BRPI0800603B1 - método para remover as células de um tecido biológico de maneira a torná-lo receptivo a novas células e pouco imunogênico - Google Patents

Abstract

método para tornar um tecido biológico acelular, receptivo a novas células e pouco imunogênico. descreve-se a presente patente de invenção corno um método para tornar um tecido biológico acelular, receptivo a novas células e pouco irnunogénico que, de acordo com as suas características, propicia a formação de um método baseado na descelularização de materiais biológicos para confecção de tecidos ou estruturas substitutivas em geral, pelo qual os mesmos são expostos para a completa remoção de células e restos celulares, de modo a restar apenas um arcabouço de matriz extracelular ou bioplástico acelular e receptivo ao repovoamento celular "in vitro" ou "in vivo1' pelo receptor, com células do receptor, células criopreservadas ou de doação compatível ao receptor, aliado a inibição a rejeição do material descelularizado pelo sistema imune deste, com vistas a favorecer de forma extremamente prática, segura e precisa uma completa reconstituição do tecido substitutivo, da estrutura substitutiva ou da área onde se empregou o tecido ou a estrutura descelularizada.

Description

(54) Título: MÉTODO PARA REMOVER AS CÉLULAS DE UM TECIDO BIOLÓGICO DE MANEIRA A TORNÃ-LO RECEPTIVO A NOVAS CÉLULAS E POUCO IMUNOGÊNICO (51) IntCI.: A61L 27/36; A61F 2/02; A61F 2/24; A61L 27/00; A61L 27/34.

(73) Titular(es): CARDIOPRÓTESE LTDA; ASSOCIAÇÃO PARANAENSE DE CULTURA - APC.

(72) Inventor(es): EDUARDO DISCHER VIEIRA; FRANCISCO DINIZ AFFONSO DA COSTA; JOAO GABRIEL RODERJAN MENDONÇA.

(57) Resumo: MÉTODO PARA TORNAR UM TECIDO BIOLÓGICO ACELULAR, RECEPTIVO A NOVAS CÉLULAS E POUCO IMUNOGÊNICO. Descreve-se a presente patente de invenção corno um método para tornar um tecido biológico acelular, receptivo a novas células e pouco irnunogénico que, de acordo com as suas características, propicia a formação de um método baseado na descelularização de materiais biológicos para confecção de tecidos ou estruturas substitutivas em geral, pelo qual os mesmos são expostos para a completa remoção de células e restos celulares, de modo a restar apenas um arcabouço de matriz extracelular ou bioplástico acelular e receptivo ao repovoamento celular in vitro ou in vivol' pelo receptor, com células do receptor, células criopreservadas ou de doação compatível ao receptor, aliado a inibição a rejeição do material descelularizado pelo sistema imune deste, com vistas a favorecer de forma extremamente prática, segura e precisa uma completa reconstituição do tecido substitutivo, da estrutura substitutiva ou da área onde se empregou o tecido ou a estrutura descelularizada.

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MÉTODO PARA REMOVER AS CÉLULAS DE UM TECIDO BIOLÓGICO DE MANEIRA A TORNÁ-LO RECEPTIVO A NOVAS CÉLULAS E POUCO IMUNOGÊNICO

001 Refere-se a presente patente de invenção a métodos biomédicos em geral, mais especificamente a um método para remover as células de um tecido biológico de maneira a tomá-lo receptivo a novas células e pouco imunogênico que, de acordo com as suas características gerais, possui como princípio básico propiciar a formação de um método de remoção de células baseado na descelularização de materiais biológicos para confecção de tecidos ou estruturas substitutivas em geral tomar um tecido biológico acelular, pelo qual os mesmos são expostos para a completa remoção de células e restos celulares existentes, de modo a restar apenas traços de matriz extracelular ou bioplástico acelular e receptivo ao repovoamento celular in vitro ou in vivo pelo receptor, com células do receptor, células criopreservadas ou de doação compatível ao receptor do tecido, além de inibir a rejeição do material descelularizado pelo sistema imune do receptor, com vistas a favorecer de forma extremamente prática, segura e precisa uma completa reconstituição do tecido substitutivo, da estrutura substitutiva ou da área onde se empregou o tecido ou a estrutura descelularizada.

002 Com procedimentos específicos, características de praticidade nos manuseios e nas aplicações para melhor adaptação e segurança dos usuários e, devido às suas características gerais, adaptável a uma enorme gama materiais biológicos, tecidos ou estruturas substitutivas e usuários.

003 A patente em apreço caracteriza-se por reunir componentes e processos em uma concepção diferenciada, a qual atenderá as diversas exigências que a natureza da utilização demanda, ou seja, primordialmente o emprego de homoenxertos valvares descelularizados e semeados in vitro ou in vivo com células autólogas do receptor. Concepção esta que garante um método de remoção de células de grande eficiência, resistência, aplicabilidade, versatilidade, durabilidade, manuseio, precisão e segurança em razão das excelentes qualidades técnicas agregadas e, cujas características gerais diferem dos demais métodos amplamente conhecidos pelo

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2/25 atual estado da técnica.

004 A presente patente consiste no emprego de um prático, moderno, eficiente e seguro método para remover as células de um tecido biológico de maneira a tomá-lo receptivo a novas células e pouco imunogênico formado por um conjunto de soluções físico-químicas e médicas corretamente incorporadas, compondo um método de remoção de células completo e diferenciado, que consiste em uma sequência de lavagens deste em uma solução de tensoativo, uma solução alcoólica, uma solução reidratante, uma solução contendo meio de cultivo celular e antibióticos e, podendo ou não ter um tratamento químico ou com biomoléculas posterior, de modo a tomar qualquer tecido biológico acelular pela remoção das células e restos celulares em um arcabouço celular ideal e receptivo ao repovoamento celular in vitro ou in vivo pelo receptor, com células do receptor, células criopreservadas ou de doação compatível ao receptor do tecido, ou seja, inibindo a rejeição do material descelularizado pelo sistema imune do receptor, favorecendo assim uma reconstituição do tecido ou área onde empregou-se o tecido descelularizado, isto é, proporcionando a correção de uma patologia, ou dano a um órgão, ou por estética, sem haver rejeição do material biológico implantado no receptor, mais precisamente proporcionando a criação de substitutos de tecidos biológicos para uma aplicação de recuperação tecidual como mais uma opção de tratamento a patologias que necessitam de reposição ou troca de tecidos biológicos que não correspondem mais a sua função, tomando-se patológicos.

005 A aplicação do presente método de remoção de células baseia-se no condicionamento de um tecido biológico a fim de tomá-lo uma estrutura fisiologicamente compatível, com anatomia ideal e capacidade regenerativa. O processo de descelularização de materiais biológicos proporciona a construção, a recuperação ou melhora de um órgão ou tecido ou suas partes, de modo que é possível restabelecer um órgão ou tecido ou suas partes implantando, injetando ou aplicando um arcabouço acelular, biocompatível e acolhedor as células do receptor, que por sua vez podem ser semeadas in vitro ou in vivo, restabelecendo a funcionalidade do tecido aplicado.

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006 A regeneração dos tecidos acometidos por algum tipo de injúria seja ela patológica ou não, muitas vezes é difícil sendo o prognóstico de perda da função. Pelos mais variados motivos muitos pacientes necessitam de transplante do órgão para restabelecer sua saúde e qualidade de vida. Embora os esforços das campanhas para doação de órgãos e tecidos tenham ótimos resultados, o número de órgãos transplantados que realmente recuperam o estado de saúde do paciente é pequeno quando comparado a fila de espera. Por outro lado o transplante, muitas vezes, não é o tratamento definitivo podendo o paciente ter uma reincidiva da patologia ou, o mais comum, desenvolver a doença do enxerto versus hospedeiro.

007 Diante disso, procura-se buscar a cura definitiva para estes pacientes, proporcionando um tratamento que não ofereça riscos e tenha uma rápida recuperação com regeneração do órgão ou tecido acometido pela patologia. Com o emprego da descelularização é possível tomar um órgão doado que seria descartado por falta de compatibilidade com o receptor, ou excedeu o tempo hábil para o transplante, em um tecido com alto potencial regenerativo e perfeitamente biocompatível, ou então o órgão ou tecido de um animal após ser processado transforma-se em uma opção na recuperação do órgão e tecido de um paciente.

008 Atualmente, um dos tecidos onde o avanço tecnológico busca um substituto ideal são as válvulas cardíacas, que por motivos patológicos é necessária sua plastia - remodelamento estrutural cirúrgico - ou substituição. Devido a inúmeros tipos de complicação o substituto ideal para uma válvula cardíaca ainda não foi alcançado. Diante da problemática citada, o método de remoção de células de um tecido biológico toma possível a confecção de um tecido substitutivo muito próximo do ideal para uma válvula cardíaca saudável.

009 Várias doenças, incluindo defeitos congênitos, moléstia reumática, degeneração mixomatosa, degeneração calcifica e processos infecciosos, entre outras, podem danificar a estrutura de uma ou mais vai vas, causando a estenose e/ou a insuficiência valvar. Nos casos de estenose, as valvas não se abrem adequadamente, com consequente obstrução ao fluxo sanguíneo. Já nas insuficiências, as valvas não se fecham de forma apropriada, permitindo o refluxo

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4/25 sanguíneo. Seja num caso ou no outro, o mau funcionamento das valvas diminuem o rendimento e a eficiência do coração e resultam em importante sobrecarga do músculo cardíaco. Dessa forma, pacientes com lesões valvares tomam-se progressivamente limitados, com sinais e sintomas de insuficiência cardíaca, e finalmente morrem se não tratados cirurgicamente em tempo hábil.

0010 Quando um paciente é operado para a correção de uma doença valvar, a primeira opção seria a de se reparar a valva acometida por meio de procedimentos denominados plastias valvares. Entretanto, em grande número de casos, a deformidade do aparelho valvar é tão importante, que a única alternativa possível é a substituição da mesma por próteses valvares cardíacas, sendo que estas próteses valvares cardíacas convencionais podem ser divididas em dois grupos básicos: as próteses biológicas e as próteses mecânicas.

0011 As próteses valvares biológicas convencionais são feitas a partir de tecidos animais, sendo os tipos mais comuns a de pericárdio bovino ou a valva aórtica porcina. Como o mecanismo valvular dessas próteses é semelhante ao das valvas nativas, o seu funcionamento é satisfatório e proporciona boa qualidade de vida aos pacientes após o implante. Entretanto, apresentam como desvantagem a durabilidade limitada, especialmente em crianças, adolescentes e pacientes jovens.

0012 Os resultados tardios com o emprego de próteses valvares biológicas são bem documentados na literatura, e podem ser resumidos com os dados abaixo relacionados. Fann et al (Fann JI, Miller DC, Moore KA, Mitchell RS, Oyer PE, Stinson EB, Robbins RC, Reitz BA, Shumway NE. Twenty-Clinical Experience With Porcine Bioprosthese. Ann Thorac Surg 1996; 62:1301-12) da Universidade de Stanford, Califórnia, EUA, estudaram os resultados tardios em dois mil oitocentos e setenta e nove pacientes submetidos ao implante de próteses valvares biológicas em posição mitral ou aórtica e observaram que, após quinze anos de evolução pósoperatória, a incidência de disfunção valvar primária foi de onze por cento (próteses aórticas) e sessenta e seis por cento (próteses mitrais) em pacientes com idade superior a setenta anos. Entretanto, quanto menor a faixa etária dos pacientes, pior foram os resultados, de modo que, em pacientes com idade entre dezesseis e trinta

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5/25 anos, a incidência de disfunção protética foi de setenta e um por cento em próteses aórticas e oitenta e três por cento nas mitrais.

0013 Estudo semelhante foi realizado por Jamienson et al (Jamienson WRE, Burr LH, Munro AI, Miyagishima RT. Carpentier-Edwards Standard Porcine Bioprosthesis: A 21-Year Experience. Ann Thorac Surg;66:S40-3) da Universidade British Columbia, Vancouver, Canadá, que analisaram mil cento e oitenta e um pacientes com até vinte e um anos de evolução pós-operatória, de modo que, em pacientes jovens, a probabilidade de uma prótese aórtica durar mais do que quinze anos é virtualmente nula. Os resultados do emprego de biopróteses em crianças e adolescentes são desanimadores, pois nessa faixa etária, a degeneração por calcificação é muito precoce e, por conseguinte, a maioria dos autores considera o seu uso proibitivo nessas circunstâncias. Odell et al (Odell JA, Gillmer D, Whiton ID, Vythilingum SP, Vanker EA. Calcification of Tissue Valves in Children: Occurrence in Porcine and Bovine Pericardial Bioprosthetic Valves. In: Biologic Bioprosthetic Valves (Bodnar A, Yacoub M). New York. Yorke Medicai Books, 1985, p 259), na África do Sul, demonstraram que tanto as próteses de pericárdio bovino como as porcinas dificilmente apresentam durabilidade maior do que cinco anos.

0014 As próteses vai vares mecânicas são construídas a partir de ligas metálicas especiais (e.g. carbono pirolítico) e, ao contrário das próteses biológicas, partem da concepção básica de possuírem durabilidade ilimitada. Existem diversos modelos comercialmente disponíveis, porém, as mais modernas e de maior uso atualmente são as próteses mecânicas de duplo folheto. Entretanto, o grande problema relacionado ao uso das próteses mecânicas, está na alta incidência de formação de coágulos sanguíneos em tomo da mesma, com o consequente risco de trombose valvar aguda ou da ocorrência de fenômenos tromboembólicos, sendo que na trombose valvar aguda a prótese fica totalmente obstruída por coágulos sanguíneos causando um quadro clínico muito grave e com alta mortalidade e o tromboembolismo ocorre quando coágulos sanguíneos menores formados em tomo da prótese se soltam dentro do coração e migram para a circulação periférica, sendo

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0015 Os tipos mais graves e provavelmente os mais freqüentes, são as embolias cerebrais, que causam acidentes vasculares cerebrais (derrames), podendo deixar sequelas graves ou até mesmo serem fatais. Por esse motivo, pacientes submetidos ao implante de próteses valvares mecânicas, devem, obrigatoriamente, fazer uso de medicação anticoagulante (cumarínicos) para o resto da vida, na tentativa de prevenir a formação desses coágulos.

0016 Entretanto, mesmo na vigência terapia anticoagulante adequada, a ocorrência de fenômenos tromboembólicos não é completamente eliminada, ficando a sua incidência em tomo de um a dois por cento por ano, significando que, ao final de dez anos de evolução, em tomo de dez a vinte por cento dos pacientes terão apresentado algum fenômeno tromboembólico. Além disso, o uso de anticoagulantes está associado com a ocorrência de fenômenos hemorrágicos, numa incidência em tomo de dois a três por cento por ano. Cumpre ressaltar que em muitas situações os acidentes hemorrágicos podem ter consequências ainda mais graves do que a própria ocorrência do tromboembolismo. Alguns aspectos relacionados com a anticoagulação também merecem ser mencionados. Por ser uma medicação com resposta variável, pacientes que usam cumarínicos devem fazer exames laboratoriais e acompanhamento médico mensal para o controle do nível sérico do medicamento. Isso, não somente prejudica a qualidade de vida como tem implicações econômicas para o paciente e para o sistema de saúde.

0017 Em decorrência dessas dificuldades, sabe-se que em países com menor condição sócio-econômica, o adequado controle da anticoagulação fica bastante prejudicado, especialmente em pacientes de zonas rurais. Esse fato, por si só, chega a ser uma contra indicação relativa para o uso de cumarínicos em boa proporção de pacientes que necessitam de uma substituição valvar. Isso explica a diferença na escolha do substituto valvar mais adequado dependendo do perfil sócio-econômico da população.

0018 Da mesma forma com que com as próteses biológicas, os resultados tardios com as próteses mecânicas também são bem conhecidos, e podem ser sumarizados.

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Assim pode-se observar que, apesar do potencial de durabilidade das próteses mecânicas ser ilimitado, a probabilidade de morte ou seqüela grave relacionados com a prótese após quinze anos de evolução fica em tomo cinqüenta por cento (Lund O, Nielsen SL, Arildsen H, Ilkjaer LB, Pilegaard HK. Standart Aortic ST Jude Valve At 18 Year. Perfomance Profile And Determinants Of Outcome. Ann Thorac Surg 2000;69:1459-65).

0019 Por outro lado, os resultados com o uso de próteses mecânicas sem medicação anticoagulante demonstraram uma incidência muito elevada de tromboembolismo, desaconselhando o seu uso nessas circunstâncias. Um desses estudos foi realizado pela Santa Casa de Curitiba na década de 80 (Costa IA, Faraco DF, Aallum FS, Pesarini A, Oliveira ECC, Takasaki G, Costa FDA. Experiência de Quatro Anos com Prótese Aortica Medtronic Hall. Medtronic - 15-20, 1984).

0020 Alguns estudos foram realizados para se avaliar, comparativamente, os resultados clínicos com o emprego de próteses biológicas e mecânicas convencionais. A maior parte desses estudos apresenta importantes limitações relacionadas à amostra dos pacientes e comparabilidade entre os grupos. Entretanto, o Veteran Affairs, nos EUA, fez estudo comparativo, prospectivo e randomizado em mil duzentos e oitenta e seis pacientes com idade média de sessenta e quatro anos e,concluíram que, a sobrevida tardia foi semelhante entre os grupos, independente do tipo da prótese empregada (Hammermeister K, Sethi GK, Henderson WG, Grover FL, Oprian C, Rahimtoola SH. Outcomes 15 Years After Valve Replacement With a Mechanical a Bioprothestic Valve. J Am Coli Cardiol 2000 oct;34(4): 11528). Porém, um dos dados mais importante desse estudo foi de que em tomo de quarenta por cento da mortalidade tardia foi relacionado com complicações diretamente relacionadas com as próteses, o que justifica a busca por substitutos valvares mais fisiológicos e de melhor qualidade.

0021 Um grupo distinto de próteses valvares é igualmente importante, os homoenxertos, que nada mais são do que valvas cardíacas humanas que podem ser transplantadas como substitutos valvares em pacientes. Na verdade, homoenxertos valvares poderíam ser considerados como um tipo de prótese biológica, entretanto,

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8/25 uma série de particularidades relacionadas à sua obtenção, ao seu desempenho funcional e durabilidade, assim como aspectos técnicos de implante cirúrgico, fazem com que eles sejam considerados como um grupo distinto de próteses valvares. Do ponto de vista funcional, os homoenxertos são superiores a qualquer outro tipo de substituto valvar. Por serem valvas humanas normais, possuem fluxo sanguíneo laminar central e seu desempenho hemodinâmico é fisiológico, ou seja, não apresentam gradientes residuais e não tem refluxo valvar.

0022 Por esse motivo, a incidência de fenômenos tromboembólicos é virtualmente nula, não necessitando de nenhuma terapêutica anticoagulante. Esses fatores possibilitam melhor qualidade de vida a esses pacientes, quando comparados com os das próteses convencionais (O'Brien MF, Stafford EG, Gardner MA, Pohlner PG, Tesar PJ, Cochrane AD, Gall Smith SE. Allograft Aortic Valve Replacement: LongTerm Follow-up. Ann Thorac Surg. 1995 Aug;60(2 suppl): S65-70 ; O'Brien MF, Harrocks S, Stafford EG, Gardner MA, Polhner PG, Tesar PJ, Stephens E. The Homograft Aortic Valve: a 29 year, 99,3% Follow-up of 1,022 Valve Replacements. J Heart Valve Dis. 2001 May; 10(3): 334-44; Discussion 335).

0023 Além da melhor qualidade de vida, o desempenho hemodinâmico fisiológico dos homoenxertos valvares propicia melhor regressão da hipertrofia ventricular esquerda, o que resulta em maior sobrevida tardia nos pacientes operados. Esse aspecto é de extrema importância na seleção do substituto valvar mais apropriado, especialmente em pacientes jovens (O'Brien MF, Stafford EG, Gardner MA, Pohlner PG, Tesar PJ, Cochrane AD, Gall Smith SE. Allograft Aortic Valve Replacement: Long-Term Follow-up. Ann Thorac Surg. 1995 Aug;60(2 suppl): S6570 ; O'Bricn MF, Harrocks S, Stafford EG, Gardner MA, Polhner PG, Tesar PJ, Stephens E. The Homograft Aortic Valve: a 29 year, 99,3% Follow-up of 1,022 Valve Replacements. J Heart Valve Dis. 2001 May; 10(3): 334-44; Discussion 335. 0024 Apesar de todas essas vantagens, algumas limitações importantes ainda impedem o uso mais abrangente e rotineiro dos homoenxertos valvares, e merecem ser discutidos mais detalhadamente. O primeiro desses aspectos se refere à maior dificuldade técnica das operações, fazendo com que o emprego de homoenxertos

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9/25 fique, de forma geral, mais restrita a grandes centros com maior volume de operações. Entretanto, as técnicas de implante puderam ser relativamente padronizadas ao longo dos últimos anos, tomando-as mais acessíveis para cirurgiões cardíacos experientes e com determinação para aplicá-las (O'Brien MF. Allograft Aortic Root Replacement: Standardization and Simplification of Technique. Ann Thorac Surg. 1995 Aug; 62(2 Suppl):S92-4 ; 0'Bricn MF, Finney RS, Stafford EG, Gardner MA, Pohlner PG, Tesar PJ, Cochrane AD, Gall Smith SE. Root Replacement For Ali Allograft Aortic Vai ves: Preferred Technique or Too Radical? Ann Thorac Surg 1995 Aug;60(2 Suppl):S87-91).

0025 Sem dúvida, a maior limitação para o uso mais rotineiro dos homoenxertos ainda está na dificuldade da obtenção de doadores humanos e nas técnicas sofisticadas e caras para o seu processamento e estocagem. Apesar de homoenxertos valvares serem amplamente utilizados nos países desenvolvidos há mais de quarenta anos, no Brasil, somente nos últimos anos com o desenvolvimento do sistema nacional de transplantes foi possível iniciar programas mais estruturados para a criação de diversos bancos de tecidos, incluindo o de homoenxertos valvares cardíacos, como o do Banco de Homoenxertos Valvares da Santa Casa de Curitiba que já processou mil e oitocentas valvas, das quais mil e duzentas já implantadas. As técnicas de processamento e estocagem empregadas por este Banco de Homoenxertos Valvares são baseadas na criopreservação, e seguem as diretrizes formuladas pelos bancos de homoenxertos dos países europeus e dos EUA (Bodnar E, Ross D. Valvular Homografts - Chapter 12 - in Replacement Cardiac Valves; Pergamon Press 1981).

0026 Apesar de essas técnicas permitirem a preservação tecidual com manutenção de viabilidade celular, homoenxertos valvares criopreservados também apresentam durabilidade limitada, provavelmente em decorrência de fatores imunogênicos envolvidos com o transplante valvar. Embora Welters et al (Welters MJP. Oei FBS, Witvliet MD, Vaessen LMB, Dijkhuis AHC, Borges JJC, Weimar W, Claas FHJ. A Broad and Strong Humoral Immune Response to Donor HLA. After Implantation of Cryopreserverd Human Heart Valve Allografts. Human Ummunilogy 2002;63:1019Petição 870180042291, de 21/05/2018, pág. 61/83

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1025) tenham sugerido que a intensidade dessa reação aumenta a probabilidade de disfunção do enxerto, a correlação entre a resposta imunológica e os resultados tardios não pode ser demonstrada nos diversos estudos da literatura (Welters MJP. Oei FBS, Witvliet MD, Vaessen LMB, Dijkhuis AHC, Borges JJC, Weimar W, Claas FHJ. A Broad and Strong Humoral Immune Response to Donor HLA. After Implantation of Cryopreserverd Human Heart Valve Allografts. Human Immunology 2002;63:1019-1025 ; Dignan R. OBrien M, Hogan P, Thomton A, Fowler K, Byme D, Stephens F, Harrocks S. Aortic Valve Allograft structural Deterioration is Associated With of Antibodies to . J Heart Valve Dis 2003 May; 12(3):382-90;discussion 390-1).

0027 Quando comparado às próteses biológicas convencionais, homoenxertos valvares apresentam maior durabilidade em qualquer faixa etária, de modo que, em pacientes com idade superior a sessenta anos, a probabilidade de disfunção dos homoenxertos após vinte e cinco anos do implante é de apenas dez por cento entretanto, em pacientes abaixo de vinte anos de idade a probabilidade de disfunção chega a quarenta e três por cento aos quinze anos de evolução. Apesar de esses resultados serem melhores do que com os das próteses biológicas convencionais, seu resultado ainda deixa a desejar, especialmente em crianças e adolescentes.

0028 Desta forma, a melhor alternativa atualmente disponível para esse grupo de pacientes é a Operação de Ross, que pode ser assim explicada. A valva pulmonar (que fica na saída do ventrículo direito) é praticamente igual à valva aórtica (que fica na saída do ventrículo esquerdo), tanto na sua morfologia como nas suas dimensões., de modo que, quando um paciente apresenta a sua valva aórtica doente, a mesma é retirada e substituída pela valva pulmonar do próprio paciente, ou seja, pelo autoenxerto pulmonar. Para a reconstrução da via de saída do ventrículo direito, onde estava à valva pulmonar, implanta-se um homoenxerto valvar criopreservado. A lógica deste procedimento consiste de que, o autoenxerto pulmonar usado em posição aórtica é uma valva autóloga viva e, portanto, imunologicamente inerte, com capacidade regenerativa e de crescimento, podendo eventualmente representar a cura da doença aórtica, sendo um substituto permanente.

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0029 O problema passa então para o lado direito, onde foi implantado o homoenxerto criopreservado. Entretanto, por estar sendo utilizado no lado direito da circulação, onde a pressão é três a quatro vezes menor do que no lado esquerdo, o homoenxerto pode durar até trinta ou quarenta anos, mesmo em crianças e adolescentes (Ross D. Pulmonary Valve Autotransplantation (the Ross Operation)). J Card Surg 1988; 3(3 Suppl): 313-9 ; Chambers JC, Somervile J, Stone S, Ross DN. Pulmonary Autograft Procedure for Aortic Valve Disease: Long-term Results of the Pioneer Series. Circulation 1997; 96: 2206-14). De fato, recentemente Yacoub et al reportaram a evolução do primeiro paciente no mundo submetido à Operação de Ross, que ainda está vivo, com as valvas normofuncionantes, trinta e seis anos após a operação inicial (Hon JKF, Melina G, Wray J, Yacoub MH. Insights from 36 Years Follow-Up a Patient With The Ross Operation. The Journal of Heart Valve Disease 2003; 12: 561-565).

0030 Os dados do Registro Internacional da Operação de Ross demonstram que após vinte anos de evolução, a sobrevida tardia foi acima de oitenta por cento e a incidência de disfunção do autoenxerto pulmonar e do homoenxerto valvar foram de apenas um ponto nove pontos percentuais e dois ponto oito pontos percentuais respectivamente. Considerando que a maioria dos pacientes submetidos a esse procedimento são crianças ou pacientes jovens, fica claro que a Operação de Ross é indiscutivelmente superior a qualquer outro tipo de substituto valvar nesses pacientes (Ourv JH, Hiro SP, Maxwell JM, Lamberti JJ, Duran CM. The Ross Procedure: Curren Registry Results. Ann Thorac surg 1998 Dec;66(6 suppl):S1625). A maior limitação para o emprego rotineiro da Operação de Ross é a dificuldade técnica do procedimento, não devendo ser realizada em serviços com baixo volume de casos ou quando a equipe cirúrgica não for devidamente treinada para a sua execução.

0031 A partir destes conceitos e estudos, pode-se definir com exatidão o fundamento primordial desta invenção que é a de promover a remoção das células de um homoenxerto tomando-o um arcabouço valvar ideal para que, após o implante, tenha características semelhantes à válvula pulmonar, ou seja, um enxerto vivo,

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12/25 inerte do ponto de vista imunogênico, e que eventualmente tenha capacidade regenerativa de crescimento (Dohmen PM, da Costa F, Konertz W. Tissue Engineered Heart Valves; The Latest Generation of Biological Valve Prostheses. Arq Bras Cardiol 2002;79(5):555-559).

0032 Desta forma, o presente método fundamenta-se na produção de tecidos biológicos acelulares e inertes ao sistema imune em laboratório, tomando-os estruturas funcionais vivas tais como ossos, dentes, tendões, cartilagens, pele, vasos sanguíneos, valvas cardíacas, ureter, membranas de revestimento (pleura, pericárdio, peritônio, dura-máter, submucosa intestinal, submucosa da bexiga e placenta) e podendo até ser aplicada a órgãos inteiros, como pele, coração e rins, entre outros. Dessa forma, toma-se possível a realização de operações reconstrutivas e/ou reparadoras em estruturas danificadas ou doentes com restauração completa e definitiva de sua função (Vacanti JP, Vacanti CA. The Challenge of Tissue Engineering. In. Principies Of Tissue Engineering. (Lanza RP, Langer R, Chick WL). Academic Press 1997; pg. 01-05). No campo dos enxertos cardiovasculares, isso significa o desenvolvimento de vasos sanguíneos e valvas cardíacas que, além de anatomicamente semelhantes às estruturas a serem substituídas, sejam também funcionalmente ativas e biologicamente compatíveis, com capacidade regenerativa e de crescimento, sendo, portanto fisiológicas e definitivas.

0033 Cabe ressaltar que, no desenvolvimento de uma prótese valvar cardíaca por engenharia de tecidos, dois elementos básicos são fundamentais: a matriz extracelular e o isolamento e cultivo celular.

0034 Substitutos valvares ideais devem possuir uma estrutura muito próxima a da válvula funcional, por este motivo utiliza-se valvas cardíacas humanas ou animais. Desde que convenientemente tratadas, as valvas, podem ter seu potencial imunogênico drasticamente reduzido, se constituindo em matrizes naturais anatomicamente perfeitas. Além disso, possuem glicosaminoglicanas e proteínas de ligação que são essenciais para a adequada adesão e proliferação celular, o que facilitaria a reorganização tecidual tanto in vitro como in vivo (O'Bricn MF, Goldstein S, Walsh S, Black, Elkins R, Clarke D. The SynerGraft Valve: A New

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Acellular (Nonglutaraldehyde-Fixed) Tissue Heart Valve for Autologous Recellularization First Experimental Studies Before Clinicai Implantion. Semin Thorac Cardiovasc Surg 11:194-200, 1999 ; Elkins RC, Lane MM, Capps SB, McCue C, Dawson PE. Hunoral Immune Response to Allograft Valve Tissue Pretreated With an Antigen Reduction Process. Semin Thorac Cardiovasc Surg 2001;13(suppl 1):82-86 ; Elkins RC, Goldstein S, Hewitt CW, Walsh SP, Dawson PE, Ollerenshaw JD, Black KS, Clarke DR, OBricn MF. Recellularization of Heart Valve Grafts by a Process of Adaptive Remodeling. Semin Thorac Cardiovasc Surg 13:87-92, 2001).

0035 É bem estabelecido que a maior fonte de antigenicidade dos tecidos vai vares se concentra nos seus elementos celulares, tanto nas células endoteliais como nos miofibroblastos, que causam a ativação de linfócitos T e produção de anticorpos do sistema HLA contra antígenos de histocompatibilidade do tipo I e II. Assim sendo, a eliminação parcial ou total dos elementos celulares é um passo essencial para a obtenção de matrizes naturais apropriadas (Elkins RC, Lane MM, Capps SB, McCue C, Dawson PE. Hunoral Immune Response to Allograft Valve Tissue Pretreated With an Antigen Reduction Process. Semin Thorac Cardiovasc Surg 2001;13(suppl

1):82-86 ; Elkins RC, Goldstein S, Hewitt CW, Walsh SP, Dawson PE, Ollerenshaw JD, Black KS, Clarke DR, O'Brien MF. Recellularization of Heart Valve Grafts by a Process of Adaptive Remodeling.Semin Thorac Cardiovasc Surg 13:87-92, 2001). 0036 Diversos tratamentos químicos capazes de descelularizar as cúspides vai vares e as paredes arteriais dos condutos tem sido propostas, incluindo o uso de tripsina, dodecilsulfato de sódio (SDS), octilphenoxietoxietanol (Triton X-100), ácido deoxicólico, soluções hipo e hipertônicas, enzimas como a RNAse e DNAse, etanol, álcoois de cadeia longa, polietilenoglicol, propilenoglicol, sais biliares, CHAPS, tween 20, tween 80 e o glicerol (Kasimir MT, Rieder E, Seebacher G, Silberhumer G, Wolner G, Weigel G, Simon P. Comparision of Different Decellularization Procedures of Porcine Heart Valves. Int J Artif Organs 2003;26:421-7 ; Kim WG, Park JK, Lee WY. Tissue-Engineered Heart Valve Leaflets: An Effective Method of Obtaining Acellularized Valve Xenografts. Int J Artif Organs 2002;25:791-7 ;

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Courtman DW, Pereira CA, Kashef V, McComb D, Lee JM, Wilson GJ. Development of a Pericardial Acellular Matrix Biomaterial: Biochemical and Mechanical Effects of Cell Extraction. J Biomed Mater. Res.,25,655-666(1994) ; Bader A, Schilling T, Teebken OE, Brandes G, Herden T, steinhoff G, Haverich A. Tissue Engineering of Heart Valves - Human Endothelial Cell Seeding of Detergent Acellularized Porcine Valves.Eur J Cardiothorac Surg 1998;14:279-283 ; Elkins RC, Dawson PE, Goldstein S, Walsh SP, Black KS. Decellularized Human Valve Allografts. Ann thorac Surg 2001;71:S428-32).

0037 No tratamento químico empregado na presente patente se faz o emprego de um tensoativo de origem biológica ou inorgânica em meio aquoso com tonacidade apropriada, a fim de se obter vários tipos de tecido acelulares para aplicação nas mais variadas áreas da medicina, como cardiologia, proctologia, estética, cirurgias corretivas, vascular, ortopedia, cirurgia geral entre outras, de modo que, independente da metodologia empregada, o objetivo final é o de se obter um tecido acelular, entretanto, sem danificar os componentes da matriz extracelular como o colágeno e as fibras elásticas, além de manter a proporção das macromoléculas intacta. Dessa forma, procura-se obter uma matriz imunologicamente inerte, com propriedades biomecânicas preservadas, não citotóxicas e que seja totalmente biocompatível, sendo que estas características são necessárias para a completa aceitação do organismo, incluindo o sistema imune, do receptor do enxerto descelularizado. Sendo uma matriz extracelular acelular, o enxerto toma-se um arcabouço perfeito para as células do paciente receptor crescerem sobre o enxerto formando uma válvula biologicamente ativa e adaptada a funcionalidade requerida, possibilitando uma melhoria na qualidade de vida do paciente.

0038 Embora o uso de valvas animais para a obtenção de essas matrizes serem bem mais fácil e prático, o risco de transmissão de doenças infecciosas e a possibilidade de reação imunológica contra elementos presentes na matriz heteróloga ainda representam desvantagens significativas (Cebotari S, Mertsching H, Kallenbach K, Kostin S, Repin O, Batrinac A, Kleczka C, Ciubotaru A, Haverich A. Construction of Autologous Human Heart Valves Based on an Acellular Allograft Matrix.

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Circulation 2002;106(suppl 1):1-63-1-68). Isso pode ser evidenciado no estudo experimental de Allaire et al (Allaire E, Guelttler C, Michel JB. Cell-free Grafts: Morphologic Characteristics of Aortic Isografts and Xenografts in Rats. J Vasc Surg 1994;19:446-456) que demonstraram, experimentalmente em ratos, que o implante de aortas heterólogas acelulares resultou em formação de aneurismas em decorrência da degradação das fibras elásticas por comprometimento imunogênico. Já as aortas homólogas acelulares se mantiveram bem preservadas e com calibre preservado. Por esse motivo, a presente patente baseia-se em enxertos homólogos descelularizados como matriz extracelular, visto que são os mais seguros e fisiológicos.

0039 O outro elemento essencial em vai vas construídas pela engenharia de tecidos é o isolamento, cultivo e multiplicação in vitro de células endoteliais e miofibroblastos, os quais serão subsequentemente semeados na matriz extracelular. Fica óbvio, portanto, que para a obtenção de um tecido vivo e funcional, há necessidade de boa compatibilidade e interação entre as células e a matriz. O isolamento de células endoteliais, miofibroblastos e células musculares lisas geralmente é feito a partir de um pequeno segmento de veia safena, apesar de outras fontes tais como a veia jugular, veias do membro superior, segmentos arteriais ou até mesmo fragmentos da valva tricúspide obtidas por biópsia poderem ser empregados 0040 Mais recentemente, o uso de células tronco também tem sido preconizado com essa finalidade (Dohmen PM, Ozaki S, Verbeken E, Yperman J, Flameng W, Konertz W. Tissue Engineering of a Pulmonary Xenograft Heart Valve. Asian Cardiovasc Thoracic Surg 2002; 10(1):25-30 ; Dohmen PM, Lembcke A, Hotz H, Kivelitz D, Konertz WF. Ross Operation With a Tissue-Engineered Heart Valve. Ann Thorac Surg 2002;74:1438-42 ; Dohmen PM, Dushe S, Kem H, Konertz W. First Clinicai Implatation of a Tissue Engineered Heart Valve Using a Glutaraldehyde Free Xenogenic Scaffold. La Arch Cardiovasc Sei 2003;4(4):26-30 ; 36. Maish MS; Hoffman-Kim D, Krueger PM, Souza JM, Harper JJ, Hopkins RA. Tricuspid Valve Biopsy: A Potential Source of Cardiac Myofibroblast Cells for Tissue-Engineered Cardiac Valves. The Journal of Heart Valve Disease 2002;l 1(4):257-261 ; Rezai N, Podor TJ, McManus Bm. Bone Marrow Cells in the

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Repair and Modulation Of Heart and Blood Vessels: Emerging op Engineered Tissue and Biomechanical Materials. Artif Organs 2004 Feb;28(2): 142-51). Apesar do isolamento, cultivo e semeadura dessas células serem bastante criteriosas e exigirem ambientes e equipamentos adequados e sofisticados, as técnicas empregadas são relativamente uniformes e bem estabelecidas na literatura. A maior controvérsia, entretanto, refere-se as quais células e em que quantidade elas necessitam ser semeadas in vitro antes do implante. Ceborati et al demonstraram que valvas cardíacas humanas descelularizadas com tripsina/EDTA quando semeadas com células endoteliais sob condições apropriadas de fluxo em bioreator, resultaram na formação de camada endotelial confluente e com alta atividade metabólica.

0041 Por sua vez, Gulbins et al demonstraram que a semeadura de próteses valvares com fibroblastos e células endoteliais foi mais efetiva do que quando essas próteses foram revestidas somente com células endoteliais. Isso ocorreu porque a síntese de colágeno e outras macromoléculas essenciais na produção da lâmina basal e da lâmina elástica interna são realizadas pelos fibroblastos. Por sua vez, a presença de uma lâmina basal mais definida permite melhor adesão e proliferação de células endoteliais, resultando numa camada endotelial confluente e uniforme. Isso demonstra a importância da interação e interdependência dos diversos tipos celulares entre si e com a matriz extracelular para a adequada funcionalidade tecidual.

0042 Existem dois enfoques básicos para o uso clínico dos homoenxertos decelularizados. No primeiro, a matriz descelularizada é implantada em pacientes, e a re-população tecidual ocorrerá in vivo, pelo próprio hospedeiro após o implante. Altemativamente, a matriz é repovoada por células do hospedeiro in vitro, antes do implante, de forma que o paciente receberá o enxerto já semeado com células autólogas. Cada método tem vantagens e desvantagens, não havendo, atualmente, resposta definitiva sobre a real superioridade de um sobre o outro.

0043 A maioria dos trabalhos que envolvem remoção de células dos tecidos trata de enxertos cardiovasculares, visto sua importância no tratamento das doenças cardiovasculares, porém a descelularização de material biológico é aplicável em

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17/25 inúmeras situações, como descelularização de outros tipos de tecido empregados em diversas patologias, com a finalidade de tomarem-se um tipo de tratamento de patologias que demandam reposição tecidual.

0044 Cabe ainda ressaltar que, nos dias atuais, é de conhecimento o pedido de patente de Invenção PI 0116309-4, Um Método para Descelularizar Material Estranho para Produzir Biopróteses, depositado em 5 de dezembro de 2001 e tendo como Titular Auto Tissue Gmbh e Inventores Wolfgang Konertz e Pascal Dohmen, sendo que a mesma possui como prioridade a patente alemã DE 100649483 de 20 de dezembro de 2000, na qual um método semelhante de remoção de células, empregando tensoativos, é descrito utilizando um processo de lavagem de três etapas. A primeira etapa constitui na lavagem do material com solução aquosa contendo 0,9% de cloreto de sódio, deoxicolato de sódio a 1% e EDTA (etilenodiamino tetracético) a 0,02%, por vinte e quatro horas a temperatura de 37°C, logo após lavagem com etanol 70% à temperatura ambiente por vinte e quatro horas e posterior reidratação com solução aquosa com 0,9% de cloreto de sódio. Após o processo os inventores indicam uma esterilização com antibióticos. Este processo, acima citado, é semelhante ao da presente patente pelo emprego de um tensoativo orgânico de origem biológica, pois o deoxicolato de sódio trata-se de um sal biliar, sendo que, devido a sua estrutura química os sais biliares têm caráter anfótero e são considerados tensoativos.

0045 É sabido que, quando se emprega um tensoativo sobre um tecido biológico, a molécula de tensoativo liga-se aos lipídios da membrana celular das células do tecido e algumas proteínas com sítios hidrofóbicos, como proteínas transmembrânicas, esta interação instabiliza a organização da membrana plasmática das células, que se rompem liberando o conteúdo intracelular, onde há proteínas e lipídios que sofrem a interação com as moléculas de tensoativo. Este processo de aplicação de tensoativo sob condições ideais de agitação de temperatura, bem como pH da solução são efetivos e resultam na completa remoção das células de um tecido biológico.

0046 No entanto, no método desta patente com prioridade alemã o tensoativo

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18/25 empregado tem uma capacidade limitada de remoção das células, devido à rápida saturação da sua atividade antipática - solubilidade em água e óleo, por este motivo a remoção das células não se dá por completa, restando no tecido restos celulares, proteínas intracelulares, DNA e RNA. Estes resíduos presentes na matriz extracelular aumentam sua imunogenicidade, diminuindo a compatibilidade com o receptor e reduzindo a vida útil do enxerto. Já, na presente patente, o tensoativo empregado é o dodecil sulfato de sódio - SDS, de origem não biológica, por isto a capacidade de maior remoção das células, com uma menor taxa de saturação e, portanto, tomando-o mais eficiente.

0047 De uma forma geral, comparando-se os métodos empregados na presente patente com a prioridade alemã frente à aplicabilidade, reprodutibilidade e resultados, pode-se demonstrar as melhorias oferecidas pela presente patente.

0048 A aplicabilidade da patente com prioridade alemã não é clara, pois o método oferece limitação quanto à quantidade e tipo de tecido, visto que o deoxicolato de sódio é incapaz de remover completamente células de tecidos densos, como ossos e tendões. Quanto à reprodutibilidade, os ensaios realizados em laboratório e vários trabalhos científicos publicados demonstram a dificuldade em reproduzir com exatidão resultado semelhante ao proposto na patente com prioridade alemã, sendo que nestes trabalhos ficam demonstrados os problemas da tecnologia como resíduos químicos, restos celulares e material nucléico aderidos a matriz extracelular e instabilidade da matriz reduzindo sua aplicabilidade. Os resultados clínicos da patente com prioridade alemã quando comparados aos da presente patente, analisando válvulas cardíacas implantadas em seres humanos, em uma pesquisa clínica, demonstram-se inferiores. A evolução dos pacientes que receberam as válvulas da patente com prioridade alemã é semelhante aos pacientes que receberam enxertos criopreservados, demonstrando que a descelularização não alcançou o objetivo.

0049 Já, o método da presente patente, teve um resultado muito bom, sendo que os pacientes apresentaram pequenas alterações que já eram esperadas devido à complexidade da cirurgia (COSTA, FDA. Operação de Ross com homoenxertos

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19/25 valvares descelularizados - resultados de médio prazo (quatro anos), RBCCV, 16789741, 2008.). Tratando-se de um tecido descelularizado, este não deve apresentar imunogenicidade, ou apenas uma pequena reação do sistema imune, o que não é visto no método da patente com prioridade alemã, quando se avalia a presença de anticorpos contra antígenos HLA, onde o título de anticorpos é baixo, porém ainda significativo, quando comparado com um implante não descelularizado, sendo que ao longo da tempo de implante o título tende a subir. Isto demonstra que a descelularização não foi efetiva, não correspondendo com o proposto pela tecnologia. Já o método da presente patente apresenta reatividade contra antígenos HLA durante o tempo de regeneração do tecido (Daniela Contini-Duarte. A Evolução Imunológica e Ecocardiográfica dos Aloenxertos Criopreservados Versus Aloenxerto Decelularizados Durante a Operação de Ross. 2006. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná,). 0050 Os objetivos, vantagens e demais características importantes da patente em apreço poderão ser mais facilmente compreendidas quando lidas em conjunto com as figuras em anexo, nas quais:

0051 A figura 1 representa um fluxograma do método para remover as células de um tecido biológico de maneira a tomá-lo receptivo a novas células e pouco imunogênico - tendo como base um coração doado.

0052 A figura 2 representa um fluxograma do método para remover as células de um tecido biológico de maneira a tomá-lo receptivo a novas células e pouco imunogênico - tendo como base órgão ou tecido doado e órgão ou tecido animal. 0053 A figura 3 representa um homoenxerto valvar criopreservado.

0054 Como se infere nas figuras em anexo que ilustram e integram o presente relatório descritivo da patente de invenção de Método para Remover as Células de um Tecido Biológico de Maneira a Tomá-lo Receptivo a Novas Células e Pouco Imunogênico, é compreendido por um método de condicionamento no qual o tecido biológico é exposto para a completa remoção de células e restos celulares, remoção mecânica de tecidos, estruturas e anexos que não tenham interesse ou não alterem o produto final da descelularização, de modo a restar apenas um arcabouço de matriz

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20/25 extracelular ou bioplástico do tipo acelular receptivo ao repovoamento celular in vitro ou in vivo pelo receptor, com células do receptor, células criopreservadas ou de doação compatível ao receptor do tecido, e inibindo a rejeição do material descelularizado pelo sistema imune do receptor, sendo o método conduzido de uma forma sequencial e dependente uma da outra com o material biológico processado através de uma sequência de lavagens que consiste de uma solução de tensoativo, uma solução alcoólica, uma solução reidratante, uma solução esterilizante contendo meio de cultivo celular e antibióticos e, podendo ou não ter um tratamento químico ou com biomoléculas posteriores.

0055 Inicialmente, aplica-se uma solução de tensoativo biológico ou inorgânico em solução com tonacidade de sal variada, aplicada sobre o tecido a uma determinada temperatura sob agitação por um determinado tempo, sendo que, estas variáveis são adaptadas a cada tipo e quantidade de tecido. O método baseia-se na característica do tensoativo em formar uma emulsão, tomando moléculas com caráter lipofílico solúveis em solução aquosa, sendo que esta característica antipática da molécula do tensoativo deve-se ao fato que estas moléculas possuem uma cauda lipofílica e uma extremidade hidrofílica possibilitando a ligação entre moléculas de diferentes características.

0056 Quando se emprega um tensoativo sobre um tecido biológico, a molécula de tensoativo liga-se aos lipídios da membrana celular das células do tecido e algumas proteínas com sítios hidrofóbicos, como proteínas transmembrânicas, esta interação instabiliza a organização da membrana plasmática das células, que rompem-se liberando o conteúdo intracelular, onde há proteínas e lipídios que sofrem a interação com as moléculas de tensoativo, de modo que, este processo de aplicação de tensoativo sob condições ideais de agitação de temperatura, bem como pH da solução são efetivos e resultam na completa remoção das células de um tecido biológico.

0057 O tensoativo empregado é o dodecil sulfato de sódio - SDS, de origem não biológica, por isto a capacidade de maior remoção das células, com uma menor taxa de saturação, tomando-o mais eficiente. Para uma completa remoção das células a

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21/25 solução de SDS é trocada para não haver a completa saturação, mantendo a remoção de células e restos celulares, sendo que estas trocas são estabelecidas conforme as características do material a ser descelularizado, sendo avaliados massa, área, complexidade e celularidade do tecido, por exemplo, para a descelularização de um patch de pele são necessárias de cinco a seis trocas de solução, já para uma válvula aórtica são necessárias apenas três trocas. Outra vantagem do SDS e a solubilidade, visto que o SDS é mais solúvel e seu produto de reação, a micela formada pela complexação da molécula de SDS mais um fosfolipídio da membrana celular, é menor e mais solúvel também.

0058 Os resíduos gerados durante a ação do tensoativo devem ser completamente removidos, pois estes geram imunogenicidade, citotoxicidade, alteração nas características físico-químicas dos componentes da matriz extracelular e alteração de cargas elétricas da matriz extracelular, o que diminui a capacidade regenerativa do tecido descelularizado. A ação do tensoativo gera a ruptura das células e organelas liberando seus conteúdos que possuem elementos nocivos a matriz extracelular como enzimas, restos de proteínas e moléculas capazes de degradar a MEC, sendo que, as enzimas que degradam a MEC podem ser serinoproteinases e metaloproteinases. Estas enzimas quando liberadas do conteúdo intracelular atuam sobre as fibras da MEC rompendo-as e, consequentemente, reduzindo a capacidade regenerativa do tecido descelularizado, de modo que para inibir esta degradação junto ao SDS é colocado em solução uma concentração suficiente de EDTA (etileno diamino tetracético) e aprotinina, a fim de inibir metalo proteinases e serino proteinases respectivamente. Estes dois reagentes não alteram a capacidade regenerativa do tecido descelularizado e também não deixam resíduos.

0059 Esta lavagem consiste de uma solução de tensoativo preferencialmente aniônico, mais preferencialmente contendo cauda lipofílica com doze carbonos na molécula na concentração entre 0,0005% a 30% p/v, mais preferencialmente o dodecil sulfato de sódio - SDS, na faixa de concentração entre 0,05% a 3%, preferencialmente entre 0,08% e 0,2%, em meio com concentração de sal entre 0,5% a 12% para remoção das células em agitação variando entre 20 à 300rpm,

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22/25 preferencialmente entre 150 e 200rpm, em temperatura controlada e variável de 10°C a 42°C, preferencialmente entre 10°C e 37 °C, mais preferencialmente entre

20°C e 28°C, durante 2 à 72hs, com seguidas trocas de solução de tensoativo durante o período de lavagem de forma regular e com espaços determinados a cada 2 à 3hs, preferencialmente 3hs.

0060 Na sequência, é necessária a aplicação de um agente removedor, pois somente a ação do tensoativo não é suficiente o bastante para remover restos celulares e, sendo estes em sua maioria lípedes de cadeia longa o emprego de um agente com características lipofílicas é necessário - solução alcoólica. Álcoois em geral (cadeia curta ou longa) possuem características lipofílicas além de características bacteriostáticas, sendo assim ideais para uma aplicação sobre tecidos biológicos previamente tratados com tensoativos. As moléculas de álcool interagem com os restos celulares como proteínas, lipídios e ácidos nucléicos solubilizando-os, mas o processo também desidrata a matriz extracelular forçando a saída de restos celulares. Este processo de solubilização de restos celulares ocorre com determinados álcoois em determinadas condições de concentração e pH.

0061 Na remoção dos resíduos da descelularização, a eficiência do SDS possibilita que o efeito do álcool seja facilitado na remoção de tudo o que restou aderido a matriz extracelular. Outro ponto importante na utilização do álcool é na remoção dos DNA e RNA residuais, o álcool desidrata a estrutura destas moléculas reduzindo seu tamanho e diminuindo sua carga elétrica forçando assim a saída deste resíduo.

0062 Esta lavagem consiste de uma solução de álcool de cadeia curta ou longa em solução entre 2 e 20 carbonos na molécula com concentração variando entre 10 90%, preferencialmente entre 2 e 4 carbonos nas concentrações entre 12 e 85% v/v, mais preferencialmente um álcool de 2 carbonos na molécula na concentração entre 30 e 90% em solução aquosa, sob agitação e temperatura entre -20 a 37°C, por 30min à 48hs. O tempo de lavagem com solução de tensoativo e solução alcoólica é preferencialmente de 12 às 30hs, mais preferencialmente entre 18 e 24hs.

0063 Em seguida, é necessário a reidratação com solução reidratante para utilização do tecido acelular, pois após a lavagem com tensoativo e a aplicação do

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23/25 agente removedor álcool o tecido biológico encontra-se acelular, porém ao final do processo a matriz extracelular está desidratada. Esta etapa do método é realizada com uma solução salina aquosa com concentração exata necessária para reidratar o tecido sem causar danos aos componentes da matriz extracelular, sendo que o mesmo pode ser feito de forma gradual ou não, realizando trocas da solução por um determinado tempo, mas sempre tendo fatores como temperatura e agitação para acelerar o processo, de modo que, a ação mecânica de agitação a uma determinada velocidade favorece o choque das moléculas de tensoativo ou álcool e do material biológico aumentando assim a efetividade na remoção de células e restos celulares. Já na etapa de hidratação não necessária agitação.

0064 Esta lavagem consiste de uma solução salina com concentração de 0,2% à 16% em temperatura controlada entre 10°C à 37°C durante um período de 4hs à 12dias, preferencialmente com solução fisiológica estéril (solução de cloreto de sódio 0,9%) à temperatura entre 10°C e 28°C.

0065 Esta lavagem pode consistir de uma solução de hidratação contendo cloro, sódio, magnésio e fosfato nas concentrações entre 0,5 e 3%, mais preferencialmente uma solução de cloreto de sódio estéril a 0,9%.

0066 Na sequência, após a hidratação do tecido acelular este é posto em uma solução contendo meio para cultivo celular e pool de antibióticos, com a finalidade de esterilizar e conservar o tecido por um maior tempo, sendo que também é possível conservar o tecido descelularizado criopreservando-o ou liofilizando-o, até o momento do uso onde se pode descongelar o tecido ou reidratá-lo sem perder seu potencial regenerativo.

0067 Esta lavagem consiste de uma solução de meio de cultura para células (RPMI, Eagle's, DMEM, MEM, F12, HAM entre outras) contendo antibióticos (Penicilina, Estreptomicina, Vancomicina, Lincomicina, Cefoxitina e Polimixina) em temperatura controlada entre -5°C à 37°C durante um período de 4hs à 180dias.

0068 Por último, um tratamento com biomoléculas ou reagentes químicos sobre a matriz extracelular descelularizada é bastante adequado, visto que nesta etapa subsequente pode ser aplicado fatores de crescimento, moléculas de matriz

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24/25 extracelular, enzimas, sequências de aminoácidos, meios nutrientes, drogas ou produtos químicos que melhorem a capacidade de adaptação das novas células e estimule-as a revitalizar o tecido a fim de recuperar mais rápido sua função. Este condicionamento da matriz pode ser realizado in vitro ou in vivo, dependendo do tipo de tecido descelularizado, tipo de célula a ser semeado sobre o tecido ou sua aplicação, visando potencializar o efeito regenerativo do tecido descelularizado.

0069 A estabilidade de um tecido descelularizado é determinada por sua origem, composição da matriz e aplicação, sendo que a maior parte dos tecidos biológicos são passíveis de descelularização, porém muitas vezes a estrutura e função do tecido ou órgão estão intimamente ligadas à presença de células, e quando estas são removidas perde-se a estrutura, por exemplo, o pâncreas humano ou animal, que se descelularizado a matriz extracelular restante é amorfa e sem capacidade de formar novamente um novo pâncreas, mesmo semeando os tipos celulares presentes neste órgão.

0070 Cabe ressaltar que, o método empregado para a remoção das células pode ser adaptado para cada tipo de tecido biológico, variando na concentração do tensoativo, no tempo de exposição à solução de tensoativo, nas características químicas do tensoativo, na temperatura, pH e concentração de sal da solução, bem como no tipo de álcool empregado para remoção dos restos celulares. Estas condições da solução de descelularização são acertadas pelas características do tecido biológico a ser descelularizado, como tamanho, espessura e composição da matriz extracelular do tecido. Como exemplo da variação da solução de descelularização têm-se a aplicação sobre bioplásticos que demandam uma baixa concentração de um tensoativo anfótero à temperatura variando entre 4 à 20°C sob agitação de 20rpm por quatro horas; e a aplicação para descelularização de um tendão de origem animal é empregado uma concentração mais alta de tensoativo aniônico à 37°C por mais de vinte e quatro horas sob constante agitação em tomo de 180rpm. Desta forma, podendo-se variar a solução de descelularização é possível remover células dos diferentes tipos de tecido biológico, como bioplásticos e tecidos de origem animal, os quais podem ter as mais variadas aplicações.

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0071 A remoção de células de um material pode ser citada em quatro estágios: remoção mecânica de material adjunto que não possua importância ou não altere o produto final da descelularização; tratamento químico para remoção efetiva dos elementos celulares; remoção dos resíduos do processo químico e recuperação das características físico-químicas da matriz; e preparação da matriz acelular para recepção de novas células, compreendendo a aplicação de qualquer agente biológico ou reagente químico que proporcione uma melhor acomodação das novas células, sendo que a presente invenção foca na descelularização de materiais biológicos para confecção de tecidos ou estruturas substitutivas removendo as células e restos celulares, tomando o tecido apto a receber novas células do receptor e inibindo assim a rejeição do material descelularizado pelo sistema imune do receptor, favorecendo assim uma reconstituição do tecido ou área onde empregou-se o tecido descelularizado.

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Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. )MÉTODO PARA REMOVER AS CÉLULAS DE UM TECIDO BIOLÓGICO DE MANEIRA A TORNÁ-LO RECEPTIVO A NOVAS CÉLULAS E POUCO IMUNOGÊNICO, caracterizado por um condicionamento em forma sequencial e dependente uma da outra na qual o material biológico é processado através de uma sequência de lavagens consistindo de uma solução de tensoativo, uma solução alcoólica, uma solução de hidratação e uma solução esterilizante contendo meio de cultivo celular e antibióticos, sendo uma lavagem de tensoativo em uma solução de baixa concentração entre 0,0005% à 30% p/v em meio com concentração de sal entre 0,5% à 12% para remoção das células em agitação variando entre 20 à 300rpm em temperatura controlada e variável de menos dez a quarenta e dois graus Célsius, durante duas a setenta e duas horas, com seguidas trocas de solução de tensoativo durante o período de lavagem de forma regular e com espaços determinados a cada duas a três horas; uma lavagem alcoólica em solução com concentração variando entre dez a noventa por cento sob agitação e temperatura entre menos vinte e trinta e sete graus Célsius, por trinta minutos a quarenta e oito horas; uma lavagem com solução de hidratação compreendendo cloreto de sódio com concentração de 0,2% à 16% em temperatura controlada entre dez a trinta e sete graus Célsius durante um período de quatro a doze dias; e uma lavagem esterilizante em solução de meio de cultura para células (RPMI, Eagle's, DMEM, MEM, F12, HAM entre outras) contendo antibióticos (Penicilina, Estreptomicina, Vancomicina, Lincomicina, Cefoxitina e Polimixina) em temperatura controlada entre menos cinco e trinta e sete grau Celsius durante um período de quatro horas a cento e oitenta dias.
2. 2. )MÉTODO PARA REMOVER AS CÉLULAS DE UM TECIDO BIOLÓGICO DE MANEIRA A TORNÁ-LO RECEPTIVO A NOVAS CÉLULAS E POUCO IMUNOGÊNICO, de acordo com a reivindicação 1 e caracterizado por o tensoativo empregado ser aniônico, preferencialmente contendo cauda lipofílica com doze carbonos na molécula, preferencialmente o dodecil sulfato de sódio - SDS, na faixa de concentração entre 0,05% à 3%, preferencialmente entre 0,08% e 0,2%.
3. 3. )MÉTODO PARA REMOVER AS CÉLULAS DE UM TECIDO BIOLÓGICO

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   DE MANEIRA A TORNÁ-LO RECEPTIVO A NOVAS CÉLULAS E POUCO IMUNOGÊNICO, de acordo com a reivindicação 1 e caracterizado por a solução de tensoativo ser trocada durante o período de lavagem de forma regular com espaços determinados a cada três horas; a agitação da lavagem com solução de tensoativo ser entre 150 a 200rpm; e a temperatura da lavagem com solução de tensoativo ser na faixa entre dez a trinta e sete graus Célsius, preferencialmente entre vinte e vinte e oito graus Célsius.
4. 4. ) MÉTODO PARA REMOVER AS CÉLULAS DE UM TECIDO BIOLÓGICO DE MANEIRA A TORNÁ-LO RECEPTIVO A NOVAS CÉLULAS E POUCO IMUNOGÊNICO, de acordo com a reivindicação 1 e caracterizado por a solução alcoólica ter entre dois e vinte carbonos na molécula, preferencialmente entre dois e quatro carbonos nas concentrações entre 12 e 85% v/v, mais preferencialmente um álcool de dois carbonos na molécula na concentração entre trinta a noventa por cento em solução aquosa.
5. 5. ) MÉTODO PARA REMOVER AS CÉLULAS DE UM TECIDO BIOLÓGICO DE MANEIRA A TORNÁ-LO RECEPTIVO A NOVAS CÉLULAS E POUCO IMUNOGÊNICO, de acordo com a reivindicação 1 e caracterizado por o tempo de lavagem com solução de tensoativo e solução alcoólica ser doze a trinta horas, preferencialmente entre dezoito e vinte quatro horas.
6. 6. )MÉTODO PARA REMOVER AS CÉLULAS DE UM TECIDO BIOLÓGICO DE MANEIRA A TORNÁ-LO RECEPTIVO A NOVAS CÉLULAS E POUCO IMUNOGÊNICO, de acordo com a reivindicação 1 e caracterizado por a lavagem de hidratação com solução de hidratação conter cloro, sódio, magnésio e fosfato nas concentrações entre 0,5 e 3%, preferencialmente ser feita com solução fisiológica estéril de cloreto de sódio 0,9% à temperatura entre dez e vinte e oito graus Célsius.
7. 7. )MÉTODO PARA REMOVER AS CÉLULAS DE UM TECIDO BIOLÓGICO DE MANEIRA A TORNÁ-LO RECEPTIVO A NOVAS CÉLULAS E POUCO IMUNOGÊNICO, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por um tratamento subsequente da matriz extracelular descelularizada com biomoléculas.
8. 8. )MÉTODO PARA REMOVER AS CÉLULAS DE UM TECIDO BIOLÓGICO

   Petição 870180137121, de 02/10/2018, pág. 8/11

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   DE MANEIRA A TORNÁ-LO RECEPTIVO A NOVAS CÉLULAS E POUCO IMUNOGÊNICO, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por um tratamento subsequente da matriz extracelular descelularizada com produtos químicos.
9. 9.)MÉTODO PARA REMOVER AS CÉLULAS DE UM TECIDO BIOLÓGICO DE MANEIRA A TORNÁ-LO RECEPTIVO A NOVAS CÉLULAS E POUCO IMUNOGÊNICO, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o acondicionamento final da matriz extracelular descelularizada ser em solução tampão ou solvente orgânico, criopreservada ou liofilizado.

   Petição 870180137121, de 02/10/2018, pág. 9/11

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