BRPI0808035B1 - uso de inibidores da degradação de p27 para o tratamento de câncer - Google Patents

Abstract

USO DE INIBIDORES DA DEGRADAÇÃO DE p27, EM PARTICULAR ARGIRINA E DERIVADOS DA MESMA, PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS PROLIFERATIVAS. A presente invenção se refere ao uso de macrociclos particulares que são inibidores da degradação proteassômica de p27, em particular Argirina e derivados da mesma, de preferência Argirina A, para o tratamento de doenças proliferativas, tal como câncer, bem como a derivatização dos referidos macrociclos.

Description

[0001] A presente invenção refere-se ao uso de macrociclos particulares que são inibidores da degradação proteassômica de p27, em particular Argirina e derivados da mesma, de preferência Argirina A, para o tratamento de doenças proliferativas, tal como câncer, bem como a derivatização dos referidos macrociclos.

[0002] Transições entre fases do ciclo celular são catalisadas por uma família de quinases ciclina-dependentes (Cdks) (Nurse, 1990; Hartwell, 1991). Em alguns organismos, os sinais fisiológicos que controlam a transição de G2 para M direcionam uma série de etapas que ativam a Cdk mitótica, Cdc2. Ativação de Cdc2 é positivamente regulada através de fosforilação sobre a treonina-161 (Booher e Beach, 1986; Krek e Nigg, 1991; Gould e outros, 1991; Solomon e outros, 1990; 1992) e negativamente através de fosforilação sobre a tirosina-15 (Gould e Nurse, 1989). Replicação incompleta de DNA retarda a desfosforilação de tyr-15 (Dasso e Newport, 1990; Smythe e Newport, 1992) e mutações na Cdc2 que convertem tyr-15 em um resíduo não-fosforilável são letais e causam uma mitose prematura (Gould e Nurse, 1989). Similarmente, superexpressão da fosfatase de tyr-15, Cdc25 (Enoch e Nurse, 1990; Kumagai e Dunphy, 1991) ou perda das quinases de tyr-15 (Ludgren e outros, 1991) supera o requisito de que a replicação de DNA seja terminada antes que mitose comece. Níveis adicionais de controle são provavelmente requeridos para explicar completamente o bloqueio de mitose causado pela replicação de DNA em andamento (Sorger e Murray, 1992; Heald e outros, 1993; Stueland e outros, 1993). Há também evidência de que a interrupção do ciclo celular induzida por dano ao DNA possa estar relacionada à inativação de Cdc2 (Rowley e outros, 1992; Walworth eoutros, 1993), mas o papel da fosforilação de tirosina nesse contexto tem sido questionado (Barbet e Carr, 1993).

[0003] Células de mamífero, tal como levedo, requerem quinases ciclina-dependentes para progressão através de G1 e entrada na fase S (D'Urso e outros, 1990; Blow e Nurse, 1990; Furukawa e outros, 1990; Fang e Newport, 1991; Pagano e outros, 1993; Tsai e outros, 1993). Ciclinas do tipo D e E são limitativas para a transição de G1 em S e ambas reduzem, mas não eliminam, o requisito da célula por fatores de crescimento mitogênicos (Ohtsubo e Roberts, 1993; Quelle e outros, 1993).

[0004] Redução nos níveis celulares do inibidor de quinase ciclina p27kip1 é frequentemente encontrada em muitos cânceres humanos e se correlaciona diretamente com o prognóstico do paciente (Philipp- Staheli, J., Payne, S.R. e Kemp, C.J. p27(Kip1): regulation and function of a haplo-insufficient tumour suppressor and its misregulation in cancer. Exp Cell Res 264, 148-68 (2001)). Especificamente, foi mostrado que renovação proteassômica ubiquitina-dependente causa expressão reduzida de p27 em muitos cânceres humanos (Loda, M. e outros, Increased proteasome-dependent degradation of the cyclin dependent kinase inhibitor p27 in aggressive colorectal carcinomas. Nat Med 3, 231-4 (1997)).

[0005] A US 5.688.665 descreve uma proteína tendo um peso molecular aparente de cerca de 27 kD e capaz de ligação a e inibição da ativação de um complexo de ciclina E-Cdk2, designado como p27. Além disso, métodos para determinar se um agente é capaz de inibir ou intensificar especificamente a capacidade da proteína p27 de inibir a ativação do complexo ciclina E-Cdk2 são descritos. Da mesma forma, o US 6.355.774 descreve a proteína p27, bem como um método para produção de p27 em células cultivadas. Ensaios in vitro para descobrir agentes os quais afetam a atividade de p27 tambémsão proporcionados. Além disso, métodos de diagnóstico e tratamento de distúrbios proliferativos são proporcionados.

[0006] Porter e outros (Porter PL, Barlow WE, Yeh IT, Lin MG, Yuan XP, Donato E, Sledge GW, Shapiro CL, Ingle JN, Haskell CM, Albain KS, Roberts JM, Livingston RB, Hayes DF. p27Kip1 and Cyclin E Expression and Breast Cancer Survival After Treatment With Adjuvant Chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 6 de Dezembro de 2006; 98(23): 1723-31) descrevem que a expressão anormal das proteínas regulatórias do ciclo celular p27(Kip1) (p27) pode estar associada à sobrevivência e reincidência de câncer de mama. Menor expressão de p27 estava associada a uma pior sobrevivência global e sobrevivência sem doença do que maior expressão p27. Baixa expressão de p27 parece estar associada a um pobre prognóstico, especialmente entre pacientes com tumores positivos para o receptor de esteróide.

[0007] O WO 02/055665, no Exemplo 8 do mesmo, descreve ensaios que têm sido usados para identificar a interação de Skp2 e p27 in vitro. Os ensaios são descritos como úteis de forma a testar compostos que inibem a proliferação celular. Os ensaios podem ser realizados na presença ou ausência de moléculas, compostos, peptídeos e as referidas moléculas identificadas através dos ensaios são fármacos potencial mente úteis descritos como agentes terapêuticos contra câncer e distúrbios proliferativos. Nenhuma molécula específica conforme identificado é descrita.

[0008] Similarmente, o US 2006-35280 descreve a rápida triagem de grandes bibliotecas de composto usando um ensaio de fluorescência tempo-decomposta homogêneo para a identificação de inibidores de ligação de Cks1-Skp2 que exerce um papel crítico na degradação ubiquitina-dependente de p27.

[0009] Pohl e outros (Pohl G, Rudas M, Dietze O, Lax S, Markis E, Pirker R, Zielinski CO, Hausmaninger H, Kubista E, Samonigg H,Jakesz R, Filipits M. High p27Kip1 expression predicts superior relapse-free and overall survival for premenopausal women with early- stage breast cancer receiving adjuvant treatment with tamoxifen plus goserelin. J Clin Oncol. 1 de Outubro de 2003; 21(19): 3594-600) descrevem que alta expressão de p27Kip1 preveu independentemente sobrevivência sem reincidência e sobrevivência global superiores em pacientes tratados com terapia endócrina combinada. Alta expressão de p27Kip1 pode, assim, ser útil para a seleção de mulheres na pré- menopausa com câncer de mama positivo para o receptor hormonal em estágio precoce para terapia endócrina combinada adjuvante.

[00010] O GB 2.367.553 descreve macrociclos farmaceuticamente ativos e os respectivos preparados farmacêuticos para o tratamento de doenças autoimunes, a indução de imunotolerância ou o tratamento de infecções bacteria nas.

[00011] É um objetivo da presente invenção proporcionar compostos que podem ser usados e estratégias que podem ser buscadas de forma a estabilizar p27, de forma a serem usados como agentes terapêuticos para o tratamento de doenças proliferativas e, em particular, doenças cancerígenas.

[00012] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, esse objetivo é resolvido através do uso de um composto da fórmula geral I:

(fórmula I)em que:R1 e R2, são hidrogênio, C1-C4 alquila a qual é não- substituída ou substituída por OH ou C1-C4 alcóxi;R3 é hidrogênio, Ci-C8 alquila a qual é não-substituída ou substituída por OH ou OR, em que R é selecionado de hidrogênio, Ci- C4 alquila, arila ou acetila,R4 é hidrogênio, halogênio, C1-C4 alquila a qual é não- substituída ou substituída por OH ou C1-C4 alcóxi;R5 é hidrogênio ou halogênio;R6 é hidrogênio ou C1-C4 alquila; eX é C=CH2OU CHR7 em que R7 é C1-C4 alquila a qual é não-substituída ou substituída por -S-C1-C4 alquila e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo,para a produção de um medicamento para o tratamento de câncer em um indivíduo.

[00013] Preferido é um uso de acordo com a presente invenção em que:R1, R2 e R3 são, independentemente, hidrogênio, C1-C4 alquila a qual é não-substituída ou substituída por OH ou C1-C4 alcóxi;R4 é hidrogênio, halogênio, C1-C4 alquila a qual é não- substituída ou substituída por OH ou C1-C4 alcóxi;R5 é hidrogênio ou halogênio;R6 é hidrogênio ou C1-C4 alquila; eX é C=CH2OU CHR7 em que R7 é C1-C4 alquila a qual é não-substituída ou substituída por -S-C1-C4 alquila e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo,para a produção de um medicamento para o tratamento de câncer em um indivíduo.

[00014] Deve ser entendido que os compostos definidos acimapodem trazer substituintes dentro de sua estrutura, por exemplo, podem trazer substituintes de porção amino apropriados.

[00015] Grupos e porções alquila nos compostos de fórmula I podem ser de cadeia ramificada ou reta. Grupos alquila são, adequadamente, de cadeia reta.

[00016] Ainda preferido é um uso de acordo com a presente invenção em que:R1 é hidrogênio ou C1-C4 alquila não-substituída, por exemplo, metila;R2 é hidrogênio ou C1-C4 alquila a qual é não-substituída ou substituída por OH, por exemplo, metila ou hidroximetila;R3 é hidrogênio ou C1-C4 alcóxi, por exemplo, metóxi;R4 é hidrogênio ou C1-C4 alquila não-substituída, por exemplo, metila;R5 é hidrogênio ou bromo;R6 é hidrogênio ou metila; eX é C=CH2 OU CHR7 em que R7 é metila a qual é não- substituída ou substituída por -S-etila, e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

[00017] Ainda mais preferido é um uso de acordo com a presente invenção em que:R1 é hidrogênio ou metila;R2 é metila ou hidroximetila;R3 é hidrogênio ou metóxi;R4 é hidrogênio ou metila;R5 é hidrogênio;R6 é metila; eX é C=CH2, e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

[00018] Preferido é um método de acordo com a presente invençãocompreendendo fornecimento de argirina A e sais farmaceuticamente aceitáveis da mesma a um paciente que precisa da mesma. Ainda particularmente preferidas são argirina B:

ou, em particular, argirina F e sais farmaceuticamente aceitáveis das mesmas.

[00019] Para argirinas, as seguintes definições se aplicam (R5 é H eR6 é Me):

Continuação

[00020] Preferido é um método de acordo com a presente invençãoem que o indivíduo é um mamífero, em particular um ser humano.

[00021] Sasse F e outros (em Sasse F, Steinmetz H, Schupp T, Petersen F, Memmert K, Hofmann H, Heusser C, Brinkmann V, von Matt P, Hofle G, Reichenbach H. Argyrins, immunosuppressive cyclic peptides from myxobacteria. I. Production, isolation, physico-chemical e biological properties. J Antibiot (Tóquio). Junho de 2002; 55(6): 543- 51) descrevem a produção de um grupo de peptídeos cíclicosdenominados argirinas, bem como algumas de suas propriedades biológicas. Câncer não é mencionado. Vollbrecht e outros (em Vollbrecht L, Steinmetz H, Hofle G, Oberer, L, Rihs G, Bovermann G e von Matt P. Argyrins, immunosuppressive cyclic peptides from myxobacteria. II. Structure elucidation and stereochemistry. J Antibiot (Tóquio). Agosto de 2002; 55(8): 715-721) descrevem a estrutura dos referidos peptídeos cíclicos.

[00022] Similarmente, Ley e outros (em Ley SV, Priour A, Heusser C. Total synthesis of the cyclic heptapeptide Argyrin B: a new potent inhibitor of T-cell independent antibody formation. Org Lett. 7 de Março de 2002; 4(5): 711-4) descrevem a síntese de argirina B e sua função como inibidor de formação de anticorpo. Câncer também não é mencionado.

[00023] Mais preferido é um método, de acordo com a presente invenção, em que o tratamento dos distúrbios proliferativos e/ou câncer compreende bloqueio de crescimento da célula tumoral e/ou destruição da vasculatura do tumor existente, tratamento de câncer de mama, tratamento de carcinoma hepatocelular, tratamento de carcinoma de cérvix, tratamento de carcinoma de pulmão, tratamento de mieloma múltiplos e/ou tratamento de câncer de cólon e tratamento de psoríase.

[00024] Outro aspecto da presente invenção, então, se refere ao uso, de acordo com a presente invenção, em que o medicamento ainda compreende ingredientes antitumor farmaceuticamente ativos adicionais, tal como paclitaxel.

[00025] Experimentos preliminares com camundongo, conforme realizado pelos presentes inventores, mostram que a Argirina já é ativa em uma concentração de 0,03 mg/kg de peso corporal. Outro aspecto da presente invenção, assim, se refere ao uso de acordo com a presente invenção, em que o composto tal como, por exemplo,Argirina A ou F, é administrado em uma dose de 0,01 mg a 200 mg/kg, de preferência em uma dose de 0,01 mg a 100 mg/kg, mais preferivelmente em uma dose de 0,02 mg a 10 mg/kg, otimamente fornecida por dia. Outro exemplo é 0,15 mg de Argirina por quilograma de peso corporal injetados intraperitonealmente a cada três dias.

[00026] Em determinadas modalidades da invenção, a administração pode ser projetada de modo a resultar em exposições sequenciais ao composto durante algum período de tempo, por exemplo, horas, dias, semanas, meses ou anos. Isso pode ser obtido através de administrações repetidas do composto, por exemplo, através de um dos métodos descritos acima ou, alternativamente, através de um sistema de distribuição com liberação controlada no qual o composto é distribuído ao indivíduo durante um período prolongado sem administrações repetidas. Por um sistema de distribuição com liberação controlada entenda-se que a liberação total do composto não ocorre imediatamente quando de administração, mas antes é retardada durante algum tempo. Liberação pode ocorrer de uma vez ou pode ocorrer gradual e continuamente. A administração de tal sistema pode ser, por exemplo, através de formas de dosagem oral de longa ação, injeções de bolo, emplastros transdérmicos ou lipossomas, os quais são encapsulados em uma matriz polimérica, os lipossomas sendo sensíveis a um estímulo específico, por exemplo, temperatura, pH, luz, campo magnético ou uma enzima de degradação e sistemas nos quais o composto é encapsulado por uma microcápsula ionicamente revestida com uma enzima de degradação no núcleo da microcápsula. Exemplos de sistemas nos quais liberação do composto é gradual e contínua incluem, por exemplo, sistemas passíveis de erosão nos quais o composto está contido em uma forma dentro de uma matriz e sistemas de difusão nos quais o composto permeia em uma taxa controlada, por exemplo, através de um polímero. Tais sistemas com liberação sustentada podem, por exemplo, estar na forma de péletes ou cápsulas.

[00027] O composto pode ser administrado antes ou subsequentemente ao aparecimento dos sintomas de doença. Em determinadas modalidades, o composto é administrado a pacientes com histórias familiares de doença ou que têm fenótipos que podem indicam uma pré-disposição à doença, por exemplo, câncer de mama ou que tenham sido diagnosticados como tendo um genotipo o qual predispõe o paciente à doença ou que têm outros fatores de risco.

[00028] O composto de acordo com a invenção é administrado ao indivíduo em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Por quantidade terapeuticamente eficaz entenda-se aquela quantidade a qual é capaz de prevenir ou reverter pelo menos parcialmente a doença. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada em uma base individual e será baseada, pelo menos em parte, considerando- se a espécie de indivíduo, o tamanho do indivíduo, a idade do indivíduo, a eficácia do composto usado em particular, a longevidade do composto usado em particular, o tipo de sistema de distribuição usado, o momento de administração com relação ao início de sintomas da doença e se um regime com uma única, múltiplas ou uma dose com liberação controlada é empregado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada por aqueles versados na técnica empregando tais fatores e usando não mais do que experimentação de rotina.

[00029] Em determinadas modalidades preferidas, a concentração do composto é em uma dose de cerca de 0,1 a cerca de 1000 mg/kg de peso corporal/dia, mais preferivelmente em torno de 0,01 mg a 200 mg/kg, de preferência em uma dose de cerca de 0,01 mg a 100 mg/kg, mais preferivelmente em uma dose de 0,02 mg a 10 mg/kg. De preferência, a forma de dosagem é tal que ela não afeta de modoprejudicialmente substancial o indivíduo.

[00030] Compostos da invenção podem também ser administrados sistêmica ou topicamente, através de qualquer via convencional, em particular enteralmente, por exemplo, oralmente, por exemplo, na forma de comprimidos ou cápsulas, parenteralmente, por exemplo, na forma de soluções ou suspensões injetáveis, topicamente, por exemplo, na forma de loções, géis, pomadas ou cremes ou na forma nasal ou um supositório.

[00031] Compostos de fórmula I e derivados dos mesmos podem ser preparados sinteticamente através de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica de química de peptídeo, por exemplo, através de um processo compreendendo formação de anel de um oligopeptídeo adequado ou, alternativamente, podem ser isolados do caldo de cultura de um micro-organismo adequado. Preparo pode incluir uma etapa de modificação adicional, por exemplo, hidratação de uma ligação dupla exocíclica, uma etapa de reação de adição ou uma etapa de halogenação. Um micro-organismo adequado pode ser identificado através de cultura de uma variedade de diferentes microorganismos, por exemplo, selecionados do grupo consistindo em mixobactérias, e seleção dos caldos de cultura resultantes com relação à presença de um composto de fórmula I, em particular um composto de fórmula I em que R1, R2, R3 e R4 são, independentemente, hidrogênio, C1-C4 alquila a qual é não- substituída ou substituída por OH ou C1-C4alcóxi; R5 é hidrogênio; e X é C=CH2.

[00032] Isolamento pode seguir métodos comumente conhecidos por aqueles versados na técnica. Uma abordagem adequada pode, por exemplo, compreender cultura dos micro-organismos na presença de uma fase sólida, por exemplo, uma resina, por exemplo, amberlite, adsorção do composto de fórmula I e eluição do composto de fórmula Ida fase sólida.

[00033] Outro aspecto da presente invenção, então, se refere a um método para seleção de um composto com relação à capacidade de inibir a degradação de p27 compreendendo contato de uma célula com um composto suspeito de inibir a degradação de p27, ensaio dos conteúdos da célula para determinar a quantidade e/ou atividade biológica de p27 e/ou o estado de ciclo celular e comparação da quantidade determinada e/ou atividade biológica de p27 ou o estado de ciclo celular com a quantidade e/ou atividade biológica de p27 e/ou o estado de ciclo celular conforme encontrado sem o composto, em que uma alteração da referida quantidade e/ou atividade biológica de p27 e/ou o estado de ciclo celular é indicativa de um composto que inibe a degradação de p27.

[00034] Métodos de ensaio dos conteúdos da célula que é contatada com o composto a ser selecionado, de forma a determinar a quantidade e/ou atividade biológica de p27 e/ou o estado de ciclo celular são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem Western blots para p27, análise de expressão de p27 (por exemplo, por meio de rtPCR) e análise de uma proteína de fusão tal como, por exemplo, p27-GFP (proteína fluorescente verde), bem como a análise de marcadores de ciclo celular. Preferido é um método de acordo com a presente invenção em que a quantidade de p27-GFP é determinada.

[00035] Preferido é um método de acordo com a presente invenção em que o composto selecionado influencia a degradação proteassômica de p27, conforme determinado, pela quantidade de uma proteína de fusão, tal como p27-GFP.

[00036] Preferido é um método de acordo com a presente invenção em que a célula investigada no ensaio é uma célula ou linhagem de célula tumoral, tal como uma linhagem de célula de câncer de mama,uma linhagem de célula de carcinoma hepatocelular, uma linhagem de célula de carcinoma de cérvix, uma linhagem de célula de carcinoma de pulmão e/ou uma célula de célula de câncer de cólon.

[00037] Mais preferido é um método de acordo com a presente invenção em que o método ainda compreende uma modificação química do composto, conforme identificado. Nesse caso, o composto, conforme selecionado, funcionará como uma assim denominada "estrutura protótipo", a qual é ainda submetida à modificações químicas as quais são, então, selecionadas com relação à sua eficácia para aumentar a quantidade e/ou atividade biológica de p27 em um ou mais métodos de seleção subsequentes, conforme acima.

[00038] Modificação pode ser realizada através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica os quais incluem, sem limitação, a introdução de novas cadeias laterais ou a troca de grupos funcionais tal como, por exemplo, introdução de halogênios, em particular F, Cl ou Br, a introdução de grupos alquila inferior, de preferência tendo um a cinco átomos de carbono tais como, por exemplo, grupos metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, terc-butila, n-pentila ou iso-pentila, grupos alquenila inferior, de preferência tendo dois a cinco átomos de carbono, grupos alquinila inferior, de preferência tendo dois a cinco átomos de carbono ou através da introdução, por exemplo, de um grupo selecionado do grupo consistindo em grupos NH2, NO2, OH, SH, NH, CN, arila, heteroarila, COH ou COOH. Além disso, grupos peptídicos adicionais poderiam ser adicionados à molécula, tais como aminoácidos simples, dipeptídeos, tripeptídeos e assim por diante.

[00039] Se necessário, as etapas de seleção do composto, modificação do composto e medição do efeito dos compostos modificados sobre a proteína podem ser repetidas uma terceira ou qualquer dado número de vezes, conforme requerido. O método descrito acima é também denominado "evolução dirigida", uma vezque ele envolve uma multiplicidade de etapas, incluindo modificação e seleção, pelas quais compostos ativos são selecionados em um processo "evolucionário", otimizando suas capacidades com relação a uma propriedade em particular, isto é, para estabilizar p27.

[00040] Preferido é um método de acordo com a presente invenção em que um composto de acordo com a fórmula I conforme acima, em que R1, R2 e R3 são, independentemente, hidrogênio, C1-C4 alquila a qual é não-substituída ou substituída por OH ou C1-C4 alcóxi; R4 é hidrogênio, halogênio, C1-C4 alquila a qual é não-substituída ou substituída por OH ou C1-C4 alcóxi; R5 é hidrogênio ou halogênio; R6 é hidrogênio ou C1-C4 alquila; e X é C=CH2 ou CHR6 em que R6 é C1-C4 alquila a qual é não-substituída ou substituída por -S-C1-C4 alquila e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, é quimicamente modificado, isto é, usado como uma estrutura protótipo para "evolução dirigida".

[00041] Ainda outro aspecto da presente invenção é dirigido a um método para a produção de uma composição farmacêutica compreendendo (a) seleção de método(s) de acordo com a presente invenção e formulação do composto selecionado com veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Veículos, excipientes e estratégias para formular uma composição farmacêutica, por exemplo, a ser administrada sistêmica ou topicamente, através de qualquer via convencional, em particular enteralmente, por exemplo, oralmente, por exemplo, na forma de comprimidos ou cápsulas, parenteralmente, por exemplo, na forma de soluções ou suspensões injetáveis, topicamente, por exemplo, na forma de loções, géis, pomadas ou cremes ou na forma nasal ou um supositório, são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e descritos na respectiva literatura.

[00042] A administração de um agente, por exemplo, um composto, pode ser realizada através de qualquer método o qual permite que oagente atinja as células-alvo. Esses métodos incluem, por exemplo, injeção, depósito, implante, supositórios, ingestão oral, inalação, administração tópica ou qualquer outro método de administração em que acesso às células-alvo pelo agente é obtido. Injeções podem ser, por exemplo, intravenosa, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal. Implante inclui inserção de sistemas de distribuição de fármaco implantáveis, por exemplo, microesferas, hidrogéis, reservatórios poliméricos, matrizes de colesterol, sistemas poliméricos, por exemplo, sistemas de erosão e/ou difusão de matriz e sistemas não-poliméricos, por exemplo, péletes comprimidas, fundidas ou parcialmente fundidas. Supositórios incluem supositórios de glicerina. Doses para ingestão oral podem ser entericamente revestidas. Inalação inclui administração do agente com um aerossol em um inalador, seja sozinho ou preso a um veículo que pode ser absorvido. O agente pode ser suspenso em líquido, por exemplo, na forma dissolvida ou coloidal. O líquido pode ser um solvente, solvente parcial ou não solvente. Em muitos casos, água ou um líquido orgânico pode ser usado.

[00043] Ainda outro aspecto da presente invenção é dirigido a uma composição farmacêutica que é produzida de acordo com o método conforme acima.

[00044] Outro aspecto da presente invenção se refere a um método de tratamento de câncer em um indivíduo compreendendo administração de uma quantidade eficaz do preparado farmacêutico de acordo com a presente invenção a um indivíduo que precisa do referido tratamento. De preferência, o referido câncer é selecionado de câncer de mama, carcinoma hepatocelular, carcinoma de cérvix, carcinoma de pulmão e câncer de cólon ou distúrbios proliferativos, conforme acima. De preferência, o referido paciente é um ser humano. Tratamento se destina a incluir, por exemplo, prevenção, tratamento,redução dos sintomas de ou cura da doença ou condição.

[00045] A invenção também inclui um método para tratamento de um indivíduo em risco de uma doença conforme acima, em que uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto conforme acima é fornecida. Estar em risco de uma doença pode resultar, por exemplo, de uma história familiar da doença, um genotipo o qual predispõe à doença ou sintomas fenotípicos os quais predispõem à doença.

[00046] Outro aspecto da presente invenção se refere ao uso, conforme acima, em que o medicamento ainda compreende ingredientes farmaceuticamente ativos adicionais que modulam o câncer, tais como câncer de mama, carcinoma hepatocelular, carcinoma de cérvix, carcinoma de pulmão e câncer de cólon ou agentes que modulam outras doenças proliferativas, tais como agentes antipsoríase.

[00047] Os inventores demonstraram que expressão de uma versão estabilizada de p27kip1 (p27kip1T187A) em um camundongo geneticamente modificado reduziu significativamente o número de pólipos adenomatosos, os quais progrediram para carcinomas invasivos (Timmerbeul, I. e outros, Testing the importance of p27 degradation by the SCFskp2 pathway in murine models of lung and cólon cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 14009-14 (2006)). Baseado nesse trabalho, os inventores tentaram identificar compostos os quais levam a uma re-expressão de p27 em tecidos cancerígenos. Nesse trabalho, os inventores identificaram a Argirina A, um composto derivado da mixobactéria archangium gephyra, como um indutor potente de expressão de p27kip1. A Argirina A induziu à apoptose em linhagens de célula de câncer humano e xenoenxertos de tumor in vivo. De modo importante, através de indução de p27kip1, ela também objetiva a vasculatura do tumor existente, o que leva à destruição do tecido tumoral in vivo. As funções da Argirina A são estritamentedependentes da expressão de p27kip1, uma vez que nem células tumorais nem células endoteliais as quais não expressam p27kip1 respem quem a esse composto. Surpreendentemente, o mecanismo molecular pelo qual a Argirina A exerce sua função biológica dependente de p27 é através de uma inibição potente do proteassoma 20S.

[00048] Para identificar substâncias as quais levam a um aumento nos níveis de expressão de p27kip1, os inventores geraram um sistema de ensaio de alto rendimento baseado em célula (vide materiais e métodos para detalhes). Uma das substâncias as quais exerceram o aumento mais forte na fluorescência foi identificada como Argirina A, um peptídeo cíclico o qual tinha sido originalmente identificado como um produto metabólico derivado da mixobactéria archangium gephyra (Sasse, F. e outros, Argyrins, immunosuppressive cyclic peptides from myxobacteria. I. Production, isolation, physicochemical and biological properties. J Antibiot (Tóquio) 55, 543- 51 (2002) figura 5A). Conforme mostrado através de citometria de fluxo, a Argirina A exerceu dois fenótipos celulares diferentes em faixas de IC50. Embora fibroblastos humanos primários, células de carcinoma de cólon A549 (câncer de pulmão) e HCT116 parassem de proliferar, linhagens de célula de carcinoma de cólon SW480, CaCo, bem como células MCF7 (câncer de mama) e HeLa (carcinoma de cérvix) sofreram apoptose, conforme mostrado por um aumento dramático na fração de fase sub G1. A atividade de indução de apoptose da Argirina A foi confirmada através de medição da fragmentação de DNA usando um ELISA de fragmentação de histona (figura 5B).

[00049] O experimento de curso de tempo visualizado na figura 1B mostra que a Argirina A induziu a um aumento nos níveis de p27kip1 celular em carcinoma de cólon SW480 e HCT116 e células HeLA.Para determinar se a alteração induzida por Argirina A nos níveis de expressão de p27kip1 era em virtude de um aumento em sua estabilidade, os inventores mediram a meia-vida de p27kip1 em células HeLa e SW480 na presença e ausência de Argirina A. A figura 1C mostra uma quantificação dos níveis de expressão de p27kip1 comparado com actina em células tratadas com ciclo-heximida, as quais foram incubadas com Argirina A ou deixadas não-tratadas. Tratamento com Argirina A resultou em um bloqueio completo na renovação de p27 nessas células. Uma vez que todos os mecanismos de renovação de p27 conhecidos envolvem destruição proteolítica da proteína pelo proteassoma 20S, os inventores mediram, em seguida, a atividade de proteassomas humanos purificados após incubação com quantidades crescentes de Argirina A. A figura 1D mostra que incubação de proteassoma 20S humano purificado com Argirina A leva a uma inibição dose-dependente das atividades de proteassoma semelhantes à caspase, tripsina e quimiotripsina. De modo importante, a extensão de inibição de proteassoma pela Argirina A era comparável com aquela medida com o inibidor de proteassoma clinicamente usado bortezomib (Velcade) in vitro. Em linha com a capacidade da Argirina A de inibir o proteassoma, os inventores descobriram que outros substratos de proteassoma bem conhecidos, isto é, p53, p21, BAX e NÍKB, também se acumulavam em resposta ao tratamento com Argirina A (figura 1E). Os inventores, portanto, concluíram que a Argirina A previne a degradação de p27 em virtude de sua atividade inibitória de proteassoma in vivo e induz à apoptose ou interrupção de G1 em uma variedade de diferentes linhagens de célula tumoral.

[00050] Em seguida, os inventores testaram se a estabilização de p27 era, na verdade, requerida para a função de indução de apoptose da Argirina A ou era meramente uma consequência de inibição de proteassoma. Para isso, os inventores trataram fibroblastos embriônicos de camundongo imortalizados de camundongos do tipo silvestre ou knockout para p27 com Argirina A ou o inibidor de proteassoma bortezomib e ensaiaram a distribuição de ciclo celular e apoptose através de citometria de fluxo. Tratamento com bortezomib induziu à apoptose após 24 horas em ambas as linhagens de célula, a despeito do estado de p27kip1. A figura 2A mostra uma quantificação das frações sub G1 em MEFs do tipo silvestre e knockout para p27 (vide também figura 6A). A mesma resposta foi observada com tratamento com MG 132. Em forte contraste, o tratamento com Argirina A induziu à apoptose apenas em células as quais expressavam p27kip1, enquanto que apenas dez por cento de fibroblastos knockout para p27kip1 sofreram morte celular apoptótica após 60 horas de tratamento. Essas diferenças na sensibilidade em resposta ao tratamento com Argirina A não foram em virtude de diferenças no acúmulo de outros substratos proteassômicos em células do tipo silvestre e knockout para p27, uma vez que os níveis de p53 e p21 aumentaram em ambas as linhagens de célula em resposta à Argirina A (figura 6B). Para ampliar essa observação à células de câncer humano, os inventores reduziram os níveis de p27kip1 em células HeLa usando siRNA específico para p27kip1. Conforme mostrado na figura 2F, células HeLa as quais expressam p27kip1 sofreram apoptose em resposta à Argirina A, enquanto que tratamento com p27siRNA bloqueou completamente a função de indução de apoptose desse composto.

[00051] A análise dos inventores mostra que, embora os inibidores de proteassoma Argirina A e bortezomib sejam capazes de bloquear a atividade proteassômica in vitro, apenas a Argirina A requer expressão de p27kip1 para induzir à morte celular. Os inventores, portanto, decidiram testar diretamente a extensão até a qual os efeitos celulares de inibição de proteassoma per se são influenciados pela expressãode p27kip1. Para isso, os inventores criaram moléculas de siRNA específicas as quais objetivam as subunidades β1 (atividade semelhante à caspase), β2 (atividade semelhante à tripsina) e β5 (atividade semelhante à quimiotripsina) do proteassoma 20S de camundongo. Os inventores, então, reduziram a expressão dessas subunidades em fibroblastos embriônicos derivados de células do tipo silvestre ou knockout para p27kip1 e mediram a atividade proteassômica e distribuição do ciclo celular. As figuras 2B e 2D mostram medições de atividade para as atividades semelhantes à caspase, quimiotripsina e tripsina do proteassoma após tratamento com Argirina A ou uma combinação de siRNAs contra as subunidades β1, β2 e β5. Os níveis de expressão da subunidade proteassômica foram visualizados nas Western blots correspem quentes. O grau de inibição que os inventores atingiram com knockdown mediado por siRNA de subunidades proteassômica foi comparável aos efeitos exercidos através de tratamento com Argirina A ou bortezomib in vivo (figura 3A). Os níveis de expressão de subunidade proteassômica são visualizados nas Western blots correspem quentes.

[00052] Perda de atividade proteassômica em fibroblastos do tipo silvestre levou à indução de apoptose em 38% (Argirina A) ou 45% (siRNA) de todas as células após 24 horas (figura 2C). De modo importante, apenas 5% (Argirina A) ou 6% (siRNA) de todos os fibroblastos derivados de camundongos knockout para p27 sofreram apoptose em níveis comparáveis de inibição de proteassoma (figura 2E), enquanto que tratamento de células do tipo silvestre ou knockout para p27 com bortezomib induziu à apoptose massiva, independente do estado de p27 (figura 2A). Esses resultados apontam em direção a um papel ainda desconhecido de p27kip1 como um regulador crítico de morte celular apoptótica em resposta à inibição de proteassoma.

[00053] Os inventores decidiram comparar as respostas celularesde células tratadas com Argirina A ou bortezomib diretamente. Para essa finalidade, os inventores determinaram a assinatura de expressão gênica de células MCF7 em resposta à Argirina A ou bortezomib e compararam os perfis de expressão gênica resultantes. A figura 6C mostra uma plotagem de correlação dos dados de expressão gênica os quais os inventores obtiveram nesses experimentos usando células MCF7 não-tratadas ou tratadas com Argirina A ou bortezomib. A figura 6D mostra os valores de correlação. Conforme mostrado na figura 2G, os perfis de expressão gênica de células MCF7 as quais foram tratadas com bortezomib ou Argirina A diferem dramaticamente. Embora o tratamento com bortezomib tenha levado à alterações na expressão de mais de 10900 genes, apenas cerca de 500 genes alteraram em resposta ao tratamento com Argirina A. Dentre esses genes, 311 foram afetados pelo bortezomib e Argirina A, respectivamente. O agrupamento gênico funcional, baseado em seus termos de ontologia gênica correspem quentes, indica que embora a Argirina A e bortezomib inibam o proteassoma 20S, eles causam perturbações muito divergentes a nível celular. A partir desses dados, os inventores concluíram que o tratamento com bortezomib afeta alvos adicionais na célula, o que resulta na ativação de várias respostas celulares, desse modo, tornando a morte celular induzida por bortezomib independente de expressão de p27kip1.

[00054] Os inventores demonstraram, recentemente, que estabilização de p27kip1 previne a progressão de pólipos adenomatosos para cânceres intestinais invasivos. Os inventores, portanto, testaram se a estabilização de p27kip1 pela Argirina A seria benéfica no tratamento de xenoenxertos tumorais derivados de célula de câncer de cólon humano. Para analisar isso, os inventores testaram primeiro se a Argirina A era ativa após aplicação in vivo. Após injeção intraperitoneal de Argirina A, proteassoma 20S foi isolado de linfócitosde sangue periférico em diferentes pontos de tempo após injeção. Conforme mostrado na figura 3A, a Argirina A inibiu todas as atividades proteassômicas após aplicação i.p. A atividade inibitória máxima foi atingida a 48h pós-injeção e todas as atividades retornaram para os níveis de linha de base a 72 horas pós-injeção. Baseado nessa descoberta, os inventores trataram camundongos trazendo tumor com 0,15 mg de Argirina por quilograma de peso corporal, injetada intraperitoneal mente a cada três dias.

[00055] Conforme mostrado na figura 3B, a Argirina A levou a uma redução significativa no tamanho dos tumores xenotransplantados usados nesses experimentos. A extensão e cinética de regressão de tumor eram comparáveis ou mesmo mais pronunciada do que aquelas observadas nos animais tratados com bortezomib. De modo importante, contudo, os inventores não observaram quaisquer sinais de desconforto, perda de peso (figura 3C) ou doença nos animais tratados com Argirina A comparado com bortezomib.

[00056] Para ensaiar a extensão de inibição de proteassoma, a indução de p27kip1 e o desenvolvimento de morte celular apoptótica em tecido tumoral primário, os inventores trataram camundongos trazendo tumor com uma única dose de Argirina A ou bortezomib e explantaram os tumores nos pontos de tempo indicados depois. Conforme mostrado na figura 3D, ambos os tratamentos, com bortezomib e Argirina A, levaram a uma redução significativa de atividade de proteassoma no tecido tumoral primário.

[00057] De modo importante, o tratamento com Argirina A resultou em uma indução de p27kip1 e morte celular apoptótica em mais de 60% de todas as células tumorais (figuras 3E, F). Esse resultado não era esperado, uma vez que células SW480 eram altamente sensíveis ao tratamento com Argirina A in vitro. Os inventores, portanto, decidiram testar se a Argirina A também mostraria um efeito contraxenoenxertos derivados de HCT116, uma vez que essas linhagens de célula não sofrem apoptose in vitro, mas antes interrompem na fase G1. Os resultados desses experimentos são mostrados na figura 4A. Embora a redução no tamanho do tumor não seja tão pronunciada quanto em xenotransplantes derivados de SW480, os inventores ainda observaram uma redução significativa no volume do tumor após tratamento com Argirina A. De modo interessante, quando tumores derivados de SW480 ou HCT116 foram explantados, eles mostraram uniformemente uma grande área necrótica no centro do tumor, a qual estava cheia de sangue e tecido tumor necrótico (figura 4B). Esse fenotipo é, frequentemente, observado com fármacos os quais interferem com a formação de vaso sanguíneo ou compostos os quais danificam diretamente os vasos do tumor existente. Os inventores, portanto, determinaram a densidade do microvaso em tecidos tumorais (SW480 ou HCT116) de camundongos os quais receberam uma única injeção de Argirina A. A figura 4C mostra que Argirina A leva a uma redução significativa no número de células endoteliais CD31 positivas, começando tão cedo quanto 90 minutos após injeção, com apenas cerca de 10% das células CD31 positivas restando a 72 horas após injeção (vide figura 3A suplementar para uma coloração representativa). Essa redução na vasculatura do tumor foi em paralelo com uma indução de expressão de p27kip1 nas células endoteliais CD31 positivas, (figura 7A). Para compreender esse fenotipo em maiores detalhes, os inventores analisaram o material do tumor primário através de microscopia eletrônica. Tão logo quanto 90 minutos após injeção, os inventores observaram intumescimento de células endoteliais, o qual foi seguido por uma perda de fixação à membrana basal e contatos célula-célula (figura 4D) na vasculatura do tumor. Como um resultado da perda aparente de célula e fixação à membrana basal após tratamento com Argirina A, muitos dos vasossanguíneos tumorais examinados estavam obstruídos com células endoteliais ou eritrócitos. A destruição do núcleo do tumor, a qual os inventores observaram após tratamento com Argirina A poderia, portanto, ser um resultado de oclusão trombótica dos vasos sanguíneos afetados. Em contraste, o bortezomib induziu a uma redução em células CD31 positivas, correlacionada com o aparecimento de células endoteliais necróticas (figura 4D).

[00058] Os inventores, então, se indagaram se a Argirina A também era capaz de prevenir a formação de estruturas tubulares semelhantes a capilar formadas por HUVEC sobre matrigel, um ensaio frequentemente usado para testar a capacidade de um composto de interferir com a neovascularização. A figura 4E mostra uma quantificação do comprimento relativo de tubos capilares formados por HUVEC quando de estimulação com VEGF. A adição de Argirina A levou a uma redução de 40% na formação de tubo nesse ensaio. De modo importante, a transfecção de siRNA contra p27 protegeu as células endoteliais contra a atividade inibitória de Argirina A. Os efeitos exercidos pelo Bortezomib nesse ensaio foram menores e não resgatados pela perda de p27. Além do comprimento do tubo, os inventores também quantificaram o número de estruturas semelhantes a vaso sanguíneo formadas por HUVECs após tratamento com Argirina A ou bortezomib (figura 4F). Ambos os tratamentos levaram a uma redução significativa nas estruturas semelhantes a vaso sanguíneo. Contudo, perda de p27 apenas teve um efeito significativo sobre o fenotipo induzido por Argirina A, reforçando a conclusão de que a Argirina A exerce suas funções biológicas através de um aumento na expressão de p27kip1.

[00059] Nesse trabalho, os inventores identificaram o peptídeo cíclico derivado de mixobactéria Argirina A como um composto o qual exerce suas funções biológicas bloqueando a renovação celular dep27kip1. Estabilização de p27kip1 levou à interrupção de G1 ou apoptose em diferentes células tumorais humanas in vitro. Tratando tumores xenotransplantados derivados de linhagens de célula de câncer de cólon humano, os inventores, além disso, mostram que Argirina A também afeta a vasculatura do tumor. Suas atividades anti angiogênicas abrangem a inibição de neo-vascularização in vitro, mas ainda mais pronunciada a destruição de vasos sanguíneos no tumor estabelecido in vivo. Os inventores mostram que a destruição do núcleo do tumor é realizada através de um descolamento de células endoteliais a partir da membrana basal e através de uma perda de contatos célula-célula. Similarmente, células HUVEC in vitro mostram uma redução na formação de adesões locais e fibras de tensão após tratamento com Argirina A, o que se correlaciona com atividade reduzida de RhoA. No mesmo contexto, perda ou supressão de expressão de p27kip1 em células tumorais conferiu resistência à atividade de indução de apoptose de Argirina A. Juntas, essas observações sustentam a conclusão de que as atividades antitumor da Argirina A são mediadas através da estabilização de p27kip1.

[00060] O mecanismo molecular pelo qual a Argirina A estabiliza p27kip1 é através da inibição do proteassoma 20S. Essa conclusão é baseada na observação de que a Argirina A é capaz de inibir todas as atividades proteassômicas do proteassoma 20S purificado in vitro, bem como em células de sangue periférico e em tecidos tumorais in vivo. Bloqueando a atividade de proteassoma com siRNA dirigido contra subunidades críticas, os inventores descobriram, surpreendentemente, que p27kip1 é, na verdade, requerido para a função de indução de apoptose de inibição de proteassoma per se. Perda ou expressão reduzida de p27kip1 poderia, portanto, resultar em uma resistência aumentada de células tumorais contra processos os quais levam ao acúmulo de proteínas as quais normalmente sãodegradadas pelo proteassoma. Os inventores sugerem que estabilização de p27kip1 através de Argirina A e outras Argirinas conforme descrito aqui tal como, em particular, Argirina F, representa uma nova estratégia valiosa para o tratamento de malignidades humanas.

[00061] Outro aspecto da presente invenção, então, se refere a um método de acordo com a presente invenção, em que o medicamento ainda compreende ingredientes antitumor farmaceuticamente ativos adicionais, tais como paclitaxel e/ou bortezomib.

[00062] Outro aspecto da presente invenção se refere a um método de tratamento de câncer em um indivíduo compreendendo administração de uma quantidade eficaz do preparado farmacêutico de acordo com a presente invenção a um indivíduo que precisa do referido tratamento. De preferência, o referido câncer é selecionado de câncer de mama, carcinoma hepatocelular, carcinoma de cérvix, carcinoma de pulmão e câncer de cólon. De preferência, o referido paciente é um ser humano. Tratamento se destina a incluir, por exemplo, prevenção, tratamento, redução dos sintomas de ou cura da doença ou condição.

[00063] A invenção também inclui um método para tratamento de um indivíduo em risco de uma doença conforme acima, em que uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto conforme acima é fornecida. Estar em risco da doença pode resultar, por exemplo, de uma história familiar da doença, um genotipo o qual predispõe à doença ou sintomas fenotípicos os quais predispõem à doença.

[00064] As figuras, sequências e exemplos a seguir servem meramente para ilustrar a invenção e não deverão ser construídos como restringindo o escopo da invenção às modalidades particulares da invenção descritas nos exemplos. Para fins da presente invenção, todas as referências, conforme citado aqui, são incorporadas aqui porreferência em suas totalidades.

[00065] SEQ ID Nos. 1 a 14 mostram as sequências de moléculas de siRNA, conforme usado na presente invenção.

Legendas para as figuras:

[00066] A figura 1 mostra que argirina A induz à estabilização de p27 através de inibição do proteassoma 20S. a) As linhagens de célula indicadas foram tratadas com Argirina A e as frações G1 e sub-G1 foram determinadas através de análise citométrica de fluxo de células coradas com iodeto de propídio. Os valores de IC50 foram determinados através de ensaios de proliferação celular MTT usando diferentes concentrações de Argirina A. O valor de IC50 foi calculado como metade da concentração máxima na qual Argirina A exercia um efeito, b) Células SW480, HCT116 e HeLa foram tratadas com Argirina A, após o que as células foram submetidas à lise nos pontos de tempo indicados para determinar os níveis de expressão de p27kip1 através de Western blotting, c) Células SW480 e HeLa foram tratadas com Argirina A ou deixadas na tratadas durante 12 horas, tempo após o qual cicloheximida foi adicionada em uma concentração de 25 pg/mL. Os níveis de expressão de p27kip1 foram determinados nos pontos de tempo indicados através de Western blotting e normalizados contra expressão de actina, a qual foi usada como um controle interno. Os gráficos mostram uma quantificação de três experimentos independentes, d) Proteassoma 20S derivado de eritrócito purificado foi incubado com as quantidades indicadas de Argirina A ou bortezomib e as atividades semelhantes à caspase, quimiotripsina e tripsina foram medidas usando substratos peptídicos fluorogênicos específicos para as diferentes atividades catalíticas, e) As linhagens de célula SW480 e HCT116 foram incubadas com Argirina A. Nos pontos de tempo indicados, as células foram submetidas à lise e os níveis de expressão de p53, p21, Bax, NÍKB e actina foram analisadosatravés de Western blotting.

[00067] A figura 2 mostra que apoptose induzida através de inibição de proteassoma depende da expressão de p27kip1. a) Para determinar se a indução de morte celular apoptótica pela Argirina A depende da expressão de p27kip1, fibroblastos embriônicos de camundongo (MEF) derivados de camundongos do tipo silvestre (WT) ou knockout para p27 (KO) foram tratados com Argirina A. O número de células apoptóticas foi determinado medindo a fração sub-G1 através de citometria de fluxo usando células coradas com iodeto de propídio. Os resultados mostrados são os números médios de seis experimentos independentes, b+d) MEF do tipo silvestre (b) e knockout para p27 (d) foram tratados com Argirina A ou transfectados com siRNAs específicos para as subunidades β1, β2 ou β5 do proteassoma durante 24 horas. Os gráficos mostram a atividade catalítica restante das diferentes subunidades proteassômicas após tratamento com Argirina A ou siRNA comparado com um controle não- tratado (n = 3). As Western blots mostram a expressão da subunidade β1, β2 ou β5 do proteassoma em células em proliferação e após tratamento com siRNAs para um experimento representativo, c+e) Medições citométricas de fluxo do número de células apoptóticas (fração sub-G1) após tratamento com Argirina A ou siRNA em MEF do tipo silvestre (c) ou knockout para p27 (E). f) Células HeLa foram tratadas com Argirina A ou siRNA contra p27 ou Argirina A e siRNA contra p27 durante 24 ou 48 horas. As Western blots mostram os níveis de expressão para p27 em resposta aos diferentes tratamentos, g) O mapa térmico mostra uma análise de correlação dos perfis de expressão genica de genoma amplo de células de câncer de mama MCF7, as quais foram tratadas com Argirina A ou bortezomib durante os tempos indicados. A matriz de valor de correlação correspem quente é fornecida na figura 6d.

[00068] A figura 3 mostra que Argirina A induz à apoptose em xenoenxertos de câncer de cólon humano in vivo, a) Camundongos foram injetados i.p. com Argirina A (0,03 mg/kg de peso corporal) ou bortezomib (1 mg/kg de peso corporal). Nos pontos de tempo indicados, proteassoma 20S foi isolado de células de sangue periférico e a atividade das diferentes subunidades proteassômicas foi determinada, conforme descrito (figura 1d). b) Linhagens de célula de carcinoma de cólon SW480 misturadas com matrigel foram injetadas sob a pele de camundongos nu/nu para estabelecer tumores de xenotransplante. Tratamento com Argirina A ou bortezomib foi iniciado quando esses tumores atingiram um volume de 200 mm3. O gráfico mostra a quantificação dos volumes de tumor nos pontos de tempo indicados comparado com o tamanho inicial, o qual foi ajustado como 100 (n = 8 Argirina A (0,15 mg/kg de peso corporal), n = 4 Bortezomib (0,6 mg/kg de peso corporal), n = 10 PBS/EtOH controle, c) Todos os camundongos foram pesados durante todo o curso do experimento. O gráfico mostra as alterações no peso corporal para camundongos tratados com Argirina A ou bortezomib. d) Determinação de atividade proteassômica em tecido tumoral após tratamento com bortezomib e Argirina A. Após uma injeção no tempo um dos respectivos compostos, os tumores foram explantados nos pontos de tempo indicados e proteassomas foram extraídos do tecido tumoral. A atividade das respectivas subunidades proteassômicas foi determinada conforme previamente descrito (figura 1d). e) Determinação do número de células p27kip1 positivas em tecido tumoral após tratamento com Argirina A. as fotografias mostram amostras representativas de colorações imuno-histoquímicas para p27 em tecidos tumorais após 10 dias de tratamento com Argirina A. f) Detecção de células apoptóticas em tumores xenotransplantados através de coloração TUNEL de tecidos tumorais após tratamento comArgirina A ou bortezomib. Pelo menos 200 células foram contadas sobre cinco seções independentes para quantificar o número de células apoptóticas.

[00069] A figura 4 mostra que a argirina A danifica os vasos sanguíneos do tumor existente e interfere com a neovascularização de uma forma dependente de p27kip1. a) Linhagens de célula de carcinoma de cólon HCT116 misturadas com matrigel foram injetadas sob a pele de camundongos nu/nu para estabelecer tumores xenotransplantados. Tratamento com Argirina A ou bortezomib foi iniciado quando esses tumores atingiram um volume de 200 mm3. O gráfico mostra a quantificação dos volumes de tumor nos pontos de tempo indicados comparado com o tamanho inicial, o qual foi ajustado como 100 (n = 8 Argirina A, n = 8 Bortezomib, n = 6 PBS/EtOH) b) As fotografias mostram a aparência macroscópica de um tumor xenotransplantado após 10 dias de tratamento com Argirina A. Note o grande centro necrótico do tumor explantado. c) Após uma única injeção de Argirina A (0,15 mg/kg de peso corporal) ou bortezomib (1,0 mg/kg de peso corporal), os tumores foram explantados nos pontos de tempo indicados e os vasos sanguíneos no tumor foram cocorados para CD31 e p27. (Vide também a figura 7A para colorações imunofluorescentes representativas). O gráfico mostra uma quantificação dos dados, d) A ultraestrutura de microvasos foi analisada após injeção de Argirina A (fotografias à direita e no meio) ou Bortezomib (fotografia à esquerda), respectivamente. Note o intumescimento da célula endotelial ("E") e a oclusão do lúmen ("L") por eritrócitos após 90 minutos de tratamento com Argirina A. A seta marca o descolamento de células endoteliais após 48h de tratamento com Argirina A. O painel à esquerda mostra células endoteliais apoptóticas após tratamento com Bortezomib. e+f) Células HUVEC foram crescidas em meio basal para célula endotelial suplementadocom fatores de crescimento e contendo FCS a 2% durante 24h e tratadas com Argirina A (1 pM), bortezomib (10 nM), siRNA contra p27, Argirina A e siRNA ou bortezomib e siRNA. O comprimento do tubo (f) e estruturas semelhantes a vaso sanguíneo foram determinados usando fotografias de culturas de HUVEC. As micrografias mostram exemplos representativos de culturas de HUVEC sob as condições indicadas.

[00070] A figura 5 mostra a) a estrutura química de Argirina A. b) O gráfico mostra uma quantificação do percentual de células SW 480 apoptóticas, conforme determinado através de um ELISA de fragmentos de DNA associados à histona após tratamento com Argirina A. Células U937 tratadas com camptotecina foram usadas como controle positivo.

[00071] figura 6 a) Os gráficos mostram exemplos representativos de medições citométricas de fluxo de células do tipo silvestre e knockout para p27 após tratamento com Argirina A ou Bortezomib. b) MEFs do tipo silvestre ou knockout para p27 foram incubados com Argirina A e os níveis de expressão de p21, p53, Bax e actina foram determinados nos pontos de tempo indicados, c) Células de câncer de mama MCF7 foram incubadas com Argirina A ou Bortezomib durante 24h ou deixadas não-tratadas e as atividades proteassômicas semelhantes à caspase, quimiotripsina e tripsina foram medidas usando substratos peptídicos fluorogênicos específicos para as diferentes atividades catalíticas, d) Valores de correlação para a figura 2G.

[00072] A figura 7 mostra cocolorações por imunofluorescência representativas de células endoteliais em tumores xenotransplantados de câncer de cólon humano para CD31 e p27.

[00073] A figura 8 mostra que tratamento com argirina A é muito bem tolerado, conforme mostrado pelo peso corporal doscamundongos.

Materiais e Métodos: Seleção de alto rendimento (HTS) para substâncias de estabilização de p27

[00074] Uma seleção celular de alto rendimento para compostos que estabilizam p27 foi estabelecida introduzindo estavelmente um plasmídeo de DNA (EGFP-N1, Clontech), o qual permite a expressão de proteína de fusão p27kip1-GFP em células HeLa. Células expressando p27-GFP foram selecionadas com neomicina e vários clones independentes foram subcultivados. Células HeLa p27-GFP foram cultivadas em lâminas com 384 placas de poços (Corning) e incubadas com um conjunto de produtos naturais altamente diverso (parte da coleção de metabólito de mixobactéria do Helmholtz Center for Infection Research) em uma concentração de 70 nM. Emissão de GFP foi determinada através de medições fluorométricas usando um contador Victor 1420 Multilabel (Perkin Elmer) a 3h, 24h, 48h e 60h após o início de tratamento. O inibidor de proteassoma MG132 foi usado como um controle positivo.

Células e cultura tecidual

[00075] Fibroblastos humanos primários (HKI); HCT116 (câncer de cólon), MCF7 (câncer de mama), CaCo (câncer de cólon), A549 (câncer de pulmão), HeLa (câncer cervical) e MEFs imortalizados foram cultivados em DMEM suplementado com FCS a 5% e 2 mg/ml de penicilina/estreptomicina. Células SW480 (câncer de cólon) foram cultivadas em meio de MC Coy suplementado com FCS a 5% e 2 mg/ml de penicilina/estreptomicina.

Anticorpos, Western Blotting, Imunofluorescência, Imuno-histoquímica

[00076] Coloração imuno-histoquímica de tecido tumoral de camundongo, Western Blotting e experimentos de imunofluorescênciaforam feitos conforme previamente descrito (Timmerbeul, I. e outros, Testing the importance of p27 degradation by the SCFskp2 pathway in murine models of lung and cólon cancer. Proc Natl Acad Sci USA 103, 14009-14 (2006). Kossatz, U. e outros, C-terminal phosphorylation controls the stability and function of p27kip1. Embo J 25, 5159-70 (2006)). Os seguintes anticorpos foram usados: p27 (Cat. No. K25020-150; Transduction Labs), p21 (N20; Santa Cruz), p53 (FL- 393; Santa Cruz), NfKB (C-20; Santa Cruz), Bax (P-19; Santa Cruz), Alexa fluor 488 (n° A11001; Invitrogen), subunidade beta 2 de proteassoma 20S (Z) (PW9300; Biomol, para células humanas), subunidade beta 2 de proteassoma 20S (Z) (PW8145; BIO TREND, para células de camundongo); subunidade beta 1 de proteassoma 20S (Y) (PW8140; BIO TREND), subunidade beta 5 de proteassoma 20S (PW8895; BIO TREND); anticorpo PECAM, clone MEC 13.3 (n° 550274; BD Pharmingen).

Ensaios MTT, apoptose, citometria de fluxo

[00077] Ensaios MTT foram feitos conforme previamente descrito (Sasse, F. e outros, Argyrins, immunosuppressive cyclic peptides from myxobacteria. I. Production, isolation, physico-chemical and biological properties. J Antibiot (Tóquio)55, 543-51 (2002)). Coloração TÚNEL de seções teciduais foi realizada com 10 microlitros de seções, as quais foram desparafinizadas e tratadas conforme recomendado pelo fabricante (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein; ROCHE, Cat n° 11 684 795 910). Análise citométrica de fluxo de células cultivadas foi feita usando um citômetro de fluorescência Becton Dickinson, conforme previamente descrito (Malek, N.P. e outros, A mouse knock- in model exposes sequential proteolytic pathways that regulate p27Kip1 in G1 and S phase. Nature 413, 323-7 (2001)). Análise da distribuição de células no ciclo celular e da fração sub-G1 foi feita usando o software Cell Quest. Um ELISA de fragmentos de DNA associados àhistona foi usado para determinar o número de células apoptóticas de acordo com as instruções do fabricante (Roche n° 11 774425001).

siRNA

[00078] Knockdown com siRNA foi realizado usando reagente de transfecção FuGene6® ou reagente de transfecção HiPerFect. As transfecções foram feitas usando siRNA em uma concentração de 0,2 nM para Psmbl, Psmb2, PSMB1, PSMB2 e CDKN1B e em uma concentração de 0,4 nM para Psmb5 e PSMB5. Todos os siRNA foram adquiridos da Ambion.P27ID118714p27 dianteiro: 5'-CGUAAACAGCUCGAAUUAAtt-3, (SEQ ID No. 1)reverso: 5'-UUAAUUCGAGCUGUUUACGtt-3' (SEQ ID No.2)Psmbl :ID:68878:Psmbl dianteiro: 5,-GGAUUUUCAAUUCAUACCCtt-3, (SEQ ID No. 3)reverso: δ'-GGGUAUGAAUUGAAAAUCCtt-S'(SEQ ID No.4)Psmb2:ID70480:Psmb2 dianteiro: 5'-GGACGAUCAUGACAAGAUGtt-3, (SEQ ID No. 5)reverso: 5,-CAUCUUGUCAUGAUCGUCCtt-3, (SEQ ID No.6)Psmb5:ID 68783Psmbδ dianteiro: δ'-GGUGCUUAUAUUGCUUCCCtt-S (SEQ ID No. 7)reverso: 5'-GGGAAGCAAUAUAAGCACCtg-3' (SEQ ID No.8)PSMB1 :ID105612PSMB1 dianteiro: δ'-GACUGUCUUACGCUGACAAtt -3'(SEQ ID No. 9)reverso: 5'-UUGUCAGCGUAAGACAGUCtc -3' (SEQ ID No. 10)PSMB2:ID:105614PSMB2 dianteiro: 5'-GAUAUUACUCCUGUGUGUUtt -3'(SEQ ID No. 11)reverso: δ'-AACACACAGGAGUAAUAUCtt -3' (SEQ ID No.12)PSMB5:ID:105622PSMB5 dianteiro: δ'-GAAGAGCCAGGAAUCGAAAtt -3'(SEQ ID No. 13)reverso: δ'-UUUCGAUUCCUGGCCUUCtg -3' (SEQ ID No. 14)

Purificação de proteassoma, ensaios de proteassoma

[00079] Ensaios de proteassoma com proteassoma 20S purificado foram realizados conforme previamente descrito (Lightcap, E.S. e outros, Proteasome inhibition measurements: clinical application. Clin Chem 46, 673-83 (2000)) usando proteassoma 20S derivado de eritrócito (Biomol International, n°LP PW8720) e substratos fluorométricos Succ-LLVY-AMC, BZ-VGR-AMC e Z-Lle-AMC (Biomol International, LP PW9905) como sondas de acordo com as instruções dos fabricantes. Extração de proteassoma de células e seções de tumor foi feita conforme previamente descrito (Crawford, L.J. e outros, Comparative selectivity and specificity of the proteasome inhibitors BzLLLCOCHO, PS-341 and MG-132. Cancer Res 66, 6379-86 (2006)). Resumidamente, células (MEF ou MCF-7) ou homogenato de amostra tecidual (seções de tumor) foram resuspensos em 1 mL de tampão de lise ATP/DTT (10 mmoles/L de Tris-HCI (pH de 7,8), 5 mmoles/L de ATP, 0,5 mmoles/L de DTT, 5 mmoles/L de MgCh) e incubados sobregelo durante 10 minutos, seguido por ultrassom durante 15 segundos. Os lisatos foram centrifugados a 400 x g durante 10 min a 4°C e o sobrenadante resultante contendo proteassomas era estável a -80 °C com a adição de glicerol a 20% durante pelo menos 1 mês. A concentração de proteína das amostras foi medida usando um ensaio de proteína coomassie (Pierce, Rockford, IL).

[00080] Para extração de proteassoma de sangue íntegro, péletes de células sanguíneas íntegras congeladas foram descongeladas e submetidas à lise em 2-3 volumes de pélete de tampão de lise gelado (EDTA a 5 mM, pH de 8,0). Os lisatos foram centrifugados a 4°C e o sobrenadante foi transferido para um tubo novo. 5 pl foram tomados para a determinação da concentração de proteína usando um ensaio com proteína coomassie (Pierce, Rockford, IL).

[00081] Ensaios de proteassoma usando proteassoma purificado de células ou tecidos foram realizados em um volume de reação de 100 pL contendo 20 pg de extrato de proteassoma, 50 mmoles/L de EDTA e 60 pmoles/L de substrato fluorogênico (quimiotripsina-semelhante (CT-L), tripsina-semelhante (T-L) ou caspase-semelhante (C-L)) em tampão de lise ATP/DTT a 37°C. O tampão de ensaio foi suplementado com uma concentração final de SDS a 0,05% para a avaliação da atividade quimiotripsina-semelhante e atividade caspase- semelhante. A taxa de divagem de substratos peptídicos fluorogênicos foi determinada monitorando a fluorescência de aminometilcumarina liberada usando um contador Victor 1420 Multilabel (Wallac) em um comprimento de onda de excitação de 395 nm e comprimento de onda de emissão de 460 nm durante um período de 60 min.

Cultura de HMVEC, ensaio de formação de estrutura de tubo semelhante a capilar in vitroe imunofluorescência

[00082] Células endoteliais microvasculares primárias (HMVEC) foram isoladas do antebraço humano. As células foram mantidas a 37°C e 10 % de CO2 em EGM-2 MV da Cambrex, o qual inclui o meio basal (EBM-2), FBS, hidrocortisona, hFGF-B, VEGF, R3-IGF, ácido ascórbico, hEGF, gentamicina e anfotericina. O efeito de argirina A ou bortezomib sobre a angiogênese in vitro foi determinado através do ensaio de formação de estrutura semelhante a capilar em matrigel. Para determinar o efeito dos diferentes compostos sobre a angiogênese in vitro, HMVECs foram cultivadas em lâminas de cultura com 96 cavidades pré-revestidas com Matrigel (BD Biosciences, n°354248) e expostas à argirina A ou bortezomib. Redes encerradas de estruturas tubulares de três campos aleatoriamente escolhidos foram classificadas sob o microscópio (Leica, Cambridge, Reino Unido). Fotografias foram tomadas com o auxílio de uma câmera Axio Vision 3.1 Zeiss e classificadas determinando o comprimento do tubo e a formação de estruturas semelhantes a vaso fechado.

Estudos de xenotransplante

[00083] 1 x 107 células SW480 ou células HCT116 (em 100microlitros de meio DMEM e 100 microlitros de matrigel) foram injetadas s.c. nos flancos de camundongos NMRI nu/nu. Os tumores cresceram durante aproximadamente 18 dias, até que eles atingissem 0 tamanho apropriado (200 mm3). O tamanho do tumor foi medido com um calibrador digital e calculado com o auxílio da seguinte fórmula: (comprimento x largura2)* π/6. Todos os experimentos foram feitos após revisão e de acordo com as agências de proteção e direitos dos animais de Lower Saxony, Alemanha.

EM

[00084] Pequenos espécimes do tumor foram fixados em glutaraldeído a 2,5% (Polysciences, Warrington, PA, EUA) em cacodilato de sódio a 0,1 M, pH de 7,3 e pós-fixados com tetróxido de ósmio a 2% (Polysciences) no mesmo tampão. Após desidratação em álcoois graduados, eles foram incrustados em Epon (Serva,Heidelberg, Alemanha). Seções finas coradas com acetato de uranila e citrato de chumbo foram examinadas em um microscópio eletrônico Philips EM 301. As micrografias eletrônicas foram selecionadas, digitalizadas e processadas usando Adobe Photoshop 6.0.

Hibridização de microarranjo de DNA e análise

[00085] A qualidade e integridade do RNA total isolado foram controladas passando todas as amostras sobre um Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies; Waldbronn, Alemanha). Para síntese do alvo biotina-rotulado começando a partir de 3 pg de RNA total, as reações foram realizadas usando protocolo- padrão fornecidos pelo fabricante (Affymetrix; Santa Clara, CA). Em cada caso, 10 pg de cRNA rotulado foram hibridizados a um lote idêntico de Affymetrix GeneChips HG-U133 2.0 durante 16 horas a 45°C. Após hibridização, os GeneChips foram lavados, corados com SA-PE e lidos usando uma estação fluídica e scanner Affymetrix GeneChip.

Análise de dados

[00086] Análise dos dados de microarranjo foi realizada usando o software Affymetrix GCOS 1.2. Para normalização todos os experimentos de arranjo foram escalonados para uma intensidade alvo de 150, de outro modo usando os valores-padrão de GCOS 1.2. O conjunto de dados todo foi depositado sobre o servidor do banco de dados público GEO em um formato compatível MIAME e está disponível sob o no. de acesso GSE8565. O coeficiente de correlação para um par de arranjos foi definido como:

V|(a> - Ma) * (í>i - Mt,)]/n(σo* σ,s) iem que ai são os sinais no arranjo a, bi são os sinais no arranjo b, p e cr são as respectivas médias e desvios padrões e n é o número de itens em cada arranjo. Agrupamento funcional baseado em termos de ontologia gênica foi realizado usando o Array Assist 5.1(Stratagene, La Jolla, CA).

Análise estatística

[00087] Análise estatística foi realizada usando o software Microsoft Excel. Se não de outro modo estabelecido, todos os dados são apresentados como a média +/- SD (as barras de erro representam SD em todas as figuras). Comparações intergrupo foram realizadas através de um t-teste de Student duplamente configurado. Valores de probabilidade de p < 0,05 foram interpretados para denotar significância estatística.

Geração de linhagem de célula p27-GFP como construto repórter

[00088] cDNA de p27 humano (no vetor de plasm ideo CS2+) foi digerido com EcoR1 e BamH1 e o fragmento resultante foi ligado após purificação em gel no vetor pEGFP-N1 (Clontech) que foi cortado com as mesmas enzimas de restrição. Assim, uma fusão com desvio da rede de leitura com a GFP, conforme contido no vetor pEGFP, foi gerada. O plasm ideo foi, então, transferido para células Hela e, após seleção das células com canamicina, clones celulares foram isolados os quais tinham o plasmídeo integrado estavelmente em seu cromossoma. A expressão das proteínas p27EGFP foi confirmada usando Western blots e precipitações imunes para p27 e GFP.

Efeito de diferentes derivados de argirina

[00089] A tabela a seguir resume os efeitos de derivados de argirina A a H sobre duas linhagens de célula de câncer, H15 (carcinoma de cérvix) e SW-480 (câncer de cólon). De forma a testar a eficácia, um clone de p27-GFP foi usado.Efeito de diferentes derivados de argirina

[00090] *A GFP-fluorescência foi determinada através de FACSapós uma incubação de 24h do clone H15GFP-p27 (linhagem de célula HeLa; carcinoma de cérvix) com os diferentes derivados de argirina (500 ng/ml).

[00091] **Concentração mínima de uma diluição serial que exibe um efeito visual.

[00092] ***Metade da inibição máxima da proliferação de SW-480 (linhagem de célula de câncer de cólon; análise seguindo um MTT- teste). Uma vez que todos os derivados, com a exceção de E e F, mostram uma progressão bifásica de inibição com um platô em inibição de 50%, a determinação de um valor de IC50 é difícil. Pode ser observado que a argirina F é particularmente eficaz e, assim, preferida.

Claims (10)

1. Uso de um composto da fórmula I:

(fórmula I)na qual:R1 e R2 são, independentemente, hidrogênio, C1-C4 alquila a qual é não-substituída ou substituída por OH ou C1-C4 alcóxi;R3 é hidrogênio, Ci-Ce alquila a qual é não-substituída ou substituída por OH ou OR, em que R é selecionado de hidrogênio, Ci- C4 alquila, arila ou acetila,R4 é hidrogênio, halogênio, C1-C4 alquila a qual é não- substituída ou substituída por OH ou C1-C4 alcóxi;R5 é hidrogênio ou halogênio;R6 é hidrogênio ou C1-C4 alquila; eX é C=CH2OU CHR7 em que R7 é C1-C4 alquila a qual é não-substituída ou substituída por -S-C1-C4 alquila e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo,caracterizado pelo fato de que é para a produção de um medicamento para o tratamento de câncer em um indivíduo.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que:R1, R2 e R3 são, independentemente, hidrogênio, Ci-Ce alquila a qual é não-substituída ou substituída por OH ou C1-C4 alcóxi;R4 é hidrogênio, halogênio, C1-C4 alquila a qual é não- substituída ou substituída por OH ou C1-C4 alcóxi;R5 é hidrogênio ou halogênio;R6 é hidrogênio ou C1-C4 alquila; eX é C=CH2OU CHR7 em que R7 é C1-C4 alquila a qual é não-substituída ou substituída por -S-C1-C4 alquila e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que:R1 é hidrogênio ou C1-C4 alquila não-substituída, metila;R2 é hidrogênio ou C1-C4 alquila a qual é não-substituída ou substituída por OH, metila ou hidroximetila;R3 é hidrogênio ou C1-C4 alcóxi, metóxi;R4 é hidrogênio ou C1-C4 alquila não-substituída, metila;R5 é hidrogênio ou bromo;R6 é hidrogênio ou metila; eX é C=CH2 OU CHR7 em que R7 é metila a qual é não- substituída ou substituída por -S-etila,e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que:R1 é hidrogênio ou metila;R2 é metila ou hidroximetila;R3 é hidrogênio ou metóxi;R4 é hidrogênio ou metila;R5 é hidrogênio;R6 é metila; eX é C=CH2, e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a4, caracterizado pelo fato de que o composto tem a seguinte fórmula:

e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido composto é argirina F e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero, em particular um ser humano.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o tratamento de câncer compreende bloqueio de crescimento de célula tumoral, bloqueio e/ou destruição da vasculatura do tumor existente, tratamento de câncer de mama, tratamento de carcinoma hepatocelular, tratamento de carcinoma do cérvix, tratamento de carcinoma do pulmão, tratamento de mieloma múltiplo e/ou tratamento de câncer de cólon.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende ainda ingredientes antitumor farmaceuticamente ativos adicionais, preferencial mente, paclitaxel.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 caracterizado pelo fato de que o composto é administrado em umadose de 0,01 mg a 200 mg/kg, de preferência em uma dose de 0,01 mg a 100 mg/kg, mais preferivelmente em uma dose de 0,02 mg a 10 mg/kg.

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