BRPI0805852A2 - polÍmeros Ácidos protÉicos, processos de produÇço, uso de polÍmeros Ácidos protÉicos, composiÇço farmacÊutica e mÉtodo de tratamento - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a polimeros ácidos protéicos (pLNs) que possuem propriedades específicas para reduzir o dano tissular e melhorar a recuperação funcional após uma lesão; ao processo de produção dos ditos polimeros ácidos protéicos. Os ditos pLNs são obtidos preferencialmente com a utilização da proteína laminina diluída em um meio a pH ácido na presença de um cátion divalente. O uso dos ditos polímeros ácido protéicos para a produção de um medicamento, uma composição farmacêutica contendo tais pLNs e um método de tratamento de animais acometidos por lesões tissulares traumáticas, degenerativas ou inflamatórias nos tecidos nervoso, muscular, epitelial e conjuntivo, também são objetos desta invenção.

Description

Relatório Descritivo

Patente de Invenção: "Polímeros Ácidos Protéicos, Processos deProdução, Uso de Polímeros Ácidos Protéicos, Composição Farmacêuticae Método de Tratamento"

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a polímeros ácidos protéicos, ao processode polimerização de uma proteína em meio ácido e ao uso do dito polímeroprotéico. Mais especificamente, a proteína polimerizada aqui descrita é aIaminina polimerizada, extremamente efetiva como agente promotor daregeneração tissular em animais mamíferos humanos ou não humanos, devidoa seu extraordinário efeito antiinflamatório.

A invenção também se refere a uma composição farmacêutica contendoum polímero ácido protéico, voltado para o tratamento de animais mamíferos,humanos ou não humanos, acometidos por lesões tissulares traumáticas,degenerativas ou inflamatórias.

O uso dos ditos polímeros ácidos protéicos para a produção de ummedicamento voltado, principalmente, para o tratamento de lesõesneurológicas, raquimedulares, o tratamento de distrofias musculares e decardiopatias também é um alvo desta invenção.

O uso dos ditos polímeros ácidos protéicos para a produção de ummedicamento voltado, principalmente, para o tratamento de inflamações nostecidos nervoso, músculo esquelético, músculo liso, músculo cardíaco, epitéliode revestimento, tecido adiposo, epitélio-conjuntivo de modo geral, também éum alvo desta invenção.A invenção também se refere a um método de tratamento de animaismamíferos humanos ou não humanos, acometidos por lesões traumáticas,degenerativas ou inflamatórias no grupo de tecidos compreendendo o tecidonervoso, músculo esquelético, músculo liso, músculo cardíaco, epitélio derevestimento, tecido adiposo, epitélio-conjuntivo de modo geral, baseado naadministração de um medicamento contendo um polímero ácido protéico a umanimal mamífero humano ou não humano, acometido de uma lesão no sistemanervoso.

Finalmente, a invenção trata de um método de tratamento de doençasinflamatórias baseadas na administração de um medicamento contendo umpolímero ácido protéico a um animal mamífero ou não mamífero.

Antecedentes da Invenção

A Iaminina é uma proteína da matriz extracelular descrita originalmentena década de 70 e que possui uma estrutura trimérica, constituída por umacadeia mais longa, a cadeia alfa e duas cadeias mais curtas, chamadas beta egama. Estas três se associam através de interações "coiled-coil" dando origema uma proteína de aproximadamente 800 KDa com a forma de uma cruz. Estaproteína foi inicialmente purificada de um extrato da massa tumoral de umtumor de camundongo denominado EHS, que produz um excesso de umaestrutura laminar conhecida como membrana basal (lâmina basal).

Posteriormente descobriu-se que a proteína inicialmente descrita correspondiaa uma isoforma de um conjunto ou família de proteínas relacionadas, que hojeconta com 15 membros. A proteína isolada de EHS passou a ser denominadalaminina-1 (LN-1), e mais recentemente de LN111. A LN-1 é expressamajoritariamente em tecidos embrionários, mas também está presente emanimais adultos, porém não no tecido nervoso propriamente dito. A expressãode laminina no tecido nervoso adulto foi detalhadamente estudada em 1989. Oaumento de sua expressão está relacionado nitidamente a processosregenerativos sejam em invertebrados, sejam em regiões do cérebro demamíferos onde ocorre crescimento axonal durante a vida adulta.

A patente americana US 4,829,000, de titularidade de The United Statesof América as represented by the Secretary of the Department of Health andHuman Service e intitulada "Reconstituted basement membrane complex withbiological activity", descreve a produção e a utilização de um extrato demembrana basal de camundongos, denominado Matrigel, de onde se podeextrair a laminina.

A patente americana US 6,632,790, de titularidade de University ofMedicine and Dentistry of New Jersey e intitulado "Laminin 2 and methods forits use", descreve a produção e os possíveis usos da laminina 2 recombinantehumana, também chamada de LN-2, e mais recentemente de LN-211. Umponto a ser ressaltado aqui é que a utilização desta proteína para o tratamentode lesões raquimedulares não foi prevista naquela patente. Além disso, nãoexiste nenhuma sugestão de que a laminina 2 recombinante humana, assimcomo nenhuma outra isoforma da proteína, que pudesse ser polimerizada empH ácido.

A patente Americana US 5,019,087, de titularidade de AmericanBiomaterials Corporation e intitulada "Nerve regeneration conduit", descrevepróteses tubulares para a regeneração de nervos periféricos. As próteses sãoconstituídas de colágeno I ou colágeno I mais laminina. É interessante quecomo a solubilização do colágeno I demanda pH ácido, no momento da adiçãoda laminina o pH já está ácido. Isto não feito te forma proposital, apenascircunstancial.

O pedido interncaional WO 03/035675, intitulado "Biologically activepeptides and their use for repairing injured nerves" descreve pequenospeptídeos derivados da seqüência da laminina-1, contendo o tripeptideo KDI,que podem promover a recuperação dos movimentos após uma transecção damedula espinhal. Nessa patente emprega-se apenas um pequeno fragmentoda proteína.

Em 2000, Freire e Coelho-Sampaio demonstraram que na temperaturade 35°C a LN-1 em baixas concentrações (entre 5nM a 60nM) é capaz de seauto-polimerizar, caso a solução em que ela esteja contida seja ácida, e deforma mais efetiva, apresente pH de 4,0. Neste experimento era fundamentalque houvesse o pré-tratamento das cubetas de quartzo, nas quais a lamininaficava contida, com material antiaderente, no caso, o silano. Este tratamentocom silano foi essencial para se manter a laminina polimerizada em seu estadosolúvel e não aderido às paredes da cubeta de quartzo.

Em 2002, Freire et al, demonstraram que polímeros produzidos a partirda adsorção em uma superfície de vidro da laminina em pH ácido (matriz delaminina ácida) desempenhavam um papel na diferenciação e migração deneurônios embrionários em cultura de células ou de explantes de tecidocortical, ou seja, in vitro. Este trabalho não apresenta nenhum ensaio in vivo enão faz qualquer demonstração de outros possíveis papeis de tais polímerosde laminina, como por exemplo, a regeneração neural.

Dessa forma, a presente invenção visa preencher todas as lacunasdeixadas no estado da técnica, descrevendo um novo processo, mais eficientepara produção da laminina polimerizada em meio ácido e o emprego destaproteína polimerizada no tratamento de lesões raquimedulares em modeloanimal.

Sumário da Invenção

É um objeto da invenção, um polímero ácido protéico que possuipropriedades regenerativas e antiinflamatórias de lesões traumáticas,degenerativas ou inflamatórias no grupo de tecidos compreendendo o tecidonervoso, músculo esquelético, músculo liso, músculo cardíaco, epitélio derevestimento, tecido adiposo, epitélio-conjuntivo de modo geral; que napresença de meio de pH ácido e de um cátion divalente se polimeriza de modoindependente da presença da membrana de celular e do meio extracelular.

É um objeto adicional da presente invenção um processo de produçãode polímeros protéicos produzidos em uma solução contendo pH ácido, a partirde uma proteína com concentração compreendida entre 80 nM e 1μΜ, sendorealizado a temperatura entre 10 a 35°C, em meio ácido, na presença de umcátion divalente, durante um período de tempo máximo de 12 horas e ocorrerno interior de recipientes produzidos com material inerte, livre decontaminantes e sem pré-tratamento com substâncias anti-aderentes.

Um outro objeto da presente invenção trata de uma composiçãofarmacêutica que contém uma quantidade farmaceuticamente eficaz de umpolímero ácido protéico e componentes não ativos, que sejamfarmaceuticamente aceitáveis.

É ainda um objeto da presente invenção, o uso dos ditos polímerosácidos protéicos para a produção de um medicamento útil no tratamento delesões traumáticas, degenerativas ou inflamatórias no grupo de tecidoscompreendendo o tecido nervoso, tecido músculo esquelético, músculo liso,músculo cardíaco, epitélio de revestimento, tecido adiposo e epitélio-conjuntivode modo geral, tais como o tratamento de lesões raquimedulares, pulmonares,distrofias musculares e cardiopatias em geral, baseado na aplicação de umaquantidade terapeuticamente eficaz dos polímeros protéicos, sobre a regiãolesada de um animal mamífero humano ou não humano, portador de uma lesão.

É ainda um objeto da presente invenção, o uso dos ditos polímerosácidos protéicos para a produção de um medicamento útil no tratamento deinflamações no grupo de tecidos compreendendo o tecido nervoso, tecidomúsculo esquelético, músculo liso, músculo cardíaco, epitélio de revestimento,tecido adiposo e epitélio-conjuntivo de modo geral, baseado na aplicação deuma quantidade terapeuticamente eficaz dos polímeros protéicos em umanimal mamífero humano ou não humano, portador de uma lesão.

Um outro objeto desta invenção se trata de um método de tratamento delesões traumáticas, degenerativas ou inflamatórias do grupo de tecidoscompreendendo o tecido nervoso, músculo esquelético, músculo liso, músculocardíaco, epitélio de revestimento, tecido adiposo, epitélio-conjuntivo de modogeral , baseado na administração de um medicamento contendo um polímeroácido protéico a um animal mamífero humano ou não humano, acometido deuma lesão no sistema nervoso.

O último objeto desta invenção se trata de um método de tratamento deinflamações grupo de tecidos compreendendo o tecido nervoso, músculoesquelético, músculo liso, músculo cardíaco, epitélio de revestimento, tecidoadiposo, epitélio-conjuntivo de modo geral, baseado na administração de ummedicamento contendo um polímero ácido protéico a um animal mamíferohumano ou não humano.

Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra um gráfico de BBB score versus semanas após alesão, comprovando a eficácia do polímero ácido de Iaminina na melhora daperformance no teste de locomoção em campo aberto (BBB) após lesãomedular por compressão. São mostrados perfis de recuperação funcionalobservados após o tratamento com o pLN(·), comparado aos controles nãoefetivos: Iaminina diluída em pH 7,0 (·), tampão ácido sem proteína(T),tampão neutro sem proteína(A).

A Figura 2 mostra a recuperação do tecido nervoso onde a lesãomedular por compressão foi induzida, após a aplicação do polímero ácido delaminina. Em A controle tratado com tampão ácido somente, em B animaltratado com o polímero ácido de laminina, ambos analisados 8 semanas após alesão.

A Figura 3 mostra o efeito de inibição da proteína GFAP promovido pelotratamento com polímero ácido de laminina. Em A pode-se observar a área dacavidade cística formada 8 semanas após a lesão no animal controle tratadocom tampão ácido somente. Observa-se também uma elevada expressão deGFAP. Em B observa-se a diminuição da área da cavidade nos animaistratados com o polímero ácido de laminina, bem como a diminuição daexpressão de GFAP. Ambos animais analisados em 8 semanas após a lesão.

A Figura 4 mostra a expressão da proteína indicadora da regeneraçãoneuronal, GAP-43 8 semanas após a lesão. Em A, animais controle tratadoscom tampão ácido somente; em B animais tratados com o polímero ácido delaminina.

A Figura 5 mostra a marcação para macrófagos (anticorpo ED1), 8semanas após a lesão. Em A, animais controle tratados com tampão ácidosomente; em B, animais tratados com o polímero ácido de laminina. Oresultado indica que o efeito do tratamento com o polímero ácido de lamininainclua uma redução da inflamação através da inibição da infiltração demacrófagos na região da lesão.

A Figura 6 mostra os níveis séricos de proteína C reativa uma semanaapós a lesão. A análise dos valores obtidos em cada condição revela que otratamento com o polímero ácido de laminina promove uma diminuição dainflamação sistêmica, corroborando a hipótese de que a melhora funcionalobservada nos animais tratados envolva um efeito anti-inflamatório dopolímero.

A Figura 7 mostra os espectros de espalhamento de luz de amostras dopolímero ácido formado pela LN-2 recombinante humana (linha contínua) oucontrole em pH 7 (linha tracejada).A Figura 8 mostra um gráfico de BBB score versus semanas após alesão de transecção. São mostrados os perfis de recuperação funcionalobservados: animais tratados com pLN-1 (A), polímeros de Iaminina purificadade placenta humana (■) e pLN-2 (·). Como controle é mostrada a recuperaçãoobtida na ausência de laminina(T).

A figura 9 mostra o efeito anti-inflamatório geral do pLN no organismo,apresentando o número total de células presentes no lavado broncoalveolar decamundongos submetidos à inalação de LPS.

Descrição detalhada da Invenção

A presente invenção descreve polímeros ácidos protéicos queapresentam atividade regenerativa e antiinflamatória em lesões traumáticas,degenerativas ou inflamatórias tissulares ocorridas no grupo de tecidoscompreendendo o tecido nervoso, músculo esquelético, músculo liso, músculocardíaco, epitélio de revestimento, tecido adiposo, epitélio-conjuntivo de modogeral; sendo formados pela polimerização de uma determinada proteína napresença de meio de pH ácido, de um cátion divalente e temperaturaadequados; de modo independente da presença da membrana celular, damembrana basal e do meio extracelular, sendo formados in vitro, dentro derecipientes produzidos em qualquer material inerte, livre de contaminantes esem pré-tratamento com substâncias anti-aderentes.

Os polímeros ácidos protéicos objeto desta invenção são formadospreferencialmente pela interação entre os braços curtos de cada molécula delaminina, sem que ocorra a ligação cruzada entre braços longos e curtos damolécula de laminina.Nesta invenção, entende-se por região lesionada, qualquer órgão animalformado pelos tecidos tecido nervoso, músculo esquelético, músculo liso,músculo cardíaco, epitélio de revestimento, tecido adiposo, epitélio-conjuntivode modo geral; incluindo órgãos tais como cérebro, medula raquidiana,músculos, coração, glândulas e pulmão.

Na natureza, também é verificada a existência de polímeros de laminina,que formam uma matriz protéica. A formação desta matriz ocorre sem que hajainterações cruzadas entre braços longos e curtos da laminina. O impedimentode tais interações é conseguido em condições naturais quando os braçoslongos das moléculas de laminina interagem com os receptores específicos damembrana celular. Portanto, é essencial que na natureza ocorra à ancoragemdos braços longos da laminina aos receptores localizados na membrana celularpara que não ocorra a interação cruzada entre os braços longos e curtos demoléculas de laminina adjacentes.

No caso dos polímeros de laminina objeto desta invenção que sãoformados in vitro, a inibição das reações cruzadas entre as cadeias longas ecurtas das moléculas de laminina adjacentes ocorre devido à acidificação domeio em que tais polímeros foram formados. Desta forma a acidificação domeio mimetiza a ação dos ditos receptores de membrana celular, que estãoausentes no objeto desta invenção.

Nos testes realizados, foi verificado que a atividade regenerativa tecidualmediada pelos polímeros ácidos protéicos desenvolvidos por esta invenção, éaumentada quando ocorre a aplicação dos ditos polímeros ácidos protéicossobre a região lesionada em um curto período de tempo após a lesão.A maior efetividade dos polímeros ácidos protéicos, quando aplicadossobre a lesão em um período curto de tempo após o acontecimento da lesãotraumáticas, degenerativas ou inflamatórias ocorre devido à capacidadeantiinflamatória promovida pelos polímeros ácidos desta invenção. Estacapacidade antiinflamatória ocorre, pois tais polímeros ácidos protéicos atuamna manutenção dos níveis séricos basais de proteína C reativa e, na promoçãoda redução da mobilização de macrófagos para a região lesionada. Em tecidos,como o tecido nervoso, esta preservação é percebida pela redução daformação de uma cavidade cística, pela diminuição da expressão de GFAP etambém do número de astrócitos ativados na região do dano. Outrodeterminante desta preservação tissular é a redução do processo ínflamatórionatural que ocorre no local da lesão, demonstrado pela redução do infiltrado demacrófagos e manutenção dos níveis séricos basais de proteína C reativa.Esses últimos efeitos induzidos pelo polímero ácido protéico desta invenção,que torna o ambiente no local da lesão mais permissivo para a ocorrênciaregeneração, como por exemplo, a regeneração axonal e broncoalveolar.

Além disto, também foi verificado que os polímeros ácidos protéicos alvodesta invenção, são capazes de promover a regeneração, no grupo de tecidoscompreendendo o tecido nervoso, músculo esquelético, músculo liso, músculocardíaco, epitélio de revestimento, tecido adiposo, epitélio-conjuntivo de modogeral, devido à ativação das rotas celulares de produção da proteína associadaao crescimento-43 (GAP43). Sabidamente, no tecido nervoso, esta proteínadesempenha um importante papel na formação, regeneração e plasticidadedos neuritos.Devido aos mecanismos de ação desempenhados pelos polímerosácidos protéicos alvo desta invenção, tais polímeros possuem um papel efetivo,e nunca dantes demonstrado na promoção da regeneração de lesõestraumáticas, degenerativas ou inflamatórias tissulares em animais mamíferoshumanos e não humanos.

Os polímeros ácidos protéicos alvo desta invenção podem ser úteis notratamento de lesões traumáticas, degenerativas ou inflamatórias no grupo detecidos compreendendo o tecido nervoso, músculo esquelético, músculo liso,músculo cardíaco, epitélio de revestimento, tecido adiposo, epitélio-conjuntivode modo geral. Preferencialmente, o uso dos ditos polímero ácido protéico nãose restringem somente ao tratamento de lesões raquimedulares e inflamaçõespulmonares. Pois além de tais polímeros induzem à neuroproteção eregeneração de fibras nervosas, podendo ser empregados no tratamento deoutras lesões traumáticas ou degenerativas do sistema nervoso central eperiférico, onde ocorra perda do tecido nervoso, bem como no tratamento dedistrofias musculares, cardiopatias.

Uma vantagem dos polímeros ácidos protéicos aqui descritos, é a suacapacidade de se auto-polimerizar desde que sejam envolvidas em um meioregulado com o pH ácido adequado. Além disso, foi demonstrado que ospolímeros ácidos protéicos formados, devido a sua capacidade regenerativa eantiinflamatória, são capazes de devolver a explantes de córtex cerebral deanimais nascidos a plasticidade neuronal perdida durante o desenvolvimento,além de promover a regeneração morfológica do tecido nervoso, bem como arecuperação funcional dos animais mamíferos portadores de uma tesãoraq ui medular.

Foi demonstrado ainda, que a capacidade antiinflamatória dos ditospolímeros ácidos protéicos desta invenção é sistêmico e não meramentelocalizada, pois ocorre em diferentes tecidos do organismo, tais como; tecidonervoso, músculo esquelético, músculo liso, músculo cardíaco, epitélio derevestimento, tecido adiposo e epitélio-conjuntivo de modo geral.

Os polímeros ácidos protéicos que são objeto desta invenção sãopreferencialmente, os agentes terapêuticos mais efetivos já descritos até hojepara impedir a degeneração e induzir a regeneração do tecido medular e,consequentemente, permitir a recuperação da locomoção e sensibilidade dosanimais tratados.

Ainda preferencialmente, os ditos polímeros ácidos protéicos destainvenção são agentes terapêuticos efetivos no combate a lesões inflamatóriasórgãos dos sistemas respiratório e nervoso.

Preferencialmente os polímeros ácidos protéicos objeto desta invençãosão polímeros de laminina, podendo ser utilizadas para produção destespolímeros de laminina, tanto a LN-1 extraída do tumor murino EHS, a LN-2recombinante humana ou a LN humana extraída de placenta.

Doravante, os polímeros ácidos protéicos serão simplesmentechamados de pLN, entretanto, devemos ressalvar que tal abreviatura não devesignificar em nenhuma hipótese a limitação da natureza de tais polímerossomente às proteínas da classe das lamininas.O processo de produção dos pLNs aqui descritos, tem início com aadição de uma elevada concentração de uma determinada proteína a serpolimerizada, em meio contendo pH ácido contendo um cátion divalente,devendo ser realizado a temperatura superior a 10°C e inferior a 35°C, nãorequerendo o pré-tratamento do recipiente onde ocorrerá a polimerização comsubstâncias anti-aderentes.

Além da vantagem de dispensar o pré-tratamento do recipiente ondeocorrerá a produção dos pLNs com substâncias anti-aderentes, tais como osilano; o processo de produção dos ditos pLNs objeto desta invenção é efetivoem promover a polimerização de uma elevada concentração da proteína queapós ser polimerizada, produzirá o referido pLN. As concentrações de proteínaempregadas neste processo variam entre 80 nM a 1μΜ, preferencialmente, oprocesso é capaz de proporcionar a polimerização de uma proteína naconcentração entre 90nM a 900nM; mais preferencialmente ainda, entre 95nMa 300nM.

Um outro fator que diferencia o processo de produção dos pLNs objetodesta invenção, com os processos de polimerização de proteína em meio ácidodescritos anteriormente, é o fato de o mesmo ocorrer na temperatura ambiente,ou seja, aproximadamente 25 0C, e ser efetivo em pH compreendido entre 3,0e 6,0, ocorrendo preferencialmente em pH entre 4,5 a 5,5. A solução ácidaempregada neste processo, é qualquer solução ácida empregada usualmenteem bioquímica, ou biologia celular, cultura de células ou tecidos celulares ouem animais in vivo.O cátion divalente necessário para que a polimerização ocorra épreferencialmente o cálcio e, todo o processo de polimerização ocorre em umperíodo máximo de 12 horas, sendo que preferencialmente o tempo necessáriopara ocorrer à polimerização é de no máximo 2 horas. Mais preferencialmenteainda, o processo ocorre em um período máximo de 10 minutos.

O recipiente necessário para a realização do processo de polimerizaçãoobjeto desta invenção, é um recipiente produzido em qualquer material inerte,livre de contaminantes e sem pré-tratamento com substâncias anti-aderentes,como o silano. O recipiente pode ser produzido em um formato qualquer,dentre as formas normalmente empregadas na produção de recipientesquímicos, clínicos e farmacêuticos, sendo os materiais preferivelmenteempregados o plástico ou, o vidro.

A composição farmacêutica alvo objeto desta invenção contém umaquantidade farmaceuticamente eficaz de um pLN, objeto desta invenção, eagentes não ativos, tais como adjuvantes, estabilizantes, diluentes elubrificantes. Preferencialmente a dita composição farmacêutica contém umaquantidade farmaceuticamente eficaz de um pLN descrito por esta invenção.

Nesta invenção, entende-se por quantidade farmaceuticamente eficaz, oquantitativo de pNLs capaz de desencadear um efeito desejável em um animalmamífero humano ou não humano.

Portanto, os pLNs alvo desta invenção podem ser utilizados na produçãode um medicamento voltado para o tratamento de lesões tissularestraumáticas, degenerativas ou inflamatórias, tais como, lesões no grupo detecidos compreendendo o tecido nervoso, músculo esquelético, músculo liso,músculo cardíaco, epitélio de revestimento, tecido adiposo, epitélio-conjuntivode modo geral; preferivelmente, dentre as lesões que podem ser tratadas pelomedicamento contendo os pLNs, temos a lesão raquimedular, distrofiasmusculares, cardiopatias e lesões pulmonares de animais mamíferos, humanoou não humano.

Os pNLs também podem ser utilizados na produção de um medicamentovoltado, principalmente, para o tratamento de inflamações nos tecidos nervoso,músculo esquelético, músculo liso, músculo cardíaco, epitélio de revestimento,tecido adiposo, epitélio-conjuntivo de modo geral.

Os medicamentos descritos nesta invenção podem ser encontrados nasformas farmacêuticas conhecidas pelo homem da arte, desde que sejamaquelas que possibilitem a aplicação do dito medicamento diretamente sobre aárea lesionada.

O método de tratamento objeto desta invenção pode ser empregado notratamento de lesões tissulares traumáticas, degenerativas ou inflamatórias nogrupo de tecidos compreendendo o tecido nervoso, músculo esquelético,músculo liso, músculo cardíaco, epitélio de revestimento, tecido adiposo,epitélio-conjuntivo de modo geral. Dentre as lesões às quais o método detratamento alvo desta invenção é eficaz, citamos como exemplo a lesãoraquimedular, distrofias musculares, cardiopatias e lesões pulmonares de umanimal mamífero humano ou não humano.

De acordo com o método de tratamento desta invenção, devem seraplicado entre 0,1 ng/kg a 1 μg/kg de um pLN diretamente sobre o local dalesão raquimedular, em um período de tempo inferior a 30 dias após aocorrência da lesão.

Preferencialmente, deve ser aplicado entre 0,5 a 500ng/kg de um pLNdiretamente sobre a região Iesionada de um animal mamífero; e maispreferencialmente ainda, o método de tratamento alvo desta invenção requer aaplicação diretamente sobre a região Iesionada em mamíferos portadores deum lesão traumáticas, degenerativas ou inflamatórias de uma quantidade entre1 a 250 ng/kg de um pLN, em um período de tempo inferior a 15 dias doacontecimento da lesão.

Os exemplos a seguir são referentes aos testes realizados para secomprovar a eficiência tanto dos próprios pLNs descritos, como do processo deprodução do pLNs alvo desta invenção, assim como, da utilidade clínicaterapêutica dos ditos pLNs, sendo meramente ilustrativos e, não devendo serutilizados na delimitação dos direitos desta invenção.

Os testes foram divididos em três etapas, como descrito abaixo, duranteas quais foram utilizadas dois tipos de pLNs distintos: o pLN-1 correspondenteao polímero obtido pela polimerização da proteína extraída de um tumor murinoEHS; e o pLN-2 - correspondente ao polímero obtido da Iaminina recombinantehumana expressa em célula de mamíferos.

Exemplo 1: produção dos pLNs

A primeira etapa da descrição da invenção é a polimerização da Iamininaem pH ácido. A proteína a ser utilizada pode ser a LN-1 extraída do tumormurino EHS ou a LN-2 recombinante humana. A polimerização foi feitadiluindo-se a proteína em tampão Tris-acetato na concentração de 20 mM, pHentre 4, contendo 1 mM de cloreto de cálcio, sendo o cálcio indispensável parao processo de polimerização. A proteína, previamente aliquotada em volumessuficientes para o tratamento do animal, é retirada do freezer a -20°C, econservada em gelo até o momento da injeção no animal, o que ocorre após alesão, preferencialmente entre 20 e 60 minutos após a lesão. O tampão acetatopreviamente é mantido a temperatura ambiente (25°C) é adicionado à alíquotade Iaminina contida em um tubo plástico (do tipo eppendorf), e a misturahomogeneizada suavemente com a própria ponteira da pipeta. A concentraçãofinal de Iaminina varia entre 50 e 200 μg/ml. Entre 5 e 10 μΙ desta suspensãosão injetados no animal preferencialmente entre 20 e 60 minutos após a lesão.

Em um teste utilizou-se a LN-1 a 100 μg/ml, em tampão pH 4,5, sendo 5 μΙinjetados na medula do animal 30 minutos após a lesão, e em outro teste foiutilizado a LN-2 recombinante na concentração de 120 μρ/ηιΙ, em tampão pH4,5, sendo injetados 10 μΙ da suspensão.

Exemplo 2: Realização dos testes

No exemplo aqui relatado foi utilizada uma lesão por compressão entre aoitava e a nona vértebras torácicas (T8-T9), gerada quando um cateterposicionado entre a medula e a vértebra é inflado. O catéter foi do tipo Fogarty2F e o volume de solução salina utilizado para inflá-lo foi de 15μΙ. Nesse caso,o animal não tratado perde o funcionamento correto das patas traseiras, o queé parcialmente recuperado ao longo de 8 semanas, sendo que permanece umalesão cística no interior da medula, mesmo após o animal ter atingido suamelhor capacidade de locomoção ao final da oitava semana (BBB = 18). Acirurgia para a introdução do cateter foi realizada anestesiando-se o animalcom um coquetel de xilasina, acepromazina e cetamina ao que se segue umaIaminectomia ao nível da sétima vértebra torácica (T7). Após a lesão porcompressão foram feitas as injeções de LN-1 ácida (pLN-1), pLN-2 ácida (pLN-2), veículos (tampão acetato pH 4 ou tampão tris pH 7). As injeções foramfeitas localmente (injeções intramedulares) conforme descrito acima.

Após o tratamento, injetou-se ainda 10 ml de solução Ringer parareposição hídrica e iônica. Posteriormente, os animais foram tratados comantibiótico (sulfato de gentamicina), para reduzir a probabilidade de infecções,principalmente urinária, e analgésicos, para minimizar a sensação de dordevida à cirurgia.

O acompanhamento da função Iocomotora destes animais através daescala BBB (Basso, Beatie e Bresnahan) revelou que os animais tratados compLN apresentavam uma recuperação funcional muito mais rápida do queaqueles tratados com veículo. A Figura 1 mostra que já em 6 semanas osanimais tratados receberam uma nota média do BBB de 20, o que correspondea uma locomoção quase normal, enquanto os animais não tratados chegam auma nota máxima de 17 após 8 semanas. A análise morfológica darecuperação tecidual revela que enquanto os animais controle (não tratadoscom pLN) apresentaram uma extensa cavidade cística no local da lesão, osanimais tratados tiveram um tecido morfologicamente mais organizado, comopode ser observado na figura 2.

Os resultados documentados nesta invenção foram obtidos com LN-1extraída e purificada do tumor EHS de camundongo. Como o uso de umaproteína obtida de fonte animal pode levar à transmissão e adaptação de vírusanimais, foi proposto que a Iaminina humana fosse empregada em terapiascom pacientes humanos. Resultados semelhantes àqueles aqui apresentadosforam obtidos com a LN-2 recombinante humana e são mostrados na figura 8.Exemplo 3: Aplicação da laminína

A aplicação da Iaminina foi realizada por intermédio de uma injeçãocontrolada manualmente, de forma que aproximadamente 1μΙ penetrasse notecido a cada minuto. O local foi exatamente no sítio da compressão ou naregião proximal da medula em relação à lesão, no caso de transecção. Aseringa de injeção foi do tipo Hamilton 80330 para 10μΙ.

A presente invenção é uma solução para o tratamento das lesõesraquimedulares, sendo inovadora porque basicamente não existem estratégiasterapêuticas para esse tipo de lesão. O tratamento convencional disponívelatualmente visa frear a progressão do dano inicial, ou seja, tenta reduzir areação inflamatória e o dano tecidual secundário. Este tratamento consiste naestabilização cirúrgica da coluna vertebral e tratamento com metilprednisolonae não resulta em benefício consistente para o paciente. A Iamininapolimerizada em pH ácido aqui proposta consegue induzir a regeneração dotecido nervoso lesado em uma compressão, contusão ou transecção da medula espinhal.

Claims (20)

1.) Polímeros ácidos protéicos que apresentam atividade regenerativa eantiinflamatória; sendo formados pela polimerização de uma proteína napresença de meio de pH ácido e de um cátion divalente.

2.) Polímeros de acordo com a reivindicação 1 em que a dita proteínapolimerizada é preferencialmente a laminina.

3.) Polímeros de acordo com a reivindicação 2 em que a lamininapolimerizada pode ser: a LN-1 extraída do tumor murino EHS, ou a LN-2recombinante humana, ou a laminina extraída de placenta humana, ouainda uma combinação das mesmas.

4.) Polímeros de acordo com a reivindicação 1 que apresentampropriedades regenerativas e antiinflamatórias em lesões traumáticas,degenerativas ou inflamatórias no grupo de tecidos compreendendo otecido nervoso, músculo esquelético, músculo liso, músculo cardíaco,epitélio de revestimento, tecido adiposo, epitélio-conjuntivo de modogeral.

5.) Processo de produção de polímeros ácidos protéicos compreendendoa etapa de acrescentar uma elevada concentração de uma determinadaproteína a ser polimerizada em meio contendo pH ácido contendo umcátion divalente, devendo ser realizado a temperatura superior a 10°C einferior a 35°C, durante um período de tempo máximo de 12 horas.

6.) Processo de acordo com a reivindicação 5 em que a temperatura dereação é aproximadamente 25°C; e o meio ácido possui pH entre 3,0 e 6,0.

7.) Processo de acordo com a reivindicação 5 em que o cálcio é o cátiondivalente.

8.) Processo de acordo com a reivindicação 5 no qual o a polimerizaçãoocorre no máximo em 2 horas.

9.) Processo de acordo com a reivindicação 6 compreendendo o pH nafaixa entre 4,0 e 5,5.

10.) Processo de acordo com a reivindicação 5 tendo capacidade depolimerizar proteínas na concentração entre 80nM a 1μΜ.

11.) Processo de acordo com a reivindicação 10 tendo capacidade depolimerizar proteínas na concentração entre 90nM a 500μΜ.

12.) Processo de acordo com a reivindicação 11 tendo capacidade depolimerizar proteínas na concentração entre 95nM a 300μΜ.

13.) Composição farmacêutica compreendendo uma quantidadefarmaceuticamente eficaz de um polímero ácido protéico e componentesnão ativos.

14.) Composição de acordo com a reivindicação 13 compreendendo umaquantidade farmaceuticamente aceitável de um polímero ácido protéicode laminina.

15.) Método de tratamento de lesões tissulares traumáticas, degenerativasou inflamatórias no grupo de tecidos compreendendo o tecido nervoso,músculo esquelético, músculo liso, músculo cardíaco, epitélio derevestimento, tecido adiposo e epitélio-conjuntivo que compreende aaplicação de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polímeroácido protéico em um animal mamífero.

16.) Método de tratamento de acordo com a reivindicação 15 quecompreende a aplicação de uma quantidade entre 0,^g/kg a 1ng/kg deum polímero ácido protéico sobre lesões tissulares traumáticas,degenerativas ou inflamatórias como a lesão raquimedular, distrofiasmusculares, cardiopatias e lesões pulmonares de um animal mamíferohumano ou não humano.

17.) Método de tratamento de acordo com a reivindicação 16 quecompreende a aplicação de uma quantidade entre 0,5 a 50(Vg/kg depolímero ácido protéico diretamente sobre a área lesionada.

18.) Método de tratamento de acordo com a reivindicação 17 quecompreende a aplicação de uma quantidade entre 1 a 250 μg/kg depolímero ácido protéico sobre a lesão tissulares traumáticas,degenerativas ou inflamatórias em um animal mamífero humano ou nãohumano.

19.) Uso de polímeros ácidos protéicos na fabricação de um medicamentopara o tratamento de lesões traumáticas, degenerativas ou inflamatóriasgrupo de tecidos compreendendo o tecido nervoso, músculo esquelético,músculo liso, músculo cardíaco, epitélio de revestimento, tecido adiposo,epitélio-conjuntivo.

20.) Uso de polímeros ácidos protéicos na fabricação de um medicamentopara o tratamento de inflamações nos tecidos nervoso, músculoesquelético, músculo liso, músculo cardíaco, epitélio de revestimento,tecido adiposo, epitélio-conjuntivo de modo geral.