FR3044383A1 - Systeme lumineux a base de luciferase - Google Patents

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Abstract

L'invention concerne un système lumineux qui comprend une cassette d'expression de la luciférase insérée dans un microorganisme procaryote, ainsi que le procédé de production de lumière associé.

Description

Système lumineux à base de luciférase L'invention concerne un système lumineux qui comprend une cassette d'expression de la luciférase insérée dans un microorganisme procaryote, ainsi que le procédé de production de lumière associé.
La bioluminescence est présente dans de nombreux phyla, particulièrement en milieu marin : bactéries, annélides, mollusques, dinoflagellés, poissons, mais aussi champignons et insectes. Les bactéries bioluminescentes sont largement trouvées dans les environnements marins et terrestres. A ce jour, au niveau des bactéries, au moins onze espèces dans quatre genres Gram négatif ont été décrites: Vibrio, Photobacterium, Shewanella (Alteromonas) et Photorhabdus (Xenorhabdus).
Dans toutes ces espèces, les cinq gènes responsables de la bioluminescence sont regroupés dans l'opéron lux.
Dans ces bactéries, la bioluminescence (lumière bleu-vert émise ayant une longueur d'onde d'environ 490 nm) est considérée comme le résultat de l'oxydation d'une flavine mononucléotide réduite (FMNH2) et d'un aldéhyde gras à longue chaîne, catalysée par la luciférase. L'enzyme luciférase est codée par deux sous-unités formant un hétérodimère (luxAB), tandis que les peptides de réductase, transférase et synthase responsables de la biosynthèse du substrat d'aldéhyde dans la réaction luminescente sont codés respectivement par trois gènes luxCDE qui flanquent les gènes luxAB, avec une transcription dans l'ordre luxCDABE. Un certain nombre de gènes lux supplémentaires ont été identifiés dans ces bactéries, tel que le gène luxG, mais seuls les gènes luxA-E sont essentiels à la biosynthèse de la lumière (Meighen, E., (1993), The FASEB Journal 7: 1016-1022.
Des applications de la bioluminescence ont été développées pour la biochimie, la biologie moléculaire et les biotechnologies (dosage de divers métabolites, gènes rapporteurs, sondes marquées, détection de contaminations bactériennes etc.) et constituent des outils puissants pour éviter le recours aux marqueurs radioactifs.
La demanderesse a découvert que l'opéron lux de bactéries luminescentes, inséré dans des microorganismes et maintenu dans un milieu gélifié pouvait former un système confiné générateur de lumière. L'invention a donc pour objet un système lumineux confiné comprenant un tel opéron inséré dans un microorganisme.
Un autre objet de l'invention est un procédé de production de lumière comprenant un tel système.
Ces modes de réalisation ainsi que d'autres de la présente invention apparaîtront facilement à l'homme du métier au vu de la présente divulgation.
La figure 1 est un diagramme schématique du plasmide pT7-luxCDABE, qui porte l'opéron lux de Vibrio fischeri en entier sous contrôle du promoteur T7.
La figure 2 est un diagramme qui représente l'intensité lumineuse du système de l'exemple 4 de l'invention en fonction du temps.
La pratique de la présente invention emploiera, sauf indication contraire, des procédés classiques de biochimie et biologie moléculaire. De telles techniques sont expliquées dans la littérature (Ausubel, FM, et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Media, PA (1995), Sambrook, J., et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, deuxième édition, Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, NY) (1989)).
Dans la description de la présente invention, les termes suivants sont définis comme indiqué ci-dessous.
Les termes "molécule d'acide nucléique" et "polynucléotide" sont utilisés de manière interchangeable et se réfèrent à une forme polymère de nucléotides de toute longueur, soit des ribonucléotides ou des désoxyribonucléotides, ou des analogues de ceux-ci.
Des exemples non limitatifs de polynucléotides incluent un gène, un fragment de gène, de l'ADNc, des polynucléotides recombinants, des plasmides, des vecteurs et un ADN isolé de toute séquence.
Un polynucléotide est typiquement composé d'une séquence spécifique de quatre bases nucléotidiques: adénine (A); cytosine (C); guanine (G); et thymine (T) (ou uracile (U) lorsque le polynucléotide est de l'ARN).
Une "séquence codante" ou une séquence qui "code" un polypeptide choisi, est une molécule d'acide nucléique qui est transcrite (dans le cas de l'ADN) et traduite (dans le cas de l'ARNm) en un polypeptide in vivo lorsqu'elle est placée sous le contrôle des séquences régulatrices appropriées de (ou «éléments de contrôle»).
Une séquence de terminaison de la transcription peut être située en 3 'de la séquence codante.
Des "éléments de contrôle" typiques comprennent, mais ne sont pas limités à, des régulateurs de transcription, tels que des promoteurs, des éléments amplificateurs de la transcription et signaux de terminaison de transcription.
Les promoteurs peuvent inclure les promoteurs inductibles, des promoteurs répressibles et des promoteurs constitutifs.
Un "polynucléotide isolé" est une molécule d'acide nucléique séparée et distincte de l'organisme entier avec lequel la molécule est trouvée dans la nature; ou une molécule d'acide nucléique dépourvue, en totalité ou en partie, de séquences normalement associées avec elle dans la nature.
Un "polypeptide" est utilisé dans ce sens le plus large pour faire référence à un composé de deux ou plusieurs sous-unités d'acides aminés. "Lié de manière fonctionnelle" se réfère à un arrangement d'éléments dans lequel les composants ainsi décrits sont configurés de manière à effectuer leur fonction habituelle. Ainsi, un promoteur donné qui est lié de manière fonctionnelle à une séquence codante est capable d'effectuer l'expression de la séquence codante lorsque les enzymes appropriées sont présentes.
Les éléments promoteurs ou d'un autre contrôle ne sont pas nécessairement contigus à la séquence codante, tant qu'ils fonctionnent pour diriger l'expression de celle-ci.
Par exemple, des séquences intermédiaires non traduites mais transcrites peuvent être présentes entre la séquence promotrice et la séquence codante mais la séquence promotrice peut encore être considérée comme "liée de manière fonctionnelle" à la séquence codante. "Recombinant", tel qu'utilisé ici pour décrire une molécule d'acide nucléique, signifie un polynucléotide d'ADN qui, en vertu de son origine ou manipulation n'est pas associé à la totalité ou une partie du polynucléotide avec lequel il est associé dans la nature, et/ou est lié à un polynucléotide autre que celui auquel il est lié dans la nature.
Le terme "recombinant", tel qu'utilisé en ce qui concerne une protéine ou un polypeptide, signifie un polypeptide produit par l'expression d'un polynucléotide recombinant. "Bactéries recombinantes", "bactéries hôtes" sont utilisés de manière interchangeable et se réfèrent à des micro-organismes procaryotes qui ont été utilisés comme receveurs pour des vecteurs recombinants ou un autre ADN de transfert, et comprennent la descendance du micro-organisme original qui a été transformé.
Un "gène" désigne un polynucléotide contenant au moins un cadre de lecture ouvert qui est capable de coder pour un polypeptide ou une protéine particulière après avoir été transcrit ou traduit. "Codée par" fait référence à une séquence d'acide nucléique qui code une séquence polypeptidique.
Un "vecteur" est capable de transférer des séquences de gènes à des cellules cibles (par exemple des vecteurs viraux, des vecteurs non viraux,... etc).
En règle générale, "construction de vecteur", "vecteur d'expression" et "vecteur de transfert de gène(s)" désignent toute construction d'acide nucléique capable de diriger l'expression d'un ou plusieurs gènes d'intérêt et qui peut transférer des séquences de gènes à des cellules cibles. Ainsi, ces termes incluent des véhicules de clonage et d'expression, tels que des plasmides, ainsi que des vecteurs viraux. "Vecteur d'expression d'acide nucléique" se réfère à un assemblage qui est capable de diriger l'expression d'une séquence ou d'un gène d'intérêt.
Le vecteur d'expression d'acide nucléique comprend un promoteur qui est lié de manière fonctionnelle aux séquences ou gène(s) d'intérêt.
Parmi les composants d'une cassette d'expression, la construction plasmidique peut comprendre une ou plusieurs origine(s) bactérienne(s) de réplication, un ou plusieurs marqueurs sélectionnables, un signal qui permet à la construction plasmidique d'exister en tant que simple brin ADN (par exemple, une origine de réplication M13) et un site de clonage multiple.
Une "cassette d'expression" comprend toute construction d'acide nucléique qui contient le(s) séquence(s) capable(s) d'être exprimée(s) dans une cellule.
Les cassettes d'expression peuvent contenir, en plus des gènes polynucléotidique(s) ou séquence(s) d'intérêt, d'autres éléments de régulation ou de contrôle.
Ces cassettes sont typiquement construites en un "vecteur", "vecteur d'expression", "vecteur d'expression d'acide nucléique" ou "vecteur de transfert de gène", afin de transférer la cassette d'expression dans des micro-organismes procaryotes cibles. "Gram-négatif" est une caractéristique taxonomique se référant à des bactéries qui sont facilement décolorées avec des colorants de la coloration de Gram standard. "La lumière visible" est définie ici, sauf indication contraire, en tant que rayonnement électromagnétique ayant une longueur d'onde comprise entre environ 400 nm et environ 750 nm.
Une "protéine génératrice de lumière" est définie comme une protéine ou un polypeptide capable de générer de la lumière par le biais d'une réaction chimique (par exemple, la bioluminescence, telle que générée par la luciférase).
Le terme "lux" se réfère à des gènes procaryotes associés à la luciférase et l'émission de photons. L'invention est un système lumineux comprenant, dans un milieu nutritif gélifié : - une cassette d'expression d'un ou plusieurs gènes codant la luciférase insérée dans un microorganisme procaryote. - un substrat de la luciférase - ledit système étant confiné dans un conteneur perméable aux gaz.
Une variété de gènes codant pour la luciférase ont été identifiés et ont été décrits dans les brevets US 5,670,356, US 5,604,123, US 5,618,722, US 5,650,289, US 5,641,641, US 5,229,285, US 5,292,658 ou US 5,418,155.
La synthèse de la lumière dans des bactéries bioluminescentes d'origine naturelle est codée par cinq gènes essentiels.
Ces gènes sont regroupés dans un opéron (luxCDABE) qui peut être déplacé dans des bactéries non naturellement bioluminescentes pour produire un phénotype bioluminescent. L'enzyme luciférase est codée par deux sous-unités luxA et luxB, alors que les enzymes responsables de la biosynthèse de l'aldéhyde sont codées par trois gènes luxC, luxD et luxE. Cependant, comme l'aldéhyde peut rapidement diffuser à travers les membranes cellulaires et est disponible dans le commerce (par exemple, Sigma, France), les gènes codant la synthèse de ce substrat (luxCDE) ne sont pas une nécessité absolue pour la bioluminescence et peuvent être substitués par l'addition de ce composé de manière exogène.
Dans un mode de réalisation préféré, les séquences codant les gènes luxA, luxB, luxC, luxD et luxE sont obtenues à partir de la bactérie luminescente Vibrio, de préférence des bactéries des espèces Vibrio fischeri, Vibrio haweyi, et Vibrio harveyi. De façon plus préférentielle, Vibrio fischeri est préféré.
Ces souches peuvent être obtenues auprès de la Collection de souches bactériennes de l’Institut Pasteur (France), ou auprès de l'ATCC (USA).
Dans cette bactérie, la luciférase est un hétérodimère constitué d’une sous-unité alpha de 42kDa et d’une sous-unité beta de 37kDa, codées respectivement par les gènes luxA et luxB tandis que luxC, luxD et luxE codent pour les enzymes (fatty acid reductase, acyl transferase et acyl protein synthase) permettant la synthèse du tétradécanal, le substrat de la luciférase. L’enzyme exprimée par luxD permet la conversion d’un acide gras en tétradécanal tandis que les enzymes exprimées par luxC/E permettent la régénération de l’acide tétradécanoïque, produit lors de la réaction de bioluminescence, en tétradécanal, substrat de la luciférase.
De plus, dans les bactéries marines comme Vibrio fischeri, on note la présence d'un gène supplémentaire, luxG, qui suit le gène luxE. La séquence en acides aminés déduite de luxG est similaire à celle de Fre, la flavine réductase de E. coli. De ce fait, le produit du gène luxG pourrait être une flavine réductase fournissant le substrat FMNH" pour la réaction de la luciférase. Cependant, le produit du gène luxG n'a jamais été exprimé ou caractérisé. Sa fonction reste donc incertaine.
Les séquences nucléotidiques des gènes de l'opéron lux de Vibrio fischeri sont indiquées dans GenBank (numéros d'accession AY341062 pour l'opéron luxCDABE et X70289.1 pour luxG).
La production de luciférase provenant de la bactérie Vibrio fischeri est optimale à une température comprise entre 15 et 30 °C. Au-delà, l'enzyme est dégradée. Cependant, la luciférase de certains opérons lux provenant d'autres bactéries, comme Vibrio campbellii, est thermostable à 37°C par exemple.
De tels gènes codant pour la luciférase peuvent être modifiés par les procédés décrits ici pour produire des séquences et/ou des cassettes d'expression polypeptidiques utiles.
Dans un aspect, l'invention comprend une cassette d'expression comprenant un polynucléotide codant les protéines LuxA, LuxB, LuxC, LuxD et LuxE, dans lequel l'agencement des séquences codant pour les produits de gènes est, de préférence, mais pas nécessairement, dans l'ordre relatif suivant 5'-LuxA-LuxB-LuxC-LuxD-LuxE- 3'. Ainsi, cette cassette réorganise l'ordre non modifié de ces gènes, à savoir luxCABDE.
Les cassettes d'expression de luxABCDE expriment non seulement la luciférase, mais également les enzymes biosynthétiques nécessaires pour la synthèse du substrat de la luciférase. Ainsi, en incluant à la fois les gènes de structure (luxAB) et du substrat (luxCDE), cette cassette d'expression ne nécessite pas l'addition de substrat exogène.
De plus, il est possible d'insérer avec l'opéron luxABCDE, le gène luxG, dans les cassettes d'expression.
Eventuellement, de courtes séquences d'ADN comprenant des promoteurs ou d'autres régulateurs de la transcription ou de la traduction sont insérées avant la cassette de lux.
En particulier, un ou des promoteurs inductibles peuvent être insérés de manière fonctionnelle avant la cassette lux afin de placer un ou plusieurs gènes de l'opéron lux sous le contrôle fonctionnel du ou desdits promoteurs.
Des promoteurs inductibles adéquats sont par exemple le promoteur T7 (inductible par isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside (IPTG)), le promoteur pBAD (inductible par l'arabinose) ou le promoteur pDawn/Dusk (inductible par la lumière ou l'obscurité).
De préférence, le promoteur T7 est utilisé, lié de manière fonctionnelle, en amont de l'opéron lux.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, des promoteurs non inductibles peuvent être utilisés en amont de la cassette lux afin de placer la cassette d'expression d'un ou plusieurs gènes codant la luciférase sous le contrôle dudit promoteur.
De tels promoteurs sont par exemple le promoteur pOsmY, psAB ou RpoS.
La cassette d'expression est de préférence capable d'exprimer des produits de gènes dans le type de micro-organisme procaryote sélectionné.
En outre, dans toutes ces cassettes, les séquences codantes des produits de gènes peuvent comprendre des codons qui sont optimaux pour l'expression des produits de gènes dans un système hôte dans laquelle la cassette d'expression doit être introduite.
Les cassettes d'expression décrites ci-dessus peuvent être intégrées au génome d'un micro-organisme procaryote par exemple par des techniques de CRISPR/Cas9, ou de façon extrachromosomique et ainsi confèrent la capacité à produire de la lumière à un microorganisme procaryote.
Dans un mode de réalisation, ces cassettes sont contenues dans des vecteurs d'expression ou vecteurs navettes, de préférence des plasmides.
Ainsi, l'invention utilise un vecteur navette comprenant au moins : a) une cassette d'expression telle que décrite ci-dessus; b) un polynucléotide codant pour un marqueur sélectionnable (par exemple, l'ampicilline ou le chloramphénicol) et c) une origine Gram négatif de réplication.
Les vecteurs contenant les éléments de régulation appropriés et des sites de clonage multiples sont disponibles dans le commerce (par exemple, Stratagene, La Jolla, Californie; Clontech, Palo Alto, Californie.).
Un tel exemple est le plasmide d’expression pRSET, vendu par la société Thermo Fisher, USA. Dans un mode de réalisation, les cassettes d'expression sont introduites dans les micro-organismes procaryotes par transformation de l'hôte, de préférence des bactéries Gram-négatives, pour conduire au système lumineux de l'invention.
De préférence, le micro-organisme procaryote est une entérobactérie, et encore plus préférentiellement cette bactérie est Escherichia coli.
De façon préférée, la souche de E. coli BL21(DE3) est utilisée. Cette souche est disponible chez New England Biolabs (France).
Alternativement, le micro-organisme procaryote est une cyanobactérie. De façon préférée, la souche de cyanobactérie utilisée est Synechocystis. En particulier, la souche Synechocystis PCC.6803 est disponible chez ATCC (USA) sous la référence n° 27184.
Les procédés de transformation de cellules procaryotes sont bien connus dans l'art (par exemple, Sambrook, et al.) et comprennent, mais ne sont pas limités à, la précipitation au phosphate de calcium et l'électroporation.
Le système lumineux de l’invention comporte ainsi de préférence une cassette d'expression d'un ou plusieurs gènes lux de Vibrio fîscheri sous le contrôle d'au moins un promoteur, de préférence un promoteur inductible, et un substrat de la luciférase, ladite cassette étant insérée dans une bactérie, de préférence E coli.
Cette bactérie, une fois transformée par ladite cassette, est cultivée dans un milieu de maintien comprenant au moins un gélifiant, de préférence de l'agar, de l'eau et de l'IPTG.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la cassette d'expression est sous le contrôle du promoteur T7, la bactérie est E. co/iBL21(DE3) et le milieu de maintien contient de l'IPTG afin d'induire l’expression des protéines de luciférase sous le contrôle du promoteur T7.
Le milieu de maintien est gélifié à raison de 4 à 10 grammes de gélifiant par litre de milieu, et de préférence de 6 à 8 grammes de gélifiant par litre de milieu. Le gélifiant est de préférence de l'agar (Gibco, France). Ceci permet d'éviter la sédimentation des bactéries bioluminescentes au sein du système lumineux. Ce milieu de maintien est ainsi conservé à 60°C, puis au moment de l’utilisation, est refroidi à 39°C pour l'ajout des bactéries transformées bioluminescentes puis rapidement inséré dans le conteneur adéquat perméable aux gaz avant gélification et solidification du milieu, préférentiellement à température ambiante.
Ce conteneur peut prendre des formes diverses mais est de préférence transparent ou presque transparent pour laisser passer la lumière émise par les bactéries. De préférence, ce conteneur est fait dans une matière polymère. Encore plus préférentiellement, cette matière polymère est du polydiméthylsiloxane ou PDMS.
Ce conteneur peut en particulier prendre la forme d'une colonne lumineuse, d'un bâton lumineux. Ce conteneur peut également prendre la forme d'une gélule destinée à être ingérée pour l'exploration fonctionnelle d'une souris par exemple.
Le procédé de production de lumière comprend les étapes consistant à la mise en œuvre d'un système qui comprend une cassette d'expression comprenant un ou plusieurs gènes codant pour la luciférase insérée dans un microorganisme et un substrat de la luciférase, ledit système étant confiné dans un conteneur perméable aux gaz.
Les exemples suivants sont destinés à illustrer l'invention sans toutefois présenter un caractère limitatif.
Exemple 1 : Construction de plasmides portant l'opéron lux - plasmide pT7-luxCDABE:
Pour la construction de ce plasmide, l’opéron luxCDABE (numéro d'accession de la séquence dans Genbank :AY341062.2) a été synthétisé chez Thermo Fisher/Life technologies, en utilisant leur service GeneArt TM.
Le produit a été amplifié par réaction en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant les amorces :
Sens :
TATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTT
GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGTATTCCAATGATAA
TTAATGGAATGATTCAAGATTTTGATAATTAT
Et Inverse :
CAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCAAGCTT
TTAATCCTTGATATTCTTTTGTATGACATTAGCCATAGAG
Le produit de la PCR a été assemblé par la technique d’assemblage de Gibson dans le vecteur d’expression pRSET (Thermo Fisher) digéré par les enzymes de restriction Xbal et Hindlll (Gibson DG, et al., (2009). "Enzymatic assembly of DNA molécules up to several hundred kilobases". Nature Methods 6 (5): 343-345.
-plasmide pOSM-luxCDABE
Le promoteur pOsmY de séquence
CTGGCACAGGAACGTTATCCGGACGTTCAGTTCCACCAGA
CCCGCGAGCATTAATTCTTGCCTCCAGGGCGCGGTAGTGGCGCCC
TGTCAATTTCCCTTCCTTATTAGCCGCTTACGGAATGTTCTTAAA
ACATTCACTTTTGCTTATGTTTTCGCTGATATCCCGAGCGGTTTCA
AAATTGTGATCTATATTTAACAA a été synthétisé chez Thermo Fisher/Life technologies, en utilisant leur service GeneArt TM.
Le produit a été amplifié par réaction en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant les amorces :
Sens: TCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGATCTCGATC CCGCGAAATCTGGCACAGGAACGTTATCCGGAC Et inverse : TTGTTAAATATAGATCACAATTTTGAAACCGCTCGG Ce produit de PCR et le produit de PCR contenant l'opéron lux ci-dessus ont été assemblés par la technique d’assemblage de Gibson dans le vecteur d’expression pRSET (Thermo Fisher) préalablement digéré par BgllI/HindlII. -plasmide pT7-luxCDABEG :
Pour la construction, l’opéron luxCDABE (numéro d'accession de la séquence dans Genbank :AY341062.2) et le gène luxG (numéro d'accession de la séquence dans Genbank : X70289) ont été synthétisés de la même manière chez Thermo Fisher/Life technologies, en utilisant leur service GeneArt TM.
Le produit a été amplifié par réaction en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant les amorces :
Sens : TATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTT GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGTATTCCAATGATAA TTAATGGAATGATTCAAGATTTTGATAATTAT Et Inverse :
CAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCAAGCTT
TTATACGTATGCAAAAGCATCGGCAAACATCT
Le produit de la PCR a été assemblé par la technique d’assemblage de Gibson dans le vecteur d’expression pRSET (Thermo Fisher) digéré par les enzymes de restriction Xbal et HindlII.
Exemple 2 : Transformation de bactéries avec le plasmide pT7-luxCDABE
Sauf indication contraire, la manipulation des bactéries, des protéines et des acides nucléiques a été réalisée en utilisant des procédés standard, comme décrit dans, par exemple, Sambrook, et al., Et Ausubel, FM, et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Media, PA (1995).
Brièvement, le plasmide pT7-luxCDABE de l'exemple 1, comportant Topéron lux de Vibrio fischeri sous contrôle du promoteur constitutif T7 de Xenorhabdus luminescens, a été inséré dans la bactérie E. co//BL21(DE3pLysS) (Promega France). Cette souche bactérienne permet l’induction de l’expression de l’ARN polymérase du phage T7 par l’ajout d'isopropyl β-D-l-thiogalactopyranoside (IPTG).
Les bactéries ont été transformées de la manière suivante :
La culture bactérienne a été cultivée pendant une nuit en LB (Gibco, France) à 37°C. Cinq mL de chaque culture ont été utilisés pour inoculer un volume de 500 mL de LB frais. Après agitation à 37°C jusqu'à une DO à 600 nm d'environ 0,6, les bactéries sont refroidies sur de la glace pendant 30 min avant d'être récoltées par centrifugation à 3000g pendant 10 min à 4°C.
Les bactéries sont reprises dans 50 mL de CaCU à lOOmM (Sigma, France) et placées sur glace pendant 30 minutes. 1 microlitre de plasmide pT7-luxCDABE à la concentration de 100 pg/mL est ajouté à 50 microlitres de bactéries compétentes puis les bactéries sont incubées 5 à 10 minutes sur glace, subissent un choc thermiques à 42°C pendant 45 secondes avant d'être à nouveau incubées 5 à 10 minutes sur glace.
Ensuite, on ajoute 250 microlitres de LB et on incube le tube 1 heure à 37°C sous agitation (800 rpm). Les bactéries sont alors étalées sur une gélose contenant la sélection antibiotique ampicilline à raison de 100 pg/mL.
Exemple 3 : préparation des cultures à insérer dans le conteneur
Les bactéries bioluminescentes de l'exemple 2 sont amplifiées en culture à 37°C sous agitation à 170 rpm dans 500mL de milieu de culture à pH7 modifié contenant 10 g/L de glucose, 13,6 g/L de KH2P04, 0.02g/L de CACL2, 0.2g/L de MgSO 7H20, 2g/L de (NH4)2S04 et 100 mg/L d'ampicilline. Ce milieu de culture est transparent. Il colore moins les bactéries lors de leur croissance que les milieux de culture standards (type LB).
La pré-culture est stoppée lorsque la densité optique à 600 nm atteint 0.8. On centrifuge à 3000g pendant 30 minutes et on remet le culot en suspension dans lmL d'eau déminéralisée. On ajoute 19mL de milieu de maintien à pH7 contenant 13,6 g/L de KH2P04, 0.02g/L de CACL2, 0.2g/L de MgSO 7H20, 2g/L de (NH4)2S04, ImM d'IPTG, 0.005% d'H202, 2g/L de (NH4)2S04, 6.2g/L d'agar et 100 mg/L d'ampicilline. Le milieu de maintien est transparent, contient de l’IPTG pour induire l’expression des protéines permettant la bioluminescence, de 1Ή202 pour permettre une oxygénation du milieu, ce qui augmente la luminosité et de l’agar pour éviter la sédimentation des bactéries. Il se solidifie/gélifie à température ambiante.
Ce milieu est préparé et maintenu à 60°C pour le garder sous forme liquide. Lorsqu'on y insère les bactéries, ce milieu est refroidi à 39°C sous contrôle précis à l’aide d’une sonde température et ensuite ajouté aux bactéries.
Exemple 4 : Insertion des bactéries bioluminescentes dans le conteneur
En raison de la solidification/gélification du milieu de maintien, il faut faire toutes les étapes d’insertion des bactéries rapidement.
Brièvement, on préchauffe une seringue vide (20mL) avec une aiguille de longueur 40mm, diamètre extérieur 1.2mm et diamètre intérieur 0.8mm à 40°C pendant 30 minutes, on insère 20mL de milieu de maintien contenant les bactéries bioluminescentes de l'exemple 3 (à une concentration de 0.5xl09 bactéries/mL) dans la seringue préchauffée, puis on injecte la solution dans le conteneur qui est une enveloppe fabriquée en PDMS (polydiméthylsiloxane). On enlève l'air du conteneur en utilisant une autre seringue. Ce système peut être stocké à 4°C pendant plusieurs jours ou peut être utilisé directement après injection. La bioluminescence commencera quelques heures après induction dès la synthèse des constituants par la bactérie.
Exemple 5 : bioluminescence observée et temps d'éclairage
Le contrôle positif est le contenu d’un bâtonnet Glowstick TM (http://www.glowstick.fr/bracelet-fluo/50-bracelets.html) dilué au quart avec de l’eau. Brièvement, un bracelet Glowstick est préparé en le cassant pour activer l’émission de lumière. Il est ensuite ouvert pour récupérer le contenu dans un tube eppendorf de 1.5mL. 250 μΐ de cette solution sont ajoutés à 750 μΐ d’eau dans un autre tube eppendorf de 1.5mL.
Le conteneur en PDMS de l’exemple 4, contenant 20mL de bactéries bioluminescentes à une concentration de 0.5xl09 bactéries/mL, est comparé au Glowstick (Figure 2).
Toutes les mesures sont effectuées à partir d’un appareil photo Nikon D5000 avec option intervallomètre (1 photo toutes les 30 minutes). Les échantillons sont placés à lm de l’objectif.
Les photos sont converties en échelle de gris puis analysées avec le logiciel Fiji qui permet de quantifier l’intensité d’une zone en termes de pixel sur une échelle de 0 à 255. L’intensité observée directement après injection montre une augmentation progressive et régulière de bioluminescence, qui commence 5 heures après injection. La bioluminescence atteint un palier au bout de 17-18h et reste de même intensité pendant une dizaine d’heures.

Claims (20)

  1. REVENDICATIONS
    1. Système lumineux comprenant, dans un milieu nutritif gélifié : une cassette d'expression d'un ou plusieurs gènes codant la luciférase insérée dans un microorganisme procaryote, un substrat de la luciférase, ledit système étant confiné dans un conteneur perméable aux gaz.
  2. 2. Système lumineux selon la revendication 1, dans lequel le conteneur est fait d'une matière polymère, de préférence du polydiméthylsiloxane.
  3. 3. Système lumineux selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel le microorganisme procaryote est une bactérie Gram-,
  4. 4. Système lumineux selon la revendication 3, dans lequel le microorganisme procaryote est une entérobactérie, préférentiellement E. coli.
  5. 5. Système lumineux selon la revendication 3, dans lequel le microorganisme procaryote est une cyanobactérie, préférentiellement Synechocystis.
  6. 6. Système lumineux selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la cassette d'expression est intégrée au génome du microorganisme procaryote.
  7. 7. Système lumineux selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la cassette d'expression est extrachromosomique.
  8. 8. Système lumineux selon la revendication 7, dans lequel la cassette d'expression est contenue dans un vecteur d'expression, de préférence un plasmide.
  9. 9. Système lumineux selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la cassette d'expression d'un ou plusieurs gènes codant pour la luciférase est sous le contrôle d'un promoteur inductible.
  10. 10. Système lumineux selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le promoteur inductible est choisi parmi les promoteurs T7, pBAD ou pDawn/Dusk.
  11. 11. Système lumineux selon la revendication 10, dans lequel le promoteur inductible est T7.
  12. 12. Système lumineux selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la cassette d'expression d'un ou plusieurs gènes codant pour la luciférase est sous le contrôle d'un promoteur non inductible.
  13. 13. Système lumineux selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et 12, dans lequel le promoteur non inductible est choisi parmi les promoteurs pOsmY, psAB et RpoS.
  14. 14. Système lumineux selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel le ou les gènes de la luciférase est (sont) issu(s) de la bactérie Vibrio Fischeri.
  15. 15. Système lumineux selon la revendication 14, dans lequel les gènes de la luciférase sont les gènes luxA, luxB, luxC, luxD et luxE.
  16. 16. Système lumineux selon la revendication 14, dans lequel les gènes de la luciférase sont les gènes luxA, luxB, luxC, luxD, luxE et luxG.
  17. 17. Système lumineux selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel le milieu gélifié contient de 4 à 10 grammes par litre d'un gélifiant.
  18. 18. Système lumineux selon la revendication 17, dans lequel le milieu gélifié contient de 6 à 8 grammes par litre d'un gélifiant.
  19. 19. Système lumineux selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans lequel le gélifiant est de l'agar.
  20. 20. Procédé de production de lumière mis en œuvre au moyen d'un système tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 19.
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