BRPI0721393A2

BRPI0721393A2 - método paea obter lipideo a monofosforilado da bordetella pertussis como um subproduto da produção de vacine celular contra coqueluche

Info

Publication number: BRPI0721393A2
Application number: BRPI0721393-0A
Authority: BR
Inventors: Isaias Raw; Flavia Saldanha Kubrusly; Dmitri Iourtov; Maria Aparecida Sakauchi; Santos Fernanda Lucio Dos; Sandra De Cassia Dias; Elaine Darini; Noemi Furuyama; Sally Mueller Affonso Prado; Hisako Gondo Higashi
Original assignee: Fundacao Butantan
Priority date: 2007-03-22
Filing date: 2007-03-22
Publication date: 2013-01-01
Also published as: WO2008134830A1; BRPI0721393B8; BRPI0721393B1

Abstract

TODO PARA OBTER LIPIDEO A MONOFOSFORILADO DA BORDETELLA PERTUSSIS COMO UM SUBPRODUTO DA PRODUçAO DE VACINA CELULAR CONTRA COQUELUCHE, mais especificamente, um método de purificação de BpMPLA a partir do processamento de um extrato alcoólico geralmente rejeitado ou filtrado da coleta inativada da vacina de Bordetella pertus.sis (subproduto da produção de vacina principal, método de purificação de BpMPLA este que compreende o processamento de um extrato alcoólico geralmente rejeitado da coleta inativada de Bordetella pertussis, a submissão deste extrato final a uma coluna de afinidade e o envio da fração eluída de detergente à hidrólise ácida seguida por neutralização, liofilização e ressuspensão com água para injeção acrescida de detergente suave; o novo BpMPLA é usado em aplicações imunoestimuladoras, mais especificamente, como um adjuvante de vacina e, ainda mais especificamente, como um adjuvante de vacina contra gripe, com resultados promissores.

Description

"MÉTODO PARA OBTER LIPÍDEO A MONOFOSFORILADO DA BORDETELLA PERTUSSIS COMO UM SUBPRODUTO DA PRODUÇÃO DE VACINA CELULAR CONTRA COQUELUCHE"

A presente invenção relaciona-se com a produção do Lipideo A Monofosforilado de Bordetella pertussis (BpMPLA; como um subproduto da produção de vacina celular da coqueluche, mais especificamente como um subproduto da vacina celular contra coqueluche obtida pelo processo desenvolvido por Raw et al, na solicitação de patente pendente PCT/BR2004/000172. Mais especificamente, relaciona-se com um método de purificação de BjAdPLA a partir do processamento de um extrato alcoólico geralmente rejeitado da coleta inativada final da vacina Bordetella pertussis, sujeitando-a a uma coluna de afinidade e enviando a fração de detergente eluida à hidrólise de ácido seguida por neutralização, liofilização e ressuspensão com água para injeção mais detergente suave. 0 novo BpMPLA é usado em aplicações imunoestimuladoras, como um adjuvante da vacina. Mais especificamente, o BpMPLA mencionado é usado como adjuvante para vacina contra gripe com resultados promissores.

A Iise das bactérias gram-negativas faz com que elas liberem lipopolissacarideo (LPS) a partir da membrana externa de sua parede celular. Para a maioria dos objetivos, os termos lipopolissacarideos ou LPS e endotoxina são sinônimos. A indução dos anticorpos bactericidas por LPS é bem conhecida, mas diversas reações após a injeção em animais ou humanos contradiz o uso de LPS em vacinas (Luderitz et al, 1982; Morrison & Ryan, 1987, Rietschel et al, 1994). Foi observado que o componente de LPS mais responsável pela atividade endotóxica é o Lipideo A. LPS é composto de um lipideo hidrofóbico (Lipideo A) , uma cadeia de polissacarideos de núcleo hidrofilico e uma cadeia lateral de polissacarideos antigênicos O hidrofilicos. O domínio de núcleo hidrofilico consiste em KDO (2-ceto-3-deoxiotônico); heptose e açúcares neutros como a galactose. 0 antígeno 0 externo consiste em unidades de dois a oito açúcares repetidos muitas vezes. 0 Lipideo A abrange um número de espécies que têm a mesma estrutura geral do Lipideo A (dois resíduos de GlcNAc-P acilados), mas diferem do número de resíduos de ácido graxo. A remoção da hidrólise das cadeias de polissacarídeo de LPS produz o Lipideo A, tanto ocorrendo naturalmente, na forma de difosforila citotóxica, quanto na forma de monofosforila menos tóxica (Rietschel et al, 1987, Caroff et al, 1988; Erridge et al, 2002) .

A diversidade biológica do Lipideo A destoxifiçado é exemplificada por suas atividades multifuncionais, incluindo agir como um adjuvante contra os antígenos da vacina. 0 Lipideo A Monofosforilado é um componente do Sistema Adjuvante Ribi (Oureshi et al, 1982; Takayama & Oureshi 1991, Gupta & Siber, 1995, Hunter, 2002) . 0 peso molecular aproximado (ou médio) é de 1,7-1,8 kDa, dependendo do número e identidade das cadeias de ácido graxo presentes. A composição do ácido graxo varia dependendo do método de produção.

Diversos métodos de produção são descritos e eles levam em conta os esforços para atenuar os atributos tóxicos de LPS sem diminuir os benefícios imunoestimuladores destes compostos. Myers et al descreveu métodos de produção de 3D-MLA (2001, 2003) . Nestes métodos, o LPS obtido a partir de bactéria gram-negativa de cápsula extremamente rugosa pode sofrer desfosforilização e descarboidratação utilizando soluções minerais ácidas de força moderada (p.ex. 0,1 N HCl) seguido da hidrólise de base (por exemplo, CM 2:1 (v/v) saturada com 0,5M Na2C03 pH 10,5) sob condições controladas seguida de rápida evaporação do solvente. Ou as células sofrem extração com solução de álcool alifático (75 peso percentual do álcool com 1 a 4 carbonos em água) produzindo células pobres em fosfolipidios após extração com clorofórmio e metanol (CM). A presente invenção é um método alternativo para

obter o Lipídeo A Monofosforilado de Bordetella pertussis (rBpMPLAy) como um subproduto da produção da vacina celular contra coqueluche, para uso em aplicações

imunoestimuladoras como um adjuvante da vacina. Uma apreciação mais completa da presente invenção

e muitas das vantagens dela derivadas são prontamente compreendidas através da descrição detalhada a seguir, em conjunto com os desenhos que acompanham o presente pedido, quais sejam:

A Figura 1 é um fluxograma da produção de BpMPLA como um subproduto do concentrado de Bordetella pertussis;

- A Figura 2 mostra a principal espécie iônica atribuída ao MPLA de Bordetella pertussis (BpMPLA);

A Figura 3 são diagramas mostrando espectros de massa por ionização de MPLA de Bordetella pertussis, ionização positiva (a e b) e ionização negativa (c e d) (ESP -/+ Esquire 3000 plus Bruker);

A Figura 4 é uma tabela mostrando alguns resultados analíticos de BpMPLA obtidos pelo presente método.

O objeto da presente patente de invenção é um "MÉTODO PARA OBTER LIPÍDEO A MONOFOSFORILADO DA BORDETELLA PERTUSSIS COMO UM SUBPRODUTO DA PRODUÇÃO DE VACINA CELULAR CONTRA COQUELUCHE", para uso em aplicações imunoestimuladoras como um adjuvante da vacina.

Mais especificamente, a presente invenção relaciona-se a um método de purificação de BpMPLA a partir do processamento de um extrato alcoólico geralmente rejeitado, suspenso ou filtrado a partir Da coleta inativada da vacina de Bordetella pertussis (subproduto da produção da vacina principal).

De acordo com a Figura 1, o presente método apresenta as seguintes etapas:

a) Tratamento alcoólico da coleta inativada da vacina de Bordetella pertussis (1) (lg da massa úmida a 20ml da solução de solvente - lg/20ml);

b) Centrifugação ou filtração do fluxo tangencial (2) do referido tratado alcoólico da vacina de Bordetella pertussis, resultando em um extrato alcoólico, suspenso ou

filtrado (3);

c) Submissão do referido extrato alcoólico, suspenso ou filtrado (3) obtido a partir da coleta inativada da vacina de Bordetella pertussis a uma coluna de afinidade (4), mais especificamente a uma coluna de afinidade de

endotoxina, que usa o ligante polimixina B imobilizada, resultando em uma fração de endotoxina enriquecida;

d) Eluição da referida fração enriquecida de endotoxicina com deoxicolato de sódio (1% DOC) (5);

e) Envio da referida fração eluida à hidrólise de ácido, com ácido acético (2N Hac) a IOO0C durante 60 minutos (6);

f) Filtração, mais especificamente, filtração de papel simples (7), para separar o precipitado de detergente;

g) Evaporação do ácido sob vácuo (8);

h) Neutralização ao pH 5-6 (9), seguindo de uma filtração estéril (10), resultando no novo BptIPLA (11);

i) Distribuição e liofilização (12) do referido novo BpMPLA;

j) Ressuspensão (13) do referido novo BpMPLA com água para injeção (WFI) mais detergente antes do uso. O novo BpMPLA é usado em aplicações

imunoestimuladoras, como um adjuvante da vacina. Mais especificamente, o BpMPLA suspenso mencionado é usado como adjuvante para vacina contra gripe. Exemplo 1: Métodos Gerais:

Preparação do Lipideo A Monofosforilado de Bordetella pertussis (BfAlPLA) a partir da coleta inativada da vacina de Bordetella pertussis (BjAdPLA) Obtenção do filtrado rejeitado:

A coleta inativada da vacina Bordetella pertussis foi concentrada pela filtração do fluxo tangencial antes do tratamento com solução alcoólica para diminuição da contaminação de LPS por lipideos e proteínas. Para a realização desta etapa, deve ser conhecida a massa úmida/ml da coleta inativada Voloome Final Bp, e então calcular a cada Ig de massa úmida a 20ml da solução de solvente (lg/20ml). Após o tratamento alcoólico, uma nova filtração de fluxo tangencial foi feita para remover o solvente e o filtrado rejeitado foi utilizado como material inicial para purificar o BjAdPLA. A determinação de KDO foi realizada nesta etapa. Obtenção da fração rica em endotoxina:

O filtrado rejeitado foi, então, passado por uma coluna de afinidade de endotoxina (coluna de polimixina) e eluída com 1% de solução de deoxicolato de sódio (1% DOC) com o volume máximo de 2 volumes da coluna. A capacidade de ligação da endotoxina por ml de gel foi anteriormente determinada para a coleta inativada de Bordetella pertussis para evitar sobrecarga. A capacidade ligante do gel de até 2mg LPS/ml foi determinada. A cromatografia de afinidade foi realizada em temperatura do refrigerador (2- 8 °C) . A amostra foi lentamente bombeada sobre o gel por períodos determinados de tempo (8-16hr), em vez de usar uma simples filtração gravitacional pela coluna. 0 volume da fração rica em endotoxina eluída foi determinado, e também o conteúdo de KDO.

Hidrólise do ácido da fração rica em endotoxina:

A fração rica em endotoxina (s) foi então submetida a uma hidrólise de ácido com 2N de ácido acético (v/v) a IOO0C durante uma hora. 0 precipitado de detergente foi removido pela filtração com papel antes da evaporação do ácido sob vácuo seguida de um ajuste de pH a pH 5-6 com 3N de NaOH. 0 filtrado neutralizado recuperado rendeu o BpMPLA e deve ser um material negativo para a determinação de KDO. A avaliação do fósforo foi realizada para determinar a concentração do Lipideo A. Filtração estéril, distribuição e liofilização de BpMPLA:

0 BpMPLA foi submetido à filtração esterilizante com membrana de PVDF com porosidade de 0,22 pm antes da distribuição e da liofilização sem nenhum estabilizador ou crioprotetor. 0 liófilo de BfAdPLA foi analisado por espectometria de massa. Ressuspensão do BpMPLA: A ressuspensão dos frascos com BpMPLA foi

realizada com água para injeção, que continha um detergente suave para evitar agregação. Exemplo 2:

Métodos Analíticos:

Ensaios calorimétricos:

0 espectrofotômetro foi utilizado para todos os ensaios calorimétricos. Determinação de KDO:

0 ensaio do ácido tiobarbitúrico (TBA) de Karkhanis et al (1978) foi utilizado para determinação de KDO.

Ensaio de fósforo:

Neste procedimento, o fosfato contido em amostras do Lipideo A é satisfatoriamente estimado por determinação de fósforo (Rouser et al, 1970). Análise de BfAdPLA por espectrometria de massa:

A espectrometria de massa foi a ferramenta

analítica utilizada para medir a massa molecular de BpMPLA. A amostra foi inserida diretamente na fonte de ionização, ou passou por cromatografia de líquido em alta pressão (HPLC) en route à fonte de ionização. 0 método de

ionização utilizado foi a Ionização por Eletrospray (ESI). Para detectar os íons negativamente carregados da amostra, a análise foi feita utilizando o modo de ionização negativa. 0 equipamento usado foi o Esquire 3000 plus, Bruker.

A Figura 2 mostra a principal espécie iônica

atribuída ao MPLA de Bordetella pertussis (BfAdPLA) .

A Figura 3 são diagramas mostrando espectros de massa por ionização tipo Eletrospray (ESI) de BpMPLA, ionização positiva (a e b) e ionização negativa (c e d) (ESP -/ + Esquire 3000 plus Bruker) . Os resultados das análises de massa de BfAdPLA mostraram que a principal espécie iônica observada foi 1291.7 m/z.

A Figura 4 é uma tabela mostrando alguns resultados analíticos de BpMPLA obtidos pelo presente método. Referências:

- Caroff M, Tacken A, Szabó L (1988) - Detergent- accelfoited hydrolysis of bacterial endotoxins and determination of the anomeric configuration of glycosyl phosphate present in the "isolated lipid A" fragment of the Bordetella pertussis endotoxin. Carbohydr Res 2:273- 82.

- Erridge C, Bennett-Guerrero E, Poxton IR (2002) Structure and function of lipopolysaccharides. Mierobes Infec 4:837-51.

- Gupta RK & Siber GR (1995) - Adjuvants for human bacines - current status, problems and future prospects. Vaccine

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- Hunter, RL (2002) - Overview of vaccine adjuvants: present and future. Vaccine 20: S7-S12.

- Karkhanis YD Zeltner JA, Jackson JJ, Cario DJ (1978) - A new and improved microassay to determine 2-keto-3-

deoxyoctonate in lipopolysaccharide of gram-negative bactéria. Anal. Biochem. 85:595-601. - Luderitz 0, Galanos C, Rietschel ET (1982) - Endotoxins og Gram-negative bactéria. Pharm Ther 15: 383-402.

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- Myers KR, Snyder DS, Blackman C, Whitaker - K 3-0 - deacylated-4'- monophosphoryl Lipid A (3D-MLA) - (2001)

USPTO 60280089.033001.

- Oureshi N, Takayama K, Ribi E (1982) - Purification and structural determination of non-toxic lipid A obtained from the lipopolysaccharide of Salmonella thyphimurium. -

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- Raw I, Kubrusly FS, Dias W0, Esteves MI, Furuyama N, Horton DSPQ, Leme E, Quintilio W, Sakauchi MA, Prado SMA, Higashi HG - Process for obtention of new cellular pertussis vaccine - PCT/BR2004/000172 - W0/2006/002502.

- Rietschel ET, Brade H, Brade L, Brandenburg K, Sehade FU, Seydel U, Zahringer U, Galanos C, Luderitz 0, Westphal 0, Labisehinski H, Kusumoto S, Shiba T (1987) - Lipid A, the endotoxic center of baeterial lipopolysacharides: relation of ehemieal structure to biological activity. Prog Clin Biol Res 231: 25-34.

- Rietsehel ET, Kirikae T, Sehade FU, Mamat U, Sehmidt G, Loppnow H, Ulmer AJ, Zahringer U, Seydel U, Di Padova F, Schreier Μ, Brade H (1994) - Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB J 8: 217-225.

- Rouser G, Fkeischer S, Yamamoto - A Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and

determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 1970 5(5): 494-6.

- Takayama KK, Oureshi N (1991) - Novel lipid A derivatives and uses therefore. WO 91/01134- PCT/US90/04145.

Claims

1. "MÉTODO PARA OBTER LIPÍDEO A MONOFOSFORILADO DA BORDETELLA PERTUSSIS COMO UM SUBPRODUTO DA PRODUÇÃO DE VACINA CELULAR CONTRA COQUELUCHE", mais especificamente, método de purificação de BpMPLA a partir do processamento de um extrato alcoólico geralmente rejeitado ou filtrado da coleta inativada da vacina de Bordetella pertussis (subproduto da produção de vacina principal), caracterizado pelas seguintes etapas: a) Tratamento alcoólico da coleta inativada da vacina Bordetella pertussis (1) (lg da massa úmida a 20ml da solução de solvente - lg/20ml); b) Centrifugação ou filtração de fluxo tangencial (2) do tratado alcoólico da vacina Bordetella pertussis, resultando em um extrato alcoólico, suspenso ou filtrado (3) ; c) Submissão do extrato alcoólico, suspenso ou filtrado (3) a partir da coleta inativada da vacina de Bordetella pertussis a uma coluna de afinidade (4), mais especificamente a uma coluna de afinidade de endotoxina, que usa como ligante polimixina B imobilizada, resultando em uma fração enriquecida de endotoxina; d) Eluição da fração enriquecida de endotoxicina com deoxicolato de sódio (1% DOC) (5); e) Envio da fração eluida à hidrólise de ácido, com ácido acético (2N Hac) a IOO0C durante 60 minutos (6); f) Filtração, mais especificamente, filtração com papel simples (7), para separar o precipitado de detergente; g) Evaporação do ácido sob vácuo (8); h) Neutralização ao pH 5-6(9), seguido de uma filtração esterilizante (10), resultando no novo BfAdPLA (11); i) Distribuição e liofilização (12) do novo BpMPLA; j) Ressuspensão do novo BpMPLA com água para injeção (WFI) mais detergente (12) antes do uso.

2. "MÉTODO PARA OBTER LIPÍDEO A MONOFOSFORILADO DA BORDETELLA PERTUSSIS COMO UM SUBPRODUTO DA PRODUÇÃO DE VACINA CELULAR CONTRA COQUELUCHE", de acordo com a reivindicação 1, caracter!ζado por o referido BpMPLA ressuspenso ser usado em aplicações imunoestimuladoras.

3. "MÉTODO PARA OBTER LIPÍDEO A MONOFOSFORILADO DA BORDETELLA PERTUSSIS COMO UM StJBPRODUTO DA PRODUÇÃO DE VACINA CELULAR CONTRA COQUELUCHE", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido BpMPLA ressuspenso ser usado como um adjuvante de vacina.

4. "MÉTODO PARA OBTER LIPÍDEO A MONOFOSFORILADO DA BORDETELLA PERTUSSIS COMO UM SUBPRODUTO DA PRODUÇÃO DE VACINA CELULAR CONTRA COQUELUCHE", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido BpMPLA ressuspenso ser usado como um adjuvante para a vacina contra gripe.