongo, Cercopithecus dryas; Macaco de Diana, Cercopithecus diana; Macaco de Roloway, Cercopithecus roloway; Greater Spot-nosed Monkey, Cercopithecus nictitans; Macaco Azul, Cercopithecus mitis; Macaco de Prata, Cercopithecus doggetti; Macaco Dourado, Cercopithecus kandti; Macaco de Sykes, Cercopithecus albogularis; Macaco de Mona, Cercopithecus mona; Macaco de Campbell’s Mona, Cercopithecus campbelli; Macaco de Lowe’s Mona, Cercopithecus lowei; Macaco de Mona Crestado, Cercopithecus pogonias; Macaco de Wolfs Mona, Cercopithecus wolfi; Macaco de Dent’s Mona, Cercopithecus denti; Lesser Spotnosed Monkey, Cercopithecus petaurista; White-throated Guenon, Cercopithecus erythrogaster, Sclater’s Guenon, Cercopithecus sclateri; Red-eared Guenon, Cercopithecus erythrotis; Moustached Guenon, Cercopithecus cephus; Macaco do Rabo Vermelho, Cercopithecus ascanius; Macaco de L'Hoest, Cercopithecus ihoesti; Macaco de Preuss, Cercopithecus preussi; Sun-tailed monkey, Cercopithecus solatus; Macaco de Hamlyn ou Macaco Cara de Coruja, Cercopithecus hamlyni; Macaco De Brazza, Cercopithecus neglectus).

[0035] Alternativamente, um primata não-chimpanzévantajoso, também dentro da subfamília Cercopithecinae, masdentro da Tribo Papionini, pode estar dentro do gênero Macaca (Símio de Barbary, Macaca sylvanus; Símio Rabo de Leão, Macacasilenus; Símio Rabo de Porco do Sul ou Beruk Macaca nemestrina; Símio Rabo de Porco do Norte, Macaca leonina; Símio da Ilha de Pagai ou Bokkoi, Macaca pagensis; Símio de Siberut, Macaca siberu; Símio de Moor, Macaca maura; Símio de Botas, Macaca ochreata; Símio de Tonkean, Macaca tonkeana; Símio de Heck, Macaca hecki; Símio de Gorontalo, Macaca nigriscens; Símio deCelebes Crestado ou "Chimpanzé" Preto, Macaca nigra; macaco Cinomolgo Símio que Come Caranguejo ou de Rabo Longo ou Kera,Macaca fascicularis; Símio do Rabo Coto ou Símio Urso, Macaca arctoides; Símio Rhesus, Macaca mulatta; Símio Rocha Formosa,Macaca cyclopis; Símio japonês, Macaca fuscata; Símio de Toque, Macaca sinica; Símio de Bonnet, Macaca radiata; Símio Barbary,Macaca sylvanmus; Símio de Assam, Macaca assamensis; Símio tibetano ou Símio de Milne-Edwards, Macaca thibetana; Símio Arunachal ou Munzala, Macaca munzala); dentro do gênero Lophocebus (Gray-cheeked Mangabey, Lophocebus albigena; Lophocebus Albigena albigena; Lophocebus albigena osmani; Lophocebus albigena johnstoni; Black Crested Mangabey, Lophocebus aterrimus; Opdenbosch's Mangabey, Lophocebus opdenboschi; Highland Mangabey, Lophocebus kipunji); dentro do gênero Papio (Babuíno de Hamadryas, Papio hamadryas; Babuíno da Guinea, Papio papio; Babuíno de Oliva, Papio anubis; Babuíno Amarelo, Papio cynocephalus; Babuíno de Chacma, Paio ursinus); dentro do gênero Theropithecus (Gelada, Theropithecus gelada); dentro do gênero Cercocebus (Sooty Mangabey, Cercocebus atys; Cercocebus atys atys; Cercocebus atys lunulatus; Collared Mangabey, Cercocebus torquatus; Agile Mangabey, Cercocebus agilis; Golden-bellied Mangabey, Cercocebus chrysogaster, Tana River Mangabey, Cercocebus galeritus; Sanje Mangabey, Cercocebus sanjei); ou dentro do gênero Mandrillus (Mandrill, Mandrillus sphinx; Drill, Mandrillus leucophaeus).

[0036] Os mais preferidos são Macaca fascicularis (também conhecido como Macaco Cinomolgo e, portanto, nos Exemplos, chamado de "Cynomolgus") e Macaca mulatta (macaco rhesus, chamado de "rhesus").

[0037] Dentro da subfamília Colobinae, um primata não-chimpanzé vantajoso pode ser do grupo africano, dentro do gênero Colobus (Colobus preto, Colobus satanas; Angola Colobus, Colobus angolensis; King Colobus, Colobus polykomos; Ursine Colobus, Colobus vellerosus; Mantled Guereza, Colobus guereza); dentro do gênero Piliocolobus (Western Red Colobus, Piliocolobus badius; Piliocolobus badius badius; Piliocolobus badius temminckii; Piliocolobus badius waldronae; Pennant's Colobus, Piliocolobus pennantii; Piliocolobus pennantii pennantii; Piliocolobus pennantii epieni; Piliocolobus pennantii bouvieh; Preuss's Red Colobus, Piliocolobus preussi; Thollon's Red Colobus, Piliocolobus tholloni; Central African Red Colobus, Piliocolobus foai;Piliocolobus foai foai; Piliocolobus foai ellioti; Piliocolobus foai oustaleti; Piliocolobus foai semlikiensis; Piliocolobus foai parmentierorum; Ugandan Red Colobus, Piliocolobus tephrosceles; Uzyngwa Red Colobus, Piliocolobus gordonorum; Zanzibar Red Colobus, Piliocolobus kirkii; Tana River Red Colobus, Piliocolobus rufomitratus); ou dentro do gênero Procolobus (Olive Colobus, Procolobus verus). Dentro da subfamília Colobinae, um primata não-chimpanzé vantajoso pode ser alternativamente do grupo de Langur (macaco da folha), dentro do gênero Semnopithecus (Nepal Gray Langur, Semnopithecus schistaceus; Kashmir Gray Langur, Semnopithecus ajax; Tarai Gray Langur, Semnopithecus hector, Northern Plains Gray Langur, Semnopithecus entellus; Black-footed Gray Langur, Semnopithecus hypoleucos; Southern Plains Gray Langur, Semnopithecus dussumieh; Tufted Gray Langur, Semnopithecus pnam); dentro do grupo T. vetulus ou do gênero Trachypithecus(Purple-faced Langur, Trachypithecus vetulus; Nilgiri Langur,Trachypithecus johnii); dentro do grupo T. cristatus ou do gênero Trachypithecus (Javan Lutung, Trachypithecus auratus; Silvery Leaf Monkey or Silvery Lutung, Trachypithecus c^status; Indochinese Lutung, Trachypithecus germaini; Tenasserim Lutung, Trachypithecus barbei); dentro do grupo do T. obscurus ou do gênero Trachypithecus (Dusky Leaf Monkey or Spectacled Leaf Monkey, Trachypithecus obscurus; Phayre's Leaf Monkey, Trachypithecus phayrei); dentro do grupo T. pileatus ou do gênero Trachypithecus (Capped Langur, Trachypithecus pileatus; Shortridge's Langur, Trachypithecus shortridgei; Gee's Golden Langur, Trachypithecus gee/); dentro do grupo T. francoisi ou do gênero Trachypithecus (Francois' Langur, Trachypithecus francoisi; Hatinh Langur, Trachypithecus hatinhensis; White-headed Langur, Trachypithecuspoliocephalus; Laotian Langur, Trachypithecus laotum; Delacour's Langur, Trachypithecus delacouh; Indochinese Black Langur, Trachypithecus ebenus); ou dentro do gênero Presbytis (Sumatran Surili, Presbytis melalophos; Banded Surili, Presbytis femoralis; Sarawak Surili, Presbytis chrysomelas; White-thighed Surili, Presbytis siamensis; White-fronted Surili, Presbytis frontata; Javan Surili, Presbytis comata; Thomas's Langur, Presbytis thomasi; Hose's Langur, Presbytis hosei; Maroon Leaf Monkey, Presbytis rubicunda; Mentawai Langur or Joja, Presbytis potenziani; Natuna Island Surili, Presbytis natunae).

[0038] Dentro da subfamília Colobinae, um primatanão-chimpanzé vantajoso pode ser alternativamente do grupo do nariz estranho, dentro do gênero Pygathrix (Red-shanked Douc, Pygathrix nemaeus; Black-shanked Douc, Pygathrix nigripes; Gray-shanked Douc, Pygathrix cinerea); dentro do gênero Rhinopithecus (Golden Snub-nosed Monkey, Rhinopithecus roxellana; Black Snub-nosed Monkey, Rhinopithecus bieti; Gray Snub-nosed Monkey, Rhinopithecus brelichi; Tonkin Snub-nosed Langur, Rhinopithecus avunculus); dentro do gênero Nasalis (Proboscis Monkey, Nasalis larvatus); ou dentro do gênero Simias (Pig-tailed Langur, Simias concolor).

[0039] Conforme utilizado na presente invenção, otermo "sagüi" denota todos os Macacos do Novo Mundo do gênero Callithrix, pertencentes, por exemplo, aos sagüis atlânticos do subgênero Callithrix (sic!) (Common Marmoset, Callithrix (Callithrix) jacchus; Black-tufted Marmoset, Callithrix (Callithrix) penicillata; Wied's Marmoset, Callithrix (Callithrix) kuhlii; White- headed Marmoset, Callithrix (Callithrix) geoffroyi; Buffy-headed Marmoset, Callithrix(Callithrix) flaviceps; Buffy-tufted Marmoset, Callithrix(Callithrix) aurita); pertencentes aos sagüis amazônicos do subgênero Mico (Rio Acari Marmoset, Callithrix (Mico) acariensis; Manicore Marmoset, Callithrix (Mico) manicorensis; Silvery Marmoset, Callithrix (Mico) argentata; White Marmoset, Callithrix (Mico) leucippe; Emilia's Marmoset, Callithrix (Mico) emiliae; Black-headed Marmoset, Callithrix (Mico) nigriceps; Marca's Marmoset, Callithrix (Mico)marcai; Blacktailed Marmoset, Callithrix (Mico) melanura; Santarem Marmoset, Callithrix (Mico) humeralifera; Maues Marmoset, Callithrix (Mico) mauesi; Gold-and-white Marmoset, Callithrix (Mico) chrysoleuca; Hershkovitz's Marmoset, Callithrix (Mico) intermedia; Satere Marmoset, Callithrix (Mico) saterei); Roosmalens' Dwarf Marmoset pertencentes ao subgênero Callibella (Callithrix (Callibella) humilis); ou Pygmy Marmoset pertencente ao subgênero Cebuella (Callithrix (Cebuella) pygmaea).

[0040] Outros gêneros de Macacos do Novo Mundocompreendem tamaris do gênero Saguinus (que compreende o grupo do S. oed/pus, o grupo S. midas, o grupo S. nigricollis, o grupo S. mystax, o grupo S. bicolor e o grupo S. inustus) e os macacos esquilo do gênero Samiri (por exemplo, Saimiri sciureus, Saimiri oerstedii, Saimiri ustus, Saimiri boliviensis, Saimiri vanzolini).

[0041] O termo "domínio de ligação" caracterizacom relação à presente invenção um domínio de um polipeptídeo que se liga/interage especificamente com uma determinada estrutura/antígeno/epítopo alvo. Desse modo, o domínio de ligação é um "sítio de interação do antígeno". O termo "sítio de interação do antígeno" define, de acordo com a presente invenção, um motif de um polipeptídeo, que pode interagir especificamente com um antígeno específico ou um grupo específico de antígenos, por exemplo, o antígeno idêntico em espécies diferentes. A dita ligação/interação também é compreendida para definir um "reconhecimento específico". O termo "reconhecimento específico" significa, de acordo com a presente invenção, que a molécula do anticorpo tem a capacidade de interação específica com e/ou ligação a pelo menos dois, e preferivelmente pelo menos três, mais preferivelmente pelo menos quatro aminoácidos de um antígeno, por exemplo, o antígeno CD3 humano tal como definido na presente invenção. Tal ligação pode ser exemplificada pela especificidade de um "princípio de trava e chave". Desse modo, os motifs específicos na seqüência de aminoácido do domínio de ligação e o antígeno se ligam em conseqüência de sua estrutura primária, secundária ou terciária bem como o resultado de modificações secundárias da dita estrutura. A interação específica do sítio de interação do antígeno com seu antígeno específico também pode resultar em uma ligação simples do dito sítio ao antígeno. Além disso, a interação específica do sítio de interação do antígeno com seu antígeno específico pode alternativamente resultar na iniciação de um sinal, por exemplo, devido à indução de uma mudança de conformação do antígeno, de uma oligomerização do antígeno, etc. Um exemplo preferido de um domínio de ligação de acordo com a presente invenção é um anticorpo. O domínio de ligação pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal ou derivado de um anticorpo monoclonal ou policlonal.

[0042] O termo "anticorpo" compreende os derivados ou os fragmentos funcionais do mesmo que ainda retêm a especificidade de ligação. As técnicas para a produção de anticorpos são bem conhecidas no estado da técnica e são descritas, por exemplo, em “Antibodies: A Laboratory Manual” de Harlow e Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 e “Using Antibodies: A Laboratory Manual”, de Harlow e Lane, 1999. O termo "anticorpo" também compreende imunoglobulinas (Ig) de classes (isto é, IgA, IgG, IgM, IgD e IgE) e subclasses(tais como IgG1, IgG2 etc.) diferentes. Estes anticorpos podemser utilizados, por exemplo, para a imunoprecipitação, purificação por afinidade e imunolocalização dos polipeptídeos ou das proteínas de fusão da invenção, bem como para o monitoramento da presença e da quantidade de tais polipeptídeos, por exemplo, nas culturas de células ou organismos procariontes ou eucariontes recombinantes.

[0043] A definição do termo "anticorpo" tambéminclui realizações tais como anticorpos quiméricos, cadeia simples e anticorpos humanizados, bem como fragmentos do anticorpo, tais como, inter alia, fragmentos de Fab. Os fragmentos ou derivados do anticorpo compreendemadicionalmente F(ab')2, Fv, fragmentos de scFv ou anticorpos de domínio único, anticorpos de domínio variável único ou domínio variável único de imunoglobulina que compreendem meramente um domínio variável, que pode ser VH ou VL, que se liga especificamente a um antígeno ou um epítopo independentemente de outras regiões ou domínios de V; vide, por exemplo, Harlow e Lane (1988) e (1999), loc. cit. Tal domínio variável único de imunoglobulina abrange não somente o polipeptídeo de domínio variável único de anticorpo isolado, mas também os polipeptídeos maiores que compreendem um ou mais monômeros de uma seqüência de polipeptídeo de domínio variável único de um anticorpo.

[0044] Vários procedimentos são conhecidos noestado da técnica e podem ser utilizados para a produção de tais anticorpos e/ou fragmentos. Desse modo, os derivados (do anticorpo) podem ser produzidos por peptidomimética. Além disso, as técnicas descritas para a produção de anticorpos decadeia simples (vide, inter alia, a Patente Norte-americana 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir os anticorpos decadeia simples específicos para o polipeptídeo eleito. Além disso, os animais transgênicos podem ser utilizados para expressar os anticorpos humanizados específicos para polipeptídeos e proteínas de fusão da presente invenção. Para a preparação de anticorpos monoclonais, qualquer técnica que ofereça os anticorpos produzidos pelas culturas de linhagem de células contínuas pode ser utilizada. Os exemplos para tais técnicas incluem a técnica de hibridoma (Nature 256 (1975),495-497) de Kohler e Milstein, a técnica de trioma, a técnica humana de hibridoma de células B (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) e a técnica de hibridoma de EBV para produziranticorpos monoclonais seres humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 7796) . A ressonância plasmônica de superfície como empregado no sistema BIAcore pode ser utilizada para aumentar a eficiência dos anticorpos de fago que se ligam a um epítopo de um polipeptídeo alvo, tal como o CD3 epsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol.Methods 183 (1995), 7-13). Também está previsto no contexto dapresente invenção que o termo "anticorpo" compreende os construtos de anticorpo que podem ser expressas em um hospedeiro tal como descrito na presente invenção abaixo, porexemplo, os construtos de anticorpo que podem ser transfectados e/ou transduzidos através de, inter alia, vetores de vírus oude plasmídeo.

[0045] O termo "interação específica", tal como utilizado de acordo com a presente invenção, significa que a molécula (do domínio) de ligação não reage cruzado ou não reage significativamente cruzado com os polipeptídeos que têm a estrutura similar como aqueles ligados pela molécula de ligação e que podem ser expressos pelas mesmas células que o polipeptídeo de interesse. A reatividade cruzada de um painel de moléculas de ligação sob investigação pode ser testada, por exemplo, pela avaliação da ligação do dito painel de moléculas de ligação sob condições convencionais (vide, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratoty Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 e Using Antibodies: A Laboratoty Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999). Os exemplos para a interação específica de um domínio de ligação com um antígeno específico compreendem a especificidade de um ligando a seu receptor. A dita definição compreende particularmente a interação dos ligandos que induzem um sinal quando da ligação a seu receptor específico. Os exemplos para a dita interação, que também é compreendida particularmente pela dita definição, são a interação de um determinante antigênico (epítopo) com o domínio de ligação (sítio de ligação antigênico) de um anticorpo.

[0046] O termo "especificidade de espécies cruzadas" ou "especificidade entre espécies", tal como utilizado na presente invenção, significa um domínio de ligação descrito na presente invenção para a mesma molécula alvo em seres humanos e em primatas não-chimpanzés. Desse modo, a "especificidade de espécies cruzadas" ou a "especificidade entre espécies" deve ser compreendida como uma reatividade entre espécies à esma molécula X expressa na espécie diferente, mas não a uma molécula comceção de X. A especificidade de espécies cruzadas de um anticorpo monoclonal que reconhece, por exemplo, o CD3 epsilon humano, a um CD3 epsilon de primata não-chimpanzé, por exemplo, o epsilon de símio CD3, pode ser determinada, por exemplo, pela análise de FACS. A análise de FACS é realizada de uma maneira que o anticorpo monoclonal respectivo seja testado quanto à ligação às células de seres humanos e de primatas não-chimpanzés, por exemplo, células de símios, que expressam os ditos antígenos epsilon CCD3 de seres humanos e de primatas não-chimpanzés, respectivamente. Um ensaio apropriado é mostrado nos exemplos seguintes.

[0047] Conforme utilizado na presente invenção, CD3 epsilon denota uma molécula expressa como parte do receptor das células T e tem o significado como atribuído tipicamente ao mesmo na técnica anterior. Em seres humanos, engloba, de forma individual ou independentemente combinada, todos as subunidades CD3 conhecidas, por exemplo, CD3 epsilon, delta CD3, gama CD3, zeta CD3, alfa CD3 e beta CD3. Os antígenos de primata CD3 não-chimpanzés tal como referido na presente invenção são, por exemplo, CD3 de Macaca fascicularis e CD3 de Macaca mulatta. Em Macaca fascicularis, abrange FN-18 negativo de CD3 epsilon e FN-18 positivo de CD3 epsilon, gama CD3 e delta CD3. Em Macaca mulatta, abrange CD3 epsilon, gama CD3 e delta CD3. Preferivelmente, o dito CD3, tal como utilizado na presente invenção, é o CD3 epsilon.

[0048] O CD3 epsilon humano é indicado no N°. de Acesso ao GenBank NM_000733 e compreende a SEQ ID NO. 1. O gama CD3 humano é indicado no N°. de Acesso ao GenBank NM 000073. O delta CD3 humano é indicado no N°. de Acesso ao GenBank NM 000732.

[0049] O "FN-18 negativo" de CD3 epsilon de Macaca fascicularis (isto é, CD3 epsilon não reconhecido pelo anticorpo monoclonal FN-18 devido a um polimorfismo tal como indicado acima) é indicado no N°. de Acesso ao GenBank AB073994.

[0050] O "FN-18 positivo" de CD3 epsilon de Macaca fascicularis (isto é, CD3 epsilon reconhecido pelo anticorpo monoclonal FN-18) é indicado no N°. de Acesso ao GenBank AB073993. O gama CD3 de Macaca fascicularis é indicado no N°. de Acesso ao GenBank AB073992. O delta CD3 de Macaca fascicularis é indicado no N°. de Acesso ao GenBank AB073991.

[0051] As seqüências de ácidos nucléicos e as seqüências de aminoácidos dos homólogos respectivos de epsilon, gama e delta CD3 de Macaca mulatta podem ser identificadas e isoladas pelas técnicas recombinantes descritas no estado da técnica (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a edição 2001). Isto se aplica mutatis mutandis aos homólogos de epsilon, gama e delta CD3 de outros primatas não- chimpanzés tal como definidos na presente invenção. A identificação da seqüência de aminoácido de Callithrix jacchus, Saimiri sciureus e Saguinus oedipus é descrita nos Exemplos em anexo. A seqüência de aminoácido do domínio extracelular de CD3 epsilon de Callithrix jacchus é descrita na SEQ ID NO: 3, a de Saguinus oedipus é descrita na SEQ ID NO: 5 e a de Saimiri sciureus é descrita na SEQ ID NO: 7.

[0052] De acordo com o que foi mencionado acima, o termo "epítopo" define um determinante antigênico, que é especificamente ligado/identificado por uma molécula de ligação tal como definido acima. O domínio ou as moléculas de ligação podem especificamente se ligar a/interagir com epítopos conformacionais ou contínuos, que são exclusivos para a estrutura alvo, por exemplo, a cadeia de CD3 epsilon de ser humano e primata não-chimpanzé. Um epítopo conformacional ou descontínuo é caracterizado pelos antígenos de polipeptídeo pela presença de dois ou mais resíduos de aminoácidos distintos que são separados na seqüência primária, mas ficam juntos na superfície da molécula quando o polipeptídeo se dobra na proteína/antígeno nativo (Sela, (1969) Science 166, 1365 e Laver, (1990) Cell 61, 553-6). Dois ou mais resíduos de aminoácidos distintos que contribuem para o epítopo estão presentes em seções separadas de uma ou mais cadeias de polipeptídeo. Estes resíduos ficam juntos na superfície da molécula quando a cadeia de polipeptídeo se dobra em uma estrutura tridimensional para constituir o epítopo. Por outro lado, um epítopo contínuo ou linear consiste em dois ou mais resíduos de aminoácidos distintos, que estão presentes em um único segmento linear de uma cadeia de polipeptídeo. Dentro da presente invenção, um epítopo CD3 "dependente do contexto" refere-se à conformação do dito epítopo. Tal epítopo dependente, localizado na cadeia de CD3 epsilon, pode somente desenvolver sua conformação correta se for encaixado dentro do restante da cadeia epsilon e mantido na posição correta pela heterodimerização da cadeia epsilon com a cadeia gama ou delta CD3. Por outro lado, um epítopo CD3 independente do contexto, tal como provido na presente invenção, refere-se à um polipeptídeo do resíduo de aminoácido 1-27 de N-terminal ou a um fragmento funcional de CD3 epsilon do mesmo. Este polipeptídeo do resíduo de aminoácido 1-27 de N-terminal ou um fragmento funcional do mesmo mantém a sua integridade estrutural tridimensional e conformação correta quando considerado fora de seu ambiente nativo no complexo de CD3. A independência do contexto do polipeptídeo do resíduo de aminoácido 1-27 de N-terminal ou um fragmento funcional do mesmo, que é parte do domínio extracelular de CD3 epsilon, representa, desse modo, um epítopo que é completamente diferente dos epítopos de CD3 epsilon descritos com relação a um método para a preparação de moléculas de ligação humanas no Pedido de Patente WO 2004/106380. O dito método utilizou CD3 epsilon recombinante unicamente expresso. A conformação deste CD3 epsilon recombinante unicamente expresso diferiu daquela adotada em sua forma natural, isto é, a forma em que a subunidade de CD3 epsilon do complexo TCR/CD3 existe como parte de um complexo não-covalente com a subunidade delta CD3 ou gama CD3 do complexo TCR/CD3. Quando tal proteína recombinante unicamente expressa de CD3 epsilon é utilizada como um antígeno para a seleção dos anticorpos de uma biblioteca de anticorpo, os anticorpos específicos para este antígeno são identificados a partir da biblioteca, embora tal biblioteca não contenha anticorpos com especificidade para autoantígenos. Isto é devido ao fato de que a proteína recombinante unicamente expressa de CD3 epsilon não existe in vivo; não é um autoantígeno. Conseqüentemente, as subpopulações das células de B que expressam os anticorpos específicos para esta proteína não foram esgotadas in vivo; uma biblioteca de anticorpo construída a partir de tais células B conteria o material genético para os anticorpos específicos para a proteína recombinante unicamente expressa de CD3 epsilon.

[0053] No entanto, uma vez que o polipeptídeo do resíduo de aminoácido 1-27 de N-terminal independente do contexto ou um fragmento funcional do mesmo é um epítopo, que se dobra em sua forma nativa, os domínios de ligação de acordo com a presente invenção não podem ser identificados pelos métodos com base na abordagem descrita no Pedido de Patente WO04/106380. Portanto, pode ser verificado nos testes que as moléculas de ligação tal como descrito no Pedido de Patente WO04/106380 não conseguem se ligar aos resíduos de aminoácido 127 de N-terminal da cadeia de CD3 epsilon.

[0054] Desse modo, as moléculas de ligação anti-CD3 convencionais ou as moléculas do anticorpo anti-CD3 (porexemplo, tal como descrito no Pedido de Patente WO 99/54440) ligam a cadeia CD3 epsilon em uma posição que é mais C- terminalmente localizada do que o polipeptídeo do resíduo deaminoácido 1-27 independente do contexto de N-terminal ou umfragmento funcional provido na presente invenção. As moléculas OKT3 e UCHT-1 do anticorpo da técnica anterior também têm uma especificidade para a subunidade epsilon do complexo TCR/CD3 entre os resíduos de aminoácido 35 a 85 e, conseqüentemente, o epítopo destes anticorpos também é mais C-terminalmente localizado. Além disso, UCHT-1 se liga à cadeia CD3 epsilon em uma região entre os resíduos de aminoácido 43 a 77 (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989), 546-50; Kjer-Nielsen,PNAS 101, (2004), 7675-7680; Salmeron, J. Immunol. 147 (1991),3047-52). Portanto, as moléculas anti-CD3 da técnica anterior não se ligam e não são dirigidas contra o epítopo do resíduo de aminoácido 1-27 de N-terminal independente do contexto definido na presente invenção (ou a um fragmento funcional do mesmo).

[0055] Para a geração de um domínio de ligaçãopreferivelmente humano compreendido em um polipeptídeo da invenção, por exemplo, em um anticorpo de cadeia simples biespecífico tal como definido na presente invenção, por exemplo, os anticorpos monoclonais que se ligam ao CD3 epsilon de seres humanos e de primatas não-chimpanzés (por exemplo, CD3 epsilon de símio) podem ser utilizados.

[0056] Em uma realização preferida dopolipeptídeo da invenção, o primata não-chimpanzé é um Macacodo Velho Mundo. Em uma realização preferida do polipeptídeo, o Macaco do Velho Mundo é um macaco do gênero Papio do gêneroMacaque. Com a máxima preferência, o macaco do gênero Macaque é Assamese macaque (Macaca assamensis), Barbary macaque (Macaca sylvanus), Bonnet macaque símio (Macaca radiata), Sulawesi-crested macaque (Macaca nigra), Formosan rock macaque (Macaca cyclopsis), Japanese snow macaque ou Japanese macaque (Macaca fuscata), Cynomologus monkey or crab-eating macaque or long-tailed macaque or Java macaque (Macaca fascicularis), Lion-tailed macaque (Macaca silenus), Pigtailed macaque (Macaca nemestrina), Rhesus macaque (Macaca mulatta), Tibetan macaque (Macaca thibetana), Tonkean macaque (Macaca tonkeana), Toque macaque (Macaca sinica), Stump-tailed macaque or Redfaced macaque or Bear monkey (Macaca arctoides), or Moor macaque (Macaca maurus). Com a máxima preferência, o macaco do gênero Papio é Hamadryas Baboon, Papio hamadryas; Guinea Baboon, Papio papio; Olive Baboon, Papio anubis; Yellow Baboon, Papio cynocephalus; Chacma Baboon, Papio ursinus.

[0057] Alternativamente, em uma realizaçãopreferida do polipeptídeo da invenção, o primata não-chimpanzé é um Macaco do Novo Mundo. Em uma realização preferida do polipeptídeo, o Macaco do Novo Mundo é um macaco do gênero Callithrix (sagüi), do gênero Saguinus ou do gênero Samiri. Com a máxima preferência, o macaco do gênero Callithrix é Callithrix jacchus, o macaco do gênero Saguinus é Saguinus oedipus e o macaco do gênero Samiri é Saimiri sciureus.

[0058] Conforme descrito na presente invenção acima, o polipeptídeo da invenção se liga com o primeiro domínio de ligação a uma cadeia do epítopo CD3ε (epsilon) humano e de primata não-chimpanzé, em que o epítopo faz parte de uma seqüência de aminoácido compreendida no grupo que consiste em 27 resíduos de aminoácido tal como descritos nas SEQ ID NO. 2, 4, 6 ou 8, ou um fragmento funcional dos mesmos.

[0059] De acordo com a presente invenção, é preferível para o polipeptídeo da invenção que o dito epítopo faça parte de uma seqüência de aminoácido que compreende 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 aminoácidos.

[0060] Com mais preferência, em que o dito epítopo compreende pelo menos a seqüência de aminoácido Gln-Asp-Gly- Asn-Glu (Q-D-G-N-E-D).

[0061] Dentro da presente invenção, um "fragmento funcional dos resíduos de aminoácido 1-27 de N-terminal" significa que o dito fragmento funcional ainda é um epítopo independente do contexto que mantém sua integridade estrutural tridimensional quando considerado fora de seu ambiente nativo no complexo CD3 (e fundido a uma seqüência de aminoácido heteróloga tal como EpCAM ou parte de Fc de imunoglobulina, por exemplo, conforme mostrado no Exemplo 3.1). A manutenção da estrutura tridimensional dentro do polipeptídeo de N- terminal do aminoácido 27 ou do fragmento funcional do mesmo de CD3 epsilon pode ser utilizada para a geração de domínios de ligação que se ligam ao fragmento CD3 epsilon do polipeptídeo de N-terminal in vitro e ao complexo CD3 nativo (subunidade CD3 epsilon) nas células T in vivo com a mesma afinidade de ligação. Dentro da presente invenção, um fragmento funcional dos resíduos de aminoácido 1-27 de N-terminal significa que as moléculas de ligação de CD3 providas na presente invenção podem ainda se ligar a tais fragmentos funcionais de uma maneira independente do contexto. O elemento versado na técnica está ciente dos métodos para o mapeamento de epítopo para determinar quais resíduos de aminoácido de um epítopo são reconhecidos por tais moléculas de ligação anti- CD3 (por exemplo, varredura de alanina).

[0062] Em uma realização preferida da invenção, o polipeptídeo da invenção compreende um (primeiro) domínio de ligação que pode se ligar a um epítopo da cadeia de CD3ε de seres humanos e de primatas não-chimpanzés e um segundo domínio de ligação que pode se ligar a um antígeno da superfície celular.

[0063] O termo "antígeno da superfície celular", tal como utilizado na presente invenção, denota uma molécula, que é indicada na superfície de uma célula. Na maior parte dos casos, esta molécula se situa na ou sobre a membrana plasmática da célula de uma maneira tal que pelo menos parte desta molécula permaneça acessível fora da célula na forma terciária. Um exemplo não limitador de uma molécula da superfície celular, que se situa na membrana plasmática é uma proteína de transmembrana que compreende, em sua conformação terciária, regiões de hidrofilicidade e hidrofobicidade. Aqui, pelo menos uma região hidrofóbica permite que a molécula da superfície celular seja encaixada ou introduzida na membrana plasmática hidrofóbica da célula sendo que as regiões hidrofílicas se estendem em um ou outro lado da membrana plasmática no citoplasma e no espaço extracelular, respectivamente. Os exemplos não limitadores das moléculas da superfície celular que se situam na membrana plasmática são as proteínas que foram modificadas em um resíduo de cisteína para contémr um grupopalmitoíla, as proteínas modificadas em um resíduo de cisteína de C-terminal para contémr um grupo farnesila ou as proteínasque foram modificadas no C-término para contémr uma âncora de glicosil fosfatidil inositol ("GPI"). Estes grupos permitem a fixação covalente das proteínas à superfície externa da membrana plasmática, onde permanecem acessíveis para o reconhecimento por moléculas extracelulares tais como os anticorpos. Os exemplos de antígenos da superfície celular incluem EGFR, EGFRvIII, MCSP, Anidrase Carbônica IX (CAIX), CD30, CD33, Her2/neu, IgE, CD44v6 e Muc-1. Além disso, osexemplos para os anticorpos de superfície celular correspondentes compreendem os antígenos que sãocaracterísticos para uma doença ou uma enfermidade específica, isto é, câncer, doenças autoimunes ou doenças de infecções que incluem as infecções virais. Conseqüentemente, o termo "antígenos da superfície celular" inclui explicitamente proteínas virais tais como as proteínas virais nativas não- processadas expostas na superfície das células infectadas (descritas, inter alia, para as proteínas de envelope do vírus da hepatite B, C e HIV-1).

[0064] Uma função de defesa das células Tcitotóxicas é a destruição das células infectadas por vírus, portanto, a propriedade exclusiva das moléculas de ligação biespecíficas da invenção de ativar e redirecionar as células T independentemente de sua especificidade autoctóna tem um grande impacto no amplo campo das infecções crônicas por vírus. Para a maior parte destas infecções, a eliminação das células persistentemente infectadas é a única possibilidade para a cura. Atualmente, terapias de células T adotivas estão sendo desenvolvidas contra infecções crônicas por CMV e EBV (Rooney, C. M., et al., Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr-virus-related lymphoproliferation. Lancet, 1995. 345 (8941): p. 9-13; Walter, E. A., et al., Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N Engl J Med, 1995. 333 (16): páginas 1038-44).

[0065] A infecção crônica por hepatite B é claramente uma das indicações mais interessantes e recompensadoras. Mundialmente, entre 350 e 400 milhões de pessoas são infectadas com HBV. O tratamento atual da hepatite HBV crônica está no interferon y e nos análogos de nucleosídeo ou nucleotídeo, uma terapia em longo prazo com efeitos colaterais consideráveis tais como a indução de exacerbação da hepatite, febre, mialgias, trombocitopenia e depressão. Embora haja agora mais de quatro regimes terapêuticos aprovados, a eliminação do vírus raramente é atingida. Uma inflamação persistente na hepatite B crônica leva à cirrose e ao carcinoma hepatocelular em mais de 25% dos pacientes. Além disso, até 40% dos pacientes com hepatite B crônica morrerão de complicações sérias, sendo responsáveis por 0,6 a 1,0 milhão de mortes por ano no mundo todo.

[0066] O HBV, o protótipo do Hepadnavírus, é um vírus envelopado cujo (re) genoma circular relaxado é transcrito reversamente em um pré-genoma do RNA. Após a infecção, o re DNA é importado no núcleo do hepatócito onde é terminado em um DNA circular fechado covalentemente (cccDNA) que contém quatro quadros de leitura sobrepostos. Serve como o molde de transcrição para o RNA pré-genômico e três RNAs subgenômicos. O pré-genoma do RNA funciona como o mRNA para a tradução do núcleo viral e da proteína polimerase. As células infectadas produzem continuamente a proteína de superfície do HBV (HBsAg) a partir do cccDNA mesmo quando a replicação do HBV é interrompida. A HBsAg consiste nas proteínas de superfície pequenas (S) com muito poucas porções das proteínas de superfície médias e grandes (L). Os HBVs S e L são visados à membrana do retículo endoplasmático (RE) de onde são transportados nas vesículas da membrana através da organela de trans Golgi à membrana plasmática (Gorelick, F. S. e C. Shugrue, Exiting the endoplasmic reticulum. Mol Cell Endocrinol, 2001. 177 (1-2): páginas 13-8). As proteínas S e L são expressas permanentemente na superfície do HBV que replica os hepatócitos conforme mostrado recentemente (Chu, C. M. e Y. F. Liaw, Membrane staining for hepatitis B surface antigen on hepatocytes: a sensitive marker of active viral replication in hepatitis B. J Clin Pathol, 1995. 48(5): páginas 470-3).

[0067] Os vírus do protótipo que expõem as proteínas de envelope na superfície celular são o vírus da hepatite B (HBV), o vírus da hepatite C (HCV) e o HIV-1, sendo que ambos representam um fardo enorme de doença global. Para a indicação do vírus HIV-1, foi mostrado recentemente que as células T modificadas por uma TCR quimérica com um construto do anticorpo de Fv dirigido na proteína de envelope gp120 podem matar as células infectadas pelo HIV-1 alvo (Masiero, S., et al., T-cell engineering by a chimeric T-cell receptor with antibody-type specificity for the HIV-1 gp120., 2005. 12 (4): páginas 299-310). Dos Hepadnavírus, o vírus da hepatite B (HBV) expressa o complexo da proteína de envelope HBsAg que é produzido continuamente a partir do cccDNA epissomal mesmo quando a replicação do HBV diminui.

[0068] A expressão como as proteínas de HBV S e L intactas na superfície celular as torna acessíveis para os anticorpos que são a característica principal da soroconversão quando os pacientes se recuperam da fase aguda das infecções e mudam do HBsAg circulante aos anti-HBs. Se a soroconversão não ocorrer, até 30% dos hepatócitos também continuam a expressar a proteína de HBV S após a terapia antiviral altamente ativa de longa duração. Desse modo, além dos linfócitos T que reconhecem especificamente os peptídeos de HBV intracelularmente processados e apresentados pelas moléculas de MHC na superfície celular, outras formas de acoplamento das células T são viáveis, visadas na proteína de superfície intacta, tais como os antígenos S e L acessíveis na membrana externa da célula. A utilização de fragmentos de anticorpo de cadeia simples que reconhecem as proteínas de envelope pequenas (S) e grandes (L) do vírus da hepatite B, os receptores artificiais das células T foram gerados, os quais permitem as células T enxertadas nos hepatócitos infectados e, quando da ativação do contato do antígeno destas células T, secretam citoquinas e matam os hepatócitos infectados.

[0069] A limitação desta abordagem é, (i) que as células T precisam ser manipuladas in vitro, (ii) os retrovírus utilizados para transferir os receptores das células T podem causar a mutagênese insercional nas células T e (iii) que uma vez que as células T foram transferidas, a resposta citotóxica não pode ser limitada.

[0070] Para superar estas limitações, as moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas que compreendem um primeiro domínio com uma especificidade de ligação para o antígeno CD3 epsilon de seres humanos e de primatas não-chimpanzés (conforme provido no contexto da presente invenção) bem como um segundo domínio com especificidade de ligação para as proteínas de envelope de HBV ou HCV dos hepatócitos infectados pode ser gerado e está dentro do âmbito da presente invenção.

[0071] Dentro da presente invenção também é preferível que o segundo domínio de ligação se ligue ao antígeno da superfície da célula humana e/ou de um primata não-chimpanzé.

[0072] Para a geração do segundo domínio de ligação do polipeptídeo da invenção, por exemplo, os anticorpos de cadeia simples biespecíficos tal como definido na presente invenção, os anticorpos monoclonais que se ligam a ambos os antígenos respectivos da superfície celular de humano e/ou de primata não-chimpanzé podem ser utilizados. Os domínios de ligação apropriados para o polipeptídeo biespecífico tal como definido na presente invenção podem ser, por exemplo, derivados dos anticorpos monoclonais específicos de espécies cruzadas pelos métodos recombinantes descritos no estado da técnica. Um anticorpo monoclonal que se liga a um antígeno humano da superfície celular e ao homólogo do dito antígeno da superfície celular em um primata não-chimpanzé pode ser testado por meio de ensaios de FACS tal como indicado acima. É evidente aos elementos versados na técnica que os anticorpos específicos de espécies cruzadas também podem ser gerados pelas técnicas de hibridoma descritas na literatura (Milstein e Kohler, Nature 256 (1975), 495-7). Por exemplo, os camundongos podem ser alternativamente imunizados com CD33 de seres humanos e de primatas não-chimpanzés. A partir destes camundongos, as células de hibridoma que produzem o anticorpo específico de espécies cruzadas são isoladas através da tecnologia de hibridoma, e são analisadas por FACS, tal como indicado acima. A geração e a análise de polipeptídeos biespecíficos tais como os anticorpos de cadeia simples biespecíficos que exibem especificidade de espécies cruzadas tal como descrito na presente invenção são mostradas nos seguintes exemplos. As vantagens dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos que exibem especificidade de espécies cruzadas incluem os pontos enumerados abaixo.

[0073] É particularmente preferível para o polipeptídeo da invenção que o primeiro domínio de ligação que pode se ligar a um epítopo da cadeia de CD3ε de seres humanos e de primatas não-chimpanzés compreende uma região de VL que compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 selecionada entre:(a) CDR-L1 tal como descrito na SEQ ID NO. 27, CDR- L2 tal como descrito na SEQ ID NO. 28 e CDR-L3 tal como descrito na SEQ ID NO. 29;(b) CDR-L1 tal como descrito na SEQ ID NO. 117, CDR- L2 tal como descrito na SEQ ID NO. 118 e CDR-L3 tal como descrito na SEQ ID NO. 119; e(c) CDR-L1 tal como descrito na SEQ ID NO. 153, CDR- L2 tal como descrito na SEQ ID NO. 154 e CDR-L3 tal como descrito na SEQ ID NO. 155.

[0074] As regiões variáveis, isto é, a cadeia leve variável ("L" de "VL") e a cadeia pesada variável ("H" ou "VH") são compreendidas no estado da técnica para prover o domínio de ligação de um anticorpo. Estas regiões variáveis abrigam as regiões determinantes complementares.

[0075] O termo "região determinante complementar" (CDR) é bem conhecido no estado da técnica para ditar a especificidade do antígeno de um anticorpo. O termo "CDR-L" ou "L CDR" refere-se a CDRs em VL, ao passo que o termo "CDR-H" ou "H CDR" refere-se a CDRs em VH.

[0076] Alternativamente, em uma realização preferida do polipeptídeo da invenção, o primeiro domínio de ligação que pode se ligar a um epítopo da cadeia de CD3ε de seres humanos e de primatas não-chimpanzés compreende uma região de VH que compreende CDR-H 1, CDR-H2 e CDR-H3 selecionada entre:(a) CDR-H1 tal como descrito na SEQ ID NO. 12, CDR- H2 tal como descrito na SEQ ID NO. 13 e CDR-H3 tal como descrito na SEQ ID NO. 14;(b) CDR-H1 tal como descrito na SEQ ID NO. 30, CDR- H2 tal como descrito na SEQ ID NO. 31 e CDR-H3 tal como descrito na SEQ ID NO. 32;(c) CDR-H1 tal como descrito na SEQ ID NO. 48, CDR- H2 tal como descrito na SEQ ID NO. 49 e CDR-H3 tal como descrito na SEQ ID NO. 50;(d) CDR-H1 tal como descrito na SEQ ID NO. 66, CDR- H2 tal como descrito na SEQ ID NO. 67 e CDR-H3 tal como descrito na SEQ ID NO. 68;(e) CDR-H1 tal como descrito na SEQ ID NO. 84, CDR- H2 tal como descrito na SEQ ID NO. 85 e CDR-H3 tal como descrito na SEQ ID NO. 86;(f) CDR-H1 tal como descrito na SEQ ID NO. 102, CDR- H2 tal como descrito na SEQ ID NO. 103 e CDR-H3 tal como descrito na SEQ ID NO. 104;(g) CDR-H1 tal como descrito na SEQ ID NO. 120, CDR- H2 tal como descrito na SEQ ID NO. 121 e CDR-H3 tal como descrito na SEQ ID NO. 122;(h) CDR-H1 tal como descrito na SEQ ID NO. 138, CDR- H2 tal como descrito na SEQ ID NO. 139 e CDR-H3 tal como descrito na SEQ ID NO. 140;(i) CDR-H1 tal como descrito na SEQ ID NO. 156, CDR- H2 tal como descrito na SEQ ID NO. 157 e CDR-H3 tal como descrito na SEQ ID NO. 158; e(j) CDR-H1 tal como descrito na SEQ ID NO. 174, CDR- H2 tal como descrito na SEQ ID NO. 175 e CDR-H3 tal como descrito na SEQ ID NO. 176.

[0077] Também é preferível que o primeiro domínio de ligação que pode se ligar a um epítopo da cadeia de CD3ε de seres humanos e de primatas não-chimpanzés compreenda uma região de VL selecionada do grupo que consiste em uma região de VL tal como descrito nas SEQ ID NO. 35, 39, 125, 129, 161 ou 165.

[0078] É preferível, alternativamente, que o primeiro domínio de ligação que pode se ligar a um epítopo da cadeia de CD3ε de seres humanos e de primatas não-chimpanzés compreenda uma região de VH selecionada do grupo que consiste em uma região de VH tal como descrito nas SEQ ID NO. 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 ou 181.

[0079] Com mais preferência, o polipeptídeo da invenção é caracterizado pelo primeiro domínio de ligação que pode se ligar a um epítopo da cadeia de CD3ε de seres humanos e de primatas não-chimpanzés, que compreende uma região de VL e uma região de VH selecionadas do grupo que consiste em:(a) uma região de VL tal como descrito na SEQ ID NO. 17 ou 21 e uma região de VH tal como descrito na SEQ ID NO. 15 ou 19;(b) uma região de VL tal como descrito na SEQ ID NO. 35 ou 39 e uma região de VH tal como descrito na SEQ ID NO. 33 ou 37;(c) uma região de VL tal como descrito em ID SEQ NO. 53 ou 57 e uma região de VH tal como descrito na SEQ ID NO. 51 ou 55;(d) uma região de VL tal como descrito em ID SEQ NO. 71 ou 75 e uma região de VH tal como descrito na SEQ ID NO. 69 ou 73;(e) uma região de VL tal como descrito na SEQ ID NO. 89 ou 93 e uma região de VH tal como descrito na SEQ ID NO. 87 ou 91;(f) uma região de VL tal como descrito na SEQ ID NO. 107 ou 111 e uma região de VH tal como descrito na SEQ ID NO. 105 ou 109;(g) uma região de VL tal como descrito na SEQ ID NO. 125 ou 129 e uma região de VH tal como descrito na SEQ ID NO. 123 ou 127;(h) uma região de VL tal como descrito na SEQ ID NO. 143 ou 147 e uma região de VH tal como descrito na SEQ ID NO. 141 ou 145;(i) uma região de VL tal como descrito na SEQ ID NO. 161 ou 165 e uma região de VH tal como descrito na SEQ ID NO. 159 ou 163; e(j) uma região de VL tal como descrito na SEQ ID NO. 179 ou 183 e uma região de VH tal como descrito na SEQ ID NO. 177 ou 181.

[0080] De acordo com uma realização preferida do polipeptídeo da invenção, os pares das Regiões de VH e das regiões de VL estão no formato de um anticorpo de cadeia simples (scFv). As regiões de VH e de VL são arranjadas na ordem VH-VL ou VL-VH. É preferível que a região de VH seja N- terminalmente posicionada a uma seqüência de aglutinante. A região de VL é C-terminalmente posicionada à seqüência de aglutinante.

[0081] Uma realização preferida do polipeptídeo acima descrito da invenção é caracterizada pelo primeiro domínio de ligação que pode se ligar a um epítopo da cadeia de CD3ε de seres humanos e de primatas não-chimpanzés que compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO. : 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ou 187.

[0082] A invenção refere-se adicionalmente a um polipeptídeo acima descrito, em que o segundo domínio de ligação se liga a um antígeno da superfície celular, que é preferivelmente um antígeno de tumor.

[0083] O termo "antígeno de tumor", tal como utilizado na presente invenção, pode ser compreendido como aqueles antígenos que são apresentados em células de tumor. Estes antígenos podem ser apresentados na superfície celular com uma parte extracelular, que é freqüentemente combinada com uma transmembrana e uma parte citoplasmática da molécula. Estes antígenos podem ser algumas vezes apresentados somente por células de tumor e nunca pelas normais. Os antígenos de tumor podem ser exclusivamente expressos em células de tumor ou podem representar uma mutação específica do tumor em comparação às células normais. Neste caso, eles são chamados de antígenos específicos de tumor. São mais comuns os antígenos que são apresentados por células de tumor e por células normais e são chamados de antígenos associados ao tumor. Estes antígenos associados ao tumor podem ser superexpressos em comparação às células normais ou são acessíveis para a ligação do anticorpo nas células de tumor devido à estrutura menos compacta do tecido do tumor em comparação ao tecido normal. Os exemplos não limitadores de antígenos de tumor, tal como utilizado na presente invenção, são EGFR (Liu, Br J. Cancer 82/12 (2000), 1991-1999; Bonner, Semin. Radiat. Oncol. 12 (2002), 11-20; Kiyota, Oncology 63/1 (2002), 92-98; Kuan, Brain Tumor Pathol. 17/2 (2000), 71-78), EGFRvIII (Kuan, Brain Tumor Pathol. 17/2 (2000), 71-78), Carboanhydrase IX (MN/CA IX) (Uemura, Br J. Cancer 81/4 (1999), 741-746; Longcaster, Cancer Res. 61/17 (2001), 6394-6399; Chia, J. Clin. Oncol. 19/16 (2001), 36603668; Beasley, Cancer Res.61/13 (2001), 5262-5267), CD33 (Abutalib, Curr Pharm Biotechnol. 7 (2006), 343-69), MCSP (Campoli, Crit Rev Immunol. 24 (2004), 267-96), ou IgE (Infuhr,Allergy 60 (2005), 977-85).

[0084] É preferível que o antígeno do tumor seja selecionado entre EGFR, EGFRvIII, MCSP, EpCAM, anidrase carbônica IX (CAIX), CD30, CD33, Her2/neu, CD44v6 e Muc-1.

[0085] O EGFR (também conhecido como c-erbl ouHER1) pertence à família de quinase de tirosina do receptor de erbB. Quando ativado pela ligação de um ligando da família EGF dos fatores de crescimento, o EGFR se homodimeriza ou heterodimeriza com um segundo EGFR ou outro elemento da família do receptor de erbB, respectivamente, iniciando uma cascata de sinalização através das quinases de proteína ativadas por mitógenos e outros fatores de transcrição que conduzem à proliferação, diferenciação e reparo (Olayioye, EMBO J. 19 (2000), 3159-67). O EGFR é superexpresso em muitos cânceresepiteliais, incluindo o câncer colorretal, de mama, de pulmão, de cabeça e de garganta (Mendelsohn, J. Clin. Oncol. 21 (2003),2787-99; Mendelsohn, J. Clin. Oncol. 20 (18, Suppl.)(2002),1s-13s; Prewett, Clin. Cancer Res. 8 (2002), 994-1003). Asuperexpressão e/ou a mutação do EGFR em células malignas conduz à ativação constitutiva da atividade de quinase resultando em a proliferação, a angiogênese, a invasão, a metástase e a inibição da apoptose (Mendelsohn (2003, loc. cit.; Ciardiello, Clin. Cancer Res. 7 (2001), 2958-70; Perez-Soler, Oncologist 9 (2004), 58-67). Os anticorpos monoclonaisque visam o domínio de ligação do ligando extracelular ou a cascata de sinalização da quinase intracelular de tirosina de EGFR demonstraram eficácia como um alvo antitumor (Laskin, Cancer Treat. Review 30 (2004), 1-17). Por exemplo, o cetuximab(Erbitux), um anticorpo monoclonal humanizado para EGFR, que inibe competitivamente o domínio extracelular de EGFR para inibir a ativação do ligando do receptor, foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) em 2004 para o tratamento do câncer de cólon metastático em combinação com o inibidor de topoisomerase de irinotecano.

[0086] O proteoglicano de sulfato de condroitinade superfície da célula associado com a melanoma (MCSP), também conhecido como antígeno associado com a melanoma de elevado peso molecular (HMW-MAA) ou proteoglicano associado com a melanoma, é um proteoglicano de grande superfície da célula de mais de 450 kDa que compreende um núcleo de glicoproteína de 250 kDa e cadeias de glicosaminoglicano unidas ao mesmo (Pluschke, PNAS 93 (1996), 9710; Nishiyama, J. Cell Biol. 114(1991), 359). A função exata do MCSP é ainda desconhecida. Elepode agir como o receptor da aderência que media as interações celulares com a matriz extracelular (ECM) e são provavelmenteimplicadas na angiogênese, na invasão do tecido e na difusão das células (Burg, Cancer Res. 59 (1999), 2869; lida, J. Biol.Chem. 276 (2001), 18786; Eisenmann, Nat. Cell Biol. 1 (1999),507; lida, Cancer Res. 55 (1995), 2177; Campoli (2004), loc.cit). O MCSP pode realçar a ligação de ligando pela integrinaa4b1, e a ativação de MCSP pode realçar a difusão de célulamediada por integrina por mecanismos dependentes de cdc42 e p130cas. O MCSP se associa através do sulfato de condroitina com MT3-MMP, que pode degradar várias ECM-proteínas. Ele pode localizar especificamente MT3-MMP nos sítios de aderência de ECM celulares. Desse modo, ambas as moléculas parecem ser requeridas para a invasão do colágeno do tipo I e a degradação da gelatina do tipo I (lida (2001), loc. cit.). O MSCP é um marcador principal para a melanoma, onde ele é altamente expresso na superfície das células do tumor. Ele é expresso por pelo menos 90% das lesões de melanoma (Natali, J. Natl. Câncer Inst. 72 (1984), 13). Entre todos os antígenosassociados ao melanoma, o MCSP apresenta o grau mais baixo de heterogeneidade (Natali, Cancer Res. 45 (1985), 2883). Aocontrário dos tumores primários de melanoma de difusão superficial (freqüência: 60%), melanoma nodular (freqüência: 20%) e melanoma de lentigo maligna (freqüência: 10%), que são geralmente MCSP-positivos (Reza Ziai 1987 Cancer Res. 47:2474), os tumores primários de melanoma lentiginoso acral (freqüência: 5%) são normalmente MCSP-negativos (Kageshita, Cancer Res. 51 (1991), 1726). Atualmente, há 53.600 casos recentemente diagnosticados de melanoma a cada ano nos Estados Unidos (2002). De maneira geral, a incidência de melanoma está aumentando.

[0087] Em uma realização preferida da invenção, o polipeptídeo é uma molécula de anticorpo de cadeia biespecífica simples.

[0088] Os problemas na presente invenção acima descritos no que diz respeito ao desenvolvimento de moléculas substitutas para estudos pré-clínicos também são agravados se a droga candidata for um anticorpo biespecífico, por exemplo, um anticorpo de cadeia simples biespecífico. Tal anticorpo biespecífico requer que ambos os antígenos reconhecidos sejam específicos de espécies cruzadas com uma determinada espécie animal para permitir a segurança dos testes em animais.

[0089] Conforme também observado acima, a presente invenção apresenta polipeptídeos que compreendem um primeiro domínio de ligação que pode se ligar a um epítopo da cadeia CD3ε de seres humanos e de primatas não-chimpanzés e um segundo domínio de ligação que pode se ligar a um antígeno da superfície celular selecionado dentre EGFR, Her2/neu ou IgE, em que o segundo domínio de ligação também se liga preferivelmente a um antígeno da superfície celular de um ser humano e/ou de um primata não-chimpanzé. A vantagem das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas como drogas candidatas que preenchem os requisitos do polipeptídeo preferido da invenção é o uso de tais moléculas em testes pré- clínicos em animais bem como em estudos clínicos e ainda para a terapia em seres humanos. Em uma realização preferida dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas da invenção, o segundo domínio de ligação que pode se ligar a um antígeno da superfície celular é de origem humana. Em uma molécula biespecífica específica de espécies cruzadas de acordo com a invenção, o domínio de ligação que pode se ligar a um epítopo da cadeia de CD3 epsilon de seres humanos e de primatas não-chimpanzés se situa na ordem VH-VL ou VL-VH no N-término ou no C-término da molécula biespecífica. Os exemplos para as moléculas biespecíficas específicas de espécies cruzadas de acordo com a invenção em arranjos diferentes da cadeia de VL e da cadeia de VH no primeiro e segundo domínios de ligação são descritos nos Exemplos em anexo.

[0090] Conforme utilizado na presente invenção, um "anticorpo de cadeia simples biespecífico" denota uma única cadeia de polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação. Cada domínio de ligação compreende uma região variável de uma cadeia pesada do anticorpo (a "região de VH"), em que a região de VH do primeiro domínio de ligação se liga especificamente à molécula de CD3ε e a região de VH do segundo domínio de ligação se liga especificamente a um antígeno da superfície celular, tal como definido mais detalhadamente abaixo. Os dois domínios de ligação são ligados opcionalmente um ao outro por um espaçador curto de polipeptídeo. Um exemplo não limitador para um espaçador de polipeptídeo é Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G-G- G-S) e as repetições do mesmo. Cada domínio de ligação pode compreender adicionalmente uma região variável de uma cadeia leve do anticorpo (a "região de VL"), a região de VH e a região de VL dentro de cada um dentre o primeiro e o segundo domínios de ligação que são ligados um ao outro através de um aglutinante de polipeptídeo, por exemplo, do tipo descrito e reivindicado no Pedido de Patente EP 623679 B1, mas em qualquer caso, suficientemente longo de maneira a permitir que a região de VH e a região de VL do primeiro domínio de ligação e a região de VH e a região de VL do segundo domínio de ligação se emparelhem umas com as outras de uma maneira tal que, conjuntamente, possam se ligar especificamente à primeira e segunda moléculas respectivas.

[0091] De acordo com uma realização preferida da invenção uma molécula de anticorpo de cadeia simples biespecífica acima caracterizada compreende um grupo das seguintes seqüências como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 e CDR L3 no segundo domínio de ligação selecionado do grupo que consiste em: ID SEQ No.: 189-194, ID SEQ No.: 201-206, ID SEQ No.: 219-224, ID SEQ No.: 237-242, ID SEQ No.: 255-260, ID SEQ No.: 273-279, ID SEQ No.: 382-384 e 387-389, ID SEQ No.: 400-402 e 405-407, ID SEQ No.: 418-420 e 423-425, ID SEQ No.: 436-438 e 441-443, ID SEQ No.: 454-456 e 459-461, ID SEQ No.: 472-474 e 477-479, ID SEQ No.: 490-492 e 495-497, ID SEQ No.: e 508-510 e 513-515, ID SEQ No.: 530-532 e 1568 a 1570, ID SEQ No.: 545-547 e 550-552, ID SEQ No.: 559-561 e 564-566, ID SEQ No.: 577-579 e 582-584, ID SEQ No.: 615-617 e 620-622, ID SEQ No.: 633-635, 638, 639 e 1571, ID SEQ No.: 650-652 e 655-657, ID SEQ No.: 668-670 e 673-675, ID SEQ No.: 682-684 e 687-689, ID SEQ No.: 696-698 e 701-703, ID SEQ No.: 710- 712 e 715-717, ID SEQ No.: 724-726 e 729-731, ID SEQ No.: 738-740 e 743-745, ID SEQ No.: 752-754 e 757-759, ID SEQ No.: 766-768 e 771-773, ID SEQ No.: 780-782 e 785-787, ID SEQ No.: 794-796 e 799-801, ID SEQ No.: 808-810 e 813-815, ID SEQ No.: 822-824 e 827-829, ID SEQ No.: 836- 838 e 841-843, ID SEQ No.: 850-852 e 855-857, ID SEQ No.: 866-868 e 871-873, ID SEQ No.: 884-886 e 889-891, ID SEQ No.: 902-904 e 907-909, ID SEQ No.: 920-922 e 925-927, ID SEQ No.: 938- 940 e 943-945, ID SEQ No.: 956-958 e 961-963, ID SEQ No.: 974-976 e 979-981, ID SEQ No.: 992-994 e 997-999, ID SEQ No.: 1006-1008 e 1011- 1013, ID SEQ No.: 1020-1022 e 1025-1027, ID SEQ No.: 1034-1036 e 1039- 1041, ID SEQ No.: 1048-1050 e 1053-1055, ID SEQ No.: 1062-1064 e 1067- 1069, ID SEQ No.: 1076-1078 e 1081-1083, ID SEQ No.: 1090-1092 e 10951097, ID SEQ No.: 1114-1116 e 1119-1121, ID SEQ No.: 1128-1130 e 1133-1135, ID SEQ No.: 1141-1143 e 1146-1148, ID SEQ No.: 1155-1157 e 1160-1162, ID SEQ No.: 1169-1171 e 1174-1176, ID SEQ No.: 1183-1185 e 1188-1190, ID SEQ No.: 1197-1199 e 12021204, ID SEQ No.: 1211-1213 e 1216-1218, ID SEQ No.: 1125-1227 e 1230-1232, ID SEQ No.: 1239-1241 e 1244-1246, ID SEQ No.: ,1253-1255 e 1258-1260, ID SEQ No.: 1267-1269 e 1272-1274, ID SEQ No.: 1281-1283 e 1286-1288, ID SEQ No.: 1295-1297 e 13001302, ID SEQ No.: 1309-1311 e 1314-1316, ID SEQ No.: 1323-1325 e 1328-1330, ID SEQ No.: 1343-1345 e 1348-1350, ID SEQ No.: 1361-1363 e 1366-1368, ID SEQ No.: 1375-1377 e 1380-1382, ID SEQ No.: 1389- 1391 e 1394-1396, ID SEQ No.: 1403-1405 e 14081410, ID SEQ No.: 1417-1419 e 1422-1424, ID SEQ No.: 1431-1433 e 1436-1438, ID SEQ No.: 1445-1447 e 1450-1452, ID SEQ No.: 1459-1461 e 1464-1466, ID SEQ No.: 1473-1475 e 1478-1480, ID SEQ No.: 1486-1491, Id SEQ No.: 1492-1497, ID SEQ No.: 15051507 e 1510-1512, ID SEQ No.: 1531-1533 e 1536-1538, ID SEQ No.: 1573-1575 e 1578-1580, ID SEQ No.: 1591-1593 e 1596-1598, ID SEQ No.: 1605-1607 e 1610-1612, e ID SEQ No.: 1619-1621, 1624-1626, Id SEQ No.: 1634-1636 e 1639-1641 e ID SEQ No.: 1652-1654, Id SEQ No.: 1657-1659 e ID SEQ No.: 1669-1674.

[0092] Uma realização particularmente preferida da invenção refere-se a um polipeptídeo acima caracterizado, em que a molécula de anticorpo de cadeia simples biespecífica compreende uma seqüência selecionada de:(a) uma seqüência de aminoácido tal como indicadoem qualquer uma das ID SEQ No. : 291, 293, 295, 297, 299, 301,303 , 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325,327 , 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345 ou 347, 393,395 , 397, 411, 413, 415, 429, 431, 433, 447, 449, 451, 465,467 , 469, 483, 485, 487, 501, 503, 505, 519, 521, 523, 1336,1338, 1340, 538, 540, 542, 556,570, 572, 574, 588, 590, 592,626, 628, 630, 643 , 645 , 647, 661, 663, 665, 679 , 693, 707,721, 735, 749, 763 , 777 , 791, 805, 819, 833, 847 , 861, 863,877, 879, 881, 895 , 897 , 899, 913, 915, 917, 931 , 933, 935,949, 951, 953, 967, 969, 971, 985, 987, 989, 1003, 1017, 1031,1045, 1059, 1073, 1087, 1101 , 1125,1138, 1152, 1166, 1180,1194, 1208, 1222, 1236, 1250, 1264, 1278, 1292, 1306, 1320,1334, 1354, 1356, 1358, 1372, 1386, 1400, 1414, 1428, 1442,1456, 1470, 1484, 1500, 1502, 1518, 1520, 1522, 1524, 1526,1528, 1544, 1546, 1548, 1550, 1552, 1554, 1556, 1558, 1560,1562, 1564, 1566, 1586, 1588, 1602, 1616, 1630, 1647, 1649 ou1663; e(b) uma seqüência de aminoácido codificada por umaseqüência de ácido nucléico tal como indicado em qualquer umadas ID SEQ No. : 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308,310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332,334, 336, 338, 340, 342, 344, 346 ou 348, 394 , 396, 398, 412,414, 416, 430, 432, 434, 448, 450, 452, 466, 468, 470, 484,486, 488, 502, 504, 506, 520, 522, 524, 1337, 1339, 1341, 539,541, 543, 557, 571, 573, 575, 589, 591, 593, 627, 629, 631,644, 646, 648, 662, 664, 666, 680, 694, 708, 722, 736, 750,764, 778, 792, 806, 820, 834, 848, 862, 864, 878, 880, 882, 896, 898, 900, 914, 916, 918, 932, 934, 936, 950, 952, 954, 968, 970, 972, 986, 988, 990, 1004, 1018, 1032, 1046, 1060, 1074, 1088, 1102, 1126,1139, 1153, 1167, 1181, 1195, 1209, 1223, 1237, 1251, 1265, 1279, 1293, 1307, 1321, 1335, 1355, 1357, 1359, 1373, 1387, 1401, 1415, 1429, 1443, 1457, 1471, 1485, 1501, 1503, 1519, 1521, 1523, 1525, 1527, 1529, 1545, 1547, 1549, 1551, 1553, 1555, 1557, 1559, 1561, 1563, 1565, 1567, 1587, 1589, 1603, 1617, 1631, 1648, 1650 ou 1664.

[0093] Em uma realização preferida da invenção, os anticorpos de cadeia simples biespecífica são específicos de espécie cruzada para CD3 épsilon e para o antígeno de superfície de célula reconhecido por seu segundo domínio de ligação. Em uma realização mais preferida, estes anticorpos de cadeia simples biespecífica são específicos de espécie cruzada para CD3 épsilon de seres humanos e de primatas não-chimpanzés e para MCSP, EGFR, EGFRvIII, anidrase carbônica IX, CD30, CD33, IgE, CD44v6, Muc-1, HBV e HCV de seres humanos e de primatas não-chimpanzés. Em uma realização alternativa, a presente invenção apresenta uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo acima descrito da invenção.

[0094] A presente invenção também se refere a um vetor que compreende a molécula de ácido nucléico da presente invenção.

[0095] Muitos vetores apropriados são conhecidos pelos elementos versados em biologia molecular, a escolha dos quais depende da função desejada e inclui plasmídeos, cosmídeos, vírus, bacteriófagos e outros vetores utilizados convencionalmente em engenharia genética. Os métodos que são bem conhecidos aos elementos versados na técnica podem ser utilizados para construir vários plasmídeos e vetores; vide, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al. (loc cit.) e Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Alternativamente, os polinucleotídeos e os vetores da invenção podem ser reconstituídos em lipossomos para a aplicação nas células alvo. Conforme discutido em mais detalhes abaixo, um vetor de clonagem foi utilizado para isolar seqüências de DNA individuais. As seqüências relevantes podem ser transferidas nos vetores de expressão onde a expressão de um polipeptídeo particular é requerida. Os vetores de clonagem típicos incluem pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 e os vetores de expressão típicos de pGBT9 incluem pTRE, pCAL-n-EK, pESP- 1, pOP13CAT.

[0096] Preferivelmente, o dito vetor compreendeuma seqüência de ácido nucléico que é uma seqüência reguladora ligada de maneira operável à dita seqüência de ácido nucléico definida na presente invenção. O termo "seqüência reguladora" refere-se às seqüências de DNA que são necessárias para efetuar a expressão das seqüências de codificação a que são ligadas. A natureza de tais seqüências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro. Nos procariontes, as seqüências de controle incluem geralmente o promotor, o sítio de ligação ribossômico e os terminais. Nos eucariontes as seqüências de controle geralmente incluem promotores, terminais e, em alguns casos, intensificadores, transativadores ou fatores de transcrição. O termo "seqüência de controle" se presta a incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é necessária para a expressão e também pode incluir componentes vantajosos adicionais.

[0097] O termo "ligado de maneira operável" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que permite que os mesmos funcionem em sua maneira pretendida. Uma seqüência de controle "ligada de maneira operável" a uma seqüência de codificação é ligada de uma maneira tal que a expressão da seqüência de codificação é obtida sob condições compatíveis com as seqüências de controle. Caso a seqüência de controle seja um promotor, fica óbvio ao elemento versado na técnica que o ácido nucléico de cordão duplo é preferivelmente utilizado.

[0098] Desse modo, o vetor citado é preferivelmente um vetor de expressão. Um "vetor de expressão" é um construto que pode ser utilizado para transformar um hospedeiro selecionado e apresenta a expressão de uma seqüência de codificação no hospedeiro selecionado. Os vetores de expressão podem ser, por exemplo, vetores de clonagem, vetores binários ou vetores integrantes. A expressão compreende a transcrição da molécula de ácido nucléico preferivelmente em um mRNA traduzível. Os elementos reguladores que asseguram a expressão em células procarióticas e/ou eucarióticas são bem conhecidos pelos elementos versados na técnica. No caso de células eucarióticas, compreendem normalmente promotores que asseguram a iniciação da transcrição e opcionalmente os sinais de poli-A assegurando a terminação da transcrição e a estabilização do transcrito. Os elementos reguladores possíveis que permitem a expressão em células procarióticas hospedeiras compreendem, por exemplo, o promotor de PL, lac, trp ou tac em E. coli, e os exemplos de elementos reguladores que permitem a expressão em células eucarióticas hospedeiras são o promotor de AOX1 ou GAL1 em leveduras ou o promotor de CMV-, SV40-, RSV- (vírus do sarcoma de Rous), intensificador de CMV-, intensificador de SV40- ou um íntron de globina em células de mamíferos e de outros animais.

[0099] Além dos elementos que são responsáveispela iniciação da transcrição, tais elementos reguladores também podem compreender sinais de terminação da transcrição, tais como o sítio de SV40-poli-A ou o sítio tk-poli-A, a jusante do polinucleotídeo.

[00100] Além disso, dependendo do sistema de expressão utilizado, as seqüências líderes capazes de dirigir o polipeptídeo a um compartimento celular ou de secretar o mesmo no meio podem ser adicionadas à seqüência de codificação da seqüência de ácido nucléico citada e são bem conhecidas noestado da técnica; vide também os exemplos em anexo. A(s) seqüência(s) líder(es) é(são) montadas na fase apropriada comseqüências de tradução, de iniciação e de terminação e preferivelmente, uma seqüência líder que pode dirigir a secreção da proteína traduzida ou uma porção da mesma, no espaço periplásmico ou no meio extracelular. Opcionalmente, a seqüência heteróloga pode codificar uma proteína de fusão queinclui um peptídeo de identificação de N-terminal que confereas características desejadas, por exemplo, estabilização ou purificação simplificada do produto recombinante expresso; vide acima. Neste contexto, os vetores de expressão apropriados são conhecidos no estado da técnica como o vetor de expressão de cDNA de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-DHFR, pEF-ADA ou pEF-neo (Mack et al. PNAS (1995) 92, 7021-7025 e Raum et al. CancerImmunol Immunother (2001) 50(3), 141-150) ou pSPORTI (GIBCOBRL).

[00101] Preferivelmente, as seqüências de controle da expressão serão sistemas eucarióticos do promotor nos vetores capazes de transformar as células eucarióticas hospedeiras transfectadas, mas as seqüências de controle para hospedeiros procarióticos também podem ser utilizadas. Uma vez que o vetor tenha sido incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições apropriadas para a expressão de nível elevado das seqüências de nucleotídeo e como desejado, a coleta e a purificação do polipeptídeo da invenção podem ocorrer; vide, por exemplo, os exemplos em anexo.

[00102] Um sistema de expressão alternativo, que pode ser utilizado para expressar uma proteína de interação do ciclo da célula é um sistema de inseto. Em tal sistema, o vírus nuclear da poliidrose nuclear de Autographs californica (AcNPV) é utilizado como um vetor para expressar genes estranhos em células de Spodoptera frugiperda ou em larvas de Trichoplusia. A seqüência de codificação da molécula de ácido nucléico citada pode ser clonada em uma região não-essencial do vírus, tal como o gene de poliedrina e ser colocada sob o controle do promotor de poliedrina. A inserção bem sucedida da dita seqüência de codificação resultará no gene de poliedrina inativo e produzirá o vírus recombinante que não tem o revestimento da proteína de revestimento. Os vírus recombinantes são então utilizados para infectar as células de S. frugiperda ou as larvas de Trichoplusia em que a proteína da invenção é expressa (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227).

[00103] Os elementos reguladores adicionais podem incluir os intensificadores transcricionais bem como os intensificadores translacionais. Vantajosamente, os vetores da invenção descritos acima compreendem um marcador selecionável e/ou pontuável.

[00104] Os genes do marcador selecionáveis úteis para a seleção de células transformadas e, por exemplo, de tecido de planta e de plantas são bem conhecidos pelos elementos versados na técnica e compreendem, por exemplo, a resistência ao antimetabólito como a base da seleção para DHFR, que confere resistência ao metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.)13 (1994), 143-149); npt, que confereresistência aos aminoglicosídeos neomicina, canamicina e paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) ehigro, que confere resistência à higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Os genes selecionáveis adicionais foramdescritos, ou seja, trpB, que permite que as células utilizem o indol no lugar do triptrofano; hisD, que permite que as células utilizem o histinol no lugar da histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); a isomerase demanose-6-fosfato que permite que as células utilizem a manose (Pedido de Patente WO 94/20627) e a ODC (descarboxilase de ornitina) que confere resistência ao inibidor dadescarboxilase de ornitina, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, em: Current Communications inMolecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Ed.) ou desaminase de Aspergillus terreus que confere resistência a Blasticidin S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995),2336-2338).

[00105] Os marcadores pontuáveis úteis também são conhecidos pelos elementos versados na técnica e estão comercialmente disponíveis. Vantajosamente, o dito marcador é uma luciferase de codificação de gene (Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), proteínaverde fluorescente (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) ouβ- glucuronidase (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907).Esta realização é particularmente útil para uma seleção simples e rápida das células, dos tecidos e dos organismos que contêm o vetor citado.

[00106] Tal como descrito acima, a molécula de ácido nucléico citada pode ser utilizada sozinha ou como parte de um vetor para expressar o polipeptídeo da invenção nas células, por exemplo, para purificação, mas também para finalidades de terapia de genes. As moléculas ou os vetores de ácido nucléico que contêm a(s) seqüência(s) de DNA que codifica(m) qualquer um dos polipeptídeos da invenção descritos acima são introduzidos nas células que produzem, por sua vez, o polipeptídeo de interesse. A terapia de genes, quetem base na introdução de genes terapêuticos às células pormeio de técnicas ex vivo ou in vivo, é uma das aplicações maisimportantes da transferência de genes. Os vetores, métodos ousistemas de aplicação de genes apropriados para a terapia degenes in vitro ou in vivo são descritos na literatura e conhecidos pelos elementos versados na técnica; vide, por exemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper,Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992),808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348(1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086;Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998),692-699; Nabel, Ann. N. Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292;Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, NatureMedicine 2 (1996), 714-716; Pedidos de Patente WO 94/29469; WO97/00957, US 5.580.859; US 5.589.466; ou Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. As moléculas de ácido nucléico e os vetores citados podem ser projetados para a introdução direta ou para a introdução através de lipossomos ou vetores virais (por exemplo, adenovirais, retrovirais) na célula. Preferivelmente, a dita célula é uma célula da linhagem de embrião, célula embrionária ou óvulo ou derivado deste, com a máxima preferência, a dita célula é uma célula tronco. Um exemplo para uma célula tronco embrionária pode ser, inter alia, uma célula tronco tal como descrito em Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428.

[00107] A invenção também apresenta um hospedeiro transformado ou transfectado com um vetor da invenção. O dito hospedeiro pode ser produzido ao introduzir o vetor da invenção descrito acima ou a molécula de ácido nucléico da invenção descrita acima no hospedeiro. A presença de pelo menos um vetor ou de pelo menos uma molécula de ácido nucléico no hospedeiro pode mediar a expressão de um gene que codifica os construtos de anticorpo de cadeia simples descritos acima.

[00108] A molécula de ácido nucléico ou o vetor descrito da invenção, que é introduzido no hospedeiro, pode se integrar ao genoma do hospedeiro ou pode ser mantido extracromossomicamente.

[00109] O hospedeiro pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica.

[00110] O termo "procariótico" se presta a incluir todas as bactérias, que podem ser transformadas ou transfectadas com as moléculas de DNA ou de RNA para a expressão de uma proteína da invenção. Os hospedeiros procarióticos podem incluir tanto bactérias gram negativas quanto bactérias gram positivas tais como, por exemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens e Bacillus subtilis. O termo "eucariótico" se presta a incluir células de leveduras, plantas superiores, insetos e preferivelmente de mamíferos. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, a proteína codificada pelopolinucleotídeo da presente invenção pode ser glicosilada ou pode ser não-glicosilada. É especialmente preferível o uso de um plasmídeo ou de um vírus que contém a seqüência de codificação do polipeptídeo da invenção e é fundido geneticamente a um Flag-tag de N-terminal e/ou His-Tag de C- terminal. Preferivelmente, o comprimento do dito Flag-tag é de aproximadamente quatro a oito aminoácidos, e com a máxima preferência oito aminoácidos. Um polinucleotídeo acima descrito pode ser utilizado para transformar ou transfectar o hospedeiro ao utilizar algumas das técnicas conhecidas geralmente pelos elementos versados na técnica. Além disso, os métodos para a preparação de genes fundidos, ligados de maneira operável e a expressão destes, por exemplo, células de mamíferos e bactérias são bem conhecidos no estado da técnica (Sambrook, loc. cit.).

[00111] Preferivelmente, o dito hospedeiro é uma bactéria ou uma célula de inseto, de fungo, de planta ou de animal.

[00112] Está particularmente previsto que o hospedeiro citado pode ser uma célula de mamífero. As células hospedeiras particularmente preferidas compreendem as células de CHO, células de COS, linhagens de célula de mieloma comoSP2/0 ou NS/O. Conforme ilustrado nos Exemplos em anexo, ascélulas CHO são particularmente preferidas como hospedeiras.

[00113] Com mais preferência, a dita célula hospedeira é uma célula humana ou de uma linhagem de célula humana, por exemplo, per.cθ (Kroos, Biotechnol. Prog., 2003, 19: 163-168).

[00114] Em uma realização adicional, a presente invenção refere-se desse modo a um processo para a produção de um polipeptídeo da invenção, em que o dito processo compreende a cultura de um hospedeiro da invenção sob condições que permitam a expressão do polipeptídeo da invenção e a recuperação do polipeptídeo produzido da cultura.

[00115] Os hospedeiros transformados podem crescer em fermentadores e ser cultivados de acordo com as técnicas conhecidas no estado da técnica para atingir o crescimento mais favorável da célula. O polipeptídeo da invenção pode ser então isolado do meio de crescimento, dos planados celulares ou das frações da membrana celular. O isolamento e a purificação, por exemplo, dos polipeptídeos microbianamente expressos da invenção podem ser executados por meio de quaisquer dispositivos convencionais tais como, por exemplo, separações cromatográficas preparativas e separações imunológicas tais como aquelas que envolvem o uso dos anticorpos monoclonais ou policlonais dirigidos, por exemplo, contra um Tag do polipeptídeo da invenção, ou tal como descrito nos Exemplos em anexo.

[00116] As condições para a cultura de um hospedeiro que permitem a expressão são conhecidas no estado da técnica e dependem do sistema de hospedeiro e do sistema/vetor de expressão utilizado em tal processo. Os parâmetros a serem modificados a fim de atingir condições que permitam a expressão de um polipeptídeo recombinante são conhecidos no estado da técnica. Desse modo, as condições apropriadas podem ser determinadas pelo elemento versado na técnica na ausência de uma indicação adicional da presente invenção.

[00117] Uma vez expresso, o polipeptídeo da invenção pode ser purificado de acordo com procedimentos padrão da técnica, incluindo a precipitação de sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia de coluna, em gel e outros ainda; vide Scopes, “Protein Purification”, Springer-Verlag, N. Y. (1982). Os polipeptídeos substancialmente puros com pelo menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidade são preferidos e 98 a 99% ou mais de homogeneidade são preferidos, para usos farmacêuticos. Uma vez purificados, parcialmente ou à homogeneidade desejada, o polipeptídeo da invenção pode ser então utilizado terapeuticamente (incluindo extracorporalmente) ou no desenvolvimento e execução de procedimentos de ensaio. Além disso, os exemplos de métodos para a recuperação do polipeptídeo da invenção de uma cultura são descritos em detalhe nos exemplos em anexo.

[00118] Além disso, a invenção apresenta uma composição que compreende um polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo como produzido pelo processo descrito acima. Preferivelmente, a dita composição é uma composição farmacêutica.

[00119] De acordo com a invenção, o termo "composição farmacêutica" refere-se a uma composição para a administração a um paciente, preferivelmente a um paciente humano. A composição farmacêutica preferida particular da presente invenção compreende as moléculas de ligação dirigidas contra e geradas contra os epítopos de CD3 independentes do contexto. Preferivelmente, a composição farmacêutica compreende formulações apropriadas de veículos, estabilizantes e/ou excipientes. Em uma realização preferida, a composição farmacêutica compreende uma composição para a administração parenteral, transdermal, intraluminal, intraarterial, intratecal e/ou intranasal ou pela injeção direta no tecido. Em particular, está previsto que a dita composição é administrada a um paciente através de infusão ou injeção. A administração das composições apropriadas pode ser efetuada por vias diferentes, por exemplo, por meio de administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, tópica ou intradermal. Em particular, a presente invenção apresenta uma administração ininterrupta da composição apropriada. Como um exemplo não limitador, a administração ininterrupta, isto é, contínua, pode ser executada por um pequeno sistema de bomba utilizado pelo paciente para medir o influxo do agente terapêutico no corpo do paciente. A composição farmacêutica que compreende as moléculas de ligação dirigidas contra e geradas contra os epítopos CD3 independentes do contexto da invenção pode ser administrada ao utilizar os ditos sistemas de bomba. Tais sistemas de bomba são conhecidos geralmente no estado da técnica e geralmente contam com a troca periódica de cartuchos que contêm o agente terapêutico a ser infundido. Ao trocar o cartucho em tal sistema de bomba, uma interrupção provisória do fluxo de outra maneira ininterrupto do agente terapêutico no corpo do paciente pode ocorrer. Em tal caso, a fase de administração antes da substituição do cartucho e a fase de administração após a substituição do cartucho ainda seriam consideradas dentro do significado do dispositivo farmacêutico e os métodos da invenção constituem uma "administração ininterrupta" de tal agente terapêutico.

[00120] A administração contínua ou ininterrupta destas moléculas de ligação dirigidas contra e geradas contra os epítopos CD3 independentes do contexto da presente invenção pode ser intravenosa ou subcutânea, feita por um dispositivo de aplicação de fluido ou um pequeno sistema de bomba que inclui um mecanismo de direcionamento de fluido para direcionar o fluido para fora de um reservatório e um mecanismo de acionamento para acionar o mecanismo de direcionamento. Os sistemas de bomba para a administração subcutânea podem incluir uma agulha ou uma cânula para penetrar a pele de um paciente e aplicar a composição apropriada no corpo do paciente. Os ditos sistemas de bomba podem ser diretamente fixados ou unidos à pele do paciente independentemente de uma veia, de uma artéria ou de um vaso sangüíneo, permitindo desse modo um contato direto entre o sistema de bomba e a pele do paciente. O sistema de bomba pode ser unido à pele do paciente por 24 horas até diversos dias. O sistema de bomba pode ser de um tamanho pequeno com um reservatório para volumes pequenos. Como um exemplo não limitador, o volume do reservatório para que a composição farmacêutica apropriada seja administrada pode estar entre 0,1 e 50 ml.

[00121] A administração contínua pode ser transdermal por meio de um emplastro usado na pele e substituído a intervalos. Um elemento versado na técnica está ciente dos sistemas de emplastro para a aplicação da droga apropriada para esta finalidade. É importante que essa administração transdermal seja especialmente tratável pela administração ininterrupta, tal como a troca de um primeiro emplastro acabado pode ser vantajosamente realizada simultaneamente com a colocação de um segundo emplastro novo, por exemplo, na superfície da pele imediatamente adjacente ao primeiro emplastro acabado e imediatamente antes da remoção do primeiro emplastro acabado. Não surgem problemas com a interrupção do fluxo ou falha na célula de energia.

[00122] A composição da presente invenção, que compreende em particular as moléculas de ligação dirigidas contra e geradas contra os epítopos CD3 independentes do contexto pode compreender adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável. Os exemplos de veículos farmacêuticos apropriados são bem conhecidos no estado da técnica e incluem soluções, por exemplo, as soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões, tais como emulsões deóleo/água, vários tipos de agentes de umidificação, soluções estéreis, lipossomos, etc. As composições que compreendem taisveículos podem ser formuladas pelos métodos convencionais bem conhecidos. As formulações podem compreender carboidratos, soluções de tampão, aminoácidos e/ou tensoativos. Os carboidratos podem ser açúcares não-redutores, preferivelmente trealose, sacarose, octassulfato, sorbitol ou xilitol. Tais formulações podem ser utilizadas para as administrações sólidas que podem ser intravenosas ou subcutâneas com e/ou sem sistemas de bomba. Os aminoácidos podem ser aminoácidos contémdos, preferivelmente lisina, acetato de lisina, arginina, glutamato e/ou histidina. Os tensoativos podem ser detergentes, preferivelmente com um peso molecular > de 1,2 KD e/ou um poliéter, preferivelmente com um peso molecular > de3 KD. Os exemplos não limitadores para detergentes preferidossão Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 ou Tween 85. Os exemplos não limitadores para poliéteres preferidos são PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 ou PEG 5000. Os sistemas de tampão utilizados na presente invenção podem ter um pH preferido de 5-9 e podem compreender citrato, succinato, fosfato, histidina e acetato. As composições da presente invenção podem ser administradas ao indivíduo em uma dose apropriada que pode ser determinada, por exemplo, por meio de estudos de escalação de dose pela administração de doses crescentes do polipeptídeo da invenção que exibe especificidade de espécies cruzadas descrita na presente invenção aos primatas não-chimpanzés, por exemplo, os símios. Conforme indicado acima, o polipeptídeo da invenção que exibe a especificidade de espécies cruzadas descrita na presente invenção pode ser vantajosamente utilizado na forma idêntica em testes pré-clínicos em primatas não-chimpanzés e como droga em seres humanos. Estas composições também podem ser administradas em combinação com outras drogas proteináceas e não-proteináceas. Estas drogas podem ser administradas simultaneamente com a composição que compreende o polipeptídeo da invenção tal como definido na presente invenção ou separadamente antes ou depois da administração do dito polipeptídeo a intervalos e em doses oportunos definidos. O regime de dosagem será determinado pelo médico de plantão e pelos fatores clínicos. Como é bem conhecido na técnica médica, dosagens para qualquer paciente dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, a área de superfície do corpo, a idade, o composto particular a ser administrado, o sexo, o tempo e a via de administração, a saúde geral e as outras drogas que estão sendo administradas simultaneamente. Os preparados para a administração parenteral incluem soluções estéreis, suspensões e emulsões aquosas ou não-aquosas. Os exemplos de solventes não-aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tais como o azeite de oliva e ésteres orgânicos injetáveis tais como o oleato de etila. Os veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo meios salinos e tamponados. Os veículos parenterais incluem a solução de cloreto de sódio, Ringer dextrose, dextrose e cloreto de sódio, Ringer lactado ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos (tais como aqueles à base de Ringer dextrose) e outros ainda. Os conservantes e outros aditivos também podem estar presentes como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e outros ainda. Além disso, a composição da presente invenção pode compreender veículos proteináceos, tais como, por exemplo, albumina de soro ou imunoglobulina, preferivelmente de origem humana. Está previsto que a composição da invenção pode compreender, além do polipeptídeo da invenção aqui definido, agentes biologicamente ativos, dependendo do uso pretendido da composição. Tais agentes podem ser drogas que agem no sistema gastrointestinal, drogas que agem como citostáticos, drogas que impedem a hiperuricemia, drogas que inibem reações imunes (por exemplo, corticosteróides), drogas que modulam a resposta inflamatória, drogas que agem no sistema circulatório e/ou agentes tais como as citoquinas conhecidas no estado da técnica.

[00123] A atividade biológica da composição farmacêutica definida na presente invenção pode ser determinada, por exemplo, por meio de ensaios de citotoxicidade, tal como descrito nos Exemplos seguintes, no Pedido de Patente WO 99/54440 ou por Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12). A "eficácia" ou a "eficácia in vivo", tal como utilizado na presente invenção, refere-se à resposta à terapia pela composição farmacêutica da invenção, ao utilizar, por exemplo, critérios padronizados deresposta de NCI. O sucesso ou a eficácia in vivo da terapia que utiliza uma composição farmacêutica da invenção refere-seà eficácia da composição para sua finalidade pretendida, isto é, a capacidade da composição causar seu efeito desejado, isto é, esgotamento das células patológicas, por exemplo, células de tumor. A eficácia in vivo pode ser monitorada pelos métodos padrão estabelecidos para as entidades de doença respectivas incluindo, mas sem ficar a elas limitados, as contagens das células brancas do sangue diferenciais, a Classificação Celular Ativada por Fluorescência, a aspiração de medula óssea. Além disso, os parâmetros específicos da química clínica específicos de várias doenças e outros métodos padrão estabelecidos podem ser utilizados. Além disso, a tomografia assistida por computador, o raio X, a tomografia por ressonância magnética nuclear (por exemplo, para a avaliação de resposta à base de critérios do National Cancer Institute [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Relatórios de um workshop internacional para padronizar os critérios de resposta para linfomas não-Hodgkin. NCI SponsoredInternational Working Group. J. Clin. Oncol. 1999; abril 17(4): 1244]), varredura de tomografia de emissão de pósitrons, contagem das células brancas do sangue, diferenciais, Classificação Celular Ativada por Fluorescência, aspiração de medula óssea, biópsias/histologias de nós linfáticos e parâmetros específicos da química clínica de vários linfomas (por exemplo, desidrogenase de lactato) e outros métodos padrão estabelecidos podem ser utilizados.

[00124] Outro grnade desafio no desenvolvimento de drogas tais como a composição farmacêutica da invenção é a modulação previsível das propriedades farmacocinéticas. Para esta finalidade, é estabelecido um perfil farmacocinético da droga candidata, isto é, um perfil dos parâmetros farmacocinéticos que afetam a capacidade de uma droga particular tratar uma dada condição. Os parâmetros farmacocinéticos da droga que influenciam a capacidade de uma droga tratar uma determinada entidade de doença incluem, mas não se limitam a: vida média, volume de distribuição, metabolismo de primeira passagem hepática e grau de ligação do soro no sangue. A eficácia de um dado agente de droga pode ser influenciada por cada um dos parâmetros mencionados acima.

[00125] A "vida média" significa o tempo em que 50% de uma droga administrada é eliminada através de processos biológicos, por exemplo, metabolismo, excreção, etc.

[00126] "Metabolismo de primeira passagem hepática" significa a propensão de uma droga ser metabolizada quando do primeiro contato com o fígado, isto é, durante a sua primeira passagem no fígado. O "volume de distribuição" significa o grau de retenção de uma droga através dos vários compartimentos do corpo, tais como, por exemplo, espaços intracelulares e extracelulares, tecidos e órgãos, etc., e a distribuição da droga dentro destes compartimentos. O "grau de ligação do soro no sangue" significa a propensão de uma droga interagir com e se ligar às proteínas do soro no sangue, tal como a albumina, conduzindo a uma redução ou a uma perda da atividade biológica da droga.

[00127] Os parâmetros farmacocinéticos também incluem a biodisponibilidade, o tempo de retardo (Tlag), Tmax, taxas de absorção, mais o início e/ou Cmax para uma determinada quantidade de droga administrada.

[00128] "Biodisponibilidade" significa a quantidade de uma droga no compartimento do sangue.

[00129] "Tempo de retardo" significa o retardo de tempo entre a administração da droga e a sua detecção e mensurabilidade no sangue ou no plasma.

[00130] "Tmax" é o tempo depois do qual a concentração máxima da droga no sangue é alcançada e "Cmax" é a concentração máxima no sangue obtida com uma determinada droga. O tempo para atingir uma concentração da droga no sangue ou no tecido que é requerido para o seu efeito biológico é influenciado por todos os parâmetros. Os parâmetros farmacocinéticos dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos, uma realização preferida do polipeptídeo da invenção, que exibem especificidade de espécies cruzadas, os quais podem ser determinados em testes pré-clínicos com animais em primatas não-chimpanzés como esboçado acima também são indicados, por exemplo, na publicação por Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1 - 12).

[00131] O termo "toxicidade", tal como utilizado na presente invenção, refere-se aos efeitos tóxicos de uma droga manifestada em eventos adversos ou em eventos adversos graves. Estes eventos colaterais podem se referir a uma falta de tolerabilidade à droga em geral e/ou a uma falta de tolerância local após a administração. A toxicidade também pode incluir os efeitos teratogênicos ou carcinogênicos causados pela droga.

[00132] O termo "segurança", "segurança in vivo" ou "tolerabilidade", tal como utilizado na presente invenção, define a administração de uma droga sem induzir eventos adversos graves diretamente após a administração (tolerância local) e durante um período mais longo da aplicação da droga. A "segurança", a "segurança in vivo" ou a "tolerabilidade" pode ser avaliada, por exemplo, a intervalos regulares durante o período de tratamento e de acompanhamento. As medições incluem a avaliação clínica, por exemplo, manifestações de órgãos, e a seleção de anomalias de laboratório. A avaliação clínica pode ser realizada e está direcionada às descobertas normais registradas/codificadas de acordo com NCI-CTC e/ou os padrões MedDRA. As manifestações de órgãos podem incluir critérios tais como alergia/imunologia, sangue/medula óssea, arritmia cardíaca, coagulação e outros ainda, tal como indicado, por exemplo, pelos Critérios de Terminologia Comuns para Eventos Adversos v3.0 (CTCAE). Os parâmetros de laboratório que podem ser testados incluem, por exemplo, hematologia, química clínica, perfil de coagulação e análise da urina e o exame de outros fluidos corpóreos tais como soro, plasma, fluido linfóide ou espinal, liquor e outros ainda. Desse modo, a segurança pode ser avaliada, por exemplo, pelo exame físico, técnicas de geração de imagens (isto é, ultrassom, raio X, varreduras por TC, geração de imagens por ressonância magnética (MRI), outras medidas com dispositivos técnicos (isto é, eletrocardiograma), sinais vitais, ao medir os parâmetros de laboratório e registrar os eventos adversos. Por exemplo, os eventos adversos em primatas não-chimpanzés nos usos e métodos de acordo com a invenção podem ser examinados por meio de métodos histopatológicos e/ou histoquímicos.

[00133] O termo "dose eficaz e não-tóxica", tal como utilizado na presente invenção, refere-se a uma dose tolerável do anticorpo de cadeia simples biespecífico tal como definido na presente invenção que é suficientemente elevada para causar o esgotamento das células patológicas, a eliminação do tumor, a diminuição do tumor ou a estabilização da doença sem ou essencialmente sem efeitos tóxicos importantes. Tais doses eficazes e não-tóxicas podem ser determinadas, por exemplo, pelos estudos de escalação de dose descritos no estado da técnica e devem estar abaixo da dose que induz eventos colaterais adversos graves (toxicidade de limitação de dose, DLT).

[00134] Os termos acima também são relatados, por exemplo, em Preclinical safety evaluation of biotechnology- derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; reunião do ICH Steering Committee de 16 de julho de 1997.

[00135] Além disso, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo da presente invenção (isto é, um polipeptídeo que compreende pelo menos um domínio de ligação que pode se ligar a um epítopo da cadeia de CD3 epsilon de seres humanos e de primatas não- chimpanzés, em que o epítopo é parte de uma seqüência de aminoácido compreendida no grupo que consiste nas SEQ ID NO. 2, 4, 6 ou 8 de acordo com a presente invenção ou produzido de acordo com o processo de acordo com a invenção) para a prevenção, o tratamento ou a melhoria de uma doença selecionada dentre uma doença proliferativa, uma doença tumorosa ou um distúrbio imunológico. Preferivelmente, a dita composição farmacêutica compreende adicionalmente formulações apropriadas de veículos, estabilizantes e/ou excipientes.

[00136] Um aspecto adicional da invenção refere- se ao uso de um polipeptídeo tal como definido na presente invenção acima ou produzido de acordo com um processo definido na presente invenção acima, para a preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção, o tratamento ou a melhoria de uma doença. Preferivelmente, a dita doença é uma doença proliferativa, uma doença tumorosa ou um distúrbio imunológico. Também é preferível que a dita doença tumorosa seja uma doença maligna, preferivelmente câncer.

[00137] Em outra realização preferida do uso do polipeptídeo da invenção, a dita composição farmacêutica é apropriada para ser administrada em combinação com uma droga adicional, isto é, tal como parte de uma coterapia. Na dita coterapia, um agente ativo pode ser opcionalmente incluído na mesma composição farmacêutica que o polipeptídeo da invenção ou pode ser incluído em uma composição farmacêutica separada. Neste último caso, a dita composição farmacêutica separada é apropriada para a administração antes, simultaneamente com ou após a administração da dita composição farmacêutica que compreende o polipeptídeo da invenção. A droga adicional ou a composição farmacêutica podem ser um composto não-proteináceo ou um composto proteináceo. No caso em que a droga adicional é um composto proteináceo, é vantajoso que o composto proteináceo seja que pode prover um sinal de ativação para as células efetoras imunes.

[00138] Preferivelmente, o dito composto não- proteináceo ou o dito composto proteináceo pode ser administrado simultaneamente ou não-simultaneamente com o polipeptídeo da invenção, com uma molécula de ácido nucléico tal como definido acima, com um vetor tal como definido acima ou com um hospedeiro tal como definido acima.

[00139] Outro aspecto da invenção refere-se a um método para a prevenção, o tratamento ou a melhoria de uma doença em um indivíduo com necessidade do mesmo, sendo que o dito método compreende a etapa de administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica da invenção. Preferivelmente, a dita doença é uma doença proliferativa, uma doença tumorosa ou um distúrbio imunológico. Ainda com mais preferência, a dita doença tumorosa é uma doença maligna, preferivelmente câncer.

[00140] Em outra realização preferida do método da invenção, a dita composição farmacêutica é apropriada para ser administrada em combinação com uma droga adicional, isto é, tal como parte de uma coterapia. Na dita coterapia, um agente ativo pode ser opcionalmente incluído na mesma composição farmacêutica que o polipeptídeo da invenção, ou pode ser incluído em uma composição farmacêutica separada. Neste último caso, a dita composição farmacêutica separada é apropriada para a administração antes, simultaneamente com ou após a administração da dita composição farmacêutica que compreende o polipeptídeo da invenção. A droga adicional ou a composição farmacêutica pode ser um composto não-proteináceo ou um composto proteináceo. No caso em que a droga adicional é um composto proteináceo, é vantajoso que o composto proteináceo possa prover um sinal de ativação para as células efetoras imunes.

[00141] Preferivelmente, o dito composto não- proteináceo ou o dito composto proteináceo pode ser administrado simultaneamente ou não-simultaneamente com o polipeptídeo da invenção, com uma molécula de ácido nucléico tal como definido acima, com um vetor tal como definido acima ou com um hospedeiro tal como definido acima.

[00142] É preferível para o método acima descrito da invenção que o dito indivíduo seja um ser humano.

[00143] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um kit que compreende um polipeptídeo da invenção, uma molécula de ácido nucléico da invenção, um vetor da invenção ou um hospedeiro da invenção.

[00144] A presente invenção é caracterizada adicionalmente pela seguinte lista de itens:

[00145] Item 1. Um método para a identificação (a) do polipeptídeo que compreende um domínio de ligação específico de espécies cruzadas que pode se ligar a um epítopo de CD3 epsilon (CD3ε) de seres humanos e de primatas não-chimpanzés, sendo que o método compreende as etapas de:(a) contato do polipeptídeo com um fragmento de N- terminal do domínio extracelular de CD3ε dos 27 aminoácidos máximos que compreendem a seqüência de aminoácido Gln-Asp-Gly- Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO. 381) ou Gln-Asp-Gly-Asn-Glu- Glu-Ile-Gly (SEQ ID NO. 382), fixada através de seu C-término a uma fase sólida;(b) eluição do polipeptídeo ligado do dito fragmento; e(c) isolamento do polipeptídeo do eluato de (b).

[00146] É preferível que o polipeptídeo identificado pelo método acima da invenção seja de origem humana.

[00147] O presente "método para a identificação (a) do polipeptídeo" é compreendido como um método para o isolamento de um ou mais polipeptídeos diferentes com a mesma especificidade para o fragmento do domínio extracelular de CD3ε que compreende em seu N-término a seqüência de aminoácido Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO. 381) ou Gln-Asp- Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly (SEQ ID NO. 382) de uma pluralidade de polipeptídeos candidatos bem como um método para a purificação de um polipeptídeo de uma solução. As realizações não limitadoras de um método de isolamento de um ou mais polipeptídeos diferentes com a mesma especificidade para o fragmento do domínio extracelular de CD3ε compreendem métodos para a seleção de entidades de ligação específicas do antígeno, por exemplo, métodos de bateia, tal como utilizado geralmente para a seleção de hibridoma, seleção de clones transientemente/estavelmente transfectados de células hospedeiras eucarióticas ou em métodos de exposição de fago. Um exemplo não limitador para este último método para a purificação de um polipeptídeo de uma solução é, por exemplo, a purificação de um polipeptídeo recombinantemente expresso de um sobrenadante da cultura ou de um preparado de tal cultura.

[00148] Conforme indicado acima, o fragmento utilizado no método da invenção é um fragmento de N-terminal do domínio extracelular da molécula de primata CD3ε. A seqüência de aminoácido do domínio extracelular da molécula de CD3ε de primatas diferentes é descrita nas SEQ ID NO. : 1, 3, 5 e 7. As duas formas de octâmero de N-terminal são descritas nas SEQ ID NO. : 381 e 382. É preferível que este N-término esteja livremente disponível para a ligação dos polipeptídeos a ser identificados pelo método da invenção. O termo "livremente disponível" é compreendido no contexto da invenção como livre de motivos adicionais tais como His-tag. A interferência de tal His-tag com uma molécula de ligação identificada pelo método da invenção é descrita no Exemplo 6 em anexo.

[00149] De acordo com o método da invenção, o dito fragmento é fixado através de seu C-término a uma fase sólida. O elemento versado na técnica irá eleger facilmente e sem nenhum problema um suporte de fase sólida adequado dependendo da realização utilizada do método da invenção. Os exemplos para um suporte sólido compreendem, mas sem ficar a eles limitados, grânulos similares a matrizes (por exemplo, grânulos de agarose, grânulos de sefarose, grânulos de poliestirol, grânulos de dextrano), placas (placas de cultura ou placas MultiWell) bem como as microplaquetas conhecidas, por exemplo, Biacore®. A seleção dos meios e dos métodos para a fixação/imobilização do fragmento ao dito suporte sólido depende da eleição do suporte sólido. Um método geralmente utilizado para a fixação/imobilização é um acoplamento através de um éster de N-hidroxisuccinamida (NHS). A química subjacente a este acoplamento bem como métodos alternativos para a fixação/imobilização são conhecidos pelo elemento versado na técnica, por exemplo, em “Bioconjugate Techniques” de Hermanson, Academic Press, Inc. (1996). Para a fixação/imobilização em suportes cromatográficos, os seguintes meios são utilizados geralmente: sefarose ativada por NHS (por exemplo, HiTrap-NHS da GE Life Science - Amersham), sefarose ativada por CnBr (por exemplo, GE Life Science - Amersham), grânulos de dextrano ativados por NHS (Sigma) ou polimetacrilato ativado. Estes reagentes também podem ser utilizados em uma abordagem descontínua. Além disso, os grânulos de dextrano que compreendem o óxido de ferro (por exemplo, disponível junto à Miltenyi) podem ser utilizados em uma abordagem descontínua. Estes grânulos podem ser utilizados em combinação com um ímã para a separação dos grânulos de uma solução. Os polipeptídeos podem ser imobilizados em uma microplaqueta Biacore (por exemplo, microplaquetas CM5) pelo uso de carboximetildextrano ativado por NHS. Exemplos adicionais para um suporte sólido apropriado são as placas MultiWell reativas de amina (por exemplo, placas Nunc ImmobilizerTM).

[00150] De acordo com o método da invenção, o dito fragmento do domínio extracelular de CD3 epsilon pode ser diretamente acoplado ao suporte sólido ou através de uma extensão de aminoácidos, que pode ser um aglutinante ou outra porção de proteína/polipeptídeo. Alternativamente, o domínio extracelular de CD3 epsilon pode ser indiretamente acoplado através de uma ou mais moléculas adaptadoras.

[00151] Os meios e os métodos para a avaliação de um peptídeo ligado a um epítopo imobilizado são bem conhecidos no estado da técnica. O mesmo é verdadeiro para os métodos para o isolamento do polipeptídeo identificado do eluato.

[00152] De acordo com a invenção, um método para o isolamento de um ou mais polipeptídeos diferentes com a mesma especificidade para o fragmento do domínio extracelular de CD3ε que compreende em seu N-término a seqüência de aminoácido Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-X-Gly de uma pluralidade de polipeptídeos candidatos pode compreender uma ou mais etapas dos seguintes métodos para a seleção de entidades específicas de antígeno:

[00153] As moléculas de ligação específicas de CD3ε podem ser selecionadas dos repertórios derivados do anticorpo. Uma biblioteca de exposição de fago pode ser construída à base de procedimentos padrão, tal como descrito, por exemplo, em "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. O formato dos fragmentos do anticorpo na biblioteca de anticorpo pode ser scFv, mas também pode ser geralmente um fragmento de Fab ou mesmo um único fragmento de anticorpo do domínio. Para o isolamento dos fragmentos do anticorpo, bibliotecas de fragmentos de anticorpo não expostos a tratamento anterior podem ser utilizadas. Para a seleção de entidades de ligação imunogênicas potencialmente baixas para um uso terapêutico posterior, as bibliotecas de fragmento de anticorpo humano podem ser favoráveis para a seleção direta de fragmentos de anticorpo seres humanos. Em alguns casos, podem formar a base para bibliotecas de anticorpo sintéticas (Knappik et al. J Mol. Biol. 2000, 296: 57 ff). O formato correspondente pode ser Fab, scFv (tal como descrito abaixo) ou os anticorpos do domínio (dAbs, tal como revisto em Holt et al., Trends Biotechnol. 2003, 21: 484 ff).

[00154] Também é sabido no estado da técnica que, em muitos casos, não há nenhuma fonte do anticorpo humano imune disponível contra o antígeno alvo. Portanto, os animais são imunizados com o antígeno alvo e as bibliotecas do anticorpo respectivas são isoladas de tecido animal como, por exemplo, do baço ou das PBMCs. O fragmento de N-terminal pode ser biotinilado ou ligado covalentemente às proteínas como KLH ou albumina de soro bovino (BSA). De acordo com as abordagens comuns, os roedores são utilizados para a imunização. Alguns repertórios do anticorpo imunes de origem não-humana podem ser especialmente favoráveis por outras razões, por exemplo, quanto à presença de anticorpos de domínio único (VHH) derivados da espécie camelóide (tal como descrito em Muyldermans, J Biotechnol. 74: 277; De Genst et al. Dev ComoImmunol. 2006, 30: 187 ff). Portanto, um formato correspondenteda biblioteca de anticorpo pode ser Fab, scFv (tal como descrito abaixo) ou os anticorpos de domínio único (VHH).

[00155] Em uma abordagem possível, dez camundongos F1 com dez semanas de idade de cruzamentos de balb/c x C57black podem ser imunizados com células inteiras, por exemplo, que expressam a transmembrana EpCAM que exibe N-terminalmente como a fusão translacional os aminoácidos 1 a 27 de N-terminal da cadeia madura de CD3ε. Alternativamente, os camundongos podem ser imunizados com a proteína de fusão epsilon-Fc de CD3 1-27 (uma abordagem correspondente é descrita no Exemplo 2 em anexo). Após a imunização de reforço, as amostras de sangue podem ser extraídas e o título do soro do anticorpo contra as células T de CD3 positivas pode ser testado, por exemplo, pela análise de FACS. Geralmente, os títulos do soro são significativamente mais elevados nos animais imunizados do que nos animais não-imunizados.

[00156] Os animais imunizados podem formar a base para a construção de bibliotecas de anticorpo imunes. Os exemplos de tais bibliotecas compreendem bibliotecas de exposição de fago. Tais bibliotecas podem ser geralmente construídas à base de procedimentos padrão, tal como descrito, por exemplo, em "Phage Display: A Laboratory Manual"; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

[00157] Os anticorpos não-humanos também podem ser humanizados através da exposição de fago devido à geração de bibliotecas do anticorpo mais variáveis que podem ser subseqüentemente enriquecidas para os aglutinantes durante a seleção.

[00158] Em uma abordagem de exibição de fago, qualquer um dos agrupamentos de fagos que exibe as bibliotecas do anticorpo forma uma base para selecionar entidades de ligação ao utilizar o antígeno respectivo como a molécula alvo. A etapa central em que os fagos específicos de antígeno, ligados a antígeno são isolados é designada como lavagem na bateia. Devido à exposição dos fragmentos do anticorpo na superfície dos fagos, este método geral é chamado de exposição de fago. Um método de seleção preferido é o uso de proteínas pequenas tais como o domínio de N2 de fago filamentoso fundido translacionalmente ao N-término de scFv exibido pelo fago. Outro método de exposição conhecido no estado da técnica, que pode ser utilizado para isolar entidades de ligação é o método de exposição de ribossomo (revisto em Groves & Osbourn, Expert Opin Biol Ther. 2005, 5: 125 ff; Lipovsek & Pluckthun, J Immunol Methods 2004, 290: 52 ff).

[00159] A fim de demonstrar a ligação das partículas de fago de scFv a uma proteína de fusão de CD3ε-Fc 1-27, uma biblioteca de fago que contém o repertório de scFv clonada pode ser colhida do sobrenadante da cultura respectivo por PEG (polietilenoglicol). As partículas de fago de ScFv podem ser incubadas com a proteína de fusão de CD3ε Fc imobilizada. A proteína de fusão de CD3ε Fc imobilizada pode ser revestida a uma fase sólida. As entidades de ligação podem ser eluídas e o eluato pode ser utilizado para a infecção de hospedeiros bacterianos não-infectados recentes. Os hospedeiros bacterianos transduzidos com sucesso com uma cópia de fagomídeo, que codificam um fragmento de scFv humano, podem ser selecionados outra vez quanto à resistência à carbenicilina e são subseqüentemente infectados, por exemplo, com o fago assistente de VCMS 13 para iniciar a segunda rodada de exposição do anticorpo e seleção in vitro. Um total de quatro a cinco rodadas de seleções é normalmente levado a efeito.

[00160] A ligação de entidades de ligação isoladas pode ser testada em células de Jurkat positivas de CD3 epsilon, células de HPBaII, PBMCs ou células eucarióticas transfectadas que contêm a seqüência de N-terminal de CD3ε fundida a EpCAM exibida na superfície ao utilizar um ensaio de fluxo citométrico (vide o Exemplo 4 em anexo).

[00161] Item 2. O método do item 1, em que o polipeptídeo compreende o domínio de ligação identificado como um primeiro domínio de ligação e um segundo domínio de ligação qoe podem se ligar a um antígeno da superfície celular.

[00162] Para a geração do segundo domínio de ligação do polipeptídeo identificado pelo método da invenção, por exemplo, anticorpos de cadeia simples biespecíficos, tal como definido na presente invenção, os anticorpos monoclonais que se ligam a ambos os antígenos respectivos da superfície celular de seres humanos e de primatas não-chimpanzés podem ser utilizados. Os domínios de ligação apropriados para o polipeptídeo biespecífico tal como definido na presente invenção, por exemplo, podem ser derivados dos anticorpos monoclonais específicos de espécies cruzadas pelos métodos recombinantes descritos no estado da técnica. Um anticorpo monoclonal que se liga a um antígeno humano da superfície celular e ao homólogo do dito antígeno da superfície celular em um primata não-chimpanzé pode ser testado por meio de ensaios de FACS tal como indicado acima. As técnicas de hibridoma, tal como descrito na literatura, (Milstein e Kehler, Nature 256 (1975), 495-7) também podem ser utilizadas para a geração de anticorpos específicos de espécies cruzadas. Por exemplo, os camundongos podem ser alternadamente imunizados com o CD3ε de seres humanos e de primatas não-chimpanzés. Destes camundongos, as células do hibridoma que produzem anticorpos específicos de espécies cruzadas podem ser isoladas através da tecnologia de hibridoma e ser analisadas por FACS tal como indicado acima. A geração e a análise de polipeptídeos biespecíficos tais como os anticorpos de cadeia simples biespecíficos que exibem especificidade de espécies cruzadas tal como descrito na presente invenção são mostradas nos Exemplos seguintes. As vantagens dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos que exibem a especificidade de espécies cruzadas incluem os pontos enumerados abaixo.Item 3. O método do item 2, em que o segundo domínio de ligação se liga a um antígeno da superfície celular de um ser humano e/ou de um primata não-chimpanzé.Item 4. O método de qualquer um dos itens 1 a 3, em que o primeiro domínio de ligação é um anticorpo.Item 5. O método do item 4, em que o anticorpo é um anticorpo de cadeia simples.Item 6. O método de qualquer um dos itens 2 a 5, em que o segundo domínio de ligação é um anticorpo.Item 7. O método de qualquer um dos itens 1 a 6, em que o fragmento do domínio extracelular de CD3ε consiste em um ou mais fragmentos de um polipeptídeo que tem uma seqüência de aminoácido de qualquer uma descrita nas SEQ ID NO. 2, 4, 6 ou 8.Item 8. O método do item 7, em que o dito fragmento tem 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 resíduos de aminoácido no comprimento.Item 9. O método de qualquer um dos itens 1 a 8, em que o método de identificação é um método de seleção de uma pluralidade de polipeptídeos que compreende um domínio de ligação específico de espécies cruzadas que pode se ligar a um epítopo de CD3ε de seres humanos e de primatas não-chimpanzés.Item 10. O método de qualquer um dos itens 1 a 8, em que o método de identificação é um método de purificação/isolamento de um polipeptídeo que compreende um domínio de ligação específico de espécies cruzadas que pode se ligar a um epítopo de CD3ε de seres humanos e de primatas não- chimpanzés.Item 11. Uso de um fragmento de N-terminal do domínio extracelular de CD3ε dos 27 aminoácidos máximos que compreendem a seqüência de aminoácido Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Met-Gly (SEQ ID NO. 381) ou Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly (SEQ ID NO. 382) para a geração de um domínio de ligação específico de espécies cruzadas.

[00163] De acordo com o dito uso da invenção, é preferível que o domínio de ligação específico de espécies cruzadas gerado seja de origem humana.Item 12. Utilização de acordo com o item 11, em que o domínio de ligação específico de espécies cruzadas é um anticorpo.Item 13. Utilização de acordo com o item 12, em que o anticorpo é um anticorpo de cadeia simples. Item 14. Utilização de acordo com o item 12 a 13, em que o anticorpo é um anticorpo biespecífica.

[00164] Estas e outras realizações são descritas eabrangidas pela descrição e pelos exemplos da presente invenção. As técnicas e os métodos recombinantes em imunologiasão descritos, por exemplo, em Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 3a edição 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual; The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A MolecularCloning Manual; Cold Spring Laboratory Press, 2002. A literatura adicional a respeito de qualquer um dos anticorpos, métodos, usos e compostos a ser empregados de acordo com a presente invenção pode ser recuperada das bibliotecas públicase dos bancos de dados, ao utilizar, por exemplo, dispositivoseletrônicos. Por exemplo, o banco de dados público "Medline", disponível na Internet, pode ser utilizado, por exemplo, em http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Bancos dedados e endereços adicionais tais como http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ou relacionados na homepage de serviços de EMBL-serviços em http: //www.embl.de/services/index.htmlsão conhecidos pelo elemento versado na técnica e também podem ser obtidos ao utilizar, por exemplo, http: //www.google.com.

As figuras mostram:

[00165] Figura 1 - Fusão dos aminoácidos 1-27 deN-terminal de CD3 epsilon de primata a uma proteína solúvelheteróloga.

[00166] Figura 2 - A figura mostra os valoresmédios de absorção das amostras em quadruplicata medidas em um ensaio de ELISA que detecta a presença de um construto que consiste nos aminoácidos 1-27 de N-terminal da cadeia CD3 epsilon de humano madura fundida à porção de dobradiça e à porção gama de Fc de IgG1 humana e de um Tag de histidina de C-terminal 6 em um sobrenadante de células 293 transientemente transfectadas. A primeira coluna etiquetada "27 aa huCD3ε" mostra o valor médio de absorção para o construto, a segunda coluna etiquetada "irrel. SN" mostra que o valor médio para um sobrenadante de células transfectadas 293 com um construto irrelevante como o controle negativo. A comparação dos valores obtidos para o construto com os valores obtidos para o controle negativo demonstra claramente a presença do construto recombinante.

[00167] Figura 3 - A figura mostra os valores médios de absorção das amostras em quadruplicata medidas em um ensaio de ELISA que detecta a ligação das moléculas de ligação anti-CD3 específicas de espécies cruzadas na forma de preparados brutos de anticorpos de cadeia simples periplasmaticamente expressos a um construto que compreende os aminoácidos de N-terminal 1-27 da cadeia CD3 epsilon de humano madura fundida à porção de dobradiça e à porção gama de Fc de IgG1 humana e de um Tag de His6 de C-terminal. As colunas mostram da esquerda para a direita os valores médios de absorção para as especificidades designadas como A2J HLP, I2C HLP E2M HLP, F70 HLP, G4H HLP, H2C HLP, E1 L HLP, F12Q HLP, F6A HLP e H1 E HLP. A coluna superior à direita etiquetada "contr. neg." mostra o valor médio de absorção para a preparação de cadeia simples de um anticorpo CD3 anti-humano murino como o controle negativo. A comparação dos valores obtidos para as especificidades anti-CD3 com os valores obtidos para o controle negativo demonstra claramente a forte ligação das especificidades anti-CD3 aos aminoácidos de N-terminal 1-27 da cadeia de CD3 epsilon de humano madura.

[00168] Figura 4 - Fusão dos aminoácidos 1-27 de N-terminal de CD3 epsilon de primata a uma proteína ligada à membrana heteróloga.

[00169] Figura 5 - Sobreposições de histograma de transfectantes diferentes testados em um ensaio de FACS que detecta a presença de proteínas de fusão de transmembrana recombinantes que consistem em EpCAM de cinomolgo e nos aminoácidos de N-terminal 1-27 da cadeia CD3 epsilon de humano, de sagüi, de tamari, de macaco esquilo e de porcos domésticos, respectivamente. As sobreposições de histograma da esquerda para a direita e de cima para baixo mostram os resultados para os transfectantes que expressam os construtos que compreendem o ser humano de 27 mer, o sagüi de 27 mer, o tamari de 27 mer, o macaco esquilo de 27 mer e o porco de 27 mer, respectivamente. Nas coberturas individuais, a linha fina representa uma amostra incubada com PBS com 2% de FCS em vez do anticorpo anti-Flag M2 como o controle negativo e a linha em negrito mostra uma amostra incubada com o anticorpo anti-Flag M2. Para cada construto, a cobertura dos histogramas mostra a ligação do anticorpo anti-Flag M2 aos transfectantes, que demonstra claramente a expressão dos construtos recombinantes nos transfectantes.

[00170] Figura 6 - As sobreposições de histograma de transfectantes diferentes testados em um ensaio de FACS que detecta a ligação das moléculas de ligação anti-CD3 específicas de espécies cruzadas na forma de preparados brutos de anticorpos de cadeia simples periplasmaticamente expressos aos aminoácidos 1-27 de N-terminal da cadeia CD3 epsilon de humano, de sagüi, de tamari e de macaco esquilo fundida respectivamente a EpCAM de cinomolgo.

[00171] Figura 6A - As sobreposições de histograma da esquerda para a direita e de cima para baixo mostram os resultados para os transfectantes que expressam CD3-EpCAM 127 que compreendem o ser humano de 27 mer testado com as moléculas de ligação de CD3 específicas designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP e G4H HLP, respectivamente.

[00172] Figura 6B - As sobreposições de histograma da esquerda para a direita e de cima para baixo mostram os resultados para os transfectantes que expressam CD3-EpCAM 127 que compreendem o sagüi de 27 mer testado com as moléculas de ligação de CD3 específicas designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP e G4H HLP, respectivamente.

[00173] Figura 6C - As sobreposições de histograma da esquerda para a direita e de cima para baixo mostram os resultados para os transfectantes que expressam CD3-EpCAM 127 que compreendem o tamari de 27 mer testado com as moléculas de ligação de CD3 específicas designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP e G4H HLP, respectivamente.

[00174] Figura 6D - As sobreposições de histograma da esquerda para a direita e de cima para baixo mostram os resultados para os transfectantes que expressam CD3-EpCAM 127 que compreendem o macaco esquilo de 27 mer testado com as moléculas de ligação de CD3 específicas designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP e G4H HLP, respectivamente.

[00175] Figura 6E - As sobreposições de histograma da esquerda para a direita e de cima para baixo mostram os resultados para os transfectantes que expressam CD3-EpCAM 127 que compreendem o porco de 27 mer testado com as moléculas de ligação de CD3 específicas designadas H2C HLP, F12Q HLP, E2M HLP e G4H HLP, respectivamente. Nas coberturas individuais, a linha fina representa uma amostra incubada com um preparado de cadeia simples de um anticorpo CD3 anti-humano murino como o controle negativo e a linha em negrito mostra uma amostra incubada com as moléculas de ligação anti-CD3 respectivas indicadas. Considerando a falta de ligação aos transfectantes de porco de 27 mer e os níveis da expressão dos construtos mostrados na Figura 5, as coberturas dos histogramas mostram uma ligação forte e específica das especificidades anti-CD3 testadas dos únicos anticorpos de cadeia simples biespecíficos seres humanos específicos inteiramente de espécies cruzadas da cadeia às células que expressam as proteínas de fusão de transmembrana recombinantes que compreendem os aminoácidos 127 de N-terminal da cadeia CD3 epsilon de humano, de sagüi, de tamari e de macaco esquilo fundida respectivamente a EpCAM de cinomolgo e mostram portanto a especificidade de espécies cruzadas de primatas múltiplos das moléculas de ligação anti- CD3.

[00176] Figura 7 - O ensaio de FACS para a detecção de CD3 epsilon humano em células T EL4 de murinos transfectadas. A análise gráfica mostra uma cobertura dos histogramas. A linha em negrito mostra as células transfectadas incubadas com o anticorpo CD3 anti-humano UCHT-1. A linha fina representa as células incubadas com um controle do isótipo de IgG1 de camundongo. A ligação do anticorpo anti-CD3 UCHT1 mostra claramente que a expressão da cadeia CD3 epsilon humana na superfície celular de células T EL4 de murinos transfectadas.

[00177] Figura 8 - A ligação dos anticorpos anti- CD3 específicos de espécies cruzadas aos mutantes de alanina em uma experiência de varredura de alanina. Nas Figuras individuais, as colunas mostram da esquerda para a direita os valores de ligação calculados em unidades arbitrárias em escala logarítmica para o transfectante do tipo selvagem (WT) e para todos os mutantes de alanina da posição 1 a 27. Os valores de ligação são calculados ao utilizar a seguinte fórmula:

[00178] Nesta equação, value_Sample valor da amostra significa o valor em unidades arbitrárias de ligação que descrevem o grau de ligação de um anticorpo anti-CD3 específico a um mutante de alanina específico conforme mostrado na Figura, Sample significa o valor de fluorescência médio geométrico obtido para um anticorpo anti-CD3 específico testado em um transfectante de varredura de alanina específico, neg_Contr. significa valor de fluorescência médio geométrico obtido para o controle negativo testado em um mutante de alanina específico, UCHT-1 significa o valor obtido para o anticorpo UCHT-1 testado em um mutante de alanina específico, WT significa o valor de fluorescência médio geométrico obtido para um anticorpo anti-CD3 específico testado no transfectante do tipo selvagem, x especifica o transfectante respectivo, y especifica o anticorpo anti-CD3 respectivo e wt especifica que o transfectante respectivo é do tipo selvagem. As posições individuais do mutante de alanina são etiquetadas com um código de letra única do aminoácido do tipo selvagem e o número da posição.

[00179] Figura 8A - A figura mostra os resultados para o anticorpo anti-CD3 A2J HLP específico de espécies cruzadas expresso como a molécula quimérica de IgG. A atividade de ligação reduzida é observada para mutações para a alanina na posição 4 (asparagina), na posição 23 (treonina) e na posição 25 (isoleucina). A perda completa da ligação é observada para mutações para a alanina na posição 1 (glutamina), na posição 2 (aspartato), na posição 3 (glicina) e na posição 5 (glutamato).

[00180] Figura 8B - A figura mostra os resultados para o anticorpo anti-CD3 E2M HLP específico de espécies cruzadas, expresso como a molécula quimérica de IgG. A atividade de ligação reduzida é observada para mutações para a alanina na posição 4 (asparagina), na posição 23 (treonina) e na posição 25 (isoleucina). A perda completa da ligação é observada para mutações para a alanina na posição 1 (glutamina), na posição 2 (aspartato), na posição 3 (glicina) e na posição 5 (glutamato).

[00181] Figura 8C - A figura mostra os resultados para o anticorpo anti-CD3 H2C HLP específico de espécies cruzadas, expresso como a molécula quimérica de IgG. A atividade de ligação reduzida é observada para mutações para a alanina na posição 4 (asparagina). A perda completa da ligação é observada para mutações para a alanina glutamina na posição 1 (glutamina), na posição 2 (aspartato), na posição 3 (glicina) e na posição 5 (glutamato).

[00182] Figura 8D - Mostra os resultados para o anticorpo anti-CD3 F12Q HLP específico de espécies cruzadas, testado como o anticorpo periplasmaticamente expresso de cadeia simples. A perda completa da ligação é observada para mutações para a alanina na posição 1 (glutamina), na posição 2 (aspartato), na posição 3 (glicina) e na posição 5 (glutamato).

[00183] Figura 9 - Ensaio de FACS que detecta aligação da molécula de ligação anti-CD3 H2C HLP específica deespécies cruzadas a CD3 humano com e sem o Tag de His6 de N-terminal. As sobreposições de histograma são executadas da linhagem de células transfectadas EL4 com a cadeia CD3 epsilon humana do tipo selvagem (histograma à esquerda) ou a cadeia CD3 epsilon humana com o Tag de His6 de N-terminal (histograma à direita) testadas em um ensaio de FACS que detecta a ligação da molécula de ligação H2C HLP específica de espécies cruzadas. As amostras são incubadas com um controle de isótipo apropriado como o controle negativo (linha fina), o anticorpo CD3 anti- humano UCHT-1 como o controle positivo (linha pontilhada) e o anticorpo H2C HLP anti-CD3 específico de espécies cruzadas na forma de uma molécula quimérica de IgG (linha em negrito). As sobreposições de histograma mostram a ligação comparável do anticorpo UCHT-1 a ambos os transfectantes em comparação ao controle do isótipo que demonstra a expressão de ambos os construtos recombinantes. As sobreposições de histograma também mostram a ligação anti-CD3 da molécula de ligação H2C HLP somente à cadeia CD3 epsilon humana do tipo selvagem, mas não à cadeia de CD3 epsilon de His6 humana. Estes resultados demonstram que um N-término livre é essencial para a ligação da molécula de ligação H2C HLP anti-CD3 específica de espécies cruzadas.

[00184] Figura 10 - Ligação de saturação de EGFR- 21-63 LH x H2C em PBMCs positivas CD3 humanas para determinaro valor de KD da ligação de CD3 às células pela análise de FACS. O ensaio é executado tal como descrito no Exemplo 7.

[00185] Figura 11 - A análise da ligação de FACS dos construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designados às células de CHO transfectadas com EGFR humano, a linhagem de células T humanas CD3+ HPB-ALL, as células de CHO transfectadas com EGFR de cinomolgo e uma linhagem de células T 4119 LnPx de símio. O tingimento por FACS é executado tal como descrito no Exemplo 12. A linha grossa representa as células incubadas com 2 μg/ml da proteína purificada que são subseqüentemente incubadas com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção etiquetado PE. A linha fina do histograma reflete o controle negativo: as células incubadas somente com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção.

[00186] Figura 12 - Atividade citotóxica induzida por construtos de cadeia simples específicos de espécie cruzada designados redirecionados a linhagens de células alvo indicadas. A) PBMCs CD4-/CD56- humanos são utilizados como célula efetoras, células de CHO transfectadas com EGFR humano como células alvo. B) A linhagem de células T de símio 4119 LnPx é utilizada como célula efetora, célula de CHO transfetada com EGFR de cynomolgus como célula alvo. O ensaio é executado tal como descrito no Exemplo 13.

[00187] Figura 13 - Atividade citotóxica induzida por construtos de cadeia simples específicos de espécie cruzada designados redirecionados a linhagens de células alvo indicadas. A) PBMCs CD4-/CD56-humanos são utilizado como células efetoras, células de CHO transfetadas com EGFR humano como células alvo. B) A linhagem de células T de símio 4119 LnPx é utilizada como célula efetora, células de CHO transfectadas com EGFR de cynomolgus como células alvo. O ensaio é executado tal como descrito no Exemplo 13.

[00188] Figura 14 - A análise da ligação de FACS dos construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designados às células de CHO transfectadas com MCSP D3 humano, a linhagem de células T humanas CD3+ HPB- ALL, as células de CHO transfectadas com MCSP D3 de cinomolgo e uma linhagem de células T 4119 LnPx de símio. O tingimento por FACS é executado tal como descrito no Exemplo 17. A linha grossa representa as células incubadas com 2 μg/ml da proteína purificada que são subseqüentemente incubadas com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção etiquetado PE. A linha fina do histograma reflete o controle negativo: as células incubadas somente com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção.

[00189] Figura 15 - A análise da ligação de FACS de células de CHO transfectadas dos construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designados com MCSP D3 humano, a linhagem de células T humanas CD3+ HPB-ALL, as células de CHO transfectadas com MCSP D3 de cinomolgo e uma linhagem de células T 4119 LnPx de símio. O tingimento por FACS é executado tal como descrito no Exemplo 17. A linha grossa representa as células incubadas com 2 μg/ml da proteína purificada que são subseqüentemente incubadas com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção etiquetado PE. A linha fina do histograma reflete o controle negativo: as células incubadas somente com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção.

[00190] Figura 16 - A análise da ligação de FACS de células de CHO transfectadas dos construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designados com MCSP D3 humano, a linhagem de células T humanas CD3+ HPB-ALL, as células de CHO transfectadas com MCSP D3 de cinomolgo e uma linhagem de células T 4119 LnPx de símio. O tingimento por FACS é executado tal como descrito no Exemplo 17. A linha grossa representa as células incubadas com 2 μg/ml da proteína monomérica purificada que são subseqüentemente incubadas com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção etiquetado PE. A linha fina do histograma reflete o controle negativo: as células incubadas somente com o anticorpo anti- his e o anticorpo de detecção.

[00191] Figura 17 - Atividade de citotoxicidade induzida pelos construtos de cadeia simples específicos de MCSP específicos de espécies cruzadas designados redirecionados às linhagens de células alvo indicadas. A) As PBMCs humanas sem CD4/CD56 estimuladas são utilizadas como células efetoras, as células de CHO transfectadas com MCSP humano D3 como células alvo. B) A linhagem de células T 4119 LnPx de símio são utilizadas como células efetoras, as células de CHO transfectadas com MCSP D3 de cinomolgo como células alvo. O ensaio é executado tal como descrito no Exemplo 18.

[00192] Figura 18 - Atividade de citotoxicidade induzida pelos construtos de cadeia simples específicos de MCSP específicos de espécies cruzadas designados redirecionados às linhagens de células alvo indicadas. A) e B) A linhagem de células T 4119 LnPx de símio são utilizadas como células efetoras, as células de CHO transfectadas com MCSP D3 de cinomolgo como células alvo. O ensaio é executado tal como descrito no Exemplo 18.

[00193] Figura 19 - Atividade de citotoxicidade induzida pelos construtos de cadeia simples específicos de MCSP específicos de espécies cruzadas designados redirecionados às linhagens de células alvo indicadas. A) e B) As PBMCs humanas sem CD4/CD56 estimuladas são utilizadas como células efetoras, as células de CHO transfectadas com MCSP humano D3 como células alvo. O ensaio é executado tal como descrito no Exemplo 18.

[00194] Figura 20 - Atividade de citotoxicidade induzida pelos construtos de cadeia simples específicos de MCSP específicos de espécies cruzadas designados redirecionados às linhagens de células alvo indicadas. A) As PBMCs humanas sem CD4/CD56 estimuladas são utilizadas como células efetoras, as células de CHO transfectadas com MCSP humano D3 como células alvo. B) A linhagem de células T 4119 LnPx de símio são utilizadas como células efetoras, as células de CHO transfectadas com MCSP D3 de cinomolgo como células alvo. O ensaio é executado tal como descrito no Exemplo 18.

[00195] Figura 21 - Atividade de citotoxicidade induzida pelos construtos de cadeia simples específicos de MCSP específicos de espécies cruzadas designados redirecionados às linhagens de células alvo indicadas. A) As PBMCs humanas sem CD4/CD56 estimuladas são utilizadas como células efetoras, as células de CHO transfectadas com MCSP humano D3 como células alvo. B) A linhagem de células T 4119 LnPx de símio são utilizadas como células efetoras, as células de CHO transfectadas com MCSP D3 de cinomolgo como células alvo. O ensaio é executado tal como descrito no Exemplo 18.

[00196] Figura 22 - A estabilidade do plasma dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas de MCSP e de CD3 testada pela medição da atividade de citotoxicidade induzida por amostras de construtos de cadeia simples designados incubados com 50% de plasma humano a 37°C e a 4°C por 24 horas respectivamente ou com a adição de 50% de plasma humano imediatamente antes do teste de citotoxicidade ou sem a adição do plasma. As células de CHO transfectadas com MCSP humano são utilizadas como a linhagem de células alvo e as PBMCs humanas sem CD4/CD56 estimuladas são utilizadas como células efetoras. O ensaio é executado tal como descrito no Exemplo 19.

[00197] Figura 23 - Queda e recuperação iniciais (isto é, redistribuição) da contagem de células T absoluta (quadrados abertos), no sangue periférico de pacientes de B- NHL (patentes números 1, 7, 23, 30, 31, e 33 da Tabela 4), que não tinham essencialmente nenhuma célula B alvo CD19-positiva circulante (triângulos cheios), durante a fase inicial da infusão intravenosa com a molécula de ligação de CD3 CD19xCD3 que reconhece um epítopo de CD3 dependente do contexto convencional. As contagens de célula absolutas são fornecidas em 1.000 células por microlitro de sangue. O primeiro ponto de dados mostra contagens da linha base imediatamente antes do início da infusão. A dose de CD19xCD3 é fornecida entre parênteses ao lado do número do paciente.

[00198] Figura 24 - (A) A redistribuição de células T repetida (quadrados abertos) no paciente #19 de B-NHL (Tabela 4) que não tinha nenhuma célula B alvo CD19-positiva circulante (triângulos cheios) e sintomas do CNS desenvolvidos sob infusão intravenosa contínua com CD19xCD3 a uma dose inicial de 5 μg/m2/24 h por um dia seguida por um aumento repentino da dose para 15 μg/m2/24 horas. As contagens de célula absolutas são fornecidas em 1.000 células por microlitro de sangue. O primeiro ponto de dados mostra contagens da linha base imediatamente antes do início da infusão. Depois da recuperação das células T circulantes do primeiro episódio de redistribuição provocado pelo início do tratamento a 5 μg/m2/24 h, o aumento da dose por etapas de 5 a 15 μg/m2/24 h provocou um segundo episódio de redistribuição de células T que foi associado com o desenvolvimento de sintomas do CNS dominados pela confusão e desorientação.(B) A redistribuição repetida de células T em um paciente de B-NHL, que desenvolveu sintomas do CNS sob infusão intravenosa repetido de bolus com CD19xCD3 a 1,5 μg/m2. As contagens de célula absolutas são fornecidas em 1.000 células por microlitro de sangue. O tempo de infusão para cada administração do bolus era de duas a quatro horas. As setas verticais indicam o início das infusões do bolus. Os pontos de dados no início de cada administração do bolus mostram as contagens das células T imediatamente antes do início da infusão do bolus. Cada infusão do bolus provocou um episódio de redistribuição de células T seguido pela recuperação das contagens de células T antes da infusão do bolus seguinte. O terceiro episódio de redistribuição das células T foi associado finalmente com o desenvolvimento de sintomas do CNS nesse paciente.

[00199] Figura 25 - Padrão de redistribuição de células T (quadrados abertos) no paciente #20 de B-NHL (Tabela 4) sem células B alvo CD19-positivas circulantes (triângulos cheios), durante a iniciação da inclinadoa da infusão de CD19xCD3, isto é, o aumento gradual uniforme da vazão de quase zero para 15 μg/m2/24 h durante as primeiras 24 horas do tratamento. As contagens de célula absolutas são fornecidas em 1.000 célula por microlitro de sangue. O primeiro ponto de dados mostra contagens de linha base imediatamente antes do início da infusão. A dose de CD19xCD3 é indicada entre parKnteses ao lado do número do paciente. As células T que reaparecem no sangue circulante após a redistribuição inicial provocada pela primeira exposição a CD19xCD3 são induzidas parcialmente a redesaparecerem do sangue circulante outra vez por níveis ainda crescentes de CD19xCD3 durante a fase da inclinadoa.

[00200] Figura 26 - Contagens de células T e B durante o tratamento com CD19xCD3 do paciente #13 de B-NHL (Tabela 4) que tinham um número significativo de células B (linfoma) alvo CD19-positivas circulante (triângulos cheios).As contagens de célula absolutas são fornecidas em 1.000 células por microlitro de sangue. O primeiro ponto de dados mostra contagens da linha base imediatamente antes do início da infusão. A dose de CD19xCD3 é indicada entre parênteses ao lado do número do paciente. As células T (quadrados abertos) desaparecem completamente da circulação com o início da infusão de CD19xCD3 e não reaparecem até que as células B (linfoma) CD19-positivas circulante (triângulos cheios) sejam esgotadas do sangue periférico.

[00201] Figura 27 - Redistribuição repetida de células T (quadrados abertos) no paciente #24 de B-NHL (Tabela 4), que não tinha essencialmente nenhuma célula B alvo CD19- positiva circulante (triângulos enchidos) e sintomas do CNS desenvolvidos com a iniciação da infusão de CD19xCD3 sem HSA adicional conforme necessário para a estabilização da droga (painel superior). Após a primeira recuperação de células T circulantes da redistribuição inicial, o fluxo desuniforme da droga devido à falta de HSA de estabilização provocou um segundo episódio de redistribuição de células T que foi associado com o desenvolvimento dos sintomas do CNS dominados pela confusão e desorientação. Quando o mesmo paciente foi reiniciado corretamente com a solução de CD19xCD3 contendo HSA adicional para a estabilização da droga, nenhumaredistribuição repetida de células T foi observada (painel inferior) e o paciente não desenvolveu outra vez nenhum sintoma do CNS. As contagens de célula absolutas são fornecidas em 1.000 células por microlitro de sangue. O primeiro ponto de dados mostra contagens da linha base imediatamente antes do início da infusão. A dose de CD19xCD3 é indicada entre parênteses ao lado do número do paciente.Figura 28

[00202] Modelo de aderência de células T às células endoteliais induzidas pela ligação monovalente aos epítopos de CD3 dependentes do contexto. A interação monovalente de uma molécula de ligação de CD3 convencional ao seu epítopo dependente do contexto em CD3 epsilon pode conduzir a uma mudança alostérica na conformação de CD3 seguida pelo recrutamento de Nck2 para o domínio citoplásmico de CD3 epsilon (Gil et al. (2002) Cell 109:901). Uma vez que Nck2 é ligado diretamente a integrinas através de PINCH e ILK (Legate et al.(2006) Nat Ver Mol Cell Biol 7:20), o recrutamento de Nck2 aodomínio citoplásmico de CD3 epsilon seguindo uma mudança alostérica na conformação de CD3 através da ligação de uma molécula de ligação de CD3 convencional (tal como CD19xCD3 do exemplo 20) ao seu epítopo dependente do contexto em CD3 epsilon, pode aumentar a aderência de células T às células endoteliais ao mudar transientemente as integrinas na superfície das células T para a sua isoforma mais adesiva através de sinalização de dentro para fora. Figura 29

[00203] Atividade citotóxica do material de teste de CD33-AF5 VH-VL x 12C VH-VL utilizado para o estudo in vivo em macacos cinomolgos tal descrito no exemplo 21. A lise específica de célula alvo CD-33positivas foi determinada em um ensaio de liberação de 51cromo padrão a concentrações crescentes de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL. A duração do ensaio foi de dezoito horas. A linhagem de células T de macaque 4119 LnPx foi utilizada como fonte de células efetoras. As células CHO transfectadas com CD33 de cinomolgo serviram como células alvo. A razão entre as células efetoras-alvo (E:T-ratio) era de 10:1. A concentração de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL requerida para a lise de células alvo meio-máxima (EC50) foi calculada a partir da curva de resposta de dose com um valor de 2,7 ng/ml.Figura 30(A) Esgotamento dependente da dose e do tempo de monócitos CD33-positivos do sangue periférico de macacos cinomolgos através da infusão contínua intravenosa de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL tal como descrito no exemplo 21. A porcentagem em relação à linha base (isto é, 100%) de contagens de monócitos CD33-positivos circulantes absolutas após a duração do tratamento tal como indicado acima das colunas é mostrada para cada um de dois macacos cinomolgos por nível de dose. O nível de dose (isto é, a vazão da infusão) é indicado abaixo das colunas. Nenhum esgotamento de monócitos CD33- positivos circulantes foi observado nos animais 1 e 2 tratados por sete dias a uma dose de 30 μg/m2/24 horas. Nos animais 3 e 4 tratados por sete dias a uma dose de 60 μg/m2/24 horas as contagens de monócitos CD33-positivos circulantes foram reduzidas a 68% e a 40% da linha base, respectivamente. A 240 μg/m2/24 horas, os monócitos CD33-positivos circulantes foram esgotados quase que completamente do sangue periférico três dias após o tratamento (animais 5 e 6). A 1.000 μg/m2/24 horas, o esgotamento de monócitos CD33-positivos circulantes do sangue periférico foi completado já depois de um dia de tratamento (animais 7 e 8).(B) Curso de contagens de células T e CD33- monócitos no sangue periférico de dois macacos cinomolgos durante a infusão contínua de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL por catorze dias a 120 μg/m2/24 horas. As contagens de células absolutas são fornecidas em 1000 células por microlitro de sangue. O primeiro ponto de dados mostra contagens da linha base imediatamente antes do começo da infusão. Após a mobilização inicial de CD33-monócitos durante as primeiras doze horas com o início da infusão, os CD33-monócitos no sangue periférico (triângulos cheios) são esgotados em dois terços (animal 10) e 50% (animal 9) em relação às respectivas contagens de linha base durante o curso de infusão adicional. As contagens de células T circulantes (quadrados abertos) mostram uma queda inicial limitada seguida pela recuperação ainda durante a presença de células alvo monocíticas CD33- positivas.Figura 31

[00204] Atividade citotóxica do material de teste de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL utilizado para o estudo in vivoem macacos cinomolgos tal como descrito no exemplo 22. A lise específica de células alvo MCSP-positivas foi determinada emum ensaio de liberação de 51cromo padrão a concentrações crescentes de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL. A duração do ensaio foi de dezoito horas. A linhagem de células T de macaque 4119 LnPx foi utilizada como fonte de células efetoras. As células CHO transfectadas com MCSP de cinomolgo serviram como células alvo. A razão de células efetoras/alvo (E:T-ratio) era de 10:1. A concentração de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL requerida para a lise de células alvo meio-máxima (EC50) foi calculada a partir da curva de resposta da dose com um valor de 1,9 ng/ml.Figura 32

[00205] Ausência de episódios iniciais de queda e recuperação subseqüente de contagens de células T absolutas (isto é, redistribuição) no sangue periférico de macacos cinomolgos durante a fase de partida da infusão intravenosa com moléculas de ligação de CD3 MCSP-F4 VH-VL x de I2C VH-VLreconhecendo essencialmente um epítopo de CD3 independente do contexto. As contagens de células absolutas são fornecidas a1.000 células por microlitro de sangue. O primeiro ponto de dados mostra contagens da linha base imediatamente antes do início da infusão. A dose de MCSP-G4 VH-VL x de I2C VH-VL é fornecida entre parênteses ao lado do número do animal. Na ausência conhecida de células alvo MCSP-positivas do sangue circulante de macacos cinomolgos não há nenhuma indução de redistribuição de células T (ou seja, um episódio de queda e recuperação subseqüente das contagens de células T absolutas) através da reticulação mediada por células alvo de CD3. Além disso, a indução da redistribuição de células T (isto é, um episódio inicial de queda e recuperação subseqüente de contagens de células T absolutas) através de um sinal, que as células T podem receber através da interação exclusiva com umsítio de ligação de CD3 somente, pode ser evitada pelo uso demoléculas de ligação de CD3 tais como MCSP-G4 VH-VL x I2C VH- VL reconhecendo um epítopo de CD3 essencialmente independente do contexto.Figura 33

[00206] Análise de ligação de FACS de construtos biespecíficos específicos de espécies cruzadas designadas para células CHO transfectadas com CD33 humano, a linhagem de células CD3+ T humanas HPB-ALL, células CHO transfectadas com CD33 de macaque e PBMC de macaque, respectivamente. O tingimento FACS é executado tal como descrito no exemplo 23.4. As linhas em negrito (realce) representam as células incubadas com 5 μg/ml de construto de cadeia simples biespecífico purificado ou de sobrenadante de cultura de célula das células transfectadas que expressam os construtos de anticorpos biespecíficos específicos de espécies cruzadas. Os histogramas preenchidos refletem os controles negativos. O sobrenadante de células CHO não transfectadas foi utilizado como controle negativo. Para cada construto de cadeia simples biespecífico específico de espécie cruzada, a sobreposição dos histogramas mostra a ligação específica do construto para CD33 de macaque e CD3 de ser humano e de macaque.Figura 34

[00207] Os diagramas mostram os resultados dos ensaios de liberação de cromo que medem a atividade citotóxica induzida pelos construtos de cadeia simples específicos de CD33 específicos de espécies cruzadas designadosredirecionados às linhagens de células alvo indicadas. As células efetoras também foram utilizadas tal como indicado. Os ensaios são executados tal como descrito no exemplo 23.5. Os diagramas demonstram claramente para cada construto o potente recrutamento da atividade citotóxica das células efetoras de ser humano e de macaque contra as células CHO transfectadas com CD33 de seres humanos e macaque, respectivamente.Figura 35

[00208] Análise de ligação de FACS de construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designadas para células CHO transfectadas com CAIX humano, a linhagem de célula de CD3+ T humanas HPB-ALL, célula CHO transfectadas com CAIX de macaque e a linhagem de células T de macaque 4119 LnPx T, respectivamente. O tingimento FACS foi executado tal como descrito no exemplo 24.5. As linhas em negrito (realce) representam as células incubadas com 2 μg/ml de construto de cadeia simples biespecífico purificado. Os histogramas preenchidos refletem os controles negativos. O sobrenadante de células CHO não transfectadas foi utilizado como controle negativo para a ligação às linhagens de células T. Um construto de cadeia simples com especificidade alvo irrelevante foi utilizado como controle negativo para a ligação a células CHO transfectadas com CAIX. Para cada construto de cadeia simples biespecífico específico de espécie cruzada, a sobreposição dos histogramas mostra a ligação específico do construto a CAIX de ser humano e de macaque e CD3 de ser humano e de macaque.Figura 36

[00209] O diagrama mostra os resultados dos ensaios de liberação de cromo medindo a atividade citotóxica induzida por construtos de cadeia simples específicos de CAIX específicos de espécies cruzadas designados redirecionados às linhagens de células alvo indicadas. As células efetoras também foram utilizadas tal como indicado. Os ensaios são executados tal como descrito no exemplo 24.6. Os diagramas demonstram claramente para cada construto o potente recrutamento da atividade citotóxica de células efetoras de seres humanos e de macaque contra as células CHO transfectadas com CAIX de seres humanos e de macaque, respectivamente.Figura 37

[00210] Atividade citotóxica induzida porconstrutos de cadeia simples específicos de EpCAM designados contra células CHO transfectadas com EpCAM humano utilizando células T humanas como células efetoras. O ensaio foi executado tal como descrito na seção dos exemplos. Os diagramas demonstram claramente o potente recrutamento da atividade citotóxica por cada construto.

[00211] Célula efetoras: estimularam o PBMCesgotado por CD4/CD56.

[00212] Células alvo: CHO transfectadas com EpCAM humano.Figura 38

[00213] Análise de ligação de FACS de construtos de cadeia simples biespecíficos designados a células CHO transfectadas com EpCAM de ser humano (2a), células CHO não transfectadas como linhagens de células EpCAM e CD3-negativas (2b), PBMCs de ser humano (2c) e linhagem de células T de macaque 4119 LnPx (2d), respectivamente. As células foram incubadas com sobrenadante contendo o respectivo construto de cadeia simples biespecífico. O tingimento FACS é executado talcomo descrito na seção dos exemplos. Para cada construto de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas,a sobreposição dos histogramas mostra a ligação específica do construto a EpCAM de ser humano e a CD3 de ser humano e de macaque. a: CHO-EpCAM (humano) b: CHO (não transfectadas)c: PBMCs de ser humanod: 4119LnPx de macaque (CD3+).Figura 39

[00214] Análise de ligação de FACS de construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designados a células CHO transfectadas com EGFRvIII humano, linhagem de células CD3+ T humanas HPB-ALL, células CHO transfectadas com EGFRvIII de cinomolgo e uma linhagem de células T de macaque 4119 LnPx. O tingimento FACS é executado tal como descrito no exemplo 26.3. A linha grossa representa as células incubadas com 2 μg/ml de proteína monomérica purificada, as quais são incubadas subseqüentemente com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção etiquetado com PE. A linha fina do histograma reflete o controle negativo: as células só foram incubadas com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção.Figura 40

[00215] Atividade citotóxica induzida porconstrutos de cadeia simples específicos de espécies cruzadas designados redirecionados às linhagens de células alvo indicadas. A) CD4-CD56-PBMCs humanos estimulados são utilizados como células efetoras, células CHO transfectadas com EGFRvIII humano como células alvo. B) A linhagem de células T de macaque 4119 LnPx é utilizada como células efetoras, células CHO transfectadas com EGFRvIII de cinomolgo como células alvo. O ensaio é executado tal como descrito no exemplo 26.3.Figura 41

[00216] Análise de ligação de FACS de construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designados a células J558L transfectadas com IgE humano, linhagem de células humanas HPB-ALL de CD3+ T, as células de J558L transfectadas com IgE de macaque e uma linhagem de células T de macaque 4119 LnPx. O tingimento FACS é executado tal como descrito no exemplo 27.2. A linha grossa representa as células incubadas com o sobrenadante da cultura de células das células CHO transfectadas com construto de cadeia simples biespecífico específico de espécie cruzada designado que são incubadas subseqüentemente com anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção etiquetado com PE. A linha fina do histograma reflete o controle negativo: células incubadas somente com o anticorpo anti-his e o anticorpo de detecção.Figura 42

[00217] Atividade citotóxica induzida pelos construtos de cadeia simples específicos de espécies cruzadas designados redirecionados às linhagens de células alvo indicadas. A) PBMCs CD4-/CD56-humanos estimulados são utilizados como células efetoras, células J558L transfectadas com IgE humano como células alvo. B) A linhagem de células T de macaque 4119 LnPx é utilizada como célula efetora, células J558L transfectadas com IgE de macaque como células alvo. O ensaio é executado tal como descrito no exemplo 27.2.Figura 43

[00218] Análise de ligação de FACS de construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designados às células CHO transfectadas com CD44 humano, linhagem de células de CD3+ T humanas HPB-ALL, células CHO transfectadas CD44 de macaque e PBMC de macaque, respectivamente. O tingimento FACS foi executado tal como descrito no exemplo 28.6. As linhas em negrito (realce) representam as células incubadas com 5 μg/ml de construto de cadeia simples biespecífico purificado. Os histogramas preenchidos refletem os controles negativos. PBS com 2% de FCS foi utilizado como controle negativo. Para cada construto de cadeia simples biespecífico específico de espécie cruzada a sobreposição dos histogramas mostra a ligação específica do construto ao CD44 de seres humanos e de macaque CD44 e a CD3 de seres humanos e de macaque.Figura 44

[00219] Análise de ligação de FACS de construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designados às células CHO transfectadas com CD44 humano que não tem o éxon v6. O tingimento FACS é executado tal como descrito no exemplo 28.6. Como controle para a expressão de CD44, as células CHO transfectadas com CD44 humano que não tem o éxon v6 e as células CHO transfectadas com CD44 humano de comprimento total foram incubadas com um anticorpo anti-CD44. As linhas em negrito (realce) representam as células incubadas com 5 μg/ml de construto de cadeia simples biespecífico purificado ou o anticorpo anti-CD44 (5 μg/ml) tal como indicado. Os histogramas preenchidos refletem os controles negativos. PBS com 2% de FCS foi utilizado como controle negativo. Para cada construto de cadeia simples biespecífico específico de espécie cruzada, a sobreposição dos histogramas revela a ausência de ligação do construto a CD44 humano que não tem o éxon v6. A presença de CD44 nas células CHO transfectadas com CD44 humano que não tem o éxon v6 foi demonstrada pela ligação comparável do anticorpo anti-CD44 a estas células e às células transfectadas com CD44 humano de comprimento total. A análise de ligação de FACS mostrou a especificidade dos construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas para o éxon v6 de CD44.Figura 45

[00220] O diagrama mostra os resultados de um ensaio de liberação de cromo que mede a atividade citotóxica induzida pelos construtos de cadeia simples específicos de CD44 específicos de espécies cruzadas designados redirecionados às células CHO transfectadas com CD44 humano tal como descrito no exemplo 28.1. Como células efetoras, PBMC humanos estimulados esgotados para CD4 e CD56 foram utilizados com uma relação de E:T de 10:1. O ensaio é executado tal como descrito no exemplo 28.7. O diagrama demonstrou para cada construto o potente recrutamento da atividade citotóxica de células efetoras humanas contra células CHO transfectadas com CD44 humano.Figura 46

[00221] Análise de ligação de FACS de construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designados às células CHO transfectadas com CD30 humano, a linhagem de células CD30+ humanas MEC-1 da célula, a linhagem de células T CD30+ humanas HPB-ALL, as células CHO transfectadas com CD30 de macaque CD30 e PBMC de macaque, respectivamente. O tingimento FACS foi executado tal como descrito no exemplo 29.5. As linhas em negrito (realce) representam as célula incubadas com 5 μg/ml de construto de cadeia simples biespecífico purificado. Os histogramas preenchidos refletem os controles negativos. PBS com 2% de FCS foi utilizado como controle negativo. Para cada construto de cadeia simples biespecífico específico de espécie cruzada, a sobreposição dos histogramas mostra a ligação específico do construto a CD30 de seres humanos e de macaque e CD3 de seres humanos e de macaque.Figura 47

[00222] Os diagramas mostram os resultados dos ensaios de liberação de cromo que medem a atividade citotóxica induzida pelos construtos de cadeia simples específicos de CD30 específicos de espécies cruzadas designados redirecionados às linhagens decélulas alvo indicadas. As células efetoras também foram utilizadas tal indicado. Os ensaios foram executados tal como descritos no exemplo 29.6. Os diagramas demonstram claramente para cada construto o potente recrutamento da atividade citotóxica de células efetoras de seres humanos e de macaque contra células positivas para CD30 de seres humanoe e de macaque, respectivamente.Figura 48

[00223] Análise de ligação de FACS de construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designados às células CHO transfectadas com HER2 humano, a linhagem de células CD3+ T humanas HPB-ALL, células CHO transfectadas com HER2 de macaque e a linhagem de células T de macaque 4119LnPx, respectivamente. O tingimento FACS foi executado tal como descrito no exemplo 30.5. As linhas em negrito (realce) representam as células incubadas com 2 μg/ml de construto de cadeia simples biespecífico purificado. As linhas finas refletem os controles negativos. PBS com 2% de FCS foi utilizado como controle negativo. Para cada construto de cadeia simples biespecífico específico de espécie cruzada, a sobreposição dos histogramas mostra a ligação específica do construto a HER2 de seres humanos e de macaque e CD3 de seres humanos e de macaque.Figura 49

[00224] Os diagramas mostram os resultados dos ensaios de liberação de cromo que medem a atividade citotóxica induzida pelos construtos de cadeia simples específicos de HER2 específicos de espécies cruzadas designados redirecionados às linhagens de células alvo indicadas. As células efetoras também foram utilizadas tal como indicado. Os ensaios foram executados tal como descritos no exemplo 30.6. Os diagramas demonstram claramente para cada construto mostrado o potente recrutamento da atividade citotóxica de células efetoras de seres humanos e de macaque contra células CHO transfectadas com HER2 de seres humanos e de macaque, respectivamente.Figura 50

[00225] Monitoramento com gel SDS PAGE e transferência Western da purificação da molécula de cadeia simples biespecífica específica de espécie cruzada designada E292F3 x I2C HL. Amostras do eluato, do sobrenadante da cultura de células (SN) e do fluxo através da coluna (FT) Fo]ram analisadas tal como indicado. Um marcador de proteína (M) foi aplicado como referência do tamanho. Uma intensa faixa de proteína com um peso molecular entre 50 e 60 kDa no gel SDS PAGE demonstra uma purificação eficiente da molécula de cadeia simples biespecífica específica de espécie cruzada até um grau muito elevado de pureza com o método de purificação de uma etapa descrito no exemplo 31.2. A transferência Western que detecta o tag de histidina6 confirma a identidade da faixa de proteína no eluato como molécula de cadeia simples biespecífica especifica de espécie cruzada. O sinal fraco para a amostra de fluxo através da amostra neste método de detecção sensível também revela a captura quase completa de moléculas de cadeia simples biespecíficas pelo método de purificação.Figura 51

[00226] Monitoramento com gel SDS PAGE e transferência Western da purificação da molécula de cadeia simples biespecífica específica de espécie cruzada designadaV207C12 HL x H2C HL. As amostras do eluato, do sobrenadante da cultura de células (SN) e do fluxo através da coluna (FT) foram analisadas tal como indicado. Um marcador de proteína (M) foi aplicado como referência do tamanho. Uma intensa faixa de proteína com um peso molecular entre 50 e 60 kDa no gel SDS PAGE demonstra a purificação eficiente da molécula de cadeia simples biespecífica específica de espécie cruzada até um grau muito elevado de pureza com o método de purificação de uma etapa descrito no exemplo 31.2. A transferência Western que detecta o Tag de histidina6 confirma a identidade da faixa de proteína no eluato como molécula de cadeia simples biespecífica específica de espécie cruzada. O sinal fraco para a amostra do fluxo através da amostra neste método de detecção sensível revela a captura quase completa de moléculas de cadeia simples biespecíficas pelo método de purificação.Figura 52

[00227] Monitoramento com gel SDS PAGE e transferência Western da purificação da molécula de cadeia simples biespecífica específica de espécie cruzada designadaAF5HLxF12QHL. As amostras do eluato, do sobrenadante da cultura de células (SN) e do fluxo através da coluna (FT) foram analisadas tal como indicado. Um marcador de proteína (M) foi aplicado como referência do tamanho. Uma intensa faixa de proteína com um peso molecular entre 50 e 60 kDa no gel SDSPAGE demonstra a purificação eficiente da molécula de cadeia simples biespecífica específica de espécie cruzada até um graumuito elevado de pureza com o método de purificação uma etapa descrita no exemplo 31.2. A transferência Western que detecta o Tag de histidina6 confirma a identidade da faixa de proteína no eluato como molécula de cadeia simples biespecífica específica de espécie cruzada. O sinal no fluxo através daamostra neste método de detecção sensível é explicado pela saturação da coluna de afinidade devido à concentração elevadade moléculas de cadeia simples biespecíficas no sobrenadante.Figura 53

[00228] Curva padrão de AF5HLxl2CHL em soro de macaco macaque a 50%. O diagrama superior mostra a curva padrão gerada para o ensaio tal como descrito no exemplo 32.2.

[00229] O diagrama inferior mostra os resultados para amostras de controle da qualidade de AF5HLxl2CHL no soro do macaco macaque a 50%. As taxas da recuperação estão acimade 90% para a amostra de QC alto e médio e acima de 80% paraa amostra de QC baixo. Desse modo, o ensaio permite a detecção de AF5HLxl2CHL em amostras do soro na faixa de 10 ng/ml a 200ng/ml (antes da diluição).Figura 54

[00230] Curva padrão de MCSP-G4 HL x I2C HL em soro de macaco macaque a 50%. O diagrama superior mostra a curva padrão gerada para o ensaio tal como descrito no exemplo 32.2.

[00231] O diagrama inferior mostra os resultados para amostras de controle da qualidade de MCSP-G4 HL x I2C HL no soro de macaco macaque a 50%. As taxas da recuperação estão acima de 98% para a amostra de QC alto e médio e acima de 85% para a amostra de QC baixo. Desse modo, o ensaio permite a detecção de MCSP-G4 HL x I2C HL em amostras do soro na faixa de 10 ng/ml a 200 ng/ml (antes da diluição).Figura 55

[00232] Análise de ligação de FACS de um anticorpo anti-Flag às células CHO transfectadas com 1-27 aminoácidos de N-terminais de CD3 epsilon da espécie designada fundidas a EpCAM de cinomolgo. O tingimento FACS foi executado tal como descrito no exemplo 33.1. As linhas em negrito (realce) representam as células incubadas com o anticorpo anti-Flag. Os histogramas preenchidos refletem os controles negativos. PBS com 2% de FCS foi utilizado como controle negativo. Os histogramas mostram uma ligação forte e comparável do anticorpo anti-Flag a todos os transfectantes, indicando uma expressão forte e igual dos construtos transfectados.Figura 56

[00233] Análise de ligação de FACS do construto I2C IgGI às células CHO que expressam 1-27 aminoácidos de N- terminal de CD3 epsilon da espécie designada fundidas a EpCAM de cinomolgo. O tingimento FACS é executado tal como descrito no exemplo 33.3. As linhas em negrito (realce) representam as células incubadas com 50 μl do sobrenadante da cultura de células das células que expressam o construto I2C IgGI. Os histogramas preenchidos refletem o controle negativo. As células que expressam 1-27 aminoácidos de N-terminal de CD3 epsilon de suínos fundidas a EpCAM de cinomolgo foram utilizadas como controle negativo. Em comparação com o controle negativo, os histogramas demonstram claramente a ligação do construto I2C IgGI a 1-27 aminoácidos de N-terminal de CD3 epsilon de seres humanos, sagüí, tamarino e macaco esquilo.Figura 57

[00234] Análise de ligação de FACS do construto I2C IgGI tal como descrito no exemplo 33.2 a CD3 humano com esem o Tag His6 de N-terminal tal como descrito nos exemplos6.1 e 5.1, respectivamente. As linhas em negrito (realce) representam as células incubadas com o anticorpo CD3 anti- humano UCHT-1, o anticorpo penta-His (Qiagen) e sobrenadante da cultura de células das células que expressam o construto I2C IgGI, respectivamente, tal como indicado. Os histogramas preenchidos refletem as células incubadas com um anticorpo IgG1 de murino irrelevante como controle negativo. As duas sobreposições superiores dos histogramas mostram a ligação comparável do anticorpo UCHT-1 a ambos os transfectantes em comparação ao controle do isotipo que demonstra a expressão de ambos os construtos recombinantes. As sobreposições dos histogramas centrais mostram a ligação do anticorpo pentaHis às células que expressam a cadeia de CD3 epsilon His6-humano(His6-CD3) mas não às células que expressam a cadeia de CD3epsilon do tipo selvagem (WT-CD3). As sobreposições inferiores dos histogramas mostram a ligação do construto I2C IgGI à cadeia de CD3 epsilon humano do tipo selvagem mas não à cadeia de CD3 epsilon de His6-humano. Estes resultados demonstram que um N-término livre é essencial para a ligação da molécula deligação anti-CD3 específica de espécie cruzada I2C à cadeia de CD3 epsilon.Figura 58

[00235] Análise de ligação de FACS de construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designados à células CHO transfectadas com MCSP D3 humano, a linhagem de células CD3+ T humanas HPB-ALL, células CHO transfectadas com MCSP D3 de macaque e a linhagem de células T de macaque 4119 LnPx, respectivamente. O tingimento FACS foi executado tal como descrito no exemplo 17. As linhas em negrito (realce) representam as células incubadas com 2 μg/ml do construto de cadeia simples biespecífico purificado ou do sobrenadante das células que contém o construto de cadeia simples biespecífico, respectivamente. Os histogramas preenchidos refletem os controles negativos. O sobrenadante de células CHO não transfectadas foi utilizado como controle negativo para a ligação às linhagens de células T. Um construto de cadeia simples com especificidade alvo irrelevante foi utilizado como controle negativo para a ligação a células CHO transfectadas com MCSP D3. Para cada construto de cadeia simples biespecífico específico de espécie cruzada, a sobreposição dos histogramas mostra a ligação específico do construto a MCSP D3 de seres humanos e de macaque e a CD3 de seres humanos e de macaque.Figura 59

[00236] Atividade citotóxica induzida pelos construtos de cadeia simples específicos de MCSP D3 específicos de espécies cruzadas designados redirecionados às linhagens de células alvo indicadas. A razão entre as células efetoras e as células alvo também foi utilizada tal como indicado. O ensaio é executado tal como descrito no exemplo 18. Os diagramas demonstram claramente o potente recrutamento específico de espécie cruzada da atividade citotóxica por cada construto.Figura 60

[00237] Análise de ligação de FACS de construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designados às células CHO transfectadas com CD33 humano, a linhagem de células CD3+ T humanas HPB-ALL, células CHO transfectadas com CD33 de macaque e PBMC de macaque, respectivamente. O tingimento FACS foi executado tal como descrito no exemplo 36.2. As linhas em negrito (realce) representam as células incubadas com o sobrenadante da cultura de células das células transfectadas que expressam os construtos de anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas. Os histogramas preenchidos refletem os controles negativos. O sobrenadante de células CHO não transfectadas foi utilizado como controle negativo. Para cada construto de cadeia simples biespecífico específico de espécie cruzada, a sobreposição dos histogramas mostra a ligação específica do construto a CD33 de seres humanos e de macaque e CD de seres humanos e de macaque.Figura 61

[00238] Os diagramas mostram os resultados dos ensaios de liberação de cromo que medem a atividade citotóxica induzida pelos construtos de cadeia simples específicos de CD33 específicos de espécies cruzadas designados redirecionados às linhagens de células alvo indicadas. As células efetoras também foram utilizadas como tal como indicado. Os ensaios são executados tal como descrito no exemplo 36.3. Os diagramas demonstram claramente para cada construto o potente recrutamento da atividade citotóxica das células efetoras de seres humanos e de macaque contra células CHO transfectadas com CD33 de seres humanos e de macaque, respectivamente. Figure 62

[00239] Redistribuição de células T em um chimpanzé sob infusão de bolus intravenosa semanal com PBS/5%de HSA e PBS/5% de HSA mais o construto de anticorpo de cadeia simples bioespecífico de EpCAM/CD3 a doses de 1,6, 2,0, 3,0 e4,5 μg/kg. O tempo da infusão para cada administração do bolus era de duas horas. As setas verticais indicam o começo das infusões de bolus. Os pontos de dados no começo de cada administração de bolus mostram as contagens de células T imediatamente antes do início da infusão de bolus. Cada infusão de bolus do construto de anticorpo de cadeia simples bioespecífico de EpCAM/CD3, que reconhece um epítopo CD3 dependente do contexto convencional, provocou um episódio de redistribuição de células T seguido pela recuperação de células T aos valores de linha base antes da infusão de bolus seguinte.Figura 63

[00240] Análise específica de ELISA CD3 de preparados periplásmicos que contêm fragmentos de proteína scFv etiquetados com Flag de clones selecionados. Os preparados periplásmicos de fragmentos de proteína scFv solúveis foramadicionadas às cavidades de uma placa de ELISA, as quais foram revestidas com a proteína de fusão Fc de CD3 epsilon humano(aa 1-27) e tinham sido bloqueadas adicionalmente com 3% BSAem PBS. A detecção foi executada por um anticorpo etiquetadocom anti-Flag-Biotina monoclonal seguido por estreptavidina conjugada com peroxidase. O ensaio ELISA foi desenvolvido por uma solução de substrato de ABTS. Os valores de OD (eixo y) foram medidos a 405 nm por um leitor de ELISA. Os nomes dos clones são apresentados no eixo x.Figura 64

[00241] Análise de ELISA de preparados periplásmicos que contêm fragmentos de proteína scFv etiquetados com Flag de clones selecionados. Os mesmos preparados periplásmicos de fragmentos de proteína scFv solúveis tal como na figura 63 foram adicionadas às cavidades de uma placa que não foi revestida com proteína de fusão de CD3 epsilon humano (aa 1-27) mas com hulgG1 (Sigma) e bloqueadas com 3% de BSA em PBS.Figura 65

[00242] A detecção foi executada por um anticorpo etiquetado com anti-Flag monoclonal seguido por estreptavidina conjugada com peroxidase. O ensaio ELISA foi desenvolvido por uma solução de substrato de ABTS. Os valores de OD (eixo y) foram medidos a 405 nm por um leitor de ELISA. Os nomes dos clones são apresentados no eixo x.

[00243] Análise de ligação de FACS de construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designados às células CHO transfectadas com CD44 humano, a linhagem de células CD3+ T humanas HPB-ALL, células CHO transfectadas com CD44 de macaque e a linhagem de células T de macaque 4119 LnPx, respectivamente. As células CHO transfectadas com CD44delv6 humano foram utilizadas como controle para enfatizar a especificidade de construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designados a CD44. O tingimento FACS é executado tal como descrito no exemplo 39.3. As linhas em negrito (realce) representam as células incubadas com o sobrenadante das células que contém o construto de cadeia simples biespecífico. Os histogramas preenchidos refletem os controles negativos. O sobrenadante de células CHO não transfectadas foi utilizado como controle negativo para a ligação às linhagens de células T. Um construto de cadeia simples com especificidade alvo irrelevante foi utilizado como controle negativo para a ligação às células CHO transfectadas com CD44 e CD44delv6. Para cada construto de cadeia simples biespecífico específico de espécie cruzada, a sobreposição dos histogramas mostra a ligação específico do construto a CD44 de seres humanos e de macaque e CD3 de seres humanos e de macaque. A sobreposição dos histogramas para cada construto não mostra nenhuma ligação específica a células CHO transfectadas com CD44delv6 humano.Figura 66

[00244] Atividade citotóxica induzida pelos construtos de cadeia simples específicos de CD44 específicos de espécies cruzadas designados redirecionados à linhagem de células alvo indicadas. A razão entre as células efetoras e as células alvo também foi utilizada tal como indicado. O ensaio é executado tal como descrito no exemplo 39.4. Os diagramas demonstram claramente a potência da citotoxicidade de mediação por cada um dos construtos biespecíficos.Figura 67

[00245] Análise de ligação de FACS de construtos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas designados tal como descrito no exemplo 41.Figura 68

[00246] Atividade citotóxica induzida por moléculas de ligação específicas de espécies cruzadas designadas tal como descrito no exemplo 41.

[00247] A presente invenção também é descrita pelos seguintes exemplos não limitadores ilustrativos que oferecem uma compreensão melhor da presente invenção e de suas muitas vantagens.

EXEMPLOS 1. Identificação das seqüências de CD3 epsilon das amostras de sangue de primatas não-humanos

[00248] As amostras de sangue dos seguintes primatas não-humanos foram utilizadas para a identificação de CD3 epsilon: Callithrix jacchus, Saguinus oedipus e Saimiri sciureus. As amostras de sangue inteiro frescas tratadas com heparina foram preparadas ao isolar o RNA celular total de acordo com o protocolo do fabricante (QIAamp RNA Blood Mini Kit, Qiagen). O mRNA extraído foi transcrito ao DNA de acordo com protocolos publicados. Resumidamente, 10 μl do RNA precipitado foram incubados com 1,2 μl da mistura de 10x hexanucleotídeo (Roche) a 70°C por dez minutos e foram armazenados em gelo. Uma mistura de reação que consiste em 4 μl de 5x o tampão do sobrescrito Il, 0,2 μl de 0,1M de ditiotreitol, 0,8 μl do sobrescrito II (Invitrogen), 1,2 μl de trifosfato de desoxirribonucleosídeo (25 μM), 0,8 μl do inibidor de RNase (Roche) e 1,8 μl de DNase e RNase livres de água (Roth) foram adicionados. A mistura de reação foi incubada à temperatura ambiente por dez minutos seguida pela incubaçãoa 42°C por cinquenta minutos e a 90°C por cinco minutos. A reação foi refrigerada em gelo antes de adicionar 0,8 μl deRNaseH (1 U/μl, Roche) e foi incubada por vinte minutos a 37°C.

[00249] Os cDNAs de cordão simples de cada espécie foram submetidos às reações em cadeia e polimerase de 35 ciclos separadas ao utilizar Taq DNA polymerase (Sigma) e a seguinte combinação de primer foi projetada na pesquisa do banco de dados: primer de avanço 5'-AGAGTTCTGGGCCTCTGC-3’ (SEQ ID NO.: 377); primer reverso 5'-CGGATGGGCTCATAGTCTG-3’ (SEQ ID NO.: 378). As faixas de 550 bp amplificadas foram purificadas com gel (Gel Extraction Kit, Qiagen) e seqüenciadas (Sequiserve, Vaterstetten/Alemanha, vide a liestágiom da seqüência).Callithrix jacchusNucleotídeosCAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAG GAACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTCGTAAATAGTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGACTTTTCGGAAATGGAGCAAAGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGATAminoácidosQDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQ SGYYACLSKETPAEEASITYLYLKARVCENCVEVDCD3epsilon Saquinus oedipus NucleotídeosCAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGGAACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTTGTAAATAGTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGATTTTTCGGAAATGGAGCAAAGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTA CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGATAminoácidosQDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEME Q SGYYACLSKETPAEEASITYLYLKARVCENCVEVDCD3epsilon Saimiris ciureus NucleotídeosCAGGACGGTAATGAAGAGATTGGTGATACTACCCAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAG GAACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACAGGAAATAAAATGGCTCGTAAAT GATCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAAGATTTTTCAGAAATGGAACA AAGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACCCCCACAGAAGAGGCGAGCCATTATCCTA CCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGATAminoácidosQDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGQEIKWLVNDQNKEGHEDHLLLEDFSEME Q SGYYACLSKETPTEEASITYLYLKARVCENCVEVD2. Geração dos fragmentos do anticorpo de cadeia simples específicos de espécies cruzadas (scFv) que se ligam aos aminoácidos 1-27 de N-terminal de CD3 epsilon de homem e de primatas não-chimpanzés diferentes.2.1 Imunização dos camundongos que utilizam o N- término de CD3 epsilon separado de seu contexto de CD3 nativo pela fusão a uma proteína solúvel heteróloga.

[00250] Camundongos F1 com dez semanas de idade docruzamento de balb/c x C57black foram imunizados com a proteína de fusão de Fc de CD3 epsilon que contém a maior parte dosaminoácidos 1-27 de N-terminal da cadeia madura de CD3 epsilon (CD3-Fc 1-27) de humano e/ou de Saimiri sciureus. Para esta finalidade, 40 μg da proteína de fusão de CD3-Fc 1-27 com 10 nmol de um oligonucleotídeo de CpG modificado por tioato (5'- TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’) em 300 ul de PBS foram injetados por camundongo intraperitonealmente. Os camundongos recebem imunizações de reforço após 21, 42 e opcionalmente 63 dias damesma maneira. Dez dias após a primeira imunização de reforço, as amostras de sangue foram tiradas e o título do soro do anticorpo contra a proteína de fusão de CD3-Fc 1-27 foi testado por ELISA. Além disso, o título contra a linhagem de células T humanas CD3 positivas HPBall foi testado na citometria de fluxo de acordo com protocolos padrão. Os títulos do soro eram significativamente mais elevados nos animais imunizados do que nos animais não-imunizados.2.2 Geração de uma biblioteca de anticorpo de scFv murino imune: Construção de uma biblioteca de anticorpo combinatória e de uma exposição de fago

[00251] Três dias após a última injeção, as células de baço de murinos foram colhidas para a preparação do RNA total de acordo com protocolos padrão.

[00252] Uma biblioteca de fragmentos de DNA da região variável (VK) de cadeia leve (kappa) de imunoglobulina (Ig) de murino e da região variável (VH) de cadeia pesada de Ig foi construída por RT-PCR no RNA murino do baço ao utilizar o primer específico de VK e VH. O cDNA foi sintetizado de acordo com protocolos padrão.

[00253] Os primers foram projetados de maneira a causar o surgimento de um sítio de reconhecimento 5'-Xhol e 3'-BstEll para os fragmentos de V de cadeia pesada amplificados e a um sítio de reconhecimento 5'-Sacl e 3'-Spel para os fragmentos de DNA de VK amplificados.

[00254] Para a amplificação de PCR dos fragmentos de DNA de VH, oito primers da família 5’-VH específicos diferentes (MVHI(GC)AG GTG CAG CTC GAG GAG TCA GGA CCT; MVH2 GAG GTC CAG CTC GAG CAG TCT GGA CCT; MVH 3 CAG GTC CAA CTC GAG CAG CCT GGG GCT; MVH4 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGG GCA; MVH5 GA(AG) GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGA GGA; MVH6 GAG GTG AAG CTT CTC GAG TCT GGA GGT; MVH7 GAA GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGGGGA; MVH8 GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT) foram cada umcombinados com um primer de 3'-VH (3'MuVHBstEII tga gga gac ggt gac cgt ggt ccc ttg gcc cca g); para a amplificação de PCRdos fragmentos de cadeia VK, sete primers da família 5'-VKespecíficos diferentes (MUVK1 CCA GTT CCG AGC TCG TTG TGA CTCAGG AAT CT; MUVK2 CCA GTT CCG AGC TCG TGT TGA CGC AGC CGC CC;MUVK3 CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA; MUVK4 CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA; MUVK5 CCA GAT GTG AGCTCG TGA TGA CCC AGA CTC CA; MUVK6 CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGACCC AGT CTC CA; MUVK7 CCA GTT CCG AGC TCG TGA TGA CAC AGT CTCCA) foram cada um combinados com um primer de 3’-VK (3'MuVkHindlll/BsiW1 tgg tgc act agt cgt acg ttt gat etc aag ctt ggt ccc).

[00255] O seguinte programa de PCR foi utilizado para a amplificação: desnaturação a 94°C por vinte segundos; recozimento de primer a 52°C por cinquenta segundos e extensão de primer a 72°C por sessenta segundos e quarenta ciclos, seguido por uma extensão final de dez minutos a 72°C.

[00256] 450 ng dos fragmentos de cadeia leve dekappa (digeridos com Sacl-Spel) foram ligados com 1.400 ng do fagomídeo pComb3H5Bhis (digerido com Sacl-Spel; fragmento grande). A biblioteca de anticorpo combinatória resultante foi então transformada em 300 ul de células Blue de Escherichia coli XL1 eletrocompetentes por eletroporação (2,5 kV, cubeta com abertura de 0,2 cm, 25 uFD, 200 ohms, pulsador de gene da Biorad), resultando em um tamanho da biblioteca de mais do que 107 clones independentes. Após uma hora da expressão do fenótipo, os transformantes positivos foram selecionados para a resistência à carbenicilina codificada pelo vetor de pComb3H5BHis em 100 ml da cultura de caldo de carne super (SB) líquido até a manhã seguinte. As células foram então colhidas por centrifugação e a preparação do plasmídeo foi levada a efeito ao utilizar um kit de preparação de plasmídeo comercialmente disponível (Qiagen).

[00257] 2.800 ng deste DNA de plasmídeo que contéma biblioteca de VK (digerido com Xhol-BstEll; fragmento grande) foram ligados com 900 ng dos fragmentos V de cadeia pesada (digerido com Xhol-BstEll) e transformados outra vez em duas alíquotas de 300 μl de células XL1 Blue de E. colieletrocompetentes por eletroporação (2,5 kV, cubeta com abertura de 0,2 cm, 25 uFD, 200 ohms), resultando em um tamanho total da biblioteca de scFv de VH-VK (fragmento variável de cadeia simples) de mais do que 107 clones independentes.

[00258] Após a expressão do fenótipo e a adaptação lenta à carbenicilina, as células de E. coli que contêm a biblioteca de anticorpo foram transferidas no meio de seleção de SB-Carbenicilina (50 ug/ml). As células de E. coli quecontêm a biblioteca de anticorpo foram então infectadas com uma dose infecciosa de 1012 partículas do fago assistenteVCSM13, resultando em a produção e a secreção do fago M13filamentoso, em que a partícula de fago contém um DNApComb3H5BHis de cordão simples que codifica um fragmento de scFv murino e exibiu a proteína de scFv correspondente como uma fusão translacional à proteína de cobertura do fago III. Este agrupamento de fagos que exibem a biblioteca do anticorpo foi utilizado posteriormente para a seleção de entidades de ligação do antígeno.2.3 Seleção com base na exposição de fago de aglutinantes específicos de CD3

[00259] A biblioteca de fago que contém o repertório de scFv clonado foi colhida do sobrenadante da cultura respectivo pela precipitação e centrifugação de PEG8000/NaCl. Aproximadamente 1011 a 1012 partículas de fago de scFv foram ressuspensas em 0,4 ml de PBS/0,1% de BSA e incubadas com 105 a 107 células de Jurkat (uma linhagem de células T humanas de CD3 positivas) por 1 hora em gelo sob agitação lenta. Estas células de Jurkat cresceram antecipadamente no meio de RPMI enriquecido com soro fetal de vitela (10%), glutamina e penicilina/estreptomicina, foram colhidas por centrifugação, lavadas em PBS e ressuspensas em PBS/1% de FCS (contendo azida sódica). O fago de scFv que não se liga especificamente às células de Jurkat foi eliminado em até cinco etapas de lavagem com PBS/1% de FCS (contendo azida sódica). Após a lavagem, as entidades de ligação foram eluídas a partir das células ao ressuspender as células em HCI-glicina ao pH 2,2 (uma incubação de dez minutos com turbilhonamento subseqüente) e após a neutralização com 2 M de Tris ao pH 12, o eluato foi utilizado para a infecção de uma cultura de células XL1 Blue frescas não-infectadas (OD600 > 0,5). A cultura de E. coli que contém células de E. coli transduzidas com sucesso com uma cópia do fagomídeo, codificando um fragmento de scFv humano, foi selecionada outra vez para a resistência à carbenicilina e infectada subseqüentemente com o fago assistente de VCMS 13 para iniciar a segunda rodada de exposição do anticorpo e a seleção in vitro. Um total de quatro a cinco rodadas de seleções foi levado a efeito, normalmente. 2.4 Seleção para aglutinantes específicos de CD3

[00260] O DNA do plasmídeo que corresponde a quatro e cinco rodadas de bateia foi isolado das culturas de E. coli após a seleção. Para a produção da proteína de scFv solúvel, os fragmentos do DNA de VH-VL foram removidos dos plasmídeos(Xhol-Spel). Estes fragmentos foram clonados através dos mesmos sítios de restrição no plasmídeo pComb3H5BFlag/His quedifere do pComb3H5BHis original pelo fato de que o construto de expressão (por exemplo, scFv) inclui um Flag-tag (TGD YKDDDDK) entre scFv e His6-tag, e as proteínas de fago adicionais foram suprimidas. Após a ligação, cada agrupamento (diferentes rodadas de bateia) do DNA do plasmídeo foi transformado em 100 μl das células XL1 Blue ou TG1 de E. coli competentes de choque térmico e chapeado em LB-ágar de carbenicilina. As colônias únicas foram escolhidas em 100 ul de LB carb (50 μg/ml).

[00261] E. coli transformado com pComb3H5BHis contendo um segmento de VL e VH produz o scFv solúvel em quantidades suficientes após a excisão do fragmento do gene III e a indução com 1 mM de IPTG. Devido a uma seqüência de sinal apropriada, a cadeia de scFv foi exportada no periplasma onde se dobra em uma conformação funcional.

[00262] Colônias bacterianas simples de E. coli TG1 das placas de transformação foram escolhidas para preparados periplasmáticos em pequena escala e cresceram no meio de SB (por exemplo, 10 ml) suplementadas com 20 mM de MgCl2 e 50 μg/ml de carbenicilina (e novamente dissolvidas em PBS (por exemplo, 1 ml) após a colheita. Por quatro rodadas de congelamento a -70°C e de descongelamento a 37°C, a membrana externa das bactérias foi destruída por choque de temperatura e as proteínas periplasmáticas solúveis incluindo os scFvs foram liberadas no sobrenadante. Após a eliminação das células intactas e os fragmentos de células por centrifugação, o sobrenadante que contém CD3-scFvs anti-humanos seres humanos foi coletado e utilizado para um exame adicional.2.5 . Identificação de aglutinantes específicos de CD3

[00263] A ligação dos scFvs isolados foi testada pela citometria de fluxo nas células eucarióticas, que em sua superfície expressam uma proteína heteróloga que indica em seu N-término os primeiros 27 aminoácidos de N-terminal de CD3 epsilon.

[00264] Tal como descrito no Exemplo 4, os primeiros aminoácidos 1-27 da seqüência de N-terminal da cadeia CD3 epsilon madura do complexo receptor de células T humanas(seqüência de aminoácido: QDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILT) foram fundidos ao N-término da proteína EpCAM de transmembrana, demodo que o N-término se situou na superfície externa da célula. Além disso, um epítopo de FLAG foi introduzido entre a seqüência de N-terminal 1-27 de CD3 epsilon e a seqüência deEpCAM. Este produto da fusão foi expresso nas células de rimembrionário humanas (HEK) e nas células de ovário do hamster chinês (CHO).

[00265] As células eucarióticas que indicam os 27 aminoácidos de N-terminal de CD3 epsilon maduro de outras espécies de primata foram preparadas do mesmo modo para Saimiri sciureus (macaco esquilo) (seqüência de aminoácido de N- terminal de CD3 epsilon: QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLT), para Callithrix jacchus (seqüência de aminoácido de N-terminal de CD3 epsilon: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT) e para Saguinusoedipus (seqüência de aminoácido de N-terminal de CD3 epsilon: QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLT).

[00266] Para a citometria de fluxo, 2,5x105 células são incubadas com o sobrenadante de 50 ul ou com 5 μg/ml dos construtos purificados em 50 μl de PBS com 2% de FCS. A ligação dos construtos foi detectada com o anticorpo anti-His (PentaHis Antibody, livre de BSA, Qiagen GmbH, Hilden, FRG) em 2 μg/ml em 50 μl de PBS com 2% de FCS. Como um segundo reagente da etapa, foi utilizado um fragmento de F(ab')2 purificado por afinidade conjugado a R-Phycoerythrin, IgG anti-camundongo de cabra (específico do fragmento de Fc-gama), diluído 1:100 em 50 μl de PBS com 2% de FCS (Dianova, Hamburgo, FRG). As amostras foram medidas em um FACSscan (BD Biosciences, Heidelberg, FRG).

[00267] A ligação foi sempre confirmada por citometria de fluxo tal como descrito no parágrafo antecedente em células T primárias de seres humanos e de primatas diferentes (por exemplo, de Saimiri sciureus, Callithrix jacchus, Saguinus oedipus).2.6 Geração de equivalentes seres humanos/humanizados de scFvs específicos de CD3 epsilon não- humanos

[00268] A região de VH de scFv anti-CD3 de murino foi alinhada contra as seqüências de aminoácido da linhagem de embrião do anticorpo humano. A seqüência de VH da linhagem de embrião do anticorpo humano foi escolhida, a qual tem a homologia mais próxima a VH não-humana e um alinhamento direto das duas seqüências de aminoácido foi executado. Havia uma série de resíduos da estrutura de VH não-humana que diferem das regiões da estrutura de VH humanas ("posições de estrutura diferentes"). Alguns destes resíduos podem contribuir para a ligação e a atividade do anticorpo a seu alvo.

[00269] Para construir uma biblioteca que contém CDRs de murinos e em cada posição da estrutura que difere da seqüência de VH humana escolhida, ambas as possibilidades (o resíduo de aminoácido humano e murino maternal), os oligonucleotídeos degenerados foram sintetizados. Estes oligonucleotídeos incorporam, em posições diferentes, o resíduo humano com uma probabilidade de 75% e o resíduo murino com uma probabilidade de 25%. Para uma VH humana, por exemplo, seis destes oligonucleotídeos tiveram que ser sintetizados, os quais se sobrepõem em uma extensão terminal de aproximadamente vinte nucleotídeos. Para esta finalidade, cada segundo primer era um primer anti-sentido.

[00270] Os sítios de restrição necessários para uma clonagem posterior dentro dos oligonucleotídeos foram suprimidos.

[00271] Estes primers podem ter um comprimento de 60 a 90 nucleotídeos, dependendo do número de primers que são necessários para transpor a seqüência de V inteira.

[00272] Por exemplo, estes seis primers foram misturados em quantidades iguais (por exemplo, 1 μl de cada primer (estoques de primer de 20 a 100 μM) a uma reação de PCRde 20 μl) e adicionados a uma mistura de PCR que consiste em tampão de PCR, nucleotídeos e Taq polimerase. Esta mistura foiincubada a 94°C por três minutos, a 65°C por um minuto, a 62°Cpor um minuto, a 59°C por um minuto, a 56°C por um minuto, a 52°C por um minuto, a 50°C por um minuto e a 72°C por dezminutos em um ciclador de PCR. O produto foi executado subseqüentemente em uma eletroforese em gel de agarose e o produto com um tamanho de 200 a 400 foi isolado do gel de acordo com métodos padrão.

[00273] Este produto de PCR foi então utilizado como um molde para uma reação padrão de PCR ao utilizar os primers que incorporam sítios de restrição de clonagem apropriados de N-terminal e de C-terminal. O fragmento do DNA do tamanho correto (para uma VH com aproximadamente 350 nucleotídeos) foi isolado pela eletroforese em gel de agarose de acordo com métodos padrão. Dessa maneira, o fragmento de DNA de VH suficiente foi amplificado. Este fragmento de VH era agora um agrupamento de fragmentos de VH que tem uma quantidade diferente de resíduos seres humanos e murinos em posições diferentes da estrutura respectivas (agrupamento de VH humanizado). O mesmo procedimento foi executado para a região de VL de scFv anti-CD3 de murino (agrupamento de VL humanizado).

[00274] O agrupamento de VH humanizado foi então combinado com o agrupamento de VL humanizado no vetor de exposição de fago pComb3H5Bhis para formar uma biblioteca de scFvs funcionais a partir da qual, após a exposição no fago filamentoso, os aglutinantes anti-CD3 foram selecionados, examinados, identificados e confirmados tal como descrito acima para scFv anti-CD3 (murino) não-humano parental. Os clones simples foram então analisados quanto às propriedades favoráveis e à seqüência de aminoácido.

[00275] Os scFvs que eram mais próximos em homologia da seqüência de aminoácido aos segmentos de V da linhagem de embrião seres humanos são particularmente preferidos àqueles em que pelo menos uma CDR dentre a CDR I e II de VH e a CDR I e II de VL kappa ou a CDR I e II de VL lambda mostram a identidade da seqüência de aminoácido maior do que 80% à CDR respectiva mais próxima de todos os segmentos de V da linhagem de embrião seres humanos. Os scFvs anti-CD3 foram convertidos em anticorpos de cadeia simples biespecíficos recombinantes tal como descrito nos seguintes exemplos 10 e 16 e foram adicionalmente caracterizados.3. Geração de uma proteína de fusão recombinante dos aminoácidos 1-27 de N-terminal da cadeia CD3 epsilon humana fundida à parte Fc de uma IgG1 (CD3-Fc 1-27).3.1 . Clonagem e expressão de CD3-Fc 1-27

[00276] A seqüência de codificação dos aminoácidos 1-27 de N-terminal da cadeia CD3 epsilon humana fundida à região de dobradiça e à região gama de Fc de imunoglobulina humana IgG1 bem como um Tag de histidina 6 foram obtidos pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão (a seqüência de cDNA e a seqüência de aminoácido da proteína de fusão recombinante são relacionadas sob as SEQ ID NO. 350 e 349). O fragmento da síntese de genes foi projetado para conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido por um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, seguido no quadro pela seqüência de codificação dos primeiros 27 aminoácidos da porção extracelular da cadeia CD3 epsilon de humano madura, seguido no quadro pela seqüência de codificação da região de dobradiça e pela porção gama de Fc de IgG1 humana, seguido no quadro pela seqüência de codificação de um Tag de histidina 6 e de um códon de interrupção (Figura 1). O fragmento da síntese de genes também foi projetado para introduzir sítios de restrição no início e no fim da codificação de cDNA para a proteína de fusão. Os sítios de restrição introduzidos, EcoRl na extremidade 5' e Sall na extremidade 3’ são utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado através de EcoRl e Sall em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) seguindo osprotocolos padrão. Uma seqüência verificou que o plasmídeo foi utilizado para a transfecção no FreeStyle 293 Expression System (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemanha) de acordo com os protocolos do fabricante. Após três dias, os sobrenadantes da cultura de células dos transfectantes foram colhidos e testados quanto à presença do construto recombinante em um ensaio deELISA. A IgG anti-humana de cabra, anticorpo específico do fragmento de Fc-gama (obtida junto à Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, Reino Unido) foi diluída em PBS a 5 μg/ml e revestida com 100 μl por cavidade em uma placa de ELISA de 96 cavidades MaxiSorp (Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Alemanha) até a manhã seguinte a 4°C. As cavidades foram lavadas com PBS com 0,05% de Tween 20 (PBS/Tween) e obstruídas com 3% de BSA em PBS (albumina bovina, fração V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) por sessenta minutos à temperatura ambiente (RT). Subseqüentemente, as cavidades foram lavadas com PBS/Tween outra vez e foram então incubadas com os sobrenadantes da cultura de células por sessenta minutos à temperatura ambiente. Após a lavagem, as cavidades foram incubadas com um anticorpo anti-His6 conjugado à peroxidase (Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) diluídas 1:500 em PBS com 1% de BSA por sessenta minutos à temperatura ambiente. Subseqüentemente, as cavidades foram lavadas com 200 μl de PBS/Tween e 100 μl de SIGMAFAST OPD (solução de substrato de SIGMAFAST OPD [dicloridreto de o-fenilenodiamina] (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) foram adicionados de acordo com os protocolos do fabricante. A reação foi interrompida pela adição de 100 μl de 1M de H2SO4. A reação de cor foi medida em um espectrofotômetro de microplaca PowerWaveX (BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, USA) em 490 nm e a subtração da absorção de base em 620 nm. Conforme mostrado na Figura 2, a presença do construto em comparação ao sobrenadante irrelevante das células 293 de HEK transfectadas de simulação utilizadas como o controle negativo era claramente detectável.3.2 Ensaio de ligação de anticorpos de cadeia simples específicos de espécies cruzadas a CD3-Fc 1-27.

[00277] A ligação de preparados brutos dos anticorpos de cadeia simples específicos de espécies cruzadasperiplasmaticamente expressos específicos para o CD3 epsilona CD3-Fc 1-27 foi testada em um ensaio de ELISA. A IgG anti-humana de cabra, anticorpo específico do fragmento de Fc-gama(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, Reino Unido) foi diluída em PBS a 5 μg/ml e revestida com 100 μl por cavidade em uma placa de ELISA de 96 cavidades MaxiSorp (Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Alemanha) até a manhã seguinte a 4°C. As placas foram lavadas com PBS com 0,05% de Tween 20 (PBS/Tween) e obstruídas com PBS com 3% de BSA (albumina bovina, fração V, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) por sessenta minutos à temperatura ambiente. Subseqüentemente, as cavidades foram lavadas com PBS/Tween e incubadas com os sobrenadantes das células que expressam o construto de CD3-Fc 1-27 por sessenta minutos à temperatura ambiente. As cavidades foram lavadas com PBS/Tween e incubadas com os preparados brutos de anticorpos de cadeia simples específicos de espécies cruzadas periplasmaticamente expressos tal como descrito acima por sessenta minutos à temperatura ambiente. Após a lavagem com PBS/Tween, as cavidades foram incubadas com o anticorpo M2 anti-Flag conjugado à peroxidase (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) diluídas 1:10000 em PBS com 1% de BSA por sessenta minutos à temperatura ambiente. As cavidades foram lavadas com PBS/Tween e incubadas com 100 μl de SIGMAFAST OPD (a solução de substrato de OPD [dicloridreto de o-fenilenodiamina] (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) de acordo com os protocolos do fabricante. A reação de cor foi interrompida com 100 μl de H2SO4 1M e medida em um espectrofotômetro de microplacaPowerWaveX (BioTek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, USA) em 490 nm e a subtração da absorção de base em 620 nm. Uma forte ligação dos anticorpos de cadeia simples seres humanos específicos de espécies cruzadas específicos para o CD3 epsilon ao construto de CD3-Fc 1-27 comparada a um anticorpo de cadeia simples anti-CD3 murino foi observada (Figura 3).4. Geração das proteínas de fusão de transmembrana recombinantes dos aminoácidos 1-27 de N-terminal de CD3 epsilon dos primatas não-chimpanzés diferentes fundidas a EpCAM de macaco cinomolgo (CD3-EpCAM 1-27).4.1 . Clonagem e expressão de CD3-EpCAM 1-27

[00278] O CD3 epsilon foi isolado dos primatas não- chimpanzés diferentes (sagüi, tamari, macaco esquilo) e dos suínos. As seqüências de codificação dos aminoácidos 1-27 de N-terminal da cadeia CD3 epsilon de humano madura, sagüi comum (Callithrix jacchus), tamari cottontop (Saguinus oedipus), macaco esquilo comum (Saimiri sciureus) e suínos domésticos (Sus scrota; utilizados como o controle negativo) fundidas ao N-término de EpCAM de cinomolgo etiquetada de Flag foram obtidas pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão. A seqüência de cDNA e a seqüência de aminoácido das proteínas de fusão recombinantes são relacionadas sob as SEQ ID NO. 351 a 360). Os fragmentos da síntese de genes foram projetados de modo a conter primeiramente um sítio de BsrGl para permitir a fusão no quadro de leitura correto com a seqüência de codificação de um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19 já presente no vetor de expressão alvo, que é seguida no quadro pela seqüência de codificação dos aminoácidos de N-terminal 1-27 da porção extracelular das cadeias CD3 epsilon maduras, que é seguida no quadro pela seqüência de codificação de um Tag de Flag e seguida no quadro pela seqüência de codificação da proteína de transmembrana de EpCAM de cinomolgo (Figura 4). Os fragmentos da síntese de genes também foram projetados para introduzir um sítio de restrição no fim da codificação de cDNA para a proteína de fusão. Os sítios de restrição BsrGl introduzidos na extremidade 5' e Sall na extremidade 3’ foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. Os fragmentos da síntese de genes foi então clonado através de BsrGl e Sall em um derivado de plasmídeo designado pEF DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025), que já continha a seqüência de codificação do peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19 seguindo os protocolos padrão. A seqüência verificou que os plasmídeos foram utilizados para transfectar transientemente as células 293 de HEK ao utilizar o reagente MATra-A (IBA GmbH, Gottingen, Alemanha) e 12 μg do DNA do plasmídeo para as células 293 de HEK aderentes em frascos de cultura de células de 175 ml de acordo com os protocolos do fabricante. Após três dias da cultura de células, os transfectantes foram testados quanto à expressão da superfície celular da proteína de transmembrana recombinante através de um ensaio de FACS de acordo com protocolos padrão. Para essa finalidade, um número de 2,5x105 células foram incubadas com o anticorpo M2 anti-Flag (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) em 5 μg/ml em PBS com 2% de FCS. O anticorpo ligado foi detectado com um fragmento F(ab')2 purificado por afinidade conjugado a R-ficoeritrina, IgG anti- camundongo de cabra, fragmento de Fc-gama específico de 1:100 em PBS com 2% de FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, Reino Unido). As amostras foram medidas em um FACScalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). A expressão das proteínas de fusão de transmembrana recombinantes etiquetadas de Flag que consistem em EpCAM de cinomolgo e os aminoácidos 1-27 de N-terminal da cadeia CD3 epsilon de humano, sagüi, tamari, macaco esquilo e suínos, respectivamente, nas células transfectadas, era claramente detectável (Figura 5).4.2 Ligação dos anticorpos de cadeia simples anti- CD3 específicos de espécies cruzadas a CD3-EpCAM 1-27

[00279] A ligação dos preparados brutos de anticorpos de cadeia simples anti-CD3 específicos de espécies cruzadas periplasmaticamente expressos aos aminoácidos 1-27 de N-terminal da cadeia CD3 epsilon de humano, sagüi, tamari e macaco esquilo fundida respectivamente a EpCAM de cinomolgo foi testada em um ensaio de FACS de acordo com protocolos padrão. Com essa finalidade, um número de 2,5x105 células foram incubadas com os preparados brutos de anticorpos de cadeia simples anti-CD3 específicos de espécies cruzadas periplasmaticamente expressos (o preparado foi executado tal como descrito acima e de acordo com os protocolos padrão) e um anticorpo de cadeia simples CD3 anti-humano murino como o controle negativo. Tal como o anticorpo secundário, o anticorpo Penta-His (Qiagen GmbH, Hildesheim, Alemanha) foi utilizado em 5 μg/ml em 50 μl de PBS com 2% de FCS. A ligação do anticorpo foi detectada com um fragmento F(ab’)2 purificado por afinidade conjugado a R-ficoeritrina, IgG anti-camundongo de cabra, específica do fragmento de Fc-gama, diluída 1:100 em PBS com 2% de FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, Reino Unido). As amostras foram medidas em um FACScalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). Conforme mostrado na Figura 6 (A a E), a ligação dos anticorpos de cadeia simples aos transfectantes que expressam as proteínas de fusão de transmembrana recombinantes que consistem nos aminoácidos 1-27 de N-terminal de CD3 epsilon de humano, sagüi, tamari ou de macaco esquilo fundida a EpCAM de cinomolgo foi observada. Nenhuma ligação dos anticorpos de cadeia simples específicos de espécies cruzadas foi observada a uma proteína de fusão que consiste em CD3 epsilon 1-27 de N-terminal de suíno fundida a EpCAM de cinomolgo utilizado como o controle negativo. A especificidade de espécies cruzadas de primatas múltiplos dos anticorpos de cadeia simples anti-CD3 foi mostrada. Os sinais obtidos com o anticorpo M2 anti-Flag e os anticorpos de cadeia simples específicos de espécies cruzadas eram comparáveis, indicando uma atividade de forte ligação dos anticorpos de cadeia simples específicos de espécies cruzadas aos aminoácidos 1-27 de N-terminal de CD3 epsilon.5. Análise de ligação dos anticorpos de cadeia simples anti-CD3 específicos de espécies cruzadas pela varredura de alanina das células de camundongo transfectadas com a cadeia CD3 epsilon humana e seus mutantes de alanina5.1 Clonagem e expressão de CD3 epsilon do tipo selvagem humano

[00280] A seqüência de codificação da cadeia CD3 epsilon humana foi obtida pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão (a seqüência de cDNA e a seqüência de aminoácido da cadeia CD3 epsilon humana são relacionadas sobas SEQ ID NO. 362 e 361). O fragmento da síntese de genes foiprojetado de modo a conter um sítio de Kozak para a expressãoeucariótica do construto e dos sítios de restrição no inícioe no fim da codificação de cDNA para o CD3 epsilon humano. Os sítios de restrição EcoRl introduzidos na extremidade 5' e Sall na extremidade 3’ foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foientão clonado através de EcoRl e Sall em um plasmídeo designado pEF NEO seguindo os protocolos padrão. O pEF NEO foi derivadode pEF DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995)7021-7025) ao substituir o DNA de DHFR pelo DNA de resistência à neomicina pela clonagem molecular convencional. Uma seqüência verificou que o plasmídeo foi utilizado para transfectar a linhagem de células T EL4 de murinos (ATCC N°. TIB-39) cultivada em RPMI com L-glutamina estabilizada suplementada com 10% de FCS, 1% de penicilina/estreptomicina,1% de HEPES, 1% de piruvato, 1% de aminoácidos não-essenciais(todos junto à Biochrom AG Berlin, Alemanha) a 37°C, 95% deumidade e 7% de CO2. A transfecção foi executada com SuperFectTransfection Reagent (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) e 2 μg doDNA do plasmídeo de acordo com o protocolo do fabricante. Após 24 horas, as células foram lavadas com PBS e cultivadas outravez no meio de cultura acima mencionado com 600 μg/ml de células G418 para a seleção (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Áustria). Dezesseis a vinte dias após a transfecção, o crescimento de células resistentes foi observado. Após mais sete a catorze dias, as células foram testadas quanto à expressão de CD3 epsilon humano pela análise de FACS de acordo com protocolos padrão. 2,5x105 células foram incubadas com o anticorpo CD3 anti-humano UCHT-1 (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha) em 5 μg/ml em PBS com 2% de FCS. A ligação do anticorpo foi detectada com um fragmento F(ab’)2 purificado por afinidade conjugado a R-ficoeritrina, IgG anti-camundongo de cabra, específico do fragmento de Fc-gama, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, Reino Unido). As amostras foram medidas em um FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). A expressão de CD3 do tipo selvagem humano nas células EL4 transfectadas é mostrada na Figura 7.5.2 Clonagem e expressão dos anticorpos de cadeia simples anti=CD3 específicos de espécies cruzadas como os anticorpos de IgG1

[00281] A fim de prover um dispositivo de detecção da ligação aprimorado dos anticorpos de cadeia simples anti- CD3 específicos de espécies cruzadas de H2C, A2J HLP e E2M HLP foram convertidos nos anticorpos de IgG1 com IgG1 de murino e as regiões constantes lambda humanas. As seqüências de cDNA que codificam as cadeias pesada e leve dos anticorpos de IgG respectivos foram obtidas pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão. Os fragmentos da síntese de genes para cada especificidade foram projetados de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para permitir a expressão eucariótica do construto, que é seguido por um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19 (SEQ ID NO. 364 e 363), que é seguida no quadro pela seqüência de codificação da região variável de cadeia pesada respectiva ou da região variável de cadeia leve respectiva, seguida no quadro pela seqüência decodificação da região constante de cadeia pesada de IgG1 demurino (SEQ ID NO. 366 e 365) ou pela seqüência de codificação da região constante de cadeia leve de lambda humana (ID SEQ NO. 368 e 367), respectivamente. Os sítios de restrição foram introduzidos no início e no fim da codificação de cDNA para aproteína de fusão. Os sítios de restrição EcoRl na extremidade5' e Sall na extremidade 3' foram utilizados para os seguintes procedimentos de clonagem. Os fragmentos da síntese de genesforam clonados através de EcoRl e Sall em um plasmídeo designado pEF DHFR (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(1995) 7021-7025) para os construtos de cadeia pesada e pEFADA (pEF ADA é descrito em Raum et al., Cancer Immunol Immunother., 50(3), (2001), 141-50) para os construtos decadeia leve) de acordo com protocolos padrão. A seqüência verificou que os plasmídeos foram utilizados para a co- transfecção dos construtos de cadeia leve e pesada respectivos no FreeStyle 293 Expression System (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemanha) de acordo com os protocolos do fabricante. Após três dias, os sobrenadantes da cultura de células dos transfectantes foram colhidos e utilizados para a experiênciade varredura de alanina.5.3 Clonagem e expressão de mutantes de alanina deCD3 epsilon humano para a varredura de alanina

[00282] Vinte e sete fragmentos de cDNA que codificam a cadeia CD3 epsilon humana com uma troca de um códon da seqüência do tipo selvagem de CD3 epsilon humano em uma codificação de códon para a alanina (GCC) para cada aminoácido dos aminoácidos 1-27 do domínio extracelular da cadeia CD3 epsilon de humano madura, respectivamente, foram obtidos pela síntese de genes. À exceção do códon trocado, os fragmentos de cDNA eram idênticos ao fragmento de cDNA de CD3 do tipo selvagem humano acima mencionado. Somente um códon foi substituído em cada construto em comparação ao fragmento de cDNA de CD3 do tipo selvagem humano descrito acima. Os sítios de restrição EcoRl e Sall foram introduzidos nos fragmentos de cDNA nas posições idênticas comparadas ao construto do tiposelvagem. Todos os construtos da varredura de alanina foramclonados em pEF NEO e a seqüência verificou que os plasmídeosforam transfectados às células EL4. A transfecção e a seleçãodos transfectantes foram executadas tal como descrito acima.Como resultado, um painel de construtos expressos foi obtido,em que o primeiro aminoácido CD3 da cadeia epsilon humana,glutamina (Q, Gln) na posição 1 foi substituído pela alanina.O último aminoácido substituído pela alanina foi a treonina (T, Thr) na posição 27 de Cd3 epsilon do tipo selvagem humanomaduro. Para cada aminoácido entre a glutamina 1 e a treonina27, os transfectantes respectivos com uma troca de aminoácidodo tipo selvagem à alanina foram gerados.5.4 Experiência de varredura de alanina

[00283] Os anticorpos quiméricos de IgG tal como descrito em 2) e os anticorpos de cadeia simples específicos de espécies cruzadas específicos para CD3 epsilon foram testados na experiência de varredura de alanina. A ligação dosanticorpos às linhagens de células EL4 transfectadas com os construtos do mutante de alanina de CD3 epsilon humano talcomo descrito em 3) foi testada pelo ensaio de FACS de acordo com protocolos padrão. 2,5x105 células dos transfectantes respectivos foram incubadas com 50 μl do sobrenadante da cultura de células contendo os anticorpos quiméricos de IgG ou com 50 μl dos preparados brutos dos anticorpos de cadeia simples periplasmaticamente expressos. Para as amostras incubadas com os preparados brutos dos anticorpos de cadeia simples periplasmaticamente expressos, o anticorpo anti-Flag M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) foi utilizado como o anticorpo secundário em 5 μg/ml em 50 μl de PBS com 2% de FCS. Para as amostras incubadas com os anticorpos quiméricos de IgG, um anticorpo secundário não foi necessário. Para todas as amostras, a ligação das moléculas do anticorpo foi detectada com um fragmento F(ab’)2 purificado por afinidade conjugado a R-ficoeritrina, IgG anti-camundongo de cabra, específico do fragmento de Fc-gama, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, Reino Unido). As amostras foram medidas em um FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). A ligação diferencial das moléculas quiméricas de IgG ou dos anticorpos de cadeia simples específicos de espécies cruzadas às linhagens de células EL4 transfectadas com os mutantes de alanina de CD3 epsilon humano foi detectada. Tal como o controle negativo, um controle de isótipo ou um preparado bruto de um anticorpo periplasmaticamente expresso de cadeia simples de especificidade irrelevante foi utilizado, respectivamente. O anticorpo UCHT-1 foi utilizado como o controle positivo para o nível de expressão dos mutantes de alanina de CD3 epsilon humano. As linhagens de células EL4 transfectadas com os mutantes de alanina para a tirosina dos aminoácidos na posição 15, valina na posição 17, isoleucina na posição 19, valina na posição 24 ou leucina na posição 26 da cadeia CD3 epsilon madura não foram avaliadas devido aos níveis muito baixos de expressão (dados não mostrados). A ligação dos anticorpos de cadeia simples específicos de espécies cruzadas e dos anticorpos de cadeia simples no formato quimérico de IgG às linhagens de células EL4 transfectadas com os mutantes de alanina de CD3 epsilon humano é mostrada na Figura 8 (A-D) como a ligação relativa em unidades arbitrárias com os valores de fluorescência médios geométricos dos controles negativos respectivos subtraídos de todos os valores de amostra de fluorescência médios geométricos respectivos. Para compensar níveis diferentes de expressão, todos os valores da amostra para um determinado transfectante foram então divididos através do valor de fluorescência médio geométrico do anticorpo UCHT-1 para o transfectante respectivo. Para a comparação com o valor da amostra do tipo selvagem de uma especificidade, todos os valores da amostra da especificidade respectiva foram finalmente divididos através do valor da amostra do tipo selvagem, ajustando desse modo o valor da amostra do tipo selvagem a 1 unidade arbitrária de ligação. Os cálculos utilizados são mostrados em detalhe na seguinte fórmula:

[00284] Nesta equação, value_Sample significa o valor em unidades arbitrárias de ligação que descreve o grau de ligação de um anticorpo anti-CD3 específico a um mutante de alanina específico conforme mostrado na Figura 8 (A-D), Sample significa o valor de fluorescência médio geométrico obtido para um anticorpo anti-CD3 específico testado em uma transfectante de varredura de alanina específico, negContr. significa o valor de fluorescência médio geométrico obtido para o controle negativo testado em um mutante de alanina específico, UCHT-1 significa o valor obtido para o anticorpo UCHT-1 testado em um mutante de alanina específico, WT significa o valor de fluorescência médio geométrico obtido para um anticorpo anti-CD3 específico testado no transfectante do tipo selvagem, x especifica o transfectante respectivo, y especifica o anticorpo anti-CD3 e wt especifica que o transfectante respectivo é do tipo selvagem.

[00285] Conforme pode ser visto na Figura 8 (A-D), o anticorpo A2J HLP de IgG mostrou uma perda relevante de ligação à asparagina dos aminoácidos na posição 4, treonina na posição 23 e isoleucina na posição 25 da cadeia madura de CD3 epsilon. Uma perda completa de ligação do anticorpo A2J HLP de IgG foi observada para a glutamina dos aminoácidos na posição 1, aspartato na posição 2, glicina na posição 3 e glutamato na posição 5 da cadeia madura de CD3 epsilon. O anticorpo E2M HLP de IgG mostrou uma perda relevante de ligação à asparagina dos aminoácidos na posição 4, treonina na posição 23 e isoleucina na posição 25 da cadeia madura de CD3 epsilon. O anticorpo E2M HLP de IgG mostrou uma perda completa de ligação à glutamina dos aminoácidos na posição 1, aspartato na posição 2, glicina na posição 3 e glutamato na posição 5 da cadeia madura de CD3 epsilon. O anticorpo H2C HLP de IgG mostrou que uma perda intermediária de ligação à asparagina do aminoácido na posição 4 da cadeia CD3 epsilon madura e mostrou uma perda completa de ligação à glutamina dos aminoácidos na posição 1, aspartato na posição 2, glicina na posição 3 e glutamato na posição 5 da cadeia madura de CD3 epsilon. O único anticorpo F12Q HLP da cadeia mostrou uma perda essencialmente completa de ligação à glutamina dos aminoácidos na posição 1, aspartato na posição 2, glicina na posição 3 da cadeia CD3 epsilon madura e glutamato na posição 5 da cadeia madura de CD3 epsilon.6. Análise de ligação da molécula de ligação anti- CD3 específica de espécies cruzadas de H2C HLP à cadeia CD3 epsilon humana com e sem o Tag de His6 de N-terminal transfectado à linhagem de células T EL4 de murinos6.1 Clonagem e expressão da cadeia CD3 epsilon humana com o Tag de histidina seis de N-terminal (Tag de His6)

[00286] Uma codificação do fragmento de cDNA para a cadeia CD3 epsilon humana com um Tag de His6 de N-terminal foi obtido pela síntese de genes. O fragmento da síntese de genes foi projetado de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, que é seguido no quadro pela seqüência de codificação de um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, que é seguido no quadro pela seqüência de codificação de um Tag de His6 que é seguido no quadro pela seqüência de codificação da cadeia CD3 epsilon de humano madura (as seqüências de cDNA e de aminoácido do construto são relacionadas como as SEQ ID NO. 380 e 379). O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a conter sítios de restrição no início e no fim do cDNA. Os sítios de restrição EcoRl introduzidos na extremidade 5' e Sall na extremidade 3’ foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi então clonado através de EcoRl e Sall em um plasmídeo designado pEF-pEF-NEO (tal como descrito acima) seguindo os protocolos padrão. Uma seqüência verificou que o plasmídeo foi utilizado para transfectar a linhagem EL4 de murino. A transfecção das células T e a seleção dos transfectantes foi executada tal como descrito acima. Após 34 dias da cultura de células, os transfectantes foram utilizados para o ensaio descrito abaixo. 6.2 Ligação da molécula de ligação anti-CD3 específica de espécies cruzadas de H2C HLP à cadeia CD3 epsilon humana com e sem o Tag de His6 de N-terminal

[00287] Um anticorpo quimérico de IgG com especificidade de ligação a H2C HLP específico para CD3 epsilon foi testado quanto à ligação ao CD3 epsilon humano com e sem o Tag de His6 de N-terminal. A ligação do anticorpo às linhagens de células EL4 transfectadas com CD3 epsilon humano de His6 e CD3 epsilon humano do tipo selvagem, respectivamente, foi testada por um ensaio de FACS de acordo com protocolos padrão. 2,5x105 células dos transfectantes foram incubadas com 50 μl do sobrenadante da cultura de células contendo o anticorpo quimérico de IgG ou 50 μl dos anticorpos respectivos do controle em 5μg/ml em PBS com 2% de FCS. Como um controle negativo, um controle de isótipo apropriado e como um controle positivo para a expressão dos construtos, o anticorpo específico de CD3 UCHT-1 foi utilizado, respectivamente. A ligação dos anticorpos foi detectada com um fragmento F(ab’)2 purificado por afinidade conjugado a R-ficoeritrina, IgG anti- camundongo de cabra, específico do fragmento de Fc-gama, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, Reino Unido). As amostras foram medidas em um FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). Em comparação à linhagem de células EL4 transfectadas com CD3 epsilon humano do tipo selvagem, uma clara perda de ligação da IgG quimérica com especificidade de ligação de H2C HLP a CD3 epsilon humano com um Tag de His6 de N-terminal foi detectada. Estes resultados mostraram que um N- término livre de CD3 epsilon é essencial para a ligação da especificidade de ligação anti-CD3 específica de espécies cruzadas de H2C HLP à cadeia CD3 epsilon humana (Figura 9).7. Determinação da constante de ligação KD do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas para o primata EGFR e o primata CD3 (EGFR LH x H2C HLP) à proteína de fusão de CD3-Fc 1-27 pela medição de Ressonância Plasmônica de Superfície comparada à ligação às PBMcs que expressam CD3 medida por um Classificador de Células Ativado por Fluorescência (FACS).7.1 Medição de Ressonância Plasmônica de Superfície

[00288] Para determinar a afinidade de ligação do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico inteiramente de espécies cruzadas de EGFR-21-63 LH x H2C HLP aos aminoácidos 1-27 do N-término da cadeia CD3 epsilon humana, uma medição de Ressonância Plasmônica de Superfície foi executada com uma proteína de fusão recombinante que consistenos aminoácidos 1-27 de N-terminal da cadeia CD3 epsilon dehumana madura fundida a uma Parte Fc de IgG1 humana (CD3-Fc 127). Para esta finalidade, uma microplaqueta decarboximetildextrano CM5 da Biacore (Biacore, Upsália, Suécia) foi instalada em um sistema Biacore 2000® (Biacore, Upsália, Suécia). Uma célula de fluxo foi ativada por uma solução de cloridreto de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida/N- hidróxi succinimida de acordo com procedimentos padrão. Uma solução da proteína de fusão de CD3-Fc 1-27 foi posteriormente adicionada, resultando em a ligação covalente estável da proteína à de dextrano da microplaqueta Biacore. A proteína não-ligada foi removida pela lavagem extensiva seguida pelo bloqueio dos grupos carbóxi ativados por NHS restantes que nãoreagiram pela adição de uma solução de etanolamina. O sucessodo acoplamento da proteína foi confirmado por um sinal superior medido como as Unidades de Resposta em comparação ao sinal antes do acoplamento. Uma célula de referência foi preparada tal como descrito, mas sem adicionar uma solução de proteína.

[00289] O anticorpo biespecífico purificado EGFR- 21-63 LH x H2C HLP foi dialisado extensivamente contra o tampão de HBS-EP (Biacore, Upsália, Suécia) em uma Slide-A-Lyzer® Mini Dialysis Unit (Pierce, Rockford-II, USA). A concentração da proteína após a diálise foi determinada pela absorção de UV280 nm, resultando em uma concentração de 43 μg/ml.

[00290] A solução da proteína foi transferida a uma placa de 96 cavidades e diluída em série com o tampão de HBS-EP em uma relação de 1:1 a mais dez cavidades.

[00291] As medições de Ressonância Plasmônica de Superfície foram feitas ao testar separadamente todas as onze cavidades. As células de fluxo foram regeneradas com o tampão de acetato entre as medições, para liberar a proteína ligada.

[00292] Os sinais de ligação das moléculas biespecíficas do anticorpo foram obtidos pela subtração do sinal da célula de referência do sinal da célula da medição conjugado com a proteína de CD3-Fc 1-27. As curvas de associação e dissociação foram medidas como Unidades de Resposta e foram registradas. As constantes de ligação foram calculadas ao utilizar o software de encaixe de curva Biacore® com base no modelo Langmuir. A constante de ligação KD calculada sobre as primeiras cinco concentrações foi determinada como sendo 1,52x10-7 M.7.2 Determinação da constante de ligação de CD3 pela medição de FACS

[00293] A fim de testar a afinidade das moléculas do anticorpo biespecíficas específicas de espécies cruzadas no que diz respeito à força de ligação a CD3 de humano nativo, uma análise de ligação de FACS de saturação adicional foi executada. A molécula do anticorpo biespecífica EGFR-21-63 escolhida LH x H2C HLP foi utilizada para ajustar uma fileira de diluição com um fator de 1:1,5 e uma concentração inicial de 63,3 μg/ml. A molécula do anticorpo biespecífica foi incubada nestas concentrações diferentes com 1,25 x 105 PBMCs humanas, cada uma por uma hora a 4°C, seguida por duas etapas de lavagem em PBS a 4°C. A detecção das moléculas do anticorpobiespecíficas ligadas foi realizada ao utilizar o anticorpo Penta-His (Qiagen GmbH, Hildesheim, Alemanha) em 5 μg/ml em 50μl de PBS com 2% de FCS. Após a incubação por 45 minutos a 4°C e duas etapas de lavagem, a ligação do anticorpo Penta-His foi detectada com um fragmento F(ab’)2 purificado por afinidade conjugado a R-ficoeritrina, fragmento de Fc-gama específico de IgG anti-camundongo de cabra, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, Reino Unido). A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS-Canto II, o software FACS Diva foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences,Heidelberg). O tingimento por FACS e a medição da intensidadede fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002). Os valores médios da intensidade de fluorescência adquiridos foram traçados como uma função da concentração da molécula do anticorpo biespecífica utilizada e analisados pelo biomatemático Prism em uma análise de ligação lateral (hipérbole). O software calculou o valor de KD correspondente que descreveu a ligação de um ligando (a molécula do anticorpo biespecífica) a um receptor (a subfração de PBMC positiva de CD3) que segue a lei de ação de massa. A fórmula subjacente é tal como segue: Y = Bmax x X/(Kd+X) com Bmax que é a ligação máxima. KD é a concentração do ligando requerida para atingir a ligação média máxima. O tingimento por FACS foi realizado em duplicatas, os valores de R2 foram melhores do que 0,95.

[00294] A ligação média máxima determinada para a molécula do anticorpo biespecífica EGFR-21-63 LH x H2C HLP foi atingida a uma concentração de 8472 ng/ml que corresponde a 154 nM (1,54 x 10-7 M) em uma determinada massa molecular de 55.000 Daltons (Figura 10). Desse modo, a afinidade de EGFR- 21-63 LH x H2C HLP aos aminoácidos 1-27 de N-terminal da cadeia CD3 epsilon humana separados de seu contexto de CD3 nativo provou ser igual à afinidade de EGFR-21-63 LH x H2C HLP a CD3 nativo em células T intactas.8. Geração de células de CHO transfectadas com EGFRhumano

[00295] A linhagem de células positivas para EGFR humano, A431 (linha de células de carcinoma epidermóide, CRL- 1555, American Type Culture Collection, Rockville, MD) foi utilizada para obter o RNA total que foi isolado de acordo comas instruções do manual do kit (Qiagen, RNeasy Mini Kit, Hilden, Alemanha). O RNA obtido foi utilizado para a síntesedo cDNA pela transcrição reversa de início aleatório. Para a clonagem da seqüência de comprimento completo do antígeno humano de EGFR, os seguintes oligonucleotídeos foram utilizados:5' EGFR AG Xbal 5'-GGTCTAGAGCATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGG-S' 3' EGFR AG Sail 5'- TTTTAAGTCGACTCATGCTCCAATAAATTCACTGCT-S'. A seqüência de codificação foi amplificada por PCR (desnaturação a 94°C por 5 minutos, recozimento a 58°C por um minuto, alongamento a 72°C por dois minutos para o primeiro ciclo; desnaturação a 94°C por um minuto, recozimento a 58°C por um minuto, alongamento a 72°C por dois minutos por trinta ciclos; extensão terminal a 72°C por cinco minutos). O produto da PCR foi digerido subseqüentemente com Xbal e Sall, ligado ao vetor de expressão pEF-DHFR apropriadamente digerido (Raum et al., Cancer Immunol. Immunother. 2001; 50: 141-150) e transformadoem E. coli. Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência do nucleotídeo verificada por seqüência (SEQ ID 370, seqüência de aminoácido SEQ ID 369) foi transfectado nas células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Aamplificação de genes do construto foi induzida ao aumentar asconcentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final deaté 20 nM de MTX.9. Geração de células de CHO que expressam o domínio extracelular de EGFR de cinomolgo

[00296] A seqüência de cDNA do domínio extracelular de EGFR de cinomolgo foi obtida por um conjunto de duas PCRs no cDNA de cólon de macaco cinomolgo (Cat#: C1534090-Cy-BC; obtido junto à BioCat GmbH, Heidelberg, Alemanha) ao utilizar as seguintes condições de reação: um ciclo a 94°C por três minutos seguido por 35 ciclos a 94°C por um minuto, a 53°C por um minuto e a 72°C por dois minutos seguidos por um ciclo terminal a 72°C por três minutos. Os seguintes primers foram utilizados:1. primer de avanço: 5'- CGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGC - 3' primer reverso: 5'- CCGTCTTCCTCCATCTCATAGC -3"2. primer de avanço: 5'-ACATCCGGAGGTGACAGATCACGGCTCGTGC -3' primer reverso: 5’-CAGGATATCCGAACGATGTGGCGCCTTCGC -3'

[00297] Essas PCRs geraram dois fragmentos sobrepostos (A: 1-869, B: 848-1923), que foram isolados eseqüenciados de acordo com protocolos padrão ao utilizar os primers de PCR e apresentaram, desse modo, uma porção de 1923 bp da seqüência de cDNA de EGFR de cinomolgo a partir do terceiro nucleotídeo do códon +1 da proteína madura ao 21° códon do domínio de transmembrana. Para gerar um construto para a expressão de EGFR de cinomolgo, um fragmento de cDNA foi obtido pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão (a seqüência de cDNA e de aminoácido do construto é relacionada sob as SEQ ID NO. 372 e 371). Neste construto, a seqüência de codificação para o EGFR de cinomolgo a partir do aminoácido +2 a +641 da proteína madura de EGFR foi fundida à seqüência de codificação de EGFR humano, substituindo a seqüência de codificação dos aminoácidos +2 a +641. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a conter umsítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto e dos sítios de restrição no início e no fim da codificação de cDNAessencialmente para o domínio extracelular de EGFR de cinomolgofundido à transmembrana e aos domínios intracelulares de EGFRhumano. Além disso, uma mutação conservadora foi introduzida no aminoácido 627 de valina mutante (o 4° aminoácido do domínio de transmembrana) à leucina para gerar um sítio de restrição (Sphl) para finalidades de clonagem. Os sítios de restrição Xbal introduzidos na extremidade 5' e Sall na extremidade 3’ foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi então clonado através de Xbal e Sall em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995)7021-7025). Uma seqüência verificou que o clone deste plasmídeo foi utilizado para transfectar as células CHO/DHFR, tal como descrito acima.10. Geração das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de EGFR e de CD3 10.1. Clonagem das moléculas de ligação específicas de espécies cruzadas

[00298] De maneira geral, as moléculas doanticorpo de cadeia simples biespecíficas, cada uma delas compreendendo um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para CD3 epsilon de seres humanos e de primatas não-chimpanzés, bem como um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para o EGFR de seres humanos e de primatas não-chimpanzés, foram projetadas tal como definido na seguinte Tabela 1:Tabela 1: Formatos das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas anti-EGFR e anti-CD3

[00299] Os construtos acima mencionados que contêmos domínios de cadeia leve variável (L) e de cadeia pesada variável (H) específicos de espécies cruzadas para EGFR de seres humanos e de cinomolgo foram obtidos pela síntese de genes. Os fragmentos da síntese de genes foram projetados de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido por um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, seguido no quadro pela seqüência de codificação da molécula do anticorpo de cadeia simples biespecífica respectiva, seguido no quadro pela seqüência de codificação de um Tag de histidina 6 e de um códon de interrupção. O fragmento da síntese de genes também foi projetado para introduzir sítios de restrição apropriados deN- e C-terminal. O fragmento da síntese de genes foi clonado através destes sítios de restrição em um plasmídeo designadopEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer ImmunolImmunother 50 (2001) 141-150) de acordo com protocolos padrão(Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado em células de ovário de hamster chinês (CHO) deficientes em reductase de diidrofolato (DHFR) para a expressão eucariótica do construto.

[00300] Os construtos foram transfectados estável ou transientemente nas células de CHO deficientes em DHFR (ATCC N°. CRL 9096) por eletroporação ou alternativamente em HEK 293 (células de rim embrionárias humanas, ATCC Número: CRL-1573) de uma maneira transiente de acordo com protocolos padrão.10.2. Expressão e purificação das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas

[00301] As moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas foram expressas nas células de ovário de hamster chinês (CHO). A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537566. A amplificação de genes dos construtos foi induzida ao aumentar as concentrações finais de MTX até 20 nM. Após duas passagens da cultura estacionária, as células cresceram em frascos de rolo com meio de soja líquido livre de nucleosídeo HyQ PF CHO (com 4,0 mM de L-glutamina com 0,1% de Pluronic F - 68; HyClone) por sete dias antes da colheita. As célulasforam removidas por centrifugação e o sobrenadante contendo a proteína expressa foi armazenado a -20°C. Alternativamente, os construtos foram transientemente expressos nas células de HEK 293. A transfecção foi executada com o reagente 293fectin (Invitrogen, #12347-019) de acordo com o protocolo do fabricante.

[00302] Akta® Explorer System (GE Health Systems) e Unicorn® Software foram utilizados para a cromatografia. A cromatografia de afinidade com metal imobilizado ("IMAC") foi executada ao utilizar um Fractogel EMD chelate® (Merck) que foi contémdo com ZnCl2 de acordo com o protocolo provido pelofabricante. A coluna foi equilibrada com o tampão A (20 mM detampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1M de NaCl) e osobrenadante da cultura de células (500 ml) foi aplicado à coluna (10 ml) a uma vazão de 3 ml/min. A coluna foi lavada com o tampão A para remover a amostra não-ligada. A proteína ligada foi eluída ao utilizar um gradiente de duas etapas do tampão B (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1Mde NaCl, 0,5 M de imidazol) de acordo com o seguinte:Etapa 1: 20% do tampão B em 6 volumes da colunaEtapa 2: 100% do tampão B em 6 volumes da coluna

[00303] As frações da proteína eluída da etapa 2foram agrupadas para uma purificação adicional. Todos os produtos químicos eram do tipo para pesquisa e foram adquiridosjunto à Sigma (Deisenhofen) ou junto à Merck (Darmstadt).

[00304] A cromatografia de filtração em gel foi executada em uma coluna do tipo preparatória HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada com o Equi-buffer (25 mM de citrato, 200 mM de lisina, 5% de glicerol, pH 7,2). As amostras da proteína eluída (vazão de 1 ml/min) foram submetidas a SDS-PAGE padrão e à transferência Western para a detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para a determinação do peso molecular (kit marcador do peso molecular, Sigma MW GF-200). As concentrações da proteína foram determinadas ao utilizar OD280 nm.

[00305] A proteína do anticorpo de cadeia simples biespecífica purificada foi analisada em SDS-PAGE sob condições reduzidas executadas com 4-12% de géis de Bis Tris pré-fundidos (Invitrogen). A preparação e a aplicação da amostra foram executadas de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. O peso molecular foi determinado com o padrão de proteína MultiMark (Invitrogen). O gel foi tingido com Coomassie coloidal (protocolo da Invitrogen). A pureza da proteína isolada era > 95%, tal como determinado por SDS-PAGE.

[00306] O anticorpo de cadeia simples biespecífico tem um peso molecular de aproximadamente 52 kDa sob condições nativas, tal como determinado pela filtração em gel em PBS. Todos os construtos foram purificados de acordo com este método.

[00307] A transferência Western foi executada ao utilizar uma membrana Optitran® BA-S83 e Blot Module da Invitrogen de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. Os anticorpos utilizados foram dirigidos contra seu Tag (Penta His, Qiagen) e Ig anti-camundongo de cabra etiquetada com fosfatase alcalina (AP) (Sigma) e BCIP/NBT (Sigma) como o substrato. Uma faixa única foi detectada em 52 kD, que corresponde ao anticorpo de cadeia simples biespecífico purificado.11. Determinação da constante de ligação KD de anticorpos de cadeia simples biespecíficos específicos inteiramente de espécies cruzadas à proteína de fusão de CD3- Fc 1-27 pela medição de Ressonância Plasmônica de Superfície

[00308] Para determinar as afinidades de ligação das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas a EGFR de primata e a CD3 der primata aos aminoácidos 1-27 do N-término da cadeia CD3 epsilon de humano madura, uma medição de Ressonância Plasmônica de Superfície foi executada com uma proteína de fusão recombinante que consiste nos aminoácidos 1-27 de N-terminal da cadeia CD3 epsilon humana fundida a uma Parte Fc de IgGI humana (CD3-Fc 1-27). Para esta finalidade, uma microplaqueta de carboximetil-dextrano CM5 da Biacore (Biacore, Upsália, Suécia) foi instalada em um sistema Biacore 20000 (Biacore, Upsália, Suécia). Uma célula de fluxo foi ativada por uma solução de cloridreto de N-(3-dimetilaminopropil)-N'- etilcarbodiimida/N-hidróxi succinimida de acordo com procedimentos padrão. Uma solução da proteína de fusão de CD3- Fc 1-27 foi adicionada posteriormente, resultando em a ligação covalente estável da proteína à camada de dextrano da microplaqueta da Biacore. A proteína não-ligada foi removida pela lavagem extensiva seguida pela obstrução dos grupos carbóxi ativados por NHS não-reagidos restantes pela adição de uma solução de etanolamina. O sucesso do acoplamento da proteína foi confirmado pela detecção de um sinal superior medido como Unidades de Resposta em comparação ao sinal antes do acoplamento. Uma célula de referência foi preparada tal como descrito, mas sem adicionar a solução da proteína.

[00309] Os anticorpos de cadeia simples biespecíficos purificados relacionados abaixo foram ajustados a 5 μg/ml com o tampão de HBS-EP (Biacore, Upsália, Suécia) e transferidos a uma placa de 96 cavidades, cada uma a um volume de 150 μl.

[00310] As medições de Ressonância Plasmônica de Superfície foram executadas para todas as amostras e as células de fluxo foram regeneradas com o tampão de acetato entre as medições para liberar a proteína ligada (tudo de acordo com protocolos padrão).

[00311] Os sinais de ligação dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos foram obtidos pela subtração do sinal da célula de referência do sinal da célula de medição conjugada com a proteína de CD3-Fc 1-27.

[00312] As curvas de associação e dissociação foram medidas como Unidades de Respostas e registradas. As constantes de ligação foram calculadas ao utilizar o software de encaixe de curva da Biacore® com base no modelo de Langmuir. As afinidades calculadas para as únicas moléculas de cadeia simples biespecífico específico inteiramente de espécies cruzadas testadas aos aminoácidos 1-27 de N-terminal de CD3 epsilon humano são fornecidas como valores de KD abaixo e variam de 2,54x10-6 M a 2,49x10-7M. "LH" refere-se a um arranjo de domínios variáveis na ordem VL-VH. "HL" refere-se a um arranjo de domínios variáveis na ordem VH-VL. G4H, F70, A2J, EL L, E2M, H1 E e F6A referem-se às moléculas de ligação de CXD3 específicas de espécies cruzadas diferentes.Molécula do anticorpo biespecífica KD(M)EGFR LH x F70 HLP 1, 01x10-6EGFR LH x A2J HLP ~2 ,49x10EGFR LH x E2M HLP 2, 46x10EGFR LH x HIE HLP 2, 54x10-612. Análise de ligação citométrica de fluxo dos anticorpos de EGFR e de CD3 biespecíficos específicos de espécies cruzadas

[00313] A fim de testar a funcionalidade dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas no que diz respeito à potencialidade de ligação a EGFR e CD3 de humano e cinomolgo, respectivamente, uma análise de FACS foi executada. Para esta finalidade, as células de CHO transfectadas com EGFR humano tal como descrito no Exemplo 8 e a linhagem de células de leucemia HPB-ALL das células T CD3 positivas humanas (DSMZ, Bransvique, ACC483) foram utilizadas para testar a ligação aos antígenos humanos. A reatividade deligação aos antígenos de cinomolgo foi testada ao utilizar otransfectante de EGFR de cinomolgo gerado descrito no Exemplo 9 e uma linhagem de células T 4119LnPx de símio (generosamente provida pelo professor Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuremberg; publicado em Knappe A, et al. e Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61) 200.000 células dapopulação de células respectiva foram incubadas por trinta minutos em gelo com 50 μl da proteína purificada dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas (2 μg/ml). Alternativamente, foi utilizado o sobrenadante da cultura de células de proteínas transientemente produzidas. As células foram lavadas duas vezes em PBS e a ligação do construto foi detectada com um anticorpo Penta His murino (Qiagen; diluído 1:20 em 50 μl de PBS com 2% de FCS). Após alavagem, os anticorpos anti-His ligados foram detectados comum anticorpo específico de Fc gama (Dianova) conjugado à ficoeritrina, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS. O meio de cultura fresco foi utilizado como um controle negativo.

[00314] A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS-Calibur, o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). O tingimento por FACS e a medição da intensidade de fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00315] A capacidade de ligação de diversas moléculas de cadeia simples biespecíficas que são específicas para EGFR e específicas de espécies cruzadas para CD3 de seres humanos e de primatas não-chimpanzés foi claramente detectável, conforme mostrado na Figura 11. Na análise de FACS, todos os construtos mostraram que a ligação a CD3 e a EGFR se comparou ao meio de cultura e ao primeiro e segundo anticorpo de detecção como os controles negativos. A especificidade do anticorpo biespecífico de espécies cruzadas aos antígenos de CD3 e EGFR de humano e cinomolgo foi demonstrada.13. Bioatividade anticorpos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas de EGFR e de CD3

[00316] A bioatividade dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos gerados foi analisada pela liberação do cromo 51 (51Cr) em ensaios de citotoxicidade in vitro ao utilizar as linhagens de células positivas de EGFR descritas nos Exemplos 8 e 9. Tal Como células efetoras, as células T de CD8 positivas humanas estimuladas ou a linhagem de células T 4119LnPx de símio foram utilizadas, respectivamente.

[00317] A geração das células T de CD8+ estimuladas foi executada tal como segue:

[00318] Uma placa de Petri (145 mm de diâmetro, Greiner) foi pré-revestida com um anticorpo anti-CD3 específico comercialmente disponível a uma concentração final de 1 μg/ml por uma hora a 37°C. A proteína não-ligada foi removida por uma etapa de lavagem com PBS. As PBMCs frescas foram isoladas de sangue periférico (30 - 50 ml de sangue humano) por centrifugação do gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. 3 - 5 x 107 PBMCs foram adicionadas à placa de Petri pré-revestida em 120 ml de RPMI 1640/10% de FCS/20 U/ml de IL-2 IL-2 (Proleukin, Chiron) e foram estimuladas por dois dias. No terceiro dia, as células foram coletadas, lavadas uma vez com RPMI 1640. IL-2 foi adicionada a uma concentração final de 20 U/ml e cultivada outra vez por um dia. Os linfócitos T citotóxicos de CD8+ (CTLs) foram isolados pelo esgotamento das células T de CD4+ e das células NK de CD56+.

[00319] As células alvo foram lavadas duas vezes com PBS e etiquetadas com 11,1 MBq de 51Cr a um volume finalde 100 μl de RPMI com 50% de FCS por 45 minutos a 37°C. Ascélulas alvo etiquetadas foram lavadas subseqüentemente três vezes com 5 ml de RPMI e utilizadas então no ensaio de citotoxicidade. O ensaio foi executado em uma placa de 96 cavidades a um volume total de RPMI suplementado 250 μl (tal como acima) com uma relação de E:T de 10:1,1 μg/ml das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas e vinte diluições de três vezes das mesmas foi aplicado. O sobrenadante da cultura de células de proteínas transientemente produzidas foi diluído alternativamente em série em etapas de 1:2. O tempo do ensaio foi de 18 horas e a citotoxicidade foi medida como valores relativos do cromo liberado no sobrenadante relacionado à diferença da lise máxima (adição de Triton-X) e da lise espontânea (sem células efetoras). Todas as medições foram feitas em quadruplicata. A medição da atividade do cromo nos sobrenadantes foi executada com um Wizard 3" Gamacounter (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemanha). A análise dos dados experimentais foi executada com Prism 4 for Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, USA). As curvas de resposta de dose sigmoidais tiveram tipicamente valores R2 > 0,90, tal como determinado pelosoftware. Os valores EC50 calculados pelo programa de análise foram utilizados para a comparação da bioatividade.

[00320] Conforme mostrado nas Figuras 12 e 13, todos os construtos do anticorpo de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas gerados revelaram atividade citotóxica contra as células alvo de EGFR positivas humanas provocada pelas células humanas de CD8+ e as células alvo de EGFR de cinomolgo positivas provocada pela linhagem de células T 4119LnPx de símio. Um anticorpo de cadeia simples biespecífico com especificidade alvo diferente foi utilizado como o controle negativo.14. Clonagem e expressão de C-terminal, de transmembrana e dos domínios extracelulares truncados de MCSP humano

[00321] A seqüência de codificação de C-terminal, de transmembrana e do domínio extracelular truncado de MCSP humano (aminoácidos 1538 - 2322) foi obtida pela síntese degenes de acordo com protocolos padrão (a seqüência de cDNA e a seqüência de aminoácido do construto recombinante para a expressão de C-terminal, de transmembrana e do domínio extracelular truncado de MCSP humano (designado como D3 humano)são relacionadas sob as SEQ ID NO. 374 e 373). O fragmento dasíntese de genes foi projetado de modo a conter primeiramenteum sítio de Kozak para permitir a expressão eucariótica doconstruto seguida pela seqüência de codificação de um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19 seguida no quadro porum Tag de FLAG, seguida no quadro por uma seqüência que contémdiversos sítios de restrição para finalidades de clonagem e a codificação para um aglutinante artificial do aminoácido 9 (SRTRSGSQL), seguido no quadro pela seqüência de codificação de C-terminal, de transmembrana e do domínio extracelular truncado de MCSP humano e de um códon de interrupção. Os sítios de restrição foram introduzidos no início e no fim do fragmento do DNA. Os sítios de restrição EcoRl na extremidade 5' e Sall na extremidade 3' foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento foi digerido com EcoRl e Sall e clonado em pEF-DHFR (pEF-DHFR é descrito em Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) seguindo os protocolos padrão. Uma seqüência verificou que o plasmídeo foi utilizado para transfectar as células CHO/DHFR (ATCC N°. CRL 9096). As células foram cultivadas em RPMI 1640 com glutamina estabilizada, suplementada com 10% de FCS, 1% de penicilina/estreptomicina (todos obtidos junto à Biochrom AG Berlin, Alemanha) e os nucleosídeos de uma solução conservada em estoque de reagentes do tipo para cultura de células (Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) a uma concentração final de 10 μg/ml de adenosina, 10 μg/ml de desoxiadenosina e 10 μg/ml de timidina, em uma incubadora a 37°C, com 95% de umidade e 7% de CO2. A transfecção foi executada ao utilizar o reagente de transfecção PolyFect (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) e 5 μg do DNA do plasmídeo de acordo com o protocolo do fabricante. Após a cultura por 24 horas, as células foram lavadas uma vez com PBS e cultivadas outra vez em RPMI 1640 com glutamina estabilizada e 1% de penicilina/estreptomicina. Desse modo, o meio de cultura de células não continha nucleosídeos e a seleção foi aplicada, desse modo, nas células transfectadas. Aproximadamente 14 dias após a transfecção, o crescimento de células resistentes foi observado. Após mais sete a catorze dias, os transfectantes foram testados quanto à expressão do construto pela análise de FACS. 2,5x105 células foram incubadas com 50 μl de um anticorpo anti-Flag-M2 (Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) diluído a 5 μg/ml em PBS com 2% de FCS. A ligação do anticorpo foi detectada com um fragmento F(ab’)2 purificado por afinidade conjugado a R- ficoeritrina, IgG anti-camundongo de cabra, específico do fragmento de Fc-gama, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, Reino Unido). As amostras foram medidas em um FACScalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha).15. Clonagem e expressão de C-terminal, de transmembrana e dos domínios extracelulares truncados de MCSP de símio

[00322] A seqüência de cDNA de C-terminal, de transmembrana e dos domínios extracelulares truncados de MCSP de símio (designada como D3 de símio) foi obtida por um conjunto de três PCRs no cDNA de pele de símio (Cat n°. C1534218-Cy-BC; BioCat GmbH, Heidelberg, Alemanha) utilizando as seguintes condições de reação: 1 ciclo a 94°C, 3 min., 40 ciclos a 94°C por 0,5 min., a 52°C por 0,5 min. e a 72°C por 1,75 min., um ciclo terminal a 72°C por 3 min. Os seguintes primers foram utilizados:primer de avanço: 5’-GATCTGGTCTACACCATCGAGC-3’ primer reverso: 5’-GGAGCTGCTGCTGGCTCAGTGAGG-3’primer de avanço: 5’- TTCCAGCTGAGCATGTCTGATGG-3’ primer reverso: 5’- CGATCAGCATCTGGGCCCAGG-3’primer de avanço: 5’- GTGGAGCAGTTCACTCAGCAGGACC-3’ primer reverso: 5’- GCCTTCACACCCAGTACTGGCC-3’

[00323] Essas PCRs geraram três fragmentos de sobreposição (A: 1-1329, B: 1229-2428,C: 1782-2547), os quais foram isolados e seqüenciados de acordo com protocolos padrão utilizando os primers de PCR e, desse modo, proveram uma porção de 2547 bp da seqüência de cDNA de MCSP de símio (a seqüência de cDNA e a seqüência de aminoácido desta porção de MCSP de símio são relacionadas sob as SEQ ID NO. 376 e 375) de 74 bp a montante de uma seqüência de codificação do domínio de C- terminal a 121 bp a jusante do códon de interrupção. Outra PCR utilizando as seguintes condições de reação: um ciclo a 94°C por três minutos, dez ciclos a 94°C por um minuto, a 52°C por um minuto e a 72°C por dois minutos e meio, um ciclo terminal a 72°C por três minutos foi utilizado para fundir os produtos de PCR das reações A e B acima mencionados. Os seguintes primers são utilizados:primer de avanço: 5'-tcccgtacgagatctggatcccaattggatggcggactcgtgctgttctcacacagagg- 3’primer reverso: 5'-agtgggtcgactcacacccagtactggccattcttaagggcaggg-3’

[00324] Os primers para esta PCR foram projetados de modo a introduzir sítios de restrição no início e no final da codificação do fragmento de cDNA para o C-terminal, a transmembrana e os domínios extracelulares truncados de MCSPde símio. Os sítios MfeI introduzidos na extremidade 5' e SalI na extremidade 3’ foram utilizados nos seguintes procedimentosde clonagem. O fragmento de PCR foi então clonado através deMfeI e SalI em um plasmídeo Bluescript contendo o fragmento deEcoRI/MfeI do do plasmídeo pEF-DHFR acima mencionado (o pEF- DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) ao substituir o C-terminal, a transmembrana eos domínios extracelulares truncados de MCSP humano. O fragmento da síntese de genes continha as seqüências de codificação do peptídeo líder de imunoglobulina e o Flag Tag bem como o aglutinante artificial (SRTRSGSQL) enquadrado à extremidade 5' da codificação do fragmento de cDNA para o C- terminal, a transmembrana e os domínios extracelulares de MCSP de símio. Este vetor foi utilizado para transfectar as célulasCHO/DHFR (ATCC n°. CRL 9096). As células foram cultivadas em RPMI 1640 com glutamina estabilizada suplementada com 10% deFCS, 1% de penicilina/estreptomicina (todos junto à Biochrom AG Berlin, Alemanha) e os nucleosídeos de uma solução conservada em estoque dos reagentes do tipo para cultura de células (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) a uma concentração final de 10 μg/ml de adenosina, 10 μg/ml de desoxiadenosina e de 10 μg/ml de timidina, em uma incubadora a 37°C, com 95% de umidade e 7% de CO2. A transfecção foi executada com o PolyFect Transfection Reagent (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) e 5 μg do DNA do plasmídeo de acordo com o protocolo do fabricante. Após a cultura por 24 horas, as células foram lavadas uma vez com PBS e cultivadas outra vez em RPMI 1640 com glutamina estabilizada e 1% de penicilina/estreptomicina. Desse modo, o meio de cultura de células não continha nucleosídeos e a seleção foi aplicada desse modo nas células transfectadas. Aproximadamente catorze dias após a transfecção, o crescimento de células resistentesfoi observado. Após mais sete a catorze dias, os transfectantsforam testados quanto à expressão do construto recombinanteatravés de FACS. 2,5x105 células foram incubadas com 50 μl deum anticorpo anti-Flag-M2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) diluído a 5 μg/ml em PBS com 2% de FCS. O anticorpo ligado foi detectado com um fragmento de F(ab’)2 purificado por afinidade conjugado a R-ficoeritrina, IgG anti- camundongo de cabra, específico do fragmento de Fc-gama, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, Reino Unido). As amostras foram medidas em um FACScalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha).16. Geração e caracterização moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de MCSP e de CD3

[00325] As moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas que compreendem um domínio de ligação específico de espécies cruzadas para CD3 epsilon de humano e primata não-chimpanzé bem como um domínio de ligação específico de espécies cruzadas para MCSP de seres humanos e de primatas não-chimpanzés, são projetadas tal como definido na seguinte Tabela 2:

[00326] Tabela 2: Formatos de anticorpos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas de MCSP e de CD3

[00327] Os construtos acima mencionados que contêm os domínios de cadeia pesada variável (VH) e de cadeia leve variável (VL) específicos de espécies cruzadas para MCSP D3 de seres humanos e de símio e os domínios de VH e VL específicos de espécies cruzadas para CD3 de seres humanos e de símio foram obtidos pela síntese de genes. Os fragmentos da síntese de genes foram projetados de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido por um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, seguido no quadro pela seqüência de codificação da molécula do anticorpo de cadeia simples biespecífica respectiva, seguido no quadro pela seqüência de codificação de um Tag de histidina 6 e de um códon de interrupção. O fragmento da síntese de genestambém foi projetado para introduzir sítios de restrição apropriados de N e C-terminal. O fragmento da síntese de genesfoi clonado através destes sítios de restrição em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Os construtos foram transfectados estável ou transientemente nas células de CHO deficientes em DHFR (ATCC N°. CRL 9096) por eletroporação ou alternativamente em HEK 293 (células de rim embrionárias humanas, ATCC Número: CRL-1573) de uma maneira transiente de acordo com protocolos padrão.

[00328] A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537566. A amplificação de genes dos construtos foi induzida pela adição de concentrações crescentes de metotrexato (MTX) até concentrações finais de 20 nM de MTX. Após duas passagens da cultura estacionária, as células cresceram em frascos de rolocom meio de soja líquido livre de nucleosídeo HyQ PF CHO (com4,0 mM de L-glutamina com 0,1% de Pluronic F - 68; HyClone)por sete dias antes da colheita. As células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante contendo a proteína expressa foi armazenado a -20°C.

[00329] Akta® Explorer System (GE Health Systems) e Unicorn® Software foram utilizados para a cromatografia. A cromatografia de afinidade com metal imobilizado ("IMAC") foi executada ao utilizar um Fractogel EMD chelate® (Merck) que foi contémdo com ZnCl2 de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. A coluna foi equilibrada com o tampão A (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1M de NaCl) e o sobrenadante da cultura de células (500 ml) foi aplicado à coluna (10 ml) a uma vazão de 3 ml/min. A coluna foi lavada com o tampão A para remover a amostra não-ligada. A proteína ligada foi eluída ao utilizar um gradiente de duas etapas do tampão B (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1M de NaCl, 0,5 M de imidazol) de acordo com o seguinte:Etapa 1: 20% do tampão B em 6 volumes da colunaEtapa 2: 100% do tampão B em 6 volumes da coluna

[00330] As frações da proteína eluída da etapa 2 foram agrupadas para uma purificação adicional. Todos os produtos químicos são do tipo para pesquisa e são adquiridos junto à Sigma (Deisenhofen) ou junto à Merck (Darmstadt).

[00331] A cromatografia de filtração em gel foi executada em uma coluna do tipo preparatória HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada com o Equi-buffer (25 mM de citrato, 200 mM de lisina, 5% de glicerol, pH 7,2). As amostras da proteína eluída (vazão de 1 ml/min) foram submetidas à SDS-PAGE padrão e à transferência Western para a detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para a determinação do peso molecular (kit marcador do peso molecular, Sigma MW GF-200). As concentrações da proteína foram determinadas ao utilizar OD280 nm.

[00332] A proteína do anticorpo de cadeia simples biespecífica purificada foi analisada em SDS-PAGE sob condições reduzidas executadas com 4-12% de géis de Bis Tris pré-fundidos (Invitrogen). A preparação e a aplicação da amostra foram executadas de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. O peso molecular foi determinado com o padrão de proteína MultiMark (Invitrogen). O gel foi tingido com Coomassie coloidal (protocolo da Invitrogen). A pureza da proteína isolada é > 95%, tal como determinado pela SDS-PAGE.

[00333] O anticorpo de cadeia simples biespecífico tem um peso molecular de aproximadamente 52 kDa sob condições nativas, tal como determinado pela filtração em gel em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Todos os construtos foram purificados de acordo com este método.

[00334] A transferência Western foi executada ao utilizar uma membrana Optitran® BA-S83 e Blot Module da Invitrogen de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. Para a detecção dos anticorpos da proteína do anticorpo de cadeia simples biespecíficos, um anticorpo de Tag anti-His foi utilizado (Penta His, Qiagen). Um anticorpo de Ig anti- camundongo de cabra etiquetado com fosfatase alcalina (AP) (Sigma) foi utilizado como o anticorpo secundário e BCIP/NBT (Sigma) como o substrato. Uma faixa única foi detectada em 52 kD, que corresponde ao anticorpo de cadeia simples biespecífico purificado.

[00335] Alternativamente, os construtos foram expressos transientemente nas células de CHO deficientes em DHFR. Resumidamente, 4 x 105 células por construto foram cultivadas em 3 ml de RPMI 1640, todo o meio com glutamina estabilizada suplementada com 10% de soro fetal de vitela, 1% de penicilina/estreptomicina e os nucleosídeos de uma solução conservada em estoque de reagentes do tipo para cultura de células (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) a uma concentração final de 10 μg/ml de adenosina, 10 μg/ml de desoxiadenosina e 10 μg/ml de timidina, em uma incubadora a 37°C, com 95% de umidade e 7% de CO2 um dia antes da transfecção. A transfecção foi executada com Fugene 6 Transfection Reagent (Roche, #11815091001) de acordo com o protocolo do fabricante. 94 μl do meio OptiMEM (Invitrogen) e 6 μl de Fugene 6 são misturados e incubados por cinco minutos à temperatura ambiente. Subseqüentemente, 1,5 μg do DNA por construto foram adicionados, misturados e incubados por 15 minutos à temperatura ambiente. Enquanto isso, as células de CHO deficientes em DHFR foram lavadas com 1x PBS e ressuspensas em 1,5 ml de RPMI 1640 em todo o meio. A mistura de transfecção foi diluída com 600 μl de RPMI 1640 em todo o meio, adicionada às células e incubada até a manhã seguinte a 37°C, com 95% de umidade e 7% de CO2. No dia após a transfecção, o volume da incubação de cada abordagem foi estendido a 5 ml de RPMI 1640 em todo o meio. O sobrenadante foi colhido após três dias de incubação.17. Análise de ligação citométrica de fluxo dos anticorpos biespecíficos específicos de espécies cruzadas de MCSP e de CD3

[00336] A fim de testar a funcionalidade dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas a respeito da potencialidade de se ligar a MCSP D3 e CD3 de seres humanos e de símio, respectivamente, foi feita uma análise de FACS. Para esta finalidade, as células de CHO transfectadas com MCSP D3 humano (tal como descrito no Exemplo 14) e a linhagem de células de leucemia de HPB-ALL das células T CD3 positivas humanas (DSMZ, Bransvique, ACC483) foram utilizadas par testar a ligação aos antígenos humanos. A reatividade de ligação aos antígenos de símio foi testada ao utilizar o transfectante de MCSP D3 de símio gerado (descrito no Exemplo 15) e uma linhagem de células T 4119LnPx de símio (gentilmente fornecida pelo prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuremberg; publicado em Knappe A, et al. e em Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61).200.000 células das linhagens de células respectivas foram incubadas por trinta minutos em gelo com 50 μl da proteína purificada dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas (2 μg/ml) ou o sobrenadante da cultura de células das células transfectadas que expressam os construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas. As células foram lavadas duas vezes em PBScom 2% de FCS e a ligação do construto foi detectada com umanticorpo anti-His murino (anticorpo Penta His; Qiagen; diluído 1:20 em 50 μl de PBS com 2% de FCS). Após a lavagem, os anticorpos anti-His ligados foram detectados com um anticorpo específico de Fc gama (Dianova) conjugado à ficoeritrina, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS. O sobrenadante das células de CHO não-transfectadas foi utilizado como o controle negativo para a ligação às linhagens de células T. Um construto de cadeia simples com especificidade alvo irrelevante foi utilizado como controle negativo para seligar às células transfectadas de CHO de MCSP-D3.

[00337] A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS-Calibur; o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). O tingimento por FACS e a medição da intensidade de fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00338] A ligação biespecífica das moléculas de cadeia simples é relacionada acima; que são de espécies cruzadas específicas para MCSP D3 e de espécies cruzadas específicas CD3 de humano e símio era claramente detectável, conforme mostrado nas Figuras 14, 15, 16 e 58. Na análise de FACS, todos os construtos mostraram a ligação a CD3 e a MCSP D3 em comparação aos controles negativos respectivos. A especificidade de espécies cruzadas dos anticorpos biespecíficos aos antígenos de MCSP D3 e CD3 e humano e de símio foi demonstrada.18. Bioatividade dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas de MCSP e CD3

[00339] A bioatividade dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos gerados foi analisada pela liberação do cromo 51 (51Cr) em ensaios de citotoxicidade in vitro utilizando as linhagens de células positivas de MCSP D3 descritas nos Exemplos 14 e 15. Como células efetoras, PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas estimuladas, as PBMCs humanas estimuladas ou a linhagem de células T 4119LnPx de símio são utilizadas como especificado nas figuras respectivas.A geração de PBMCs esgotadas de CD4/CD56 estimuladas foi executada tal como segue:

[00340] O revestimento de uma placa de Petri (145 mm de diâmetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) foi realizado com um anticorpo anti-CD3 específico comercialmente disponível (por exemplo, OKT3, Orthoclone) a uma concentração final de 1 μg/ml por uma hora a 37°C. A proteína não-ligada foi removida por uma etapa de lavagem com PBS. As PBMCs frescas foram isoladas do sangue periférico (30-50 ml de sangue humano) pela centrifugação do gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. 3-5 x 107 PBMCs foram adicionadas à placade Petri pré-revestida em 120 ml de RPMI 1640 com glutaminaestabilizada/10% de FCS/20 U/ml de IL-2(Proleukin, Chiron) e estimuladas por dois dias. No terceiro dia, as células foram coletadas e lavadas uma vez com RPMI 1640. A IL-2 foi adicionada a uma concentração final de 20 U/ml e as célulasforam cultivadas outra vez por um dia no mesmo meio de culturade células que aquele acima. Pelo esgotamento das células T de CD4+ e das células NK de CD56+ de acordo com protocolos padrão, os linfócitos T citotóxicos de CD8+ (CTLs) foram enriquecidos.

[00341] As células alvo foram lavadas duas vezes com PBS e etiquetadas com 11,1 MBq de 51Cr a um volume finalde 100 μl de RPMI com 50% de FCS por 45 minutos a 37°C. Ascélulas alvo etiquetadas foram lavadas subseqüentemente três vezes com 5 ml de RPMI e foram então utilizadas no ensaio decitotoxicidade. O ensaio foi executado em uma placa de 96 cavidades a um volume total de 250 μl de RPMI suplementado(tal como acima) com uma relação de E:T. de 10:1,1 μg/ml das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas e vinte diluições de três vezes das mesmas foram aplicadas. Ao utilizar o sobrenadante que contém as moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas, 21 diluições de duas vezes e 20 diluições de três vezes das mesmas foram aplicadas para o ensaio de citotoxicidade de humano e de símio, respectivamente. O tempo de ensaio foi de 18 horas e a citotoxicidade foi medida como os valores relativos do cromo liberado no sobrenadante relacionados à diferença da lise máxima (adição de Triton-X) e da lise espontânea (sem as células efetoras). Todas as medições foram feitas em quadruplicatas. A medição da atividade do cromo nos sobrenadantes foi executada com Wizard 3” Gamacounter (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemanha). A análise dos dados experimentais foi executada com Prism 4 for Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA). As curvas de resposta de dose sigmoidais têm tipicamente os valores de R2 > 0,90, tal como determinado pelo software. Os valores EC50 calculados pelo programa de análise foram utilizados para a comparação da bioatividade.

[00342] Conforme mostrado nas Figuras 17 a 21 e 59, todos os construtos do anticorpo de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas gerados demonstram atividade citotóxica contra as células alvo humanas positivas de MCSP D3 provocada pelas PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas estimuladas ou pelas PBMC estimuladas e contra as células alvo positivas de MCSP D3 de símio provocada pela linhagem de células T 4119LnPx de símio.19. Estabilidade no plasma dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas de MCSP e de CD3

[00343] A estabilidade dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos gerados no plasma humano foi analisada pela incubação dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos em 50% de plasma humano a 37°C e a 4°C por 24 horas e pelo teste da bioatividade subseqüente. A bioatividade foi estudada em uma liberação de cromo 51 (51Cr) no ensaio de citotoxicidade in vitro utilizando uma linhagem de células de CHO de MCSP positivas (que expressa MCSP como clonado de acordo com o Exemplo 14 ou 15) como as células alvo e as células T de CD8 positivas humanas estimuladas como as células efetoras.

[00344] Os valores EC50 calculados pelo programa de análise tal como descrito acima são utilizados para a comparação da bioatividade dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos incubados com 50% de plasma humano por 24 horas a 37°C e a 4°C, respectivamente, com os anticorpos de cadeia simples biespecíficos sem a adição do plasma ou misturados com a mesma quantidade de plasma imediatamente antes do ensaio.

[00345] Conforme mostrado na Figura 22 e na Tabela 3, a bioatividade dos anticorpos biespecíficos G4 H-L x I2C HL, G4 H-L x H2C H-L e G4 H-L x F12Q H-L não foi reduzida significativamente em comparação aos controles sem a adição do plasma ou com a adição do plasma imediatamente antes do teste da bioatividade.

[00346] Tabela 3: Bioatividade dos anticorposbiespecíficos sem ou com a adição do plasma

[00347] 20. A redistribuição de células Tcirculantes na ausência de células alvo circulantes pela primeira exposição às moléculas de ligação de CD3 dirigidas nos epítopos de CD3 convencionais, isto é, dependentes do contexto, é um fator de risco principal para os eventos adversos relacionados à iniciação do tratamento

[00348] A redistribuição das células T nos pacientes com Linfoma Não-Hodgkin de Células B (B-NHL) depois da iniciação do tratamento com a molécula de ligação de CD3 convencional.

[00349] As moléculas de ligação de CD19xCD3 convencionais são uma molécula de ligação de CD3 do formato de scFv em tandem biespecífico (Loffler (2000, Blood, Volume 95, número 6) ou o Pedido de Patente WO 99/54440). Consiste em duas porções de ligação diferentes dirigidas (i) em CD19 na superfície das células B humanas normais e malignas e (ii) em CD3 nas células T humanas. Pela reticulação de CD3 nas células T com CD19 nas células B, este construto provoca a lise redirigida das células B normais e malignas pela atividade citotóxica das células T. O epítopo de CD3 reconhecido por tal molécula de ligação de CD3 convencional é localizado na cadeia de CD3 epsilon, onde somente toma a conformação correta se for encaixado dentro do restante da cadeia epsilon e mantido na posição correta pela heterodimerização da cadeia epsilon com a cadeia gama ou delta CD3. A interação deste epítopo altamente dependente do contexto com uma molécula de ligação de CD3 convencional (vide, por exemplo, Loffler (2000, Blood, Volume 95, número 6) ou o Pedido de Patente WO 99/54440) - mesmo quando ocorre de uma forma puramente monovalente e sem reticulação - pode induzir uma mudança alostérica na conformação de CD3 conduzindo à exposição de uma região rica em prolina de outra maneira escondida dentro do domínio citoplasmático de CD3 epsilon. Uma vez exposta, a região rica em prolina pode recrutar a molécula de transdução de sinal Nck2, que é capaz de provocar sinais intracelulares adicionais. Embora isto não seja suficiente para a ativação completa das células T, que requer definitivamente a reticulação de diversas moléculas CD3 na superfície das células T, por exemplo, reticulação de diversas moléculas anti-CD3 ligadas a diversas moléculas CD3 em uma célula T por diversas moléculas CD19 na superfície de uma célula B, a interação monovalente pura das moléculas de ligação de CD3 convencionais a seu contexto que o epítopo dependente de CD3 epsilon não é ainda inerte para as células T em termos de sinalização. Sem ficar limitado pela teoria, as moléculas de ligação de CD3 convencionais monovalentes (conhecidas no estado da técnica) podem induzir algumas reações das células T quando infundidas em seres humanos mesmo naqueles casos em que nenhuma célula alvo circulante está disponível para a reticulação de CD3. Uma reação importante das células T à infusão intravenosa da molécula de ligação de CD19xCD3 convencional monovalente nos pacientes com B-NHL que não têm essencialmente nenhuma célula B circulante positiva de CD19 é a redistribuição das células T após o início do tratamento. Foi verificado em uma experimentação clínica de fase I que esta reação das células T ocorre durante a fase inicial da infusão intravenosa da molécula de ligação de CD19xCD3 em todos os indivíduos sem células B alvo positivas de CD19 essencialmente independentes da dose da molécula de ligação de CD19xCD3 (Figura 23). No entanto, foi verificado que os aumentos repentinos na exposição da molécula de ligação de CD19xCD3 provocam virtualmente a mesma reação das células T redistribucionais nestes pacientes como exposição inicial das células T à molécula de ligação de CD19xCD3 no início do tratamento (Figura 24A) e mesmo aumentos graduais na exposição da molécula de ligação de CD19xCD3 ainda podem ter efeitos redistribucionais nas células T circulantes (Figura 25). Além disso, foi verificado que esta reação das células T redistribucionais essencialmente independente de dose da na ausência de células alvo circulantes como provocada pelas moléculas de ligação de CD3 convencionais como a molécula de ligação de CD19xCD3 (por exemplo, descrito no Pedido de Patente WO 99/54440) em 100% de todos os indivíduos tratados é um fator de risco principal para os eventos adversos relacionados à iniciação do tratamento.

[00350] De acordo com o protocolo do estudo, os pacientes com Linfoma Não-Hodgkin de Células B (B-NHL) indolente histologicamente confirmado relapso incluindo o linfoma de células do manto foram recrutados em uma experimentação de escalação de dose interpaciente da fase I multi-centro. O protocolo do estudo foi aprovado pelos comitês de ética independentes de todos os centros participantes e foi enviado para a notificação à autoridade regulatória responsável.

[00351] Uma doença mensurável (pelo menos uma lesão > 1,5 cm), tal como documentado pela varredura por TC, foi requerida para a inclusão no estudo. Os pacientes receberam a molécula de ligação de CD19xCD3 convencional por infusão intravenosa contínua com um sistema portátil do minibomba durante quatro semanas a uma vazão constante (isto é, nível de dose). Os pacientes foram hospitalizados durante as primeiras duas semanas do tratamento antes que fossem liberados do hospital e continuassem o tratamento em casa. Os pacientes sem evidência de progressão da doença após quatro semanas foram oferecidos para continuar o tratamento por mais quatro semanas. Até esse ponto, seis níveis de dose diferentes foram testados sem atingir uma dose tolerada máxima (MTD): 0,5, 1,5, 5, 15, 30 e 60 μg/m2/24 horas. As coortes consistiram em três pacientes, cada uma se nenhum evento adverso definido pelo protocolo do estudo como DLT (toxicidade de limitação de dose) fosse observado. No caso de uma DLT entre os primeiros três pacientes, a coorte era expandida para seis pacientes, que - na ausência de uma segunda DLT - permitiram uma escalação dedose adicional. Conseqüentemente, os níveis de dose sem a DLT nas coortes com 3 pacientes ou com uma DLT nas coortes com 6pacientes foram considerados como seguros. O tratamento do estudo foi interrompido em todos os pacientes que desenvolveram DLT. A 15 e 30 μg/m2/24 horas, os diferentes modos de iniciação do tratamento durante as primeiras 24 horas foram testados em diversas coortes adicionais: (i) Aumento em etapas após 5μg/m2/24 horas para as primeiras 24 horas a uma dose demanutenção de 15 μg/m2/24 horas (coorte de pacientes de 15 etapas), (ii) aumento contínuo uniforme da vazão de quase zero a 15 ou 30 μg/m2/24 horas (coortes de pacientes de 15 inclinadoe 30 inclinado) e (iii) início com a dose de manutenção do começo (coortes de pacientes com 15 planos, 30 planos e 60planos). Todas as coortes de pacientes em níveis de dose de 0,5, 1,5 e 5 μg/m2/24 horas foram iniciadas com a dose demanutenção do começo (isto é, iniciação plana).

[00352] Os cursos de tempo das contagens absolutas das células B e T no sangue periférico foram determinados por quatro análises de FACS de cor tal como segue:Coleta de amostras de sangue e análise rotineira

[00353] As amostras de sangue de 15 inclinados, 15 planos, 30 inclinados, 30 planos e 60 planos de coortes de pacientes (6 ml) foram obtidas antes e 0,75, 2, 6, 12, 24, 30,48 horas após o início da infusão da molécula de ligação de CD19xCD3 (tal como descrito no Pedido de Patente WO 99/54440) bem como nos dias de tratamento 8, 15, 17, 22, 24, 29, 36, 43,50, 57 e quatro semanas após o término da infusão da moléculade ligação convencional CD19xCD3 utilizando os tubos Vacutainer™ contendo EDTA (Becton Dickinson) que foram enviados para análise a 4°C. Nas coortes de pacientes, as amostras de sangue de 15 etapas (6 ml) foram obtidas antes e 6, 24, 30, 48 horas após o início da infusão da molécula deligação de CD19xCD3 bem como nos dias de tratamento 8, 15, 22,29, 36, 43, 50, 57 e quatro semanas após o término da infusãoda molécula de ligação de CD19xCD3. Nos níveis de dose, as amostras de sangue de 0,5, 1,5 e 5 μg/m2/24 horas (6 ml) foramobtidas antes e 6, 24, 48 horas após o início da infusão damolécula de ligação de CD19xCD3 bem como nos dias de tratamento 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57 e quatro semanas após o términoda infusão da molécula de ligação de CD19xCD3. Em alguns casos, ligeiras variações destes pontos de tempo ocorreram por razões operacionais. A análise de FACS das subpopulações de linfócitos foi executada dentro de 24 - 48 h após a coleta da amostra desangue. Os números absolutos das subpopulações de leucócitosnas amostras de sangue foram determinados através da análisede sangue diferencial em um CoulterCounter™ (Coulter).Isolamento de PBMCs das amostras de sangue

[00354] O isolamento de PBMCs (célulasmononucleares do sangue periférico) foi executado por um protocolo de separação de gradiente adaptado Ficoll™. O sanguefoi transferido à temperatura ambiente aos tubos com 10 ml deLeucosep™ (Greiner) pré-carregado com 3 ml da solução Biocoll™ (Biochrom). A centrifugação foi realizada em um rotor de impulsão por quinze minutos em 1700xg e a 22°C sem desaceleração. As PBMCs acima da camada Biocoll™ foram isoladas, lavadas uma vez com o tampão de FACS (PBS/2% de FBS [Fetal Bovine Serum; Biochrom]), centrifugadas e ressuspensasno tampão de FACS. A centrifugação durante todas as etapas delavagem foi realizada em um rotor de impulsão por quatro minutos em 800xg e a 4°C. Se necessário, a lise dos eritrócitosfoi executada ao incubar as PBMCSs isoladas em 3 ml do tampãoda lise de eritrócitos (8,29 g de NH4Cl, 1,00 g de KHCO3, 0,037g de EDTA e 1,0 l de H2Obidest, pH 7,5) por cinco minutos à temperatura ambiente seguida por uma etapa de lavagem com otampão de FACS.Tingimento das PBMCs com os anticorpos etiquetados por fluorescência contra as moléculas da superfície da célula

[00355] Os anticorpos monoclonais foram obtidos junto à Invitrogen (1Cat. n°. MHCD1301. 2Cat. n°. MHCD1401),Dako (5Cat. n°. C7224) ou junto à Becton Dickinson (3Cat. n°.555516. 4Cat. n°. 345766) utilizados de acordo com asrecomendações do fabricante. 5x105 - 1x106 células foramtingidas com a seguinte combinação de anticorpo: anti-CD131 /anti-CD142 (FITC) x anti-CD563 (PE) x anti-CD34 (PerCP) x anti- CD195 (APC). As células foram peletizadas em placas de títulos múltiplos de 96 cavidades em formato de V (Greiner) e o sobrenadante foi removido. As pelotas da célula foram ressuspensas a um volume total de 100 μl contendo os anticorpos específicos diluídos no tampão de FACS. A incubação foi realizada no escuro por trinta minutos a 4°C. Subseqüentemente, as amostras foram lavadas duas vezes com o tampão de FACS e aspelotas da célula foram ressuspensas no tampão de FACS para aanálise citométrica de fluxo.Detecção citométrica de fluxo dos linfócitos tingidos por FACS

[00356] O levantamento de dados foi executado com FACSCalibur™ BD de quatro cores (Becton Dickinson). Para cada medição, 1x104 células das subpopulações de linfócitos definidas foram adquiridas. A análise estatística foi executada com o programa CellQuest Pro™ (Becton Dickinson) para obter porcentagens da subpopulação de linfócitos e para classificar a intensidade de expressão da molécula da superfície da célula. Subseqüentemente, as porcentagens dos subconjuntos de linfócitos únicos relacionados aos linfócitos totais (isto é, as células B mais T mais NK excluindo quaisquer células mielóides através do tingimento de CD13/14), tal como determinado por FACS, foram correlacionadas com a contagem de linfócitos da análise de sangue diferencial para calcular osnúmeros absolutos de células das células T (CD3+, CD56,CD13/14) e das células B (CD19+, CD13/14).

[00357] A redistribuição das células T durante a fase inicial de tratamento da molécula de ligação de CD19xCD3 convencional (por exemplo, descrito no Pedido de Patente WO 99/54440) em todos aqueles pacientes que não tiveram essencialmente nenhuma célula B de CD19 circulante positiva no início do tratamento é mostrada (Figura 23). Para comparação, um exemplo representativo de redistribuição das células T durante a fase inicial de tratamento da molécula de ligação de CD19xCD3 em um paciente com um número significativo de células B de CD19 circulantes positivas é mostrado na Figura 26.

[00358] Em ambos os casos (isto é, essencialmente nenhuma ou muitas células B e T circulantes), as contagens de células circulantes diminuem rapidamente quando do início do tratamento. No entanto, na ausência de células B circulantes, as células T tendem a retornar muito cedo ao sangue circulante, sendo que o retorno das células T ao sangue circulante daqueles pacientes que têm um número significativo de células B circulantes no início do tratamento é geralmente atrasado até que estas células B circulantes estejam esgotadas. Desse modo, os padrões de redistribuição das células T diferem principalmente na cinética de reaparecimento das células T no sangue circulante.

[00359] A avaliação da eficácia com base na varredura por TC foi realizada pela radiologia de referência central após quatro semanas de tratamento e nos pacientes quereceberam mais quatro semanas também, após oito semanas de tratamento mais, em todos os casos, quatro semanas após o fimdo tratamento. O desaparecimento e/ou a normalização no tamanho de todas as lesões conhecidas (incluindo um baço ampliado) mais a depuração da medula óssea das células de linfoma nos casos de infiltração da medula óssea foram contados como a resposta completa (CR). A redução de pelo menos 50% da linha de base da soma dos produtos dos dois diâmetros maiores (SPD) de cada lesão predefinida alvo foi definida como a resposta parcial (PR); uma redução de pelo menos 25% foi considerada uma resposta mínima (MR). A doença progressiva (PD) foi definida como um aumento de 050% dos SPD da linha de base. Os desvios de SPD de uma linha de base entre +50% e -25% foram considerados como doença estável (SD).

[00360] A demografia do paciente, as doses recebidas e o resultado clínico em 34 pacientes são resumidos na Tabela 4. A atividade anti-tumor clínica da molécula de ligação de CD19xCD3 era claramente dependente da dose: Oesgotamento consistente de células B de CD19 positivas circulantes (linfoma) do sangue periférico foi observado a partir de 5 μg/m2/24h. Em 15 μg/m2/24 horas e 30 μg/m2/24 horas, as respostas clínicas objetivas (em PRs e CRs) foram gravadas primeiramente bem como os casos de eliminação parcial e completa das células B de linfoma da medula óssea infiltrada. Finalmente, em 60 μg/m2/24 horas, a taxa de resposta aumentou 100% (PRs e CRs) e a depuração da medula óssea das células B de linfoma estava completa em todos os casos avaliáveis.

[00361] A molécula de ligação de CD19xCD3 foi bem tolerada pela maioria dos pacientes. A maioria dos eventos adversos freqüentes dos tipos 1-4 em 34 pacientes, não obstante a causalidade é resumida na Tabela 5. Os eventos adversos relacionados à molécula de ligação de CD19xCD3 eram geralmente transientes e inteiramente reversíveis. Em particular, havia dois pacientes (pacientes #19 e #24 na Tabela 4) essencialmente sem as células B de CD19 positivas circulantes cujo tratamento foi interrompido cedo por causa dos eventos adversos ao SNC (sintomas principais: confusão e desorientação) relacionados à redistribuição repetida das células T durante a fase inicial de infusão da molécula de ligação de CD19xCD3.

[00362] Um destes pacientes (#19) estava na coorte de quinze etapas. Ele recebeu 5 μg/m2/24 horas da molécula de ligação de CD19xCD3 para as primeiras 24 horas seguido pelo aumento repentino a uma dose de manutenção de 15 μg/m2/24h. O padrão correspondente da redistribuição das células T mostra que as contagens das células T circulantes diminuíram rapidamente quando do início da infusão a 5 μg/m2/24 horas seguido pelo reaparecimento precoce das células T no sangue circulante essencialmente sem células B de CD19 circulantes positivas. Conseqüentemente, as contagens periféricas das células T tinham sido inteiramente recuperadas quando a dose da molécula de ligação de CD19xCD3 foi aumentada após 24 horas de 5 a 15 μg/m2/24h. Portanto, a etapa de dose poderia provocar um segundo episódio de redistribuição das células T conforme mostrado na Figura 24A. Esta redistribuição de células T repetida foi relacionada com os efeitos colaterais do SNC (sintomas principais: confusão e desorientação) nestepaciente, que conduziu à interrupção da infusão. A relação entre a redistribuição repetida das células T e tais eventos adversos ao SNC também foi observada em experimentações clínicas da fase I precedente nos pacientes com B-NHL que receberam a molécula de ligação de CD19xCD3 (por exemplo, descrito no Pedido de Patente WO 99/54440) como a infusão de bolus repetida por duas a quatro horas, cada uma seguida geralmente por dois dias de intervalo livre de tratamento (Figura 24B). Cada infusão de bolus única provocou um episódio de redistribuição das células T que consiste em uma diminuiçãorápida nas contagens de células T circulantes e da recuperaçãodas células T antes da infusão de bolus seguinte. No total, oseventos adversos ao SNC relacionados à redistribuição repetida das células T foram observados em 5 de 21 pacientes. A Figura24B mostra o exemplo representativo de um paciente das experimentações de infusão de bolus, que desenvolveram sintomas do SNC após o terceiro episódio de redistribuição das células T. Tipicamente, os pacientes com eventos adversos ao SNC nas experimentações de infusão de bolus também tiveram baixas contagens de células B circulantes.

[00363] O segundo paciente (#24) da experimentação de infusão contínua, cujo tratamento foi interrompido logo por causa dos eventos adversos ao SNC (sintomas principais: confusão e desorientação) relacionados à redistribuição repetida das células T durante a fase inicial de infusão da molécula de ligação de CD19xCD3, estava na coorte 15-flat. Por engano, este paciente recebeu uma infusão da molécula de ligação de CD19xCD3 sem HSA adicional como requerido para aestabilização da droga. O fluxo desigual resultante da droga provocou episódios repetidos de redistribuição das células Tem vez de somente um (Figura 27A) com a conseqüência que a infusão teve que ser interrompida por causa do desenvolvimento de sintomas do SNC. Ainda assim, quando o mesmo paciente reiniciou corretamente com a solução da molécula de ligação de CD19xCD3 que contém HSA adicional para a estabilização da droga (por exemplo, descrito no Pedido de Patente WO 99/54440), nenhuma redistribuição repetida das células T foi observada e, novamente, o paciente não desenvolveu nenhum sintoma do SNC (Figura 27 B). Já que este paciente também não teveessencialmente nenhuma célula B circulante, as células T circulantes poderiam reagir com a cinética de redistribuição rápida mesmo a mudanças sutis na exposição da droga, tal como observado. Os eventos adversos ao SNC relacionados à redistribuição das células T nos pacientes que não têm essencialmente nenhuma célula alvo circulante podem ser explicados por um aumento transiente da aderência das células T às células endoteliais seguido pela aderência simultânea em massa das células T circulantes às paredes dos vasos sangüíneos com uma queda consecutiva dos números das células T no sanguecirculante, tal como observado. A fixação simultânea em massa das células T às paredes dos vasos sangüíneos pode causar umaumento da permeabilidade endotelial e ativação das células endoteliais. As conseqüências da permeabilidade endotelial aumentada são deslocamentos de fluidos do compartimento intravenoso aos compartimentos do tecido intersticial, incluindo o interstício do SNC. A ativação das células endoteliais pelas células T fixadas pode ter efeitos pró- coagulatórios (Monaco et al. J Leukoc Biol 71 (2002) 659-668)com distúrbios possíveis no fluxo sangüíneo (incluindo fluxo sangüíneo cerebral) particularmente no que diz respeito à microcirculação capilar. Desse modo, os eventos adversos ao SNC relacionados à redistribuição das células T nos pacientes essencialmente sem as células alvo circulantes podem ser a conseqüência de vazamento capilar e/ou distúrbios na microcirculação capilar através da aderência das células T às células endoteliais. O stress endotelial causado por um episódio de redistribuição das células T é tolerado pela maioria dos pacientes, sendo que o stress endotelial intensificado causado pela redistribuição repetida das células T causa normalmente eventos adversos ao SNC. Mais de um episódio de redistribuição das células T pode ser menos arriscado somente nos pacientes que têm baixas contagens da linha de base de células T circulantes. No entanto, também o stress endotelial limitado causado por um episódio de redistribuição das células T pode causar eventos adversos ao SNC em casos raros de suscetibilidade aumentada para eventos, tal como observado em 1 de 21 pacientes nas experimentações deinfusão de bolus com a molécula de ligação de CD19xCD3.

[00364] Sem ficar limitado pela teoria, o aumento transiente da aderência das células T às células endoteliais nos pacientes que não têm essencialmente nenhuma célula alvo circulante pode ser explicado como a reação das células T à interação monovalente de uma molécula de ligação de CD3 convencional, tal como a molécula de ligação de CD19xCD3 (por exemplo, Pedido de Patente WO 99/54440), a seu epítopo dependente do contexto em CD3 epsilon, tendo por resultado uma mudança alostérica na conformação de CD3 seguida pelo recrutamento de Nck2 ao domínio citoplasmático de CD3 epsilon tal como descrito acima. Como Nck2 está ligado diretamente às integrinas através de PINCH e ILK (Figura 28), o recrutamento de Nck2 ao domínio citoplasmático de CD3 epsilon que segue uma mudança alostérica na conformação de CD3 através da ligação de uma molécula de ligação de CD3 convencional, tal como a molécula de ligação de CD19xCD3, a seu epítopo dependente do contexto em CD3 epsilon, pode aumentar a aderência das células T às células endoteliais ao comutar transientemente as integrinas na superfície das células T em sua isoforma mais aderente através da sinalização de dentro para fora.

[00365] Tabela 4: Demografia de paciente e resultado clínico

[00366] *Respostas completas (CR) e parciais (PR)confirmadas centralmente por critérios de Cheson em negrito; MR, resposta mínima (>25 < a 50%); SD, doença estável; PD, doença progressiva; duração da primeira documentação de resposta em parênteses; + denota uma resposta crescente.

[00367] aA coorte 4 foi expandida para estudar três programações diferentes de iniciação de tratamento .

[00368] bPR após oito semanas de tratamento que se tornou uma CR após um ciclo adicional de tratamento de 4 semanas na mesma dose seguindo sete semanas do intervalo livre de tratamento.

[00369] n.e.: não avaliável, por causa do período de tratamento < sete dias.

[00370] n.d.: não determinado (infiltrado, masnenhuma segunda biópsia executada no fim do tratamento.

[00371] n.i.: não infiltrado no início dotratamento.

[00372] Tabela 5: Incidência de eventosadversos observados durante o tratamento

[00374] As abreviaturas utilizadas são: AE, eventoadverso; AP, fosfatase alcalina; LDH, desidrogenase de lactato; CRP, proteína C reativa; ALT, transaminase de alanina; AST, transaminase de aspartato; GGT, transferase de gama- glutamila; dados de AE do ciclo de tratamento adicional do paciente 34 ainda não incluídos.

[00375] Tal como explicado acima, as moléculas de ligação de CD3 convencionais (por exemplo, descritas no Pedido de Patente WO 99/54440) capazes de se ligar a um epítopo dependente do contexto, embora funcionais, conduzem ao efeito indesejado de redistribuição das células T nos pacientes, causando eventos adversos ao SNC. Por outro lado, as moléculas de ligação da presente invenção, ao se ligar aos aminoácidos independentes do contexto de N-terminal 1-27 da cadeia de CD3 epsilon, não conduzem a tais efeitos de redistribuição das células T. Conseqüentemente, as moléculas de ligação de CD3 da invenção são associadas a um melhor perfil de segurança em comparação às moléculas de ligação de CD3 convencionais.21. Moléculas de ligação de CD3 biespecíficas da invenção que induzem a lise de células alvo mediada por células T ao reconhecer um antígeno de superfície alvo esgotado das células positivas do antígeno alvo in vivo

[00376] Uma molécula de ligação de CD3 biespecífica da invenção que reconhece CD33 como o antígeno alvo esgota os monócitos circulantes de CD33 positivos do sangue periférico de macacos cinomolgos

[00377] CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL (seqüência de aminoácido: SEQ ID NO. 415) foi produzido pela expressão nascélulas de CHO utilizando a seqüência de nucleotídeo de codificação da SEQ ID NO. 416. As seqüências de codificação (i) de um líder de cadeia pesada de imunoglobulina de N- terminal que compreende um códon inicial encaixado dentro de uma seqüência de consenso de Kozak e (ii) um tag de His6 de C-terminal seguido por um códon de interrupção foram ambos unidos enquadrado à seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO. 416 antesda inserção do fragmento de DNA resultante, tal como obtidopela síntese de genes no sítio de clonagem múltiplo do vetor de expressão de pEF-DHFR (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). A transfecção estável das células de CHOdeficientes em DHFR, a seleção para transfectantes DHFR positivos que secretam a molécula de ligação de CD3 de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL ao sobrenadante da cultura e a amplificação de genes da cultura com metotrexato para níveiscrescentes de expressão foram realizadas tal como descrito (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 92 (1995) 7021-7025).O material de teste para o tratamento de macacos cinomolgosfoi produzido em um fermentador de 200 litros. A purificaçãoda proteína da colheita de 3 execuções da produção se baseouna cromatografia de afinidade de IMAC que alveja o tag de His6de C-terminal de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL seguido pela cromatografia de exclusão de tamanho preparativa (SEC). O rendimento total do material livre de endotoxina final do teste foi de 60 mg. O perfil de SEC analítico de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL para o uso em macacos cinomolgos revelou que o material de teste consistiu quase exclusivamente no monômero. A potência do material de teste foi medida em um ensaio de citotoxicidade tal como descrito no Exemplo 23.5 utilizando as células de CHO transfectadas com CD33 de cinomolgo como as células alvo e a linhagem de células T 4119LnPx de símio como a fonte de células efetoras (Figura 29). A concentração de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL requerida para a lise média máxima de células alvo pelas células T efetoras (EC50) foi determinada como sendo 2,7 ng/ml.

[00378] Macacos cinomolgos jovens (com aproximadamente três anos) (Macaca fascicularis) foram tratados por infusão intravenosa contínua da molécula de ligação de CD3 de CD33-AF5v VH-VL x I2C VH-VL em vazões diferentes (isto é, níveis de dose) para estudar o esgotamento dos monócitos CD33 positivos circulantes do sangue periférico. Esta situação é equivalente ao tratamento com a molécula de ligação de CD3 de CD19xCD3 convencional (específica para CD19 nas células B e CD3 nas células T) daqueles pacientes com B- NHL que têm células B alvo CD19 positivas circulantes (vide, por exemplo, o Pedido de Patente WO 99/54440). O esgotamento das células B alvo CD19 positivas circulantes do sangue periférico tinha se tornado um substituto válido para a eficácia clínica geral da molécula de ligação de CD3 convencional (CD19xCD3 como provido no Pedido de Patente WO99/54440) nos pacientes com malignomas de células B CD19 positivas como o B-NHL. Do mesmo modo, o esgotamento dos monócitos CD33 positivos circulantes do sangue periférico é considerado como um substituto válido para a eficácia clínica geral das moléculas de ligação de CD3 biespecíficas dirigidas a de CD33 da invenção como CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL nos pacientes com malignomas mielóides CD33 positivos como AML (leucemia mielóide aguda).

[00379] A infusão contínua foi realizada de acordo com o método de Swivel tal como segue: Os macacos são cateterizados através da veia femoral à veia cava caudal utilizando um cateter de veia. O cateter é introduzido subcutaneamente na região dorsal do ombro e sai pela escápula caudal. Um tubo é então passado através de uma camisa e de uma mola de proteção. A camisa é presa em torno do animal e o cateter, através do tubo, é conectado a uma bomba de infusão.

[00380] A solução de administração (1,25 M de lisina, 0,1% de Tween 80, pH 7) sem o material de teste foi infundida continuamente em 48 ml/24 horas por sete dias antes do início do tratamento para permitir a climatização dos animais às condições da infusão. O tratamento foi iniciado pela adição do material de teste de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH- VL à solução de administração na quantidade requerida para cada nível de dose individual a ser testado (isto é, vazão de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL). O reservatório da infusão foi mudado todos os dias durante a fase inteira de climatização e de tratamento. A duração do tratamento planejada era de sete dias com exceção do nível de dose de 120μg/m2/24 horas, em que os animais receberam 14 dias de tratamento.

[00381] Os cursos de tempo das contagens absolutas nas células T circulantes e dos monócitos de CD33 positivos foram determinados pela análise de FACS de três cores ou de quatro cores, respectivamente: Coleta das amostras de sangue e análise rotineira

[00382] As amostras de sangue (1 ml) foram obtidas antes e 0,75, 2, 6, 12, 24, 30, 48, 72 horas após o início da infusão contínua com MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL bem como após sete e catorze dias (e após nove dias no nível de dose de 120 μg/m2/24h) de tratamento utilizando os tubos Vacutainer™ contendo EDTA (Becton Dickinson) que foram enviados para análise a 4°C. Em alguns casos, ligeiras variações destes pontos de tempo ocorreram por razões operacionais. A análise de FACS das subpopulações de linfócitos foi executada dentro de 24 - 48 horas após a coleta da amostra de sangue. Os números absolutos das subpopulações de leucócitos nas amostras de sangue foram determinados através da análise de sangue diferencial em um laboratório veterinário rotineiro.Isolamento de PBMCs das amostras de sangue

[00383] O isolamento de PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) foi executada por um protocolo de separação de gradiente adaptado Ficoll™. O sangue foi transferido à temperatura ambiente a tubos Falcon™ de 5 ml pré-carregados com 1 ml da solução Biocoll™ (Biochrom). A centrifugação foi realizada em um rotor de impulsão por quinze minutos em 1700xg e a 22°C sem desaceleração. As PBMCs acima da camada Biocoll™ foram isoladas, lavadas uma vez com o tampão de FACS (PBS/2% de FBS [Fetal Bovine Serum; Biochrom]), centrifugadas e ressuspensas no tampão de FACS. A centrifugação durante todas as etapas de lavagem foi realizada em um rotor de impulsão por 4 minutos em 800xg e a 4°C. Se necessário, a lise dos eritrócitos era executada ao incubar as PBMCSs isoladas em de 3 ml do tampão da lise de eritrócitos (8,29 g de NH4Cl, 1,00 g de KHCO3, 0,037 g de EDTA e 1,0 l de H2Obidest, pH 7,5) por cinco minutos à temperatura ambiente seguida por uma etapa de lavagem com o tampão de FACS.Tingimento de PBMCs com os anticorpos etiquetados por fluorescência contra as moléculas da superfície da célula

[00384] Os anticorpos monoclonais reativos com antígenos de cinomolgo foram obtidos junto à Becton Dickinson(1Cat. N°. 345784, 2Cat. N°. 556647, 3Cat. N°. 552851, 6Cat.N°. 557710), Beckman Coulter (4Cat. N°. IM2470) e Miltenyi(5Cat. N°. 130-091-732) e utilizados de acordo com asrecomendações do fabricante. 5x105 - 1x106 células foramtingidas com as seguintes combinações de anticorpo: anti-CD141 (FITC) x anti-CD562 (PE) x anti-CD33 (PerCP) x anti-CD194 (APC) e anti-CD141 (FITC) x anti-CD335 (PE) x anti-CD166 (Alexa Fluor 647™). As células foram peletizadas em placas de títulos múltiplos de 96 cavidades em formato de V (Greiner) e o sobrenadante foi removido. As pelotas da célula foram ressuspensas a um volume total de 100 μl contendo os anticorposespecíficos diluídos no tampão de FACS. A incubação foi realizada no escuro por trinta minutos a 4°C. Subseqüentemente, as amostras foram lavadas duas vezes com o tampão de FACS e aspelotas de célula foram ressuspensas no tampão de FACS para aanálise citométrica de fluxo.Detecção citométrica de fluxo de linfócitos tingidos por FACS

[00385] O levantamento de dados foi executado com FACSCalibur™ BD de quatro cores (Becton Dickinson). Para cada medição, 1x104 células das subpopulações definidas de linfócitos foram adquiridas. A análise estatística foi executada com o programa CellQuest Pro™ (Becton Dickinson) para obter porcentagens da subpopulação de linfócitos e para classificar a intensidade de expressão da molécula de superfície da célula. Subseqüentemente, as porcentagens dos subconjuntos de linfócitos únicos relacionados aos linfócitos totais (isto é, as células B mais T mais NK excluindo as células mielóides através do tingimento de CD14), tal como determinado por FACS, foram correlacionadas com a contagem de linfócitos da análise diferencial do sangue para calcular números de células absolutos das células T (CD3+, CD56, CD14).Os números absolutos de monócitos CD33 positivos foram calculados ao multiplicar as contagens de monócitos da análisediferencial do sangue com as relações correspondentes dos monócitos CD33 positivos (CD33+, CD14+) a todos os monócitos(CD14+), tal como determinado por FACS.

[00386] A porcentagem comparada à linha de base (isto é, 100%) das contagens absolutas dos monócitos CD33 positivos circulantes no fim do tratamento com o CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL em quatro coortes de dois macacos cinomolgos com a escalação de dose inter-coorte de 30 a mais de 60 e 240a 1000 μg/m2/24 horas são mostradas na Figura 30A.

[00387] Conforme mostrado na Figura 30A, a infusão intravenosa contínua de CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL induz o esgotamento dos monócitos CD33 positivos circulantes de uma maneira dependente de dose. Quando não havia ainda nenhum esgotamento detectável dos monócitos CD33 positivos circulantes em 30 μg/m2/24 horas, uma primeira tendência para uma redução das contagens de monócitos CD33 positivos tornou- se visível em 60 μg/m2/24 horas após sete dias de tratamento. Em 240 μg/m2/24 horas, os monócitos CD33 positivos foram esgotados quase completamente do sangue periférico após três dias de tratamento. Isto foi atingido ainda mais rapidamente em 1.000 μg/m2/24 horas, onde o esgotamento dos monócitos CD33 positivos circulantes do sangue periférico já foi terminado após um dia de tratamento.

[00388] Esta descoberta foi confirmada pelos resultados mostrados na Figura 30B que demonstra o esgotamento dos monócitos CD33 positivos circulantes em dois terços e 50% comparado à linha de base respectiva em dois macacos cinomolgos tratados pela infusão contínua com o CD33-AF5 VH-VL x I2C VH- VL em 120 μg/m2/24 horas por catorze dias.

[00389] Este resultado é um claro sinal da eficácia clínica das moléculas de ligação de CD3 da invenção em geral e das moléculas de ligação biespecíficas de CD3 dirigidas a CD33 da invenção para o tratamento de malignomas de CD33 positivos como a AML em particular. Além disso, a redistribuição das células T durante a fase inicial de tratamento com CD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL na presença das células alvo circulantes (isto é, monócitos CD33 positivos) parece ser menos acentuada do que a redistribuição das células T durante a fase inicial de tratamento com os construtos CD19xCD3 convencionais, tal como descrito no Pedido de PatenteWO99/54440 em pacientes com B-NHL com um número significativode células alvo circulantes (isto é, células B de CD19 positivas) conforme mostrado na Figura 26. Embora as célulasT desapareçam completamente da circulação quando do início da infusão de CD19xCD3 e não reapareçam até que as células B alvo de CD19 positivas circulantes estejam esgotadas do sangue periférico (Figura 26), o desaparecimento inicial das célulasT circulantes está incompleto quando do início da infusão comCD33-AF5 VH-VL x I2C VH-VL e as contagens das células T sãorecuperadas ainda durante a presença das células alvo de CD33 positivas (Figura 30B). Isto confirma que as moléculas de ligação de CD3 da invenção (dirigidas contra e geradas contra um epítopo da cadeia epsilon) de CD3ε de humano e de primata não-chimpanzé e que formam uma parte ou um fragmento da seqüência de aminoácido de comprimento completo, tal como provido na SEQ ID NO. 2, 4, 6 ou 8), ao reconhecer um epítopo de CD3 de independente do contexto, mostram um perfil de redistribuição mais favorável das células T do que as moléculas de ligação de CD3 convencionais que reconhecem um epítopo de CD3 dependente do contexto, tal como as moléculas de ligação providas no Pedido de Patente WO99/54440.22. Moléculas de ligação de CD3 da invenção dirigidas essencialmente nos epítopos CD3 independentes do contexto ao induzir menos redistribuição das células T circulantes na ausência das células alvo circulantes reduzem o risco de eventos adversos relacionados à iniciação do tratamento- Redistribuição reduzida das células T em macacos cinomolgos após a iniciação do tratamento com uma molécula de ligação de CD3 específica de espécies cruzadas representativa da invenção

[00390] MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL (seqüência de aminoácido: SEQ ID NO. 313) foi produzido pela expressão nas células de CHO utilizando a seqüência de nucleotídeo da codificação da SEQ ID NO. 314. As seqüências de codificação (i) de um líder de cadeia pesada de imunoglobulina de N- terminal que compreendem um códon inicial encaixado dentro de uma seqüência de consenso de Kozak e (ii) um tag de His6 de C- terminal seguido por um códon de interrupção foram ambos unidos enquadrado à seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO. 314 antes da inserção do fragmento de DNA resultante, tal como obtido pela síntese de genes no sítio de clonagem múltiplo do vetor de expressão de pEF-DHFR (Raum et. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). A transfecção estável das células de CHO deficientes em DHFR, a seleção para transfectantes DHFR positivos que secretam a molécula de ligação de CD3 de MCSP- G4 VH-VL x I2C VH-VL ao sobrenadante da cultura e a amplificação de genes da cultura com metotrexato para níveis crescentes de expressão foi realizada tal como descrito (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 92 (1995) 7021-7025). O material de teste para o tratamento de macacos cinomolgos foi produzido em um fermentador de 200 litros. A purificação da proteína da colheita se baseou na cromatografia de afinidade de IMAC que alveja o tag de His6 de C-terminal de MCSP-G4 VH- VL x I2C VH-VL seguido pela cromatografia de exclusão de tamanho preparativa (SEC). O rendimento total do material de teste livre de endotoxina final era de 40 mg. O material de teste consistiu em 70% de monômero, 30% de dímero e uma pequena contaminação de multímero superior. A potência do material de teste foi medida em um ensaio de citotoxicidade tal como descrito no Exemplo 18 utilizando as células de CHO transfectadas com MCSP de cinomolgo como as células alvo e a linhagem de células T 4119LnPx de símio como a fonte de células efetoras (Figura 31). A concentração de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL requerida para a lise média máxima de células alvo pelas células T efetoras (EC50) foi determinada como sendo 1,9 ng/ml.

[00391] Macacos cinomolgos jovens (com aproximadamente três anos) (Macaca fascicularis) foram tratados por infusão intravenosa contínua da molécula de ligação de CD3 de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL em vazões diferentes (isto é, níveis de dose) para estudar a redistribuição de células T circulantes após a iniciação do tratamento na ausência de células alvo circulantes. Embora a molécula de ligação de CD3 de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL possa reconhecer MCSP de cinomolgo e CD3 de cinomolgo, não há nenhuma célula circulante no sangue que expresse MCSP. Portanto, a única interação possível no sangue circulante é a ligação do braço específico de CD3 de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL a CD3 nas células T. Esta situação é equivalente ao tratamento com a molécula de ligação de CD3 convencional (molécula de ligação de CD19xCD3 específica para CD19 nas células B e CD3 nas células T) daqueles pacientes com B-NHL, que não têm nenhuma célula B alvo circulante de CD19 positiva, tal como descrito no Exemplo 20.

[00392] A infusão contínua foi realizada de acordo com o método de Swivel tal como segue: Os macacos são cateterizados através da veia femoral à veia cava caudal utilizando um cateter de veia. O cateter é introduzido subcutaneamente na região dorsal do ombro e sai na escápula caudal. Um tubo é então passado através de uma camisa e de uma mola de proteção. A camisa é presa em torno do animal e o cateter, através do tubo, é conectado a uma bomba de infusão.

[00393] A solução de administração (1,25 M de lisina, 0,1% de Tween 80, pH 7) sem material de teste foi infundida continuamente em 48 ml/24 horas por sete dias antes do início do tratamento para permitir a climatização dos animais às condições da infusão. O tratamento foi iniciado pela adição do material de teste de MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL à solução de administração na quantidade requerida para cada nível de dose individual a ser testado (isto é, vazão de MCSP- G4 VH-VL x I2C VH-VL). O reservatório da infusão foi mudado todos os dias durante a fase inteira de climatização e de tratamento. A duração do tratamento foi de sete dias.

[00394] Os cursos de tempo das contagens absolutas de células T no sangue periférico foram determinados pela análise de FACS de 4 cores tal como segue:Coleta de amostras de sangue e análise rotineira

[00395] As amostras de sangue (1 ml) foram obtidas antes e 0,75, 2, 6, 12, 24, 30, 48, 72 horas após o início da infusão contínua com MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL bem como após sete dias de tratamento utilizando os tubos Vacutainer™ contendo EDTA (Becton Dickinson) que foram enviados para análise a 4°C. Em alguns casos, ligeiras variações destes pontos de tempo ocorreram por razões operacionais. A análise de FACS das subpopulações de linfócitos foi executada dentro de 24 - 48 horas após a coleta da amostra de sangue. Os números absolutos das subpopulações de leucócitos nas amostras de sangue foram determinados através da análise de sangue diferencial em um laboratório veterinário rotineiro.Isolamento das PBMCs das amostras de sangue

[00396] O isolamento das PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) foi executada por um protocolo de separação de gradiente adaptado Ficoll™. O sangue foi transferido à temperatura ambiente aos tubos Falcon™ de 5 ml pré-carregados com 1 ml da solução Biocoll™ (Biochrom). A centrifugação foi realizada em um rotor de impulsão por quinze minutos em 1700xg e a 22°C sem desaceleração. As PBMCs acima da camada de Biocoll™ foram isoladas, lavadas uma vez com o tampão de FACS (PBS/2% de FBS [Fetal Bovine Serum; Biochrom]), centrifugadas e ressuspensas no tampão de FACS. A centrifugação durante todas as etapas de lavagem foi realizada em um rotor de impulsão por quatro minutos em 800xg e a 4°C. Se necessário, a lise dos eritrócitos era executada ao incubar as PBMCSs isoladas em 3 ml do tampão da lise de eritrócitos (8,29 g NH4Cl, 1,00 g de KHCO3, 0,037 g de EDTA e 1,0 l de H2Obidest, pH 7,5) por cinco minutos à temperatura ambiente seguida por uma etapa de lavagem com o tampão de FACS.Tingimento das PBMCs com os anticorpos etiquetados por fluorescência contra as moléculas da superfície da célula

[00397] Os anticorpos monoclonais reativos com antígenos de cinomolgo foram obtidos junto à Becton Dickinson(1Cat. No. 345784, 2Cat. No. 556647, 3Cat. No. 552851) e BeckmanCoulter (4Cat. No. IM2470) utilizados de acordo com as recomendações do fabricante. 5x105 - 1x106 células foramtingidas com a seguinte combinação de anticorpo: anti-CD141 (FITC) x anti-CD562 (PE) x anti-CD33 (PerCP) x anti-CD194 (APC). As células foram peletizadas em placas de títulos múltiplos de96 cavidades em formato de V (Greiner) e o sobrenadante foi removido. As pelotas da célula foram ressuspensas a um volumetotal de 100 μl contendo os anticorpos específicos diluídos notampão de FACS. A incubação foi realizada no escuro por trintaminutos a 4°C. Subseqüentemente, as amostras foram lavadas duas vezes com o tampão de FACS e as pelotas de célula foram ressuspensas no tampão de FACS para a análise citométrica de fluxo.Detecção citométrica de fluxo de linfócitos tingidos por FACS

[00398] O levantamento de dados foi executado com FACSCalibur™ BD de 4 cores (Becton Dickinson). Para cada medição, 1x104 células das subpopulações definidas de linfócitos foram adquiridas. A análise estatística foi executada com o programa CellQuest Pro™ (Becton Dickinson) para obter porcentagens da subpopulação de linfócitos e para classificar a intensidade de expressão da molécula de superfície da célula. Subseqüentemente, as porcentagens dos subconjuntos de linfócitos únicos relacionados aos linfócitos totais (isto é, as células B mais T mais NK excluindo as células mielóides através do tingimento de CD14), tal como determinado por FACS, foram correlacionadas com a contagem de linfócitos da análise diferencial do sangue para calcular os números de células absolutos das células T (CD3+, CD56, CD14).

[00399] A redistribuição das células T durante a fase inicial de tratamento com MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL em macacos cinomolgos em níveis de dose de 60, 240 e 1000 μg/m2/24 horas é mostrada na Figura 32. Estes animais não mostraram nenhum sinal de qualquer redistribuição das células T durante a fase inicial de tratamento, isto é, as contagens das células T aumentaram em vez de diminuir quando da iniciação do tratamento. Devido ao fato que a redistribuição das células T é consistentemente observada em 100% de todos os pacientes sem as células alvo circulantes, quando da iniciação do tratamento com a molécula de ligação de CD3 convencional (por exemplo, o construto de CD19xCD3 tal como descrito no Pedido de Patente WO 99/54440) contra um epítopo de CD3, dependente do contexto demonstrou-se que substancialmente menos redistribuição das células T na ausência de células alvo circulantes quando da iniciação do tratamento pode ser observada com uma molécula de ligação de CD3 da invenção dirigida e gerada contra um epítopo de cadeia CD3 epsilon de humano e de primata não-chimpanzé, tal como definido pela seqüência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NO.: 2, 4, 6 ou 8 ou um fragmento das mesmas. Isto está claro para as moléculas de ligação de CD3 dirigidas contra um epítopo de CD3 dependente do contexto, tal como os construtos descritos no Pedido de Patente WO 99/54440, as moléculas de ligação contra os epítopos CD3 independentes do contexto, tal como (alia inter) provido em qualquer uma das SEQ ID NO.: 2, 4, 6 ou 8 (ou os fragmentos destas seqüências) oferecem esta redistribuição das células T substancialmente menos prejudicial e indesejada. Uma vez que a redistribuição das células T durante a fase inicial de tratamento com as moléculas de ligação de CD3 é um fator de risco principal para eventos adversos ao SNC, as moléculas de ligação de CD3 providas na presente invenção e capazes de reconhecer um epítopo de CD3 independente do contexto têm uma vantagem substancial sobre as moléculas de ligação de CD3 conhecidas no estado da técnica e dirigidas contra os epítopos CD3 dependentes do contexto. Certamente, nenhum dos macacos cinomolgos tratados com MCSP-G4 VH-VL x I2C VH-VL mostraram quaisquer sinais de sintomas do SNC.

[00400] A independência do contexto do epítopo de CD3 é provida na presente invenção e corresponde aos primeiros 27 aminoácidos de N-terminal de CD3 epsilon) ou os fragmentos desta extensão de aminoácido 27. Este epítopo independente do contexto é extraído de seu ambiente nativo dentro do complexo de CD3 e é fundido às seqüências de aminoácido heterólogas sem perda de sua integridade estrutural. As moléculas de ligação anti-CD3 como providas na presente invenção e geradas (e dirigidas) contra um epítopo de CD3 independente do contexto oferecem uma melhoria clínica surpreendente no que diz respeito à redistribuição das células T e, desse modo, um perfil de segurança mais favorável. Sem ser limitado pela teoria, uma vez que seu epítopo de CD3 é independente do contexto, formando um subdomínio auto-suficiente autônomo sem muita influência no restante do complexo de CD3, as moléculas de ligação de CD3 providas na presente invenção induzem mudanças menos alostéricas na conformação de CD3 do que as moléculas de ligação de CD3 convencionais (como as moléculas providas no Pedido de Patente WO 99/54440), que reconhecem os epítopos CD3dependentes do contexto como as moléculas providas no Pedido de Patente WO 99/54440. Conseqüentemente (outra vez sem serlimitado pela teoria), a indução do recrutamento de NcK2 intracelular pelas moléculas de ligação de CD3 providas na presente invenção também é reduzida, tendo por resultado menos mudança de isoforma das integrinas das células T e menos aderência das células T às células endoteliais. É preferível que os preparados das moléculas de ligação de CD3 da invenção(dirigidas contra e geradas contra um epítopo independente docontexto como definido na presente invenção) consistem essencialmente em moléculas monoméricas. Estas moléculas monoméricas são ainda mais eficientes (do que as moléculas diméricas ou multiméricas) em evitar a redistribuição de células e, desse modo, o risco de eventos adversos do SNC durante a fase inicial de tratamento.23. Geração e caracterização das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de CD33 e CD323.1 Geração das células de CHO que expressam CD33humano

[00401] A seqüência de codificação de CD33 humano como publicada no GenBank (Número de acesso NM_001772) foi obtida pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão. O fragmento da síntese de genes foi projetado de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido por um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, seguido enquadrado pela seqüência de codificação da proteína de CD33 humana madura, seguido enquadrado pela seqüência de codificação do dipeptídeo de glicina de serina, por um tag de histidina 6 e por um códon de interrupção (a seqüência de cDNA e de aminoácido do construto é relacionada sob as SEQ ID NO. 525 e 526). O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição no começo e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos, EcoRI na extremidade 5’ e SalI na extremidade 3’, foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado através de EcoRI e SalI em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) seguindo os protocolos padrão. Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes do construto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX.23.2. Geração das células de CHO que expressam o domínio extracelular de CD33 de símio

[00402] A seqüência de DNA de CD33 de símio foi obtida por um conjunto de 3 PCRs no cDNA de medula óssea do macaco símio preparadas de acordo com protocolos padrão. As seguintes condições de reação: 1 ciclo a 94°C por três minutos seguido por 35 ciclos a 94°C por um minuto, a 53°C por um minuto e a 72°C por dois minutos seguido por um ciclo terminal a 72°C por três minutos e os seguintes primers foram utilizados:1.1. primer de avanço: 5'-gaggaattcaccatgccgctgctgctactgctgcccctgctgtgggcaggggccctggcta tgg-3’ primer reverso: 5'-gatttgtaactgtatttggtacttcc-3’ 4. primer de avanço: 5'-attccgcctccttggggatcc-3’ primer reverso: 5'-gcataggagacattgagctggatgg-3’ 5. primer de avanço: 5'-gcaccaacctgacctgtcagg-3’primer reverso: 5'-agtgggtcgactcactgggtcctgacctctgagtattcg-3’

[00403] Essas PCRs geraram três fragmentos de sobreposição, que foram isolados e seqüenciados de acordo com protocolos padrão utilizando os primers de PCR e desse modo apresentaram uma porção da seqüência de cDNA de CD33 de símio do segundo nucleotídeo do códon +2 ao terceiro nucleotídeo do códon +340 da proteína madura. Para gerar um construto para a expressão de CD33 de símio, um fragmento de cDNA foi obtido pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão (a seqüência de cDNA e de aminoácido do construto é relacionada sob as SEQ ID NO. 527 e 528). Neste construto, a seqüência de codificação de CD33 de símio do aminoácido +3 a +340 da proteína CD33 madura foi fundida à seqüência de codificação de CD33 humano que substitui a seqüência de codificação humana dos aminoácidos +3 a +340. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a conter um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto e dos sítios de restrição no começo e no fim do fragmento que contém a codificação decDNA essencialmente para todo o domínio extracelular de CD33 de símio, o domínio de transmembrana de CD33 de símio e umdomínio CD33 intracelular quimérico de símio-humano. Os sítios de restrição XbaI introduzidos na extremidade 5' e SalI na extremidade 3’ foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi então clonado através de XbaI e SalI em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Um clone verificado por seqüência desteplasmídeo foi utilizado para transfectar as células de CHO/DHFR, tal como descrito acima.23.3. Geração das moléculas do anticorpobiespecíficas específicas de espécies cruzadas de CD33 e CD3- Clonagem das moléculas de ligação específicas de espécies cruzadas

[00404] Geralmente, as moléculas do anticorpo biespecíficas, cada uma delas compreendendo um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para CD3 epsilon de humano e de primata não-chimpanzé bem como um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para CD33 de humano e de primata não- chimpanzé, foram projetados tal como definido na seguinte Tabela 6.

[00405] Tabela 6: Formatos das moléculas anti-CD3 e anti-CD33 biespecíficas específicas de espécies cruzadas

[00406] Os construtos acima mencionados que contêmos domínios de cadeia leve variável (L) e de cadeia pesada (H) específicos de espécies cruzadas para CD33 e CD3 de humano e de símio específicos de espécies cruzadas das combinações deVH e de VL específicas para CD3 de humano e de símio foramobtidos pela síntese de genes. Os fragmentos da síntese de genes foram projetados de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido pelo peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, seguido enquadrado pela seqüência de codificação da molécula do anticorpo biespecífica respectiva, seguido enquadrado pela seqüência de codificação por um tag de histidina 6 e um códon de interrupção. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição apropriados no começo e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado atravésdestes sítios de restrição em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother50 (2001) 141-150) seguindo os protocolos padrão. Osprocedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Aamplificação de genes do construto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final deaté 20 nM de MTX. Expressão e purificação das moléculas do anticorpo biespecíficas

[00407] As moléculas do anticorpo biespecíficas são expressas nas células de ovário de hamster chinês (CHO). A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Aamplificação de genes dos construtos foi induzida pela adição de concentrações crescentes de MTX até concentrações finais de 20 nM de MTX. Após duas passagens da cultura estacionária, as células cresceram em frascos de rolo com meio de soja líquido de HyQ PF CHO livre de nucleosídeo (com 4,0 mM de L-glutamina com 0,1% de Pluronic F-68; HyClone) por sete dias antes da colheita. As células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante contendo a proteína expressa foi armazenado a - 20°C. Alternativamente, os construtos foram transientemente expressos nas células de HEK 293. A transfecção foi executada com o reagente 293fectin (Invitrogen, #12347-019) de acordo com o protocolo do fabricante.

[00408] Akta® Explorer System (GE Health Systems) e Unicorn® Software foram utilizados para a cromatografia. A cromatografia de afinidade com metal imobilizado ("IMAC") foiexecutada utilizando um Fractogel EMD chelate® (Merck) que foi carregado com ZnCl2 de acordo com o protocolo provido pelofabricante. A coluna foi equilibrada com o tampão A (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1M de NaCl) e osobrenadante da cultura de células (500 ml) foi aplicado à coluna (10 ml) a uma vazão de 3 ml/min. A coluna foi lavada com o tampão A para remover a amostra não-ligada. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de duas etapas do tampão B (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1Mde NaCl, 0,5 M de imidazol) de acordo com o seguinte:Etapa 1: 20% do tampão B em 6 volumes da colunaEtapa 2: 100% do tampão B em 6 volumes da coluna

[00409] As frações da proteína eluída a partir da etapa 2 foram agrupadas para uma purificação adicional. Todosos produtos químicos eram do tipo para pesquisa e foram adquiridos junto à Sigma (Deisenhofen) ou junto à Merck (Darmstadt).

[00410] A cromatografia de filtração em gel foi executada em uma coluna do tipo preparatória HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada com o Equi-buffer (25 mM de citrato, 200 mM de lisina, 5% de glicerol, pH 7,2). As amostras da proteína eluída (vazão de 1 ml/min) foram submetidas à SDS-PAGE padrão e à transferência Western para a detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para a determinação do peso molecular (kit marcador do peso molecular, Sigma MW GF-200). As concentrações da proteína foram determinadas utilizando OD280 nm.

[00411] A proteína do anticorpo biespecífica purificada foi analisada por SDS-PAGE sob condições reduzidas executadas com 4-12% de géis de Bis Tris pré-fundidos (Invitrogen). A preparação e a aplicação da amostra foram executadas de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. O peso molecular foi determinado com MultiMark protein standard (Invitrogen). O gel foi tingido com Coomassie coloidal (protocolo da Invitrogen). A pureza da proteína isolada é > 95%, tal como determinado pela SDS-PAGE.

[00412] O anticorpo biespecífico tem um peso molecular de aproximadamente 52 kDa, sob condições nativas, tal como determinado pela filtração em gel em PBS. Todos os construtos foram purificados de acordo com este método.

[00413] A transferência Western foi executada utilizando uma membrana Optitran® BA-S83 e Invitrogen Blot Module de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. Para a detecção dos anticorpos da proteína do anticorpo biespecífico, um anticorpo anti-His Tag foi utilizado (Penta His, Qiagen). Um anticorpo de Ig anti-camundongo de cabra etiquetado com fosfatase alcalina (AP) (Sigma) foi utilizado como o anticorpo secundário e BCIP/NBT (Sigma) como o substrato. Uma faixa única foi detectada em 52 kD, que corresponde ao anticorpo biespecífico purificado.23.4. Análise da ligação citométrica de fluxo dos anticorpos biespecíficos específicos de espécies cruzadas de CD33 e CD3

[00414] A fim de testar a funcionalidade dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas com relação à capacidade de se ligar a CD33 e CD3 de humano e de símio, respectivamente, uma análise de FACS foi executada. Para esta finalidade, as células de CHO transfectadas com CD33 humano tal como descrito no Exemplo 23.1 e a linhagem de células de leucemia das células T positivas de CD3 humanas HPB-ALL (DSMZ, Bransvique, ACC483) foram utilizadas para testar a ligação aos antígenos humanos. A reatividade de ligação aos antígenos de símio foi testada utilizando o transfectante gerado de CD33 de símio descrito no Exemplo 23.2 e as PBMCs de símio (a preparação das PBMCs de símio foi executada pela centrifugação do gradiente de Ficoll do sangue periférico dos macacos símios de acordo com protocolos padrão). 200.000 células das linhagens de células de PBMC respectivas foram incubadas por trinta minutos em gelo com 50 μl da proteína purificada dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas (5 μg/ml) ou o sobrenadante da cultura de células das células transfectadas que expressam os construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas. As células foram lavadas duas vezes em PBS com 2% de FCS e a ligação do construto foi detectada com um anticorpo anti-His murino (Penta His Antibody; Qiagen; diluído 1:20 em 50 μl de PBS com 2% de FCS). Após a lavagem, os anticorpos anti-His ligados foram detectados com um anticorpo específico de Fc-gama (Dianova) conjugado à ficoeritrina, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS. O sobrenadante das células de CHO não-transfectadas foi utilizado como o controle negativo.

[00415] A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS-Calibur; o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). O tingimento e a medição de FACS da intensidade de fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00416] A ligação específica de CD3 de humano e de primata não-chimpanzé das moléculas de ligação de CD3 da invenção era claramente detectável, conforme mostrado na Figura 33. Na análise de FACS, todos os construtos mostram a ligação a CD3 e a CD33 em comparação aos controles negativos respectivos. A especificidade de espécies cruzadas dos anticorpos biespecíficos aos antígenos de CD3 e CD33 de humano e de símio é demonstrada.23.5. Bioatividade dos anticorpos biespecíficos específicos de espécies cruzadas de CD33 e CD3

[00417] A bioatividade dos anticorpos biespecíficos gerados foi analisada pela liberação do cromo 51 (51Cr) em ensaios de citotoxicidade in vitro utilizando as linhagens de células CD33 positivas descritas nos Exemplos 23.1 e 23.2. Como células efetoras, PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas ou a linhagem de células T de 4119LnPx de símio foram utilizadas, tal como especificado nas figuras respectivas.

[00418] A geração de PBMCs humanas estimuladas foi executada tal como segue:

[00419] Uma placa de Petri (85 mm de diâmetro, Nunc) foi revestida com um anticorpo anti-CD3 específico comercialmente disponível (por exemplo, OKT3, Othoclone) a uma concentração final de 1 μg/ml por uma hora a 37°C. A proteína não-ligada foi removida por uma etapa de lavagem com PBS. As PBMCs frescas foram isoladas do sangue periférico (30-50 ml de sangue humano) pela centrifugação do gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. 3-5 x 107 PBMCs foram adicionadas à placa de Petri pré-revestida em 50 ml de RPMI 1640 com glutamina estabilizada/10% de FCS/20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) e foram estimuladas por dois dias. No terceiro dia, as células foram coletadas e lavadas uma vez com RPMI 1640. A IL- 2 foi adicionada a uma concentração final de 20 U/ml e as células foram cultivadas outra vez por um dia no mesmo meio de cultura de células que aquele acima.

[00420] As células alvo foram lavadas duas vezes com PBS e etiquetadas com 11,1 MBq de 51Cr a um volume final de 100 μl de RPMI com 50% de FCS por 45 minutos a 37°C. As células alvo etiquetadas foram lavadas subseqüentemente três vezes com 5 ml de RPMI e então utilizadas no ensaio de citotoxicidade. O ensaio foi executado em uma placa de 96 cavidades a um volume total de 250 μl de RPMI suplementado (tal como acima) com uma relação de E:T de 10:1,1 μg/ml das moléculas biespecíficas específicas de espécies cruzadas do anticorpo e vinte diluições de três vezes das mesmas foram aplicadas. O tempo do ensaio era dedezoito horas e a citotoxicidade foi medida como os valores relativos do cromo liberado no sobrenadante relacionados à diferença da lise máxima (adição de Triton-X) e da lise espontânea (sem as células efetoras). Todas as medições foram feitas em quadruplicatas. A medição da atividade do cromo nos sobrenadantes foi executada com Wizard 3” Gamacounter (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemanha). A análise dos dados experimentais foi executada com Prism 4 for Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA). As curvas de resposta de dose sigmoidais têm tipicamente os valores de R2 > 0,90, tal como determinado pelo software. Osvalores EC50 calculados pelo programa de análise foram utilizados para a comparação da bioatividade.

[00421] Conforme mostrado na Figura 34, todos os construtos biespecíficos específicos de espécies cruzadas gerados demonstram atividade citotóxica contra as células alvo CD33 positivas humanas provocada pelas PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas estimuladas e contra as células positivas alvo de CD33 de símio provocada pela linhagem de células T de 4119LnPx de símio.24. Geração e caracterização das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de CAIX e CD324.1 Geração das células de CHO que expressam CAIX humano

[00422] A seqüência de codificação de CAIX humano como publicada no GenBank (Número de acesso NM_001216) foi obtida pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão. O fragmento da síntese de genes foi projetado de modo a conter a seqüência de codificação da proteína humana de CAIX incluindo seu peptídeo líder (a seqüência de cDNA e de aminoácido doconstruto é relacionada sob as SEQ ID NO. 604 e 605). O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo aintroduzir sítios de restrição no começo e no fim do fragmento.Os sítios de restrição introduzidos, XbaI na extremidade 5’ eSalI na extremidade 3’, foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado através de XbaI e SalI em um plasmídeo designado pEF- DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) seguindo os protocolos padrão.Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes do construtofoi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX.24.2 Geração das células de CHO que expressam CAIX de símio

[00423] A seqüência de codificação de CAIX de símio como publicada no GenBank (Número de acesso XM_001088481) foi obtida pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão. O fragmento da síntese de genes foi projetado de modo a conter a seqüência de codificação da proteína de CAIX de símio incluindo seu peptídeo líder (a seqüência de cDNA e de aminoácido do construto é relacionada sob as SEQ ID NO. 606 e 607). O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição no começo e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos, XbaI na extremidade 5’ e SalI na extremidade 3’, foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado através de XbaI e SalI em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) seguindo os protocolospadrão. Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes do construtofoi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX.24.3 Geração das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de CAIX e CD3- Clonagem das moléculas de ligação específicas de espécies cruzadas

[00424] Geralmente, as moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas, cada uma delas compreendendo um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para CD3 epsilon de humano e de primata não- chimpanzé bem como um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para CAIX de humano e de primata não-chimpanzé, foram projetadas como definido na seguinte Tabela 7.

[00425] Tabela 7: Formatos das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas anti-CD3 e anti-CAIX

[00426] Os construtos acima mencionados que contêmos domínios de cadeia leve variável (L) e de cadeia pesada (H) específicos de espécies cruzadas para CAIX e CD3 de humano e de símio específicos de espécies cruzadas das combinações deVH e de VL específicas para CD3 de humano e de símio foramobtidos pela síntese de genes. Os fragmentos da síntese de genes foram projetados de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido pelo peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, seguido enquadrado pela seqüência de codificação da molécula do anticorpo de cadeia simples biespecífica respectiva, seguidoenquadrado pela seqüência de codificação por um Tag de histidina 6 e um códon de interrupção. O fragmento da síntesede genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição apropriados no começo e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado através destes sítios de restrição em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) seguindo osprotocolos padrão. Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes doconstruto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX.24.4 Expressão e purificação das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas

[00427] As moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas foram expressas nas células de ovário de hamster chinês (CHO). A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537566. A amplificação de genes dos construtos foi induzida pela adição de concentrações crescentes de MTX até concentrações finais de 20 nM de MTX. Após duas passagens da cultura estacionária, as células cresceram em frascos de rolo com meio de soja líquido de HyQ PF CHO livre de nucleosídeo (com 4,0 mM de L-glutamina com 0,1% de Pluronic F-68; HyClone) por sete dias antes da colheita. As células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante contendo a proteína expressa foi armazenado a -20°C. Alternativamente, os construtos foram transientemente expressos nas células de HEK 293. A transfecção foi executada com o reagente 293fectin (Invitrogen, #12347- 019) de acordo com o protocolo do fabricante.

[00428] Akta® Explorer System (GE Health Systems) e Unicorn® Software foram utilizados para a cromatografia. A cromatografia de afinidade com metal imobilizado ("IMAC") foi executada utilizando um Fractogel EMD chelate® (Merck) que foi carregado com ZnCl2 de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. A coluna foi equilibrada com o tampão A (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1M de NaCl) e osobrenadante da cultura de células (500 ml) foi aplicado à coluna (10 ml) a uma vazão de 3 ml/min. A coluna foi lavada com o tampão A para remover a amostra não-ligada. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de duas etapas do tampão B (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1Mde NaCl, 0,5 M de imidazol) de acordo com o seguinte:Etapa 1: 20% do tampão B em 6 volumes da colunaEtapa 2: 100% do tampão B em 6 volumes da coluna

[00429] As frações da proteína eluída a partir da etapa 2 foram agrupadas para uma purificação adicional. Todos os produtos químicos são do tipo para pesquisa e foram adquiridos junto à Sigma (Deisenhofen) ou junto à Merck (Darmstadt).

[00430] A cromatografia de filtração em gel foi executada em uma coluna do tipo preparatória HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada com o Equi-buffer (25 mM de citrato, 200 mM de lisina, 5% de glicerol, pH 7,2). As amostras da proteína eluída (vazão de 1 ml/min) foram submetidas à SDS-PAGE padrão e à transferência Western para a detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para a determinação do peso molecular (kit marcador do peso molecular, Sigma MW GF-200). As concentrações da proteína foram determinadas utilizando OD280 nm.

[00431] A proteína do anticorpo de cadeia simples biespecífica purificada foi analisada por SDS-PAGE sob condições reduzidas executadas com 4-12% de géis de Bis Tris pré-fundidos (Invitrogen). A preparação e a aplicação da amostra foram executadas de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. O peso molecular foi determinado com MultiMark protein standard (Invitrogen). O gel foi tingido com Coomassie coloidal (protocolo da Invitrogen). A pureza da proteína isolada é > 95%, tal como determinado pela SDS-PAGE.

[00432] O anticorpo de cadeia simples biespecífico tem um peso molecular de aproximadamente 52 kDa, sob condições nativas, tal como determinado pela filtração em gel em PBS. Todos os construtos foram purificados de acordo com este método.

[00433] A transferência Western foi executada utilizando uma membrana Optitran® BA-S83 e Invitrogen BlotModule de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. Paraa detecção dos anticorpos da proteína do anticorpo de cadeia simples biespecíficos, um anticorpo de Tag anti-His foi utilizado (Penta His, Qiagen). Um anticorpo de Ig anti- camundongo de cabra etiquetado com fosfatase alcalina (AP) (Sigma) foi utilizado como o anticorpo secundário e BCIP/NBT (Sigma) como o substrato. Uma faixa única foi detectada em 52 kD, que corresponde ao anticorpo de cadeia simples biespecífico purificado.24.5. Análise da ligação citométrica de fluxo dos anticorpos biespecíficos específicos de espécies cruzadas de CAIX e CD3

[00434] A fim de testar a funcionalidade dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas com relação à capacidade de se ligar ao ser humano eCAIX de símio e CD3, respectivamente, uma análise de FACS foiexecutada. Para esta finalidade, as células de CHO transfectadas com CAIX humano tal como descrito no Exemplo 24.1 e a linhagem de células de leucemia das células T positivas de CD3 humanas HPB-ALL (DSMZ, Bransvique, ACC483) foram utilizadas para testar a ligação aos antígenos humanos. A reatividade de ligação aos antígenos de símio foi testada utilizando o transfectante gerado de CAIX de símio descrito no Exemplo 24.2 e uma linhagem de células T de 4119LnPx de símio (generosamente provida pelo prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuremberg; publicado em Knappe A, et al. e Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). 200.000células das linhagens de células respectivas foram incubadas por trinta minutos em gelo com 50 μl da proteína purificada dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas (2 μg/ml) ou o sobrenadante da cultura de células das células transfectadas que expressam os construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas. As células foram lavadas duas vezes em PBS com 2% de FCS e aligação do construto foi detectada com um anticorpo anti-Hismurino (Penta His Antibody; Qiagen; diluído 1:20 em 50 μl de PBS com 2% de FCS). Após a lavagem, os anticorpos anti-His ligados foram detectados com um anticorpo específico de Fc- gama (Dianova) conjugado à ficoeritrina, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS. O sobrenadante das células de CHO não- transfectadas foi utilizado como o controle negativo para a ligação às linhagens de células T. Um construto de cadeia simples com especificidade alvo irrelevante foi utilizado como o controle negativo para a ligação às células de CHO transfectadas de CAIX.

[00435] A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS-Calibur; o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). O tingimento e a medição de FACS da intensidade de fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00436] A ligação biespecífica das moléculas de cadeia simples relacionadas acima, que são específicas de espécies cruzadas para CAIX e específicas de espécies cruzadas para CD3 de humano e de primata não-chimpanzé, era claramente detectável, conforme mostrado na Figura 35. Na análise de FACS, todos os construtos mostraram ligação a CD3 e a CAIX em comparação aos controles negativos respectivos. A especificidade de espécies cruzadas dos anticorpos biespecíficos a CD3 de humano e de primata não-chimpanzé e aos antígenos de CAIX foi demonstrada.24.6. Bioatividade dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas de CAIX e CD3

[00437] A bioatividade dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos gerados foi analisada pela liberação do cromo 51 (51Cr) em ensaios de citotoxicidade in vitro utilizando as linhagens de células positivas de CAIX descritas nos Exemplos 24.1 e 24.2. Como células efetoras, PBMC esgotadas de CD4/CD56 humanas estimuladas, PBMCs humanas estimuladas ou a linhagem de células T de 4119LnPx de símio foram utilizadas, tal como especificado nas figuras respectivas.- A geração das PBMCs humanas estimuladas foi executada tal como segue:

[00438] Uma placa de Petri (145 mm de diâmetro, Greiner) foi revestida com um anticorpo anti-CD3 específico comercialmente disponível (por exemplo, OKT3, Othoclone) a uma concentração final de 1 μg/ml por uma hora a 37°C. A proteína não-ligada foi removida por uma etapa de lavagem com PBS. As PBMCs frescas foram isoladas do sangue periférico (30-50 ml de sangue humano) pela centrifugação do gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. 3-5 x 107 PBMCs foram adicionadas à placa de Petri pré-revestida em 120 ml de RPMI 1640 com glutamina estabilizada/10% de FCS/20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) e foram estimuladas por dois dias. No terceiro dia, as células foram coletadas e lavadas uma vez com RPMI 1640. A IL- 2 foi adicionada a uma concentração final de 20 U/ml e as células foram cultivadas outra vez por um dia no mesmo meio de cultura de células que aquele acima. - A geração das PBMCs esgotadas de CD4/CD56 estimuladas foi executada tal como segue:

[00439] Uma placa de Petri (145 mm de diâmetro, Greiner) foi revestida com um anticorpo anti-CD3 específico comercialmente disponível (por exemplo, OKT3, Othoclone) a uma concentração final de 1 μg/ml por uma hora a 37°C. A proteína não-ligada foi removida por uma etapa de lavagem com PBS. As PBMCs frescas foram isoladas do sangue periférico (30-50 ml de sangue humano) pela centrifugação do gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. 3-5 x 107 PBMCs foram adicionadas à placa de Petri pré-revestida em 120 ml de RPMI 1640 com glutamina estabilizada/10% de FCS/20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) e foram estimuladas por dois dias. No terceiro dia, ascélulas foram coletadas e lavadas uma vez com RPMI 1640. A IL-2 foi adicionada a uma concentração final de 20 U/ml e as células foram cultivadas outra vez por um dia no mesmo meio decultura de células que aquele acima. Pelo esgotamento das células T de CD4+ e das células NK de CD56+ de acordo com protocolos padrão, os linfócitos T citotóxicos de CD8+ (CTLs) foram enriquecidos.

[00440] As células alvo foram lavadas duas vezes com PBS e etiquetadas com 11,1 MBq de 51Cr a um volume finalde 100 μl de RPMI com 50% de FCS por 45 minutos a 37°C. Ascélulas alvo etiquetadas foram lavadas subseqüentemente três vezes com 5 ml de RPMI e então utilizadas no ensaio de citotoxicidade. O ensaio foi executado em uma placa de 96 cavidades a um volume total de 250 μl de RPMI suplementado (tal como acima) com as relações diferentes de E:T de 5:1 a 50:1 que são especificadas nas figuras respectivas. 1 μg/ml das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas e vinte diluições de três vezes das mesmas foram aplicadas. O tempo do ensaio era de dezesseis horas e a citotoxicidade foi medida como os valores relativos do cromo do liberado no sobrenadante relacionados à diferença da lise máxima (adição de Triton-X) e da lise espontânea (sem as células efetoras). Todas as medições foram feitas em quadruplicatas. A medição da atividade do cromo nos sobrenadantes foi executada com Wizard 3” Gamacounter (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemanha). A análise dos dados experimentais foi executada com Prism 4 for Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA). As curvas de resposta de dose sigmoidais têm tipicamente os valores de R2 > 0,90, tal como determinado pelo software. Os valores EC50 calculados pelo programa de análise foram utilizados para a comparação da bioatividade.

[00441] Conforme mostrado na Figura 36, todos os construtos do anticorpo de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas gerados demonstraram atividade citotóxica contra as células alvo positivas de CAIX humanas provocada pelas PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas estimuladas ou pelas PBMCs estimuladas e contra as células alvo positivas de CAIX de símio provocada pela linhagem de células T de 4119LnPx de símio.25. Geração e caracterização das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de EpCAM e CD3- Construção de anticorpos biespecíficos específicos de EpCAM

[00442] A base para a construção de anticorpos biespecíficos específicos de EpCAM era o anticorpo HD69 específico de EpCAM inteiramente humano (Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50: 141 ff). VH e VL foram amplificados pela PCR do DNA de HD69 de acordo com métodos padrão. VH e VL foram subseqüentemente clonados em um plasmídeo, formando desse modo um scFv funcional (orientação VH-Ligando-VL) de acordo com protocolos padrão. Este construto de scFv foi então amplificado pela PCR utilizando primers que introduzem um sítio de restrição de N-terminal de BsrGI e de C-terminal de BspE1 útil para a clonagem funcional ao formato do anticorpo biespecífico (5'-HD69-BsrG1: 5'- gacaggtgtacactccgaggtgcagctgctcgagtctgg-3’; 3'-HD69-BspE1: 5'-tgatagtccggatttgatctccagcttggtcc-3’). O produto de PCR foi então clonado em três vetores de expressão apropriados, cada um compreendendo uma combinação de VH e VL específica de espécies cruzadas para CD3 de humano e de símio (HL de H2C, HL de F12Q e I2C, respectivamente), codificando desse modo três construtos biespecíficos funcionais de HD69 HL x H2C HL, HD69 HL x F12Q HL e HD69 HL x I2C HL. Os construtos foram então transfectados nas células de CHO deficientes em DHFR por eletroporação para a transfecção estável de acordo com procedimentos padrão, tendo por resultado três agrupamentos de células transfectadas, cada agrupamento expressando um dos três produtos biespecíficos.

[00443] Tabela 8: Formatos das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas anti-EpCAM que compreendem uma porção anti-CD3 específica cruzada de humano- cinomolgo

[00444] A bioatividade dos anticorpos de cadeiasimples biespecíficos gerados (em sobrenadantes da cultura das células de CHO em que expressam os construtos biespecíficos respectivas) foi analisada pela liberação do cromo 51 em ensaios de citotoxicidade in vitro utilizando a linhagem de células positivas de EpCAM transfectadas de CHO-EpCAM (que expressa EpCAM de humano ligado à superfície, publicado em Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50: 141 ff) como as células alvo. Como células efetoras, as células T de CD8 positivas humanas estimuladas foram utilizadas. Conforme mostrado na Figura 37, todos os construtos do anticorpo de cadeia simples biespecíficos gerados revelaram atividade citotóxica contra as células alvo EpCAM positivas humanas provocada pelas células de CD8+ humanas. Como um controle negativo, o sobrenadante da cultura das células de CHO não- transfectadas foi utilizado, o qual não revelou nenhuma citotoxicidade detectável.

[00445] Para demonstrar a atividade específica cruzada dos construtos biespecíficos gerados no braço de CD3, a análise citométrica de fluxo foi executada, na qual a ligação dos construtos às células que expressam CD3 humano e as células que expressam CD3 de símio foi verificada. Além disso, a especificidade às células de EpCAM positivas foi examinada.

[00446] Resumidamente, as células de CHO transfectadas com EpCAM humano e as células T de CD3 positivas humanas em PBMCs humanas isoladas foram utilizadas para testar a ligação aos antígenos humanos. A reatividade de ligação ao antígeno de CD3 de símio foi testada utilizando uma linhagem de células T de 4119LnPx de símio (generosamente provida pelo prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen- Nuremberg; publicado em Knappe A, et al. e Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). 200.000 células das linhagens de células respectivas foram incubadas por trinta minutos em gelo com o sobrenadante da cultura de células das células transfectadas que expressam os construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas de CD3. As células foram lavadas duas vezes em PBS com 2% de FCS e a ligação do construto foi detectada com um anticorpo anti-His murino (Penta His Antibody; Qiagen; diluído 1:20 em 50 μl de PBS com 2% de FCS). Após a lavagem, os anticorpos anti-His ligados foram detectados com um anticorpo específico de Fc- gama (Dianova) conjugado à ficoeritrina, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS. O sobrenadante das células de CHO não- transfectadas foi utilizado como o controle negativo para a ligação às linhagens de células T.

[00447] A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS-Calibur e o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). O tingimento e a medição de FACS da intensidade de fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00448] A ligação biespecífica das moléculas de cadeia simples, que são específicas para EpCAM humano e específicas de espécies cruzadas para CD3 de humano e de símio era claramente detectável, conforme mostrado na Figura 38. Na análise citométrica de fluxo todos os construtos mostraram ligação a CD3 e EpCAM em comparação aos controles negativos respectivos e a linhagem de células de CHO negativa de EpCAM/CD3 .26. Geração e caracterização das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de EGFRvIII e CD326.1. Geração e expressão de células de CHO transfectadas com EGFRvIII humano

[00449] A seqüência de codificação de C-terminal, de transmembrana e do domínio citoplasmático do receptor do fator de crescimento epidermal do mutante (DeltaEGFR, de2-7 EGFR ou EGFRvIII são utilizados como sinônimos) contendo um apagamento de 267 aminoácidos do domínio extracelular (Kuan CT, Wikstrand CJ, Bigner DD: EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy; Endocr Relat Cancer. Junho de 2001; 8(2): 83-96) foi obtida pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão. O fragmento da síntese de genes foi projetado de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para permitir a expressão eucariótica do construto seguida pela seqüência de codificação do peptídeo líder do aminoácido 24 seguido enquadrado pela seqüência de codificação do domínio extracelular de C-terminal humano, de transmembrana e do domínio citoplasmático e um códon de interrupção. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição no começo e no fim do fragmento do DNA. Para finalidades de clonagem, os sítios de reconhecimento da enzima de restrição de XbaI e de SalI foram adicionados às extremidades em 5' e 3', respectivamente. O DNA sintético do gene foi subseqüentemente digerido com XbaI e SalI, ligado ao vetor de expressão pEF-DHFR apropriadamente digerido e transformado em E. coli. Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada (a seqüência de cDNA e a seqüência de aminoácido do construto recombinante são relacionadas sob as SEQ ID NO. 599 e 598) foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito acima.26.2. Geração e expressão EGFR vIII de cinomolgo

[00450] Em analogia ao exemplo 26.1, a variante deEGFR vIII de cinomolgo foi criado pelo apagamento dos 267 aminoácidos do domínio extracelular e a inserção do novo aminoácido de glicina no sítio de fusão (aminoácido n°. 6). Ofragmento da síntese de genes foi projetado de modo a conterprimeiramente um sítio de Kozak para permitir a expressão eucariótica do construto seguido pela seqüência de codificação do peptídeo líder do aminoácido 24 seguido enquadrado pela seqüência de codificação do domínio extracelular de C-terminal de cinomolgo, de transmembrana e do domínio citoplasmático (ambos humanos) e um códon de interrupção. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição no começo e no fim do fragmento do DNA. Ossítios de restrição XbaI introduzidos na extremidade 5' e SalIna extremidade 3’ foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento foi digerido com XbaI/SalI e foi clonado em pEF-DHFR seguindo os protocolos padrão. Uma seqüência verificou que o plasmídeo foi utilizado para transfectar as células de CHO/DHFR (ATCC n°. CRL 9096; cultivadas em RPMI 1640 com a glutamina estabilizada obtida junto à Biochrom AG Berlin, Alemanha, suplementadas com 10% de FCS, 1% de penicilina/estreptomicina, todos obtidos junto à Biochrom AG Berlin, Alemanha e os nucleosídeos de uma solução conservada em estoque dos reagentes do tipo para cultura decélulas obtidos junto à Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha, a uma concentração final de 10 μg/ml deadenosina, 10 μg/ml de desoxiadenosina e 10 μg/ml de timidina, em uma incubadora a 37°C, com 95% de umidade e 7% de CO2). A transfecção foi executada utilizando PolyFect Transfection Reagent (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) e 5 μg do DNA do plasmídeo de acordo com o protocolo do fabricante. Após umacultura de 24 horas, as células foram lavadas uma vez com PBS e cultivadas outra vez no meio de cultura de células acimamencionado a não ser pelo fato de que o meio não era suplementado com os nucleosídeos, e o FCS dialisado (obtido junto à Biochrom AG Berlin, Alemanha) foi utilizado. Desse modo, o meio de cultura das células não continha nucleosídeose a seleção foi aplicada desse modo às células transfectadas.Aproximadamente catorze dias após a transfecção, o crescimento de células resistentes foi observado. Após mais sete a catorze dias, os transfectantes deram positivo para a expressão do construto através de FACS.26.3. Geração das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de EGFRvIII e CD3

[00451] Geralmente, as moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas, cada uma delas compreendendo um domínio com uma especificidade de ligação ao antígeno de CD3de humano e de primata não-chimpanzé bem como um domínio com uma especificidade de ligação ao antígeno de EGFRvIII de humano e de primata não-chimpanzé, foram projetadas como definido na seguinte Tabela 9.

[00452] Tabela 9: Formatos das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas anti-CD3 e anti-EGFRvIII

[00456] Os construtos acima mencionados que contêmos domínios de cadeia leve variável (L) e de cadeia pesada (H) específicos de espécies cruzadas para EGFR vIII e CD3 de humano e de cinomolgo específicos de espécies cruzadas das combinaçõesde VH e de VL específicas para CD3 de humano e de símio foram obtidos pela síntese de genes. Os fragmentos da síntese de genes foram projetados de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido pelo peptídeo líder do aminoácido 19, seguido enquadrado pela seqüência de codificação da molécula do anticorpo de cadeia simples biespecífica respectiva, seguido enquadrado pela seqüência de codificação por um Tag de histidina 6 de imunoglobulina e um códon de interrupção. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição apropriados no começo e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado através destes sítios de restrição em um plasmídeo designado pEF-DHFR seguindo os protocolos padrão. Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes do construto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX. Alternativamente, os construtos foram transfectados às células de CHO deficientes em DHFR de uma maneira transiente de acordo com protocolos padrão.

[00457] As experiências de ligação de FACS foram executadas com a linhagem de células de CHO transfectadas de EGFRvIII humanas para avaliar a capacidade de ligação ao antígeno humano de EGFRvIII. A especificidade de espécies cruzadas ao tecido de cinomolgo foi testada ao desdobrar as células de CHO transfectadas com o EGFRvIII de cinomolgo. As mesmas mudanças nas linhagens de células se aplicam aos ensaios de citotoxicidade executados com anticorpos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas de EGFRvIII e CD3. Excluindo isso, os ensaios foram executados tal como descrito nos Exemplos 4 e 5.

[00458] Tal como ilustrado na Figura 39, os anticorpos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas gerados de EGFRvIII e CD3 demonstraram ligação aos antígenos de humano e de cinomolgo e provaram ser inteiramente específicos de espécies cruzadas.

[00459] Conforme mostrado na Figura 40, todos os construtos do anticorpo de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas gerados revelaram atividade citotóxica contra as células alvo de EGFRvIII positivas humanas provocada pelas células de CD8+ humanas e das células alvo positivas de EGFRvIII de cinomolgo provocada pela linhagem de células T 4119LnPx de símio. Como um controle negativo, um anticorpo de cadeia simples biespecífico irrelevante foi utilizado.27. Geração e caracterização das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de IgE e CD327.1. Clonagem e expressão da forma de IgE ligada à membrana de humano e de símio

[00460] A linhagem de células de camundongo J558L (obtida da Interlab Project, Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Gênova, Itália, ECACC 88032902), uma linhagem de células de mieloma da variante de perda de cadeia pesada espontâneo que sintetiza e secreta uma cadeia leve lambda, foi utilizada para ser complementada por um variante de cadeia pesada ligado à membrana de IgE de humano e de símio, respectivamente. A fim de gerar tais construtos, as moléculas sintéticas foram obtidas pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão (as seqüências de nucleotídeo dos construtos são relacionadas sob as SEQ ID NO. 595 e 594). Nestes construtos, a seqüência de codificação para a cadeia de CD3 epsilon de humano e de símio foi fundida à região humana de transmembrana de IgE, respectivamente. A especificidade incorporada da cadeia de VH é dirigida contra hapten(4-hidróxi- 3-nitro-fenil)acetila) (NP). O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a conter um sítio de Kozak para a expressão eucariótica dos sítios de restrição do construto e de um líder de imunoglobulina no início e no fim do DNA. Os sítios de restrição EcoRl introduzidos na extremidade 5' e Sall na extremidade 3' foram utilizados durante a etapa de clonagem no plasmídeo da expressão designado pEFDHFR. Após a verificação da seqüência (de símio: região C epsilon de Ig de Macaca mulatta XM_001116734, mRNA; de humano: cromossomo 14 de Homo sapiens NC_000014, seqüência completa, National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez), os plasmídeos foram utilizados para transfectar as células de CHO/DHFR, tal como descrito acima. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR é executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes do construto é induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX.27.2. Geração das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de CD3 e IgE

[00461] Geralmente, as moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas, cada uma delas compreendendo um domínio com uma especificidade de ligação ao antígeno de CD3 de humano e de primata não-chimpanzé, bem como um domínio com uma especificidade de ligação ao antígeno de IgE de humano e primata não-chimpanzé, foram projetadas tal como definido na seguinte Tabela 10.

[00462] Tabela 10: Formatos das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas anti-CD3 e anti-IgE

[00467] Os construtos acima mencionados que contêmos domínios de cadeia leve variável (L) e de cadeia pesada (H) específicos de espécies cruzadas para IgE de humano e de símio e as combinações de VH e de VL específicas de CD3 específicaspara CD3 de humano e de símio foram obtidos pela síntese degenes. Os fragmentos da síntese de genes foram projetados de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido pelo peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, seguido enquadrado pela seqüência de codificação da molécula do anticorpo de cadeia simples biespecífica respectiva, seguido enquadrado pela seqüência de codificação por um Tag de histidina 6 e um códonde interrupção. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição apropriadosno começo e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado através destes sítios de restrição em um plasmídeo designado pEF-DHFR seguindo os protocolos padrão. Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes do construto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX. Alternativamente, os construtos foram transfectados às células de CHO deficientes em DHFR de uma maneira transiente de acordo com protocolos padrão.

[00468] As experiências de ligação de FACS foram executadas com a linhagem de células J558L transfectadas de IgE humana para avaliar a capacidade de ligação à IgE humana. A especificidade de espécies cruzadas às células positivas de IgE de símio foi testada ao desdobrar as células J558L transfectadas com a IgE de símio. As mesmas mudanças em linhagens de células aplicam-se à linhagem de células J558L que também foi utilizada para os ensaios de citotoxicidade executados com anticorpos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas de IgE e CD3. As experiências de ligação bem como os ensaios de citotoxicidade foram executados tal como descrito acima.

[00469] Conforme ilustrado nas Figuras 41, os anticorpos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas gerados de CD3 e IgE demonstraram ligação aos antígenos de humano e de cinomolgo e provaram ser inteiramente específicos de espécies cruzadas.

[00470] Conforme mostrado na Figura 42, todos os construtos do anticorpo de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas gerados revelaram atividade citotóxica contra as células positivas humanas alvo de IgE provocada por célula humanas de CD8+ e as células positivas alvo de IgE de símio provocada pela linhagem de células T 4119LnPx de símio. Como um controle negativo, um anticorpo de cadeia simples biespecífico irrelevante foi utilizado. 28. Geração e caracterização das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de CD44 e CD328. 1 Geração das células de CHO que expressam CD44 humano

[00471] A seqüência de codificação de CD44 humano como publicada no GenBank (Número de acesso AJ251595) e também contendo o éxon CD44v6 foi obtida pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão. O fragmento da síntese de genes foi projetado de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido pela seqüência de codificação da proteína CD44 humana e um códon de interrupção (a seqüência de cDNA e de aminoácido do construto é relacionada sob as SEQ ID NO. 608 e 609). O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição no começo e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos, EcoRI na extremidade 5’ e SalI na extremidade 3’, foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado através de EcoRI e SalI em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR foi descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) seguindo os protocolos padrão. Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Aamplificação de genes do construto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX.28.1. Geração das células de CHO que expressam CD44 humano sem o éxon v6

[00472] A seqüência de codificação de CD44 humano como publicada no GenBank (Número de acesso AJ251595) suprimida para a seqüência que codifica o éxon v6 foi obtida pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão. O fragmento da síntese de genes foi projetado de modo a conter primeiramenteum sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido pela seqüência de codificação da proteína CD44 humanasem o éxon v6 e um códon de interrupção (a seqüência de cDNA e de aminoácido do construto é relacionada sob as SEQ ID NO.610 e 611). O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição no começoe no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos, EcoRI na extremidade 5’ e SalI na extremidade 3’, foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado através de EcoRI eSalI em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150)seguindo os protocolos padrão. Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes do construto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX.28.2. Geração das células de CHO que expressamCD44 de símio

[00473] A seqüência de codificação de CD44 de símio como publicada no GenBank (Número de acesso XM_001115359) e também contendo o éxon CD44v6 foi obtida pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão (a seqüência de cDNA e de aminoácido do construto é relacionada sob as SEQ ID NO. 612 e 613). No construto utilizado, a seqüência de codificação corresponde a CD44 de símio à exceção de uma mutação de ponto na posição 1 do códon do quinto aminoácido do peptídeo de sinal da proteína CD44, que resulta em uma mutação da arginina ao triptofano que corresponde à seqüência humana. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a conter um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto e dos sítios de restrição no começo e no fim do fragmento. Os sítios introduzidos EcoRI na extremidade 5' e SalI na extremidade 3’ foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes em foi então clonado através de EcoRI e SalI em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Um clone verificado por seqüência deste plasmídeo foi utilizado para transfectar as células de CHO/DHFR, tal como descrito acima.28.3. Geração das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de CD44v6 e CD3

[00474] Geralmente, as moléculas do anticorpo decadeia simples biespecíficas, cada uma delas compreendendo um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para CD3 epsilon de humano e de primata não- chimpanzé bem como um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para CD44v6 de humano e de primata não-chimpanzé, são projetadas como definido na seguinte Tabela 11.

[00475] Tabela 11: Formatos das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas anti-CD3 e anti-CD44v6

[00476] Os construtos acima mencionados que contêmos domínios de cadeia leve variável (L) e de cadeia pesada (H)específicos de espécies cruzadas para CD44 de humano e de símioe as combinações de VH e de VL específicas de CD3 específicas de espécies cruzadas para CD3 de humano e de símio são obtidospela síntese de genes. Os fragmentos da síntese de genes foramprojetados de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido pelo peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, seguido enquadrado pela seqüência de codificação da molécula do anticorpo de cadeia simples biespecífica respectiva, seguido enquadrado pela seqüência de codificação por um tag de histidina 6 e um códon de interrupção. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição apropriados no começo e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado através destes sítios de restrição em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) seguindo osprotocolos padrão. Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes doconstruto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX.28.4. Expressão e purificação das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas

[00477] As moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas foram expressas nas células de ovário de hamster chinês (CHO). A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537566. A amplificação de genes dos construtos foi induzida pela adição de concentrações crescentes de MTX até concentrações finais de 20 nM de MTX. Após duas passagens da cultura estacionária, as células cresceram em frascos de rolo com meio de soja líquido de HyQ PF CHO livre de nucleosídeo (com 4,0 mM de L-glutamina com 0,1% de Pluronic F-68; HyClone) por sete dias antes da colheita. As células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante contendo a proteína expressa foi armazenado a -20°C. Alternativamente, os construtos foram transientemente expressos nas células de HEK 293. A transfecção foi executada com o reagente 293fectin (Invitrogen, #12347- 019) de acordo com o protocolo do fabricante.

[00478] Akta® Explorer System (GE Health Systems) e Unicorn® Software foram utilizados para a cromatografia. A cromatografia de afinidade com metal imobilizado ("IMAC") foi executada utilizando um Fractogel EMD chelate® (Merck) que foi carregado com ZnCl2 de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. A coluna foi equilibrada com o tampão A (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1M de NaCl) e osobrenadante da cultura de células (500 ml) foi aplicado à coluna (10 ml) a uma vazão de 3 ml/min. A coluna foi lavada com o tampão A para remover a amostra não-ligada. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de duas etapas do tampão B (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1Mde NaCl, 0,5 M de imidazol) de acordo com o seguinte:Etapa 1: 20% do tampão B em 6 volumes da colunaEtapa 2: 100% do tampão B em 6 volumes da coluna

[00479] As frações da proteína eluída a partir da etapa 2 foram agrupadas para uma purificação adicional. Todosos produtos químicos eram do tipo para pesquisa e foram adquiridos junto à Sigma (Deisenhofen) ou junto à Merck (Darmstadt).

[00480] A cromatografia de filtração em gel foi executada em uma coluna do tipo preparatória HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada com o Equi-buffer (25 mM de citrato, 200 mM de lisina, 5% de glicerol, pH 7,2). As amostras da proteína eluída (vazão de 1 ml/min) foram submetidas à SDS-PAGE padrão e à transferência Western para a detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para a determinação do peso molecular (kit marcador do peso molecular, Sigma MW GF-200). As concentrações da proteína foram determinadas utilizando OD280 nm.

[00481] A proteína do anticorpo de cadeia simples biespecífica purificada foi analisada por SDS-PAGE sob condições reduzidas executadas com 4-12% de géis de Bis Tris pré-fundidos (Invitrogen). A preparação e a aplicação da amostra foram executadas de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. O peso molecular é determinado com MultiMark protein standard (Invitrogen). O gel foi tingido com Coomassie coloidal (protocolo da Invitrogen). A pureza da proteína isolada era > 95%, tal como determinado pela SDS-PAGE.

[00482] O anticorpo de cadeia simples biespecífico tem um peso molecular de aproximadamente 52 kDa, sob condições nativas, tal como determinado pela filtração em gel em PBS. Todos os construtos foram purificados de acordo com este método.

[00483] A transferência Western foi executada utilizando uma membrana Optitran® BA-S83 e Invitrogen Blot Module de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. Os anticorpos utilizados foram dirigidos contra o Tag de histidina 6 (Penta His, Qiagen) e a Ig anti-camundongo de cabra etiquetada com fosfatase alcalina (AP) (Sigma) e BCIP/NBT (Sigma) como o substrato. Uma faixa única foi detectada em 52 kD, que corresponde ao anticorpo de cadeia simples biespecífico purificado.28.5. Análise da ligação citométrica de fluxo dos anticorpos CD44 e CD3 biespecíficos específicos de espécies cruzadas

[00484] A fim de testar a funcionalidade dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas com relação à capacidade de se ligar a CD44 e CD3 de humano e de símio, respectivamente, uma análise de FACS foi executada. Para esta finalidade, as células de CHO transfectadas com CD44 humano tal como descrito no Exemplo 28.1 e a linhagem de células de leucemia das células T positivas de CD3 humanas HPB-ALL (DSMZ, Bransvique, ACC483) foram utilizadas para testar a ligação aos antígenos humanos. A reatividade de ligação aos antígenos de símio foi testada utilizando o transfectante gerado de CD44 de símio descrito no Exemplo 28.3 e as PBMCs de símio (a preparação das PBMCs de símio foi executada pela centrifugação do gradiente de Ficoll do sangue periférico dos macacos símios de acordo com protocolos padrão). A especificidade para o éxon v6 de CD44 foi testado utilizando as células de CHO transfectadas que expressam CD44 humano sem o éxon v6 gerado tal como descrito no Exemplo 28.2. 200.000 células das linhagens de células respectivas ou PBMCs de símio foram incubadas por trinta minutos em gelo com 50 μl da proteína purificada dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas (5 μg/ml) ou 50 μl de um anticorpo anti-CD44 comercialmente disponível (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg; também 5 μg/ml). As células foram lavadas duas vezes em PBS com 2% de FCS e a ligação do construto foi detectada com um anticorpo anti-His murino (Penta His Antibody; Qiagen; diluído 1:20 em 50 μl de PBS com 2% de FCS). O anticorpo anti-His foi omitido para as amostras incubadas com o anticorpo anti-CD44 comercialmente disponível. Após a lavagem, o anticorpo anti- His ligado ou o anticorpo anti-CD44 foi detectado com um anticorpo específico de Fc-gama (Dianova) conjugado à ficoeritrina, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS. PBS com 2% de FCS foi utilizado como o controle negativo.

[00485] A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS-Calibur; o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). O tingimento e a medição de FACS da intensidade de fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00486] A ligação biespecífica das moléculas de cadeia simples relacionadas acima, que eram específicas de espécies cruzadas para CD44 e específicas de espécies cruzadas para CD3 de humano e de primata não-chimpanzé, era claramente detectável, conforme mostrado na Figura 43. Na análise de FACS, todos os construtos mostraram ligação a CD3 e a CD44 em comparação aos controles negativos respectivos. Aespecificidade de espécies cruzadas dos anticorpos biespecíficos aos antígenos CD3 e CD44 de humano e de símio foi demonstrada.

[00487] A especificidade para o éxon v6 de CD44 foi demonstrado na Figura 44 pela falta de ligação dos construtos às células de CHO transfectadas com o CD44 humanoque não tem o éxon v6. A expressão de CD44 por estas células foi demonstrada pela ligação comparável do anticorpo anti-CD44 comercialmente disponível àquelas células e às células de CHO transfectadas com o CD44 humano de comprimento completo.28.6. Bioatividade dos anticorpos de cadeia simplesbiespecíficos específicos de espécies cruzadas de CD44 e CD3

[00488] A bioatividade dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos gerados foi analisada pela liberação do cromo 51 (51Cr) em ensaios de citotoxicidade in vitroutilizando a linhagem de células CD44 positivas descrita no Exemplo 28.1. Como células efetoras, PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas foram utilizadas.- A geração de PBMCs humanas estimuladas foi executada tal como segue:

[00489] Uma placa de Petri (145 mm de diâmetro, Greiner) foi revestida com um anticorpo anti-CD3 específico comercialmente disponível (por exemplo, OKT3, Orthoclone) a uma concentração final de 1 μg/ml por uma hora a 37°C. A proteína não-ligada foi removida por uma etapa de lavagem com PBS. As PBMCs frescas foram isoladas do sangue periférico (3050 ml de sangue humano) pela centrifugação do gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. 3-5 x 107 PBMCs foram adicionadas à placa de Petri pré-revestida em 120 ml de RPMI 1640 com glutamina estabilizada/10% de FCS/20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) e foram estimuladas por dois dias. No terceiro dia, as células foram coletadas e lavadas uma vez com RPMI 1640. A IL-2 foi adicionada a uma concentração final de 20 U/ml e as células foram cultivadas outra vez por um dia no mesmo meio de cultura de células que aquele acima.

[00490] Pelo esgotamento das células T de CD4+ edas células NK de CD56+ de acordo com protocolos padrão, os linfócitos T citotóxicos de CD8+ (CTLs) foram enriquecidos.

[00491] As células alvo foram lavadas duas vezes com PBS e etiquetadas com 11,1 MBq de 51Cr a um volume finalde 100 μl de RPMI com 50% de FCS por 45 minutos a 37°C. Ascélulas alvo etiquetadas foram lavadas subseqüentemente três vezes com 5 ml de RPMI e então utilizadas no ensaio de citotoxicidade. O ensaio foi executado em uma placa de 96 cavidades a um volume total de 250 μl de RPMI suplementado (tal como acima) com uma relação de E:T de 10:1,1 μg/ml das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas e vinte diluições de três vezes das mesmas foram aplicadas. O tempo do ensaio era de dezoito horas e a citotoxicidade foi medida como os valores relativosdo cromo do liberado no sobrenadante relacionados à diferença da lise máxima (adição de Triton-X) e da lise espontânea (semas células efetoras). Todas as medições foram feitas em quadruplicatas. A medição da atividade do cromo nos sobrenadantes foi executada com Wizard 3” Gamacounter (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemanha). A análise dos dados experimentais foi executada com Prism 4 for Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA). As curvas de resposta de dose sigmoidais têm tipicamente os valores de R2 > 0,90, tal como determinado pelo software. Osvalores EC50 calculados pelo programa de análise foram utilizados para a comparação da bioatividade.

[00492] Conforme mostrado na Figura 45, os construtos do anticorpo de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas gerados demonstraram atividade citotóxica contra as células positivas humanas alvo CD44 provocada pelas PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas estimuladas.29. Geração e caracterização das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de CD30 e CD329.1. Geração das células de CHO que expressam CD30 humano

[00493] A seqüência de codificação de CD30 humana como publicada no GenBank (Número de acesso M83554) foi obtida pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão. O fragmento da síntese de genes foi projetado de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido por um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, seguido enquadrado pela seqüência de codificação da proteína CD30 humana madura e um códon de interrupção (a seqüência de cDNA e de aminoácido do construto é relacionada sob as SEQ ID NO. 1103 e 1104). O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição no começo e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos, EcoRI na extremidade 5’ e SalI na extremidade 3’, foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. Os sítios de restrição internos foram removidos pela mutação silenciosa da seqüência de codificação no fragmento da síntese de genes (BsrGI: nucleotídeo 243 de T a C; SalI: nucleotídeo 327 de A a G; SalI: nucleotídeo 852 de A a G; EcoRI: nucleotídeo 1248 de T a C). O fragmento da síntese de genes foi clonado através de EcoRI e SalI em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) seguindo os protocolos padrão. Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes do construtofoi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX.29.2. Geração das células de CHO que expressam CD30 de símio

[00494] A seqüência de DNA de CD30 de símio foi obtida por um conjunto de 4 PCRs no DNA de medula óssea do macaco símio preparado de acordo com protocolos padrão. As seguintes condições de reação: um ciclo a 94°C por dois minutos seguido por 35 ciclos a 94°C por um minuto, a 55°C por um minuto e a 72°C por um minuto seguido por um ciclo terminal de72°C por três minutos e os seguintes primers foram utilizados:6. primer de avanço: 5'-cctcgccgcgctgggactgc-3’ primer reverso: 5'-ggtgccactggagggttccttgc-3’7. primer de avanço: 5'-gcttcttccattctgtctgcccagcagg-3’primer reverso: 5'-ggtaggggacacagcgggcacaggagttgg-3’8. primer de avanço: 5'-cctggcatgatctgtgccacatcagcc-3’ primer reverso: 5'-gcgttgagctcctcctgggtctgg-3’9. primer de avanço: 5'-cctcccrgcccaagctagagcttgtgg-3’ primer reverso: 5'- cgactctagagcggccgctcactttccagaggcagctgtgggcaaggggtcttctttccct tcc-3’

[00495] As reações de PCR foram executadas sob a adição de betaína do tipo para PCR a uma concentração final de 1M. Essas PCRs geraram quatro fragmentos de sobreposição, que foram isolados e seqüenciados de acordo com protocolos padrão utilizando os primers de PCR e oferecem desse modo uma porção de CD30 de símio da codificação da seqüência de DNA do códon 12 do peptídeo líder ao códon 562 da proteína madura. Para gerar um construto para a expressão de CD30 de símio, um fragmento do DNA foi obtido pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão (a seqüência de cDNA e de aminoácido do construto é relacionada sob as SEQ ID NO. 1105 e 1106). Neste construto, a seqüência de codificação para CD30 de símio do aminoácido 12 do peptídeo líder ao aminoácido 562 da proteína CD30 madura foi fundida à seqüência de codificação de CD30 humano que substitui a parte respectiva da seqüência de codificação humana. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a conter um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto e dos sítios de restrição no começo e no fim do fragmento que contém a codificação do cDNA para todo o domínio extracelular de CD30 de símio, o domínio de transmembrana de CD30 de símio e um domínio CD30 intracelular quimérico de símio-humano. Os sítios introduzidos XbaI na extremidade 5' e SalI de restrição na extremidade 3’ foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi então clonado através de XbaI e SalI em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Um clone verificado por seqüência deste plasmídeo foi utilizado para transfectar as células de CHO/DHFR, tal como descrito acima.29.3 Geração das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de CD30 e CD3- Clonagem das moléculas de ligação específicas de espécies cruzadas

[00496] Geralmente, as moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas, cada uma delas compreendendo um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para CD3 epsilon de humano e de primata não- chimpanzé bem como um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para CD30 de humano e de primata não-chimpanzé, foram projetadas como definido na seguinte Tabela 12.

[00497] Tabela 12: Formatos das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas anti-CD3 e anti-CD30

[00498] Os construtos acima mencionados que contêmos domínios de espécies cruzadas específicos de cadeia leve variável (L) e de cadeia pesada variável (H) para CD30 de humano e de símio e as combinações de VH e de VL específicas de CD3 específicas de espécies cruzadas para CD3 de humano e de símio foram obtidos pela síntese de genes. Os fragmentos da síntese de genes foram projetados de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido por um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, seguido enquadrado pela seqüência de codificação da molécula do anticorpo de cadeia simples biespecífica respectiva, seguido enquadrado pela seqüência de codificação de um Tag de histidina 6 e um códon de interrupção. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição apropriados no começo e nofim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado através destes sítios de restrição em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001)141-150) seguindo os protocolos padrão. Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Aamplificação de genes do construto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final deaté 20 nM de MTX.29.4 Expressão e purificação das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas

[00499] As moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas foram expressas nas células de ovário de hamster chinês (CHO). A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537566. A amplificação de genes dos construtos foi induzida pela adição de concentrações crescentes de MTX até concentrações finais de 20 nM de MTX. Após duas passagens da cultura estacionária, as células cresceram em frascos de rolo com meio de soja líquido de HyQ PF CHO livre de nucleosídeo (com 4,0 mM de L-glutamina com 0,1% de Pluronic F-68; HyClone) por sete dias antes da colheita. As células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante contendo a proteína expressa foi armazenado a -20°C. Alternativamente, os construtos foram transientemente expressos nas células de HEK 293. A transfecção foi executada com o reagente 293fectin (Invitrogen, #12347- 019) de acordo com o protocolo do fabricante.

[00500] Akta® Explorer System (GE Health Systems) e Unicorn® Software foram utilizados para a cromatografia. A cromatografia de afinidade com metal imobilizado ("IMAC") foi executada utilizando um Fractogel EMD chelate® (Merck) que foi carregado com ZnCl2 de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. A coluna foi equilibrada com o tampão A (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1M de NaCl) e osobrenadante da cultura de células (500 ml) foi aplicado à coluna (10 ml) a uma vazão de 3 ml/min. A coluna foi lavada com o tampão A para remover a amostra não-ligada. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de duas etapas do tampão B (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1Mde NaCl, 0,5 M de imidazol) de acordo com o seguinte procedimento: Etapa 1: 20% do tampão B em 6 volumes da colunaEtapa 2: 100% do tampão B em 6 volumes da coluna

[00501] As frações da proteína eluída a partir da etapa 2 foram agrupadas para uma purificação adicional. Todos os produtos químicos são do tipo para pesquisa e foram adquiridos junto à Sigma (Deisenhofen) ou junto à Merck (Darmstadt).

[00502] A cromatografia de filtração em gel foi executada em uma coluna do tipo preparatória HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada com o Equi-buffer (25 mM de citrato, 200 mM de lisina, 5% de glicerol, pH 7,2). As amostras da proteína eluída (vazão de 1 ml/min) foram submetidas à SDS-PAGE padrão e à transferência Western para a detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para a determinação do peso molecular (kit marcador do peso molecular, Sigma MW GF-200). As concentrações da proteína foram determinadas utilizando OD280 nm.

[00503] A proteína do anticorpo de cadeia simples biespecífica purificada foi analisada por SDS-PAGE sob condições reduzidas executadas com 4-12% de géis de Bis Tris pré-fundidos (Invitrogen). A preparação e a aplicação da amostra foram executadas de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. O peso molecular foi determinado com MultiMark protein standard (Invitrogen). O gel foi tingido com Coomassie coloidal (protocolo da Invitrogen). A pureza da proteína isolada era > 95%, tal como determinado pela SDS-PAGE.

[00504] O anticorpo de cadeia simples biespecífico tem um peso molecular de aproximadamente 52 kDa, sob condições nativas, tal como determinado pela filtração em gel em PBS. Todos os construtos foram purificados de acordo com este método.

[00505] A transferência Western foi executada utilizando uma membrana Optitran® BA-S83 e Invitrogen Blot Module de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. Os anticorpos utilizados foram dirigidos contra o Tag de His (Penta His, Qiagen) e Ig anti-camundongo de cabra etiquetada com fosfatase alcalina (AP) (Sigma) e BCIP/NBT (Sigma) como o substrato. Uma faixa única foi detectada em 52 kD, que corresponde ao anticorpo de cadeia simples biespecífico purificado.29.5 Análise da ligação citométrica de fluxo dos anticorpos CD30 e CD3 biespecífico específicos de espécies cruzadas

[00506] A fim de testar a funcionalidade dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas com relação à capacidade de se ligar a CD30 e CD3 de humano e de símio, respectivamente, uma análise de FACS foi executada. Para esta finalidade, as células de CHO transfectadas com CD30 humano tal como descrito no Exemplo 29.1, na linhagem de células B positivas MEC-1 de CD30 humanas (DSMZ, Bransvique, ACC 497) e na linhagem de células de leucemia das células T positivas de CD3 humanas HPB-ALL (DSMZ, Bransvique, ACC483) foram utilizadas para testar a ligação aos antígenos humanos. A reatividade de ligação aos antígenos de símio foi testada utilizando o transfectante gerado de CD30 de símio descrito em no Exemplo 29.2 e uma linhagem de células T 4119LnPx de símio (generosamente provida pelo prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuremberg; publicado em Knappe A, et al. e Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). 200.000 células das linhagens de células respectivas foram incubadas por trinta minutos em gelo com 50 μl da proteína purificada dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas (5 μg/ml). As células foram lavadas duas vezes em PBS com 2% de FCS e a ligação do construto foi detectada com um anticorpo Penta His murino (Qiagen; diluído 1:20 em 50 μl de PBS com 2% de FCS). Após a lavagem, os anticorpos anti-His ligados foram detectados com um anticorpo específico de Fc-gama (Dianova) conjugado à ficoeritrina, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS. PBS com 2% de FCS foi utilizado como um controle negativo.

[00507] A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS-Calibur; o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). O tingimento e a medição de FACS da intensidade de fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00508] A ligação biespecífica das moléculas de cadeia simples relacionadas acima, que são específicas de espécies cruzadas para CD30 e específicas de espécies cruzadas para CD3 de humano e de primata não-chimpanzé, era claramente detectável, conforme mostrado na Figura 46. Na análise de FACS, todos os construtos mostraram ligação a CD3 e a CD30 comparados ao controle negativo. A especificidade de espécies cruzadas dos anticorpos biespecíficos aos antígenos CD3 e CD30 de humano e de símio foi demonstrada.29.6 Bioatividade dos anticorpos de cadeia simplesbiespecíficos específicos de espécies cruzadas de CD30 e CD3

[00509] A bioatividade dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos gerados foi analisada pela liberação do cromo 51 (51Cr) em ensaios de citotoxicidade in vitro utilizando a linhagem de células B positivas MEC-1 de CD30 humanas (DSMZ, Bransvique, ACC 497) e as células de CHO transfectadas com CD30 de símio descritas no Exemplo 29.2. Como células efetoras, as PBMC esgotadas de CD4/CD56 humanas estimuladas ou a linhagem de células T de 4119LnPx de símio foram utilizadas, respectivamente.

[00510] A geração de PBMCs humanas estimuladas foi executada tal como segue:

[00511] Uma placa de Petri (145 mm de diâmetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) foi revestida com um anticorpo anti-CD3 específico comercialmente disponível (por exemplo, OKT3, Orthoclone) a uma concentração final de 1 μg/ml por uma hora a 37°C. A proteína não-ligada foi removida por uma etapa de lavagem com PBS. As PBMCs frescas foram isoladas do sangue periférico (30-50 ml de sangue humano) pela centrifugação do gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. 3-5 x 107 PBMCs foram adicionadas à placa de Petri pré- revestida em 120 ml de RPMI 1640 com glutamina estabilizada/10% de FCS/20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) e foram estimuladas por dois dias. No terceiro dia, as células foram coletadas e lavadas uma vez com RPMI 1640. A IL-2 foi adicionada a uma concentração final de 20 U/ml e as células foram cultivadas outra vez por um dia no mesmo meio de cultura de células que aquele acima.

[00512] Pelo esgotamento das células T de CD4+ e das células NK de CD56+ de acordo com protocolos padrão, os linfócitos T citotóxicos de CD8+ (CTLs) foram enriquecidos.

[00513] As células alvo foram lavadas duas vezes com PBS e etiquetadas com 11,1 MBq de 51Cr a um volume final de 100 μl de RPMI com 50% de FCS por sessenta minutos a 37°C. As células alvo etiquetadas foram lavadas subseqüentemente três vezes com 5 ml de RPMI e então utilizadas no ensaio de citotoxicidade. O ensaio foi executado em uma placa de 96 cavidades a um volume total de 250 μl de RPMI suplementado (tal como acima) com uma relação de E:T de 10:1,1 μg/ml das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas e vinte diluições de três vezes das mesmas foram aplicadas. O tempo do ensaio era de quatro horas para o ensaio utilizando MEC-1 e PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas e de 18 horas para o ensaio que utiliza ascélulas de CHO transfectadas de CD30 de símio e a linhagem decélulas T 4119LnPx de símio. A citotoxicidade foi medida como os valores relativos do cromo liberado no sobrenadante relacionados à diferença da lise máxima (adição de Triton-X) e da lise espontânea (sem as células efetoras). Todas as medições foram feitas em quadruplicatas. A medição da atividade do cromo nos sobrenadantes foi executada com Wizard 3” Gamacounter (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemanha). A análise dos dados experimentais foi executada com Prism 4 for Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA). As curvas de resposta de dose sigmoidais têmtipicamente os valores de R2 > 0,90, tal como determinado pelosoftware. Os valores EC50 calculados pelo programa de análise foram utilizados para a comparação da bioatividade.

[00514] Conforme mostrado na Figura 47, todos os construtos do anticorpo de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas gerados demonstraram atividade citotóxica contra as células alvo CD30 positivas humanas provocada pelas PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas estimuladas e as células alvo positivas de CD30 de símio provocada pela linhagem de células T 4119LnPx de símio.30. Geração e caracterização das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de HER2 e CD330.1. Geração das células de CHO que expressam HER2 humano

[00515] A seqüência de codificação de HER2 humano como publicada no GenBank (Número de acesso X03363) foi obtida pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão. O fragmento da síntese de genes foi projetado de modo a conter a seqüência de codificação da proteína HER2 humana incluindo seu peptídeo líder (a seqüência de cDNA e de aminoácido do construto é relacionada sob as SEQ ID NO. 1107 e 1108). O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição no começo e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos, XbaI na extremidade 5’ e SalI na extremidade 3’, foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado através de XbaI e SalI em um plasmídeo designado pEF- DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) seguindo os protocolos padrão. Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes do construtofoi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX.30.2. Geração das células de CHO que expressam o domínio extracelular de HER2 de símio

[00516] A seqüência de codificação de HER2 humanotal como descrito acima foi modificada para codificar os aminoácidos 123 a 1038 da proteína de HER2 de símio tal comopublicado no GenBank (Número de acesso XP_001090430). A seqüência de codificação para esta proteína quimérica foi obtida pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão (a seqüência de cDNA e de aminoácido do construto é relacionada sob as SEQ ID NO. 1109 e 1110). O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a conter um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto e dos sítios de restrição no começo e no fim do fragmento. Os sítios introduzidos XbaI na extremidade 5' e SalI de restrição na extremidade 3’ foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi então clonado através de XbaI e SalI em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001)141-150). Um clone verificado por seqüência deste plasmídeo foi utilizado para transfectar as células de CHO/DHFR, tal como descrito acima.30.3. Geração das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de HER2 e CD3- Clonagem das moléculas de ligação específicas de espécies cruzadas

[00517] Geralmente, moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas, cada uma delas compreendendo um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para CD3 epsilon de humano e de primata não- chimpanzé bem como um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para HER2 de humano e de símio, são projetadas como definido na seguinte Tabela 13.

[00518] Tabela 13: Formatos das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas anti-CD3 e anti-HER2

[00519] Os construtos acima mencionados que contêmos domínios de cadeia leve variável (L) e de cadeia pesada (H) específicos de espécies cruzadas para o HER2 de humano e de símio e as combinações de VH e de VL específicas de CD3 específicas de espécies cruzadas para CD3 de humano e de símio foram obtidos pela síntese de genes. Os fragmentos da síntesede genes foram projetados de modo a conter primeiramente umsítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido por um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido19, seguido enquadrado pela seqüência de codificação da molécula do anticorpo de cadeia simples biespecífica respectiva, seguido enquadrado pela seqüência de codificaçãoum Tag de histidina 6 e um códon de interrupção. O fragmentoda síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição apropriados no começo e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado através destes sítios de restrição em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001)141-150) seguindo os protocolos padrão. Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Aamplificação de genes do construto foi induzida ao aumentar asconcentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final deaté 20 nM de MTX.30.4 Expressão e purificação das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas

[00520] As moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas foram expressas nas células de ovário de hamster chinês (CHO). A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537566. A amplificação de genes dos construtos foi induzida pela adição de concentrações crescentes de MTX até concentrações finais de 20 nM de MTX. Após duas passagens da cultura estacionária, as células cresceram em frascos de rolo com meio de soja líquido de HyQ PF CHO livre de nucleosídeo (com 4,0 mM de L-glutamina com 0,1% de Pluronic F-68; HyClone) por sete dias antes da colheita. As células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante contendo a proteína expressa foi armazenado a -80°C. A transfecção foi executada com o reagente 293fectin (Invitrogen, #12347-019) de acordo com o protocolo do fabricante.

[00521] Akta® Explorer System (GE Health Systems) e Unicorn® Software foram utilizados para a cromatografia. A cromatografia de afinidade com metal imobilizado ("IMAC") foi executada utilizando um Fractogel EMD chelate® (Merck) que foi carregado com ZnCl2 de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. A coluna foi equilibrada com o tampão A (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1M de NaCl) e osobrenadante da cultura de células (500 ml) foi aplicado à coluna (10 ml) a uma vazão de 3 ml/min. A coluna foi lavada com o tampão A para remover a amostra não-ligada. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de duas etapas do tampão B (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1Mde NaCl, 0,5 M de imidazol) de acordo com o seguinte:Etapa 1: 20% do tampão B em 6 volumes da colunaEtapa 2: 100% do tampão B em 6 volumes da coluna

[00522] As frações da proteína eluída a partir da etapa 2 foram agrupadas para uma purificação adicional. Todosos produtos químicos eram do tipo para pesquisa e foram adquiridos junto à Sigma (Deisenhofen) ou junto à Merck (Darmstadt).

[00523] A cromatografia de filtração em gel foi executada em uma coluna do tipo preparatória HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada com o Equi-buffer (25 mM de citrato, 200 mM de lisina, 5% de glicerol, pH 7,2). As amostras da proteína eluída (vazão de 1 ml/min) foram submetidas à SDS-PAGE padrão e à transferência Western para a detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para a determinação do peso molecular (kit marcador do peso molecular, Sigma MW GF-200). As concentrações da proteína foram determinadas utilizando OD280 nm.

[00524] A proteína do anticorpo de cadeia simples biespecífica purificada foi analisada por SDS-PAGE sob condições reduzidas executadas com 4-12% de géis de Bis Tris pré-fundidos (Invitrogen). A preparação e a aplicação da amostra foram executadas de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. O peso molecular foi determinado com MultiMark protein standard (Invitrogen). O gel foi tingido com Coomassie coloidal (protocolo da Invitrogen). A pureza da proteína isolada era > 95%, tal como determinado pela SDS-PAGE.

[00525] O anticorpo de cadeia simples biespecífico tem um peso molecular de aproximadamente 52 kDa, sob condições nativas, tal como determinado pela filtração em gel em PBS. Todos os construtos foram purificados de acordo com este método.

[00526] A transferência Western foi executada utilizando uma membrana Optitran® BA-S83 e Invitrogen BlotModule de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. Paraa detecção dos anticorpos da proteína do anticorpo de cadeia simples biespecíficos, um anticorpo de Tag anti-His foi utilizado (Penta His, Qiagen). Um anticorpo de Ig anti- camundongo de cabra etiquetado com fosfatase alcalina (AP) (Sigma) foi utilizado como o anticorpo secundário e BCIP/NBT (Sigma) como o substrato. Uma faixa única foi detectada em 52 kD, que corresponde ao anticorpo de cadeia simples biespecífico purificado.1.5 5 Análise da ligação citométrica de fluxo dos anticorpos biespecíficos específicos de espécies cruzadas de HER2 e CD3

[00527] A fim de testar a funcionalidade dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas com relação à capacidade de se ligar a HER2 e CD3 de humano e de símio, respectivamente, uma análise de FACS foi executada. Para esta finalidade, as células CHO transfectadas com HER2 humano tal como descrito no Exemplo 30.1 e a linhagem de células de leucemia das células T positivas de CD3 humanas HPB-ALL (DSMZ, Bransvique, ACC483) são utilizadas para testar a ligação aos antígenos humanos. A reatividade de ligação aos antígenos de símio foi testada utilizando o transfectante gerado de HER2 de símio descrito no Exemplo 30,2 e uma linhagem de células T de 4119LnPx de símio (generosamente provida pelo prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen- Nuremberg; publicado em Knappe A, et al. e Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). 200.000 células das linhagens de células respectivas foram incubadas por trinta minutos em gelo com 50 μl da proteína purificada dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas (2 μg/ml). As células foram lavadas duas vezes em PBS com 2% de FCS e a ligação do construto foi detectada com um anticorpo anti-His murino (Penta His Antibody; Qiagen; diluído 1:20 em 50 μl de PBS com 2% de FCS). Após a lavagem, os anticorpos anti-His ligados foram detectados com um anticorpo específico de Fc- gama (Dianova) conjugado à ficoeritrina, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS. PBS com 2% de FCS foi utilizado como o controle negativo para a ligação às linhagens de células T bem como às células de CHO transfectadas de HER2.

[00528] A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS-Calibur; o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). O tingimento e a medição de FACS da intensidade de fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00529] A ligação biespecífica das moléculas de cadeia simples relacionadas acima, que são específicas de espécies cruzadas para HER2 e específicas de espécies cruzadas para CD3 de humano e de primata não-chimpanzé, era claramente detectável, conforme mostrado na Figura 48. Na análise de FACS, todos os construtos mostraram ligação a CD3 e a HER2 em comparação aos controles negativos respectivos. Aespecificidade de espécies cruzadas dos anticorpos biespecíficos aos antígenos CD3 e HER2 de humano e de símio foi demonstrada.1.6 6 Bioatividade dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas de HER2 e CD3

[00530] A bioatividade dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos gerados foi analisada pela liberação do cromo 51 (51Cr) em ensaios de citotoxicidade in vitroutilizando as linhagens de células positivas de HER2 descritas nos Exemplos 30.1 e 30.2. Como células efetoras, PBMCs esgotadas CD56 humanas não-estimuladas ou a linhagem de células T de 4119LnPx de símio foram utilizadas, tal como especificado nas figuras respectivas.

[00531] A geração de PBMCs esgotadas de CD56 não- estimuladas humanas foi executada como segue: As PBMCs frescas foram isoladas do sangue periférico (30-50 ml de sangue humano) pela centrifugação do gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. O esgotamento das células NK de CD56+ foi realizado de acordo com protocolos padrão.

[00532] As células alvo foram lavadas duas vezes com PBS e etiquetadas com 11,1 MBq de 51Cr a um volume finalde 100 μl de RPMI com 50% de FCS por 45 minutos a 37°C. Ascélulas alvo etiquetadas foram lavadas subseqüentemente três vezes com 5 ml de RPMI e então utilizadas no ensaio de citotoxicidade. O ensaio foi executado em uma placa de 96 cavidades a um volume total de 250 μl de RPMI suplementado (tal como acima) com uma relação de E:T de 10:1,1 μg/ml das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas e 15-21 diluições quíntuplasdas mesmas foram aplicadas. O tempo do ensaio era de dezoitohoras e a citotoxicidade foi medida como os valores relativos do cromo liberado no sobrenadante relacionados à diferença da lise máxima (adição de Triton-X) e da lise espontânea (sem as células efetoras). Todas as medições foram feitas em quadruplicatas. A medição da atividade do cromo nos sobrenadantes foi executada com Wizard 3” Gamacounter (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemanha). A análise dos dados experimentais foi executada com Prism 4 for Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA). As curvas de resposta de dose sigmoidais têm tipicamente os valores de R2 > 0,90, tal como determinado pelo software. Osvalores EC50 calculados pelo programa de análise foram utilizados para a comparação da bioatividade.

[00533] Conforme mostrado na Figura 49, todos os construtos do anticorpo de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas gerados demonstraram atividade citotóxica contra as células alvo positivas humanas de HER2 provocada pelas PBMCs esgotadas de CD56 não-estimuladas e contra as células alvo positivas de HER2 de símio provocada pela linhagem de células T de 4119LnPx de símio.31. Purificação das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas por um procedimento de afinidade com base no epítopo de CD3 epsilon independente do contexto que corresponde aos aminoácidos 1-27 de N-terminal31.1 . Geração de uma coluna de afinidade que exibe o epítopo de CD3 epsilon humano independente do contexto isolado que corresponde aos aminoácidos 1-27 de N-terminal

[00534] O plasmídeo para a expressão do construto CD3-Fc 1-27 que consiste nos aminoácidos 1-27 de N-terminal da cadeia de CD3 epsilon humana fundida à região de dobradiça e à região gama de Fc de imunoglobulina humana IgG1 descritas acima (Exemplo 3; a seqüência de DNA e a seqüência de aminoácido da proteína de fusão recombinante são relacionadas sob as SEQ ID NO. 350 e 349) foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes do construto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX. Após duas passagens da cultura estacionária, as células cresceram em frascos de rolo com meio de soja líquido de HyQ PF CHO livre de nucleosídeo (com 4,0 mM de L- glutamina com 0,1% de Pluronic F-68; HyClone) por sete dias antes da colheita. As células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante contendo a proteína expressa foi armazenado a 20°C. Para o isolamento da proteína de fusão, uma coluna de afinidade de Fc anti-humana de cabra foi preparada de acordo com protocolos padrão utilizando anticorpo específico do fragmento de Fc de IgG anti-humano de cabra purificado por afinidade comercialmente disponível com reação cruzada mínima às proteínas do soro de boi, de cavalo e de camundongo (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.). Utilizando esta coluna de afinidade, a proteína de fusão foi isolada do sobrenadante da cultura de células em um Akta Explorer System (GE Amersham) e foi eluída pelo ácido cítrico. O eluato foi neutralizado e concentrado. Após a diálise contra o tampão de acoplamento livre de amina, a proteína de fusão purificada foi acoplada a uma coluna HiTrap de 1 ml (GE Amersham) ativada com N-Hidróxi- Succinimida (NHS).

[00535] Após o acoplamento, os grupos NHS restantes foram obstruídos e a coluna foi lavada e armazenada a 5°C no tampão de armazenagem contendo 0,1% de azeto de sódio.31.2 Purificação das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas utilizando uma coluna de afinidade do peptídeo de CD3 humano

[00536] 200 ml do sobrenadante da cultura de células das células que expressam as moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas foram filtrados de maneira estéril em 0,2 μm e aplicados à coluna de afinidade do peptídeo de CD3 utilizando um Akta Explorer System (GE Amersham).

[00537] A coluna foi então lavada com solução salina tamponada com fosfato (PBS) ao pH 7,4 para lavar a amostra não-ligada. A eluição foi feita com um tampão ácido ao pH 3,0 contendo 20 mM de ácido cítrico e 1M de cloreto de sódio. A proteína eluída foi neutralizada imediatamente por 1M de trisidroximetilamina (TRIS) ao pH 8,3 contido em tubos de coleta do coletor de fração.

[00538] A análise da proteína foi feita por SDS- PAGE e transferência Western.

[00539] Para a SDS-PAGE, 4-12% de géis de BisTris são utilizados (Invitrogen). O tampão de execução era 1 x MES- SDS-Puffer (Invitrogen). Como a proteína padrão, 15 μl de Sharp Protein Standard pré-tingida (Invitrogen) foram aplicados. A eletroforese foi executada por 60 minutos em 200 volts com um máximo de 120 mA. Os géis foram lavados em água desmineralizada e tingidos com o Coomassie por uma hora. Os géis são destingidos em água desmineralizada por três horas. As fotografias são tiradas com um sistema de documentação Syngene Gel.

[00540] Para a transferência Western, um dobro do gel da SDS-PAGE foi gerado e as proteínas foram eletrotransferidas a uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi obstruída com 2% de albumina de soro bovino em PBS e foi incubada com o anticorpo Penta His murino biotinilado (Qiagen). Como o reagente secundário, um conjugado de fosfatase alcalina de estreptavidina (DAKO) foi utilizado. As transferências foram desenvolvidas com a solução de substrato de BCIP/NBT (Pierce).

[00541] Conforme demonstrado nas Figuras 50, 51 e 52, o uso de uma coluna de afinidade do peptídeo de CD3 humano tal como descrito acima permite a purificação altamente eficiente das moléculas de cadeia simples biespecíficas do sobrenadante da cultura de células. Os anticorpos de cadeia simples específicos de espécies cruzadas anti-CD3 contidos nas moléculas de cadeia simples biespecíficas permitem, portanto, através de suas propriedades de ligação específicas, um método de purificação de uma etapa genérico eficiente para as moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas, sem a necessidade de quaisquer Tags unidos unicamente para finalidades de purificação.32. Ensaio farmacocinético genérico para moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas32.1 . Produção de CD3-Fc 1-27 para o uso no ensaio farmacocinético

[00542] A seqüência de codificação dos aminoácidos 1-27 de N-terminal da cadeia de CD3 epsilon humana fundida à região de dobradiça e à região gama de Fc de imunoglobulina humana IgG1 foi obtida pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão (a seqüência de cDNA e a seqüência de aminoácido da proteína de fusão recombinante são relacionadas sob as SEQ ID NO. 1111 e 1112). O fragmento da síntese de genes foi projetado de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido por um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, seguido enquadrado pela seqüência de codificação dos primeiros 27 aminoácidos da porção extracelular da cadeia epsilon madura de CD3 humana, seguido enquadrado pela seqüência de codificação da região de dobradiça e porção gama de Fc de IgG1 humana e um códon de interrupção. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição no início e no fim da codificação do cDNA para a proteína de fusão. Os sítios de restrição introduzidos, EcoRI na extremidade 5’ e SalI na extremidade 3’, foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado através de EcoRI e SalI em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) seguindo os protocolos padrão. Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes do construto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX. Após duas passagens da cultura estacionária, as células cresceram em frascos de rolo com meio de soja líquido de HyQ PF CHO livre de nucleosídeo (com 4,0 mM de L-glutamina com 0,1% de Pluronic F-68; HyClone) por sete dias antes da colheita. As células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante contendo a proteína expressa foi armazenado a 20°C. Para o isolamento da proteína de fusão, uma coluna de afinidade de Fc anti-humana de cabra foi preparada de acordo com protocolos padrão utilizando um anticorpo específico do fragmento de Fc de IgG anti-humano de cabra purificado por afinidade comercialmente disponível com reação cruzada mínima às proteínas do soro de boi, de cavalo e de camundongo (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.). Utilizando esta coluna de afinidade, a proteína de fusão foi isolada do sobrenadante da cultura de células em um Akta Explorer System (GE Amersham) e foi eluída pelo ácido cítrico. O eluato foi neutralizado e concentrado.32.2 Ensaio farmacocinético para moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas

[00543] O ensaio é baseado na tecnologia ECL-ELISA que utiliza a detecção etiquetada de rutênio nas placas de carbono medidas em um dispositivo Sektor Imager (MSD). Em uma primeira etapa, as placas de carbono (MSD High Bind Plate de 96 cavidades Cat: L15xB-3) foram revestidas com 5 μl/cavidade em 50 ng/ml dos CD3-Fc 1-27 purificados descritos no Exemplo 32.1. A placa foi então secada até a manhã seguinte a 25°C. AAs placas foram subseqüentemente obstruídas com 5% de BSA (Paesel&Lorei #100568) em PBS em 150 μl/cavidade por 1h a 25°Cem uma incubadora sob agitação (700 RPM). Na etapa seguinte, as placas foram lavadas três vezes com 0,05% de Tween em PBS. Uma curva padrão em 50% de soro de símio em PBS foi gerada pela diluição em série de 1:4 começando em 100 ng/ml da molécula de cadeia simples biespecífica específica de espécies cruzadas respectiva a ser detectada no ensaio. As amostras docontrole de qualidade (QC) foram preparadas em 50% de soro de símio em PBS variando de 1 ng/ml a 50 ng/ml da molécula decadeia simples biespecífica específica de espécies cruzadasrespectiva dependendo das concentrações previstas de soro naamostra. As amostras padrão, do QC ou desconhecidas foram transferidas às placas de carbono em 10 μl/cavidade e foramincubadas por 90 minutos a 25°C na incubadora sob agitação (700 RPM). As placas foram lavadas subseqüentemente três vezes com 0,05% de Tween em PBS. Para a detecção, 25 μl/cavidade doanticorpo penta-His-Biotin (Qiagen, 200 μg/ml em 0,05% de Tween em PBS) foram adicionados e foram incubados por uma hora a 25°C em uma incubadora sob agitação (700 RPM). Em uma segunda etapa de detecção, 25 μl/cavidade da solução de StreptavidinSulfoTag (MSD; Cat: R32AD-1; Lote: W0010903) foram adicionados e foram incubados por uma hora a 25°C em uma incubadora sob agitação (700 RPM). As placas foram lavadas subseqüentemente três vezes com 0,05% de Tween em PBS. Finalmente, 150 μl/cavidade de MSD Reading Buffer (MSD, cat: R9ZC-1) foram adicionados e as placas foram lidas no dispositivo Sektor Imager.

[00544] As Figuras 53 e 54 demonstram a praticabilidade da detecção das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas em amostras de soro de macacos símios para as moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas. Os anticorpos de cadeia simples específicos de espécies cruzadas anti-CD3 contidos nas moléculas de cadeia simples biespecíficas permitem, portanto, através de suas propriedades de ligação específicas, um ensaio genérico altamente sensível para a detecção das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas. O ensaio definido acima pode ser utilizado no contexto de estudos toxicológicos formais que são necessários para o desenvolvimento de drogas e podem ser facilmente adaptados para a medição das amostras de pacientes em relação à aplicação clínica das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas.33. Geração das proteínas de fusão de transmembrana recombinantes dos aminoácidos 1-27 de N-terminal de CD3 epsilon de primatas não-chimpanzé diferentes fundidas a EpCAM de macaco cinomolgo (CD3-EpCAM 1-27). 33.1 Clonagem e expressão de CD3-EpCAM 1-27

[00545] CD3 epsilon foi isolado de primatas não- chimpanzé diferentes (sagüi, tamari, macaco esquilo) e de suínos. As seqüências de codificação dos aminoácidos 1-27 de N-terminal da cadeia de CD3 epsilon de humano maduras, de sagüi comum (Callithrix jacchus), de tamari cottontop (Saguinus oedipus), de macaco esquilo comum (Saimiri sciureus) e de porcos domésticos (Sus scrofa; utilizado como o controle negativo) fundidas ao N-término de EpCAM de cinomolgo etiquetado de Flag foram obtidas pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão (a seqüência de cDNA e a seqüência de aminoácido das proteínas de fusão recombinantes são relacionadas sob as SEQ ID NO. 351 a 360). Os fragmentos da síntese de genes foram projetados de modo a conter primeiramente um sítio de BsrGI para permitir a fusão no quadro de leitura correto com a seqüência de codificação de um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19 já presente no vetor de expressão alvo, que foi seguido enquadrado pela seqüência de codificação dos aminoácidos de N-terminal 1-27 da porção extracelular das cadeias de CD3 epsilon maduras, que foi seguido enquadrado pela seqüência de codificação de um Tag de Flag e seguido enquadrado pela seqüência de codificação da proteína madura de transmembrana de EpCAM de cinomolgo. Os fragmentos da síntese de genes também foram projetados de modo a introduzir um sítio de restrição no fim da codificação do cDNA para a proteína de fusão. Os sítios de restrição introduzidos BsrGI na extremidade 5’ e SalI na extremidade 3’ foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. Os fragmentos da síntese de genes foram então clonados através de BsrGI e SalI em um derivado do plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150), que já contém a seqüência de codificaçãodo peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, seguindo os protocolos padrão. Os plasmídeos verificados por seqüência foram utilizados para transfectar as células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes doconstruto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX.

[00546] Os transfectantes foram testados quanto à expressão da superfície da célula da proteína de transmembrana recombinante através de um ensaio de FACS de acordo com protocolos padrão. Com essa finalidade, um número de 2,5x105 células foram incubadas com 50 μl do anticorpo M2 anti-Flag (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) em 5 μg/ml em PBS com 2% de FCS. O anticorpo ligado foi detectado com um fragmento de F(ab’)2 purificado por afinidade conjugado a R- ficoeritrina, IgG anti-camundongo de cabra, fragmento de Fc- gama específico de 1:100 em PBS com 2% de FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, Reino Unido). A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS- Calibur; o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). O tingimento e a medição de FACS da intensidade de fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00547] A expressão das proteínas de fusão de transmembrana recombinantes etiquetadas de Flag que consistem em EpCAM de cinomolgo e nos aminoácidos 1-27 de N-terminal da cadeia de CD3 epsilon de humano, de sagüi, de tamari, de macaco esquilo e de suínos, respectivamente, nas células transfectadas, é claramente detectável (Figura 55).33.2 Clonagem e expressão do anticorpo de cadeia simples anti-CD3 específico de espécies cruzadas HL I2C na forma de um anticorpo de IgG1

[00548] A fim de prover um dispositivo de detecção de ligação aprimorado do anticorpo de cadeia simples específico de espécies cruzadas anti-CD3, a especificidade de I2C VHVL é convertida em um anticorpo IgG1 com IgG1 de murino e as seqüências constantes do DNA das regiões de kappa murino que codificam a cadeia pesada do anticorpo de IgG foram obtidas pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão. Os fragmentos da síntese de genes foram projetados de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para permitir a expressão eucariótica do construto, que é seguido por um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, que é seguido enquadrado pela seqüência de codificação da região variável de cadeia pesada ou da região variável de cadeia leve, seguido enquadrado pela seqüência de codificação da região constante de cadeia pesada de IgG1 de murino, tal como publicado no GenBank (Número de acesso AB097849) ou pela seqüência de codificação da região constante de kappa de cadeia leve de murino, tal como publicado no GenBank (Número de acesso D14630), respectivamente.

[00549] Os sítios de restrição foram introduzidos no início e no fim da codificação de cDNA para a proteína de fusão. Os sítios EcoRI na extremidade 5' e SalI de restrição na extremidade 3' foram utilizados para os seguintes procedimentos de clonagem. Os fragmentos da síntese de genes foram clonados através de EcoRI e SalI em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) para o construto de cadeia pesada e pEFADA (o pEFADA é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) para o construto de cadeia leve de acordo com protocolos padrão. Os plasmídeos verificados por seqüência foram utilizados para a co- transfecção dos construtos de cadeia leve e pesada às células de CHO deficientes em DHFR respectivas para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537566. A amplificação de genes dos construtos foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX e desoxicoformicina (dCF) a uma concentração final de até 300 nM de dCF. Após duas passagens da cultura estacionária, o sobrenadante da cultura de células foi coletado e utilizado na experiência subseqüente.33.3 Ligação do anticorpo I2C HL de cadeia simples anti-CD3 específico de espécies cruzadas na forma de um anticorpo IgG1 a CD3-EpCAM 1-27

[00550] A ligação do construto de I2C IgG1 gerado aos aminoácidos 1-27 de N-terminal das cadeias de CD3 epsilon de humano, de sagüi, de tamari e de macaco esquilo respectivamente fundidas a Ep-CAM de cinomolgo tal como descrito no Exemplo 33.1 foi testada em um ensaio de FACS de acordo com protocolos padrão. Com essa finalidade, um número de 2,5x105 células foram incubadas com 50 μl do sobrenadanteda cultura de células que contém o construto de I2C IgG1 talcomo descrito no Exemplo 33.2. A ligação do anticorpo foi detectada com um fragmento de F(ab’)2 purificado por afinidade conjugado a R-ficoeritrina, IgG anti-camundongo de cabra, específico do fragmento de Fc-gama, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, Reino Unido). A citometria de fluxo foi executada emum aparelho FACS-Calibur; o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences,Heidelberg). O tingimento e a medição de FACS da intensidade de fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00551] Conforme mostrado na Figura 56, a ligação do construto de I2C IgG1 aos transfectantes que expressam as proteínas de fusão de transmembrana recombinantes que consistem nos aminoácidos 1-27 de N-terminal de CD3 epsilon de humano, de sagüi, de tamari ou de macaco esquilo fundidas a EpCAM de cinomolgo em comparação ao controle negativo que consiste nos aminoácidos 1-27 de N-terminal de CD3 epsilon de suíno fundidos a EpCAM de cinomolgo foi observada. A especificidade de espécies cruzadas de multi-primata de I2C foi desse modo demonstrada. Os sinais obtidos com o anticorpo anti Flag M2 e o construto I2C IgG1 eram comparáveis, indicando uma forte atividade de ligação da especificidade I2C específica de espécies cruzadas aos aminoácidos 1-27 de N-terminal de CD3 do epsilon.

[00552] 34. Ligação da molécula de ligação anti-CD3 específica de espécies cruzadas I2C à cadeia de CD3 epsilon humana com e sem o Tag de His6 de N-terminal

[00553] Um anticorpo IgG1 quimérico com a especificidade de ligação I2C tal como descrito no Exemplo 33.2 específico para CD3 epsilon foi testado quanto à ligaçãoa CD3 epsilon humano com e sem o Tag de His6 de N-terminal. Aligação do anticorpo às linhagens de células EL4 transfectadas com CD3 epsilon de His6 humano tal como descrito no Exemplo 6.1 e CD3 epsilon do tipo selvagem humano tal como descrito no Exemplo 5.1 foi testada respectivamente por um ensaio de FACS de acordo com protocolos padrão. 2,5x105 células dos transfectantes foram incubadas com 50 μl do sobrenadante da cultura de células que contém o construto de I2C IgG1 ou 50 μldos anticorpos do controle respectivos em 5μg/ml em PBS com 2%de FCS. Como o controle negativo, um controle de isótipo apropriado e como o controle positivo para a expressão dosconstrutos, o anticorpo UCHT-1 específico de CD3 foi utilizado,respectivamente. A detecção do Tag de His6 foi executada com o anticorpo Penta His (Qiagen). A ligação dos anticorpos foi detectada com um fragmento de F(ab’)2 purificado por afinidade conjugado a R-ficoeritrina, IgG anti-camundongo de cabra, específico do fragmento de Fc-gama, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, Suffolk, Reino Unido). A citometria de fluxo foi executada emum aparelho FACS-Calibur; o software CellQuest foi utilizadopara obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences,Heidelberg). O tingimento e a medição de FACS da intensidadede fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00554] A ligação comparável do anticorpo de UCHT- 1 CD3 anti-humano a ambos os transfectantes demonstra níveis de expressão aproximadamente iguais dos construtos. A ligaçãodo anticorpo Penta His confirmou a presença do Tag de His6 noconstruto de CD3 de His6 humano, mas não no construto do tiposelvagem.

[00555] Comparado à linhagem de células EL4 transfectadas com Cd3 epsilon humano do tipo selvagem, uma clara perda de ligação do construto de I2C IgG1 a CD3 epsilon humano com um Tag de His6 de N-terminal foi detectada. Estes resultados mostram que um N-término livre de CD3 epsilon é essencial para a ligação da especificidade de ligação de I2C anti-CD3 de espécies cruzadas específica à cadeia de CD3 epsilon humana (Figura 57).35. Construtos do anticorpo de cadeia simples biespecíficos dirigidos a CD3 de humano e de primata não- chimpanzé e aos epítopos de MUC-1 específicos de tumor

[00556] A seqüência VH3 3-72 de VH da linhagem de embrião do anticorpo humana (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) foi escolhida como o contexto de estrutura para CDRH1 (SEQ ID 1486), CDRH2 (SEQ ID 1487) e CDRH3 (SEQ ID 1488). Do mesmo modo, a seqüência VH3 3-73 de VH da linhagem de embrião do anticorpo humana (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) foiescolhida como o contexto de estrutura para CDRH1 (SEQ ID 1492), CDRH2 (SEQ ID 1493) e CDRH3 (SEQ ID 1494). Para cada VH humana, diversos oligonucleotídeos degenerados tiveram que ser sintetizados, os quais são sobrepostos em uma extensão de terminal de aproximadamente 15-20 nucleotídeos. Para esta finalidade, cada segundo primer era um primer anti-sentido. Para VH3 3-72, os seguintes oligonucleotídeos foram utilizados: 5’ VH72-A-XhoIGAAGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCMTGARACTCTCTTGTGCTGCT3’ VH72-BCTGGCGGACCCAGTCCATCCAGGCATCACTAAAAGTGAATCCAGAAGCAGCACAAGAGAG5’ VH72-CGACTGGGTCCGCCAGKCTCCAGRGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGSTGAAATTAGAAACAAAGCCAAT3’ VH72-DTTTGGAATCATCTCTTGAGATGGTGAACCTCCCTTTCACAGACTCATCATAATATGTTGCATGATTATTGGCTTTGTTTCT5’ VH72-EAGAGATGATTCCAAAARTAGMSTGTACCTGCAAATGAWMAGCTTAARARCTGAA GACACTGSCSTTTATTACTGTACTGGG3’ VH72-F-BstEIIGACCGTGGTGACCAGAGTCCCCTGGCCCCAGTTAGCAAACTCCCCAGTACAGTAATAPara VH3 3-73, os oligonucleotídeos eram como segue:5’ VH73-A-XhoICAAGTTCAGCTGCTCGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCC3’ VH73-BCCAGTTCATCCAGTAGTTACTGAAAGTGAATCCAGAGGCARCACAGGAGAGTTTCAKGGATCCTCCAGGTTG5’ VH73-CTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGKCTYCAGRGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGSTGAAATTAGATTGAAATCTAAT3’ VH73-DTTTGGAATCATCTCTTGAGATGGTGAACCTCCCTTTCACAGACTCCGCATAATGTGTTGCATAATTATTAGATTTCAATCT 5’ VH73-EAGAGATGATTCCAAAARTASTGYCTACCTGCAAATGAACARCTTAARARCT GAAGACACTGSCRTTTATTACTGTACGGGA 3’ VH73-F-BstEIIGACCGTGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAAGCAAATTGTCCCACTCC CGTACAGTAATA

[00557] Cada um destes conjuntos de primers é transposto sobre a seqüência de VH correspondente inteira.

[00558] Dentro de cada conjunto, os primers foram misturados em quantidades iguais (por exemplo, 1 μl de cada primer [estoques de primer de 20 a 100 μM] a 20 μl de reação de PCR) e adicionados a uma mistura de PCR que consiste no tampão de PCR, nos nucleotídeos e na polimerase de Taq. Esta mistura foi incubada a 94°C por três minutos, a 65°C por um minuto, a 62°C por um minuto, a 59°C por um minuto, a 56°C por um minuto, a 52°C por um minuto, a 50°C por um minuto e a 72°C por dez minutos em um ciclador de PCR. O produto foi executado subseqüentemente em uma eletroforese em gel de agarose e o produto com um tamanho de 200 a 400 foi isolado do gel de acordo com métodos padrão.

[00559] Cada produto da PCR de VH foi então utilizado como um molde para uma reação de PCR padrão utilizando os primers que incorporam os sítios de restrição de clonagem apropriados de N-terminal e de C-terminal. O fragmento do DNA do tamanho correto (para uma VH com aproximadamente 350 nucleotídeos) foi isolado pela eletroforese em gel de agarose de acordo com métodos padrão. Dessa maneira, o fragmento do DNA de VH suficiente foi amplificado.

[00560] A seqüência VkII A18 de VL da linhagem de embrião do anticorpo humana (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) foi escolhida como o contexto de estrutura para CDRL1 (SEQ ID 1489), CDRL2 (SEQ ID 1490) e CDRL3 (SEQ ID 1491). Do mesmo modo, a seqüência VL7 7a de VL da linhagem de embrião do anticorpo humana (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) foiescolhida como o contexto de estrutura para CDRL1 (SEQ ID 1495), CDRL2 (SEQ ID 1496) e CDRL3 (SEQ ID 1497). Para cada VL humana, diversos oligonucleotídeos degenerados tiveram que ser sintetizados, os quais são sobrepostos em uma extensão de terminal de aproximadamente 15-20 nucleotídeos. Para esta finalidade, cada segundo primer era um primer anti-sentido. Os sítios de restrição necessários para uma clonagem posterior dentro dos oligonucleotídeos foram suprimidos. Para VkII A18, os seguintes oligonucleotídeos foram utilizados: 5’ Vk2A18-A-SacICCTGATGAGCTCGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGYCTGTCASTCYT GGASAKCMAGCTTCCATCTCTTGC3’ Vk2A18-BCCAATATAAATAGGTGTTTCCATTGTTGTGTACCAGGTTCTGACTAGATCT GCAAGAGATGGAAGC5’ Vk2A18-CACCTATTTATATTGGTWCCTGCAGAAGYCAGGCCAGTCTCCAMAGCTCCTG ATTTATAGGGCTTCCATC3’ Vk2A18-DCTTGAGTGTGAAATCTGTCYCTGATCCACTGCCACTGAACCTGTCTGGGAC CCCAGAAAATCGGATGGAAGCCCTATA5’ Vk2A18-EACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATSTGGGAGTT TATTWCTGCTTTCAAGGTACACAT3’ Vk2A18-F-BsiWI/SpeICCCGATACTAGTCGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTTGACCGAACGT CCACGGAACATGTGTACCTTGAAAGCAPara VL7 7a, os oligonucleotídeos eram tal como segue:5’Vlam7a-A-SacICCTGCAGAGCTCGTTGTGACTCAGGAAYCTKCACTCACCRYATCACCTGGT GRAACAGTCACACTCACTTGT 3’ Vlam7a-BCCAGTTGGCATAGTTACTTGTTGTAACAGCCCCAGTACTTGAGCGACAAGT GAGTGTGACTGT 5’ Vlam7a-CAACTATGCCAACTGGKTCCAASAAAAACCAGRTCAKKYAYYCMSTGSTCTA ATAKRTGGTACCAACAACCGA 3’ Vlam7a-DGGTGAGGGCAGCCTTGYCTCCAAKCAGGGAGCCTGAGAATCTGGCAGGARY MCMTGGTGCTCGGTTGTTGGTACC 5’ Vlam7a-EAAGGCTGCCCTCACCMTCWCAGGGGYACAGMCTGAGGATGAGGCARWATAT TWCTGTGCTCTATGGTACAGC3’ Vlam7a-F-BsiWI/SpeICCAGTAACTAGTCGTACGTAGGACAGTCAGTTTGGTTCCTCCACCGAACAC CCAATGGTTGCTGTACCATAGAGCACA

[00561] Cada um destes conjuntos de primers é transposto sobre a seqüência de VL correspondente inteira.

[00562] Dentro de cada conjunto, os primers foram misturados em quantidades iguais (por exemplo, 1 μl de cada primer [estoques de primer de 20 a 100 μM] a 20 μl de reação de PCR) e adicionados a uma mistura de PCR que consiste no tampão de PCR, nos nucleotídeos e na polimerase de Taq. Esta mistura foi incubada a 94°C por três minutos, a 65°C por um minuto, a 62°C por um minuto, a 59°C por um minuto, a 56°C por um minuto, a 52°C por um minuto, a 50°C por um minuto e a 72°C por dez minutos em um ciclador de PCR. O produto foi executado subseqüentemente em uma eletroforese em gel de agarose e o produto com um tamanho de 200 a 400 foi isolado do gel de acordo com métodos padrão.

[00563] Cada produto de VL PCR foi então utilizado como um molde para uma reação de PCR padrão utilizando os primers que incorporam os sítios de restrição de clonagem apropriados de N-terminal e de C-terminal. O fragmento do DNA do tamanho correto (para uma VL com aproximadamente 330 nucleotídeos) foi isolado pela eletroforese em gel de agarose de acordo com métodos padrão. Dessa maneira, o fragmento de DNA de VL suficiente foi amplificado.

[00564] O produto da PCR de VH com base em 3-72 de VH3 final (isto é, o repertório de VH humano/humanizado) foi então combinado com o produto da PCR de VL com base em VkII A18 final (isto é, o repertório de VL humano/humanizado) e o produto da PCR com base em 3-73 VH3 final (isto é, o repertório de VH humano/humanizado) com o produto da PCR com base em VL7 7a final (isto é, o repertório de VL humano/humanizado) no vetor de exposição de fago pComb3H5Bhis para formar duas bibliotecas diferentes de scFvs funcionais a partir dos quais - após a exposição no fago filamentoso - os aglutinantes anti- MUC-1 foram selecionados, examinados, identificados e confirmados tal como descrito, tal como segue:

[00565] 450 ng dos fragmentos de cadeia leve (digeridos com Sacl-Spel) foram ligados com 1400 ng do fagomídeo pComb3H5Bhis (digerido com Sacl-Spel; fragmento grande). A biblioteca do anticorpo combinatória resultante foi então transformada em 300 μl de células de Escherichia coli XL1 Blue eletrocompetentes por eletroporação (2,5 kV, cubeta com abertura de 0,2 cm, 25 uFD, 200 Ohm, pulsador de genes da Biorad), tendo por resultado uma biblioteca com um tamanho de mais de 107 clones independentes. Após uma hora da expressão do fenótipo, os transformantes positivos foram selecionados para a resistência à carbenicilina codificada pelo vetor de pComb3H5BHis em 100 ml da cultura de supercaldo de carne líquido (SB) até a manhã seguinte. As células foram então colhidas por centrifugação e a preparação do plasmídeo foi realizada utilizando um kit de preparação de plasmídeo comercialmente disponível (Qiagen).

[00566] 2800 ng deste DNA de plasmídeo contendo abiblioteca de VL (digeridos com Xhol-BstEII; fragmento grande) foram ligados com 900 ng dos fragmentos de V de cadeia pesada (digeridos com Xhol-BstEII) e transformados outra vez em duas alíquotas de 300 μl de células de E. coli XL1 Blueeletrocompetentes por eletroporação (2,5 kV, cubeta com abertura de 0,2 cm, 25 uFD, 200 Ohm), tendo por resultado umtamanho total da biblioteca de scFv de VH-VL (fragmentovariável de cadeia simples) de mais do que 107 clonesindependentes.

[00567] Após a expressão do fenótipo e lenta adaptação à carbenicilina, as células de E. coli que contêm a biblioteca do anticorpo foram transferidas ao meio de seleção de SB-Carbenicilina (50 ug/ml). As células de E. coli que contêm a biblioteca do anticorpo foram então infectadas com uma dose infecciosa de 1012 partículas do fago assistente VCSM13, tendo por resultado a produção e a secreção do fago filamentoso de M13, em que a partícula do fago contém um DNA de pComb3H5BHis de cordão simples que codifica um fragmento de scFv e exibe a proteína de scFv correspondente como uma fusãotranslacional à proteína de cobertura do fago III. Este agrupamento de fagos que exibem a biblioteca do anticorpo foiutilizado para a seleção de entidades de ligação do antígeno.Geração das células de CHO que expressam MUC-1 humano

[00568] A seqüência de codificação de MUC-1 humano como publicada no GenBank (Número de acesso J05581) foi obtida pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão. O fragmento da síntese de genes foi projetado de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido pela seqüência de codificação da proteína MUC-1 e um códon de interrupção (a seqüência de cDNA e de aminoácido do construto é relacionada sob as SEQ ID NO. de 1498 e do 1499 humanos). No fragmento da síntese de genes, a seqüência de repetição interna (nucleotídeos 382 a 441) de MUC-1, que é contida somente uma vez na versão depositada no GenBank é contida dezesseis vezes refletindo repetições múltiplas em MUC-1 fisiologicamente expressas. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição no começo e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos, EcoRI na extremidade 5’ e SalI na extremidade 3’, foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. Os sítios de restrição internos de XmaI foram removidos pela mutação silenciosa da seqüência de codificação no fragmento da síntese de genes (nucleotídeo 441 de C a T; isto é, o último nucleotídeo da primeira repetição e, portanto, identicamente mutacionado nas 15 seqüências de repetição subseqüentes; e nucleotídeo 2160 de G a C). O fragmento da síntese de genes foi clonado através de EcoRI e SalI em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al., Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) seguindo os protocolos padrão. Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes do construto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX.

[00569] Para a seleção de entidades de ligação do antígeno, a biblioteca de fago que carrega o repertório de scFv clonada foi colhida do sobrenadante de cultura respectivo por meio da precipitação de PEG8000/NaCl e centrifugação. Aproximadamente 1011 a 1012 partículas do fago de scFv foram ressuspensas em 0,4 ml de PBS/0,1% de BSA e foram incubadas com os 105 a 107 células de CHO transfectadas de MUC-1 (vide o Exemplo MUC-1 RoK) por uma hora em gelo sob agitação lenta. Estas células de CHO transfectadas de MUC-1 foram colhidas de antemão por centrifugação, lavadas em PBS e ressuspensas em PBS/1% de FCS (contendo azeto de sódio). O fago de scFv que não se liga especificamente às células de CHO transfectadas de MUC-1 foi eliminado por até cinco etapas de lavagem com PBS/1% de FCS (contendo azeto de sódio). Após a lavagem, as entidades de ligação foram eluídas das células ao ressuspender as células em HCl-glicina ao pH 2,2 (uma incubação de 10 minutos com turbilhonamento subseqüente) e após a neutralização com 2M de Tris ao pH 12, o eluato foi utilizado para a infecção de uma cultura de E. coli XL1 Blue fresca não-infectada (OD600 > 0,5). A cultura de E. coli que contém as células de E. coli transduzidas com sucesso com uma cópia do fagomídeo, que codificam um fragmento de scFv humano/humanizado, foi selecionada outra vez para a resistência à carbenicilina e infectada subseqüentemente com o fago assistente de VCMS 13 para iniciar a segunda rodada de exposição do anticorpo e seleção in vitro. Um total de quatro a cinco rodadas de seleções foi normalmente executado.

[00570] A fim de selecionar os aglutinantes específicos de MUC-1, o DNA do plasmídeo que corresponde a quatro e cinco rodadas de lavagem em bateia foi isolado das culturas de E. coli após a seleção. Para a produção da proteína de scFv solúvel heterólogo, os fragmentos do DNA de VH-VL foi removido dos plasmídeos (XhoI-Spel). Estes fragmentos foram clonados através dos mesmos sítios de restrição no plasmídeo pComb3H5BFlag/His que difere do pComb3H5BHis original pelo fato de que o construto da expressão (por exemplo, scFv) inclui um Flag-Tag (DYKDDDDK) entre o scFv e o tag de His6 e as proteínas do fago adicionais foram suprimidas. Após a ligação, cada agrupamento (diferentes rodadas de lavagem em bateia) do DNA do plasmídeo foi transformado em 100 μl de E. coli TG1 ou XLl Blue competentes por choque térmico e foi chapeado em LB- ágar de carbenicilina. As colônias únicas foram escolhidas em 100 μl de LB carb (50 ug/ml).

[00571] E. coli transformado com pComb3H5BHis que contém um segmento de VH e de VL produz o scFv solúvel heterólogo em quantidades suficientes após a excisão do fragmento do gene III e a indução com 1 mM de IPTG. Devido a uma seqüência de sinal apropriada, a cadeia de scFv foi exportada ao periplasma onde se desdobra em uma conformação funcional.

[00572] As colônias bacterianas de E. coli TG1 únicas das placas de transformação foram escolhidas para preparados periplasmáticos de pequena escala e cresceram no meio de SB (por exemplo, 10 ml) suplementadas com 20 mM de MgCl2 e 50μg/ml de carbenicilina (e redissolvidas em PBS (por exemplo, 1 ml) após a colheita. Por quatro rodadas de congelamento a -70°C e de descongelamento a 37°C, a membrana externa das bactérias foi destruída por choque de temperatura e as proteínas periplasmáticas solúveis heterólogas incluindo os scFvs foram liberadas no sobrenadante. Após a eliminação das células intactas e dos fragmentos de células por centrifugação, o sobrenadante contendo os scFvs anti-MUC-1 foi coletado e utilizado para a identificação dos aglutinantes MUC-1 específicos tal como segue:

[00573] A ligação dos scFvs a MUC-1 foi testada pela citometria de fluxo em células de CHO transfectadas de MUC-1; as células de CHO não-transfectadas foram utilizadas como o controle negativo.

[00574] Para a citometria de fluxo, 2,5x105 células foram incubadas com 50 μl do preparado periplasmático de scFv ou com 5 μg/ml de scFv purificado em 50 μl de PBS com 2% de FCS. A ligação de scFv foi detectada com o anticorpo anti-His (Penta-His Antibody, livre de BSA, Qiagen GmbH, Hilden, FRG) em 2 μg/ml em 50 μl de PBS com 2% de FCS. Como um reagente da segunda etapa, fragmento de F(ab’)2 purificado por afinidade conjugado à ficoeritrina, IgG anti-camundongo de cabra (específico do fragmento de Fc-gama), diluído 1:100 em 50 μl de PBS com 2% de FCS (Dianova, Hamburgo, FRG) é utilizada. As amostras foram medidas em um FACSscan (BD Biosciences, Heidelberg, FRG).

[00575] Clones simples foram então analisados quanto às propriedades favoráveis e à seqüência de aminoácido. Os scFvs específicos de MUC-1 foram convertidos em anticorpos de cadeia simples biespecíficos recombinantes ao uní-los através de um aglutinante de Gly4Ser1 com o scFv I2C específico de CD3 (SEQ ID 185) ou qualquer outro scFv específico de CD3 da invenção para resultar nos construtos com o arranjo de domínio de VHMuc1 - (Gly4Ser1)3 -VLMuc1- Gly4Ser1-VHCD3 - (Gly4Ser1)3 - VLCD3 ou arranjos de domínio alternativos. Para a expressão em células de CHO, as seqüências de codificação de (i) um líder de cadeia pesada de imunoglobulina de N-terminal que compreende um códon inicial incorporado dentro de uma seqüência de consenso de Kozak e (ii) um tag de His6 de C-terminal seguido por um códon de interrupção eram ambos unidos enquadrado à seqüência de nucleotídeo que codifica os anticorpos de cadeia simples biespecíficos antes da inserção do fragmento de DNA resultante, tal como obtido pela síntese de genes no sítio de clonagem múltiplo do vetor de expressão de pEF-DHFR (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). A transfecçãoestável das células de CHO deficientes em DHFR, a seleção de transfectantes DHFR positivos que secretam os anticorpos de cadeia simples biespecíficos ao sobrenadante da cultura e a amplificação de genes da cultura com metotrexato para níveis crescentes de expressão foram realizadas tal como descrito (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 92 (1995) 7021-7025).Todos os procedimentos restantes da técnica foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)).

[00576] A identificação de construtos do anticorpo de cadeia simples biespecíficos funcionais foi realizada pela análise citométrica de fluxo do sobrenadante da cultura de células de CHO transfectadas. Para esta finalidade, a ligação de CD3 foi testada na linhagem de células de leucemia de células T positivas de CD3 HPB-ALL (DSMZ, Bransvique, ACC483) e na linhagem de células T 4119LnPx de símio. A ligação aos epítopos de MUC-1 específicos de tumor foi testada em célulasde CHO transfectadas de MUC-1. 200.000 células da linhagem decélulas respectiva foram incubadas por trinta minutos em gelocom 50 μl do sobrenadante da cultura de células. As células foram lavadas duas vezes em PBS com 2% de FCS e o construto do anticorpo de cadeia simples biespecífica ligado foi detectado com um anticorpo anti-His murino (Penta His Antibody; Qiagen; diluído 1:20 em 50 μl de PBS com 2% de FCS). Após a lavagem, os anticorpos anti-His ligados foram detectados com um anticorpo específico de Fc-gama (Dianova) conjugado à ficoeritrina, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS. O sobrenadante das células de CHO não-transfectadas foi utilizado como o controle negativo.

[00577] A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS-Calibur; o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). O tingimento e a medição de FACS da intensidade de fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00578] Somente os construtos que exibem ligação biespecífica a CD3 de humano e de símio, bem como os epítopos de MUC-1 específicos de tumor foram selecionados para uso adicional.

[00579] Para a produção da proteína, as células de CHO que expressam o anticorpo de cadeia simples biespecífico inteiramente funcional e adaptadas ao meio de soja líquido de HyQ PF CHO livre de nucleosídeo (com 4,0 mM de L-glutamina com0,1% de Pluronic F-68; HyClone) cresceram em frascos de rolo com meio de soja líquido de HyQ PF CHO livre de nucleosídeo(com 4,0 mM de L-glutamina com 0,1% de Pluronic F-68; HyClone) por sete dias. O sobrenadante da cultura foi removido das células por centrifugação e armazenado a -20°C até a purificação. Como equipamento de cromatografia para a purificação do anticorpo de cadeia simples biespecífico do sobrenadante da cultura, Akta® Explorer System (GE Health Systems) e Unicorn® Software foram utilizados. A cromatografia de afinidade com metal imobilizado ("IMAC") foi executada utilizando um Fractogel EMD chelate® (Merck) que foi carregadocom ZnCl2 de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. Acoluna foi equilibrada com o tampão A (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1M de NaCl) e o sobrenadante dacultura de células (500 ml) foi aplicado à coluna (10 ml) a uma vazão de 3 ml/min. A coluna foi lavada com o tampão A para remover a amostra não-ligada. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de duas etapas do tampão B (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1M de NaCl, 0,5 M deimidazol) de acordo com o seguinte:Etapa 1: 20% do tampão B em 6 volumes da colunaEtapa 2: 100% do tampão B em 6 volumes da coluna

[00580] As frações da proteína eluída a partir da etapa 2 foram agrupadas para uma purificação adicional. Todos os produtos químicos eram do tipo para pesquisa e foram adquiridos junto à Sigma (Deisenhofen) ou junto à Merck (Darmstadt).

[00581] A cromatografia de filtração em gel foi executada em uma coluna do tipo preparatória HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada com o Equi-buffer (25 mM de citrato, 200 mM de lisina, 5% de glicerol, pH 7,2). As amostras da proteína eluída (vazão de 1 ml/min) foram submetidas à SDS-PAGE padrão e à transferência Western para a detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para a determinação do peso molecular (kit marcador do peso molecular, Sigma MW GF-200). As concentrações da proteína foram determinadas utilizando OD280 nm.

[00582] A proteína do anticorpo de cadeia simples biespecífica purificada foi analisada por SDS-PAGE sob condições reduzidas executadas com 4-12% de géis de Bis Tris pré-fundidos (Invitrogen). A preparação e a aplicação da amostra foram executadas de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. O peso molecular foi determinado com MultiMark protein standard (Invitrogen). O gel foi tingido com Coomassie coloidal (protocolo da Invitrogen). A pureza da proteína isolada é > 95%, tal como determinado pela SDS-PAGE.

[00583] O anticorpo de cadeia simples biespecífico tem um peso molecular de aproximadamente 52 kDa, sob condições nativas, tal como determinado pela filtração em gel em PBS. Todos os construtos foram purificados de acordo com este método.

[00584] A transferência Western foi executada utilizando uma membrana Optitran® BA-S83 e Invitrogen BlotModule de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. Paraa detecção dos anticorpos da proteína do anticorpo de cadeia simples biespecíficos, um anticorpo de Tag anti-His foi utilizado (Penta His, Qiagen). Um anticorpo de Ig anti- camundongo de cabra etiquetado com fosfatase alcalina (AP) (Sigma) foi utilizado como o anticorpo secundário e BCIP/NBT (Sigma) como o substrato. Uma faixa única foi detectada em 52 kD, que corresponde ao anticorpo de cadeia simples biespecífico purificado.

[00585] A potência no sistema humano e de primata não-chimpanzé dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos que interagem com o CD3 de humano e de símio e com os epítopos de MUC-1 específicos de tumor foi determinada por um ensaio de citotoxicidade com base na liberação do cromo 51 (51Cr)utilizando células de CHO transfectadas de MUC-1 como células alvo e PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas estimuladas ou a linhagem de células T de 4119LnPx de símio como células efetoras.A geração de PBMCs humanas estimuladas foi executada tal como segue:

[00586] Uma placa de Petri (145 mm de diâmetro, Nunc) foi revestida com um anticorpo anti-CD3 específico comercialmente disponível (por exemplo, OKT3, Othoclone) a uma concentração final de 1 μg/ml por 1 hora a 37°C. A proteína não-ligada foi removida por uma etapa de lavagem com PBS. AsPBMCs frescas foram isoladas do sangue periférico (30-50 ml desangue humano) pela centrifugação do gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. 3-5 x 107 PBMCs foram adicionadas à placa de Petri pré-revestida em 120 ml de RPMI 1640 com glutamina estabilizada/10% de FCS/20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) e foram estimuladas por dois dias. No terceiro dia, ascélulas foram coletadas e lavadas uma vez com RPMI 1640. A IL-2 foi adicionada a uma concentração final de 20 U/ml e as células foram cultivadas outra vez por um dia no mesmo meio decultura de células que aquele acima.

[00587] As células alvo foram lavadas duas vezes com PBS e etiquetadas com 11,1 MBq de 51Cr a um volume finalde 100 μl de RPMI com 50% de FCS por 45 minutos a 37°C. Ascélulas alvo etiquetadas foram lavadas subseqüentemente três vezes com 5 ml de RPMI e então utilizadas no ensaio de citotoxicidade. O ensaio foi executado em uma placa de 96 cavidades a um volume total de 250 μl de RPMI suplementado (tal como acima) com uma relação de E:T de 10:1,1 μg/ml das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas e vinte diluições de três vezes das mesmas foram aplicadas. O tempo do ensaio era de dezoito horas e a citotoxicidade foi medida como os valores relativosdo cromo do liberado no sobrenadante relacionados à diferença da lise máxima (adição de Triton-X) e da lise espontânea (semas células efetoras). Todas as medições foram feitas em quadruplicatas. A medição da atividade do cromo nos sobrenadantes foi executada com Wizard 3” Gamacounter (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemanha). A análise dos dados experimentais foi executada com Prism 4 for Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA). As curvas de resposta de dose sigmoidais têm tipicamente os valores de R2 > 0,90, tal como determinado pelo software. Osvalores EC50 como a medida da potência foram calculados pelo programa de análise. 36. Geração das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de CD33 e CD336.1. Geração das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de CD33 e CD3

[00588] Geralmente, as moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas, cada uma delas compreendendo um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para CD3 epsilon de humano e de símio, bem como um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para CD33 de humano e de símio, foram projetadas como definido na seguinte Tabela 14.

[00589] Tabela 14: Formatos das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas anti-CD3 e anti-CD33

[00590] Os construtos acima mencionados que contêmos domínios de cadeia leve variável (L) e de cadeia pesada variável (H) específicos de espécies cruzadas para CD33 e CD3 de humano e de símio das combinações de VH e de VL específicas para CD3 de humano e de símio foram obtidos pela síntese de genes. Os fragmentos da síntese de genes foram projetados de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido por um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, seguido enquadrado pela seqüência de codificação da molécula do anticorpo de cadeia simples biespecífica respectiva, seguido enquadrado pela seqüência de codificação uma um tag de histidina 6 e um códon de interrupção. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição apropriados no começo e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado atravésdestes sítios de restrição em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother50 (2001) 141-150) seguindo os protocolos padrão. Osprocedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Aamplificação de genes do construto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final deaté 20 nM de MTX. Após duas passagens da cultura estacionária, o sobrenadante da cultura de células foi coletado e utilizado nas experiências subseqüentes.36.2. Análise da ligação citométrica de fluxo dos anticorpos biespecíficos específicos de espécies cruzadas de CD33 e CD3

[00591] A fim de testar a funcionalidade dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas com relação à capacidade de se ligar a CD33 e CD3 de humano e de símio, respectivamente, uma análise de FACS é executada. Para esta finalidade, as células de CHO transfectadas com CD33 de humano tal como descrito no Exemplo 23.1 e a linhagem de células de leucemia das células T positivas de CD3 humanas HPB-ALL (DSMZ, Bransvique, ACC483) foram utilizadas para testar a ligação aos antígenos humanos. A reatividade de ligação aos antígenos de símio foi testada utilizando o transfectante gerado de CD33 de símio descrito no Exemplo 23.2 e as PBMCs de símio (a preparação das PBMCs de símio foi executada pela centrifugação do gradiente de Ficoll do sangue periférico dos macacos símios de acordo com protocolos padrão). 200.000 células das linhagens de células respectivas ou PBMCs foram incubadas por trinta minutos em gelo com 50 μl do sobrenadante da cultura de células das células transfectadas que expressam os construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas. As células foram lavadas duas vezes em PBS com 2% de FCS e a ligação doconstruto foi detectada com um anticorpo anti-His murino (Penta His Antibody; Qiagen; diluído 1:20 em 50 μl de PBS com 2% deFCS). Após a lavagem, os anticorpos anti-His ligados foram detectados com um anticorpo específico de Fc-gama (Dianova) conjugado à ficoeritrina, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS. O sobrenadante das células de CHO não-transfectadas foi utilizado como o controle negativo.

[00592] A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS-Calibur; o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). O tingimento e a medição de FACS da intensidade de fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00593] A ligação biespecífica das moléculas de cadeia simples relacionadas acima, que eram específicas de espécies cruzadas para CD33 e específicas de espécies cruzadas para CD3 de humano e de primata não-chimpanzé, era claramente detectável, conforme mostrado na Figura 60. Na análise de FACS, todos os construtos mostraram ligação a CD3 e a CD33 em comparação aos controles negativos respectivos. A especificidade de espécies cruzadas dos anticorpos biespecíficos aos antígenos de CD3 e CD33 de humano e de símio foi demonstrada.36.3. Bioatividade dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas de CD33 e CD3

[00594] A bioatividade dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos gerados foi analisada pela liberação do cromo 51 (51Cr) em ensaios de citotoxicidade in vitro utilizando as linhagens de células CD33 positivas descritas nos Exemplos 23.1 e 23.2. Como células efetoras, PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas ou a linhagem de células T de 4119LnPx de símio foram utilizadas, tal como especificado nas figuras respectivas.

[00595] Uma placa de Petri (145 mm de diâmetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) foi revestida com um anticorpo anti-CD3 específico comercialmente disponível (por exemplo, OKT3, Orthoclone) a uma concentração final de 1 μg/ml por uma hora a 37°C. A proteína não-ligada foi removida por uma etapa de lavagem com PBS. As PBMCs frescas foram isoladas do sangue periférico (30-50 ml de sangue humano) pela centrifugação do gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. 3-5 x 107 PBMCs foram adicionadas à placa de Petri pré- revestida em 120 ml de RPMI 1640 com glutamina estabilizada/10% de FCS/20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) e foram estimuladas por dois dias. No terceiro dia, as células foram coletadas e lavadas uma vez com RPMI 1640. A IL-2 foi adicionada a uma concentração final de 20 U/ml e as células foram cultivadas outra vez por um dia no mesmo meio de cultura de células que aquele acima.

[00596] Pelo esgotamento das células T de CD4+ e das células NK de CD56+ de acordo com protocolos padrão, os linfócitos T citotóxicos de CD8+ (CTLs) foram enriquecidos.

[00597] As células alvo foram lavadas duas vezes com PBS e etiquetadas com 11,1 MBq de 51Cr a um volume finalde 100 μl de RPMI com 50% de FCS por 45 minutos a 37°C. Ascélulas alvo etiquetadas foram lavadas subseqüentemente três vezes com 5 ml de RPMI e então utilizadas no ensaio de citotoxicidade. O ensaio foi executado em uma placa de 96 cavidades a um volume total de 250 μl de RPMI suplementado (tal como acima) com uma relação de E:T de 10:1. O sobrenadante das células que expressam as das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas auma concentração final de 50% e 20 diluições de três vezes dasmesmas foram aplicadas. O tempo do ensaio era de 18 horas e acitotoxicidade foi medida como os valores relativos do cromoliberado no sobrenadante relacionados à diferença da lise máxima (adição de Triton-X) e da lise espontânea (sem as células efetoras). Todas as medições foram feitas em quadruplicatas. A medição da atividade do cromo nos sobrenadantes foi executada com Wizard 3” Gamacounter (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemanha). A análise dos dados experimentais foi executada com Prism 4 for Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA). As curvas de resposta de dose sigmoidais têm tipicamente os valores de R2 > 0,90, tal como determinado pelo software. Os valores EC50 calculados pelo programa de análise foram utilizados para a comparação da bioatividade.

[00598] Conforme mostrado na Figura 61, todos os construtos do anticorpo de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas gerados demonstram atividade citotóxica contra as células alvo CD33 positivas humanas provocada pelas PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas estimuladas e contra as células positivas alvo de CD33 de símio provocada pela linhagem de células T de 4119LnPx de símio.37. Redistribuição das células T circulantes de chimpanzé quando da exposição a uma molécula de ligação de CD3 biespecífica convencional dirigida a uma molécula alvo que não estava presente nas células sangüíneas circulantes

[00599] Um único chimpanzé macho foi submetido à escalação de dose com o construto do anticorpo biespecífico de EpCAM/CD3 de cadeia simples (Schlereth (2005) Cancer Res 65: 2882). Tal como no construto do anticorpo biespecífico de CD19/CD3 de cadeia simples convencional (Loffler (2000, Blood, Volume 95, número 6) ou WO99/54440), o braço de CD3 do dito construto de EpCAM/CD3 também é dirigido contra um epítopo dependente do contexto convencional de CD3 de humano e de chimpanzé. No dia 0, o animal recebeu 50ml de PBS/5% de HSA sem o material de teste, seguido por 50ml de PBS/5% de HSA mais o construto do anticorpo biespecífico de EpCAM/CD3 de cadeia simples em 1,6, 2,0, 3,0 e 4,5 μg/kg nos dias 7, 14, 21 e 28, respectivamente. O período de infusão era de duas horas por administração. Para cada infusão semanal, o chimpanzé era sedado com 2-3 mg/kg de Telazol intramuscularmente, intubadoe colocado sob anestesia isoflurano/O2 com pressões sangüíneas médias estáveis. Um segundo cateter intravenoso foi colocadoem um membro oposto para coletar amostras de sangue inteiro(heparinizado) nos pontos de tempo indicados na Figura 62 paraa análise de FACS das células sangüíneas circulantes. Após alise de eritrócitos padrão, as células T foram tingidas com um anticorpo Etiquetado de FITC que reage com o CD2 de chimpanzé (Becton Dickinson) e a porcentagem de células T por linfócitos totais foi determinada por citometria de fluxo. Conforme mostrado na Figura 62, cada administração do construto do anticorpo biespecífico de EpCAM/CD3 de cadeia simples induzuma queda rápida das células T circulantes como observado como construto do anticorpo biespecífico de CD19/CD3 de cadeia simples nos pacientes com B-NHL, que não tiveram essencialmente nenhuma célula B alvo circulante (linfoma). Já que não há nenhuma célula alvo de EpCAM positiva no sangue circulante de humano e de chimpanzé, a queda de células T circulantes quando da exposição ao construto do anticorpo biespecífico de EpCAM/CD3 de cadeia simples pode ser atribuída unicamente a um sinal, que as células T recebem através da interação pura do braço de CD3 do construto com um epítopo de CD3 dependente docontexto convencional na ausência de qualquer reticulação mediada pelas células alvo. Como a redistribuição de célulasT induzida através de sua exposição ao construto do anticorpobiespecífico de CD19/CD3 de cadeia simples nos pacientes comB-NHL, que não tiveram essencialmente nenhuma célula B alvo circulante (linfoma), a redistribuição de células T de chimpanzé quando da exposição ao construto do anticorpo biespecífico de EpCAM/CD3 de cadeia simples pode ser explicada por uma mudança conformacional de CD3 após o evento de ligação a um epítopo de CD3 dependente do contexto, resultando adicionalmente no aumento transiente da aderência das células T ao endotélio dos vasos sangüíneos (vide o Exemplo 20). Esta descoberta confirma que as moléculas de ligação de CD3 convencionais dirigidas aos epítopos de CD3 dependentes do contexto - unicamente através desta interação - podem conduzir a um padrão de redistribuição de células T do sangue periférico, que é associado com o risco de eventos adversos ao SNC em humanos, tal como descrito no Exemplo 20.38. Ligação específico dos clones de scFv ao N- término de CD3 epsilon de humano38.1. Expressão bacteriana dos construtos de scFv em E. coli XL1 Blue

[00600] Conforme mencionado previamente, E. coli XL1 Blue transformado com o pComb3H5Bhis/Flag que contém um segmento de VH e de VL produz o scFv solúvel heterólogo em quantidades suficientes após a excisão do fragmento do gene III e a indução com 1 mM de IPTG. A cadeia de scFv é exportada ao periplasma onde se desdobra em uma conformação funcional.

[00601] Os seguintes clones de scFv foram escolhidos para esta experiência:i) ScFvs 4-10, 3-106, 3-114, 3-148, 4-48, 3-190 e3-271 tal como descrito no Pedido de Patente WO 2004/106380.ii) ScFvs dos clones de ligação anti-CD3 epsilon humanos H2C, F12Q e I2C tal como descrito na presente invenção.

[00602] Para os preparados periplasmáticos, as células bacterianas transformadas com o scFv respectivo que contém os plasmídeos que permitem a expressão periplasmática cresceram no meio de SB suplementado com 20 mM de MgCl2 e 50 μg/ml de carbenicilina e foram redissolvidas em PBS após a colheita. Por quatro rodadas de congelamento a -70°C e de descongelamento a 37°C, a membrana externa das bactérias foi destruída por choque osmótico e as proteínas periplasmáticas solúveis heterólogas incluindo os scFvs foram liberadas no sobrenadante. Após a eliminação das células intactas e dos fragmentos de células por centrifugação, o sobrenadante contendo os scFvs de CD3 anti-humano humanos foi coletado e utilizado para um exame adicional. Estes sobrenadantes brutos que contêm o scFv serão denominados adicionalmente como preparados periplasmáticos (PPP).38.2. Ligação dos scFvs a CD3 epsilon humano (aa 1-27) - proteína de fusão de Fc

[00603] As experiências com ELISA foram realizadas ao revestir o CD3 epsilon humano (aa 1-27) - proteína de fusão de Fc às cavidades de placas plásticas com 96 cavidades (Nunc, Maxisorb) tipicamente a 4°C até a manhã seguinte. A solução de revestimento do antígeno foi então removida, as cavidades foram lavadas uma vez com PBS/0,05% de Tween 20 e foram subseqüentemente obstruídas com PBS/3% de BSA por pelo menos uma hora. Após a remoção da solução de obstrução, os PPPs e as soluções de controle foram adicionados às cavidades e foram incubados por tipicamente uma hora à temperatura ambiente. As cavidades foram então lavadas três vezes com PBS/0,05% de Tween 20. A detecção dos scFvs ligados ao antígeno imobilizado foi realizada utilizando um anticorpo anti-FLAG-tag etiquetado de biotina (M2 anti Flag-Bio, Sigma, tipicamente a uma concentração final de 1 μg/ml de PBS) e detectado com uma estreptavidina etiquetada por peroxidase (Dianova, 1 μg/ml de PBS). O sinal foi desenvolvido pela adição da solução do substrato de ABTS e medido em um comprimento de onda de 405 nm. A ligação não-específica das amostras de teste ao agente de obstrução e/ou à porção de IgG1 humana de CD3 epsilon humano (aa 1-27) - proteína de fusão de Fc foi examinada pelarealização do ensaio idêntico com os reagentes idênticos e o sincronismo idêntico nas placas de ELISA que foram revestidas com IgG1 humana (Sigma). A PBS foi utilizada como um controle negativo.

[00604] Conforme mostrado na Figura 63, os scFvs H2C, F12Q e I2C mostram fortes sinais de ligação em CD3 epsilon humano (aa 1-27) - proteína de fusão de Fc. Os scFvs humanos3-106, 3-114, 3-148, 3-190, 3-271, 4-10 e 4-48 (tal comodescrito no Pedido de Patente WO 2004/106380) não mostram ligação significativa acima do nível do controle negativo.

[00605] Para excluir a possibilidade de que a ligação positiva dos scFvs H2C, F12Q e I2C às cavidades revestidas com CD3 epsilon humano (aa 1-27) - proteína de fusãode Fc seja devido à ligação a BSA (utilizada como um agente deobstrução) e/ou à porção Fc-gama de IgG1 humana de CD3 epsilonhumano (aa 1-27) - proteína de fusão de Fc, uma segundaexperiência de ELISA foi executada paralelamente. Nesta segunda experiência de ELISA, todos os parâmetros eram idênticos àqueles da primeira experiência de ELISA, exceto pelo fato de que na segunda experiência de ELISA, a IgG1 humana (Sigma) era revestida em vez do CD3 epsilon humano (aa 1-27) - proteína de fusão de Fc. Conforme mostrado na Figura 64, nenhum dos scFvs testados mostraram ligação significativa a BSA e/ou a IgG1 humana acima do nível de base.

[00606] Tomados conjuntamente, estes resultados permitem a conclusão que as moléculas de ligação de CD3 convencionais que reconhecem um epítopo dependente do contexto de CD3 epsilon (por exemplo, tal como descrito no Pedido de Patente WO 2004/106380) não se ligam especificamente à região de CD3 epsilon humano (aa 1-27), visto que os scFvs H2C, F12Q e I2C que se ligam a um epítopo independente do contexto de CD3 epsilon mostram claramente a ligação específica aos aminoácidos 27 de N-terminal de CD3 epsilon humano.39. Geração das moléculas de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas de CD44 e CD339.1. Clonagem das moléculas de ligação específicas de espécies cruzadas

[00607] Geralmente, as moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas, cada uma delas compreendendo um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para CD3 epsilon de humano e de símio, bem como um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para CD44 de humano e de símio, são projetadas tal como definido na seguinte Tabela 15.

[00608] Tabela 15: Formatos das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas anti-CD3 e anti-CD44

[00609] Os construtos acima mencionados que contêm os domínios de cadeia pesada variável (VH) e de cadeia leve variável (VL) específicos de espécies cruzadas para CD44 de humano e de símio e os domínios de VH e de VL específicos de espécies cruzadas para CD3 de humano e de símio foram obtidos pela síntese de genes. Os fragmentos da síntese de genes foram projetados de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido por um peptídeo líder de imunoglobulina do aminoácido 19, seguido enquadrado pela seqüência de codificação da molécula do anticorpo de cadeia simples biespecífica respectiva, seguido enquadrado pela seqüência de codificação de um tag de histidina 6 e um códon de interrupção. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição apropriados de N- e de C-terminal. O fragmento da síntese de genes foi clonado através destes sítios de restrição em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado nas células de ovário de hamster chinês (CHO) deficientes em reductase de diidrofolato (DHFR) para a expressão eucariótica do construto.39.2. Expressão das moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecíficas

[00610] Os construtos biespecíficos foram expressos transientemente nas células de CHO deficientes em DHFR. Resumidamente, 4 x 105 células por construto foram cultivadas em 3 ml de RPMI 1640 em todo o meio com o glutamina estabilizada suplementada com 10% de soro fetal de vitela, 1% de penicilina/estreptomicina e os nucleosídeos de uma solução conservada em estoque dos reagentes do tipo para cultura de células (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Alemanha) a uma concentração final de 10 μg/ml de adenosina, 10 μg/ml de desoxiadenosina e 10 μg/ml de timidina, em uma incubadora a 37°C, com 95% de umidade e 7% de CO2 um dia antes da transfecção. A transfecção foi executada com Fugene HD Transfection Reagent (Roche, #04709691001) de acordo com o protocolo do fabricante. 94 μl do meio OptiMEM (Invitrogen) e 6 μl de Fugene HD foram misturados e incubados por cinco minutos à temperatura ambiente. Subseqüentemente, 1,5 μg de DNA por construto foram adicionados, misturados e incubados por quinze minutos à temperatura ambiente. Enquanto isso, as células de CHO deficientes em DHFR foram lavadas com 1x PBS e ressuspensas em 1,5 ml de RPMI 1640 em todo o meio. A mistura da transfecção foi diluída com 600 μl de RPMI 1640 em todo o meio, adicionada às células e incubada até a manhã seguinte a 37°C, com 95% de umidade e 7% de CO2. Um dia após a transfecção, o volume de incubação de cada abordagem foi estendido a 5 ml de RPMI 1640 em todo o meio. O sobrenadante foi colhido após três dias de incubação.39.3. Análise da ligação citométrica de fluxo dos anticorpos CD44 e CD3 biespecíficos específicos de espécies cruzadas

[00611] A fim de testar a funcionalidade dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas com relação à capacidade de se ligar a CD44 de humano e de símio e CD3, respectivamente, uma análise de FACS foi executada. Para esta finalidade, as células de CHO transfectadas com CD44 humano (tal como descrito no Exemplo 28.1) e a linhagem de células de leucemia das células T positivas de CD3 humanas HPB-ALL (DSMZ, Bransvique, ACC483) foram utilizadas para testar a ligação aos antígenos humanos. A reatividade de ligação aos antígenos de símio gerados foitestada utilizando o transfectante CD44 de símio (descrito noExemplo 28.3) e uma linhagem de células T de 4119LnPx de símio (generosamente provida pelo prof. Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen-Nuremberg; publicado em Knappe A, et al. e Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256-61). Parademonstrar a especificidade dos construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas a CD44, a ligação a CD44delv6 humano (CD44 suprimido para o éxon v6) foitestada utilizando células de CHO transfectadas com CD44delv6humano (geração descrita no Exemplo 28.2).

[00612] 200.000 células das linhagens de célulasrespectivas foram incubadas por trinta minutos em gelo com 50 μl dos sobrenadantes de células das células transfectadas que expressam os construtos do anticorpo biespecíficos específicos de espécies cruzadas. As células foram lavadas duas vezes emPBS com 2% de FCS e a ligação do construto foi detectada comum anticorpo anti-His murino (Penta His Antibody; Qiagen; diluído 1:20 em 50 μl de PBS com 2% de FCS). Após a lavagem, os anticorpos anti-His ligados foram detectados com um anticorpo específico de Fc-gama (Dianova) conjugado à ficoeritrina, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS. O sobrenadante das células de CHO não-transfectadas foi utilizado como o controle negativo para a ligação às linhagens de células T. Um construto de cadeia simples com especificidade alvo irrelevante foi utilizado como o controle negativo para a ligação às células de CHO transfectadas CD44 e CD44delv6.

[00613] A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS-Calibur; o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). O tingimento e a medição de FACS da intensidade de fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00614] A ligação biespecífica das moléculas de cadeia simples relacionadas acima, que são específicas de espécies cruzadas para CD44 e específicas de espécies cruzadas para CD3 de humano e de símio era claramente detectável, conforme mostrado na Figura 65a-d. Nenhuma ligação das moléculas a CD44delv6 foi vista na Figura 65e. A especificidade de espécies cruzadas dos anticorpos biespecíficos aos antígenos de CD3 e CD44 de humano e de símio foi, portanto, claramente demonstrada.39.4. . Bioatividade dos anticorpos de cadeia simplesbiespecíficos específicos de espécies cruzadas de CD44 e CD3

[00615] A bioatividade dos anticorpos de cadeia simples biespecíficos gerados foi analisada pela liberação do cromo 51 (51Cr) em ensaios de citotoxicidade in vitroutilizando a linhagem de células positivas humanas de CD44 descrita em 28.1. Como células efetoras, PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas estimuladas; as PBMCs humanas estimuladas foram utilizadas como especificado na Figura respectiva.

[00616] A geração das PBMCs esgotadas de CD4/CD56 estimuladas foi executada tal como segue:O revestimento de uma placa de Petri (145 mm de diâmetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) foi realizado com um anticorpo anti-CD3 específico comercialmente disponível (por exemplo, OKT3, Othoclone) a uma concentração final de 1 μg/ml por uma hora a 37°C. A proteína não-ligada foi removida por uma etapa de lavagem com PBS. As PBMCs frescas foram isoladas do sangue periférico (30-50 ml de sangue humano) pela centrifugação do gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. 3-5 x 107 PBMCs foram adicionadas à placa de Petri pré- revestida em 120 ml de RPMI 1640 com glutamina estabilizada/10% de FCS/20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) e foram estimuladas por dois dias. No terceiro dia, as células foram coletadas e lavadas uma vez com RPMI 1640. A IL-2 foi adicionada a uma concentração final de 20 U/ml e as células foram cultivadas outra vez por um dia no mesmo meio de cultura de células que aquele acima. Pelo esgotamento das células T de CD4+ e das células NK de CD56+ de acordo com protocolos padrão, os linfócitos T citotóxicos de CD8+ (CTLs) foram enriquecidos.

[00617] As células alvo foram lavadas duas vezes com PBS e etiquetadas com 11,1 MBq de 51Cr a um volume final de 100 μl de RPMI com 50% de FCS por 45 minutos a 37°C. As células alvo etiquetadas foram lavadas subseqüentemente três vezes com 5 ml de RPMI e então utilizadas no ensaio de citotoxicidade. O ensaio foi executado em uma placa de 96 cavidades a um volume total de 250 μl de RPMI suplementado (tal como acima) com uma relação 10:1 de E:T. O sobrenadante das células que contém as moléculas do anticorpo de cadeia simples biespecífico específico de espécies cruzadas e 20 diluições de duas vezes das mesmas foram aplicados para o ensaio de citotoxicidade humana. O tempo do ensaio era de 18 horas e a citotoxicidade foi medida como os valores relativos do cromo liberado no sobrenadante relacionados à diferença da lise máxima (adição de Triton-X) e da lise espontânea (sem as células efetoras). Todas as medições foram feitas em quadruplicatas. A medição da atividade do cromo nos sobrenadantes foi executada com Wizard 3” Gamacounter (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemanha). A análise dos dados experimentais foi executada com Prism 4 for Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA). As curvas de resposta de dose sigmoidais têm tipicamente os valores de R2 > 0,90, tal como determinado pelo software. Osvalores EC50 calculados pelo programa de análise foram utilizados para a comparação da bioatividade.

[00618] Conforme mostrado na Figura 66, todos os construtos do anticorpo de cadeia simples biespecíficos específicos de espécies cruzadas gerados demonstraram atividade citotóxica contra as células positivas alvo CD44 provocada pelas PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas estimuladas.40. Geração do fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico específico de espécies cruzadas de CD3 e do antígeno de HCV40.1. . Geração das células de CHO que expressam a glicoproteína de envelope de HCV E2 (genótipos 1a e 1b de HCV)

[00619] As seqüências de codificação daglicoproteína de envelope de E2 do vírus da hepatite C (HCV)(Genótipo 1a e 1b de HCV, isolados de HCV dos subtipos respectivos; seqüências determinadas de acordo com protocolos padrão) cada um como proteínas de fusão translacionais com a transmembrana de CD4 humano e o domínio intracelular foram obtidas pela síntese de genes de acordo com protocolos padrão. Os fragmentos da síntese de genes foram projetados de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido pela seqüência de codificação de um peptídeo de sinal do aminoácido 14, seguido pela seqüência de codificação dos primeiros 278 (genótipo 1a) ou 279 (genótipo 1b) aminoácidos da glicoproteína de envelope de HCV E2, uma seqüência do epítopo de myc dobrada e a seqüência de codificação de transmembrana de CD4 e o domínio intracelular que corresponde aos aminoácidos 372 a os 433 humanos da proteína madura (tal como publicado no Número de acesso no GenBank M12807) e um códon de interrupção (as seqüências de cDNA e de aminoácido dos construtos foram relacionadas sob as SEQ ID NO. HCV-1 a HCV-4, genótipos 1a e 1b respectivamente). Os fragmentos da síntese de genes também foram projetados de modo a introduzir sítios de restrição no começo e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos, EcoRI na extremidade 5’ e SalI na extremidade 3’, foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. Os fragmentos da síntese de genes foram clonados através de EcoRI e SalI em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150) seguindo os protocolos padrão. Os procedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do construto. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. A amplificação de genes do construto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final de até 20 nM de MTX. Finalmente, duas linhagens de células foram geradas: uma linhagem de células de CHO com o genótipo 1a do domínio de HCV E2 expresso na superfície e outra linhagem de células de CHO com o genótipo 1b do domínio de HCV E2 expresso na superfície.40.2. Clonagem de um fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico de espécies cruzadas

[00620] Geralmente, um fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico, que compreende um domínio com uma especificidade de ligação específica de espécies cruzadas para CD3 epsilon de humano e de símio, bem como um domínio com uma especificidade de ligação para HCV, foi projetado tal como definido na seguinte Tabela 16.Tabela 16: Formato de um fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico específico do antígeno anti-HCV e específico de espécies cruzadas anti-CD3

[00621] O construto acima mencionado que contém osdomínios de cadeia leve variável (L) e de cadeia pesada variável (H) específicos para os antígenos de HCV e as combinações de VH e de VL específicas de espécies cruzadas para CD3 de humano e de símio foram obtidos pela síntese de genes. O fragmento da síntese de genes foi projetado de modo a conter primeiramente um sítio de Kozak para a expressão eucariótica do construto, seguido pelo peptídeo líder do aminoácido 19 de imunoglobulina, seguido enquadrado pela seqüência de codificação do fragmento do anticorpo de cadeiasimples em tandem biespecífico, seguido enquadrado pela seqüência de codificação por um Tag de histidina 6 e um códonde interrupção. O fragmento da síntese de genes também foi projetado de modo a introduzir sítios de restrição apropriados no começo e no fim do fragmento. Os sítios de restrição introduzidos foram utilizados nos seguintes procedimentos de clonagem. O fragmento da síntese de genes foi clonado atravésdestes sítios de restrição em um plasmídeo designado pEF-DHFR (o pEF-DHFR é descrito em Raum et al. Cancer Immunol Immunother50 (2001) 141-150) seguindo os protocolos padrão. Osprocedimentos acima mencionados foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Um clone com a seqüência de nucleotídeo verificada por seqüência foi transfectado às células de CHO deficientes em DHFR para a expressão eucariótica do fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico. A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Aamplificação de genes do construto foi induzida ao aumentar as concentrações de metotrexato (MTX) a uma concentração final deaté 20 nM de MTX.40.3. Expressão e purificação do fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico

[00622] O fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico foi expresso nas células de ovário de hamster chinês (CHO). A expressão da proteína eucariótica nas células de CHO deficientes em DHFR foi executada tal como descrito por Kaufmann R. J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537566. A amplificação de genes dos construtos foi induzida pela adição de concentrações crescentes de MTX até concentrações finais de 20 nM de MTX. Após duas passagens da cultura estacionária, as células cresceram em frascos de rolo com meio de soja líquido de HyQ PF CHO livre de nucleosídeo (com 4,0 mM de L-glutamina com 0,1% de Pluronic F-68; HyClone) por sete dias antes da colheita. As células foram removidas por centrifugação e o sobrenadante contendo a proteína expressa foi armazenado a -20°C. Alternativamente, os construtos foram transientemente expressos nas células de HEK 293. A transfecção é executada com o reagente 293fectin (Invitrogen, #12347-019) de acordo com o protocolo do fabricante.

[00623] Akta® Explorer System (GE Health Systems) e Unicorn® Software foram utilizados para a cromatografia. A cromatografia de afinidade com metal imobilizado ("IMAC") foi executada utilizando um Fractogel EMD chelate® (Merck) que foi carregado com ZnCl2 de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. A coluna foi equilibrada com o tampão A (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1M de NaCl) e osobrenadante da cultura de células (500 ml) foi aplicado à coluna (10 ml) a uma vazão de 3 ml/min. A coluna foi lavada com o tampão A para remover a amostra não-ligada. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de duas etapas do tampão B (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1Mde NaCl, 0,5 M de imidazol) de acordo com o seguinte:Etapa 1: 20% do tampão B em 6 volumes da colunaEtapa 2: 100% do tampão B em 6 volumes da coluna

[00624] As frações da proteína eluída a partir da etapa 2 foram agrupadas para uma purificação adicional. Todos os produtos químicos eram do tipo para pesquisa e foram adquiridos junto à Sigma (Deisenhofen) ou junto à Merck (Darmstadt).

[00625] A cromatografia de filtração em gel foi executada em uma coluna do tipo preparatória HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada com o Equi-buffer (25 mM de citrato, 200 mM de lisina, 5% de glicerol, pH 7,2). As amostras da proteína eluída (vazão de 1 ml/min) foram submetidas à SDS-PAGE padrão e à transferência Western para a detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para a determinação do peso molecular (kit marcador do peso molecular, Sigma MW GF-200). As concentrações da proteína foram determinadas utilizando OD280 nm.

[00626] O fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico purificado foi analisado pela SDS-PAGE sob condições reduzidas executadas com 4-12% de géis de Bis Tris pré-fundidos (Invitrogen). A preparação e a aplicação da amostra foram executadas de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. O peso molecular foi determinado com MultiMark protein standard (Invitrogen). O gel foi tingido com Coomassie coloidal (protocolo da Invitrogen). A pureza da proteína isolada era > 95%, tal como determinado pela SDS-PAGE.

[00627] O fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico tem um peso molecular de aproximadamente 52 kDa, sob condições nativas, tal como determinado pela filtração em gel em PBS.

[00628] A transferência Western foi executada utilizando uma membrana Optitran® BA-S83 e Invitrogen Blot Module de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. Os anticorpos utilizados são dirigidos contra His Tag (Penta His, Qiagen) e Ig anti-camundongo de cabra etiquetada com fosfatase alcalina (AP) (Sigma) e BCIP/NBT (Sigma) como o substrato. Uma faixa única foi detectada em 52 kD, que corresponde ao fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico purificado.40.4. Análise da ligação citométrica de fluxo do fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico específico de espécies cruzadas de CD3 e do antígeno de HCV

[00629] A fim de testar a funcionalidade do fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico específico de espécies cruzadas com relação à capacidade de se ligar ao antígeno de HCV e a CD3 de humano e de símio, respectivamente, uma análise de FACS foi executada. Para esta finalidade, as células de CHO transfectadas com antígeno E2 de HCV de dois genótipos diferentes de HCV (1a e 1b), tal como descrito no Exemplo 40.1, a linhagem de células de leucemia de células T positivas de CD3 HPB-ALL (DSMZ, Bransvique, ACC483) e a linhagem de células T de 4119LnPx de símio foram utilizadas para testar a ligação aos antígenos respectivos. 200.000 células das linhagens de células respectivas foram incubadas por trinta minutos em gelo com 50 μl do sobrenadante de células da cultura de células transfectadas que expressam o construto do anticorpo biespecífico específico de espécies cruzadas. As células foram lavadas duas vezes em PBS com 2% de FCS e a ligação do fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico foi detectada com um anticorpo anti-His murino (Penta His Antibody; Qiagen; diluído 1:20 em 50 μl de PBS com 2% de FCS). Após a lavagem, os anticorpos anti-His ligados foram detectados com um anticorpo específico de Fc-gama (Dianova) conjugado à ficoeritrina, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS.

[00630] A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS-Calibur; o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). O tingimento e a medição de FACS da intensidade de fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00631] A ligação biespecífica do fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico ao antígeno de HCV e a CD3 de humano e de primata não-chimpanzé era claramente detectável, conforme mostrado na Figura 67. Na análise de FACS, o fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico mostrou ligação aos antígenos de CD3 e de HCV em comparação aos controles negativos respectivos. A especificidade de espécies cruzadas do fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico para CD3 de humano e de símio de um lado e a especificidade de HCV de outro foram demonstradas.40.5. Bioatividade do fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico específico de espécies cruzadas de CD3 e do antígeno de HCV

[00632] A bioatividade do fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico foi analisada pela liberação do cromo 51 (51Cr) em ensaios de citotoxicidade invitro utilizando a linhagem de células positivas do antígeno de HCV descrita no Exemplo 40.1. Como células efetoras, PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas de dois doadores diferentes foram utilizadas.

[00633] Uma placa de Petri (145 mm de diâmetro, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) foi revestida com um anticorpo anti-CD3 específico comercialmente disponível (por exemplo, OKT3, Orthoclone) a uma concentração final de 1 μg/ml por uma hora a 37°C. A proteína não-ligada foi removida por uma etapa de lavagem com PBS. As PBMCs frescas foram isoladas do sangue periférico (30-50 ml de sangue humano) pela centrifugação do gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. 3-5 x 107 PBMCs foram adicionadas à placa de Petri pré- revestida em 120 ml de RPMI 1640 com glutamina estabilizada/10% de FCS/20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) e foram estimuladas por dois dias. No terceiro dia, as células foram coletadas e lavadas uma vez com RPMI 1640. A IL-2 foi adicionada a uma concentração final de 20 U/ml e as células foram cultivadas outra vez por um dia no mesmo meio de cultura de células que aquele acima.

[00634] Pelo esgotamento das células T de CD4+ e das células NK de CD56+ de acordo com protocolos padrão, os linfócitos T citotóxicos de CD8+ (CTLs) foram enriquecidos.

[00635] As células alvo foram lavadas duas vezes com PBS e etiquetadas com 11,1 MBq de 51Cr a um volume final de 100 μl de RPMI com 50% de FCS por 45 minutos a 37°C. As células alvo etiquetadas foram lavadas subseqüentemente três vezes com 5 ml de RPMI e então utilizadas no ensaio de citotoxicidade. O ensaio foi executado em uma placa de 96 cavidades a um volume total de 250 μl de RPMI suplementado (tal como acima) com uma relação de E:T de 10:1,76. 4 μg/ml do fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico específico de espécies cruzadas e 20 diluições de duas vezes do mesmo foram aplicadas. O tempo do ensaio era de 18 horas e a citotoxicidade foi medida como os valores relativos do cromo liberado no sobrenadante relacionados à diferença da lise máxima (adição de Triton-X) e da lise espontânea (sem as células efetoras). Todas as medições foram feitas em quadruplicatas. A medição da atividade do cromo nos sobrenadantes foi executada com Wizard 3” Gamacounter (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemanha). A análise dos dados experimentais foi executada com Prism 4 for Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA).

[00636] Conforme mostrado na Figura 68, o fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico específico de espécies cruzadas demonstrou atividadecitotóxica contra as células positivas alvo do antígeno humano de HCV.41. Fragmentos do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecíficos dirigidos a CD3 de humano e de primata não-chimpanzé e aos antígenos do vírus da hepatite exibidos na superfície de células infectadas41.1 Vírus da hepatite B (HBV)

[00637] Os seguintes oligonucleotídeosdegenerados, que se sobrepõem mutuamente em uma extensão de terminal de aproximadamente 15-20 nucleotídeos e em que cada segundo primer é um primer anti-sentido, foram utilizados para prover um contexto da seqüência de VH humana para CDRH1 (SEQ ID 1634), CDRH2 (SEQ ID 1635) e CDRH3 (SEQ ID 1636): 5’C8-VH-A-XhoICCACTTCTCGAGTCTGGCGSCGRASTGMWGMAGCCTGGCGSCTCCSTGMRG STGTCCTGCRMGGCCTCCGGC 3’C8-VH-BCCCTGGAGCCTGCCGCACCCAGGACATGGCGTAGCCGGWGAAGGTGWAGCC GGAGGCCKYGCAGGA5’C8-VH-CCGGCAGGCTCCAGGGMAGGGACTGGAATGGRTGRGCTCCATCTCCGGCTCC GGCGGCTCCACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGG 3’C8-VH-DCTTGGCGCAGTAGTACASGGCGGTGTCCTCGGMCCGCAGGGAGYTCAKCTS CAKGTACASGGTGYTCKTGGAGKTGTCCCGGSTSATTGTGAMCCGGCCCTTCACGGA 3’C8-VH-E-BstEIIGACCGTGGTGACCAGGGTGCCCTGGCCCCAGTTGCCCAGAGGGAAGTAGTA GATGGAGGAGCCGTAGTATTCCTGCCGGCCAGGAGGCTTGGCGCAGTAGTA

[00638] Estes conjuntos de primers são transpostos sobre a seqüência de VH inteira. Dentro deste conjunto, os primers foram misturados em quantidades iguais (por exemplo, 1 μl de cada primer [estoques de primer de 20 a 100 μM] a 20 μl de reação de PCR) e adicionados a uma mistura de PCR que consiste no tampão de PCR, nos nucleotídeos e na polimerase de Taq. Esta mistura foi incubada a 94°C por três minutos, a 65°C por um minuto, a 62°C por um minuto, a 59°C por um minuto, a 56°C por um minuto, a 52°C por um minuto, a 50°C por um minuto e a 72°C por dez minutos em um ciclador de PCR. O produto foi executado subseqüentemente em um uma eletroforese em gel de agarose e o produto com um tamanho de 200 a 400 foi isolado do gel de acordo com métodos padrão.

[00639] O produto resultante da PCR de VH foi então utilizado como um molde para uma reação de PCR padrão utilizando os primers que incorporam os sítios de restrição de clonagem apropriados de N-terminal e de C-terminal (primer 5'C8-VH-A-XhoI e primer 3'C8-VH-E-BstEII). O fragmento do DNA do tamanho correto (para uma VH com aproximadamente 350 nucleotídeos) foi isolado pela eletroforese em gel de agarose de acordo com métodos padrão. Dessa maneira, o fragmento do DNA de VH suficiente foi amplificado.

[00640] Os seguintes oligonucleotídeosdegenerados, que se sobrepõem mutuamente em uma extensão de terminal de aproximadamente 15-20 nucleotídeos e em que cada segundo primer é um primer anti-sentido, foram utilizados para prover um contexto da seqüência de VL humana para CDRL1 (SEQ ID 1639), CDRL2 (SEQ ID 1640) e CDRL3 (SEQ ID 1641), que eram anexados a CDRH1 (SEQ ID 1634), a CDRH2 (SEQ ID 1635) e a CDRH3 (SEQ ID 1636): 5’C8-Vl-A-SacICCTCAAGAGCTCGCCCTGAYGCAGCCTSCCTCCGTGTCCGTGKCCCYTGGC MAGACCGCCMGCATCACCTGCGGCGGCAAC 3’C8-Vl-BCAGCACAGGGGMCTGTCCTGGCTTCTGCTGATACCAGTGCACGGACTTGGA GCCGATGTTGTTGCCGCCGCAGGTGAT 5’C8-Vl-CCAGAAGCCAGGACAGKCCCCTGTGCTGGTCRTATACGACGACTCCGACCGC CCTTCCGGCATCCCTGAGCGGTTCTCCGGCTCC 3’C8-Vl-DGACCTGGCAGTAGTAGTCGGCCTCGTCCMYGGCCTSCRCCCSGGAGATGGT CAGGGTGRCGGTGKTGCCGGAGYTGGAGCCGGAGAACCG 3’C8-Vl-E-BsiWI/SpeICCCGATACTAGTCGTACGCAGCACGGTCAGCTTTGTTCCGCCGCCAAACAC CACCAGGTCGGAGGAGGAGTCCCAGACCTGGCAGTAGTAGTCGGC

[00641] Este conjunto de primers é transposto sobre a seqüência de VL correspondente inteira. Dentro deste conjunto, os primers foram misturados em quantidades iguais (por exemplo, 1 μl de cada primer [estoques de primer de 20 a 100 μM] a 20 μl de reação de PCR) e adicionados a uma mistura de PCR que consiste no tampão de PCR, nos nucleotídeos e na polimerase de Taq. Esta mistura foi incubada a 94°C por três minutos, a 65°C por um minuto, a 62°C por um minuto, a 59°C por um minuto, a 56°C por um minuto, a 52°C por um minuto, a 50°C por um minuto e a 72°C por dez minutos em um ciclador de PCR. O produto é executado subseqüentemente em um uma eletroforese em gel de agarose e o produto com um tamanho de 200 a 400 foi isolado do gel de acordo com métodos padrão.

[00642] O produto da PCR resultante de VL foi então utilizado como um molde para uma reação de PCR padrão utilizando os primers que incorporam os sítios de restrição de clonagem apropriados de N-terminal e de C-terminal (primer 5'C8-Vl-A-SacI e primer 3'C8-Vl-E-BsiWI/SpeI). O fragmento do DNA do tamanho correto (para uma VL com aproximadamente 330 nucleotídeos) foi isolado pela eletroforese em gel de agarose de acordo com métodos padrão. Dessa maneira, o fragmento de DNA de VL suficiente foi amplificado.

[00643] O produto final da PCR de VH (isto é, o repertório de VH humano/humanizado) foi então combinado com seu produto final da PCR de VL respectivo (isto é, o repertório de VL humano/humanizado) no vetor de exposição de fago pComb3H5Bhis para formar uma biblioteca de fragmentos do anticorpo funcional de scFv a partir da qual - após a exposição no fago filamentoso - os aglutinantes anti-HBS foram selecionados, examinados, identificados e confirmados tal como descrito, tal como segue:

[00644] 450 ng dos fragmentos de cadeia leve (digeridos com Sacl-Spel) foram ligados com 1400 ng do fagomídeo pComb3H5Bhis (digerido com Sacl-Spel; fragmento grande). A biblioteca do anticorpo combinatória resultante foi então transformada em 300 μl de células de Escherichia coli XL1 Blue eletrocompetentes por eletroporação (2,5 kV, cubeta com abertura de 0,2 cm, 25 uFD, 200 Ohm, pulsador de genes da Biorad), tendo por resultado uma biblioteca com um tamanho de mais de 107 clones independentes. Após uma hora da expressão do fenótipo, os transformantes positivos foram selecionados para a resistência à carbenicilina codificada pelo vetor de pComb3H5BHis em 100 ml da cultura de supercaldo de carne líquido (SB) até a manhã seguinte. As células foram então colhidas por centrifugação e a preparação do plasmídeo foi realizada utilizando um kit de preparação de plasmídeo comercialmente disponível (Qiagen).

[00645] 2800 ng deste DNA de plasmídeo contendo abiblioteca de VL (digerido com Xhol-BstEII; fragmento grande) foram ligados com 900 ng dos fragmentos de V de cadeia pesada (digeridos com Xhol-BstEII) e transformados outra vez em duas alíquotas de 300 μl de células de E. coli XL1 Blue eletrocompetentes por eletroporação (2,5 kV, cubeta comabertura de 0,2 cm, 25 uFD, 200 Ohm), tendo por resultado umtamanho total da biblioteca de fragmentos do anticorpo de scFv de VH-VL de mais de 107 clones independentes.

[00646] Após a expressão do fenótipo e lenta adaptação à carbenicilina, as células de E. coli que contêm a biblioteca do anticorpo foram transferidas ao meio de seleção de SB-Carbenicilina (50 μg/ml). As células de E. coli que contêm a biblioteca do anticorpo foram então infectadas com uma dose infecciosa de 1012 partículas do fago assistente VCSM13, tendo por resultado a produção e a secreção do fago filamentoso de M13, em que a partícula do fago contém um DNA de pComb3H5BHis de cordão simples que codifica um fragmento do anticorpo de scFv e que exibiu o fragmento correspondente doanticorpo de scFv como uma fusão translacional à proteína decobertura do fago III. Este agrupamento de fagos que exibem a biblioteca do anticorpo foi utilizado para a seleção de entidades de ligação do antígeno.

[00647] Do mesmo modo, o procedimento antecedente foi aplicado para outro aglutinante alvo. Para esta finalidade, os seguintes oligonucleotídeos degenerados, que se sobrepõem mutuamente em uma extensão de terminal de aproximadamente 1520 nucleotídeos e em que cada segundo primer é um primer anti-sentido, foram utilizados para prover um contexto da seqüência de VH humana para CDRH1 (SEQ ID 1669), CDRH2 (SEQ ID 1670) eCDRH3 (SEQ ID 1671): 5’C9-VH-A-XhoICCACTTCTCGAGTCTGGGGSAGRGGTGRWGMAGCCTGGGRSGTCCSTGARA STCTCCTGTGCAGCCTCTGGA 3’C9-VH-BCCACTCCAGCCCCTKGCCTGGAGCCTGGCGGACCCAGTGTATGCCATAATT ACTGAAGGTGWATCCAGAGGCTGCACAGGA 5’C9-VH-CGCTCCAGGCMAGGGGCTGGAGTGGRTGGSACTTATATCATATGATGGAAAT AAGAAATTCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGA 3’C9-VH-DGTAATATACAGCCGTGTCCTCAGRTCTCAGGCTGCTCAKTTSCAKATMCAC CGTGYTCKTAGAAGTGTCTCTGGTSATGGYGAMTCGGCCCTTCACGGAGTC 3’C9-VH-E-BstEIIGACCGTGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCAGTAGTCAAATTCCCCCCAGTA CAAGGCAATACCCCCAGATTTCGCACAGTAATATACAGCCGTGTC

[00648] Como primers para que a reação de PCR final padrão incorpore sítios de restrição de clonagem apropriados de N-terminal e de C-terminal a VH, os oligonucleotídeos 5'C9- VH-A-XhoI e 3'C9-VH-E-BstEII foram utilizados.

[00649] Análogos a VH, os seguintesoligonucleotídeos degenerados, que se sobrepõem mutuamente em uma extensão de terminal de aproximadamente quinze a vinte nucleotídeos e em que cada segundo primer é um primer anti- sentido, foram utilizados para prover um contexto da seqüência de VL humana para CDRL1 (SEQ ID 1672), CDRL2 (SEQ ID 1673) e CDRL3 (SEQ ID 1674), que são anexados a CDRH1 (SEQ ID 1669), a CDRH2 (SEQ ID 1670) e a CDRH3 (SEQ ID 1671): 5’C9-Vl-A-SacICCTCAAGAGCTCGWACTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGYGGCCCCAGGA CA GAMGGYCAYGATTTCCTGTGGGGGAAAC 3’C9-Vl-BGCCTGGCWKCTGCTGATACCAGTGCACGGTTGTACTTCCAATGTTGTTTCC CCCACAGGAAAT 5’C9-Vl-CTGGTATCAGCAGMWGCCAGGCMMGGCCCCTRWGCTGSTCRTCTATGATGAT AACGAGCGACCCTCAGGGATCCCTGASCGATTCTCTGGCTCC 3’C9-Vl-DCACTTGACAATAATAGTCGGCCTCATCCCCGGYTTSGASCCYGKTGATGSY CAGGGTGGCCGAGGTCCCAGASTTGGAGCCAGAGAATCG 3’C9-Vl-E-BsiWI/SpeICCCGATACTAGTCGTACGTAGGACGGTCAGCTTCGTCCCTCCGCCGAATAC CACATGATCACTACCACTATCCCACACTTGACAATAATAGTC

[00650] Como primers para que a reação de PCR final padrão incorpore sítios de restrição de clonagem apropriados de N-terminal e de C-terminal a VL, os oligonucleotídeos 5'C9- Vl-A-SacI e 3'C9-Vl-E-BsiWI/SpeI foram utilizados.

[00651] Para a seleção de entidades de ligação do antígeno, a biblioteca de fago que carrega o repertório de scFv clonado foi colhida do sobrenadante respectivo da cultura pela precipitação de PEG (polietilenoglicol) 8000/NaCl e centrifugação. Aproximadamente 1011 a 1012 partículas do fago de scFv foram ressuspensas em 0,4 ml de PBS/0,1% de BSA e foram incubadas com o antígeno imobilizado de HBS (por exemplo, EngerixR-B, GlaxoSmithKline, Alemanha; HBvaxProTM, Aventis Pasteur MSD SNC, França) por 2 h sob agitação delicada a 37°C. O antígeno imobilizado de HBS (por exemplo, 5 μg/ml PBS) foi revestido nas cavidades e as cavidades foram subseqüentemente obstruídas de acordo com protocolos padrão.

[00652] As partículas do fago que exibem os fragmentos do anticorpo de scFv que não se ligam especificamente ao antígeno alvo foram eliminadas por etapas de lavagem com PBS/0,1% de BSA (o Tween 20 pode ser adicionado à solução de lavagem para aumentar o rigor da lavagem). Após a lavagem, as entidades de ligação foram eluídas utilizando HCl-glicina ao pH 2,2 e após a neutralização com 2M de Tris ao pH 12, o eluato foi utilizado para a infecção de uma cultura de E. coli Blue XL1 não-infectada fresca.

[00653] Para a eluição das entidades de ligação fortes restantes nas cavidades eluídas, 200 μl de uma cultura de E. coli Blue XL1 fresca (OD600 > 0,5) foram adicionados às cavidades eluídas e foram incubados por mais dez minutos sob agitação delicada. Ambas as culturas de E. coli foram então misturadas e as células transduzidas com sucesso com uma cópia do fagomídeo, que codifica um fragmento humano do anticorpo de scFv, foram selecionadas outra vez para a resistência à carbenicilina e subseqüentemente infectadas com o fago assistente de VCMS 13 para iniciar a segunda rodada de exposição do anticorpo e seleção in vitro. Um total de quatro a cinco rodadas de seleções foi normalmente realizado.

[00654] A fim de selecionar os aglutinantes específicos de HBS, o DNA do plasmídeo que corresponde a quatro e cinco rodadas de lavagem em bateia foi isolado das culturasde E. coli após a seleção. Para a produção do fragmento do anticorpo de scFv solúvel heterólogo, os fragmentos do DNA deVH-VL foram removidos dos plasmídeos (XhoI-Spel). Estes fragmentos foram clonados através dos mesmos sítios de restrição no plasmídeo pComb3H5BFlag/His que difere do pComb3H5BHis original pelo fato de que o construto da expressão (por exemplo, fragmento do anticorpo de scFv) inclui um FlagTag (DYKDDDDK) entre o fragmento do anticorpo de scFv e o tagde His6 e as proteínas do fago adicionais foram suprimidas. Após a ligação, cada agrupamento (rodadas diferentes de lavagem em bateia) do DNA do plasmídeo foi transformado em 100 μl de E. coli TG1 ou XL1 Blue competente por choque térmico e chapeado em LB-ágar de carbenicilina. As colônias únicas foram escolhidas em 100 μl de carb LB (50 μg/ml).

[00655] E. coli transformado com pComb3H5BHis que contém um segmento de VH e de VL produz o fragmento do anticorpo de scFv solúvel heterólogo em quantidades suficientes após a excisão do fragmento do gene III e indução com 1 mM de IPTG. Devido a uma seqüência de sinal apropriada, o fragmento do anticorpo de scFv foi exportado no periplasma onde se desdobra em uma conformação funcional.

[00656] As colônias bacterianas de E. coli TG1 únicas das placas de transformação foram escolhidas para preparados periplasmáticos de pequena escala e cresceram no meio de SB (por exemplo, 10 ml) suplementado com 20 mM de MgCl2 e 50μg/ml de carbenicilina (e redissolvidas em PBS (por exemplo, 1 ml) após a colheita. Por quatro rodadas de congelamento a -70°C e de descongelamento a 37°C, a membrana externa das bactérias foi destruída por choque de temperatura e as proteínas periplasmáticas solúveis heterólogas incluindo os fragmentos do anticorpo de scFv foram liberados no sobrenadante. Após a eliminação das células intactas e dos fragmentos de células por centrifugação, o sobrenadante contendo os fragmentos do anticorpo de scFv anti-HBS de foi coletado e utilizado para a identificação de aglutinantes específicos de HBS tal como segue:

[00657] O antígeno de HBS foi revestido nas cavidades de placas plásticas com 96 cavidades (Nunc, Maxisorb) tipicamente a 4°C até a manhã seguinte. As cavidades foram lavadas uma vez com PBS/0,05% de Tween 20 e subseqüentemente obstruídas com PBS/3% de BSA por pelo menos uma hora. Após a remoção da solução de obstrução, os preparados do periplasma e as soluções de controle foram adicionados às cavidades e foram incubados por tipicamente uma hora à temperatura ambiente. As cavidades foram então lavadas três vezes com PBS/0,05% de Tween 20. A detecção dos fragmentos do anticorpo de scFv e dos anticorpos do controle ligados ao antígeno imobilizado foi realizada utilizando um anticorpo murino monoclonal anti-His6 ou anti Flag-Tag (anti-PentaHis da Qiagen e M2 anti-Flag da Sigma, tipicamente a uma concentração final de 1 μg/ml de PBS) detectado com um anticorpo do fragmento de Fab anti-camundongo de cabra policlonal etiquetado por peroxidase (Dianova, 1 ug/ml de PBS). O sinal foi desenvolvido pela adição da solução do substrato de ABTS e medido em um comprimento de onda de 405 nm. A ligação não-específica das amostras de teste ao agente de obstrução foi examinada realizando ensaios idênticos com reagentes idênticos e sincronismo idêntico nas placas de ELISA que não eram revestidas com o antígeno, mas somente obstruídas com BSA.

[00658] Para excluir a possibilidade de que a ligação positiva possa ser devido à ligação à BSA (a ser utilizada como um agente de obstrução na primeira experiência de ELISA), uma segunda experiência de ELISA foi executada paralelamente. Nesta segunda experiência de ELISA, todos os parâmetros eram idênticos àqueles da primeira experiência de ELISA, exceto pelo fato de que, na segunda experiência de ELISA, não ocorre nenhum revestimento com antígeno, mas somente a obstrução com BSA.

[00659] A fim de identificar aqueles fragmentos do anticorpo de scFv específicos de HBS identificados por ELISA, que também se ligam ao antígeno de HBS como exibido na superfície de células infectadas com HBV, a imunofluorescência indireta com o fragmento do anticorpo de scFv etiquetado por Flag seguido pelo anticorpo anti-Flag conjugado a FITC nas células HepG2.2.15 (Bohne F, Chmielewski M, Ebert G, et al. T cells redirected against hepatitis B virus surface proteins eliminate infected hepatocytes. Gastroenterology 2008; 134: 239-47) foi realizada de acordo com protocolos padrão (por exemplo, Current Protocols in Immunology, Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002, unidade 21.3). As células HepG2 não-infectadas serviram como o controle negativo. As condições da cultura das células HepG2.2.15 para a exibição mais favorável do antígeno de HBS na superfície da célula foram descritas por Bohne et al. (Bohne F, Chmielewski M, Ebert G, et al. T cells redirected against hepatitis B virus surface proteins eliminate infected hepatocytes. Gastroenterology 2008; 134: 239-47).

[00660] Clones confirmados para a ligação específica ao antígeno de HBS na superfície de células infectadas com HBV foram então analisados quanto às propriedades favoráveis da proteína e à seqüência de aminoácido. Os fragmentos específicos do anticorpo de scFv de HBS foram convertidos em fragmentos do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecíficos recombinantes ao uní-los através de um aglutinante de Gly4Ser1 com o fragmento do anticorpo de scFv específico de CD3 I2C (SEQ ID 185) ou qualquer outro fragmento do anticorpo de scFv específico de CD3 da invenção para resultar nos construtos com o arranjo de domínio de VHMuc1 - (Gly4Ser1)3 -VLMuc1- Gly4Ser1-VHCD3 - (Gly4Ser1)3 - VLCD3 ou arranjos de domínio alternativos. Para a expressão em células de CHO, as seqüências de codificação de (i) um líder de cadeia pesada de imunoglobulina de N-terminal que compreende um códon inicial incorporado dentro de uma seqüência de consenso de Kozak e (ii) um tag de His6 de C-terminal seguido por um códon de interrupção foram ambos unidos enquadrado à seqüência de nucleotídeo que codifica os fragmentos do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecíficos antes da inserção do fragmento de DNA resultante, tal como obtido pela síntese de genes no sítio de clonagem múltiplo do vetor de expressão de pEF-DHFR (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). A transfecção estável das células de CHO deficientes em DHFR, a seleção para transfectantes DHFR positivos que secretam os anticorpos de cadeia simples biespecíficos ao sobrenadante da cultura e a amplificação de genes da cultura com metotrexato para níveis crescentes de expressão foram realizados tal como descrito (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 92 (1995) 7021-7025). Todos osprocedimentos restantes da técnica foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)).

[00661] Os fragmentos do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecíficos funcionais foram identificados por ELISA e citometria de fluxo utilizando o sobrenadante da cultura de células de CHO transfectadas. Para esta finalidade, a ligação de CD3 foi testada na linhagem de células de leucemia das células T positivas de CD3 humanas HPB-ALL (DSMZ, Bransvique, ACC483) e na linhagem de células T de 4119LnPx de símio. 200.000 células da linhagem de células respectiva foram incubadas por trinta minutos em gelo com 50 μl do sobrenadante da cultura de células. As células foram lavadas duas vezes em PBS com 2% de FCS e o fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico ligado foi detectado com um anticorpo anti-His murino (Penta His Antibody; Qiagen; diluído 1:20 em 50 μl de PBS com 2% de FCS). Após a lavagem, os anticorpos anti-His ligados foram detectados com um anticorpo específico de Fc-gama (Dianova) conjugado à ficoeritrina, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS. O sobrenadante das células de CHO não- transfectadas foi utilizado como o controle negativo.

[00662] A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS-Calibur; o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). O tingimento e a medição de FACS da intensidadede fluorescência são executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002). A ligação ao antígeno de HBS foi testada por ELISA tal como descrito acima. A detecção do fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico ligado foi realizada utilizando um anticorpo anti-His6 murino monoclonal (anti-PentaHis da Qiagen tipicamente a uma concentração final de 1 μg/ml PBS) seguido por um anticorpo do fragmento de Fab anti-camundongo de cabra policlonal etiquetado por peroxidase (Dianova, 1 ug/ml de PBS).

[00663] Somente os construtos que exibem ligação biespecífica a CD3 de humano e de símio, bem como ao antígeno de HBS, foram selecionados para uso adicional.

[00664] Para a produção da proteína, as células de CHO que expressam fragmentos do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecíficos inteiramente funcionais e adaptadas ao meio de soja líquido de HyQ PF CHO livre de nucleosídeo (com4,0 mM de L-glutamina com 0,1% de Pluronic F-68; HyClone) cresceram em frascos de rolo com meio de soja líquido de HyQPF CHO livre de nucleosídeo (com 4,0 mM de L-glutamina com 0,1% de Pluronic F-68; HyClone) por sete dias. O sobrenadante da cultura foi removido das células por centrifugação e armazenado a -20°C até a purificação. Como equipamento de cromatografia para a purificação do fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico do sobrenadante da cultura, Akta® Explorer System (GE Health Systems) e Unicorn® Software foram utilizados. A cromatografia de afinidade com metal imobilizado ("IMAC") foi executada utilizando um Fractogel EMD chelate® (Merck) que foi carregado com ZnCl2 de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. A coluna foi equilibrada com o tampão A (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1M de NaCl) e o sobrenadante da cultura de células(500 ml) foi aplicado à coluna (10 ml) a uma vazão de 3 ml/min. A coluna foi lavada com o tampão A para remover a amostra não- ligada. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradientede duas etapas do tampão B (20 mM de tampão de fosfato de sódioao pH 7,2, 0,1M de NaCl, 0,5 M de imidazol) de acordo com oseguinte:Etapa 1: 20% do tampão B em 6 volumes da colunaEtapa 2: 100% do tampão B em 6 volumes da coluna

[00665] As frações da proteína eluída a partir da etapa 2 foram agrupadas para uma purificação adicional. Todosos produtos químicos são do tipo para pesquisa e foram adquiridos junto à Sigma (Deisenhofen) ou junto à Merck (Darmstadt).

[00666] A cromatografia de filtração em gel foi executada em uma coluna do tipo preparatória HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada com o Equi-buffer (25 mM de citrato, 200 mM de lisina, 5% de glicerol, pH 7,2). As amostras da proteína eluída (vazão de 1 ml/min) foram submetidas à SDS-PAGE padrão e à transferência Western para a detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para a determinação do peso molecular (kit marcador do peso molecular, Sigma MW GF-200). As concentrações da proteína são determinadas utilizando OD280 nm.

[00667] O fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico purificado foi analisado pela SDS-PAGE sob condições reduzidas executadas com 4-12% de géis de Bis Tris pré-fundidos (Invitrogen). A preparação e a aplicação da amostra foram executadas de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. O peso molecular foi determinado com MultiMark protein standard (Invitrogen). O gel foi tingido com Coomassie coloidal (protocolo da Invitrogen). A pureza da proteína isolada é > 95%, tal como determinado pela SDS-PAGE.

[00668] O fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico tem um peso molecular de aproximadamente 52 kDa, sob condições nativas, tal como determinado pela filtração em gel em PBS. Todos os construtos foram purificados de acordo com este método.

[00669] A transferência Western foi executada utilizando uma membrana Optitran® BA-S83 e Invitrogen BlotModule de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. Paraa detecção dos fragmentos do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecíficos, o anticorpo anti-His Tag foi utilizado (Penta His, Qiagen). Um anticorpo de Ig anti-camundongo de cabra etiquetado com fosfatase alcalina (AP) (Sigma) foi utilizado como o anticorpo secundário e BCIP/NBT (Sigma) como o substrato. Uma faixa única foi detectada em 52 kD, que corresponde ao fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico purificado.

[00670] A potência no sistema de humano e de primata não-chimpanzé dos fragmentos do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecíficos que interagem com o CD3 de humano e de símio e com o antígeno de HBS foi determinada por um ensaio de citotoxicidade não-radioativo utilizando as células HepG2.2.15 como as células alvo, tal como descrito por Bohne et al. (Bohne F, Chmielewski M, Ebert G, et al. T cells redirected against hepatitis B virus surface proteins eliminated infected hepatocytes. Gastroenterology 2008; 134:239-47) e as PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas estimuladas ou a linhagem de células T de 4119LnPx de símio em vez das células T transduzidas com um receptor quimérico das células T como as células efetoras. A fim de obter as curvas de resposta de dose, a concentração de cada fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico (em vez da relação de E:T tal como descrito por Bohne et al.) foi titulada no ensaio de citotoxicidade a uma relação de E:T fixa (por exemplo, 10:1 ou 5:1).

[00671] A geração de PBMCs humanas estimuladas foi executada tal como segue:Uma placa de Petri (85 mm de diâmetro, Nunc) foi revestida com um anticorpo anti-CD3 específico comercialmentedisponível (por exemplo, OKT3, Othoclone) a uma concentração final de 1 μg/ml por uma hora a 37°C. A proteína não-ligadafoi removida por uma etapa de lavagem com PBS. As PBMCs frescas foram isoladas do sangue periférico (30-50 ml de sangue humano) pela centrifugação do gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. 3-5 x 107 PBMCs foram adicionadas à placa de Petri pré-revestida em 50 ml de RPMI 1640 com glutamina estabilizada/10% de FCS/20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) e foram estimuladas por dois dias. No terceiro dia, as célulasforam coletadas e lavadas uma vez com RPMI 1640. A IL-2 foi adicionada a uma concentração final de 20 U/ml e as célulasforam cultivadas outra vez por um dia no mesmo meio de cultura de células que aquele acima.

[00672] A análise dos dados experimentais do ensaio de citotoxicidade foi executada com Prism 4 for Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA). As curvas de resposta de dose sigmoidais têm tipicamente os valores de R2 > 0,90, tal como determinado pelo software.Os valores EC50 como a medida da potência foram calculados pelo programa de análise.41.2 Vírus da hepatite C (HCV)

[00673] Os seguintes oligonucleotídeosdegenerados, que se sobrepõem mutuamente em uma extensão determinal de aproximadamente 15-20 nucleotídeos e em que cada segundo primer é um primer anti-sentido, são utilizados paraprover um contexto da seqüência de VH humana para CDRH1 (SEQ ID 1652), CDRH2 (SEQ ID 1653) e CDRH3 (SEQ ID 1654): 5’HC1-VH-A-XhoICAGCTACTCGAGTSGGGCGSAGGACTGKTGMAGCCTKSGGRGTCCCTGAGWCTCTCCTGCGCTG 3’HC1-VH-BCCACTCCAGCCCCTTCCCAGGGGMCTGGCGGAYCCAGGTCCAGAAGTAACCACTWAAGGTAMMACCAKAGRCAGCGCAGGAGAGWCTCAGGGAC5’HC1-VH-CCTGGGAAGGGGCTGGAGTGGRTTRGTGAAAGCAATTATAGTGGAAGTACCAGGTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAKTCACCATATCA3’HC1-VH-DATACAGCCGTGTCCKCGGCTSTCASAGAAYTCAKCTKCAGGKAGARCKKGTTCTKGGAGKTGTCTMYTGATATGGTGAMTCGACTCTTG 5’HC1-VH-EAGCCGMGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGGTTGGGCGGTGGACGGTATGGACGTCTGGGGCCGAGGGACCTTGGTCACCGTC3’HC1-VH-F-BstEIIGAGACGGTGACCAAGGTCCCTCGGCCCCAGACGTCCATACC

[00674] Estes conjuntos de primers são transpostos sobre a seqüência de VH inteira. Dentro deste conjunto, os primers foram misturados em quantidades iguais (por exemplo, 1 μl de cada primer [estoques de primer de 20 a 100 μM] a 20 μl de reação de PCR) e adicionados a uma mistura de PCR que consiste no tampão de PCR, nos nucleotídeos e na polimerase de Taq. Esta mistura foi incubada a 94°C por três minutos, a 65°C por um minuto, a 62°C por um minuto, a 59°C por um minuto, a 56°C por um minuto, a 52°C por um minuto, a 50°C por um minuto e a 72°C por dez minutos em um ciclador de PCR. O produto foi executado subseqüentemente em um uma eletroforese em gel deagarose e o produto com um tamanho de 200 a 400 foi isolado dogel de acordo com métodos padrão.

[00675] O produto resultante da PCR de VH foi então utilizado como um molde para uma reação de PCR padrão utilizando os primers que incorporam os sítios de restrição de clonagem apropriados de N-terminal e de C-terminal (primer 5'HC1-VH-A-XhoI e primer 3'HC1-VH-F-BstEII). O fragmento do DNA do tamanho correto (para uma VH com aproximadamente 350 nucleotídeos) foi isolado pela eletroforese em gel de agarose de acordo com métodos padrão. Dessa maneira, o fragmento do DNA de VH suficiente foi amplificado.

[00676] Os seguintes oligonucleotídeosdegenerados, que se sobrepõem mutuamente em uma extensão de terminal de aproximadamente 15-20 nucleotídeos e em que cada segundo primer era um primer anti-sentido, foram utilizadospara prover um contexto da seqüência de VL humana para CDRL1(SEQ ID 1657), CDRL2 (SEQ ID 1658) e CDRL3 (SEQ ID 1659), que são anexados a CDRH1 (SEQ ID 1652), a CDRH2 (SEQ ID 1653) e a CDRH3 (SEQ ID HC1 1654): 5’HC1-Vl-A-SacIACTAGCGAGCTCGWGCTGACACAGCCACCCTCG5’HC1-Vl-BGCTGACACAGCCACCCTCGGYGTCAGKGACCCCAGGACAGASGGYCASGATCTCCTGCTCTGGAGATGCATTGCCAAAGCAATATGC 3’HC1-Vl-CCCCTGAGGGCCTCTCATTATCTTTATATATCASCAACWYAGGGGCCKKGCC TGGCWKCTGCTGATACCAGTAAGCATATTGCTTTGGCAATGC 5’HC1-Vl-DGATAATGAGAGGCCCTCAGGGRTCCCTGASCGATTCTCTGGCTCCARGTCA GGGACATCAGYCTCGTTGRCCATCAGTGGASTCMRGKCAGAAGACGAGGCTGACTA 3’HC1-Vl-E-BsiWI/SpeIGCTACTACTAGTCGTACGTAGGACGGTCAGCTGGGTCCCTCCGCCGAACAC CCAGGAAGAACCACTGCTGTCTGCTGATTGACAGTAATAGTCAGCCTCGTCTTCTG

[00677] Este conjunto de primers é transposto sobre a seqüência de VL correspondente inteira. Dentro deste conjunto, os primers foram misturados em quantidades iguais (por exemplo, 1 μl de cada primer [estoques de primer de 20 a 100 μM] a 20 μl de reação de PCR) e adicionados a uma mistura de PCR que consiste no tampão de PCR, nos nucleotídeos e na polimerase de Taq. Esta mistura foi incubada a 94°C por três minutos, a 65°C por um minuto, a 62°C por um minuto, a 59°C por um minuto, a 56°C por um minuto, a 52°C por um minuto, a 50°C por um minuto e a 72°C por dez minutos em um ciclador de PCR. O produto foi executado subseqüentemente em um umaeletroforese em gel de agarose e o produto com um tamanho de200 a 400 foi isolado do gel de acordo com métodos padrão.

[00678] O produto da PCR resultante de VL foi então utilizado como um molde para uma reação de PCR padrão utilizando os primers que incorporam os sítios de restrição de clonagem apropriados de N-terminal e de C-terminal (primer 5'HC1-Vl-A-SacI e primer 3'HC1-Vl-E-BsiWI/SpeI). O fragmento do DNA do tamanho correto (para uma VL com aproximadamente 330 nucleotídeos) foi isolado pela eletroforese em gel de agarose de acordo com métodos padrão. Dessa maneira, o fragmento de DNA de VL suficiente foi amplificado.

[00679] O produto final da PCR de VH (isto é, o repertório de VH humano/humanizado) foi então combinado com seu produto final da PCR de VL respectivo (isto é, o repertório de VL humano/humanizado) no vetor de exposição de fago pComb3H5Bhis para formar uma biblioteca de fragmentos do anticorpo funcional de scFv a partir da qual - após a exposição no fago filamentoso - os aglutinantes anti-HBS foram selecionados, examinados, identificados e confirmados tal como descrito, tal como segue:

[00680] 450 ng dos fragmentos de cadeia leve(digeridos com Sacl-Spel) foram ligados com 1400 ng do fagomídeo pComb3H5Bhis (digerido com Sacl-Spel; fragmento grande). A biblioteca do anticorpo combinatória resultante foi então transformada em 300 μl de células de Escherichia coli XL1 Blue eletrocompetentes por eletroporação (2,5 kV, cubeta com abertura de 0,2 cm, 25 uFD, 200 Ohm, pulsador de genes da Biorad), tendo por resultado uma biblioteca com um tamanho demais de 107 clones independentes. Após uma hora da expressãodo fenótipo, os transformantes positivos foram selecionados para a resistência à carbenicilina codificada pelo vetor de pComb3H5BHis em 100 ml da cultura de supercaldo de carne líquido (SB) até a manhã seguinte. As células foram então colhidas por centrifugação e a preparação do plasmídeo foi realizada utilizando um kit de preparação de plasmídeo comercialmente disponível (Qiagen).

[00681] 2800 ng deste DNA de plasmídeo contendo abiblioteca de VL (digerida com Xhol-BstEII; fragmento grande) foram ligados com 900 ng dos fragmentos de V de cadeia pesada (digeridos com Xhol-BstEII) e transformados outra vez em duas alíquotas de 300 μl de células de E. coli XL1 Blue eletrocompetentes por eletroporação (2,5 kV, cubeta com abertura de 0,2 cm, 25 uFD, 200 Ohm), tendo por resultado um tamanho total da biblioteca de scFv de VH-VL (fragmento variável de cadeia simples) de mais do que 107 clones independentes.

[00682] Após a expressão do fenótipo e lenta adaptação à carbenicilina, as células de E. coli que contêm a biblioteca do anticorpo foram transferidas ao meio de seleção de SB-Carbenicilina (50 μg/ml). As células de E. coli que contêm a biblioteca do anticorpo foram então infectadas com uma dose infecciosa de 1012 partículas do fago assistente VCSM13, tendo por resultado a produção e a secreção do fago filamentoso de M13, em que a partícula do fago contém um DNA de pComb3H5BHis de cordão simples que codifica um fragmento do anticorpo de scFv e que exibiu o fragmento correspondente do anticorpo de scFv como uma fusão translacional à proteína de cobertura do fago III. Este agrupamento de fagos que exibem a biblioteca do anticorpo foi utilizado para a seleção de entidades de ligação do antígeno.

[00683] Para esta finalidade, a biblioteca de fago que carrega o repertório clonado de fragmentos do anticorpo de scFv foi colhida do sobrenadante respectivo da cultura pela precipitação de PEG8000/NaCl e centrifugação. Aproximadamente 1011 a 1012 partículas do fago que exibem o fragmento do anticorpo de scFv foram ressuspensas em 0,4 ml de PBS/0,1% de BSA e foram incubadas com 105 a 107 células de CHO transfectadas com o antígeno E2 de HCV dos genótipos 1a e/ou 1b de HCV tal como descrito no Exemplo 40.1 por uma hora em gelo sob agitação lenta. Estas células de CHO transfectadas com o antígeno de HCV foram colhidas de antemão por centrifugação, lavadas em PBS e ressuspensas em PBS/1% de FCS (contendo azeto de sódio). As partículas do fago que exibem os fragmentos do anticorpo de scFv, que não se ligam especificamente às células de CHO transfectadas com o antígeno de HCV, foram eliminadas por até cinco etapas de lavagem com PBS/1% de FCS (contendo azeto desódio). Após a lavagem, as entidades de ligação foram eluídas das células ao ressuspender as células em HCl-glicina ao pH 2,2 (uma incubação de dez minutos com turbilhonamento subseqüente) e após a neutralização com 2M de Tris ao pH 12, o eluato foi utilizado para a infecção de uma cultura de E. coli XL1 Blue fresca não-infectada (OD600 > 0,5). A cultura de E. coli que contém as células de E. coli transduzidas com sucesso com uma cópia do fagomídeo, que codifica um fragmento do anticorpo de scFv humano/humanizado, foi selecionada outra vez para a resistência à carbenicilina e infectada subseqüentemente com o fago assistente de VCMS 13 para iniciar a segunda rodada de exposição do anticorpo e seleção in vitro. Um total de quatro a cinco rodadas de seleções é normalmente realizado.

[00684] A fim de selecionar os aglutinantes específicos do antígeno de HCV, o DNA do plasmídeo que corresponde a quatro e cinco rodadas de lavagem em bateia foi isolado das culturas de E. coli após a seleção. Para a produção do fragmento do anticorpo de scFv solúvel heterólogo, os fragmentos do DNA de VH-VL foram removidos dos plasmídeos (XhoI-Spel). Estes fragmentos foram clonados através dos mesmos sítios de restrição no plasmídeo pComb3H5BFlag/His quedifere do pComb3H5BHis original pelo fato de que o construtode expressão (por exemplo, o fragmento do anticorpo de scFv) inclui um Flag-Tag (DYKDDDDK) entre o fragmento do anticorpo de scFv e o tag de His6 e as proteínas do fago adicionais foram suprimidas. Após a ligação, cada agrupamento (rodadas diferentes de lavagem em bateia) do DNA do plasmídeo foi transformado em 100 μl de E. coli TG1 ou XLl Blue competente por choque térmico e chapeado em LB-ágar de carbenicilina. As colônias únicas foram escolhidas em 100 μl de LB carb (50 μg/ml).

[00685] E. coli transformado com o pComb3H5BHis que contém um segmento de VH e de VL produz o fragmento do anticorpo de scFv solúvel heterólogo em quantidades suficientes após a excisão do fragmento do gene III e a indução com 1 mM de IPTG. Devido a uma seqüência de sinal apropriada, o fragmento do anticorpo de scFv foi exportado no periplasma onde se desdobra em uma conformação funcional.

[00686] As colônias bacterianas de E. coli TG1 únicas das placas de transformação foram escolhidas para preparados periplasmáticos de pequena escala e cresceram no meio de SB (por exemplo, 10 ml) suplementadas com 20 mM de MgCl2 e 50μg/ml de carbenicilina (e foram redissolvidas em PBS (por exemplo, 1 ml) após a colheita. Por quatro rodadas de congelamento a -70°C e de descongelamento a 37°C, a membrana externa das bactérias foi destruída por choque de temperatura e as proteínas periplasmáticas solúveis heterólogas incluindo os fragmentos do anticorpo de scFv são liberadas no sobrenadante. Após a eliminação das células intactas e dos fragmentos de células por centrifugação, o sobrenadante contendo os fragmentos do anticorpo de scFv anti-HCV foi coletado e utilizado para a identificação de aglutinantes específicos do antígeno de HCV tal como segue:

[00687] A ligação dos fragmentos do anticorpo de scFv a HCV é testada pela citometria de fluxo nas células de CHO transfectadas com o antígeno de HCV (vide o Exemplo 40.1); as células de CHO não-transfectadas foram utilizados como o controle negativo.

[00688] Para a citometria de fluxo, 2,5x105 células foram incubadas com 50 μl do fragmento do anticorpo de scFv do preparado periplasmático com 5 μg/ml de fragmentos do anticorpo de scFv purificados em 50 μl de PBS com 2% de FCS. A ligação do fragmento do anticorpo de scFv foi detectada com o anticorpo anti-His (Penta-His Antibody, livre de BSA, Qiagen GmbH, Hilden, FRG) em 2 μg/ml em 50 μl de PBS com 2% de FCS. Como um reagente da segunda etapa, um fragmento de F(ab’)2 purificado por afinidade conjugado à ficoeritrina, IgG anti-camundongo de cabra (específico do fragmento de Fc-gama), diluído 1:100 em 50 μl de PBS com 2% de FCS (Dianova, Hamburgo, FRG) foi utilizado. As amostras foram medidas em um FACSscan (BD Biosciences, Heidelberg, FRG).

[00689] Clones simples foram então analisados quanto às propriedades favoráveis e à seqüência de aminoácido. Os fragmentos específicos do anticorpo de scFv de HCV foram convertidos em fragmentos do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecíficos recombinantes ao uní-los através de um aglutinante de Gly4Ser1 com o fragmento específico do anticorpo de scFv CD3 I2C (SEQ ID 185) ou qualquer outro fragmento do anticorpo específico de scFv de CD3 da invenção para resultar nos construtos com o arranjo de domínio de VHMuc1 - (Gly4Ser1)3 -VLMuc1- Gly4Ser1-VHCD3 - (Gly4Ser1)3 - VLCD3 ou arranjos de domínio alternativos. Para a expressão em células de CHO, as seqüências de codificação (i) de um líder de cadeia pesada de imunoglobulina de N-terminal que compreende um códon inicial incorporado dentro de uma seqüência de consenso de Kozak e (ii) um tag de His6 de C-terminal seguido por um códon de interrupção foram ambos unidos enquadrado à seqüência de nucleotídeo que codifica os fragmentos do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecíficos antes da inserção do fragmento de DNA resultante, tal como obtido pela síntese de genes no sítio de clonagem múltiplo do vetor de expressão de pEF-DHFR (Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). A transfecção estável das células de CHO deficientes em DHFR, a seleção para transfectantes DHFR positivos que secretam os fragmentos do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecíficos ao sobrenadante da cultura e a amplificação de genes da cultura com metotrexato para níveis crescentes de expressão foram realizados tal como descrito (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 92 (1995) 7021-7025). Todos os procedimentos restantes da técnica foram realizados de acordo com protocolos padrão (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)).

[00690] A identificação de fragmentos do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecíficos funcionais foi realizada pela análise citométrica de fluxo do sobrenadante da cultura de células de CHO transfectadas. Para esta finalidade, a ligação de CD3 foi testada na linhagem de células de leucemia das células T positivas de CD3 HPB-ALL (DSMZ, Bransvique, ACC483) e na linhagem de células T 4119LnPx de símio. A ligação a HCV foi testada nas células de CHO transfectadas com o antígeno de HCV (vide o Exemplo 40.1). 200.000 células da linhagem de células respectiva foram incubadas por trinta minutos em gelo com 50 μl do sobrenadante da cultura de células. As células foram lavadas duas vezes em PBS com 2% de FCS e o fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico ligado foi detectado com um anticorpo anti-His murino (Penta His Antibody; Qiagen; diluído 1:20 em 50 μl de PBS com 2% de FCS). Após a lavagem, os anticorpos anti-His ligados foram detectados com um anticorpo específico de Fc- gama (Dianova) conjugado à ficoeritrina, diluído 1:100 em PBS com 2% de FCS. O sobrenadante das células de CHO não- transfectadas foi utilizado como o controle negativo.

[00691] A citometria de fluxo foi executada em um aparelho FACS-Calibur; o software CellQuest foi utilizado para obter e analisar os dados (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg). O tingimento e a medição de FACS da intensidade de fluorescência foram executados tal como descrito em Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach e Strober, Wiley-Interscience, 2002).

[00692] Somente os construtos que mostram ligação biespecífica a CD3 de humano e de símio, bem como ao antígeno de HCV, foram selecionados para uso adicional.

[00693] Para a produção da proteína, as células de CHO que expressam o fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico inteiramente funcional adaptadas ao meio de soja líquido de HyQ PF CHO livre de nucleosídeo (com4,0 mM de L-glutamina com 0,1% de Pluronic F-68; HyClone) cresceram em frascos de rolo com meio de soja líquido de HyQPF CHO livre de nucleosídeo (com 4,0 mM de L-glutamina com 0,1% de Pluronic F-68; HyClone) por sete dias. O sobrenadante da cultura foi removido das células por centrifugação e armazenado a -20°C até a purificação. Como equipamento de cromatografia para a purificação do fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico da cultura do sobrenadante, Akta® Explorer System (GE Health Systems) e Unicorn® Software foram utilizados. A cromatografia de afinidade com metal imobilizado ("IMAC") foi executada utilizando um Fractogel EMD chelate® (Merck) que foi carregado com ZnCl2 de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. A coluna foi equilibrada com o tampão A (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1M de NaCl) e o sobrenadante da cultura de células (500 ml) foi aplicado à coluna (10 ml) a uma vazão de 3 ml/min. A coluna foi lavada com o tampão A para remover a amostra não-ligada. A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de duas etapas do tampão B (20 mM de tampão de fosfato de sódio ao pH 7,2, 0,1M de NaCl, 0,5 M de imidazol) de acordo com o seguinte:Etapa 1: 20% do tampão B em 6 volumes da colunaEtapa 2: 100% do tampão B em 6 volumes da coluna

[00694] As frações da proteína eluída a partir da etapa 2 foram agrupadas para uma purificação adicional. Todos os produtos químicos são do tipo para pesquisa e foram adquiridos junto à Sigma (Deisenhofen) ou junto à Merck (Darmstadt).

[00695] A cromatografia de filtração em gel foi executada em uma coluna do tipo preparatória HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE/Amersham) equilibrada com o Equi-buffer (25 mM de citrato, 200 mM de lisina, 5% de glicerol, pH 7,2). As amostras da proteína eluída (vazão de 1 ml/min) foram submetidas à SDS-PAGE padrão e à transferência Western para a detecção. Antes da purificação, a coluna foi calibrada para a determinação do peso molecular (kit marcador do peso molecular, Sigma MW GF-200). As concentrações da proteína foram determinadas utilizando OD280 nm.

[00696] O fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico purificado foi analisado pela SDS-PAGE sob condições reduzidas executadas com 4-12% de géis de Bis Tris pré-fundidos (Invitrogen). A preparação e a aplicação da amostra foram executadas de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. O peso molecular foi determinado com MultiMark protein standard (Invitrogen). O gel foi tingido com Coomassie coloidal (protocolo da Invitrogen). A pureza da proteína isolada é > 95%, tal como determinado pela SDS-PAGE.

[00697] O fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico tem um peso molecular de aproximadamente 52 kDa, sob condições nativas, tal como determinado pela filtração em gel em PBS. Todos os construtos foram purificados de acordo com este método.

[00698] A transferência Western foi executada utilizando uma membrana Optitran® BA-S83 e Invitrogen BlotModule de acordo com o protocolo provido pelo fabricante. Paraa detecção dos fragmentos do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecíficos, o anticorpo anti-His Tag foi utilizado (Penta His, Qiagen). Um anticorpo de Ig anti-camundongo de cabra etiquetado com fosfatase alcalina (AP) (Sigma) foi utilizado como o anticorpo secundário e BCIP/NBT (Sigma) como o substrato. Uma faixa única foi detectada em 52 kD, que corresponde ao fragmento do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecífico purificado.

[00699] A potência no sistema de humano e de primata não-chimpanzé dos fragmentos do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecíficos que interagem com o CD3 de humano e de símio e com o antígeno de HCV foi determinada por um ensaio de citotoxicidade com base na liberação do cromo 51 (51Cr) utilizando as células de CHO transfectadas com o antígeno de HCV como as células alvo (vide o Exemplo 40.1) e as PBMCs esgotadas de CD4/CD56 humanas estimuladas ou a linhagem de células T de 4119LnPx de símio como as células efetoras.

[00700] A geração de PBMCs humanas estimuladas foi executada tal como segue:Uma placa de Petri (85 mm de diâmetro, Nunc) foi revestida com um anticorpo anti-CD3 específico comercialmentedisponível (por exemplo, OKT3, Othoclone) a uma concentração final de 1 μg/ml por uma hora a 37°C. A proteína não-ligadafoi removida por uma etapa de lavagem com PBS. As PBMCs frescas foram isoladas do sangue periférico (30-50 ml de sangue humano) pela centrifugação do gradiente de Ficoll de acordo com protocolos padrão. 3-5 x 107 PBMCs foram adicionadas à placa de Petri pré-revestida em 50 ml de RPMI 1640 com glutamina estabilizada/10% de FCS/20 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron) e foram estimuladas por dois dias. No terceiro dia, as célulasforam coletadas e lavadas uma vez com RPMI 1640. A IL-2 foi adicionada a uma concentração final de 20 U/ml e as célulasforam cultivadas outra vez por um dia no mesmo meio de cultura de células que aquele acima.

[00701] As células alvo foram lavadas duas vezes com PBS e etiquetadas com 11,1 MBq de 51Cr a um volume finalde 100 μl de RPMI com 50% de FCS por 45 minutos a 37°C. Ascélulas alvo etiquetadas foram lavadas subseqüentemente três vezes com 5 ml de RPMI e então utilizadas no ensaio de citotoxicidade. O ensaio foi executado em uma placa de 96 cavidades a um volume total de 250 μl de RPMI suplementado (tal como acima) com uma relação de E:T de 10:1,1 μg/ml dos fragmentos do anticorpo de cadeia simples em tandem biespecíficos específicos de espécies cruzadas e vinte diluições de três vezes dos mesmos foram aplicadas. O tempo do ensaio era de dezoito horas e a citotoxicidade foi medida como os valores relativos do cromo liberado no sobrenadante relacionados à diferença da lise máxima (adição de Triton-X) e da lise espontânea (sem as células efetoras). Todas as medições foram feitas em quadruplicatas. A medição da atividade do cromo nos sobrenadantes foi executada com Wizard 3” Gamacounter (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Koln, Alemanha). A análise dos dados experimentais foi executada com Prism 4 for Windows (versão 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, Califórnia, EUA). As curvas de resposta de dose sigmoidais têmtipicamente os valores de R2 > 0,90, tal como determinado pelosoftware. Os valores EC50 como a medida da potência foram calculados pelo programa de análise.

Claims (16)

1. POLIPEPTÍDEO, caracterizado por compreender um domínio de ligação que é um anticorpo capaz de se ligar a um epítopo de seres humanos e Callithrix jacchus, Saguinus oedipus e Saimiri sciureus de cadeia de CD3S, em que o epítopo faz parte de uma sequência de aminoácido compreendida no grupo que consiste de SEQ ID No. 2, 4, 6 ou 8 e que compreende a sequência de aminoácido Gln-Asp-Gly-Asn-Glu,em que o polipeptídeo adicionalmente compreende um segundo domínio de ligação que é capaz de se ligar a um antígeno da superfície da célula.em que o polipeptídeo consiste em combinações CDRs VH e VL, como indicado a seguir:CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, como representado nas SEQ ID NOs: 30 a 32, e CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, como representado nas SEQ ID NOs: 27 a 29 (molécula de ligação H2C);CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, como representado nas SEQ ID NOs: 12 a 14, e CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, como representado nas SEQ ID NOs: 27 a 29 (molécula de ligação F6A);CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, como representado nas SEQ ID NOs: 48 a 50, e CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, como representado nas SEQ ID NOs: 27 a 29 (molécula de ligação H1E);CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, como representado nas SEQ ID NOs: 66 a 68, e CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, como representado nas SEQ ID NOs: 27 a 29 (molécula de ligação G4H);CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, como representado nas SEQ ID NOs: 102 a 104, e CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, como representado nas SEQ ID NOs: 27 a 29 (molécula de ligação E1L);CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, como representado nas SEQ ID NOs: 138 a 140, e CDR-L1, como representado nas SEQ ID NOs: 27 a 29 (molécula de ligação F7O);CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, como representado nas SEQ ID NOs: 120 a 122, e CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, como representado nas SEQ ID NOs: 117 a 119 (molécula de ligação E2M);CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, como representado nas SEQ ID NOs: 84 a 86, e CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, como representado nas SEQ ID NOs: 117 a 119 (molécula de ligação A2J);CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, como representado nas SEQ ID NOs: 156 a 158, e CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, como representado nas SEQ ID NOs: 153 a 155 (molécula de ligação F12Q); eCDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, como representado nas SEQ ID NOs: 174 a 176, e CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, como representado nas SEQ ID NOs: 153 a 155 (molécula de ligação I2C).

2. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo primeiro domínio de ligação compreender adicionalmente uma região VL selecionada do grupo que consiste de uma região VL, tal como indicado na SEQ ID No. 35; 39; 125; 129; 161 ou 165.

3. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo primeiro domínio de ligação compreender adicionalmente uma região VH selecionada do grupo que consiste em uma região VH, tal como indicado em SEQ ID No. 15; 19; 33; 37; 51; 55; 69; 73; 87; 91; 105; 109; 123; 127; 141; 145; 159; 163; 177 ou 181.

4. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo primeiro domínio de ligação compreender adicionalmente uma região VL e uma região VH selecionadas do grupo que consiste de: (a) uma região VL, tal como indicado na SEQ ID No. ou 21 e uma região VH, tal como indicado na SEQ ID No. 15 19;(b) uma região VL, tal como indicada na SEQ ID NO. ou 39 e uma região VH, tal como indicada na SEQ ID No. 33 37;(c) uma região VL, tal como indicada na SEQ ID No. ou 57 e uma região VH, tal como indicada na SEQ ID No. 51 55;(d) uma região VL, tal como indicada na SEQ ID No. ou 75 e uma região VH, tal como indicada na SEQ ID No. 69 73;(e) uma região VL, tal como indicada na SEQ ID No. ou 93 e uma região VH, tal como indicada na SEQ ID No. 87 91;(f) uma região VL, tal como indicada na SEQ ID No. ou 111 e uma região VH, tal como indicada na SEQ ID No. ou 109;(g) uma região VL, tal como indicada na SEQ ID No. ou 129 e uma região VH, tal como indicada na SEQ ID No. ou 127;(h) uma região VL, tal como indicada na SEQ ID No. ou 147 e uma região VH, tal como indicada na SEQ ID No. ou 145;(i) uma região VL, tal como indicada na SEQ ID No. ou 165 e uma região VH, tal como indicada na SEQ ID No. ou 163; e(j) uma região VL, tal como indicada na SEQ ID No. ou 183 e uma região VH, tal como indicada na SEQ ID No.ou 181.

5. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo primeiro domínio de ligação ainda compreender uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID No. 23; 25; 41; 43; 59; 61; 77; 79; 95; 97; 113; 115; 131; 133; 149; 151; 167; 169; 185 ou 187.

6. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo antígeno da superfície da célula ser um antígeno de tumor.

7. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo dito polipeptídeo ser uma molécula de anticorpo de cadeia simples biespecífica.

8. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela molécula de anticorpo de cadeia simples biespecífica compreender um grupo das seguintes sequências como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 e CDR L3 no segundo domínio de ligação selecionado do grupo que consiste em:SEQ ID Nos. 189-194, SEQ ID Nos. 201-206, SEQ ID Nos. 219-224, SEQ ID Nos. 237-242, SEQ ID Nos. 255-260, SEQ ID Nos. 273-279, SEQ ID Nos. 382-384 e 387-389, SEQ ID Nos. 400402 e 405-407, SEQ ID Nos. 418-420 e 423-425, SEQ ID Nos. 436438 e 441-443, SEQ ID Nos. 454-456 e 459-461, SEQ ID Nos. 472474 e 477-479, SEQ ID Nos. 490-492 e 495-497, SEQ ID Nos. 508510 e 513-515,SEQ ID Nos. 530-532 e 1568 a 1570, SEQ ID Nos. 545547 e 550-552, SEQ ID Nos. 559-561 e 564-566,SEQ ID Nos. 577-579 e 582-584,SEQ ID Nos. 615-617 e 620-622, SEQ ID Nos. 633-635, 638, 639 e 1571, SEQ ID Nos. 650-652 e 655-657, SEQ ID Nos. 668-670 e 673-675, SEQ ID Nos. 682-684 e 687-689, SEQ ID Nos. 696-698 e 701-703, SEQ ID Nos. 710-712 e 715-717, SEQ ID Nos. 724-726 e 729-731, SEQ ID Nos. 738-740 e 743-745, SEQ ID Nos. 752-754 e 757-759, SEQ ID Nos. 766- 768 e 771-773, SEQ ID Nos. 780-782 e 785-787, SEQ ID Nos. 794-796 e 799-801, SEQ ID Nos. 808-810 e 813-815, SEQ ID Nos. 822-824 e 827-829, SEQ ID Nos. 836-838 e 841-843, SEQ ID Nos. 850-852 e 855-857,SEQ ID Nos. 866-868 e 871-873, SEQ ID Nos. 884-886 e 889-891, SEQ ID Nos. 902-904 e 907-909, SEQ ID Nos. 920-922 e 925-927, SEQ ID Nos. 938-940 e 943-945, SEQ ID Nos. 956-958 e 961-963, SEQ ID Nos. 974-976 e 979-981, SEQ ID Nos. 992-994 e 997-999, SEQ ID Nos. 1006-1008 e 1011-1013, SEQ ID Nos. 10201022 e 1025-1027, SEQ ID Nos. 1034-1036 e 1039-1041, SEQ ID Nos. 1048-1050 e 1053-1055, SEQ ID Nos. 1062-1064 e 1067-1069, SEQ ID Nos. 1076-1078 e 1081-1083, SEQ ID Nos. 1090-1092 e 1095-1097,SEQ ID Nos. 1114-1116 e 1119-1121, SEQ ID Nos. 11281130 e 1133-1135, SEQ ID Nos. 1141-1143 e 1146-1148, SEQ ID Nos. 1155-1157 e 1160-1162, SEQ ID Nos. 1169-1171 e 1174-1176, SEQ ID Nos. 1183-1185 e 1188-1190, SEQ ID Nos. 1197-1199 e 1202-1204, SEQ ID Nos. 1211-1213 e 1216-1218, SEQ ID Nos. 12251227 e 1230-1232, SEQ ID Nos. 1239-1241 e 1244-1246, SEQ ID Nos. 1253-1255 e 1258-1260, SEQ ID Nos. 1267-1269 e 1272-1274, SEQ ID Nos. 1281-1283 e 1286-1288, SEQ ID Nos. 1295-1297 e 1300-1302, SEQ ID Nos. 1309-1311 e 1314-1316, SEQ ID Nos. 13231325 e 1328-1330,SEQ ID Nos. 1343-1345 e 1348-1350, SEQ ID Nos. 13611363 e 1366-1368, SEQ ID Nos. 1375-1377 e 1380-1382, SEQ ID Nos. 1389- 1391 e 1394-1396, SEQ ID Nos. 1403-1405 e 14081410, SEQ ID Nos. 1417-1419 e 1422-1424, SEQ ID Nos. 1431-1433 e 1436-1438, SEQ ID Nos. 1445-1447 e 1450-1452, SEQ ID Nos. 1459-1461 e 1464-1466, SEQ ID Nos. 1473-1475 e 1478-1480, SEQ ID Nos. 1486-1491, SEQ ID Nos. 1492-1497,SEQ ID Nos. 1505-1507 e 1510-1512, SEQ ID Nos. 15311533 e 1536-1538,SEQ ID Nos. 1573-1575 e 1578-1580, ID SEQ Nos. 15911593 e 1596-1598, SEQ ID Nos. 1605-1607 e 1610-1612, SEQ ID Nos. 1619-1621 e 1624-1626, SEQ ID Nos. 1634-1636 e 1639-1641,SEQ ID Nos. 1652-1654 e SEQ ID Nos. 1657-1659 e SEQ ID Nos. 1669-1674.

9. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pela molécula de anticorpo de cadeia simples biespecífica compreender uma sequência selecionada de:(a) uma sequência de aminoácido, tal como indicadoem qualquer uma das SEQ ID Nos . 291, 293, 295, 297, 299, 301,303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325,327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 393,395, 397, 411, 413, 415, 429, 431, 433, 447, 449, 451, 465,467, 469, 483, 485, 487, 501, 503, 505, 519, 521, 523, 1336,1338, 1340, 538, 540, 542, 556 , 570, 572, 574, 588, 590, 592,626, 628, 630, 643, 645, 647, 661, 663, 665, 679, 693, 707,721, 735, 749, 763, 777, 791, 805, 819, 833, 847, 861, 863,877, 879, 881, 895, 897, 899, 913, 915, 917, 931, 933, 935,949, 951, 953, 967, 969, 971, 985, 987, 989, 1003, 1017, 1031,1045, 1059, 1073, 1087, 1101, 1125, 1138, 1152, 1166, 1180,1194, 1208, 1222, 1236, 1250, 1264, 1278, 1292, 1306, 1320,1334, 1354, 1356, 1358, 1372, 1386, 1400, 1414, 1428, 1442,1456, 1470, 1484, 1500, 1502, 1518, 1520, 1522, 1524, 1526,1528, 1544, 1546, 1548, 1550, 1552, 1554, 1556, 1558, 1560,1562, 1564, 1566, 1586, 1588, 1602, 1616, 1630, 1647, 1649 ou1663; e (b) uma sequência de aminoácido codificada por uma sequência de ácido nucléico, tal como indicado em qualquer umadas SEQ ID Nos . 292 , 294 . 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308,310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332,334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 394, 396, 398, 412,414, 416, 430, 432, 434, 448, 450, 452, 466, 468, 470, 484,486, 488, 502, 504, 506, 520, 522, 524, 1337, 1339, 1341, 539,541, 543, 557, 571, 573, 575, 589, 591, 593; 627, 629, 631,644, 646, 648, 662, 664, 666, 680; 694, 708, 722, 736, 750,764, 778, 792, 806, 820, 834, 848, 862, 864, 878, 880, 882,896, 898, 900, 914, 916, 918, 932, 934, 936, 950, 952, 954,968, 970, 972, 986, 988, 990, 1004, 1018 , 1032, 1 046, 1060,1074, 1088, 1102, 1126, 1139, 1153, 1167, 1181, 1195, 1209,1223, 1237, 1251, 1265, 1279, 1293, 1307, 1321, 1335, 1355,1357, 1359, 1373, 1387, 1401, 1415, 1429, 1443, 1457, 1471,1485, 1501, 1503, 1519, 1521, 1523, 1525, 1527, 1529, 1545,1547, 1549, 1551, 1553, 1555, 1557, 1559, 1561, 1563, 1565,1567, 1587, 1589, 1603, 1617, 1631, 1648, 1650 ou 1664.

10. SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLÉICO, caracterizada porcodificar um polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 2 a 5, compreendendoum ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em um ácido nucleico tal como indicado na SEQ ID NO: 36, 40,126, 130, 162 ou 166;um ácido nucleico tal como indicado na SEQ ID NO:16, 20, 34, 38, 52, 56, 70, 74, 88, 92, 106, 110, 124, 128,142, 146, 160, 164, 178 ou 182;um ácido nucleico selecionado do grupo que consisteem(a) um ácido nucleico tal como indicado na SEQ ID NO: 18 ou 22e 16 ou 20; (b) um ácido nucleico tal como indicado na SEQ ID NO: 36 ou 40e 34 ou 38;(c) um ácido nucleico tal como indicado na SEQ ID NO: 54 ou 58e 52 ou 56;(d) um ácido nucleico tal como indicado na SEQ ID NO: 72 ou 76e 70 ou 74;(e) um ácido nucleico tal como indicado na SEQ ID NO: 90 ou 94e 88 ou 92;(f) um ácido nucleico tal como indicado na SEQ ID NO: 108 ou112 e 106 ou 110;(g) um ácido nucleico tal como indicado na SEQ ID NO: 126 ou130 e 124 ou 128;(h) um ácido nucleico tal como indicado na SEQ ID NO: 144 ou148 e 142 ou 146;(i) um ácido nucleico tal como indicado na SEQ ID NO: 162 ou166 e 160 ou 164; e(j) um ácido nucleico tal como indicado na SEQ ID NO: 180 ou184 e 178 ou 182;um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em um ácido nucleico tal como indicado na SEQ ID NO: 24, 26,42, 44, 60, 62, 78, 80, 96, 98, 114, 116, 132, 134, 150, 152,168, 170, 186 ou 188.

11. VETOR, caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucléico, conforme definido na reivindicação 10.

12. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado por compreender o cultivo de um hospedeiro, sob condições que permitem a expressão do dito polipeptídeo, e a recuperação do polipeptídeos produzido da cultura.

13. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, ou produzida de acordo com o processo, conforme definido na reivindicação 12.

14. POLIPEPTÍDEO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de l a 9, ou produzida de acordo com o processo, conforme definido na reivindicação 12, caracterizado por ser para o uso na prevenção, tratamento ou melhora de uma doença selecionada entre uma doença proliferativa, uma doença de tumor ou um distúrbio imunológico.

15. KIT, caracterizado por compreender um polipeptídeo, tal como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, uma molécula de ácido nucléico, conforme definido na reivindicação 10, um vetor, conforme definido na reivindicação 11.

16. USO DE UM FRAGMENTO N-TERMINAL DO DOMÍNIO EXTRACELULAR DE CD3ε DE MÁXIMO DE 27 AMINOÁCIDOS, caracterizado por compreender a sequência de aminoácido Gln- Asp-Gly-Asn- Glu-Glu-Met-Gly ou Gln-Asp-Gly-Asn-Glu-Glu-Ile-Gly para a geração de um polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 1.