BRPI0802282A2 - placa biosensora tipo elisa baseada em bactÉrias bioluminescentes imobilizadas para anÁlises de toxicidade e susceptibilidade contra agentes microbicidas e processo de preparaÇço de bactÉrias bioluminescentes para a referida placa - Google Patents
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Abstract
PLACA BIOSENSORA TIPO ELISA BASEADA EM BACTÉRIAS BIOLUMINESCENTES IMOBILIZADAS PARA ANÁLISES DE TOXICIDADE E SUSCEPTIBILIDADE CONTRA AGENTES MICROBICIDAS E PROCESSO DE PREPARAÇçO DE BACTÉRIAS BIOLUMINESCENTES PARA A REFERIDA PLACA. A presente invenção diz respeito a biosensores bioluminescentes baseados em bactérias transformadas com os genes que codificam as luciferases de Pyrearinus termitiiuminans e Macrolampis sp2 imobilizadas em matriz de gel para análise de toxicidade geral de amostras e susceptibilidade bacteriana contra agentes microbicidas, cujo invento demonstra-se útil para análises ambientais, microbiológicas e bioprospecção farmacêutica.
Description
PLACA BIOSENSORA TIPO ELISA BASEADA EM BACTÉRIASBIOLUMINESCENTES IMOBILIZADAS PARA ANÁLISES DETOXICIDADE E SUSCEPTIBILIDADE CONTRA AGENTESMICROBICIDAS E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE BACTÉRIASBIOLUMINESCENTES PARA A REFERIDA PLACA.
Campo da invenção
A presente invenção diz respeito a biosensores bioluminescentesbaseados em bactérias transformadas com os genes que codificam asluciferases de Pyrearinus termitilluminans e Macrolampis sp2 imobilizadasem matriz de gel para análise de toxicidade geral de amostras esusceptibilidade bacteriana contra agentes microbicidas. O invento orareivindicado demonstra-se útil para análises ambientais, microbiológicas ebioprospecção farmacêutica.Estado da técnica
As luciferases são as enzimas que catalizam a produção debioluminescência em diferentes organismos. Elas catalizam a oxidação demoléculas genericamente conhecidas por luciferinas produzindo um fótonde luz visível com alta eficiência [1]. As luciferases de vagalumes e outrosbesouros catalizam a oxidação de uma luciferina benzotiazólica ativada porATP. Numa primeira etapa estas luciferases catalizam a ativação daluciferina às custas de ATP, produzindo adenilato de luciferina. Nasegunda etapa, o adenilato de luciferina é oxidado por oxigênio molecularproduzindo oxiluciferina, dióxido de carbono e um fóton de luz na faixaverde-amarela do espectro com uma eficiênica quântica de ca 40%.
Devido à sensibilidade do sistema luciferina-luciferase de vagalumesao ATP, este sistema tem sido amplamente utilizado para fins de detecçãoluminométrica de ATP em amostras biológicas e ensaios enzimáticos [2,3].Este princípio tem servido para o desenvolvimento de métodos rápidos esensíveis de análise de contaminação microbiológica de amostras deáguas, alimentos, medicamentos, têxteis e utensílios entre outros, sendoatualmente o método mais utilizado para realização de controle dequalidade em laboratórios e indústrias alimentares. De acordo com Stanley[4], mais de 45 kits utilizando luciferina-luciferase de vagalumes estãocomercialmente disponíveis. Mais recentemente, com a clonagem docDNA que codifica a luciferase de vagalumes, permitiu sua utilização comoum dos mais versáteis e eficientes genes repórter para estudo deexpressão gênica em bactérias, leveduras, plantas e mamíferos [5,6].Baseado neste princípio, os genes de luciferases são utilizados paraanalisar e quantificar a ativação de promotores em diferentes tiposcelulares, como marcadores bioluminescentes da tranformação etransfecção de células por vetores plasmidiais e virais, como marcadoresda progressão e regressão de infecções bacterianas, micóticas e virais [6]em estudos clínicos e testes para drogas antimicrobicidas [7], em estudosde progressão e regressão de câncer [8].
As luciferases também tem sido extensivamente utilizadas em biosensores de agentes tóxicos entre os quais metais pesados, fenóis,aromáticos halogenados, inseticidas e outros disruptores ambientais , entremuitas outras aplicações biotecnológicas e biomédicas [9-15]. Atualmentevárias células transformadas geneticamente com o gene da luciferase devagalumes são utilizadas como biosensores para análise de toxicidade deáguas poluídas, solos, biodisponibilidade de nutrientes ou para análise deagentes microbicidas. Estes biosensores dividem-se em simplesbiosensores celulares para a análise geral de toxicidade de amostras, ondeo efeito tóxico é avaliado pela diminuição da bioluminescência mediante aalteração do metabolismo celular e os níveis relativos de ATP, ebiosensores específicos para determinados poluentes, nos quais umpromotor responsivo a estes agentes é ligado ao gene da luciferase demodo que o sinal bioluminescente é proporcional à ativação por esteagente. Um biosensor utilizando cepas de Mycobacterium tuberculosisisoladas de pacientes transfectadas com um bacteriófago contendo o geneda luciferase de vagalume foi desenvolvido para a análise desusceptibilidade a drogas antimicoplasma [16]. Entretanto, toda essavariada gama de aplicações tem utilizado unicamente o gene da luciferasedo vagalume norte-americano Photinus pyralis, que produz luz verdeamarelada em condições fisiológicas, e alguns de seus variantesproduzidos por engenharia genética.
Anteriormente clonamos o cDNA para várias luciferases oriundas deespécies brasileiras de vagalumes [17-20]. A luciferase de Pyrearinustermitilluminans, em particular, mostrou-se particularmente apropriada paraexpressão celular devido à sua alta emissão de luz, estabilidade e cinéticade luminescência. A luciferase de Macrolampis sp2 também mostra-separticularmente apropriada, devido à sua alta emissão de luz eestabilidade. Descrevemos aqui biosensores celulares bioluminescentesbaseados em bactérias transformadas com os respectivos genes dasluciferases, imobilizadas em gel de agarose para detecção de toxicidadede amostras líquidas e susceptibilidade bacteriana contra antibióticos eagentes microbicidas.
Descrição do invento:
1. Luciferase recombinante de Pyrearinus termitilluminans. OcDNA para a luciferase do elaterídeo Pyrearinus termitilluminans(Listagens 1 e 2) foi previamente clonada em plasmídeo pBluescript [17]. Aluciferase de Macrolampis sp2 também foi clonada anteriormente emplasmídeo pBluescript e em pPro, e constitui objeto de patente.
2. Processo de preparação de bactérias bioluminescentes para aplaca biosensora. O plasmídeo pBluescript contendo o cDNA para aluciferase de Pyrearinus termitilluminans (listagem 1) ou Macrolampis sp2foi utilizado para transformar as células E. coli XI1-Blue ou BL21-DE3(Stratagene) (Fig.1). As bactérias foram cultivadas em meio LB líquidocontendo ampicilina a 37°C até densidade ótica (OD600) de 0.5 e entãoinduzidas a 22°C até OD600= 1.5 com IPTG (Isopropiltiogalactosídeo) 1mM para a expressão de luciferase. A suspensão bacteriana foi entãomisturada com top-agar previamente derretido e termostatizado a 40°Cmais IPTG, e despejada nos poços da placa dè Elisa. A placa assimpreparada é incubada por 6 h à temperatura ambiente e então usada paraensaio ou estocada à 4°C até o ensaio.
3. Características do invento. O invento consiste em uma placa deElisa 96 poços contendo bactérias E.coli bioluminescentes transformadascom o plasmídeo contendo o gene da luciferase de Pyrearinustermitilluminans, de Macrolampis sp2 ou de outra luciferase sob controle deum promotor induzível, imobilizadas em matriz de Agar (Fig. 2). A placapode ser estocada a 4°C por até 30 dias com pouca perda de atividade.
4. Procedimento de ensaio. O ensaio consiste nas seguintes etapas:
1a) etapa - É adicionado 10 jil de amostra tóxica ou agente microbicidanos poços da placa e incubação durante 2, 6 e 12 horas. 2a) etapa -Adiciona-se então 5 \ú de luciferina 10 mM. 3a) etapa incuba-se a placa por5 min à temperatura ambiente; e, 4a) etapa - Analisa-se dabioluminescência remanescente por fotometria (Fig.1), luminometria oufotografia em relação ao controle com o solvente no qual a amostra tóxicaestava dissolvida.
No experimento mostrado na Fig. 1, os poços contendo as bactériasbioluminescentes foram incubados na presença de diferentes antibióticos eprópolis e a bioluminescência analisada depois de 2, 6 e 12 horas deincubação à temperatura ambiente. Pode-se verificar que em todos ospoços contendo os agentes microbicidas, exceto nos controles, houvesupressão da bioluminescência, atestando o efeito tóxico destes.
5. Utilidade. A placa biosensora e o respectivo método descritos acimapermitem uma rápida análise de toxicidade de drogas antimicrobicidas eprodutos naturais (Fig. 1) contra bactérias E. Coli e outras bactérias,baseado no efeito destas drogas na supressão de ATP. Este método podeser adaptado para outras bactérias e microorganismos patogênicos parafins de análise de susceptibilidade de drogas microbicidas, e parabiprospecção de extratos de fungos, vegetais ou animais. Pode serutilizado também para a análise de toxicidade de águas e outras amostras.Uma variante deste invento utiliza bactérias transformadas com o gene deuma luciferase pH-sensitiva de Macrolampis para análise simultânea deefeito de toxicidade e presença de metais pesados através de mudançaespectral da bioluminescência.
6. Originalidade. O processo descrito consiste em um processosimples, rápido e de baixo custo para a rápida análise de susceptibilidadebacteriana para antibióticos e bioprospecção de agentes microbicidas, oupara a análise de poluição de águas podendo ser empregado em indústriasfarmacêuticas, laboratórios de análises clínicas, laboratórios de pesquisa,estações de tratamento de água, laboratórios de análises ambientais, entreoutros. O produto visa também atender a demanda de novos bioensaiospara projetos de bioprospecção como os projetos Biota-biprospect. Aoriginalidade do método consiste principalmente na utilização de novasluciferases de origem nacional clonadas pelo autor, em especial aluciferase de Pyrearinus termitilluminans e de Macrolampis sp2 queapresenta propriedades termoestabilidade, emissão de luz intensa eestável em células vivas, e no formato de imobilização das bactérias.
7. Abaixo, é descrita a Seqüência do cDNA e respectiva traduçãoem seqüência de aminoácidos da luciferase de Pyrearinustermitilluminans.
GAATTCGCGGCCGCTGTTGATCTGTGTGTGTTCCGAAAGTTAATTCTACAATC
10 20 30 40 50 60
ATGATGAAGAGAGAAAAAAATGTTGTTTACGGCCCCGAACCCAAACACCCTTTGGGAAACMetMetLysArgGluLysAsnValValTyrGlyProGluProLysHisProLeuGlyAsn
70 80 .., 90 . . 100 110 120
TTTACTGCTGGAGAAATGCTCTACAATGCCCTTCATAAGCATTCCCACATACCGCAAGCA. . PheThrAlaGlyGluMetLeuTyrAsnAlaLeuHisLysHisSerHisIleProGlnAla
130 140 150 160 170 180
ATATTAGATGTGATGGGTAATGAATCGCTGTCATATCAAGAATTTTTCGACACTACTGTCIleLeuAspValMetGlyAsnGluSerLeuSerTyrGlnGluPhePheAspThrThrVal
190 200 210 220 230 240
AAGCTAGGACAAAGTCTTCAAAATTGTGGATACAAGATGAATGATGTAGTGTCGATCTGTLysLeuGlyGlnSerLeuGlnAsnCysGlyTyrLysMetAsnAspValValSerlleCys
250 260 270 280 290 300
GCTGAGAACAATAAAAGATTTTTCATCCCCATTATTTCAGCTTGGTATATTGGTATGGTTAlaGluAsnAsnLysArgPhePhelleProIlelleSerAlaTrpTyrlleGlyMetVal
310 320 330 340 350 360GTAGCACCTGTTAATGAAGACTACATCCCAGATGAACTTTGTAAAGTCACGGGTATATCAValAlaProValAsnGluAspTyrlleProAspGluLeuCysLysValThrGlylleSer
370 380 390 400 410 420
AAACCAATACTGGTCTTCACTACAAGAAAAATCTTACCTAAGGTATTAGAGGTAAAGGACLysProIleLeuValPheThrThrArgLysIleLeuProLysValLeuGluValLysAsp
430 440 450 460 470 480
AGAACTAATTACATAAAGAGAATTATAATACTAGATTCTGAAGAAAATCTGCTTGGTTGCArgThrAsnTyrlleLysArgllellelleLeuAspSerGluGluAsnLeuLeuGlyCys
490 500 510 520 530 540
GAAAGTCTTCATAATTTTATGTCCCGTTATTCGGATAATAATCTTCAGACCTTTAAGCCTGluSerLeuHisAsnPheMetSerArgTyrSerAspAsnAsnLeuGlnThrPheLysPro
550 560 570 580 590 600
CTACATTACGATCCTGTTGATCAAGTGGCAGCTATTTTATGTTCGTCAGGCACAACTGGALeuHisTyrAspProValAspGlnValAlaAlalleLeuCysSerSerGlyThrThrGly
610 620 630 640 650 660
TTACCCAAAGGTGTTATGCAAACGCATAGAAACATTTGTGTTCGACTTACACATGCTTCGLeuProLysGlyValMetGlnThrHisArgAsnlleCysValArgLeuThrHisAlaSer
670 680 690 700 710 720
GATCCCAGAGTTGGAACACAACTTATTCCTGGAGTATCAGTTTTGGCGTATCTGCCTTTCAspProArgValGlyThrGlnLeuIleProGlyValSerValLeuAlaTyrLeuProPhe
730 740 750 760 770 780
TTCCATGCTTTTGGGTTTTCTATAAACTTAGGATACTTTATGGTGGGCCTTCGTGTTGTTPheHisAlaPheGlyPheSerlleAsnLeuGlyTyrPheMetValGlyLeuArgValVal
790 800 810 820 830 840
ATGCTAAGACGATTTAATCAAGAAGTATTTTTAAAAGCCATTCAAGATTATGAAGTTCGAMetLeuArgArgPheAsnGlnGluValPheLeuLysAlalleGlnAspTyrGluValArg
850 860 870 880 890 900
AGTGTAATCAACGTTCCATCAACAATACTGTTCTTGTCGAAAAGTCCTTTAGTTGACAAASerValIleAsnValProSerThrlleLeuPheLeuSerLysSerProLeuValAspLys
910 920 930 940 950 960
TACGATTTATCGACTTTGGCGGAATTGTGTTGCGGCGCTGCACCATTAGCAAAGGAAGTTTyrAspLeuSerThrLeuAlaGluLeuCysCysGlyAlaAlaProLeuAlaLysGluVal
970 980 990 1000 1010 1020
GCTGAGATAGCAGTGAAACGACTAAACCTGCCAGGAATTCGTTGTGGATATGGTTTGACAAlaGluIleAlaValLysArgLeuAsnLeuProGlylleArgCysGlyTyrGlyLeuThr
1030 1040 1050 1060 1070 1080
GAGTCTACTTCAGCTAATATACATACTCTTCACAATGAATTTAAGTCAGGATCACTTGGAGluSerThrSerAlaAsnlleHisThrLeuHisAsnGluPheLysSerGlySerLeuGly
1090 1100 1110 1120 1130 1140
AAAGTCACTCCTTATATGGCTGCGAAAATAATAGATAGGAACACTGGTGAAGCTTTGGGALysValThrProTyrMetAlaAlaLysIlelleAspArgAsnThrGlyGluAlaLeuGly
1150 1160 1170 1180 1190 1200
CCAAATCAAGTTGGAGAACTATGCATCTGGGGTCCTATGGTAACAAAAGGTTACGTGAACProAsnGlnValGlyGluLeuCysIleTrpGlyProMetValThrLysGlyTyrValAsn
1210 1220 1230 1240 1250 1260
AATCCACAAGCCACCAAAGAGGCTATTGATGACGACGGTTGGCTTCACTCTGGAGACTTTAsnProGlnAlaThrLysGluAlalleAspAspAspGlyTrpLeuHisSerGlyAspPhe
1270 1280 1290 1300 1310 1320
GGATACTATGATGAGGATGAATATTTCTATATAGTGGACCGTTACAAGGAACTTATTAAAGlyTyrTyrAspGluAspGluTyrPheTyrlleValAspArgTyrLysGluLeuIleLys
1330 1340 1350 1360 1370 1380
TATAAAGGCTATCAGGTAGCACCTGTAGAATTAGAAGAGATTTTATTACAACATCCAGGTTyrLysGlyTyrGlnValAlaProValGluLeuGluGluIleLeuLeuGlnHisProGly
1390 1400 1410 1420 1430 1440
ATAAGAGATGTTGCTGTCGTTGGTATTCCTGATATAGAAGCTGGAGAACTACCAGCTGGGIleArgAspValAlaValValGlylleProAspIleGluAlaGlyGluLeuProAlaGly
1450 1460 1470 1480 1490 1500
TTCGTGGTTAAACAACCCGGAGCACAACTTACAGCAAAAGAAGTTTACGATTTTCTTGCCPheValValLysGlnProGlyAlaGlnLeuThrAlaLysGluValTyrAspPheLeuAla
1510 1520 1530 1540 1550 1560
CAACGGGTCTCTCATTCAAAGTATTTGCGTGGAGGAGTTCGATTCGTTGATTCAATACCCGlnArgValSerHisSerLysTyrLeuArgGlyGlyValArgPheValAspSerllePro
1570 1580 1590 1600 1610 1620
AGGAATGTTACAGGTAAAATTTCAAGAAAAGAACTTCGAGAGGCGTTGATGGAAAAAGCTArgAsnValThrGlyLysIleSerArgLysGluLeuArgGluAlaLeuMetGluLysAla
1630
TCTAAACTTTAAAAGTCTTGCTTGGATTTAGAAAAAAGAGTAGTGATGGGATATATTCTTSerLysLeu***
AAACCAATTAAAACATTTGGTAAATAAATGCCTAACCAATAAAAAAAAAAAAAAAGCTAGTGGTGGTGGTGGCGGCACTTCATTTTCCGGTAGTTTCAGCAGCAGTGGTGGTGCTGGTGGAGCCCATGGAGGAGGGCCAGTTTTACATCAACGTTTTGCTGATGGAGAAAGGGAACTCGTAACTGGTGGTGCAGGACATGTTGCAGCATCCGCAAATGCAAATGGACCTAATGGGGCAGTCAGCTTTAGTTCTTCCT CAG T T GAC GAAAACGGACAAGTACATTACAATACTCATGCTCGCAGATTTTAAATTGTNACTAAAATAAGTATAATGCTCAAAATTCCTATTAGTTTTAGATTAATTTGCAATGTTTCCTTTATAGTTTTATGTTAGTGTTAATAACTATTTTTTTTTAAATAAAATTTGATTTTTTTCGCGGCCGCTAGCGGCCGCGAATT
8 - Descrição da seqüência de amino-ácidos da luciferase de Pyrearinustermitilluminans.
MMKREKNVVYGPEPKHPLGNFTAGEMLYNALHKHSHIPQAILDVNGNESLSYQEFFDTTVKLGQSLQNCGYKMNDVVSICAENNKRFFIPIISAWYIGMVVAPVNEDYIPDELCKVTGISKPILVFTTRKILPKVLEVKDRTNYIKRIIILDSEENLLGCESLHNFMSRYSDNNLQTFKPLHYDPVDQVAAILCSSGTTGLPKGVMQTHRNICVRLTHASDPRVGTQLIPGVSVLAYLPFFHAFGFSINLGYFMVGLRVVMLRRFNQEVFLKAIQDYEVRSVINVPSTILFLSKSPLVDKYDLSTLAELCCGAAPLAKEVAEIAVKRLNLPGIRCGYGLTESTSANIHTLHNEFKSGSLGKVTPYMAAKIIDRNTGEALGPNQVGELCIWGPMVTKGYVNNPQATKEAIDDDGWLHSGDFGYYDEDEYFYIVDRYKELIKYKGYQVAPVELEEILLQHPGIRDVAVVGIPDIEAGELPAGFVVKQPGAQLTAKEVYDFLAQRVSHSKYLRGGVRFVDSIPRNVTGKISRKELREALMEKA
SKLDescrição das figuras
A figura 1, ilustra o esquema de transformação de bactéria com plasmídeocontendo o gene de luciferase sob controle de um promotor constituitivo ouinduzível, e sua expressão e produção de bioluminescência medianteadministração de luciferina.
A figura 2, ilustra a Incubação dos poços da placa de Elisa contendobactérias XL1-Blue transformadas com o plasmídeo pBluescrip-Pyrearinustermitilluminans (pBI-Pyt) imobilizadas em agarose com 10 p.l de diferentesagentes microbicidas. Após a adição dos agentes, a placa foi incubada por 2h àtemperatura ambiente. Adicionou-se então 5 p.l de luciferina 10 mM em tampãocitrato pH 5 e a bioluminescência foi registrada em câmara de fotodetecçãoATTO, onde 1 significa control, 2 Cloramfenicol, 3 Tetraciclina, 4 Eritromicina, 5Azotromicina e 6 própolis.
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20.Viviani, V. R., F. G. C. Arnoldi, M. Brochetto-Braga and Y. Ohmiya (2004)Cloning and characterization of the cDNA for the Brazilian Cratomorphusdistinctus larval firefly luciferase: similarities with European Lampyris noctilucaand Asiatic Pyrocoelia luciferases. Comp. Biochem. Physiol. Part B 139, 151-156.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
Seqüência do cDNA e respectiva tradução em seqüência deaminoácidos da luciferase de Pyrearínus termitilluminans.Listagem 1:
GAATTCGCGGCCGCTGTTGATCTGTGTGTGTTCCGAAAGTTAATTCTACAATC
10 20 30 40 50 60
ATGATGAAGAGAGAAAAAAATGTTGTTTACGGCCCCGAACCCAAACACCCTTTGGGAAACMetMetLysArgGluLysAsnValValTyrGlyProGluProLysHisProLeuGlyAsn
70 80 90 100 110 120
TTTACTGCTGGAGAAATGCTCTACAATGCCCTTCATAAGCATTCCCACATACCGCAAGCAPheThrAlaGlyGluMetLeuTyrAsnAlaLeuHisLysHisSerHisIleProGlnAla
130 140 150 160 170 180
ATATTAGATGTGATGGGTAATGAATCGCTGTCATATCAAGAATTTTTCGACACTACTGTCIleLeuAspValMetGlyAsnGluSerLeuSerTyrGlnGluPhePheAspThrThrVal
190 200 210 220 230 240
AAGCTAGGACAAAGTCTTCAAAATTGTGGATACAAGATGAATGATGTAGTGTCGATCTGTLysLeuGlyGlnSerLeuGlnAsnCysGlyTyrLysMetAsnAspValValSerlleCys
250 260 270 280 290 300
GCTGAGAACAATAAAAGATTTTTCATCCCCATTATTTCAGCTTGGTATATTGGTATGGTTAlaGluAsnAsnLysArgPhePhelleProIlelleSerAlaTrpTyrlleGlyMetVal
310 320 330 340 350 360
GTAGCACCTGTTAATGAAGACTACATCCCAGATGAACTTTGTAAAGTCACGGGTATATCAValAlaProValAsnGluAspTyrlleProAspGluLeuCysLysValThrGlylleSer
370 380 390 400 410 420
AAACCAATACTGGTCTTCACTACAAGAAAAATCTTACCTAAGGTATTAGAGGTAAAGGACLysProIleLeuValPheThrThrArgLysIleLeuProLysValLeuGluValLysAsp
430 440 450 460 470 480
AG AAC TAAT T AC AT AAAGAG AAT TATAATAC T AG AT T C T G AAGAAAAT CTGCTTGGTTGCArgThrAsnTyrlleLysArgllellelleLeuAspSerGluGluAsnLeuLeuGlyCys
490 500 510 520 530 540
GAAAGTCTTCATAATTTTATGTCCCGTTATTCGGATAATAATCTTCAGACCTTTAAGCCTGluSerLeuHisAsnPheMetSerArgTyrSerAspAsnAsnLeuGlnThrPheLysPro
550 560 570 580 590 600
CTACATTACGATCCTGTTGATCAAGTGGCAGCTATTTTATGTTCGTCAGGCACAACTGGALeuHisTyrAspProValAspGlnValAlaAlalleLeuCysSerSerGlyThrThrGly
610 620 630 640 650 660
TTACCCAAAGGTGTTATGCAAACGCATAGAAACATTTGTGTTCGACTTACACATGCTTCGLeuProLysGlyValMetGlnThrHisArgAsnlleCysValArgLeuThrHisAlaSer
670 680 690 700 710 720
GATCCCAGAGTTGGAACACAACTTATTCCTGGAGTATCAGTTTTGGCGTATCTGCCTTTCAspProArgValGlyThrGlnLeuIleProGlyValSerValLeuAlaTyrLeuProPhe
730 740 750 760 770 780TTCCATGCTTTTGGGTTTTCTATAAACTTAGGATACTTTATGGTGGGCCTTCGTGTTGTTPheHisAlaPheGlyPheSerlleAsnLeuGlyTyrPheMetValGlyLeuArgValVal
790 800 810 820 830 840
ATGCTAAGACGATTTAATCAAGAAGTATTTTTAAAAGCCATTCAAGATTATGAAGTTCGAMetLeuArgArgPheAsnGlnGluValPheLeuLysAlalleGlnAspTyrGluValArg
850 860 870 880 890 900
AGTGTAATCAACGTTCCATCAACAATACTGTTCTTGTCGAAAAGTCCTTTAGTTGACAAASerValIleAsnValProSerThrlleLeuPheLeuSerLysSerProLeuValAspLys
910 920 930 940 950 960
TACGATTTATCGACTTTGGCGGAATTGTGTTGCGGCGCTGCACCATTAGCAAAGGAAGTTTyrAspLeuSerThrLeuAlaGluLeuCysCysGlyAlaAlaProLeuAlaLysGluVal
970 980 990 1000 1010 1020
GCTGAGATAGCAGTGAAACGACTAAACCTGCCAGGAATTCGTTGTGGATATGGTTTGACAAlaGluIleAlaValLysArgLeuAsnLeuProGlylleArgCysGlyTyrGlyLeuThr
1030 1040 1050 1060 1070 1080
GAGTCTACTTCAGCTAATATACATACTCTTCACAATGAATTTAAGTCAGGATCACTTGGAGluSerThrSerAlaAsnlleHisThrLeuHisAsnGluPheLysSerGlySerLeuGly
1090 1100 1110 1120 1130 1140
AAAGTCACTCCTTATATGGCTGCGAAAATAATAGATAGGAACACTGGTGAAGCTTTGGGALysValThrProTyrMetAlaAlaLysIlelleAspArgAsnThrGlyGluAlaLeuGly
1150 1160 1170 1180 1190 1200
CCAAATCAAGTTGGAGAACTATGCATCTGGGGTCCTATGGTAACAAAAGGTTACGTGAACProAsnGlnValGlyGluLeuCysIleTrpGlyProMetValThrLysGlyTyrValAsn
1210 1220 1230 1240 1250 1260
AATCCACAAGCCACCAAAGAGGCTATTGATGACGACGGTTGGCTTCACTCTGGAGACTTTAsnProGlnAlaThrLysGluAlalleAspAspAspGlyTrpLeuHisSerGlyAspPhe
1270 1280 1290 1300 1310 1320
GGATACTATGATGAGGATGAATATTTCTATATAGTGGACCGTTACAAGGAACTTATTAAAGlyTyrTyrAspGluAspGluTyrPheTyrlleValAspArgTyrLysGluLeuIleLys
1330 1340 1350 1360 1370 1380
TATAAAGGCTATCAGGTAGCACCTGTAGAATTAGAAGAGATTTTATTACAACATCCAGGTTyrLysGlyTyrGlnValAlaProValGluLeuGluGluIleLeuLeuGlnHisProGly
1390 1400 1410 1420 1430 1440
ATAAGAGATGTTGCTGTCGTTGGTATTCCTGATATAGAAGCTGGAGAACTACCAGCTGGGIleArgAspValAlaValValGlylleProAspIleGluAlaGlyGluLeuProAlaGly
1450 1460 1470 1480 1490 1500
TTCGTGGTTAAACAACCCGGAGCACAACTTACAGCAAAAGAAGTTTACGATTTTCTTGCCPheValValLysGlnProGlyAlaGlnLeuThrAlaLysGluValTyrAspPheLeuAla
1510 1520 1530 1540 1550 1560
CAACGGGTCTCTCATTCAAAGTATTTGCGTGGAGGAGTTCGATTCGTTGATTCAATACCCGlnArgValSerHisSerLysTyrLeuArgGlyGlyValArgPheValAspSerllePro
1570 1580 1590 1600 1610 1620
AG GAAT GTTACAGG TAAAAT T T CAAGAAAAGAAC TTCGAGAGGCGTTGATG GAAAAAG C TArgAsnValThrGlyLysIleSerArgLysGluLeuArgGluAlaLeuMetGluLysAla
1630TCTAAACTTTAAAAGTCTTGCTTGGATTTAGAAAAAAGAGTAGTGATGGGATATATTCTTSerLysLeu***
AAACCAATTAAAACATTTGGTAAATAAATGCCTAACCAATAAAAAAAAAAAAAAAGCTAGTGGTGGTGGTGGCGGCACTTCATTTTCCGGTAGTTTCAGCAGCAGTGGTGGTGCTGGTGGAGCCCATGGAGGAGGGCCAGTTTTACATCAACGTTTTGCTGATGGAGAAAGGGAACTCGTAACTGGTGGTGCAGGACATGTTGCAGCATCCGCAAATGCAAATGGACCTAATGGGGCAGTCAGCTTTAGTTCTTCCTCAGTTGACGAAAACGGACAAGTACATTACAATACTCATGCTCGCAGATTTTAAATTGTNACTAAAATAAGTATAATGCTCAAAATTCCTATTAGTTTTAGATTAATTTGCAATGTTTCCTTTATAGTTTTATGTTAGTGTTAATAACTATTTTTTTTTAAATAAAATTTGATTTTTTTCGCGGCCGCTAGCGGCCGCGAATTSeqüência de amino-ácidos da luciferase de Pyrearinustermitilluminans. Listagem 2:
MMKREKNVVYGPEPKHPLGNFTAGEMLYNALHKHSHIPQAILDVNGNESLSYQEFFDTTVKLGQSLQNCGYKMNDVVSICAENNKRFFIPIISAWYIGMVVAPVNEDYIPDELCKVTGISKPILVFTTRKILPKVLEVKDRTNYIKRIIILDSEENLLGCESLHNFMSRYSDNNLQTFKPLHYDPVDQVAAILCSSGTTGLPKGVMQTHRNICVRLTHASDPRVGTQLIPGVSVLAYLPFFHAFGFSINLGYFMVGLRVVMLRRFNQEVFLKAIQDYEVRSVINVPSTILFLSKSPLVDKYDLSTLAELCCGAAPLAKEVAEIAVKRLNLPGIRCGYGLTESTSANIHTLHNEFKSGSLGKVTPYMAAKIIDRNTGEALGPNQVGELCIWGPMVTKGYVNNPQATKEAIDDDGWLHSGDFGYYDEDEYFYIVDRYKELIKYKGYQVAPVELEEILLQHPGIRDVAVVGIPDIEAGELPAGFVVKQPGAQLTAKEVYDFLAQRVSHSKYLRGGVRFVDSIPRNVTGKISRKELREALMEKASKL
Claims (6)
1. - PLACA BIOSENSORA, caracterizada por uma placa de Elisa contendobactérias E.coli e outras espécies bioluminescentes transformadas com oplasmídeo contendo o gene da luciferase de Pyrearinus termitilluminans,de Macrolampis sp2 ou de outra luciferase sob controle de um promotorinduzível, imobilizadas em matriz de Agar (Fig. 2), sendo que a placa podeser estocada a 4°C por até 30 dias com pouca perda de atividade.
2. - PLACA BIOSENSORA, de acordo com a reivindicação 1, écaracterizada pelo cDNA para a luciferase recombinante de Pyrearinustermitilluminans, listagens 1 e 2, para subclonagem ou já devidamentesubclonado em vetores de expressão celulares, sob controle de promotorinduzível ou constituitivo, tornando possível a expressão de luciferase ativade Pyrearinus termitilluminans e produção de bioluminescência intracelularestável, mediante o fornecimento exógeno de luciferina de vagalumes.
3. - PROCESSO PARA ANÁLISES DE TOXICIDADE ESUSCEPTIBILIDADE CONTRA AGENTES MICROBICIDAS, écaracterizado pelo plasmídeo pBluescript ou pProHtA (Invitrogen) possuiro cDNA para a luciferase de Pyrearinus termitilluminans (listagem 1) ouMacrolampis sp2, ser utilizado para transformar as células E. coli XI1-Blueou BL21-DE3 (Stratagene) e outras linhagens (Fig.1).
4. - PROCESSO PARA ANÁLISES DE TOXICIDADE ESUSCEPTIBILIDADE CONTRA AGENTES MICROBICIDAS, de acordocom a reivindicação 3, é caracterizado pelas serem cultivadas em meio LBlíquido ou análogos contendo ampicilina a 37°C até densidade ótica(OD600) de 0.5 e serem induzidas a 22°C até OD600= 1.5 com IPTG(Isopropiltiogalactosídeo) 1 mM para a expressão de luciferase.
5. - PROCESSO PARA ANÁLISES DE TOXICIDADE ESUSCEPTIBILIDADE CONTRA AGENTES MICROBICIDAS, de acordocom as reivindicações 3 e 4, é caracterizado pela suspensão bacterianaser misturada com top-agar previamente derretido e termostatizado a 40°Cmais IPTG, e despejada nos poços da placa de Elisa, sendo que a placaassim preparada é incubada por 6-12 h à temperatura ambiente e entãoestocada à 4°C até o ensaio.
6. PROCESSO PARA ANÁLISES DE TOXICIDADE ESUSCEPTIBILIDADE CONTRA AGENTES MICROBICIDAS, de acordocom as reivindicações 3, 4 e 5, é caracterizado pelo ensaio possuir asseguintes etapas: 1a) adição de 10 de amostra tóxica ou agentemicrobicida nos poços da placa e incubação durante 2, 6 e 12 horas; 2a)adição de 5 \i\ de luciferina 10 mM; 3a) incubação da placa por 10 min àtemperatura ambiente; e, 4a) análise da bioluminescência remanescentepor fotometria, luminometria ou fotografia em relação ao controle com osolvente no qual a amostra tóxica estava dissolvida.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BRPI0802282 BRPI0802282A2 (pt) | 2008-06-06 | 2008-06-06 | placa biosensora tipo elisa baseada em bactÉrias bioluminescentes imobilizadas para anÁlises de toxicidade e susceptibilidade contra agentes microbicidas e processo de preparaÇço de bactÉrias bioluminescentes para a referida placa |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BRPI0802282 BRPI0802282A2 (pt) | 2008-06-06 | 2008-06-06 | placa biosensora tipo elisa baseada em bactÉrias bioluminescentes imobilizadas para anÁlises de toxicidade e susceptibilidade contra agentes microbicidas e processo de preparaÇço de bactÉrias bioluminescentes para a referida placa |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0802282A2 true BRPI0802282A2 (pt) | 2010-03-02 |
Family
ID=41722422
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| BRPI0802282 BRPI0802282A2 (pt) | 2008-06-06 | 2008-06-06 | placa biosensora tipo elisa baseada em bactÉrias bioluminescentes imobilizadas para anÁlises de toxicidade e susceptibilidade contra agentes microbicidas e processo de preparaÇço de bactÉrias bioluminescentes para a referida placa |
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|---|---|
| BR (1) | BRPI0802282A2 (pt) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR3044383A1 (fr) * | 2015-12-01 | 2017-06-02 | Glowee | Systeme lumineux a base de luciferase |
-
2008
- 2008-06-06 BR BRPI0802282 patent/BRPI0802282A2/pt not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR3044383A1 (fr) * | 2015-12-01 | 2017-06-02 | Glowee | Systeme lumineux a base de luciferase |
| WO2017093682A1 (fr) * | 2015-12-01 | 2017-06-08 | Glowee | Systeme lumineux a base de luciferase |
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