BRPI0807059A2 - Uso de enterovírus, e, método para prevenir ou tratar de uma doença - Google Patents

Description

“USO DE ENTEROVÍRUS, E, MÉTODO PARA PREVENIR OU TRATAR DE UMA DOENÇA”

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito à redução do risco de sensibilização alérgica, especialmente a sensibilização mediada por IgE, e seu desenvolvimento para doença clínica, por meio do que as doenças alérgicas tais como a asma, o eczema e a rinite alérgica, e a conjuntivite, podem ser prevenidas ou tratadas. Mais precisamente, a presente invenção diz respeito ao uso de um vírus específico na fabricação de uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar de uma doença associada com a sensibilização alérgica.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A incidência das doenças alérgicas tem constantemente aumentado nos países desenvolvidos durante as recentes décadas. O sistema imune de uma criança recém-nascida é imaturo, e se desenvolve durante os primeiros meses e anos da infância. A criança saudável desenvolve uma resposta imune contra os patógenos em seu ambiente, ao passo que uma proporção crescente das crianças desenvolve uma resposta alérgica contra fatores não nocivos no ambiente, levando a doenças alérgicas.

Várias tentativas têm sido feitas para prevenir o desenvolvimento das doenças alérgicas. Por muitos anos a exclusiva amamentação do bebê na mama da mãe, e a evitação do contato com possíveis fontes alergênicas, tais como gatos e cães na infância prematura, tem sido considerada como meios para reduzir o risco de doenças alérgicas. Entretanto, os resultados não têm sido convincentes.

Uma hipótese mais recente para a causa das doenças alérgicas é a “hipótese da higiene”, que baseia-se no fato de que a predominância das doenças alérgicas é significativamente mais elevada nos países prósperos com elevados padrões de vida e higiene, do que nos países que têm padrões mais baixos de higiene. Uma outra associação inversa entre o número de irmãos e as doenças alérgicas foi documentada nos exames epidemiológicos [1, 2], O desenvolvimento em uma fazenda parece estar associado com a predominância inferior de rinite alérgica e a sensibilização [3, 4, 5]. As 5 crianças que não vivem em uma fazenda, mas que têm contato regular com o gado, também tinham uma predominância inferior de sensibilização alérgica [4]. As razões subjacentes por trás destas associação são amplamente desconhecidas, mas a “hipótese de higiene” proporciona uma possível explicação sugerindo que a exposição a uma variedade de micróbios na 10 infância protege contra as doenças alérgicas por promover a maturação do sistema imune [2, 6], Uma possível abordagem para atacar a alergia tem sido a administração de bactérias probióticas, especialmente as bactérias de ácido láctico, as quais têm sido observadas promoverem uma resposta imuno tolerogênica.

Vários estudos têm sugerido um papel para as células T CD4+

polarizadas em Th2 na patogênese da asma e da alergia [7 a 9], mas os mecanismos imunológicos exatos que regulam a sensibilização alérgica não são conhecidos. As respostas imunes propensas a Thl podem regular negativamente os efeitos das células Th2 [7] ou as células T reguladores 20 podem controlar a função tanto das células Thl quanto das Th2, bem como o equilíbrio de Thl/Th2 [8, 9]. Não obstante alguns relatos tenham sido contraditórios, existe apoio epidemiológico de que algumas infecções, tais como o vírus da hepatite A (HAV) [10 a 13], o Toxoplasma gondii [12, 13] e o Helicobacter pylori [12 a 14] e os componentes bacterianos [15 a 17] são 25 associados com um risco reduzido de doenças alérgicas, assim apoiando a hipótese de que a carga microbiana é um importante fator ambiental que confere proteção contra o desenvolvimento de alergias na infância [18]. Além disso, uma associação inversa independente foi observada entre o número de infecções gastrintestinais antes da idade dos 5 anos, e o risco de atopia na UK [19]. Foi também relatado que a infecção na infância prematura com herpesvírus humano do tipo 6 (HHV-6) poderia proteger contra o desenvolvimento da sensibilização de IgE, doença atópica e alergia em crianças jovens (WO 2006/031195).

5 Entretanto, nem todas as infecções microbianas têm um efeito

protetor sobre a preponderância das doenças atópicas. Foi, por exemplo, observado que a soropositividade quanto aos patógenos bacterianos intestinais, tais como Clostridium difficile, Campylobacter jejuni e Yersinia enteroeolitica, foi associada com uma preponderância mais elevada da atopia 10 entre os adultos dinamarqueses [13]. Recentemente, Benn et al. relataram que as doenças infecciosas durante os primeiros 6 meses de vida (a maior parte infecções respiratórias superiores) aumentam o risco de atopia [20], e Bager e colaboradores observaram um risco crescente de atopia com o número crescente de infecções causadas por vírus transportados pelo ar (sarampo, 15 rubéola, caxumba e varicela) antes da idade de 1 ano [21].

Existe uma necessidade explícita de meios eficazes para reduzir o risco de sensibilização alérgica e desse modo prevenir ou tratar das doenças com ela associadas. Em particular, existe uma necessidade de prevenir o desenvolvimento de doenças alérgicas tais como a asma, eczema, 20 rinite alérgica e conjuntivite e alergias induzidas pelos alimentos. A presente invenção atende a estas necessidades.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção baseia-se no uso do enterovírus para prevenir ou tratar de uma doença associada com a sensibilização alérgica. Em 25 particular, a invenção proporciona o uso do enterovírus na fabricação de uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar de uma doença associada com a sensibilização alérgica, em que referido enterovírus não contenha uma seqüência de ácido nucléico exógeno que seja integrada no genoma viral e que codifique um alérgeno que induza referida sensibilização alérgica. Um método para prevenir ou tratar de uma doença associada com a sensibilização alérgica, em que uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo o enterovírus é administrada a uma pessoa em necessidade dela, é também apresentado, e em que referido enterovírus não contém uma 5 seqüência de ácido nucléico exógeno que seja integrada no genoma viral e que codifique um alérgeno que induza referida sensibilização alérgica.

As implicações particulares da invenção são apresentadas nas reivindicações anexas. Outros objetos, detalhes e vantagens se tomarão evidentes da seguinte descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra a preponderância do IgE específico de alérgeno em crianças carelianas russas de acordo com a soropositividade quanto a diferentes sorotipos enterovirais.

A Figura 2 mostra a indução do mRNA FoxP3 nas culturas celulares mononucleares do sangue periférico estimuladas com enterovírus ineficazes (CBV4), enterovírus purificados tratados pelo calor (CBV4), agonistas TLR diferentes [poli(I:C), LPS, Resiquimod] e estimulador de células T policlonais (anti-CD3+anti-CD28). As células foram colhidas após

24 horas de incubação. Os resultados são mostrados como expressão relativa do mRNA FoxP3 em comparação com as células tratadas no meio. EV = enterovírus.

A Figura 3 mostra a indução do mRNA IL-10 nas culturas celulares mononucleares do sangue periférico estimuladas com enterovírus ineficazes (CBV4), enterovírus purificados tratados pelo calor (CBV4), agonistas TLR diferentes [poli(I:C), LPS, Resiquimod] e estimulador de células T policlonais (anti-CD3+anti-CD28). As células foram colhidas após

24 horas de incubação. Os resultados são mostrados como expressão relativa do mRNA IL-IO em comparação com as células tratadas no meio. EV = enterovírus. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção baseia-se na descoberta de que a sensibilização alérgica e as doenças com ela associadas, podem ser prevenidas pela vacinação com uma composição compreendendo enterovírus como um ingrediente imunoativo. Os vírus recombinantes compreendendo uma seqüência de ácido nucléico exógeno, que seja integrada no genoma viral, e que codifique um epítopo de um alérgeno e um sítio de clivagem proteolítica artificial, foram anteriormente sugeridos como vacinas contra a alergia (WO 93/11251), não obstante nenhum exemplo que proporcionasse o efeito contra a alergia fosse fornecido. A abordagem é completamente diferente da presente invenção, porque o vírus funciona como um “portador” passivo ou veículo de liberação para o ácido nucléico exógeno integrado no genoma viral e codificando para um antígeno, o que, acredita-se, elicie uma resposta imune desejada contra o referido antígeno, enquanto a presente invenção baseia-se no efeito imunorregulador que é induzido pelo próprio enterovírus. Portanto, o enterovírus da presente invenção é o componente ativo e não contém nenhuma seqüência de ácido nucléico exógeno integrada que codifique um alérgeno que induza a sensibilização alérgica a ser prevenida ou tratada. Entretanto, o enterovírus usado na presente invenção pode incluir uma seqüência de ácido nucléico exógeno não codificadora, que seja integrada no genoma viral, bem como de ácido nucléico exógeno codificador ou não codificador, que não seja integrado no genoma viral. O enterovírus usado na presente invenção pode também incluir proteínas exógenas. Em uma forma de realização da invenção, o enterovírus não contém nenhum ácido nucléico exógeno que codifique a proteína exógena, e especialmente não contenha nenhum ácido nucléico exógeno integrado que codifique a proteína exógena.

“Alérgeno”, como aqui usado, é um composto que pode induzir uma resposta imune alérgica, e pode ser uma proteína completa ou apenas um fragmento imunoativo, isto é, seu epítopo. Os ácidos nucléicos não são claramente considerados alérgenos em relação a isto.

O grupo de enterovírus inclui mais do que 100 diferentes sorotipos. As infecções de enterovírus são usualmente subclínicas, mas elas podem também causar várias espécies de doenças. Poliovírus, coxsackievírus 5 B, coxsackievírus A e ecovírus, bem como os enterovírus numerados, são enterovírus conhecidos como estando envolvidos no desenvolvimento de uma variedade de doenças. As infecções dos enterovírus acham-se espalhados através da via fecal-oral e infeccionam o hospedeiro através da mucosa e do sistema imune associado com os intestinos. Elas são potentes ativadores do 10 sistema imune e causam intensas alterações no sistema imune.

“Enterovírus”, como usado no presente relatório descritivo, inclui tanto os enterovírus completos quanto os seus componentes ou as suas combinações. Os enterovírus podem ser uma cepa de enterovírus vivos atenuados ou não atenuados, uma cepa geneticamente modificada, ou um 15 componente derivado de uma cepa de enterovírus, tal como uma subunidade ou peptídeo, um componente protéico estrutural ou sua combinação, tal como um vírus como partícula, ou um genoma ou fragmento de genoma, tal como RNA ou cDNA codificando uma proteína viral imunologicamente ativa. Pode ser também uma cepa de enterovírus mortos, isto é, de enterovírus inativados. 20 Os enterovírus que são particularmente úteis na prevenção e

tratamento da sensibilização alérgica podem ser identificados pela sua capacidade de induzir as vias imunorreguladoras ou regular negativamente as respostas imunes do tipo Th2. Tais enterovírus podem ser identificados pela análise de seu efeito sobre as células T reguladoras e/ou equilíbrio de 25 Thl/Th2 e/ou produção de citocinas imunorreguladoras tais como IL-10, ou durante a estimulação in vitro das leucocinas do sangue periférico com diferentes enterovírus, ou in vivo em crianças com infecção de enterovírus. Tipicamente tais enterovírus devem ativar as células T reguladoras positivas em PoxP3 ou as células T reguladoras que produzem IL-IO ou outras citocinas imunorreguladoras. Tais enterovírus podem também reduzir a atividade das células do tipo Th2 refletidas, por exemplo, por um decréscimo na produção da IL-4 ou de outras citocinas do tipo Th2 e/ou confrontando o aumento na atividade das células do tipo Thl com a produção aumentada do 5 interferon-gama ou outras citocinas do tipo Thl. Os enterovírus que são particularmente úteis nesta invenção, podem também ser identificados por seu efeito protetor nos estudos epidemiológicos. Tipicamente, tais enterovírus devem ter sido mais freqüentes nos indivíduos que não tenham desenvolvido sensibilização alérgica ou sintomas alérgicos em comparação com pacientes 10 que tenham desenvolvido a sensibilização alérgica ou os sintomas alérgicos. Estes vírus podem ser identificados medindo-se os anticorpos específicos do sorotipo do sangue ou pela análise das propriedades antigênicas ou genéticas dos vírus detectados nesta espécie de estudos epidemiológicos.

Vírus atenuados são vírus dos quais a virulência tenha sido 15 reduzida. Isto pode ser realizado por diferentes métodos, incluindo a passagem sucessiva do vírus nas culturas celulares, a modificação antigênica por tratamentos químicos, a construção de vírus recombinantes ou quiméricos, a mutageneização do genoma viral, a deleção ou inserção de certas regiões de genes, a seleção de mutantes sensíveis à temperatura, ou a 20 irradiação. Alternativamente, o enterovírus pode ser atenuado por isolados virais naturais atenuados ou cDNA viral infeccioso ou RNA tendo capacidade reduzida para causar a doença clínica.

O enterovírus vivo atenuado ou não atenuado é convenientemente administrado por via oral. Cada dose de imunização inclui 25 vírus infecciosos ou RNA ou cDNA infecciosos em um título, o qual é capaz de produzir infecção ou ativação do sistema imune inato ou adaptativo, ou induzir as células T reguladoras ou as citocinas reguladoras nos seres humanos. Esta dose deve corresponder àquela que é usada na vacina oral de poliovírus vivos do tipo de Sabin tradicional, incluindo cepas de Sabin de um mínimo de IO5,5 a IO6TCID50 para o Tipo 1 do poliovírus, IO5 TCID5O para o tipo 2 do poliovírus, e IO5,5 a IO5,8 TCID50 para o tipo 3 do poliovírus, vivos atenuados de poliovírus. A dose pode também ser outra, se tiver sido confirmado ser segura e infecciosa ou capaz de ativar o sistema imune inato ou adaptativo. (TCID = dose infecciosa da cultura tecidual; TCID50 = a dose que infecciona 50 % das culturas).

Alternativamente, o enterovírus pode incluir vírus completos, a infectuosidade dos quais tenha sido inativada, ou vacinas de subunidades contendo certas estruturas antigênicas, proteínas ou peptídeos dos vírus, ou sua combinação (tal como partículas tipo vírus), ou fragmentos do RNA ou cDNA virais codificando o vírus completo ou proteínas virais individuais, ou formas inativadas do vírus. As vacinas inativadas podem ser produzidas pela propagação do vírus em culturas celulares e pela sua purificação das células infectadas e dos meios de cultura por centrifugação de alta velocidade em um gradiente de densidade formado por sacarose ou outro meio de alta densidade. Alternativamente o vírus pode ser purificado por cromatografia. A infectuosidade dos vírus purificados é destruída por inativação dos vírus mediante tratamento químico (por exemplo, a inativação por formalina como aquela usada para produzir IPV), irradiação ou tratamento térmico. As vacinas de subunidades podem consistir de proteínas virais purificadas ou proteínas virais recombinantes, peptídeos sintéticos correspondentes aos epítopos antigênicos virais, partículas tipo vírus ou capsídeos virais vazios, que são produzidos durante a infecção, mas carecem do genoma viral. Estas vacinas de subunidades podem ser administradas ou como tais, ou combinadas com haptenos ou portadores (por exemplo, partículas de ISCOM, quitosano, agonistas de TLR, micropartículas biodegradáveis).

Os enterovírus acima mencionados podem ser administrados parenteralmente por injeções, pelas vias peroral, intradérmica, transcutânea, sublingual, intranasal como inalação, ou por via retal. Cada dose de imunização inclui estruturas virais em um título, as quais são capazes de induzir a resposta imune apropriada em seres humanos. Esta dose deve corresponder àquela usada na vacina de poliovírus inativados do tipo Salk, incluindo 1,8 a 2 μg de proteína viral por dose e 20 a 40 unidades D antigênicas do poliovírus tipo 1, 4 a 8 unidades D antigênicas do poliovírus tipo 2, e 16 a 32 unidades D antigênicas do poliovírus tipo 3. A dose também pode ser outra, se tiver sido confirmado ser segura e imunogênica ou capaz de estimular o sistema imune inato ou adaptativo, ou induzir as células T reguladoras ou as citocinas reguladoras. Os enterovírus podem ser administrados em diferentes combinações, incluindo um ou mais sorotipos de enterovírus dados simultaneamente ou de forma serial. Se os diferentes enterovírus forem administrados simultaneamente, a composição farmacêutica pode estar na forma de uma mistura de diferentes enterovírus. Os enterovírus podem também ser administrados em combinação com pelo menos um alérgeno, por exemplo alérgeno completo ou sua subunidade imunologicamente ativa, de modo a promover uma resposta tolerogênica contra o referido alérgeno. De acordo com uma forma de realização da invenção, a vacina contém enterovírus como o único ingrediente imunoativo e, e acordo com outra forma de realização, ela contém uma mistura de enterovírus e um ou mais alérgenos exógenos.

O enterovírus é formulado em uma composição farmacêutica, a qual, além dos ingredientes ativos que eliciam a estimulação imune, podem conter excipientes, portadores, haptenos e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Os excipientes, portadores, haptenos e adjuvantes podem incluir, 25 por exemplo, fenoxietanol, cloreto de magnésio, sacarose, tiomersal, formaldeído, fenol, antibióticos (preservativos) ou sais de alumínio, micropartículas poliméricas, partículas de ISCOM, proteínas portadoras (por exemplo a toxina da cólera), lipossomas, micelas protéicas (haptenos/adjuvantes) ou agonistas de TLR. A composição farmacêutica é preferivelmente administrada a uma criança dentro dos 5 anos após o nascimento, e mais preferível dentro dos 3 anos, especialmente dentro dos 2 anos, e o mais preferível dentro de 1 ano após o nascimento, com reforçadores administrados mais tarde na vida 5 para prevenir a sensibilização alérgica. Aos indivíduos que já tenham sido sensibilizados, independente dos sintomas de uma doença ou não, pode ser administrada a composição farmacêutica em qualquer idade.

“Uma quantidade eficaz” da composição farmacêutica é uma quantidade que seja capaz de eliciar ou uma resposta imune adaptativa ou inata que seja capaz de induzir a imunidade e de proteger o receptor contra o vírus, ou pela eliciação dos anticorpos neutralizantes ou de uma resposta de mediação celular, ou de ambos. Pode também ser uma quantidade que seja capaz de induzir a produção de citocinas reguladoras (tais como a IL-10) ou de ativar as células T reguladoras (Treg) ou induzir uma alteração favorável no equilíbrio das células Thl/Th2, mesmo que a imunidade protetora contra o vírus não seja induzida. A indução das citocinas reguladoras ou das células ou da alteração no equilíbrio de Thl/Th2 pode ocorrer nas respostas imune específicas do vírus ou específicas do alérgeno, ou de ambos. Pode também ser um efeito mais generalizado ao sistema imune influenciando uma ampla disposição das respostas imunes com diferentes especificidades a antígenos ou a alérgenos. Um tal efeito generalizado é tipicamente mediado pelas citocinas imunorreguladoras solúveis tais como a IL-10.

Quando o sistema imune é exposto a componentes estranhos no ambiente incluindo patógenos, uma resposta imune é induzida, a qual pode 25 ser dominada por uma resposta ou do tipo Thl ou do tipo Th2. Ambas respostas se acham combatendo as infecções, enquanto as células Th2 se acham também promovendo a alergia. Um equilíbrio apropriado entre as células Thl/Th2 é essencial para uma resposta apropriada. Entretanto, em pacientes suscetíveis às doenças alérgicas, a resposta do tipo Th2 se acha dominando. Além disso, Estes indivíduos podem ter função anormal das células T reguladoras e de outros componentes de regulação imune.

A “sensibilização alérgica” refere-se a eliciar uma resposta imune dominada por Th2, levando à produção de IgE específica do alérgeno contra vários antígenos ambientais, a maioria deles inofensivos. A IgE específica do alérgeno, por sua vez, medeia as reações de hipersensibilidade que provocam os sintomas da doença alérgica. Esta espécie de resposta imune pode ser medida pelo ensaio da IgE específica do alérgeno, por exemplo de uma amostra de sangue. Os níveis elevados de IgE específico do alérgeno refletem sensibilização alérgica a um certo alérgeno. Além disso, os altos níveis de imunoglobulina de IgE total podem indicar sensibilização alérgica. O teste de picada da pele também é usado para diagnosticar doenças alérgicas. A composição farmacêutica contendo enterovírus é uma vacina que é capaz de prevenir ou tratar qualquer doença associada com a sensibilização alérgica.

A sensibilização alérgica mediada por IgE pode levar a várias espécies de doenças alérgicas, tais como o eczema alérgico, a asma alérgica, o alimento mediado por IgE ou a alergia a drogas, a conjuntivite alérgica ou a rinite. A vacina enteroviral é capaz de reduzir o risco de sensibilização mediada pela IgE e por esse meio prevenir doenças provocadas pela sensibilização ao IgE, tais como a rinite alérgica e a asma.

A vacina enteroviral pode ser administrada a uma corte de nascimento completo ou a um grupo selecionado de uma população, tal como crianças de famílias em que pelo menos um membro da família tenha sido diagnosticado com uma reação ou doença alérgica, para prevenir a sensibilização alérgica. Além disso, a vacina de enterovírus pode ser usada em indivíduos que tenham sensibilização alérgica assintomática (concentrações aumentadas de IgE específico de alérgenos, sem sintomas) para impedir que venham a desenvolver sintomas clínicos. De acordo com isto, a vacina de enterovírus pode também ser usada para aliviar os sintomas e doença alérgicos. As variações e as associações no predomínio das infecções microbianas e da sensibilização alérgica em crianças na Finlândia e na Rússia foram estudadas em um único ambiente epidemiológico em duas áreas de pontos de vista sócio-econômico e cultural marcadamente diferentes, embora geograficamente adjacentes.

MÉTODOS Objetos de experiência

O corte de estudo careliano russo incluiu 266 crianças escolares, e o corte finlandês da mesma forma incluiu 266 crianças escolares. As crianças representavam as populações da corrente principal e não foram selecionadas de acordo com possíveis doenças alérgicas ou outras doenças. Todas as crianças da Republica Careliana tinham pais de etnia ou finlandesa ou careliana, o que confere um ambiente étnico próximo àquele das crianças da Finlândia [22]. Os cortes de estudo incluíam ao todo 114 meninos e 152 meninas de cada país. A idade média na amostragem foi de 11,4 anos (faixa de 7 a 15 anos) em ambos os cortes.

Amostras de sangue foram colhidas durante 1988 de crianças escolares aleatoriamente selecionadas na Carélia. Os antecedentes étnicos tanto da mãe quanto do pai foram registrados, e todas as crianças cujos ambos os pais eram de etnia ou finlandesa ou careliana foram incluídas no presente estudo (N = 266). Quanto a estas crianças Carelianas, um corte de crianças finlandesas foi combinado aos pares por idade, gênero e período do ano da amostragem (não mais do que 1 mês de diferença), assim minimizando o efeito da estação sobre a exposição aos micróbios e alérgenos. O corte finlandês foi recrutado da mesma maneira do corte careliano e incluiu inicialmente 3654 crianças escolares vivendo na região de Oulu da Finlândia [23]. Amostras de sangue foram colhidas de cada criança. IgE E ANTICORPOS VIRAIS Os níveis de IgE específica de alérgenos foram medidos com o uso do imunoensaio de fluoroenzimas Uni-CAP® (Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Suécia). IgE específica para dois alérgenos inalantes comuns (bétula e gato) e para albumina de ovo foi analisada de acordo com as instruções do fabricante. Estes alérgenos foram selecionados porque a exposição a eles pode ser esperada ser bem semelhante em ambas as populações. Quanto à IgE específica dos alérgenos, os valores de 0,35 IU/litro ou mais foram considerados positivos. Nos estudos anteriores, os valores totais da IgE que excederem a 100 IU/litro foram considerados como marcadores da predisposição atópica [24].

Os anticorpos de enterovírus reativos no grupo foram analisados com o uso do imunoensaio enzimático (EIA) e os coxsackievírus B4 tratados pelo calor (CBV4) como antígenos, como anteriormente descrito [25]. Este método detecta anticorpos que não são sorotipos específicos, mas que são de reatividade cruzada entre vários sorotipos enterovirais. A capacidade deste método para detectar anticorpos de reatividade cruzada contra vários sorotipos foi intensificada pelo tratamento térmico do antígeno viral, já que este tratamento expõe as estruturas de reatividade cruzada escondidas dos vírus.

Os anticorpos que eram específicos para um dado sorotipo foram medidos com o uso de uma ensaio de neutralização de placa como anteriormente descrito [26]. Este método mede os anticorpos de neutralização, os quais são específicos para o sorotipo que é usado no ensaio. Nós pesquisamos anticorpos contra dois sorotipos de coxsackievírus B (CBV4 e CBV5) e dois sorotipos de ecovírus (ecovírus 9 e 11) com o uso das cepas virais de referência ATCC.

Os anticorpos do vírus da hepatite A (HAV) da classe IgG foram medidos com o uso do kit de EIA comercial anti HAV Enzygnost® de acordo com as instruções do fabricante (Dade Behring, Marburg, Alemanha). O Processador de Elisa Behring III foi usado para outro processamento dos testes e para o cálculo dos níveis dos anticorpos.

INDUÇÃO DAS VIAS IMUNORREGULADORAS

O efeito do enterovírus sobre as vias imunorreguladoras foi analisado mediante o estímulo das culturas de células mononucleares com enterovírus. As células mononucleares do sangue periférico de pessoal de laboratório saudável foram purificadas com o uso do BD Vacutainer® CPT® Tube (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) de acordo com as instruções do fabricante. As células mononucleares foram lavadas duas vezes com RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e cultivadas por 48 horas em +37 0C (5 % de CO2) em reservatórios de placas de microtitulação de fundo redondo (agrupamento de cultura celular de 96 reservatórios Costar, Corning Inc., Corning, NY, USA) com o uso de 200.000 células por 100 μΐ por reservatório. O meio de cultura continha 10 % de soro humano, 1 % de penicilina, 1 % de estreptomicina e 1 % de L-glutamina em RPMI 1640 e um dos seguintes estimulantes: Meio (controle), enterovírus infeccioso (coxsackievírus B4) (3 PFU/célula), CBV4 altamente purificado e tratado pelo calor na concentração de 1,0 μg/ml, análogo de dsRNA (agonista TLR-3) poli(I:C) na concentração de 5 μg/ml (Alexis Biochemicals, São Diego, CA, USA), agonista TLR7/8 Resiquimod na concentração de 5 μg/ml (Alexis Biochemicals), LPS do sorotipo J5 de E. coli (Re) como agonista TLR4 na concentração de 100 μg/ml (Alexis Biochemicals), bem como uma combinação de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) como ativador das células T policlonais.

O efeito do vírus nas células T reguladoras foi analisado medindo-se a expressão do mRNA específico de FoxP3 e IL-10. As análises foram feitas com o uso de RT-PCR e o sistema de PCR de tempo real 7900 HT Fast (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). O RNA foi extraído com o RNeasy Mini Kit de acordo com as instruções do fabricante. Durante a extração do RNA, uma digestão de DNase em coluna foi realizada com o RNase-Free DNase Set (Qiagen, Hilden, Alemanha). O RNA foi transcrito reverso usando a enzima de transcriptase reversa M-MLV e tampão 5 (Promega, Madison, WI, USA) e iniciadores de hexâmeros aleatórios. Para os ensaios de PCR de tempo real, iniciadores costumeiros para FoxP3 e IL-IO foram designados, enquanto os iniciadores para a proteína de TATA boxe (TBP) de ligação do gene de preparação foram de uma publicação anterior [27] com leve modificação no iniciador dianteiro. Cada conjunto de 10 iniciadores tem um iniciador abrangendo o bordo de éxon-éxon. As seqüências iniciadoras foram as seguintes: FoxP3 dianteira 5’-ACA GCA CAT TCC CAG AGT TCC-3’, reversa 5’-GAA CTC CAG CTC ATC CAC G-3’; IL-10 dianteira 5’-CAG TTT TAC CTG GAG GAG GTG-3’, reversa 5’-AGA TGC CTT TCT CTT GGA GCT TAT-3’; TBP dianteira 5’-CGA 15 ATA TAA TCC CAA GCG GTT-3 ’ e reversa 5 ’-ACT TCA CAT CAC AGC TCC CC-3\ O cDNA sintetizado foi amplificado com o Kit DyNAmo Flash SYBR Green qPCR (Finnzymes, Espoo, Finlândia). As condições térmicas de ciclagem foram de 7 minutos em 95 °C, 40 ciclo de 10 segundos em 95 °C, 30 segundos em 60 °C, e 30 segundos em 78 0C (para eliminação do dímero 20 preparador), seguidas pela extensão final em 60 0C por 1 minuto. Uma etapa de curva de dissociação variando as temperaturas de 60 0C a 95 0C foi adicionada no final de cada desenvolvimento. Para a análise dos dados, os valores do ciclo limite (Ct) de FOXP3 e IL-10 foram normalizados aos valores de Ct do gene TBP de controle endógeno. Os valores da expressão 25 relativos foram calculados com o uso do método Pfaffl como anteriormente descrito [28].

MÉTODOS ESTATÍSTICOS

As análises estatísticas foram realizadas com a versão 12,0 do programa da SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) e as análises de Confidence Interval (CIA) [29]. A preponderância do IgE específico, dos altos valores (> 100 IU/litro) do IgE total e dos anticorpos microbianos, foi comparada entre os dois cortes emparelhados com o uso do teste de McNemar. As comparações dos níveis de IgE totais (variável contínua com uma distribuição distorcida) entre os cortes emparelhados foram realizadas com o uso do teste Wilcoxon Signed Ranks. A tabulação cruzada e o teste de qui-quadrado ou o teste exato de Fisher foram aplicados para as análises das associações entre os anticorpos virais, os valores da IgE total e IgE específica na Carélia Russa e na Finlândia. O teste de Mann-Whitney U foi usado quando as associações entre os níveis totais de IgE e IgE específica (classificadas como positivas ou negativas) foram analisadas e, também, nas análises das associações entre os níveis de IgG de CBV4 e IgE específica. Como uma técnica multivariada, a regressão logística foi aplicada para identificar o efeito independente de cada parâmetro, quando apropriado. A seleção do modelo baseou-se em um procedimento dianteiro em etapas, em que o limite para entrar e remover o termo foi igual a 0,10. Os resultados são apoiados pela avaliação da razão de probabilidade (OR) e intervalos de confiança (CI) de 95 %. Se houvesse perdas ou valores indiferentes, os casos não eram incluídos nas análises que envolviam aqueles parâmetros particulares. O número de tais casos foi pequeno, por exemplo quanto às sorologias nas crianças carelianas russas, 0 a 2 casos de perdas por micróbio analisado. Todas as análises foram bilaterais. Valores P estatisticamente significativos (< 0,05) são fornecidos.

RESULTADOS

A preponderância da IgE específica de alérgeno foi significativamente mais baixa nas crianças carelianas russas do que nas crianças finlandesas (Tabela 1).

A preponderância do enterovírus e dos anticorpos vitais da hepatite A foi significativamente mais elevada nas crianças da Carélia Russa do que nas crianças na Finlândia (Tabela 2). Além disso, a sensibilização alérgica na Carélia Russa foi mais rara nas crianças que tinham anticorpos enterovirais, ao passo que nenhum de tal efeito foi observado em termos de anticorpos da hepatite A (Tabela 3). Ao todo 22 % das crianças que eram 5 negativas quanto ao enterovírus tiveram pelo menos um resultado de IgE específico positivo em comparação com os 5 % das crianças soropositivas. O nível médio de anticorpos enterovirais foi de 74 unidades de imunoensaios enzimáticos (EIU) (variação: O a 224) em crianças que não tinham nenhuma IgE específica em comparação com as 49 EIU (variação: O a 154) naquelas IO que tinham pelo menos uma IgE específica de alérgeno (P = 0,048).

Na Finlândia, o número de crianças soropositivas do HAV foi muito baixo (Tabela 2), o que tomou difícil analisar sua associação com a IgE específica de alérgeno. Entretanto, os anticorpos de enterovírus foram freqüentes nas crianças da Finlândia, mas, ao contrário daquelas da Carélia 15 Russa, elas não apresentaram nenhuma associação com as respostas da IgE específica de alérgeno (18 % das crianças soronegativas de enterovírus tinham pelo menos um resultado de IgE específico positivo em comparação com os

23 % das crianças soropositivas).

O fato de que uma associação entre infecções e a 20 predominância da atopia ter sido observada apenas nas crianças carelianas russas, mas não nas crianças finlandesas, pode ser explicado pela hipótese de que as crianças finlandesas são infectadas em uma idade mais avançada, já que a circulação dos enterovírus e de outros micróbios é conspicuamente mais baixa na Finlândia. De acordo com a hipótese de higiene, as infecções que 25 ocorrem durante os primeiros meses de vida são aquelas mais importantes, já que nesta idade elas podem ter um efeito marcante sobre a maturação do sistema imune associado com os intestinos e as vias reguladoras do desenvolvimento e o equilíbrio de Thl/Th2.

De modo a testar se o efeito protetor do enterovírus difere entre os diferentes sorotipos, analisamos ao todo 244 crianças carelianas russas quanto ao IgE específico do alérgeno e neutralizando anticorpos contra quatro diferentes sorotipos de enterovírus (CBV4, CBV5, ecovírus 9 e ecovírus 11). Tendo em vista que os anticorpos neutralizantes permanecem 5 elevados por décadas, a presença destes anticorpos indica infecção anterior pelo sorotipo, o que é usado no ensaio. O ecovírus 11 foi associado com forte proteção contra a sensibilização alérgica (Figura I). Ao todo 31,8% das crianças soronegativas de ecovírus 11 tiveram IgE específico de alérgeno em relação a pelo menos um dos três alérgenos mostrados na Tabela 1, em 10 comparação com apenas 13,2 % de crianças soropositivas de ecovírus 11 (P <

0,001). Na análise de regressão logística múltipla, a soropositividade do ecovírus 11 tinha um efeito independente nítido sobre a IgE específica do alérgeno (P < 0,001; OR3,2 [95 % de Cl 1,7 a 6,2]). Os resultados indicam que o efeito protetor dos enterovírus contra a sensibilização alérgica pode depender do sorotipo do vírus.

O efeito protetor do enterovírus contra a sensibilização alérgica pode ser mediado por seu efeito sobre o sistema imune. Acredita-se em geral que o desenvolvimento da sensibilização alérgica esteja relacionado com a regulação imune anormal. As células T reguladoras desempenham um 20 papel principal na regulação imune, e um mecanismo possível pelo qual o vírus pode mediar o efeito antialérgico observado é a ativação induzida pelo vírus destas células. As células T reguladoras especificamente expressam o fator de transcrição FoxP3 (células T reguladoras naturais) e secretam citocinas imunorreguladoras tais como IL-10 (células reguladoras Trl). 25 Particularmente a secreção da IL-10 pelas células Trl pode ser importante na desrregulagem negativa das respostas alérgicas [30]. Nós analisamos de o enterovírus poderia estimular as células reguladoras mediante a exposição das células mononucleares do sangue periférico ao enterovírus infeccioso ou o enterovírus purificado tratado pelo calor in vitro. A resposta induzida pelo vírus foi comparada com aquela obtida com os agonistas TLR [poli(I:C), LPS de E. coli] e ativador de células T policlonais (mistura dos anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28).

A exposição das células mononucleares ao CBV4 infeccioso leva a um nítido aumento (3,3 vezes) na expressão do mRNA específico de FoxP3 (Figura 2) e a um aumento de 3,6 vezes no mRNA especifico de IL-10 em comparação com as culturas de tratamento simulado (Figura 3). De forma semelhante, o CBV4 termicamente tratado resultou em um aumento de 1,9 vez no mRNA de FoxP3 e um aumento de 3 a 4 vezes no mRNA de IL-10. O poli(I:C) não induziu nem o mRNA de FoxP3 nem de IL-10, enquanto a combinação anti-CD3/anti-CD28 induziu a expressão tanto de FoxP3 quanto de IL-10 (aumentos de 8,1 e de 2,6 vezes, respectivamente). Resiquimod e LPS não induziram a expressão de FoxP3 (Figura 2), mas resultaram em um aumento nítido na expressão de IL-10. Estes resultados mostram que os enterovírus são capazes de ativar as células T reguladoras. A ativação induzida pelos enterovírus foi comparável com aquela obtida com o uso de um forte ativador das células T policlonais (mistura de anti-CD3/anti-CD28) apoiando a relevância biológica deste fenômeno. Além disso, o enterovírus foi capaz de induzir a expressão mais forte do FoxP3 do que os três agonistas clássicos de TLR e uma expressão de IL-10 tão forte quanto os agonistas de TLR4 e TLR7/8 (LPS e Resiquimod, respectivamente).

Assim sendo, estes resultados sugerem que as infecções dos enterovírus são associadas com um risco reduzido de sensibilização alérgica e podem modular o sistema imune de uma maneira que possa estimular as vias imunorreguladoras e por esse meio proteger contra doenças alérgicas. TABELA I. A PREVALÊNCIA (% E 95 % DE Cl) DO IgE ESPECÍFICO DO ALÉRGENO EM CRIANÇAS ESCOLARES NA FINLÂNDIA E NA CARÉLIA RUSSA

Finlândia Carélia Russa Valor P (n = 266) (n = 266) Gato 11% (8 a 16%) 2 % (1 a 5 %) <0,001 Bétula 11% (8 a 16%) 2 % (1 a 5 %) <0,001 Albúmen de ovo 6 % (4 a IO %) 3 % (2 a 6 %) 0,093 Pelo menos um positivo (22 % (17 a 27 %) 6% (4 a 10%) <0,001 TABELA 2. PREVALÊNCIA (% E 95 % DE Cl) DO ENTEROVÍRUS E DOS ANTICORPOS DO VÍRUS DA HEPATITE A EM CRIANÇAS ESCOLARES NA FINLÂNDIA E NA CARÉLIA RUSSA Finlândia Carélia Russa ValorP (n = 266) (n = 266) Enterovírus 77% (72 a 82%) 93% (90 a 96%) <0,001 VirusdaHepatiteA 2%*(la5%) 24% (19 a 29%) <0,001 $

Apenas 166 crianças finlandesas foram triadas quanto a anticorpos HAV * O antígeno de enterovírus usado neste ensaio foi o Coxsackievírus B4

altamente purificado, que foi tratado pelo calor para tomá-lo amplamente reativo com anticorpos contra diferentes sorotipos de enterovírus. TABELA 3

PROPORÇÃO DAS CRIANÇAS (% E 95 % DE Cl) POSITIVAS QUANTO A PELO MENOS UM IgE ESPECÍFICO DE ALÉRGENO EM RELAÇÃO À SOROPOSITIVIDADE QUANTO AO ENTEROVÍRUS E A ANTICORPOS DO VÍRUS DA HEPATITE A EM CRIANÇAS ESCOLARES NA CARÉLIA RUSSA

Soropositivo Soronegativo Valor P Modelo logístico* viral viral OR (95 % de Cl) Valor P Enterovírus 13/247 4/18 0,02 0,16 0,006 (5%; 3-9%) (22%; 9-45%) (0,04 a (0,6) Vírus da Hepatite A 5/63 12/201 0,579 NS (8%; 3-17%) (6%; 3-10%) $

NS: não significativo, um modelo dianteiro em etapas (para entrar e remoção 0,10)

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Claims (10)

1. Uso de enterovírus, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar de uma doença associada com a sensibilização alérgica mediada por IgE, em que o referido enterovírus não contém uma seqüência de ácido nucléico exógena que seja integrada no genoma viral e que codifique um alérgeno que induza referida sensibilização alérgica.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreende uma cepa de enterovírus ativos, uma cepa de enterovírus geneticamente modificados, uma cepa de enterovírus inativados, um componente estrutural derivado de uma cepa de enterovírus, ou uma combinação dos mesmos, tais como uma partícula tipo vírus.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreende o genoma ou um fragmento de genoma derivado de uma cepa de enterovírus.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada por via peroral, intracutânea, transcutânea, sublingual, intranasal, como uma inalação, pelo reto, ou por via parenteral mediante injeções.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é usada para prevenir ou tratar da asma, do eczema alérgico, da alergia a alimentos ou drogas, ou da rinite alérgica ou conjuntivite.

6. Uso de acordo com a reivindicação 1 ,caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é administrada a uma criança dentro dos 2 anos após o nascimento.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as composições farmacêuticas contendo diferentes sorotipos de enterovírus são administradas ou simultaneamente, ou em série.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é usada para prevenir sintomas alérgicos em indivíduos sensibilizados, ou para aliviar os sintomas alérgicos em indivíduos sensibilizados.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica contendo o enterovírus é administrada em combinação com um alérgeno.

10. Método para prevenir ou tratar de uma doença associada com a sensibilização alérgica, caracterizado pelo fato de que uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica contendo o enterovírus é administrada a uma pessoa em necessidade do mesmo, e em que referido enterovírus não contém uma seqüência de ácido nucléico exógena que seja integrada no genoma viral e que codifique um alérgeno que induza referida sensibilização alérgica.