BRPI0808416A2 - Determinação quantitativa de risedronato na urina por spe-lc-ms-ms - Google Patents
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Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE RISEDRONATO NA URINA POR SPE-LCMS-MS".
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a um método de SPE-LC-MS-MS para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina. Antecedentes da Invenção
Bisfosfonatos inibem a reabsorção óssea e são tratamentos eficazes para doenças ósseas metabólicas incluindo osteoporose e doença de Paget (I. Elomaa, C. Blomqvist, L. Porkka, T.Holmstrom, T.Taube, C.Lamberg-Allardt1 G.H. Borgstrom. Lancet 1985; i: 1155; J.P. Kosonen, J. Pharm Biomed Anal. 1992; 10:881; J.A. Cantril, H.M. Buckler1 D.C. Anderson, Ann. RheumatoL Dis. 1986; 45:1012; H.FIeisch, Horm. Metab. Res. 1997; 29:145). A prevenção de reabsorção óssea resulta dos efeitos inibitórios na função de osteoclastos maduros. Vários métodos bioanalíticos foram publicados para bisfosfonatos. Em geral, esses métodos são principalmente com base em cromatografia de par de íon e troca iônica com UV1 fluorescência (com uma derivatização de pré- ou pós-coluna), condutividade, fósforo fotométrico seletivo, índice refrativo e detecção de dispersão de Iuz explorativa (V. Virtanen, L.H.J. Lajunen, J. Chromatogr. 1993; 617:291; V. Virtanem, L.H.J. Lajunen, Talanta 1993; 40: 661; S.E. Meek1 D.J. Pietrzyk Anal. Chem. 1988; 60:1397; M.J. Lovdahl, D.J. Pietrzyk, J. Chromatogr. A 1999; 850:143; R. Niemi1 H. Taipale1 M. Ahlmark1 J. Vepsalainen1 T. Jarvinen1 J. Chromatogr. B 1997; 701:97; T.L. Chester1 Anal. Chem. 1980; 52:1621).
A técnica de GC-MS1 combinada com acilação e sililação, foi usada para determinar Risedronato na Urina humana (D.Y. Mitchell1 R.A. Eusebio, L.E. Dunlap, K.A. Pallone, J.D. Nesbitt, D.A. Russell, M.E. Clay, P.J. Bekker, Pharm. Res. 1998; 15:228). O método mais sensível para análise de Risedronato na Urina humana foi obtido usando ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) (D.Y. Mitchell1 M.A. Heise1 K.A. Pallone, J.D. Nesbilt, M.E. Clay, J.D. Nesbitt, D.A. Russell, C.W. Melson, J. Clin. Pharmacol. 1999; 48:536). A HPLC de par de íon de mudança de coluna com detecção de UV foi também relatada quantificar o Risedronato na urina humana (P.T. Vallano1 SB. Shugars1 W.F. Kline1 E.J. Woolf1 B.K. Matuszewski1 J. Chromatogr. B 1003; 794:23). Embora alguns destes métodos mostrem uma sensibilidade muito alta, eles são todos muito complicados e demorados.
Recentemente, mais esforço foi proposto no desenvolvimento de
método de LC/MS/MS para risedronato com pós-extração ou na derivatização de cartucho (L.S. Zhu, V.N. Lapko, J.W. Lee, Y.J. Basir1 C. Kafonek, R. Olsen, C. Briscoe, Rapid commun. Mass Spectrom. 2006, 20: 3421; S.Turcotte, J. Couture, F. Vallee, AAPS PharmSci Vol. 5, n° 4, Abstract M1357 (2003).
Sumário da Invenção
A presente invenção é direcionada a um método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina compreendendo:
a) adicionar um padrão interno à amostra de urina;
b) aplicar a amostra de urina a um cartucho Oasis HLB, em que
o cartucho foi pré-condicionado com metanol;
c) lavar o cartucho com cerca de TEA a 1 % (v/v) em água e cerca de ácido fórmico a 1% (v/v) em metanol;
d) eluir risedronato, pelo menos uma vez, com uma mistura de cerca de 60% (v/v) de metanol e cerca de 40% (v/v) de água contendo cerca
de 3 mM de EDTA sob vácuo;
e) evaporar a solução eluída e reconstituir com uma mistura de 10% (v/v) de metanol e 90% (v/v) de 0,05 M de tampão de NH4Ac-NhUOH para fornecer uma mistura de amostra de risedronato e o padrão interno; e
f) analisar a mistura de amostra com um sistema de LC-MS/MS.
O método de SPE-LC-MS-MS anteriormente mencionado para determinação quantitativa de risedronato em uma amostra de urina é relativamente simples, sensível, preciso e exato, e mais completamente discutido com a ajuda das seguintes figuras e descrição detalhada abaixo.
Breve Descrição dos Desenhos
FIGURA 1 é o Espectro de ESI-MS de Risedronato.
FIGURA 2 é o Espectro de ESI-MS de Desóxi-risedronato. FIGURA 3 é o Cromatograma de Risedronato na Urina de Camundongo (LLOQ 10 ng/mL), em que a intensidade do pico na retenção de 2,27 minutos é mais do que três vezes a intensidade do mesmo pico no Espectro de HPLC da Amostra Nula de Urina de Camundongo. Isto significa que a concentração de risedronato em 10 ng/mL na urina de camundongo pode ser quantificada.
FIGURA 4 é o Cromatograma de Urina de Controle de Camundongo.
FIGURA 5 é o Cromatograma Típico de Risedronato e DesóxiRisedro nato.
FIGURA 6 é a Curva de Calibração Típica de Risedronato na Urina de Camundongo.
Descrição Detalhada da Invenção Definições e Abreviações
Como utilizado acima, e ao longo da descrição da invenção, as seguintes abreviações, a menos que de outra maneira indicado, serão entendidas ter os seguintes significados:
amu - unidade de massa atômica Cps - Contagem por segundo CV% - Coeficiente percentual de variação Diff% - Diferença percentual entre concentração teórica e concentração medida
EDTA - Ácido etilenodiaminatetraacético ESI - lonização de Spray Elétrica HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Pressão LC-MS - Cromatografia Líquida de Alta Pressão - Espectrometria de massa
LLOQ - Limite inferior de quantidade
MRM - Monitoramento de reação múltiplo
MS - Espectrometria de massa
m/z - Massa/carga
NH4Ac - Acetato de amônio NH4OH - Hidróxido de amônio SD - Desvio-padrão SPE - Extração de fase sólida TEA -TrietiIamina v/v - Volume/volume
Como usado acima, e em toda a descrição da invenção, os seguintes termos, a menos que de outra maneira indicado, serão entendidos ter os seguintes significados.
"Desóxi-Risedronato" significa ácido (1-fosfono-2-piridin-3-il-etil)fosfônico, tendo a seguinte estrutura química :
"Coluna Inertsil 3-Fenil para HPLC" é fabricada e vendida por
Varian, Inc.,
"Padrão interno" é uma substância química que é adicionada em uma quantidade constante em amostras, padrões de calibração e nulos em 15 uma análise. Esta substância química é usada para calibração plotando-se a relação do sinal de analito para o sinal-padrão interno como uma função da concentração de analito dos padrões. Isto é feito para medir e corrigir a perda de analito durante a preparação de amostra ou entrada de amostra. Particularmente, o padrão interno é um composto que tem similar, porém não a 20 mesma, estrutura química do analito.
"Cartucho Oasis HLB" é fabricado e vendido por Waters Corporation. O tamanho do cartucho é dependente da concentração de risedronato na amostra de urina. Quanto mais baixa a concentração de risedronato da amostra de urina, maior o tamanho do cartucho, e maior o volume da amos25 tra de urina e a solução para lavar o cartucho e risedronato eluído deve ser usada.
"Risedronato" significa ácido (1-hidróxi-1-fosfono-2-piridin-3-iletil)-fosfônico, tendo a seguinte estrutura química: "Amostra de urina" significa amostra de urina de mamífero, incluindo amostra de urina humana.
Modalidade Particular da Invenção
Uma modalidade particular da invenção é o método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina, em que a amostra de urina é uma amostra de urina de camundongo ou rato.
Outra modalidade particular da invenção é o método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina, em que o padrão interno é desóxi-risedronato.
Outra modalidade particular da invenção é o método para quanti
tativamente determinar risedronato em uma amostra de urina, em que o cartucho Oasis HLB é um cartucho Oasis HLB de 30 mg.
Outra modalidade particular da invenção é o método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina, em que o padrão interno é desóxi-risedronato que é adicionado como uma solução em água; mais particularmente como uma solução de cerca de 10 μg/mL em água.
Outra modalidade particular da invenção é o método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina, em que a quantidade da amostra de urina é de cerca de 0,4 mL.
Outra modalidade particular da invenção é o método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina, em que o cartucho foi pré-condicionado com cerca de 1 mL de metanol.
Outra modalidade particular da invenção é o método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina, em que o cartucho foi pré-condicionado com cerca de 1 mL de metanol e seguido por cerca de 0,5 mL de TEA a 1 % (v/v) em água.
Outra modalidade particular da invenção é o método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina, em que o cartucho é lavado com cerca de 0,5 mL de cerca de TEA a 1 % (v/v) em água e cerca de 0,5 mL de cerca de ácido fórmico a 1% (v/v) em metanol.
Outra modalidade particular da invenção é o método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina, em que a quantidade da mistura de cerca de 60% (v/v) de metanol e cerca de 40% (v/v) de água, contendo cerca de 3 mM de EDTA, é de cerca de 1,5 mL.
Outra modalidade particular da invenção é o método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina, em que risedronato é duas vezes eluído com cerca de 0,75 mL da mistura de cerca de 60% (v/v) de metanol e cerca de 40% (v/v) de água contendo cerca de 3 mM de EDTA.
Outra modalidade particular da invenção é o método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina, em que a quantidade da mistura de 10% (v/v) de metanol e 90% (v/v) de 0,05 M de tampão de NH4Ac-NH4OH é cerca de 100 μί.
Outra modalidade particular da invenção é o método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina, em que o padrão interno é desóxi-risedronato, e analisando a mistura de amostra com 20 um sistema de LC-MS/MS compreende separar risedronato e desóxirisedronato por HPLC em uma coluna Inertsil 3-Fenil para HPLC por eluição de gradiente com uma mistura de solução A e solução B, em que a quantidade da solução A é aumentada a partir de cerca de 10% (v/v) para cerca de 95% (v/v), e em que a solução A é cerca de 90% (v/v) de metanol em água, 25 e solução B é cerca de 10 mM de tampão de ácido acético-acetato de amônio com trietilamina a 2% (v/v).
Outra modalidade particular da invenção é o método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina de camundongo ou rato, compreendendo:
a) adicionar cerca de 100 μί de cerca de 10 μg/mL de solução
de desóxi-risedronato em água a cerca de 0,4 mL da amostra de urina de camundongo ou rato; b) aplicar a amostra de urina de camundongo ou rato a um cartucho Oasis HLB de 30 mg, em que o cartucho foi pré-condicionado com cerca de 1 mL de metanol e seguido por cerca de 0,5 mL de TEA a 1% (v/v) em água;
c) lavar o cartucho com cerca de 0,5 mL de TEA a 1 % (v/v) em
água e cerca de 0,5 mL de ácido fórmico a 1% (v/v) em metanol;
d) eluir risedronato com cerca de 1,5 mL de uma mistura de cerca de 60% (v/v) de metanol e cerca de 40% (v/v) de água contendo cerca de 3 mM de EDTA sob vácuo;
e) evaporar a solução eluída e reconstituir com cerca de 100 μί
de uma mistura de cerca de 10% (v/v) de metanol e cerca de 90% (v/v) de cerca de 0,05 M de tampão de NH4Ac-NH4OH para fornecer uma mistura de amostra de risedronato e desóxi-risedronato; e
f) analisar a mistura de amostra com um sistema de LC-MS/MS, 15 em que risedronato e desóxi-risedronato são separados por HPLC em uma coluna Inertsil 3-Fenil para HPLC por eluição de gradiente com uma mistura da solução A e solução B, em que a quantidade da solução A é aumentada de cerca de 10% (v/v) para cerca de 95% (v/v), e em que a solução A é cerca de 90% (v/v) de metanol em água, e solução B é cerca de 10 mM de 20 tampão de ácido acético-acetato de amônio com trietilamina a 2% (v/v).
Outra modalidade particular da invenção é o método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina de camundongo ou rato, compreendendo:
a) adicionar cerca de 100 μΐ de cerca de 10 μg/mL de solução de desóxi-risedronato em água a cerca de 0,4 mL da amostra de urina de
camundongo ou rato;
b) aplicar a amostra de urina de camundongo ou rato a um cartucho Oasis HLB de 30 mg, em que o cartucho foi pré-condicionado com cerca de 1 mL de metanol e seguido por cerca de 0,5 mL de TEA a 1% (v/v)
em água;
c) lavar o cartucho com cerca de 0,5 mL de TEA a 1% (v/v) em água e cerca de 0,5 mL de ácido fórmico a 1% (v/v) em metanol; d) eluir risedronato duas vezes com cerca de 0,75 mL de uma mistura de cerca de 60% (v/v) de metanol e cerca de 40% (v/v) de água contendo cerca de 3 mM de EDTA sob vácuo;
e) evaporar a solução eluída e reconstituir com cerca de 100 μ L de uma mistura de cerca de 10% (v/v) de metanol e cerca de 90% (v/v) cerca de 0,05 M de tampão de NH4Ac-NH4OH para fornecer uma mistura de amostra de risedronato e desóxi-risedronato; e
f) analisar a mistura de amostra com um sistema de LC-MS/MS, em que risedronato e desóxi-risedronato são separados por HPLC em uma
coluna Inertsil 3-Fenil para HPLC por eluição de gradiente com uma mistura de solução A e solução B, em que a quantidade da solução A é aumentada de cerca de 10% (v/v) a cerca de 95% (v/v), e em que a solução A é cerca de 90% (v/v) de metanol em água, e solução B é cerca de 10 mM de tampão de ácido acético-acetato de amônio com trietilamina a 2% (v/v).
Deve ser entendido que esta invenção abrange todas as combi
nações apropriadas das modalidades particulares referidas a esta.
A presente invenção aparecerá mais claramente a partir do seguinte exemplo que é apresentado apenas como uma ilustração e não deve ser considerado como Iimitante da invenção em seu escopo.
Exemplo
Etapa 1: Preparação de Padrões de Urina de Risedronato na Urina de Camundongo ou Rato
Uma solução de matéria-prima de 1 mg/mL de risedronato é preparada dissolvendo-se risedronato em água em grau de HPCL. 250 μg/mL, 25 100 μς/ιηί e 50 μg/mL de soluções-padrão de risedronato são preparados diluindo-se 250 μΐ, 100 μί e 50 μί da solução de matéria-prima de risedronato de 1 mg/mL em 1 mL com água de grau de HPLC, respectivamente. Diluições apropriadas de 250 μg/mL, 100 μg/mL e 50 μg/mL de soluçõespadrão de risedronato são realizadas para produzir soluções de funciona30 mento de risedronato de 25 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 2,5 μg/mL e 1 μg/mL. Padrões de urina de risedronato, variando de 10 ng/mL a 2500 ng/mL, são preparadas adicionando-se 4 μί de cada solução de funcionamento em 0,4 mL de urina de controle de camundongo ou rato (isto é, urina de camundongo ou rato que não é dosada com risedronato).
Etapa 2: Preparação de Amostra
Uma amostra de urina de 0,4 mL coletada a partir de camun5 dongo ou rato que foi dosada com risedronato é transferida em um tubo de cultura de vidro de 10 x 75 mm. 100 μί de solução-padrão interna de matéria-prima, isto é, 10 μg/mL de solução de desóxi-risedronato em água, e 100 μί de TEA a 5% em água são adicionados a todos os padrões de urina de risedronato e à amostra de urina, respectivamente.
Extração de amostra é realizada com um cartucho Oasis HLB de
30 mg (1 mL, fabricado e vendido por Waters Corporation, Catalog No.: WAT094225). Os cartuchos são condicionados com 1 mL de metanol e seguidos por 0,5 mL de TEA a 1% em água. A amostra de urina é aplicada ao cartucho. O cartucho é lavado com 0,5 mL de TEA a 1% em água e 0,5 mL 15 de 1% de ácido fórmico em metanol, e em seguida o analito e o padrão interno são eluídos usando duas etapas de eluição consecutivas com 0,75 mL de uma mistura de 60% de metanol em água contendo 3 mM de EDTA. Durante a extração de amostras, um vácuo (0,35 - 1,05 Kg/cm2) (5-15 Psi) é usado a cada etapa para puxar o líquido pelos cartuchos. A solução eluída é 20 secada sob nitrogênio a 37 0C durante 70 minutos e em seguida o resíduo é reconstituído em 100 μί de 10% de metanol / 90% de 0,05 M de tampão de NH4Ac-NH4OH (pH 9,26).
Etapa 3: Análise de LC-MS/MS
A análise de Risedronato é realizada usando sistema de LCMS/MS API 4000 (vendido por MDS Sciex), incluindo uma bomba Shimadzu LC-10AD, controlador de sistema SCL-10A VP, autoamostrador Leap Technologies HTS PAL e espectrômetro de massa quadripolar triplo API 4000.
Risedronato e o padrão interno são separados em uma coluna Inertsil 3-Fenil para HPLC (3 μί, 50 x 030 mm, fabricada e vendida por Varian, Inc., Catalog N0: 0408 - 050 x 030) por eluição de gradiente com uma mistura da solução A e solução B em 6 minutos, em que a quantidade da solução A é aumentada a partir de 10% a 95%. A solução A é 90% de metanol em água, e a solução B é 10 mM de tampão de ácido acético-acetato de amônio (pH=5,0) com 2% de trietilamina. A taxa de fluxo é mantida constante em 0,2 mL/min. A amostra (10 μΙ_ reconstituída) é injetada sobre a coluna de HPLC diretamente. O espectrômetro de massa é programado para moni5 torar a transição m/z 281,9-»63,1 para risedronato sob modo negativo com uma energia de colisão de -58 volts. O m/z 265,8-^79,2 é usado para medir o padrão interno de desóxi-Risedronato. A temperatura de fonte é mantida a 350°C. Um tempo de ciclo analítico de 6 minutos é empregado.
Resultados Linearidade
O ensaio para o padrão de urina de rato ou camundongo de risedronato é linear a partir de 10 a 2500 ng/mL com um LLOQ de 10 ng/mL. A precisão determinada em LLOQ é 14,8% com uma precisão de 17,8% (n=3). Parâmetros de regressão obtidos durante a validação são relatados 15 na tabela 1. Coeficientes de correlação de 0,98 ou maior para risedronato são obtidos a partir da análise dia a dia. Uma curva de calibração típica é representada na figura 6.
Tabela 1. Parâmetros de regressão para risedronato na Urina de camundon£0__
Curva No/Data Parâmetros de regressão Declive (respos¬ Interceptação Coeficiente de ta/concentração) (resposta à Correlação concentração 0) No dia N0 1 0,000260 0,00208 0,9993 N0 2 0,000257 0,00151 0,9961 N0 3 0,000232 0,00300 0,9895 Média 0,000250 0,00220 0,9950 SD 0,000015 CV% 6,2 Dia a Dia Dia 1 0,000267 0,00331 0,997 Dia 2 0,000229 0,000594 0,9974 Dia 3 0,000260 0,00208 0,9993 Média 0,000252 0,00199 0,9979 SD 0,000020 CV% 8,0 Especificidade
Um pico pequeno, no tempo de retenção de 2,27, é encontrado na urina de controle de camundongo, porém a altura do pico de LLOQ (10 ng/mL) é mais de três vezes a intensidade do pico na urina de controle de camundongo (veja FIGURA 3 e FIGURA 4). Desse modo, concentração de risedronato a 10 ng/mL pode ser quantificada.
Precisão
Precisão é expressa como o coeficiente percentual de variação das concentrações medidas em cada nível de controle durante a duração do 10 estudo. O coeficiente no dia da variação para os controles na urina de camundongo variou de 2,2 a 9,6%. A precisão do dia a dia para os controles em 3 níveis de concentração variou de 5,2 a 10,3%. As precisões no dia e dia a dia para os padrões variaram de 0,3 a 26%.
Exatidão
A exatidão do ensaio é expressa como a diferença percentual
entre a concentração de controle de qualidade determinada média e o valor teórico.
A exatidão do ensaio no dia para os controles de urina de camundongo variou de -5,3 a 4,4%. A exatidão do dia a dia é determinada du20 rante três dias de análise usando os controles em 3 níveis de concentração. A exatidão do dia a dia variou de -4,0 a 6,0%. A precisão das concentrações calculadas novamente dos padrões de urina de camundongo está dentro de ±15%.
Tabela 2. A exatidão e a precisão de padrões de calibração de risedronato de urina de camundongo
Replicação Concentração nominal (ng/mL) 10 25 50 100 250 500 1000 2500 No dia N0 1 7,93 20,7 49,4 100 237 422 995 2460 N0 2 13,3 22 42,8 91,6 238 388 868 2470 N0 3 9,94 25,4 50,6 97 253 476 976 2500 Média 10,39 22,7 47,6 96,2 243 429 946 2477 SD 2,71 2,43 4,20 4,26 8,96 44,38 68,50 20,82 CV% 26,1 10,7 8,8 4,4 3,7 10,4 7,2 0,8 Dif% 3,9 -9,2 -4,8 -3,8 -2,9 -14,3 -5,4 -0,9 Dia a dia Dia 1 13,8 24,7 46,9 93,5 237 532 1120 2610 Dia 2 10,7 21,5 50,6 107 248 501 1010 2640 Dia 3 9,94 25,4 50,6 97 253 476 976 2500 Média 11,48 23,9 49,4 99,2 246 503 1035 2583 SD 2,04 2,08 2,14 7,01 8,19 28,05 75,27 73,71 CV% 17,8 8,7 4,3 7,1 3,3 5,6 7,3 2,9 Dif% 14,8 -4,5 -1,3 -0,8 -1,6 0,6 3,5 3,3 Tabela 3. A exatidão e a precisão de controles de qualidade de risedronato de urina de camundongo_
Data Concentração nominal (ng/mL) 25 250 2500 Dia 1 28,2 257 2900 30 290 2580 26,1 236 2870 Dia 2 28,9 226 2650 Data Concentração nominal (ng/mL) 25 250 2500 27,2 208 2800 25,5 238 2470 Dia 3 27,1 244 2650 24,1 246 2670 24,4 231 2520 23,8 204 2600 20,6 259 2610 No dia (Dia 3) Média 24,0 237 2610 SD 2,31 20,8 57,9 CV% 9,6 8,8 2,2 Dif% -4 -5,28 4,4 Dia a Dia Média 26,0 240 2665 SD 2,69 24,1 138 CV% 10,3 10,1 5,2 Dif% 4,0 -4,0 6,6 Recuperação
Uma recuperação de risedronato na urina de camundongo extraída quando comparada à urina de camundongo extraída nula com líquido reforçado está em torno de 51,3%
Tabela 4. Recuperação de risedronato a partir de amostras de urina de camundongo (250 ng/mL) __
Replicação Amostra de Urina (á- Amostra Nula de Urina rea de pico) Extraída + área de pico de líquido reforçado N0 1 12400 30400 N0 2 18000 28800 N0 3 16600 29800 N0 4 18100 36000 N0 5 14500 30300 Média 15920 31060 SD 2447 2833 CV% 15,4 9,1 Recuperação (%) 51,3 A presente invenção pode ser expressa em outras formas específicas sem afastar-se do espírito ou atributos essenciais da mesma.
Claims (16)
1. Método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina compreendendo: a) adicionar uma solução de padrão interno à amostra de urina; b) aplicar a amostra de urina a um cartucho Oasis HLB, em que o cartucho foi pré-condicionado com metanol; c) lavar o cartucho com cerca de TEA a 1 % (v/v) em água e cerca de ácido fórmico a 1% (v/v) em metanol; d) eluir risedronato, pelo menos uma vez, com uma mistura de cerca de 60% (v/v) de metanol e cerca de 40% (v/v) de água contendo cerca de 3 mM de EDTA sob vácuo; e) evaporar a solução eluída e reconstituir com uma mistura de10% (v/v) de metanol e 90% (v/v) de 0,05 M de tampão de NH4Ac-NH4OH para fornecer uma mistura de amostra de risedronato e o padrão interno; e f) analisar a mistura de amostra com um sistema de LC-MS/MS.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a amostra de urina é uma amostra de urina de camundongo ou rato.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o padrão interno é desóxi-risedronato.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o padrão interno é desóxi-risedronato que é adicionado como uma solução em água.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o padrão interno é desóxi-risedronato que é adicionado como uma solução de cerca de 10 μg/mL em água.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o cartucho Oasis HLB é um cartucho Oasis HLB de 30 mg.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a quantidade da amostra de urina é cerca de 0,4 mL.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o cartucho foi pré-condicionado com cerca de 1 mL de metanol.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o cartucho foi pré-condicionado com cerca de 1 mL de metanol e seguido por cerca de .0,5 mL de TEA a 1% (v/v) em água.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o cartucho é lavado com cerca de 0,5 mL de cerca de TEA a 1% (v/v) em água e cerca de 0,5 mL de cerca de ácido fórmico a 1% (v/v) em metanol.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a quantidade da mistura de cerca de 60% (v/v) de metanol e cerca de 40% (v/v) de água contendo cerca de 3 mM de EDTA é cerca de 1,5 mL.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que risedronato é eluído duas vezes com cerca de 0,75 mL da mistura de cerca de 60% (v/v) de metanol e cerca de 40% (v/v) de água contendo cerca de 3 mM de EDTA.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a quantidade da mistura de 10% (v/v) de metanol e 90% (v/v) de 0,05 M de tampão de NH4Ac-NH4OH é cerca de 100 μί.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o padrão interno é desóxi-risedronato, e analisar a mistura de amostra com um sistema de LC-MS/MS compreende separar risedronato e desóxi-risedronato por HPLC em uma coluna Inertsil 3-Fenil para HPLC por eluição de gradiente com uma mistura da solução A e da solução B, em que a quantidade da solução A é aumentada de cerca de 10% (v/v) para cerca de 95% (v/v), e em que a solução A é cerca de 90% (v/v) de metanol em água, e a solução B é cerca de 10 mM de tampão de ácido acético-acetato de amônio com trietilamina a 2% (v/v).
15. Método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina de camundongo ou rato, compreendendo: a) adicionar cerca de 100 μί de cerca de 10 μg/mL de solução de desóxi-risedronato em água a cerca de 0,4 mL da amostra de urina de camundongo ou rato; b) aplicar a amostra de urina de camundongo ou rato a um cartucho Oasis HLB de 30 mg, em que o cartucho foi pré-condicionado com cerca de 1 mL de metanol e seguido por cerca de 0,5 mL de TEA a 1% (v/v) em água; c) lavar o cartucho com cerca de 0,5 mL de TEA a 1 % (v/v) em água e cerca de 0,5 mL de ácido fórmico a 1% (v/v) em metanol; d) eluir risedronato com cerca de 1,5 mL de uma mistura de cerca de 60% (v/v) de metanol e cerca de 40% (v/v) de água contendo cerca de 3 mM de EDTA; e) evaporar a solução eluída e reconstituir com cerca de 100 μί de uma mistura de cerca de 10% (v/v) de metanol e cerca de 90% (v/v) de cerca de 0,05 M de tampão de NH4Ac-NH4OH para fornecer uma mistura de amostra de risedronato e desóxi-risedronato; e f) analisar a mistura de amostra com um sistema de LC-MS/MS, em que risedronato e desóxi-risedronato são separados por HPLC em uma coluna de Inertsil 3-Fenil para HPLC por eluição de gradiente com uma mistura da solução A e da solução B, em que a quantidade da solução A é aumentada de cerca de 10% (v/v) para cerca de 95% (v/v), e em que a solução A é cerca de 90% (v/v) de metanol em água, e a solução B é cerca de 10 mM de tampão de ácido acético-acetato de amônio com trietilamina a 2% (v/v).
16. Método para quantitativamente determinar risedronato em uma amostra de urina de camundongo ou rato, compreendendo: a) adicionar cerca de 100 μί de cerca de 10 μg/mL de solução de desóxi-risedronato em água a cerca de 0,4 mL da amostra de urina de camundongo ou rato; b) aplicar a amostra de urina de camundongo ou rato a um cartucho Oasis HLB de 30 mg, em que o cartucho foi pré-condicionado com cerca de 1 mL de metanol e seguido por cerca de 0,5 mL de TEA a 1% (v/v) em água; c) lavar o cartucho com cerca de 0,5 mL de TEA a 1% (v/v) em água e cerca de 0,5 mL de ácido fórmico a 1% (v/v) em metanol; d) eluir risedronato duas vezes com cerca de 0,75 mL de uma mistura de cerca de 60% (v/v) de metanol e cerca de 40% (v/v) de água contendo cerca de 3 mM de EDTA; e) evaporar a solução eluída e reconstituir com cerca de 100 μί de uma mistura de cerca de 10% (v/v) de metanol e cerca de 90% (v/v) de cerca de 0,05 M de tampão de NH4Ac-NH4OH para fornecer uma mistura de amostra de risedronato e desóxi-risedronato; e f) analisar a mistura de amostra com um sistema de LC-MS/MS, em que risedronato e desóxi-risedronato são separados por HPLC em uma coluna Inertsil 3-Fenil para HPLC por eluição de gradiente com uma mistura da solução A e da solução B, em que a quantidade da solução A é aumentada de cerca de 10% (v/v) para cerca de 95% (v/v), e em que a solução A é cerca de 90% (v/v) metanol em água, e a solução B é cerca de 10 mM de tampão de ácido acético-acetato de amônio com trietilamina a 2% (v/v).
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