BRPI0718973A2 - Composição de combustível, métodos para preparar uma composição de combustível, e para acionar um motor, e, veículo - Google Patents

Description

"COMPOSIÇÃO DE COMBUSTÍVEL, MÉTODOS PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO DE COMBUSTÍVEL, E PARA ACIONAR UM MOTOR, E, VEÍCULO"

PEDIDOS RELACIONADOS ANTERIORES

Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) de Pedidos de Patente Provisórios U.S. de Nos. 60/860.853, depositado aos 21 de Novembro de 2006, e 60/951.236, depositado aos 23 de Julho de 2007, todos os quais são aqui incorporados como referências em suas totalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO

São aqui proporcionados, dentre outras coisas, composições de combustível de jato e métodos de preparação e uso das mesmas. Em algumas modalidades, as composições de combustível compreendem pelo menos um componente combustível pronta e eficientemente produzido, pelo menos em parte, de um microorganismo. Em certas modalidades, as composições de combustível aqui proporcionadas compreendem uma concentração alta de pelo menos um componente combustível bioengenheirado. Em outras modalidades, as composições de combustível aqui proporcionadas compreendem limonano.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Biocombustível é geralmente um combustível derivado de biomassa, i.e., recentemente organismos vivos ou seus subprodutos metabólicos, tal como esterco de animais. Biocombustível é desejável porque é de uma fonte de energia renovável, diferentemente de outras fontes naturais tais como combustíveis de petróleo, de carvão e nuclear. Um biocombustível que é adequado para uso como combustível de jato ainda tem que ser introduzido. Portanto, há uma necessidade de biocombustíveis para motores a jato. A presente invenção proporciona tais biocombustíveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

São aqui proporcionados, dentre outras coisas, composições de combustível compreendendo limonano e métodos de preparação e uso das mesmas. Em algumas modalidades, as composições de combustível adicionalmente compreendem um composto aromático. Em outras modalidades, o composto aromático é um isoprenóide. Em ainda outras modalidades, o composto aromático é p-cimeno. Em certas modalidades, a composição de combustível compreende um componente combustível pronta e eficientemente produzido, pelo menos em parte, de um microorganismo.

Em um aspecto, são aqui proporcionadas composições de combustível compreendendo (a) limonano em uma quantidade que é pelo menos 2% em volume, baseada no volume total da composição; e (b) um combustível baseado em petróleo em uma quantidade que é pelo menos 5% em volume, baseada no volume total da composição, sendo que a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C. Em algumas modalidades, as composições de combustível aqui mostradas adicionalmente compreendem p-cimeno.

Em outro aspecto, são aqui proporcionadas composições de combustível compreendendo (a) limonano em uma quantidade que é pelo menos 40% em volume, baseada no volume total da composição; (b) p- cimeno em uma quantidade que é de cerca de 1 % a cerca de 10% em volume, baseada no volume total da composição; e (b) um combustível baseado em petróleo em uma quantidade que é pelo menos 40% em volume, baseada no volume total da composição, sendo que a composição de combustível tem

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uma densidade de cerca de 750 kg/m a cerca de 840 kg/m a 15°C, um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C; e um ponto de congelamento menor do que -40°C.

Em outro aspecto, são aqui proporcionados métodos de preparação de uma composição de combustível compreendendo as etapas de (a) contactar um material de partida isoprenóide com hidrogênio na presença de um catalisador para formar um limonano; e (b) misturar o limonano com um componente combustível para preparar a composição de combustível. Em algumas modalidades, o material de partida isoprenóide é limoneno, β- felandreno, γ-terpineno, terpinoleno ou uma combinação dos mesmos.

Em outro aspecto, são aqui proporcionados métodos de preparação de uma composição de combustível a partir de um açúcar simples compreendendo as etapas de (a) contactar uma célula capaz de preparar um material de partida isoprenóide com o açúcar simples sob condições adequadas para preparar o material de partida isoprenóide; (b) converter o material de partida isoprenóide em limonano; e (c) misturar o limonano com um componente combustível para preparar a composição de combustível. Em certas modalidades, o material de partida isoprenóide é limoneno, β- felandreno, γ-terpineno, terpinoleno ou uma combinação dos mesmos.

Em outro aspecto, são aqui proporcionados veículos compreendendo um motor de combustão interna; um tanque de combustível conectado no motor de combustão interna; e uma composição de combustível aqui mostrada no tanque de combustível, sendo que a composição de combustível é usada para acionar o motor de combustão interna. Em algumas modalidades, o motor de combustão interna é um motor a jato.

Em outro aspecto, são aqui proporcionados métodos de acionar um motor compreendendo as etapas de comburir uma ou mais das composições de combustível aqui mostradas. Em certas modalidades, o motor é um motor a jato.

Em algumas modalidades, o limonano nas composições de combustível aqui mostradas é ou compreende

ou uma combinação dos mesmos.

Em certas modalidades, o combustível baseado em petróleo nas composições de combustível aqui mostradas é querosene, Jato A, Jato A- 1, Jato Β, ou uma combinação dos mesmos. Em outras modalidades, as composições de combustível aqui mostradas atendem à especificação ASTM D 1655 para jato A, Jato A-I ou Jato B.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figure 1 é uma representação esquemática da via de

mevalonato ("MEV") para a produção de pirofosfato de isopentenila ("IPP").

Figura 2 é uma representação esquemática da via de 1 -desóxi- D-xilulose-5-difosfato ("DXP") para a produção de pirofosfato de isopentenila ("IPP") e pirofosfato de dimetil-alila ("DMAPP"). Dxs é 1- desóxi-D-xilulose-5-fosfato; Dxr é l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato- redutoisomerase (também conhecida como IspC); IspD é 4-difosfo-citidil-2- C-metil-D-eritritol-sintase; IspE é 4-difosfo-citidil-2-C-metil-D-eritritol- sintase; IspF é 2C-metil-D-eritritol-2,4-ciclo-difosfato-sintase; IspG é 1- hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil-4-difosfato-sintase (IspG); e ispH é isopentil/dimetil-alil-difosfato-sintase.

Figura 3 é uma representação esquemática da conversão de uma molécula de IPP e uma molécula de DMAPP em pirofosfato de geranila ("GPP"). Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, geranil-difosfato-sintase. Figuras 4A-B mostram mapas de plasmídeos de expressão

pAM408, pAM409, e pAM424.

Figuras 5 A-E mostram mapas dos insertos de vetores pAM489, pAM491, pAM493, pAM495, e pAM497.

Figura 6 mostra mapas de plasmídeos de expressão pTrc99A- GTS, pTrc99A-TS, PTrc99A-LMS, e pTrc99A-PHS.

Figura 7 mostra mapas de plasmídeos de expressão pRS425- Ieu2d-GTS, pRS425-leu2d-TS, pRS425-leu2d-LMS, e pRS425-leu2d-PHS.

Figura 8 mostra os dados de teste ASTM D 1655 para certas modalidades das composições de combustível aqui mostradas. Figura 9 mostra as curvas de destilação para um Jato A e certas misturas de jato A, AMJ-300, e AMJ-310. DEFINIÇÕES

As especificações ASTM D 1655, publicadas por ASTM International, definem certas exigências de aceitação mínima para jato A, Jato A-1, e Jato B.

"Composto bioengenheirado" refere-se a um composto preparado por uma célula hospedeira, incluindo qualquer microorganismo ou células archae, bacterianas, ou eucarióticas. "Biocombustível" refere-se a qualquer combustível que é

derivado de uma biomassa, i.e., recentemente organismos vivos ou seus

r

subprodutos metabólicos, tal como esterco de vacas. E uma fonte renovável de energia, diferentemente de outras fontes naturais tais como combustíveis de petróleo, de carvão e nuclear. "Densidade" refere-se a uma medida de massa por volume em

uma temperatura particular. O método geralmente aceito para medir a densidade de um combustível é ASTM Standard D 4052, que é aqui incorporado como referência.

"Teste Doutor" é para a detecção de mercaptanos em combustíveis baseados em petróleo tais como querosene e combustível de jato. Este teste também pode proporcionar informação sobre sulfeto de hidrogênio e enxofre elementar que podem estar presentes nos combustíveis. O método geralmente aceito para medir o ponto de congelamento de um combustível é ASTM Standard D 4952, que é aqui incorporado como referência.

"Ponto de vaporização instantânea" refere-se à temperatura mais baixa na qual os vapores acima de um líquido inflamável ignizar-se-ão no ar sob aplicação de uma fonte de ignição. Geralmente, cada líquido inflamável tem uma pressão de vapor, que é uma função da temperatura do líquido. À medida que a temperatura aumenta, aumenta a pressão de vapor do líquido. À medida que a pressão de vapor aumenta, a concentração do líquido evaporado no ar aumenta. Na temperatura do ponto de vaporização instantânea, quantidade de líquido apenas suficiente tem vaporizado para trazer o espaço de vapor-ar acima do líquido para além do limite inferior de inflamabilidade. Por exemplo, o ponto de vaporização instantânea da gasolina é cerca de -430C que é o porquê a gasolina é tão elevadamente inflamável. Por razões de segurança, é desejável ter pontos de vaporização instantânea muito mais altos para combustível que é contemplado para uso em motores a jato. Os métodos geralmente aceitos para medir o ponto de vaporização instantânea de um combustível são ASTM Standard D 56, ASTM Standard D 93, ASTM Standard D 3828-98, todos os quais são aqui incorporados como referências.

"Ponto de congelamento" refere-se à temperatura na qual o último cristal de parafina se funde, quando se aquece um combustível que tem sido previamente esfriado até formar cristais parafínicos. O método geralmente aceito para medir o ponto de congelamento de um combustível é ASTM Standard D 2386, que é aqui incorporado como referência.

"Combustível" refere-se a um ou mais hidrocarbonetos, um ou mais alcoóis, um ou mais ésteres graxos ou uma sua mistura. Preferivelmente, hidrocarbonetos líquidos são usados. Combustível pode ser usado para acionar motores de combustão interna tais como motores recíprocos (e.g., motores a gasolina e motores a diesel), motores de Wankel, motores a jato, alguns motores de foguete, motores de míssil e motores de turbina a gás. Em algumas modalidades, combustível tipicamente compreende uma mistura de hidrocarbonetos tais como alcanos, cicloalcanos e hidrocarbonetos aromáticos. Em outras modalidades, combustível compreende limonano.

"Aditivo de combustível" refere-se aos componentes químicos adicionados em combustíveis para alterar as propriedades do combustível, e.g., para melhorar o desempenho do motor, manuseio de combustível, estabilidade de combustível, ou para controle de contaminante. Tipos de aditivos incluem, mas não são limitados a, antioxidantes, melhoradores de estabilidade térmica, melhoradores de cetano, estabilizadores, melhoradores de fluxo a frio, melhoradores de combustão, antiespumantes, aditivos de anti- névoa, inibidores de corrosão, melhoradores de lubricidade, inibidores de formação de gelo, aditivos de limpeza de injetor, supressores de fumaça, aditivos redutores de arrasto, desativadores de metal, dispersantes, detergentes, desemulsificadores, corantes, marcadores, dissipadores estáticos, biocidas e combinações dos mesmos. O termo "aditivos convencionais" refere-se aos aditivos de combustível conhecidos pelo técnico experiente, tais como aqueles descritos acima, e não incluem limonano.

"Componente combustível" refere-se a qualquer composto ou uma mistura de compostos que são usados para formular uma composição de combustível. Há "componentes combustíveis maiores" e "componentes combustíveis menores". Um componente combustível maior está presente na composição combustível em pelo menos 50% em volume; e um componente combustível menor está presente na composição combustível em menos do que 50%. Aditivos de combustível são componentes combustíveis menores. Limonano pode ser um componente maior ou um componente menor, ou em uma mistura com outros componentes combustíveis.

"Composição de combustível" refere-se a um combustível que compreende pelo menos dois componentes combustíveis.

"Isoprenóide" e "composto isoprenóide" são usados aqui intercambiavelmente e se referem a um composto derivável de difosfato de isopentila.

"Material de partida isoprenóide" refere-se a um composto isoprenóide do qual limonano pode ser preparado.

"Combustível de jato" refere-se a um combustível adequado para uso em um motor a jato.

"Querosene"refere-se a um destilado de fração específica de petróleo (também conhecido como "óleo cru"), geralmente entre cerca de 15O0C e cerca de 275 0C na pressão atmosférica. Óleos crus são compostos principalmente de hidrocarbonetos das classes parafínica, naftênica, e aromática.

"Limonano" refere-se ao seguinte composto

"Combustível de míssil" refere-se a um combustível adequado para uso em um motor de míssil. "p-Cimeno" refere-se ao seguinte composto

"Combustível baseado em petróleo" refere-se a um combustível que inclui um destilado de fração de petróleo.

"Ponto de fumaça" refere-se ao ponto no qual um combustível ou uma composição de combustível é aquecido até ele se decompor e fumegar. O método geralmente aceito para medir o ponto de fumaça de um combustível é ASTM Standard D 1322, que é aqui incorporado como referência.

"Viscosidade" refere-se a uma medição da resistência de um combustível ou uma composição de combustível à deformação sob tensão cisalhante. O método geralmente aceito para medir o viscosidade de um combustível é ASTM Standard D 445, que é aqui incorporado como referência.

Como aqui usado, uma composição que é um composto "substancialmente puro" está substancialmente livre de um ou mais outros compostos, i.e., a composição contém mais do que 80% em volume, mais do que 90% em volume, mais do que 95% em volume, mais do que 96% em volume, mais do que 97% em volume, mais do que 98% em volume, mais do que 99% em volume, mais do que 99,5% em volume, mais do que 99,6% em volume, mais do que 99,7% em volume, mais do que 99,8% em volume, ou mais do que 99,9% em volume do composto; ou menos do que 20% em volume, menos do que 10% em volume, menos do que 5% em volume, menos do que 3% em volume, menos do que 1% em volume, menos do que 0,5% em volume, menos do que 0,1% em volume, ou menos do que 0,01% em volume de um ou mais outros compostos, baseado no volume total da composição.

Como aqui usado, uma composição que está "substancialmente livre" de um composto significa que a composição contém menos do que menos do que 20% em volume, menos do que 10% em volume, menos do que 5% em volume, menos do que 4% em volume, menos do que 3% em volume, menos do que 2% em volume, menos do que 1% em volume, menos do que 0,5% em volume, menos do que 0,1% em volume, ou menos do que 0,01%) em volume do composto, baseado no volume total da composição.

Como aqui usado, o termo "estereoquimicamente pura" significa uma composição que compreende um estereoisômero de um composto e está substancialmente livre de outros estereoisômeros daquele composto. Por exemplo, uma composição estereomericamente pura de um composto tendo um centro quiral estará substancialmente livre do enantiômero oposto do composto. Uma composição estereomericamente pura de um composto tendo dois centros quirais estará substancialmente livre dos outros diastereômeros oposto do composto. Um composto estereomericamente puro típico compreende mais do que cerca de 80% em peso de um estereoisômero do composto e menos do que cerca de 20% em peso de outros estereoisômeros do composto, mais preferivelmente mais do que cerca de 90% em peso de um estereoisômero do composto e menos do que cerca de 10% em peso dos outros estereoisômeros do composto, ainda mais preferivelmente mais do que cerca de 95% em peso de um estereoisômero do composto e menos do que cerca de 5% em peso dos outros estereoisômeros do composto, e muito mais preferivelmente mais do que cerca de 97% em peso de um estereoisômero do composto e menos do que cerca de 3% em peso dos outros estereoisômeros do composto.

Como aqui usado, o termo "enantiomericamente pura" significa uma composição estereomericamente pura de um composto tendo um centro quiral.

Como aqui usado, o termo "racêmico" ou "racemato" significa

cerca de 50% de um enantiômero e cerca de 50% do enantiômero correspondente em relação a todos os centros quirais na molécula. A invenção inclui todas as misturas enantiomericamente puras, enantiomericamente enriquecidas, diastereomericamente puras, diastereomericamente enriquecidas, e racêmicas do compostos da invenção.

Em adição às definições acima, certos compostos aqui descritos têm uma ou mais ligações duplas que podem existir como o isômero quer Z quer E. Em certas modalidades, compostos aqui descritos estão presentes como isômeros individuais substancialmente livres de outros isômeros e alternativamente, como misturas de vários isômeros, e.g., misturas racêmicas de estereoisômeros.

Na descrição seguinte, todos os números aqui mostrados são valores aproximados, a não ser que a expressão "cerca de" ou "aproximado" seja usada em conexão com os mesmos. Podem variar em 1 por cento, 2 por cento, 5 por cento, ou, algumas vezes, 10 a 20 por cento. Sempre que uma faixa numérica com um limite inferior, RL e um limite superior, RU, é mostrada, qualquer número caindo dentro da faixa é especificamente mostrado. Em particular, os seguintes números dentro da faixa são especificamente mostrados: R=RL+k*(RU-RL), sendo que k é uma variável variando de 1 por cento a 100 por cento com um incremento de 1 por cento, i.e., k é 1 por cento, 2 por cento, 3 por cento, 4 por cento, 5 por cento,..., 50 por cento, 51 por cento, 52 por cento,..., 95 por cento, 96 por cento, 97 por cento, 98 por cento, 99 por cento, ou 100 por cento. Além disso, qualquer faixa numérica definida por dois números R como definida acima também é especificamente mostrada.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES DA INVENÇÃO Em um aspecto, a invenção proporciona uma composição combustível compreendendo: (a) limonano em uma quantidade que é pelo menos 2% em

volume, baseada no volume total da composição; e

(b) um combustível baseado em petróleo em uma quantidade que é pelo menos 5% em volume, baseada no volume total da composição,

sendo que a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C.

Em certas modalidades, a quantidade de limonano é de cerca de 2% a cerca de 95%, de cerca de 2% a cerca de 90%, de cerca de 2% a cerca de 80%, de cerca de 2% a cerca de 70% ou de cerca de 2% a cerca de 50% em peso ou volume, baseada no peso ou volume total da composição de combustível. Em certas modalidades, a quantidade de limonano é pelo menos cerca de 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% em peso ou volume, baseada no peso ou volume total da composição de combustível. Em certas modalidades, a quantidade está em % em peso baseada no peso total da composição de combustível. Em outras modalidades, a quantidade está em % em volume baseada no volume total da composição.

Em outras modalidades, limonano está presente em uma quantidade de no máximo cerca de 5%, no máximo cerca de 10%, no máximo cerca de 15%), no máximo cerca de 20%», no máximo cerca de 25%, no máximo cerca de 30%, no máximo cerca de 35%, no máximo cerca de 40%, no máximo cerca de 45%, no máximo cerca de 50%, no máximo cerca de 60%, no máximo cerca de 70%, no máximo cerca de 80%, ou no máximo cerca de 90%, baseada no peso ou volume total da composição de combustível. Em outras modalidades, limonano está presente em uma quantidade de cerca de 2% a cerca de 99%, de cerca de 2.5% a cerca de 95%, de cerca de 5% a cerca de 90%, de cerca de 7,5% a cerca de 85%, de cerca de 10% a cerca de 80%, de cerca de 15% a cerca de 80%, de cerca de 20% a cerca de 75%, ou de cerca de 25% a cerca de 75%, baseada no peso ou volume total da composição de combustível.

Em algumas modalidades, o limonano nas composições de combustível aqui mostradas é ou compreende

Em outras modalidades, o limonano nas composições de combustível aqui mostradas é ou compreende

Em ainda outras modalidades, o limonano nas composições de

combustível aqui mostradas é ou compreende uma mistura compreendendo:

Em algumas modalidades, limonano é derivado de um material de partida isoprenóide. Em certas modalidades, o material de partida isoprenóide é preparado por células hospedeiras pela conversão de uma fonte de carbono no material de partida isoprenóide.

Em outras modalidades, a fonte de carbono é um açúcar tal como um monossacarídeo (açúcar simples), um dissacarídeo, ou uma ou mais combinações dos mesmos. Em certas modalidades, o açúcar é um açúcar simples capaz de suportar o crescimento de uma ou mais células aqui proporcionadas. O açúcar simples pode ser qualquer açúcar conhecido por aquelas pessoas experientes na arte. Alguns exemplos não-limitantes de açúcares simples ou monossacarídeos adequados incluem glicose, galactose, manose, frutose, ribose, e combinações dos mesmos. Alguns exemplos não- limitantes de dissacarídeos adequados incluem sacarose, lactose, maltose, trealose, celobiose, e combinações dos mesmos.

Em outras modalidades, a fonte de carbono é um polissacarídeo. Alguns exemplos não-limitantes de polissacarídeos adequados incluem amido, glicogênio, celulose, quitina, e combinações dos mesmos.

Em ainda outras modalidades, a fonte de carbono é uma fonte de carbono não-fermentável. Alguns exemplos não-limitantes de fonte de carbono não-fermentável adequada incluem acetato e glicerol.

Em algumas modalidades, a quantidade do combustível baseado em petróleo na composição de combustível aqui mostrada pode ser de cerca de 5% a cerca de 90 %, de cerca de 5% a cerca de 85%, de cerca de 5% a cerca de 80%, de cerca de 5% a cerca de 70%, de cerca de 5% a cerca de 60%, ou de cerca de 5% a cerca de 50%, baseada na quantidade total da composição de combustível. Em certas modalidades, a quantidade do combustível baseado em petróleo é menor do que cerca de 95%, menor do que cerca de 90%, menor do que cerca de 85%), menor do que cerca de 75%, menor do que cerca de 70%, menor do que cerca de 65%, menor do que cerca de 60%, menor do que cerca de 55%, menor do que cerca de 50%, menor do que cerca de 45%, menor do que cerca de 40%, menor do que cerca de 35%, menor do que cerca de 30%), menor do que cerca de 25%, menor do que cerca de 20%), menor do que cerca de 15%, menor do que cerca de 10%), baseada na quantidade total da composição de combustível. Em outras modalidades, o combustível baseado em petróleo é pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%) baseado na quantidade total da composição de combustível. Em algumas modalidades, a quantidade está em % em peso baseada no peso total da composição de combustível. Em outras modalidades, a quantidade está em % em volume baseada no volume total da composição.

Em algumas modalidades, o combustível baseado em petróleo é querosene. Querosene convencional geralmente é uma mistura de hidrocarbonetos, tendo um ponto de ebulição de cerca de 285°F a cerca de 610°F (i.e., de cerca de 140°C a cerca de 320°C). Em outras modalidades, o combustível baseado em petróleo é

um combustível de jato. Qualquer combustível de jato conhecido pelos técnicos experientes pode ser aqui usado. O American Society for Testing and Materials ("ASTM") e o United Kingdom Ministry of Defense ("MOD") têm desempenhado os papéis líder em definição e manutenção de especificação para combustível de turbina para aviação civil ou combustível de jato. As especificações respectivas publicadas por estas duas organizações são muito similares mas não são idênticas. Muitos outros países publicam suas próprias especificações nacionais para combustível de jato mas estão muito próximas ou são completamente idênticas à especificação quer de ASTM quer de MOD. ASTM D 1655 é a Especificação Padrão para Combustíveis de Turbina de Aviação e inclui especificações para Combustíveis Jato A, Jato A-Ie Jato B. Defence Standard 91-91 é a especificação MOD para jato A-I.

Jato A-I é o combustível de jato mais comum e é produzido para um grupo internacionalmente padronizado de especificações. Apenas nos Estados Unidos, uma versão de jato A-I conhecida como Jato A também é usada. Outro combustível de jato que é comumente usado em aviação civil é chamado Jato B. Jato B é um combustível mais leve na região de nafta- querosene que é usado por causa de seu desempenho melhorado em clima frio . Jato A, Jato A-Ie Jato B são especificados em ASTM Specification D 1655. Alternativamente, combustíveis de jato são classificados por militares em todo o mundo com um sistema diferente de números JP. Alguns são quase idênticos às suas contra-partes civis e diferem apenas pelas quantidades de uns poucos aditivos. Por exemplo, Jato A-I é similar a JP-8 e Jato B é similar a JP-4.

Em algumas modalidades, as composições de combustível aqui proporcionadas adicionalmente compreendem um composto aromático tal como p-cimeno, m-cimeno ou o-cimeno. Em outras modalidades, o composto aromático é ou compreende p-cimeno. Em certas modalidades, a quantidade de p-cimeno é de cerca de 0,1% a cerca de 50% em volume, de cerca de 0,1% a cerca de 45% em volume, de cerca de 0,1% a cerca de 40% em volume, ou de cerca de 0,1 % a cerca de 35% em volume, baseada no volume total da composição. Em outras modalidades, a quantidade de p- cimeno é de cerca de 0,5% a cerca de 35% em volume, baseada no volume total da composição. Em ainda outras modalidades, a quantidade de p-cimeno é de cerca de 1% a cerca de 25%, de cerca de 5% a cerca de 25%, de cerca de 5% a cerca de 20%, ou 10% a cerca de 20%» em volume, baseada no volume total da composição.

Em algumas modalidades, a quantidade total de compostos aromáticos nas composições de combustível é de cerca de 1% a cerca de 50% em peso ou volume, baseada no peso ou volume total da composição de combustível. Em outras modalidades, a quantidade total de compostos aromáticos nas composições de combustível é de cerca de 15% a cerca de 35%> em peso ou volume, baseada no peso ou volume total das composições de combustível. Em outras modalidades, a quantidade total de compostos aromáticos nas composições de combustível é de cerca de 15%» a cerca de 25% em peso ou volume, baseada no peso ou volume total das composições de combustível. Em outras modalidades, a quantidade total de compostos aromáticos nas composições de combustível é de cerca de 5% a cerca de 10% em peso ou volume, baseada no peso ou volume total da composição de combustível. Em ainda outras modalidades, a quantidade total de compostos aromáticos nas composições de combustível é menor do que cerca de 25% em peso ou volume, baseada no peso ou volume total das composições de combustível.

Em algumas modalidades, a composição de combustível adicionalmente compreende um aditivo de combustível. Em certas modalidades, o aditivo de combustível é de cerca de 0,1% a cerca de 50% em peso ou volume, baseado no peso ou volume total da composição de combustível. O aditivo de combustível pode ser qualquer aditivo de combustível conhecido por aquelas pessoas experientes na arte. Em outras modalidades, o aditivo de combustível é selecionado do grupo consistindo de oxigenados, antioxidantes, melhoradores de estabilidade térmica, estabilizadores, melhoradores de fluxo a frio, melhoradores de combustão, antiespumantes, aditivos de anti-névoa, inibidores de corrosão, melhoradores de lubricidade, inibidores de formação de gelo, aditivos de limpeza de injetor, supressores de fumaça, aditivos redutores de arrasto, desativadores de metal, dispersantes, detergentes, desemulsificadores, corantes, marcadores, dissipadores estáticos, biocidas e combinações dos mesmos. A quantidade de um aditivo de combustível na composição de

combustível aqui mostrada pode ser de cerca de 0,1% a menor do que cerca de 50%, de cerca de 0,2% a cerca de 40%, de cerca de 0.3% a cerca de 30%, de cerca de 0,4% a cerca de 20%, de cerca de 0,5% a cerca de 15% ou de cerca de 0,5% a cerca de 10%, baseada na quantidade total da composição de combustível. Em certas modalidades, a quantidade de um aditivo de combustível é menor do que cerca de 50%, menor do que cerca de 45%, menor do que cerca de 40%, menor do que cerca de 35%, menor do que cerca de 30%>, menor do que cerca de 25%, menor do que cerca de 20%, menor do que cerca de 15%, menor do que cerca de 10%, menor do que cerca de 5%, menor do que cerca de 4%, menor do que cerca de 3%, menor do que cerca de 2%, menor do que cerca de 1% ou menor do que cerca de 0,5%, baseada na quantidade total da composição de combustível. Em algumas modalidades, a quantidade está em % em peso baseada no peso total da composição de combustível. Em outras modalidades, a quantidade está em % em volume baseada no volume total da composição.

Exemplos ilustrativos de aditivos de combustível são descritos com mais detalhe abaixo. Melhoradores de lubricidade são um exemplo. Em certos aditivos, a concentração do melhorador de lubricidade no combustível cai dentro da faixa de cerca de 1 ppm a cerca de 50.000 ppm, preferivelmente de cerca de 10 ppm a cerca de 20.000 ppm, e mais preferivelmente de cerca de 25 ppm a cerca de 10.000 ppm. Alguns exemplos não-limitantes de melhorador de lubricidade incluem ésteres de ácido graxo.

Estabilizadores melhoram a estabilidade de armazenagem da composição de combustível. Alguns exemplos não-limitantes de estabilizadores incluem terciário-alquil-aminas primárias. O estabilizador pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 2% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em peso a cerca de 1% em peso.

Melhoradores de combustão aumentam a velocidade de queima de massa da composição de combustível. Alguns exemplos não- limitantes de melhoradores de combustão incluem ferroceno(diciclo- pendadienil-ferro), melhoradores de combustão baseados em ferro (e.g., TURBOTECT™ ER-18 de Turbotect (USA) Inc., Tomball, Texas), melhoradores de combustão baseados em bário, melhoradores de combustão baseados em cério, e melhoradores de combustão baseados em ferro e magnésio (e.g., TURBOTECT™ 703 de Turbotect (USA) Inc., Tomball, Texas). O melhorador de combustão pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 1% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em peso a cerca de 1% em peso.

Antioxidantes que evitam a formação de depósitos de goma sobre componentes de sistema de combustível causada por oxidação de combustíveis em armazenagem e/ou inibem a formação de compostos de peróxido em certas composições de combustível podem ser aqui usados. O antioxidante pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 5% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em peso a cerca de 1% em peso.

Dissipadores estáticos reduzem os efeitos de eletricidade estática gerada pelo movimento de combustível através de sistemas de transferência de combustível de velocidade alta. O dissipador estático pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001%) em peso a cerca de 5% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01%) em

peso a cerca de 1 % em peso.

Inibidores de corrosão protegem metais ferrosos no manuseio de sistemas de combustível tais como tubulações, e tanques de armazenagem de combustível, da corrosão. Em circunstâncias onde lubricidade adicional é desejada, inibidores de corrosão que também melhoram as propriedades de lubrificação da composição podem ser usados. O inibidor de corrosão pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 5% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em

peso a cerca de 1% em peso.

Inibidores de formação de gelo de sistema de combustível (também chamado de aditivo de anti-formação de gelo) reduzem o ponto de congelamento da água precipitada dos combustíveis de jato devido ao esfriamento em altitudes elevadas e previnem a formação de cristais de gelo que restringem o fluxo de combustível para o motor. Certos inibidores de formação de gelo de sistema de combustível também podem atuar como um biocida. O inibidor de formação de gele de sistema de combustível pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 5% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em peso a cerca de 1% em peso.

Biocidas são usados para combater crescimento microbiano na composição de combustível. O biocida pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 5% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em peso a cerca de 1% em peso.

Desativadores de metal suprimem o efeito catalítico que alguns metais, particularmente cobre, têm sobre a oxidação de combustível. O desativador de metal pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 5% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em peso a cerca de 1% em peso.

Melhoradores de estabilidade térmica são usados para inibir a formação de depósito nas áreas de temperatura alta do sistema de combustível de aeronave. O melhorador de estabilidade térmica pode estar presente na composição de combustível em uma concentração de cerca de 0,001% em peso a cerca de 5% em peso, baseada no peso total da composição de combustível, e em uma modalidade de cerca de 0,01% em peso a cerca de 1% em peso.

Em algumas modalidades, a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea maior do que cerca de 32°C, maior do que cerca de 33°C, maior do que cerca de 34°C, maior do que cerca de 35°C, maior do que cerca de 36°C, maior do que cerca de 37°C, maior do que cerca de 38°C, maior do que cerca de 39°C, maior do que cerca de 40°C, maior do que cerca de 41°C, maior do que cerca de 42°C, maior do que cerca de 43°C, ou maior do que cerca de 44°C. Em outras modalidades, a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea maior do que 38°C. Em certas modalidades, o ponto de vaporização instantânea da composição de combustível aqui mostrada é medido de acordo com ASTM Standard D 56. Em outras modalidades, o ponto de vaporização instantânea da composição de combustível aqui mostrada é medido de acordo com ASTM Standard D 93. Em outras modalidades, o ponto de vaporização instantânea da composição de combustível aqui mostrada é medido de acordo com ASTM Standard D 3828- 98. Em ainda outras modalidades, o ponto de vaporização instantânea da composição de combustível aqui mostrada é medido de acordo com qualquer método convencional conhecido por um técnico experiente para medir o ponto de vaporização instantânea de combustíveis.

Em algumas modalidades, a composição de combustível tem uma densidade a 15°C de cerca de 750 kg/m a cerca de 850 kg/m , de cerca

~ T Λ

de 750 kg/m a cerca de 845 kg/m , de cerca de 750 kg/m a cerca de 840 kg/m3, de cerca de 760 kg/m3 a cerca de 845 kg/m3, de cerca de 770 kg/m3 a cerca de 850 kg/m3, de cerca de 770 kg/m3 a cerca de 845 kg/m3, de cerca de 775 kg/m3 a cerca de 850 kg/m3, ou de cerca de 775 kg/m3 a cerca de 845 kg/m3. Em outras modalidades, a composição de combustível tem uma densidade a 15°C de cerca de 780 kg/m3 a cerca de 845 kg/m3. Em ainda outras modalidades, a composição de combustível tem uma densidade a 15°C de cerca de 775 kg/m3 a cerca de 840 kg/m3. Em ainda outras modalidades, a composição de combustível tem uma densidade a 15°C de cerca de 750 kg/m a cerca de 805 kg/m3. Em certas modalidades, a densidade de uma composição de combustível aqui mostrada é medida de acordo com ASTM Standard D 4052. Em outras modalidades, a densidade da composição de combustível aqui mostrada é medida de acordo com qualquer método convencional conhecido por um técnico experiente para medir densidade de combustíveis.

Em algumas modalidades, a composição de combustível tem

um ponto de congelamento que é menor do que -3O0C, menor do que -40°C, menor do que -50°C, menor do que -60°C, menor do que -70°C, ou menor do que -80°C. Em outras modalidades, a composição de combustível tem um ponto de congelamento de cerca de -80°C a cerca de -30°C, de cerca de -75°C a cerca de -35°C, de cerca de -70°C a cerca de -40°C, ou de cerca de -65°C a cerca de -45°C. Em certas modalidades, o ponto de congelamento da composição de combustível aqui mostrada é medido de acordo com ASTM Standard D 2386. Em outras modalidades, o ponto de congelamento da composição de combustível aqui mostrada é medido de acordo com qualquer método convencional conhecido por um técnico experiente para medir ponto de congelamento de combustíveis.

Em algumas modalidades, a composição de combustível tem uma densidade a 15°C de cerca de 750 kg/m3 a cerca de 850 kg/m3, e um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C. Em certas modalidades, a composição de combustível tem uma densidade a 15 0C de cerca de 750 kg/m3 a cerca de 850 kg/m3, um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C, e um ponto de congelamento menor do que -40°C. Em certas modalidades, a composição de combustível tem uma densidade a 15°C de cerca de 750 kg/m3 a cerca de 840 kg/m3, um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C, e um ponto de congelamento menor do que -40°C.

Em algumas modalidades, a composição de combustível tem um ponto de ebulição inicial que é de cerca de 140°C a cerca de 170°C. Em outras modalidades, a composição de combustível tem um ponto de ebulição final que é de cerca de 180°C a cerca de 300°C. Em ainda outras modalidades, a composição de combustível tem um ponto de ebulição inicial que é de cerca de 140°C a cerca de 170°C, e um ponto de ebulição final que é de cerca de 180°C a cerca de 300°C. Em certas modalidades, a composição de combustível atende à especificação de destilação de ASTM D 86.

Em algumas modalidades, a composição de combustível tem uma temperatura de Testador de Oxidação Térmica de Combustível de jato (JFTOT) que é igual a ou maior do que 245°C. Em outras modalidades, a composição de combustível tem uma temperatura de JFTOT que é igual a ou maior do que 250°C, igual a ou maior do que 255°C, igual a ou maior do que 260°C, ou igual a ou maior do que 265°C.

Em algumas modalidades, a composição de combustível tem uma viscosidade a -20°C que é menor do que 6 mm2/s, menor do que 7 mm2/s, menor do que 8 mm2/s, menor do que 9 mm2/s, ou menor do que 10 mm2/s. Em certas modalidades, a viscosidade da composição de combustível aqui mostrada é medido de acordo com ASTM Standard D 445.

Em algumas modalidades, a composição de combustível atende à especificação ASTM D 1655 para jato A-1. Em outras modalidades, a composição de combustível atende à especificação ASTM D 1655 para jato A. Em ainda outras modalidades, a composição de combustível atende à especificação ASTM D 1655 para jato B.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição combustível compreendendo:

(a) limonano em uma quantidade que é pelo menos cerca de 5% em volume, baseada no volume total da composição;

(b) p-cimeno em uma quantidade que é pelo menos cerca de 0,5% em volume, baseada no volume total da composição; e,

(b) um combustível baseado em petróleo em uma quantidade que é pelo menos 40% em volume, baseada no volume total da composição. Em outras modalidades, o limonano está presente em uma quantidade que está entre cerca de 5 % e cerca de 60% em volume, baseada no volume total da composição. Em ainda outras modalidades, o limonano está presente em uma quantidade que está entre cerca de 5% e cerca de 25% em volume, baseada no volume total da composição. Em ainda outras modalidades o limonano está presente em uma quantidade que está entre cerca de 20% e cerca de 50% em volume, baseada no volume total da composição.

Em certas outras modalidades, o p-cimeno está presente em uma quantidade que está entre cerca de 0,5% e cerca de 25% em volume baseada no volume total da composição. Em ainda outras modalidades, o p- cimeno está presente em uma quantidade que está entre cerca de 0,5% e cerca de 10% em volume baseada no volume total da composição.

Em certas outras modalidades, a composição de combustível tem uma densidade a 15°C de entre 750 e 840 kg/m3, tem um ponto de vaporização instantânea que é igual a ou maior do que 38°C; e ponto de congelamento que é menor do que -40°C. Em ainda outras modalidades, o combustível baseado em petróleo é Jato Aea composição de combustível atende à especificação ASTM D 1655 para jato A. Em ainda outras modalidades, o combustível baseado em petróleo é Jato A-Iea composição de combustível atende à especificação ASTM D 1655 para jato A-1. Em ainda outras modalidades, o combustível baseado em petróleo é Jato Bea composição de combustível atende à especificação ASTM D 1655 para jato B.

Em outro aspecto, um sistema de combustível é proporcionado compreendendo um tanque de combustível contendo a composição de combustível aqui mostrada. Opcionalmente, o sistema de combustível pode adicionalmente compreender um sistema de esfriamento de motor tendo um agente de refrigeração de motor circulando, uma linha de combustível conectando o tanque de combustível com o motor de combustão interna, e/ou um filtro de combustível posicionado na linha de combustível. Alguns exemplos não-limitantes de motores de combustão interna incluem motores recíprocos (e.g., motores a gasolina e motores a diesel), motores de Wankel, motores a jato, alguns motores de foguete, e motores de turbina a gás.

Em algumas modalidades, o tanque de combustível está posicionado com dito sistema de combustível de modo a permitir transferência de calor do agente de refrigeração de motor recirculando para a composição de combustível contida no tanque de combustível. Em outras modalidades, o sistema de combustível adicionalmente compreende um segundo tanque de combustível contendo um segundo combustível para um motor a jato e uma segunda linha de combustível conectando o segundo tanque de combustível com o motor. Opcionalmente, as primeira e segunda linhas de combustível podem estar munidas com válvulas eletromagneticamente operadas que podem ser abertas ou fechadas independentemente umas das outras ou simultaneamente. Em outras modalidades, o segundo combustível é um Jato A.

Em outro aspecto, um arranjo de motor é proporcionado compreendendo um motor de combustão interna, um tanque de combustível contendo a composição de combustível aqui mostrada, uma linha de combustível conectando o tanque de combustível com o motor de combustão interna. Opcionalmente, o arranjo de motor pode adicionalmente compreender um filtro de combustível e/ou um sistema de esfriamento de motor compreendendo um agente de refrigeração de motor circulando. Em algumas modalidades, o motor de combustão interna é um motor a diesel. Em outras modalidades, o motor de combustão interna é um motor a jato.

Quando se usa a composição de combustível aqui mostrada, é desejável remover matéria particulada originária da composição de combustível antes de injetá-la no motor. Portanto, é desejável selecionar um filtro de combustível adequado para uso em um sistema de combustível aqui mostrado. Água em combustíveis usados em um motor de combustão interna, ainda em quantidades pequenas, pode ser muito nociva para o motor. Portanto, é desejável que alguma água presente na composição de combustível seja removida antes da injeção no motor. Em algumas modalidades, água e matéria particulada podem ser removidas pelo uso de um filtro de combustível utilizando uma centrífuga de turbina, na qual água e matéria particulada são separadas da composição de combustível em uma extensão que permite a injeção da composição de combustível filtrada no motor, sem risco de danificar o motor. Outros tipos de filtros de combustível que podem remover água e/ou matéria particulada também podem ser usados.

Em outro aspecto, é proporcionado um veículo compreendendo um motor de combustão interna, um tanque de combustível contendo a composição de combustível aqui mostrada, e uma linha de combustível conectando o tanque de combustível com o motor de combustão interna. Opcionalmente, o veículo pode adicionalmente compreender um filtro de combustível e/ou um sistema de esfriamento de motor compreendendo um agente de refrigeração de motor circulando. Alguns exemplos não-limitantes de veículos incluem carros, motocicletas, trens, navios, e aeronave.

Métodos de Preparação de Composições de Combustível

Em outro aspecto, são aqui proporcionados métodos de preparação de uma composição de combustível compreendendo as etapas de:

(a) contactar um material de partida isoprenóide com hidrogênio na presença de um catalisador para formar um limonano; e

(b) misturar o limonano com um componente combustível para preparar a composição de combustível.

Em uma modalidade, o material de partida isoprenóide é

limoneno Em outra modalidade, o material de partida isoprenóide é β-

felandreno

Em outra modalidade, o material de partida isoprenóide é γ-

terpineno

Em ainda outra modalidade, o material de partida isoprenóide

é terpinoleno

Em certas modalidades, quando o material de partida isoprenóide é contactado com hidrogênio na presença de um catalisador, ambos limonano e p-cimeno são formados. Em outras modalidades, o material de partida isoprenóide é convertido em limonano que está substancialmente livre de p-cimeno.

Em outro aspecto, são aqui proporcionados métodos de preparação de uma composição de combustível a partir de um açúcar simples compreendendo as etapas de:

(a) contactar uma célula capaz de preparar um material de partida isoprenóide com o açúcar simples sob condições adequadas para preparar o material de partida isoprenóide;

(b) converter o material de partida isoprenóide em limonano;

e,

(c) misturar o limonano com um componente combustível para preparar dita composição de combustível.

Em algumas modalidades, o material de partida isoprenóide é convertido em limonano pelo contato do material de partida isoprenóide com hidrogênio na presença de um catalisador. Em certas modalidades, o material de partida isoprenóide é convertido em ambos limonano e p-cimeno pelo contato do material de partida isoprenóide com hidrogênio na presença de um catalisador. Nestas modalidades, ambos limonano e p-cimeno são misturados com um componente combustível para preparar dita composição de combustível em etapa (c).

Em outro aspecto, é proporcionada uma instalação para manufatura de um combustível, componente biocombustível bioengenheirado, ou aditivo de combustível bioengenheirado da invenção. Em certas modalidades, a instalação é capaz de manufatura biológica de materiais de partida Ci0. Em certas modalidades, a instalação é adicionalmente capaz de preparar um aditivo de combustível isoprenóide ou componente combustível a partir do material de partida.

A instalação pode compreender qualquer estrutura útil para preparar o material de partida isoprenóide usando um microorganismo. Em algumas modalidades, a instalação biológica compreende uma ou mais das células aqui mostradas. Em algumas modalidades, a instalação biológica compreende uma cultura de células compreendendo pelo menos um material de partida isoprenóide em uma quantidade de pelo menos cerca de 1% em peso, pelo menos cerca de 5% em peso, pelo menos cerca de 10% em peso, pelo menos cerca de 20% em peso, ou pelo menos cerca de 30% em peso, baseada no peso total da cultura de células. Em outras modalidades, a instalação biológica compreende um fermentador compreendendo uma ou mais das células aqui descritas.

Qualquer fermentador que pode proporcionar às células ou bactérias um ambiente estável e ótimo no qual elas podem crescer ou se reproduzir pode ser aqui usado. Em algumas modalidades, o fermentador compreende uma cultura compreendendo uma ou mais das células aqui mostradas. Em outras modalidades, o fermentador compreende uma cultura de células capaz de biologicamente manufaturar pirofosfato de geranila (GPP). Em outras modalidades, o fermentador compreende uma cultura de células capaz de biologicamente manufaturar difosfato de isopentila (IPP). Em certas modalidades, o fermentador compreende uma cultura de células compreendendo pelo menos um material de partida isoprenóide em uma quantidade de pelo menos cerca de 1% em peso, pelo menos cerca de 5% em peso, pelo menos cerca de 10% em peso, pelo menos cerca de 20% em peso, ou pelo menos cerca de 30% em peso, baseada no peso total da cultura de células.

A instalação pode adicionalmente compreender qualquer

estrutura capaz de manufaturar o componente combustível ou aditivo de combustível a partir do material de partida isoprenóide. A estrutura pode compreender um hidrogenador para a hidrogenação do material de partida isoprenóide. Qualquer hidrogenador que pode ser usado para reduzir ligações duplas C=C em ligações simples C-C sob condições conhecidas pelos técnicos experientes pode ser aqui usado. O hidrogenador pode compreender um catalisador de hidrogenação aqui mostrado. Em algumas modalidades, a estrutura adicionalmente compreende um misturador, um recipiente, e uma mistura dos produtos de hidrogenação da etapa de hidrogenação e um aditivo de combustível convencional no recipiente.

O açúcar simples pode ser qualquer açúcar conhecido por aquelas pessoas experientes na arte. Alguns exemplos não-limitantes de açúcares simples ou monossacarídeos adequados incluem glicose, galactose, manose, frutose, ribose e combinações dos mesmos. Alguns exemplos não- limitantes de dissacarídeos adequados incluem sacarose, lactose, maltose, trealose, celobiose e combinações dos mesmos. Em certas modalidades, o componente biocombustível bioengenheirado pode ser obtido a partir de um polissacarídeo. Alguns exemplos não-limitantes de polissacarídeos adequados incluem amido, glicogênio, celulose, quitina e combinações dos mesmos.

Os monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos adequados para preparar o tetrametil-ciclo-hexano bioengenheirado podem ser encontrados em uma ampla variedade de colheitas ou fontes. Alguns exemplos não-limitantes de colheitas ou fontes adequadas incluem cana-de- açúcar, bagaço, miscanthus, beterraba, sorgo, sorgo granífero, swítchgrass (Panicum virgatum), cevada, cânhamo, kenaf (.Hibiscus cannabinus), batatas, batatas doces, mandioca, girassol, fruta, melaço, soro de leite ou leite desnatado, milho, forragem, grão, trigo, madeira, papel, palha, algodão, muitos tipos de resíduo de celulose, e outra biomassa. Em certas modalidades, as colheitas ou fontes adequadas incluem cana-de-açúcar, beterraba e milho.

Métodos de Preparação de Compostos

Os compostos da presente invenção podem ser preparados usando qualquer método conhecido na técnica incluindo método biológico, síntese química total (sem o uso de materiais biologicamente derivados), e um método híbrido onde meios biológicos e químicos são usados. Em certas modalidades, os materiais de partida isoprenóides são cada um preparados pelas células hospedeiras pela conversão de açúcar simples no produto desejado. Células hospedeiras

Os materiais de partida isoprenóides também podem ser preparados por qualquer método conhecido na técnica incluindo métodos biológicos, sínteses químicas, e métodos híbridos. Quando o material de partida isoprenóide é preparado biologicamente, células hospedeiras que são modificadas para produzirem o produto desejado podem ser usadas. Como todos isoprenóides, o material de partida isoprenóide é preparado bioquimicamente através de um intermediário comum, difosfato de isopentila

("IPP").

A célula hospedeira pode ser crescida de acordo com qualquer técnica conhecida por aquelas pessoas experientes na arte. Em particular, a célula hospedeira pode ser crescida em meio de cultura apropriado para a célula hospedeira. Em modalidades vantajosas, o meio de cultura compreende componentes prontamente disponíveis, renováveis. A presente invenção assim proporciona fontes de energia prontamente disponíveis, renováveis, métodos de seu uso para produzir composições de combustível. Em certas modalidades, a célula hospedeira é crescida ou cultivada por contato com um açúcar simples sob condições adequadas para seu crescimento e produção de um material de partida isoprenóide. Em certas modalidades, a célula hospedeira pode ser crescida ou cultivada pelo contato com glicose, galactose, manose, frutose, ribose, ou uma combinação dos mesmos. A presente invenção assim proporciona composições de combustível derivadas de açúcares simples, e.g. glicose, galactose, manose, frutose, ribose, e combinações dos mesmos, e métodos de sua produção a partir dos açúcares simples.

Qualquer célula hospedeira adequada pode ser usada na prática dos métodos e composições aqui descritos. Em uma modalidade, a célula hospedeira é um microorganismo hospedeiro geneticamente modificado no qual moléculas de ácido nucleico têm sido inseridas, deletadas ou modificadas (i.e., mutadas; e.g., por inserção, deleção, substituição, e/ou inversão de nucleotídeos), quer para produzir o isoprenóide ou derivado de isoprenóide desejado, quer para produzir rendimentos aumentados do isoprenóide ou derivado de isoprenóide desejado. Em certas modalidades, a célula hospedeira é capaz de ser crescida em meio de crescimento líquido.

Exemplos ilustrativos de células hospedeiras adequadas incluem qualquer célula de archae, bacteriana, ou eucariótica. Exemplos de uma célula de archae incluem, mas não são limitadas àquelas pertencendo aos gêneros: Aeropyrum, Archaeglobus, Halobacterium, Methanococcus, Methanobaeterium, Pyroeoecus, Sulfolobus, e Thermoplasma. Exemplos ilustrativos de espécie archae incluem mas não são limitadas a: Aeropyrum pernix, Archaeoglobus fulgidus, Methanoeoceus jannasehii, Methanobaeterium thermoautotrophieum, Pyroeoecus abyssi, Pyroeoecus horikoshii, Thermoplasma acidophilum, e Thermoplasma volcanium.

Exemplos de espécies bacterianas úteis incluem, mas não são limitadas àquelas pertencendo aos gêneros: Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anaeystis, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Brevibacterium, Chromatium, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Phormidium, Pseudomonas, Rhodobacter,

Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Rhodococcus, Salmonel la, Scenedesmun, Serratia, Shigella, Staphlococcus, Strepromyces, Synneeoccus, e Zymomonas.

Exemplos ilustrativos de espécies bacterianas úteis incluem mas não são limitadas a: Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum, Clostridium beigerinckii, Enterobacter sakazakii, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Mesorhizobium loti, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudica, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum,. Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, e semelhantes.

Em geral, se uma célula hospedeira bacteriana é usada, é preferida uma cepa não-patogênica. Exemplos ilustrativos de cepas não- patogênicas incluem mas não são limitados a: Bacillus subtilis, Eseheriehia coli, Laetibaeillus aeidophilus, Lactobacillus helvetieus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Pseudomonas pudita, Rhodobaeter sphaeroides, Rodobaeter eapsulatus, Rhodospirillum rubrum, e semelhantes.

Exemplos de células eucarióticas úteis incluem mas não são limitados células fúngicas. Exemplos de células fungicas incluem, mas não são limitadas àquelas pertencendo aos gêneros: Aspergillus, Candida, Chrysosporium, Cryotoeoceus, Fusarium, Kluyveromyces, Neotyphodium, Neurospora, Penieillium, Pichia, Saccharomyees, e Triehoderma.

Exemplos ilustrativos de espécies eucarióticas úteis incluem mas não são limitados a: Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Candida albieans, Chrysosporium lueknowense, Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Kluyveromyces laetis, Neurospora crassa, Piehia angusta, Pichiafinlandiea, Piehia kodamae, Piehia membranaefaeiens, Pichia methanolica, Pichia opuntiae, Pichia pastoris, Pichia pijperi, Pichia quercuum, Pichia salictaria, Pichia thermotolerans, Pichia trehalophila, Pichia stipitis, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces aureus, Saccaromyces bayanus, Saccaromyces boulardi, Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces fungicidicus, Streptomyces gríseochromogenes, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces vinaceus, e Triehoderma reesei.

Em geral, se uma célula eucariótica é usada, é preferida uma espécie não-patogênica. Exemplos ilustrativos de espécies não-patogênicas incluem mas não são limitados a: Fusarium graminearum, Fusarium venenatum, Pichia pastoris, Saccaromyces boulardi, e Saccaromyees eerevisiae.

Em adição, certas espécies têm sido denominadas pela Food e Drug Administration como GRAS ou Geralmente Consideradas Seguras. Estas cepas incluem: Bacillus subtilis, Lactibacillus acidophilus, Lactobacillus helvetieus, e Saccharomyees eerevisiae.

Vias de IPP

Há duas vias biossintéticas que sintetizam IPP e seu isômero, pirofosfato de dimetil-alila ("DMAPP"). Eucariotos diferentes de plantas usam a via de isoprenóide dependente de mevalonato ("MEV") exclusivamente para converter acetil-coenzima A ("acetil-CoA") em IPP, que é subseqüentemente isomerizado para DMAPP. Procariotos, com algumas exceções, a via de desóxi-xilulose-5-fosfato ("DXP") ou independente de mevalonato para produzir IPP e DMAPP separadamente através de um ponto de ramificação. Em geral, plantas usam ambas as vias MEV e SXP para a síntese de IPP.

Via MEV

Uma representação esquemática da via MEV é descrita em Figura 1. Em geral, a via compreende seis etapas.

Na primeira etapa, duas moléculas de acetil-coenzima A são enzimaticamente combinadas para formar aceto-acetil-CoA. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, acetil-CoA tiolase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados aos seguintes números de acesso em GenBank e organismo do qual as seqüências são derivadas: (NC 000913 REGION: 2324131..2325315; Eseheriehia eolí), (D49362; Paraeoeeus denitrifleans), e (L20428; Saccharomyees eerevisiae).

Na segunda etapa da via MEV, aceto-acetil-CoA é enzimaticamente condensada com outra molécula de acetil-CoA para formar 3-hidróxi-3-meti 1-glutaril-CoA (HMG-CoA). Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, HMG-CoA sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (NC_001145. complemento 19061..2053 6; Saccharomyces eerevisiae), (X96617; Saccharomyees eerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kitasatospora griseola), (BT007302; Homo sapiens), e (NC_002758, Locus tag SAV2546, GeneID 1122571; Staphyloeoeeus aureus).

Na terceira etapa, HMG-CoA é enzimaticamente convertida em mevalonato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, HMG-CoA redutase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (NM_206548; Drosophila melanogaster), (NC_002758, Locus tag SAV2545, GeneID 1122570; Staphyloeoeeus aureus), (NM_204485; Gallus gallus), (ABO 15627; Streptomyees sp. KO 3988), (AF542543; Nieotiana attenuata), (AB037907; Kitasatospora griseola), (AX128213, proporcionando a seqüência codificadora de uma HMGR truncada; Saccharomyees eerevisiae), e (NC001145: complemento (115734.. 118898; Saccharomyees eerevisiae).

Na quarta etapa, mevalonato é enzimaticamente fosforilado para formar mevalonato 5-fosfato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, mevalonato cinase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (L77688; Arabidopsis thaliana), e (X55875; Saccharomyees eerevisiae).

Na quinta etapa, um segundo grupo fosfato é enzimaticamente adicionado em mevalonato 5-fosfato para formar mevalonato 5-pirofosfato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, fosfomevalonato cinase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM_006556; Homo sapiens), e (NC_001145. complemento 712315..713670; Saccharomyces cerevisiae).

Na sexta etapa, mevalonato 5-pirofosfato é enzimaticamente é convertido em IPP. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, mevalonato pirofosfato descarboxilase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (X97557; Saccharomyees cerevisiae), (AF290095; Enteroeoeeus faeeium), e (U49260; Homo sapiens).

Se IPP é para ser convertido em DMAPP usando a via de mevalonato, então é exigida uma sétima etapa. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, IPP isomerase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (NC 000913, 3031087..3031635; Eseheriehia eoli), e (AF082326; Haematocoeeus pluvialis).

Via DXP

Uma representação esquemática da via DXP é descrita em Figura 2. Em geral, a via DXP compreende sete etapas. Na primeira etapa, piruvato é condensado com D-gliceraldeído 3-fosfato para preparar 1-desóxi- D-xilulose-5-fosfato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AF035440; Eseheriehia eoli), (NC_002947, locus tag PP0527; Pseudomonas putida KT2440), (CP000026, locus tag SPA2301; Salmonella enteriea Paratyphi, see ATCC 9150), (NC_007493, locus tag RSP_0254; Rhodobaeter sphaeroides 2.4.1), (NC005296, locus tag RPA0952; Rhodopseudomonas palustris CGA009), (NC 004556, locus tag PD1293; Xylellafastidiosa Temeculal), e (NC_003076, locus tag AT5G11380; Arabidopsis thaliana).

Na segunda etapa, l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato é convertido em 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AB013300; Escherichia coli), (AF148852; Arabidopsis thaliana), (NC_002947, locus tag PP1597; Pseudomonas putida KT2440), (AL939124, locus tag SC05694; Streptomyces coelicolor A3(2)), (NC 007493, locus tag RSP 2709; Rhodobaeter sphaeroides 2.4.1), e (NC_007492, locus tag PflJ 107; Pseudomonasfluoreseens PfO-1).

Na terceira etapa, 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato é convertido em 4-difosfo-citidil-2C-metil-D-eritritol. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, 4-difosfo-citidil-2C-metil-D-eritritol sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AF230736; Escheriehia coli), (NC_007493, locus tag RSP 2835; Rhodobaeter sphaeroides 2.4.1), (NC_003071, locus tag AT2G02500; Arabidopsis thaliana), e (NC 002947, locus tag PPl614; Pseudomonas putida KT2440).

Na quarta etapa, 4-difosfo-citidil-2C-metil-D-eritritol é convertido em 4-difosfo-citidil-2C-metil-D-eritritol-2-fosfato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, 4-difosfo-citidil-2C-metil- D-eritritol cinase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AF216300; Eseherichia coli) e (NC_007493, locus tag RSP_1779; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1).

Na quinta etapa, 4-difosfo-citidil-2C-metil-D-eritritol-2- fosfato é convertido em 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclo-difosfato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, 2C-metil-D-eritritol 2,4- ciclo-difosfato sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AF230738; Eseheriehia coli), (NC 007493, locus tag RSP6071; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1), e (NC_002947, locus tag PPl618; Pseudomonasputida KT2440).

Na sexta etapa, 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclo-difosfato é convertido em l-hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil-4-difosfato. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, l-hidróxi-2-metil-2-(E)- butenil-4-difosfato sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AY033515; Escherichia colí), (NC 002947, locus tag PP0853; Pseudomonas putida KT2440), e (NC_007493, locus tag RSP_2982; Rhodobacter sphaeroides 2.4.1).

Na sétima etapa, l-hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil-4-difosfato é convertido em quer IPP quer seu isômero, DMAPP. Uma enzima conhecida em catalisar esta etapa é, por exemplo, isopentil/dimetil-alil difosfato sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos incluem mas não são limitados a: (AY062212; Escheriehia colí) e (NC_002947, locus tag PP0606; Pseudomonas putida KT2440).

Em algumas modalidades, "conversação cruzada" (ou interferência) entre os processos metabólicos da própria célula hospedeira e aqueles processos envolvidos com a produção de IPP como aqui proporcionados são minimizadas ou inteiramente eliminadas. Por exemplo, conversação cruzada é minimizada ou inteiramente eliminada quando o microorganismo hospedeiro baseia-se exclusivamente na via DXP para sintetizar IPP, e uma via MEV é introduzida para proporcionar IPP adicional. Um tal organismo hospedeiro não estaria equipado para alterar a expressão das enzimas da via MEY ou processar os intermediários associados com a via MEV. Organismos que se baseiam exclusivamente ou predominantemente na via DXP incluem, por exemplo, Eseheriehia eoli.

Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz IPP via a via MEV, quer exclusivamente quer em combinação com a via DXP. Em outras modalidades, uma via DXP de hospedeiro é funcionalmente desativada de modo que a célula hospedeira produza IPP exclusivamente através de uma via MEV heterogeneamente introduzida. A via DXP pode ser funcionalmente desativada pela desativação da expressão de gene ou inativação da função de uma ou mais das enzimas da via DXP . Material de partida isoprenóide

Em algumas modalidades GPP é preparado pelo método como descrito esquematicamente em Figura 3. Uma molécula de IPP e uma molécula de DMAPP são condensadas para formar GPP. Em algumas modalidades, a reação pode ser catalisada por uma enzima conhecida em catalisar esta etapa, por exemplo, geranil-difosfato-sintase. Vários materiais de partida isoprenóides podem ser preparados a partir de GPP.

Exemplos ilustrativos de polinucleotídeos codificadores de pirofosfato de geranila sintase incluem mas não são limitados a: (AF513111; Abies grandis), (AF513112; Abies grandis), (AF513113; Abies grandis), (AY534686; Antirrhinum majus), (AY534687; Antirrhinum majus), (Y17376; Arabidopsis thaliana), (AEO16877, Locus API 1092; Bacillus cereus; ATCC 14579), (AJ243739; Citrus sinensis), (AY534745; Clarkia breweri), (AY953508; Ipspini), (DQ286930; Lycopersicon eseulentum), (AF182828; Mentha xpiperita), (AF182827; Mentha χ piperita), (MPI249453; Mentha χ piperita), (PZE431697, Locus CAD24425; Paraeoeeus zeaxanthinifaeiens), (AY866498; Pierorhiza kurrooa), (AY351862; Vitis vinifera), e (AF203881, Locus AAF12843; Zymomonas mobilis).

GPP pode ser subseqüentemente convertido em vários materiais de partida isoprenóides usando uma ou mais terpeno sintases. Alguns exemplos não-limitantes incluem os seguintes exemplos e seus estereoisômeros.

Limoneno

Limoneno, cuja estrutura é

é encontrado na casca de frutas cítricas e em hortelã-pimenta. Limoneno é preparado a partir de GPP por limoneno sintase. Exemplos ilustrativos de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem mas não são limitados a: (+)-limoneno sintases (AF514287, REGION: 47.. 1867; Citrus limon) e (AY055214, REGION: 48.. 1889; Agastache rugosa) e (-)-limoneno 5 sintases (DQ195275, REGION: 1..1905; Pieea sitehensis), (AF006193, REGION: 73.. 1986; Abies grandis), e (MHC4SLSP, REGION: 29.. 1828; Mentha spieata).

β-Felandreno

β-Felandreno tendo a seguinte estrutura:

é um constituinte do óleo essencial de Buplerum frutieosum.

Bioquimicamente, β-felandreno é preparado a partir de GPP por uma β- felandreno sintase. Um exemplo não-limitante de uma seqüência de nucleotídeos adequada inclui número de acesso no GenBank de AF13 9205, REGION: 34.. 1926, de Abies grandis.

γ-Terpineno

γ-Terpineno tendo a seguinte estrutura:

é um constituinte do óleo essencial de frutas cítricas. Bioquimicamente, γ-terpineno é preparado a partir de GPP por uma γ- terpineno sintase. Alguns exemplos não-limitantes de seqüências de nucleotídeos adequadas incluem número de acesso no GenBank de AF514286, REGION: 30.. 1832 de Citrus limon e ABl 10640, REGION I..1803 de Citrus unshiu.

Terpinoleno

Terpinoleno tendo a seguinte estrutura:

é um constituinte de numerosos óleos essenciais. Bioquimicamente, terpinoleno é preparado a partir de GPP por uma terpinoleno sintase. Um exemplo não-limitante de uma seqüência de nucleotídeos adequada inclui AY906866, REGION: 10.. 1887 de Pseudotsuga menziesii.

Em algumas modalidades, o material de partida isoprenóide pode ser obtido ou preparado a partir de terpenos naturalmente ocorrentes que podem ser produzidos por uma ampla variedade de plantas, tais como Copaifera langsdorfii, coníferas, e eufórbias; insetos, tais como borboletas com asas traseiras em forma de cauda de andorinha, besouros de folha, térmites, e vespões de pinheiro; e organismos marinhos, tais como algas, esponjas, corais, moluscos, e peixes.

Copaifera langsdorfii ou árvore Copaifera também é conhecida como a árvore de diesel e a árvore de querosene. Tem muitos nomes em linguagens locais, incluindo kupa'y, cabismo, e copauva. Arvore Copaifera pode produzir uma quantidade grande de compostos terpênicos em suas madeira e folhas. Geralmente, uma árvore Copaifera pode produzir de cerca de 30 a cerca de 40 litros de óleo terpênico por ano.

Óleos terpênicos também podem ser obtidos de coníferas e eufórbias. Coníferas pertencem à divisão de planta Pinophyta ou Coniferae e são geralmente plantas de semente cônica com tecido vascular. As coníferas são em sua maioria árvores, mas algumas coníferas podem ser arbustos. Alguns exemplos não-limitantes de coníferas adequadas incluem cedros, ciprestes, pinheiros-douglas, pinheiros, juníperos, dâmaras, lariços, pinheiros, sequóias, abetos, e teixos. Eufórbias, também conhecidas como Euphorbia, são um gênero de plantas mundial muito diverso, pertencendo à família eufórbia (Euphorbiaceae). Consistindo de cerca de 2160 espécies, eufórbias são um dos gêneros maiores do reino vegetal.

Os materiais de partida isoprenóides são monoterpenos que são parte de uma classe maior de compostos chamados terpenos. Uma classe grande e variada de hidrocarbonetos, terpenos inclui hemiterpenos, monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, sesterterpenos, triterpenos, 10 tetraterpenos, e politerpenos. Como um resultado, materiais de partida isoprenóides adequados podem ser isolados de óleos terpênicos para uso na presente invenção.

Conversão Química

Em certas modalidades, limonano e p-cimeno nas composições de combustível são aqui proporcionados preparados por hidrogenação de um material de partida isoprenóide. Exemplos ilustrativos de materiais de partida isoprenóides adequados incluem, mas não são limitados a, limoneno, β- felandreno, γ-terpineno, terpinoleno e qualquer combinação dos mesmos.

Em algumas modalidades, hidrogenação ocorre por reação do 20 material de partida isoprenóide com hidrogênio na presença de um catalisador tal como Pd, Pd/C, Pt, PtO2, Ru(PPh3)2Cl2, níquel de Raney e combinações dos mesmos. Alternativamente, qualquer agente redutor que pode reduzir uma ligação C=C em uma ligação C-C pode ser usado, um exemplo ilustrativo de um tal agente redutor é hidrazina na presença de um catalisador, tal como, 25 perclorato de 5-etil-3-metil-umiflavínio, sob uma atmosfera de oxigênio. Uma reação de redução com hidrazina é mostrada em Imada et al., J. Am. Chem. Soe, 127, 14544-14545 (2005), que é aqui incorporado como referência.

O catalisador para a reação de hidrogenação dos materiais de partida isoprenóides pode estar presente em qualquer quantidade para a reação prosseguir. Em algumas modalidades, a quantidade de catalisador de hidrogenação é de cerca de 1 g a cerca de 100 g por litro de reagente, de cerca de 2 g a cerca de 75 g por litro de reagente, de cerca de 3 g a cerca de 50 g por litro de reagente, de cerca de 4 g a cerca de 40 g por litro de reagente, de cerca de 5 g a cerca de 25 g por litro de reagente, ou de cerca de 5g a cerca de 10 g por litro de reagente.

Em algumas modalidades, o catalisador é um catalisador de Pd. Em outras modalidades, o catalisador é 5% Pd/C. Em ainda outras modalidades, o catalisador é 10% Pd/C. Em alguma destas modalidades, a carga de catalisador está entre cerca de 1 g e cerca de 10 g por litro de reagente. Em outras modalidades, a carga de catalisador está entre cerca de 5 g e cerca de 5 g por litro de reagente.

Em algumas modalidades, a reação de hidrogenação procede na temperatura ambiente. Contudo, devido ao fato de a reação de hidrogenação ser exotérmica, a temperatura de mistura reacional pode aumentar à medida que a reação prossegue. Quando a temperatura de reação é mantida na ou próxima da temperatura ambiente, substancialmente todo o produto formado será limonano. Contudo, quantidades crescentes de p- cimeno são formadas à medida que a temperatura aumenta. Assim em certas modalidades onde a quantidade de p-cimeno é para ser minimizada, a temperatura de reação é de cerca de 10°C a cerca de 75°C, de cerca de 15°C a cerca de 60°C, de cerca de 20°C a cerca de 50°C, ou de cerca de 20°C a cerca de 40°C, inclusive. Em outras modalidades onde uma quantidade apreciável de p-cimeno é desejada, a temperatura de reação é de cerca de 75°C a cerca de 150°C, entre de cerca de 90°C a cerca de 130°C, ou de cerca de IOO0C a cerca de 125°C.

A pressão do hidrogênio para a reação de hidrogenação pode ser qualquer pressão que pode fazer com que a reação ocorra. Em algumas modalidades, a pressão do hidrogênio é de cerca de 69 kPa a cerca de 6.895 kPa, de cerca de 345 kPa a cerca de 5.516 kPa, de cerca de 2.758 kPa a cerca de 4.137 kPa, ou de cerca de 4345 kPa a cerca de 5345 kPa. Em outras modalidades, a pressão de hidrogênio é menor do que 689,5 kPa.

Em algumas modalidades, a conversão do material de partida isoprenóide em limonano ocorre em duas etapas. Na primeira, uma porção do material de partida isoprenóide é convertida em p-cimeno em uma reação de desproporção onde o material de partida isoprenóide é contactado com um catalisador de hidrogenação na presença de calor. Em algumas modalidades, a temperatura de reação da primeira etapa é de cerca de 75°C a cerca de 150°C, de cerca de 90°C a cerca de 130°C, ou de cerca de IOO0C a cerca de 125°C. Na segunda, a porção restante do material de partida isoprenóide (que não tem sido convertida em p-cimeno) é convertida em limonano em uma reação de hidrogenação. Em algumas modalidades, a temperatura de reação da segunda etapa é de cerca de 10°C a cerca de 75°C, de cerca de 15°C a cerca de 60°C, de cerca de 20°C a cerca de 50°C, ou de cerca de 20°C a cerca de 40°C.

Métodos Comerciais

Um aspecto da presente invenção refere-se a um método comercial compreendendo: (a) obter um biocombustível compreendendo limonano derivado de um material de partida isoprenóide pela realização de 20 uma reação de fermentação de um açúcar com uma célula hospedeira recombinante, sendo que a célula hospedeira recombinante produz o material de partida isoprenóide; e (b) comercializar e/ou vender dito biocombustível.

Em outras modalidades, a invenção proporciona um método de comercializar ou distribuir o biocombustível aqui mostrado a negociantes, 25 fornecedores, e/ou usuários de um combustível, cujo método compreende anunciar e/ou oferecer para venda o biocombustível aqui mostrado. Em outras modalidades, o biocombustível aqui mostrado pode ter características comerciais ou físicas aperfeiçoadas em relação ao combustível natural ou à contra-parte biocombustível contendo etanol. Em certas modalidades, a invenção proporciona um método para parceria ou colaboração com ou licenciamento de um refinador de óleo de petróleo estabelecido para misturar o biocombustível aqui mostrado em combustíveis baseados em petróleo tais como uma gasolina, combustível de jato, querosene, combustível diesel ou uma combinação dos mesmos. Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para parceria ou colaboração com ou licenciamento de um refinador de óleo de petróleo estabelecido para processar (por exemplo, hidrogenar, hidrocraquear, craquear, adicionalmente purificar) os biocombustíveis aqui mostrados, modificando-os deste modo em uma tal maneira para conceder propriedades benéficas aos biocombustíveis. O refinador de óleo de petróleo estabelecido pode usar o biocombustível aqui mostrado como uma matéria-prima para modificação química adicional, cujo produto final poderia ser usado como um combustível ou um componente de mistura de uma composição de combustível.

Em outras modalidades, a invenção proporciona um método para parceria ou colaboração com ou licenciamento de um produtor de açúcar a partir de uma fonte renovável (por exemplo, milho, cana-de-açúcar, bagaço, ou material lignocelulósico) para produzir tais fontes de açúcar renováveis 20 para a produção dos biocombustíveis aqui mostrados. Em algumas modalidades, milho e cana-de-açúcar, as fontes de açúcar tradicionais, podem ser usadas. Em outras modalidades, material lignocelulósico barato (resíduo agrícola, forragem de milho, ou colheitas de biomassa tais como switchgrass (Panicum virgatum) e capim dos pampas) pode ser usado como uma fonte de 25 açúcar. Derivado de açúcar tais fonte baratas pode ser alimentado na produção do biocombustível aqui mostrado, de acordo com os métodos da presente invenção.

Em certas modalidades, a invenção proporciona um método para parceria ou colaboração com ou licenciamento de um produtor químico que produz e/ou usa açúcar de uma fonte renovável (por exemplo, milho, cana-de-açúcar, bagaço, ou material lignocelulósico) para utilizar açúcar obtido de um recurso renovável para a produção do biocombustível aqui mostrado.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são intencionados apenas para propósitos ilustrativos e em nenhum modo limitam o escopo da presente invenção.

A prática da presente invenção pode empregar, a não ser que seja indicado de outra maneira, técnicas convencionais da indústria biossintética e semelhantes, que estão dentro da habilidade da arte. Pelo fato de que tais técnicas não são totalmente aqui descritas, pode-se encontrar referência ampla a elas na literatura científica.

Nos seguintes exemplos, têm sido feitos esforços para garantir acurácia com respeito aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, e assim por diante), mas variação e desvio podem ser acomodados, e no caso de existir erro clerical nos números aqui relatados, uma pessoa ordinariamente experiente na técnica à qual esta invenção pertence pode deduzir a quantidade correta em vista da revelação aqui restante. A não ser que seja indicado de outro modo, temperatura é relatada em graus Celsius, e pressão está na ou próxima da pressão atmosférica ao nível do mar. Todos os reagentes, a não ser que seja indicado de outra maneira, foram obtidos comercialmente. Os seguintes exemplos são intencionados apenas para propósitos ilustrativos e em nenhum modo limitam o escopo da presente invenção.

Exemplo 1

Este exemplo descreve métodos para preparar plasmídeos de expressão que codificam enzimas incluindo enzimas da via MEV de Saccharomyces cerevisiae organizados em operons. Plasmídeo de expressão pMevT foi gerado pela inserção do operon MevT no vetor pBAD33. O operon MevT codifica o grupo de enzimas da via MEV que juntas transformam o precursor ubíquo acetil-CoA em (R)- mevalonato, a saber aceto-acetil-CoA tiolase, HMG-CoA sintase, e HMG- CoA redutase. O operon MevT foi gerado por amplificação por PCR de DNA genômico de Escherichia coli a seqüência codificadora do gene atoB (número de acesso no GenBank de NC000913 REGION: 2324131..2325315) (codifica uma aceto-acetil-CoA tiolase), de DNA genômico de Saccharomyees cerevisiae a seqüência codificadora do gene ERG13 (número de acesso no GenBank de X96617, REGION: 220.. 1695) (codifica uma HMG-CoA sintase), e de DNA genômico de Saceharomyces cerevisiae um segmento da região codificadora do gene HMGl (número de acesso no GenBank de M22002, REGION: 1660..3165) (codifica uma HMG-Coa redutase truncada (tHMGR)). O iniciador de PCR a montante para a amplificação do fragmento de gene HMGl incluiu um códon de iniciação artificial. Os fragmentos amplificados foram editorados juntos usando extensões de recobrimento (SOEing), durante cujo processo sítios de ligação de ribossomo foram introduzidos após as seqüências codificadoras atoB e ERGl3. Após a adição de projeções 3' A, o operon MevT foi ligado no vetor de clonagem TA pCR4 (Invitrogen, Carlsbad, CA). O operon MevT foi subseqüentemente ligado no sítio de restrição Xmal PstI de vetor pBAD33 (Guzman et al. (1995) J. Bacteriol. 177(14): 4121-4130). Para por o operon sob o controle do promotor PLac, ° fragmento araC-ΡβΑΌ NsiI-XmaI de pBAD33 foi substituído pelo fragmento NsiI-XmaI de pBBRIMCS, dando plasmídeo de expressão pMevT (veja Patente U.S. Número 7.192.751).

Plasmídeo de expressão pAM36-MevT66 foi gerado pela inserção do operon MeVT66 no vetor pAM36. O vetor pAM36 foi gerado pela inserção de um cassete de oligonucleotídeo contendo sítios de restrição Ascl-Sfil-AsiSI-XhoI-Pael-FsIl-Pmel no vetor pACYC184 (número de acesso no GenBank de X06403), e pela remoção do gene concessor de resistência à tetramicina em pACYC184. O operon MevT66 foi sinteticamente gerado usando SEQ ID NO: 1 como um modelo, que compreende o gene atoB de Escherichia coli (número de acesso no GenBank de NC 000913 REGION:

2324131..2325315), o gene ERGl3 de Saccharomyees cerevisiae (número de acesso no GenBank de X96617, REGION: 220.. 1695), e uma versão truncada do gene HMGl de Saccharomyces cerevisiae (número de acesso no GenBank de M22002, REGION: 1777..3285), todas as três seqüências sendo códon- otimizadas para expressão em Escherichia coli. O operon MevT66 sinteticamente gerado foi flanqueado por um sítio de restrição 5' EcoRl e um sítio de restrição 3' HindIIl, e assim pôde ser clonado em sítios de restrição compatíveis de um vetor de clonagem tal como um vetor de origem pACYC ou pUC padrão. Deste construto, o operon MevT66 foi amplificado por PCR com sítios de restrição SfiI e AsiSI flanqueando, o fragmento de DNA amplificado foi digerido até completitude usando enzimas de restrição SfiI e AsiSI, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 4,2 kb foi extraído do gel usando um kit de purificação de gel (Qiagen, Valencia, CA), e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de restrição SfiI AsiSI do vetor pAM36, dando plasmídeo de expressão pAM36-MevT66.

Plasmídeo de expressão pAM25 foi gerado pela inserção do operon MeVT66 no vetor pAM29. O vetor pAM29 foi criado pela montagem da origem de replicação pl5A e gene concedente de resistência à canamicina de pZS24-MCSl (Lutz e Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25:1203-1210) com um promotor lacUV5 gerado de oligonucleotídeo. O construto de síntese de DNA compreendendo o operon MevT66 (veja definição para pAM36- MevT66 acima) foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição EcoRI e HindIII, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 4,2 kb foi extraído de gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de restrição EcoRl HindlII de pAM29, dando plasmídeo de expressão pAM25.

Plasmídeo de expressão pMevB-Cm foi gerado pela inserção do operon MevB no vetor pBBRIMCS-l. O operon MevB codifica o grupo 5 de enzimas que juntas convertem (R)-mevalonato em IPP, a saber mevalonato cinase, fosfomevalonato cinase, e mevalonato pirofosfato carboxilase. O operon MevB foi gerado por amplificação por PCR de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae a seqüência codificadoras do gene ERG12 (número de acesso no GenBank de X55875, REGION: 580..1911) (codifica uma 10 mevalonato cinase), do gene ERG8 gene (número de acesso no GenBank de Z49939, REGION: 3363..4718) (codifica uma fosfomevalonato cinase), e do gene MVDl (número de acesso no GenBank de X97557, REGION: 544.. 1734) (codifica uma mevalonato pirofosfato carboxilase), e por editoração dos fragmentos de PCR juntos usando extensões de recobrimento (SOEing). Pela 15 escolha das seqüência de iniciador apropriadas, os códons de terminação de ERG 12 e ERG8 foram mutados de TAA para TAG durante amplificação para introduzir sítios de ligação de ribossomo. Após a adição de projeções 3' A, o operon MevB foi ligado no vetor de clonagem TA pCR4 (Invitrogen, Carlsbad, CA). O operon MevB foi excisado por digestão do construto de 20 clonagem até completitude usando enzima de restrição PstI, resolvendo a mistura reacional por eletroforese em gel, extraindo do gel o fragmento de DNA de aproximadamente 4,2 kb, e ligando o fragmento de DNA isolado no sítio de restrição PstI de vetor pBBRIMCS-l (Kovach et al., Gene 166(1): 175-176 (1995)), dando plasmídeo de expressão pMevB-Cm.

Plasmídeo de expressão pMBI foi gerado pela inserção o

operon MBI no vetor pBBRlMCS-3. Em adição às enzimas do operon MevB, o operon MBI também codifica uma isopentenil pirofosfatase isomerase, que catalisa a conversão de IPP em DMAPP. O operon MBI foi gerado por amplificação por PCR de DNA genômico de Escherichia coli a seqüência codificadora do gene idi (número de acesso no GenBank de AP119715) usando iniciadores que continham um sítio de restrição XmaI em suas extremidades 5', digerindo o fragmento de DNA amplificado até completitude usando enzima de restrição XmaI, resolvendo a mistura reacional por eletroforese em gel, extraindo do gel o fragmento de aproximadamente 0,5 kb, e ligando o fragmento de DNA isolado no sítio de restrição XmaI de plasmídeo de expressão pMevB-Cm, posicionando deste modo idi na extremidade 3' do operon MevB. O operon MBI foi subclonado no sítio de restrição SalI SacI de vetor pBBRlMCS-3 (Kovach et al., Gene 166(1): 175- 176 (1995)), dando plasmídeo de expressão pMBI (veja Patente U.S. Número 7.192.751).

Plasmídeo de expressão pMBIS foi gerado pela inserção do gene ispA em pMBI. o gene ispA codifica uma famesil difosfato sintase, que catalisa a condensação de duas moléculas de IPP com uma molécula de DMAPP para preparar famesil pirofosfato (FPP). A seqüência codificadora do gene ispA (número de acesso no GenBank de D00694, REGION: 484.. 1383) foi amplificada por PCR a partir de DNA genômico de Escherichia coli usando um iniciador direto com um sítio de restrição SaeII e um iniciador inverso com um sítio de restrição Saci. O produto de PCR amplificado foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição SacII e Saci, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, e o fragmento de DNA de aproximadamente 0,9 kb foi extraído do gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de restrição SacII SacI de pMBI, posicionando deste modo o gene ispA 3' de idi e o operon MevB, e dando plasmídeo de expressão pMBIS (veja Patente U.S. Número 7.192.751).

Plasmídeo de expressão pMBIS-gpps foi derivado de plasmídeo de expressão pMBIS pela substituição da seqüência codificadora ispA por uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma geranil- difosfato-sintase (“gpps”). Um fragmento de DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma geranil-difosfato-sintase foi gerada sinteticamente usando a seqüência codificadora do gene gpps de Arabidopsis thaliana (número de acesso no GenBank de Yl 73 76, REGION:

52.. 1320), códon-otimizada para expressão em Escherichia coli, como um modelo (SEQ ID NO: 2). A seqüência de nucleotídeos foi flanqueada por um

sítio de restrição líder SaeII e um sítio de restrição terminal Saci, e assim pôde ser clonada nos sítios de restrição compatíveis de um vetor de clonagem tal como um vetor de origem pACYC ou pUC padrão. A seqüência de geranil-difosfato-sintase sinteticamente gerada foi isolada por digestão do 10 construto de síntese de DNA até completitude usando enzimas de restrição SacII e Saci, resolvendo a mistura reacional por eletroforese em gel, extraindo do gel o fragmento de DNA de aproximadamente 1,3 kb, e ligando o fragmento de DNA isolado no sítio de restrição SacII SacI de plasmídeo de expressão pMBIS, dando plasmídeo de expressão pMBIS-gp/w.

Exemplo 2

Este exemplo descreve métodos para preparar vetores de expressão codificadores de enzimas incluindo enzimas da via MEV de Staphylococcus aureus organizados em operons.

Plasmídeo de expressão pAM41 foi derivado de plasmídeo de expressão pAM25 por substituição da seqüência codificadora do gene HMGl, que codifica a Saccharomyces cerevisiae HMG-CoA redutase, pela seqüência codificadora do gene mvaA, que codifica a Staphylococcus aureus HMG-CoA redutase (número de acesso no GenBank de BAOOOO17, REGION:

2688925..2687648). A seqüência codificadora do gene mvaA foi amplificada por PCR a partir de DNA genômico de Staphyloccoccus aureus subsp. aureus

(ATCC 70069) usando iniciadores 4-49 mvaA SpeI (SEQ ID NO: 13) e 4-49 mvaAR XbaI (SEQ ID NO: 14), o fragmento de DNA amplificado foi digerido até completitude usando enzima de restrição SpeI, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, e o fragmento de DNA de aproximadamente 1,3 kb foi extraído do gel. a seqüência codificadora HMGl foi removida de pAM25 por digestão do plasmídeo até completitude usando enzima de restrição HindIII. As projeções terminais do fragmento de DNA linear resultante foram cegadas usando T4 DNA polimerase. O fragmento de 5 DNA foi então parcialmente digerido usando enzima de restrição SpeI, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, e o fragmento de DNA de 4,8 kb foi extraído do gel. O fragmento de DNA isolado foi ligado com o produto de mvaA PCR SpeI-digerido, dando plasmídeo de expressão pAM41.

Plasmídeo de expressão pAM52 foi derivado de plasmídeo de expressão pAM41 por substituição da seqüência codificadora do gene ERGl3, que codifica a Saccharomyces cerevisiae HMG-CoA sintase, pela seqüência codificadora do gene mvaS, que codifica a Staphylococcus aureus HMG-CoA sintase (número de acesso no GenBank de BAOOOO17, REGION:

2689180..2690346). A seqüência codificadora do gene mvaS foi amplificada 15 por PCR a partir de DNA genômico de Staphyloccoccus aureus subsp. aureus (ATCC 70069) usando iniciadores HMGS 5' Sa mvaS-S (SEQ ID NO: 15) e HMGS 3' Sa mvaS-AS (SEQ ID NO: 16), e o fragmento de DNA amplificado foi usado como um iniciador de PCR para substituir a seqüência codificadora do gene HMGl em pAM41 de acordo com o método de Geiser et al. 20 (BioTeehniques 31:88-92 (2001)), dando plasmídeo de expressão pAM52.

Exemplo 3

Este exemplo descreve métodos para preparar plasmídeos de expressão que codificam enzimas incluindo enzimas da via DXP de Eseheriehia coli organizados em operons.

Plasmídeo de expressão pAM408 foi gerado pela inserção

genes codificadores de enzimas da via “top” DXP no vetor pAM29. Enzimas da via “top” DXP incluem l-desóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase (codificada pelo gene dxs de Escherichia coli), 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato redutoisomerase (codificada pelo gene dxr de Escherichia coli), 4-difosfo- citidil-2C-metil-D-eritritol sintase (codificada pelo gene ispD de Escherichia coli), e 4-difosfo-citidil-2C-metil-D-eritritol sintase (codificada pelo gene ispE de Eseheriehia coli), que juntas transformam piruvato e D-gliceraldeído- 3-fosfato em 4-difosfo-citidil-2C-metil-D-eritritol-2-fosfato. Fragmentos de 5 DNA compreendendo seqüências de nucleotídeos que codificam enzimas da via “top” DXP foram geradas por amplificação por PCR das seqüências codificadoras de dxs (número de acesso no GenBank de U00096 REGION:

437539..439401), dxr (número de acesso no GenBank de U00096 REGION:

193521..194717), ispD (número de acesso no GenBank de U00096 REGION: 2869803..2870512), e ispE (número de acesso no GenBank de U00096

REGION 1261249.. 1262100) genes de Escherichia coli cepa DHl (ATCC #33849) com seqüências de Shine Dalgamo ótimas adicionadas e sítios de restrição 5' e 3' usando os iniciadores de PCR mostrados em SEQ ID NOs: 17 até 24. Os produtos de PCR foram resolvidos por eletroforese em gel, 15 extraídos de gel, digeridos até completitude usando enzimas de restrição apropriadas (XhoI e KpnI para o produto de PCR compreendendo o gene dxs; KpnI e ApaI para o produto de PCR compreendendo o gene dxr, ApaI e NdeI para o produto de PCR compreendendo o gene ispD; NdeI e MluI para o produto de PCR compreendendo o gene ispE), e purificados usando o kit de 20 purificação de PCR (Qiagen, Valencia, CA). Quantidades aproximadamente equimolares de cada produto de PCR foram então adicionadas em uma reação de ligação para montar os genes individuais em um operon. Desta reação de ligação, 1 \íL de mistura reacional foi usado para amplificar por PCR dois cassetes de gene separados, a saber os cassetes de gene dxs-dxr e ispD-ispE. 25 O cassete de gene dxs-dxr foi amplificado por PCR usando iniciadores 67-1A- C (SEQ ID NO: 17) e 67-ID-C (SEQ ID NO: 20), e o cassete de gene ispD- ispE foi amplificado por PCR usando iniciadores 67-IE-C (SEQ ID NO: 21) e 67-IH-C (SEQ ID NO: 24). Os produtos de PCR foram resolvidos por eletroforese em gel, e extraídos do gel. O produto de PCR compreendendo o cassete de gene dxs-dxr foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição XhoI e ApaI, e o produto de PCR compreendendo o cassete de gene ispD-ispE foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição ApaI e MluI. Os dois produtos de PCR foram purificados, e os fragmentos de DNA 5 purificados foram ligados no sítio de restrição Sail MluI do vetor pAM29, dando plasmídeo de expressão pAM408 (veja Figura 4A para um mapa de plasmídeo).

Plasmídeo de expressão pAM409 foi gerado pela inserção genes codificadores de enzimas da via “de fundo” DXP no vetor pAM369. 10 Enzimas da via “de fundo” DXP incluem 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclo- difosfato sintase (codificada pelo gene ispF de Escherichia coli), 1 -hidróxi-2- metií-2-(E)-butenil-4-difosfato sintase (codificada pelo gene ispG de Escheriehia coli), e isopentenil/dimetil-alil difosfato sintase (codificada pelo gene ispH de Escherichia coli), que juntas transformam 4-difosfo-citidil-2C- 15 metil-D-eritritol-2-fosfato em IPP e DMAPP. IPP também é convertido em DMAPP até a atividade de isopentil difosfato isomerase (codificada pelo gene idi de Escherichia coli). DMAPP pode ser adicionalmente convertido em FPP até a atividade de uma famesil difosfato sintase (tal como codificada pelo gene ispA de Escherichia coli). Um operon codificador de enzimas da via “de 20 fundo” DXP bem como uma isopentil difosfato isomerase e uma famesil difosfato sintase foi gerado por amplificação por PCR de ispF (número de acesso no GenBank de U00096 REGION: 2869323..2869802), ispG (número de acesso no GenBank de U00096 REGION: 2638708..2639826), ispH (número de acesso no GenBank de U00096 REGION: 26211.21221), idi 25 (número de acesso no GenBank de AFl 19715), e ispA (número de acesso no GenBank de D00694 REGION: 484.. 1383) genes de Escherichia coli cepa DHl (ATCC #33849) com seqüências de Shine Dalgamo ótimas adicionadas e sítios de restrição 5' e 3' usando os iniciadores de PCR mostrados em SEQ ID NOs: 25 até 34. Os produtos de PCR foram resolvidos por eletroforese em gel, extraídos do gel, digeridos com as enzimas de restrição apropriadas {BamHI e ApaI para o produto de PCR compreendendo o gene ispF; KpnI e ApaI para o produto de PCR compreendendo o gene ispG; Sail e KpnI para o produto de PCR compreendendo o gene ispH; SalI e HindIII para o produto de PCR compreendendo o gene idi; HindIII e NcoI para o produto de PCR compreendendo o gene ispA), e purificados. Quantidades aproximadamente equimolares de cada produto de PCR foram então adicionadas em uma reação de ligação para montar os genes individuais em um operon. Desta reação de ligação, 1 μΐ, de mistura reacional foi usado para amplificar por PCR dois cassetes de gene separados, a saber os cassetes de gene ispF-ispG e ispH-idi- gene ispA. O cassete de gene ispF-ispG foi amplificado por PCR usando iniciadores 67-2A-C (SEQ ID NO: 25) e 67-2D-C (SEQ ID NO: 28), e o cassete de gene ispH-idi-gene ispA foi amplificado por PCR usando iniciadores 67-2E-C (SEQ ID NO: 29) e 67-2J-C (SEQ ID NO: 34). Os produtos de PCR foram resolvidos por eletroforese em gel, e extraídos do gel.

O produto de PCR compreendendo o cassete de gene ispF-ispG foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição BamHI e KpnI, e o produto de PCR compreendendo o cassete de gene ispH-idi- ispA foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição KpnI e NcoL Os dois produtos de 20 PCR foram purificados. Vector pAM369 foi criado pela montagem da origem de replicação pl5A de pAM29 e gene de beta-lactamase para resistência à amplicilina de pZE12-luc (Lutz e Bujard (1997) Nuel Aeids Res. 25:1203- 1210) com um promotor IaeUYS oligonucleotídeo-gerado. Os dois produtos de PCR isolados contendo o operon da via “de fundo” DXP foram ligados no 25 sítio de restrição BamHI NeoI do vetor pAM369, dando plasmídeo de expressão pAM409 (veja Figura 4B para um mapa de plasmídeo).

Plasmídeo de expressão pAM424, um derivado de plasmídeo de expressão pAM409 contendo a origem de replicação RK2 de amplo espectro de hospedeiro, foi gerado pela transferência do promotor IaeXJW5 e do operon ispFGH-idi-ispA de pAM409 no vetor pAM257. Vetor pAM257 foi gerado como segue: o locus RK2par foi amplificado por PCR a partir do DNA plasmídeo RK2 (Meyer et al. (1975) Science 190:1226-1228) usando iniciadores 9-156A (SEQ ID NO: 35) e 9-156B (SEQ ID NO: 36), o produto 5 de PCR de 2,6 kb foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição AatlI e XhoI, e o fragmento de DNA foi ligado em um plasmídeo contendo a origem de replicação p 15 e o gene concedente de resistência a cloranfenicol de vetor pZA31-luc (Lutz e Bujard (1997) Nucl Acids Res. 25:1203-1210), dando plasmídeo pAM37-par; pAM37-par foi digerido até a completitude 10 usando enzimas de restrição SacI e HindIII, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, o fragmento de DNA compreendendo o locus RK2 par e o gene de resistência a cloranfenicol foi extraído do gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio SacIHindIII do mini-RK2 replicon pRRIO (Roberts et al (1990) J Bacteriol. 172:6204-6216), dando vetor pAM133; 15 pAM133 foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição BglII e HindIII, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 6,4 kb faltante do gene de resistência à ampicilina e origem conjugativa oriT foi extraído do gel, e o fragmento de DNA isolado foi ligado com um fragmento de DNA sinteticamente gerado 20 compreendendo um sítio de clonagem múltipla que continha sítios de restrição PciI eXhol, dando vetor pAM257. Plasmídeo de expressão pAM409 foi digerido até a completitude usando enzimas de restrição XhoI e PciI, a mistura reacional foi resolvida por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 4,4 kb DNA foi extraído do gel, e o fragmento de DNA 25 isolado foi ligado no sítio de restrição XhoI PciI do vetor pAM257, dando plasmídeo de expressão pAM424 (veja Figura 4C para um mapa de plasmídeo).

Exemplo 4

Este exemplo descreve métodos para preparar vetores para a integração selecionada de ácidos nucleicos codificadores de enzimas incluindo enzimas da via MEV em localizações cromossômicas específicas de Saccharomyces cerevisiae.

DNA genômico foi isolado de Saccharomyces cerevisiae cepas Y002 (CEN.PK2 background; MATa; ura3-52; trp 1-289; leu2- 3,112; his3Al; MAL2-8C; SUC2), Y007 (S288C background MATa trplA63), Y051 (S288C background; MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3A0 P0ALi-//MG/1586'3323 PGAU-upc2-lerg9::PMET3-ERG9::HIS3 P0ALr ERG20 Pgali-//AiGi1586'3323) e EG123 (MATa ura3; trpl; leu2; his4 canl). As cepas foram crescidas durante a noite em meio líquido contendo 1% de extrato de levedo, 2% de peptona-Bacto, e 2% de dextrose (meio YPD). Células foram isoladas de 10 mL de culturas líquidas por centrifugação a 3.100 rpm, lavagem das pelotas celulares em 10 mL de água ultra-pura, e re-centrifugação. DNA genômico foi extraído usando o kit de extração de DNA de levedura Y-DER (Pierce Biotechnologies, Rockford, IL) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. DNA genômico extraído foi recolocado em suspensão em 100 μΕ de Tris-Cl 10 mM, pH 8,5, e leituras de OD26o/28o foram obtidas em um espectrofotômetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) para determinar a pureza e a concentração de DNA genômico.

Amplificação de DNA por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada em um Applied Biosystems 2720 Thermocycler (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA) usando o sistema Phusion High Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes OY, Espoo, Finlândia) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Com a completitude da amplificação por PCR de um fragmento de DNA que era para ser inserido no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), projeções de nucleotídeo A foram criadas pela adição de 1 μί de Qiagen Taq Polimerase (Qiagen, Valencia, CA) na mistura reacional e realização de uma etapa de extensão de PCR a 12°C, de 10 minutos adicionais, seguida pelo esfriamento para 4°C. Com a completitude de uma amplificação por PCR, 8 \\L· de uma solução de glicerol 50% foram adicionados na mistura de reação, e a mistura inteira foi carregada sobre um gel de agarose com 1% de TBE (Tris 0,89 M, 5 Ácido Bórico 0,89 M, EDTA sal de sódio 0,02 M) contendo 0,5 μg/mL de brometo de etídio.

Eletroforese em gel de agarose foi realizada a 120 V, 400 mA por 30 minutos, e Bandas de DNA foram visualizadas em luz ultravioleta. Bandas de DNA foram excisadas do gel com uma lâmina de 10 barbear estéril, e o DNA excisado foi purificado do gel usando o Kit de Recuperação de DNA de Gel Zymoclean (Zymo Research, Orange, CA) de acordo com protocolo sugerido pelo fabricante. O DNA purificado foi eluído em 10 μι de água ultra-pura, e leituras de OD26o/28o foram obtidas em um espectrofotômetro ND-1000 para determinar a pureza e a 15 concentração de DNA.

Ligações foram realizadas usando 100-500 μg de produto de PCR purificado e T4 DNA Ligase de Concentração Alta (New England Biolabs, Ipswich, MA) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Para propagação de plasmídeo, construtos ligados foram transformados em 20 células quimicamente competentes de Escherichia coli DH5a (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Transformantes positivos foram selecionados sobre meios sólidos contendo

1,5% de Ágar Bacto, 1% de Triptona, 0,5% de extrato de levedo, 1% de NaCl, e 50 μg/mL de um antibiótico apropriado. Transformantes isolados foram 25 crescidos por 16 horas em meio líquido LB contendo 50 μg/mL de antibiótico carbenicilina ou canamicina a 37°C, e plasmídeo foi isolado e purificado usando um QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Construtos foram verificados por realização de digestões diagnosticas por enzima de restrição, resolvendo os fragmentos de DNA sobre um gel de agarose, e visualizando as bandas usando luz ultravioleta. Construtos selecionados também foram verificados por seqüenciamento de DNA, que foi feito por Elim Biopharmaceuticals Inc. (Hayward, CA).

Plasmídeo pAM489 foi gerado pela inserção do inserto ERG20-PGAL-tHMGR de vetor pAM471 no vetor pAM466. Vetor pAM471 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA ERG20-PGal- tHMGR, que compreende a matriz de leitura aberta (ORF) de ERG20 (posições de nucleotídeo de ERG20 1 a 1208; A de códon de iniciação ATG é nucleotídeo 1) (ERG20), o locus genômico contendo os promotores divergentes GALl e GALlO (posição de nucleotídeo de GALl -Ia -668) (Pgal)3 e uma ORF truncada de HMGl (posições de nucleotídeo de HMGl 1586 a 3323) (tHMGR), no vetor de clonagem TOPO Zero Blunt II (Invitrogen, Carlsbad, CA). Vetor pAM466 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA xRPr856 a +548, que compreende um segmento do locus TRPl de tipo selvagem de Saccharomyces cerevisiae que se estende da posição de nucleotídeo -856 até a posição 548 e hospeda um sítio de restrição interno não-nativo XmaI entre bases - 226 e -225, no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Fragmentos de DNA ERG20-PGAL-tHMGR e TRPr856 a +548 foram gerados por amplificação por PCR como esboçado em Tabela 1. Para a construção de pAM489,400 ng de pAM471 e 100 ng de pAM466 foram digeridos até completitude usando enzima de restrição XmaI (New England Biolabs, Ipswich, MA), Fragmentos de DNA correspondendo ao inserto ERG20-PGAL_tHMGR e o vetor pAM466 linearizado foram purificados do gel, e 4 equivalentes molares do inserto purificado foram ligados com 1 equivalente molar do vetor linearizado purificado, dando pAM489 (veja Figura 5A para um mapa e SEQ ID NO: 3 para a seqüência de nucleotídeos do inserto ERG20-PGAL-tHMGR). Tabela 1 - Amplificações por PCR realizadas para gerar pAM489 Rodada Modelo Iniciador 1 Iniciador 2 Produto de de PCR PCR 1 100 ng de DNA genômico Y051 61-67-CPK001-G 61-67-CPK002-G j a - (SEQ ID NO: 37) (SEQ ID NO: 38) 226 61-67-CPK003-G 61-67-CPK004-G TRprzj- a (SEQ ID NO: 39) (SEQ ID NO: 40) +548 100 ng de DNA genômico EG123 61-67-CPK025-G 61-67-CPK050-G ERG20 (SEQ ID NO: 61) (SEQ ID NO: 69) 100 ng de DNA genômico Y002 61-67-CPK051-G 61-67-CPK052-G Pgal (SEQ ID NO: 70) (SEQ ID NO: 71) 61-67-CPK053-G 61-67-CPK031-G tHMGR (SEQ ID NO: 72) (SEQ ID NO: 62) 2 100 ng de cada um de produtos de 61-67-CPK001-G 61-67-CPK004-G j-»:>o a PCR purificados TRPf856 a 226 e (SEQ ID NO: 37) (SEQ ID NO: 40) +548 TRPr 3 100 ng de cada um de produtos de 61-67-CPK025-G 61-67-CPK052-G ERG20-Pgal PCR purificados ERG20 e PGal (SEQ ID NO: 61) (SEQ ID NO: 71) 3 100 ng de cada um de produtos de 61-67-CPK025-G 61-67-CPK031-G ERG20- PCR purificados ERG20-Pgal e (SEQ ID NO: 61) (SEQ ID NO: 62) Pgal- tHMGR tHMGR Plasmídeo pAM491 foi gerado pela inserção do inserto

ERG13-PGAL-tHMGR de vetor pAM472 no vetor pAM467. Vetor pAM472 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA ERG13-PGAL-tHMGR, que compreende a ORF de ERG 13 (posições de nucleotídeo de ERG13 1 a 1626) 5 (ERG13), o locus genômico contendo os promotores divergentes GALl e GALlO (posição de nucleotídeo de GALl -1 a -668) (PGal), e uma ORF truncada de HMGl (posição de nucleotídeo de HMGl 1586 a 3323) (tHMGR), no sítio de restrição XmaI de Vetor de clonagem TOPO Zero Blunt

-723 â

II. Vetor pAM467 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA URA3'

70 \ que compreende um segmento do locus de tipo selvagem URA3 de Saccharomyces cerevisiae que se estende da posição de nucleotídeo -723 até a posição -224 e hospeda um sítio de restrição interno não-nativo XmaI entre bases -224 e -223, no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1. Fragmentos de DNA ERG13-PcAL-tHMGR e URA3'723 a701 foram gerados por amplificação 15 por PCR como esboçado em Tabela 2. Para a construção de pAM491, 400 ng de pAM472 e 100 ng de pAM467 foram digeridos até completitude usando enzima de restrição XmaI, fragmentos de DNA correspondendo ao inserto ERG13-PGAi -tHMGR e o vetor pAM467 linearizado foram purificados do gel, e 4 equivalentes molares do inserto purificado foram ligados com 1 equivalente molar do vetor linearizado purificado, dando pAM491 (veja Figura 5B para um mapa e SEQ ID NO: 4 para a seqüência de nucleotídeos

do inserto ERGO-PoAL-tEtMGR).

Tabela 2 - Amplificações por PCR realizadas para gerar pAM491 Rodada Modelo Iniciador 1 Iniciador 2 Produto de de PCR PCR 1 100 ng de DNA genômico Y007 61-67-CPK005-G 61-67-CPK006-G URA3'7JJ a ‘ (SEQ ID NO:41) (SEQ ID NO: 42) 224 61-67-CPK007-G 61-67-CPK008-G URA3-^ a (SEQ ID NO: 43) (SEQ ID NO: 44) 701 100 ng de DNA genômico Y002 61-67-CPK032-G 61-67-CPK054-G ERG 13 (SEQ ID NO: 63) (SEQ ID NO: 73) 61-67-CPK052-G 61-67-CPK055-G Pgal (SEQ ID NO: 71) (SEQ ID NO: 74) 61-67-CPK031-G 61-67-CPK053-G tHMGR (SEQ ID NO: 62) (SEQ ID NO: 72) 2 100 ng de cada um de produtos de 61-67-CPK005-G 61-67-CPK008-G URA3WJ a PCR purificados URA3'723 a"224 e (SEQ ID NO: 41) (SEQ ID NO: 44) 701 URA3'223 a701 100 ng de cada um de produtos de 61-67-CPK032-G 61-67-CPK052-G ERG13- PCR purificados ERGO e Pqal (SEQ DD NO: 63) (SEQ ID NO: 71) Pgal 3 100 ng de cada um de produtos de 61-67-CPK031-G 61-67-CPK032-G ERG13- PCR purificados ERG13-Pgal e (SEQ ID NO: 62) (SEQ ID NO: 63) Pgal- tHMGR tHMGR Plasmídeo pAM493 foi gerado pela inserção do inserto IDIl -

5 Pgm-tHMGR de vetor pAM473 no vetor pAM468. Vetor pAM473 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA IDII-Pgal-íHMGR, que compreende a ORF de IDI 1 (posição de nucleotídeo de IDIl 1 a 1017) (IDI1), o locus genômico contendo os promotores divergentes GALl e GALlO (posição de nucleotídeo de GALl -1 a -668) (Pgal)5 e uma ORF truncada de HMGl 10 (posições de nucleotídeo de HMGl 1586 a 3323) (tHMGR), no vetor de clonagem TOPO Zero Blunt II. Vetor pAM468 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA ADET825 a 653, que corresponde a um segmento do locus de tipo selvagem ADEl de Saccharomyces cerevisiae que se estende da posição de nucleotídeo -225 até a posição 653 e hospeda um sítio de restrição 15 interno não-nativo XmaI entre bases -226 e -225, no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1. Fragmentos de DNA IDIl-PGAL-tHMGR e ADEr'825 a 653 foram gerados por amplificação por PCR como esboçado em Tabela 3. Para a construção de pAM493, 400 ng de pAM473 e 100 ng de pAM468 foram digeridos até completitude usando enzima de restrição XmaI, fragmentos de DNA correspondendo ao inserto IDIl-PGAL-tHMGR e o vetor pAM468 linearizado foram purificados do gel, e 4 equivalentes molares do inserto purificado foram ligados com 1 equivalente molar do vetor linearizado 5 purificado, dando vetor pAM493 (veja Figura 5C para um mapa e SEQ ID

NO: 5 para a seqüência de nucleotídeos do inserto IDII -P0AirtHMGR).

Tabela 3 - Amplificações por PCR realizadas para gerar pAM493 Rodada Modelo Iniciador 1 Iniciador 2 Produto de de PCR PCR 1 100 ng de DNA genômico Y007 61-67-CPK009-G 61-67-CPK010-G ADEfsii “ - (SEQ ID NO: 45) (SEQ ID NO: 46) 226 61-67-CPK011-G 61-67-CPK012-G ADEl-z^ a (SEQ ID NO: 47) (SEQ ID NO: 48) 653 100 ng de DNA genômico Y002 61-67-CPK047-G 61-67-CPK064-G IDIl (SEQ ID NO: 68) (SEQ ID NO: 83) 61-67-CPK052-G 61-67-CPK065-G Pgal (SEQ ID NO: 71) (SEQ ID NO: 84) 61-67-CPK031-G 61-67-CPK053-G tHMGR (SEQ ID NO: 62) (SEQ ID NO: 72) 2 100 ng de cada um de produtos de 61-67-CPK009-G 61-67-CPK012-G ADEIh" a PCR purificados ADEl ’825 a '226 e (SEQ ID NO: 45) (SEQ ID NO: 48) 653 ADEf225 a653 100 ng de cada um de produtos de 61-67-CPK047-G 61-67-CPK052-G IDII-Pgal PCR purificados IDIl e Pqal (SEQ ID NO: 68) (SEQ ID NO: 71) 3 100 ng de cada um de produtos de 61-67-CPK031-G 61-67-CPK047-G IDI1-PGal- PCR purificados IDII -Pgal e (SEQ ID NO: 62) (SEQ ID NO: 68) tHMGR tHMGR Plasmídeo pAM495 foi gerado pela inserção do inserto ERGlO-

Pgal-ERGI2 de pAM474 no vetor pAM469. Vetor pAM474 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA ERG10-PGal-ERG12, que compreende a ORF 10 de ERGlO (posição de nucleotídeo de ERGlO 1 a 1347) (ERG 10), o locus genômico contendo os promotores divergentes GALl e GAL10 (posição de nucleotídeo de GALl -Ia -668) (Pgal)5 e a ORF de ERG 12 (posição de nucleotídeo de ERG12 1 a 1482) (ERG 12), no vetor de clonagem TOPO Zero Blunt II. Vetor pAM469 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA HIS32 a 15 1000 HISMX- HIS3504 a ’1103, que compreende dois segmentos do locus de tipo selvagem HIS de Saccharomyces cerevisiae que se estende da posição de nucleotídeo -32 até a posição -1000 e da posição de nucleotídeo 504 até a posição 1103, um marcador HISMX, e um sítio de restrição não-nativo XmaI entre a seqüência HIS3504 a ’n03 e o marcador HISMX, no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1. Fragmentos de DNA ERG10-PGAl-ERG12 e fflS3-32 a ,00°- HISMX- HISS504a'1103 foram gerados por amplificação por PCR como esboçado em Tabela 4. Para construção de pAM495, 400 ng de pAM474 e 100 ng de pAM469 foram digeridos até completitude usando enzima de restrição XmaI, 5 fragmentos de DNA correspondendo ao inserto ERG10-PGal-ERG12 e o vetor PAM469 linearizado foram purificados do gel, e 4 equivalentes molares do inserto purificado foram ligados com 1 equivalente molar do vetor linearizado purificado, dando vetor pAM495 (veja Figura 5D para um mapa e SEQ ID NO: 6 para a seqüência de nucleotídeos do inserto 10 ERG10-Pgal-ERG12).

Tabela 4 - Reações PCR realizadas para gerar pAM495 Rodada Modelo Iniciador 1 Iniciador 2 Produto de de PCR PCR 1 100 ng de DNA genômico 61-67-CPK013-G 61-67-CPKO 14alt- HIS3 a Y007 (SEQ ID NO:49) G (SEQ ID NO: 50) 61-67-CPK017-G 61-67-CPKO 18-G HIS3 ^- ^ íuj (SEQ ID NO:53) (SEQ ID NO: 54) 61-67-CPK035-G 61-67-CPK056-G ERG 10 (SEQ ID NO:64) (SEQ ID NO: 75) 61-67-CPK057-G 61-67-CPK058-G Pgal (SEQ1DN0:76) (SEQ ID NO: 77) 61-67-CPK040-G 61-67-CPK059-G ERG 12 (SEQ ID NO: 65) (SEQ ID NO: 78) ng de plasmídeo pAM330 61-67-CPKO15 alt-G 61-67-CPKO 16-G HISMX DNA** (SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 52) 2 100 ng de cada um de 61 -67-CPKO15 alt-G 61-67-CPKO 18-G HISMX- produtos de PCR purificados (SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 54) IIIS3 2-i 103 HIS3504a-1103emSMX 100 ng de cada um de 61-67-CPK035-G 61-67-CPK05 8-G ERGIO-Pgal produtos de PCR purificados (SEQ ID NO: 64) (SEQ ID NO: 77) ERG 10 e Pgal 3 IOOng de cada um de 61-67-CPKO 13-G 61-67-CPKO 18-G HIS3'32 produtos de PCR purificados (SEQ ID NO: 49) (SEQ ID NO: 54) HISMX HIS3-32 a -1000 e HISMX_ IrII S 3 ^ ^ ^ HjS3504a-lI03 100 ng de cada um de 61-67-CPK035-G 61-67-CPK040-G ERG IO-Pgal- produtos de PCR purificados (SEQ ID NO: 64) (SEQ ID NO: 65) ERG12 ERGlO-P0ALeERG 12 ** O marcador HISMX em pAM330 originado de pFA6a-HISMX6-PGALl como descrito por van Dijker et al. ((2000) Enzyme Microb. Technol. 26(9-10):706-714) Plasmídeo pAM497 foi gerado pela inserção do inserto ERG8-

Pgal-ERGI9 de pAM475 no vetor pAM470. Vetor pAM475 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA ERG8-PGal-ERG19, que compreende a ORF de ERG8 (posição de nucleotídeo de ERG8 1 a 1512) (ERG8), o locus genômico contendo os promotores divergentes GALl e GALlO (posição de nucleotídeo de GALl -Ia -668) (Pgal), e a ORF de ERG 19 (posição de nucleotídeo de ERG19

1 a 1341) (ERG 19), no vetor de clonagem TOPO Zero Blunt II. Vetor pAM470 foi gerado pela inserção de fragmento de DNA LEU2-100a450-HISMX- LEU21096 5 a 1770, que compreende dois fragmentos do locus de tipo selvagem LEU2 de Saccharomyces cerevisiae que se estende da posição de nucleotídeo -100 até a posição 450 e da posição de nucleotídeo 1096 até a posição 1770, um marcador HISMX, e um sítio de restrição não-nativo XmaI entre a seqüência LEU21096 a 1770 e o marcador HISMX, no vetor de clonagem TOPO TA pCR2.1. Fragmentos 10 de DNA ERG8-Pgal-ERG19 e LEU2'100 a 450-MSMX- LEU21096 a 1770 foram gerados por amplificação por PCR como esboçado em Tabela 5. Para a construção de pAM497, 400 ng de pAM475 e 100 ng de pAM470 foram digeridos até completitude usando enzima de restrição XmaI, fragmentos de DNA correspondendo ao inserto ERG8-PGal-ERG19 e o vetor pAM470 15 linearizado foram purificados, e 4 equivalentes molares do inserto purificado foram ligados com 1 equivalente molar do vetor linearizado purificado, dando vetor pAM497 (veja Figura 5E para um mapa e SEQ ID NO: 7 para a seqüência de nucleotídeos do inserto ERG8-Pgal-ERG19).

Tabela 5 - Reações PCR realizadas para gerar pAM497 Rodada Modelo Iniciador 1 Iniciador 2 Produto de PCR de PCR 1 100 ng de DNA genômico 61-67-CPKO 19- 61-67-CPK020-G LEU2'l00a45U Y007 G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 56) 55) 61-67-CPK023- 61-67-CPK024-G LEU21096 3 1770 G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 60) 59) ng de plasmídeo pAM330 61-67-CPK021- 61-67-CPK022-G HISMX DNA ** G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 58) 57) 100 ng de DNA genômico 61-67-CPK041- 61-67-CPK060-G ERG 8 Y002 G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 79) 66) 61-67-CPK061- 61-67-CPK062-G Pgal G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 81) 80) 61-67-CPK046- 61-67-CPK063-G ERG19 G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 82) 67) 2 100 ng de cada um de produtos 61-67-CPK021- 61-67-CPK024-G HISMX- de PCR purificados LEU21096 a G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 60) LEU21096a1770 1770 e HISMX 57) 100 ng de cada um de produtos 61-67-CPK041- 61-67-CPK062-G ERG8-PGAL de PCR purificados ERG8 e G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 81) Pgal 66) 3 100 ng de produtos de PCR 61-67-CPK019- 6I-67-CPK.024-G LEU2‘I0U 3 4i0- purificados LEU2'100 a 450 e G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 60) HISMX- HISMX- LEU21096 3 1770 55) LEU21096 3 1770 100 ng de cada um de produtos 61-67-CPK041- 61-67-CPK046-G ERG8-Pgal- de PCR purificados ERG8-Pgal G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 67) ERG19 e ERG 19 66) ** O marcador HISMX em pAM330 originado de pFA6a-HISMX6-PGALl como descrito por van Dijker et al. ((2000) Enzyme Microb. Technol. 26(9-10):706-714) Exemplo 5

Este exemplo descreve métodos para preparar plasmídeos de expressão que codificam enzimas que convertem GPP.

Plasmídeos de expressão pTrc99A-GTS e pTrc99A-TS foram gerados pela inserção de uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma γ-terpineno sintase (“GTS”) ou uma terpinoleno sintase (“TS”), respectivamente, no vetor pTrc99A. O inserto da seqüência de nucleotídeos foi gerado sinteticamente, usando como um modelo a seqüência codificadora do gene de γ-terpineno sintase de Citrus limon (número de acesso no GenBank de AF514286 REGION: 30.. 1832) ou a seqüência codificadora do gene de terpinoleno sintase de Ocimum basilicum (número de acesso no GenBank de AY693650) ou de Pseudotsuga menziesii (número de acesso no GenBank de AY906866 REGION: 10.. 1887), todas as seqüências de nucleotídeos estando códon-otimizadas para expressão em Escheriehia coli (SEQ ID NOs:8 até 10, respectivamente). A seqüência codificadora foi flanqueada por um sítio de restrição líder XmaI e um sítio de restrição terminal XbaI. O ácido nucleico sintético foi clonado nos sítios de enzima de restrição compatíveis de um vetor de clonagem tal como um vetor de origem pACYC ou pUC padrão, do qual foi liberado de novo por digestão do construto de síntese de DNA até completitude usando enzimas de restrição XbaI e XmaI, resolvendo a mistura reacional por eletroforese em gel, e extraindo do gel o fragmento de DNA codificador de terpeno sintase de aproximadamente 1,7 a 1,8 kb. O fragmento de DNA isolado foi ligado no sítio de restrição XmaIXbal de vetor pTrc99A (Amman et al., Gene 40:183- 190 (1985)), dando plasmídeo de expressão pTrc99A-GTS ou pTrc99A-TS (veja Figura 6 para mapas de plasmídeo).

5 Plasmídeos de expressão pTrc99A-LMS e pTrc99A-PHS são

geralmente gerados pela inserção de uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma limoneno sintase (“LMS”) ou uma β-felandreno sintase (“PHS”), respectivamente, no vetor pTrc99A. O inserto de seqüência de nucleotídeos é gerado sinteticamente, usando como um modelo por exemplo a 10 seqüência codificadora do gene de limoneno sintase de Abies grandis (número de acesso no GenBank de AF006193 REGION: 73.. 1986) ou a seqüência codificadora de do gene de β-felandreno sintase de Abies grandis (número de acesso no GenBank de AF139205 REGION: 34.. 1926). A seqüência de nucleotídeos codificadora da limoneno sintase é flanqueada por um sítio de 15 restrição líder NeoI e um sítio de restrição terminal PstI, e a seqüência de nucleotídeos codificadora da β-felandreno sintase é flanqueada por um sítio de restrição líder XmaI e um sítio de restrição terminal XbaI. O construto de síntese de DNA de limoneno sintase é digerido até completitude usando enzimas de restrição NeoI e PstI e, o construto de síntese de DNA de β- 20 felandreno é digerido até completitude usando enzimas de restrição Xmal e XbaI. A mistura reacional é resolvida por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 1,9 kb é extraído do gel, e o fragmento de DNA isolado é ligado no sítio de restrição NeoI PstI (para o inserto de limoneno sintase) ou o sítio de restrição Xmal XbaI (para o inserto de β-felandreno) do 25 vetor pTrc99A, dando plasmídeo de expressão pTrc99A-LMS ou pTrc99A- PHS (veja Figura 6 para mapas de plasmídeo).

Plasmídeos de expressão pRS425-leu2d-GTS, pRS425-leu2d- TS, pRS425-leu2d-LMS, e pRS425-leu2d-PHS são geralmente gerados pela inserção de uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma γ-terpineno sintase (“GTS”), uma terpinoleno sintase (“TS”), uma limoneno sintase (“LMS”), ou uma β-felandreno sintase (“PHS”), respectivamente, ligados nos promotores divergentes GALl e GALlO (posição de nucleotídeo de GALl -1 a -668) (Pgal)5 no vetor pRS425-leu2d. Vetor pRS425-leu2d foi gerado por 5 amplificação por PCR do gene leu2 de pAM178 (SEQ ID NO: 12) usando iniciadores PW-91-079-CPK373-G (SEQ ID NO: 89) e PW-79-079-CPK374- G (SEQ ID N0:90), e da estrutura principal de vetor pRS425 (número de acesso no GenBank de U03452) usando iniciadores PW-91-079-CPK376-G (SEQ ID NO: 91) e PW-79-079-CPK375-G (SEQ ID NO: 92), resolvendo as 10 misturas reacionais por eletroforese em gel, extraindo do gel o fragmento de gene leu2 de aproximadamente 1,6 kb e a estrutura principal de vetor pRS425 de aproximadamente 4,6 kb, tratando os fragmentos de DNA com T4 cinase para adicionar grupos fosfato terminais, e ligando os dois fragmentos de DNA. O inserto de seqüência de nucleotídeos é gerado sinteticamente, usando 15 como um modelo por exemplo a seqüência codificadora do gene de γ- terpineno sintase de Citrus limon (número de acesso no GenBank de AF514286 REGION: 30.. 1832), a seqüência codificadora do gene de terpinoleno sintase de Ocimum basilicum (número de acesso no GenBank de AY693650) ou de Pseudotsuga menziesii (número de acesso no GenBank de 20 AY906866 REGION: 10.. 1887), a seqüência codificadora do gene de limoneno sintase de Abies grandis (número de acesso no GenBank de AF006193 REGION: 73.. 1986), ou a seqüência codificadora do gene de β- felandreno sintase de Abies grandis (número de acesso no GenBank de AF139205 REGION: 34.. 1926), cada seqüência codificadora sendo ligada 25 nos promotores divergentes GALl e GAL10 (posição de nucleotídeo de GALl -1 a -668) (Pgal)· A seqüência de nucleotídeo tem terminais cegos, e assim pode ser clonada nos sítios de restrição compatíveis de um vetor de clonagem tal como vetor de origem pACYC ou pUC padrão. A seqüência de PoAL-terpeno sintase sinteticamente gerada é isolada por digestão do construto de síntese de DNA usando enzima de restrição SmaI (digestão parcial para o construto de β-felandreno sintase, digestão completa para todos os outros construtos), a mistura reacional é resolvida por eletroforese em gel, o fragmento de DNA de aproximadamente 2,5 kb a 2,6 kb é extraído do gel, e o 5 fragmento de DNA isolado é ligado no sítio de restrição SmaI de vetor pRS425-leu2d, dando plasmídeo de expressão pRS425-leu2d-GTS, pRS425- leu2d-TS, pRS425-leu2d-LMS, ou pRS425-leu2d-PHS (veja Figura 7 para mapas de plasmídeo).

Exemplo 6

Este exemplo descreve a geração de cepas hospedeiras de

Escherichia coli úteis na invenção.

Como detalhado em Tabela 6, cepas hospedeiras foram ou são criadas por transformação de células parentais de Escherichia coli quimicamente competentes com um ou mais plasmídeos de expressão de Exemplos 1 até 3 e Exemplo 5.

Tabela 6 - Cepas hospedeiras de Escherichia coli Cepa Cepa Parental de Plasmídeos de Seleção de Antibiótico Hospedeira E. coli Expressão 1 DHl pMevT pMBIS-gpp.v 100 μg/mL de carbenicilina pTrc99 A-GTS 34 μg/mL de cloranfenicol 2 pMevT pMBIS-gpps pTrc99A-TS 3 pMevT pMBIS-EPPs pTrc99A-LMS 4 pMevT pMBIS-gp/w PTrc99A-PHS pAM408 pAM424 100 μg/mL de carbenicilina pTrc99A-GTS 50 μg/mL de canamicina 6 pAM408 pAM424 pTrc99A-TS 7 pAM408 pAM424 pTrc99A-LMS 8 pAM408 pAM424 pTrc99A-PHS Os transformantes de célula hospedeira são selecionados sobre

ágar de Luria Bertoni (LB) contendo antibióticos. Colônias individuais são transferidas de ágar LB para tubos de cultura contendo 5 mL de meio líquido LB e antibióticos. As culturas são incubadas a 37°C em um agitador rotativo a 250 rpm até o crescimento alcançar a fase exponencial tardia. As células são adaptadas para meios mínimos pela passagem delas até 4 a 5 rodadas 5 sucessivas de meios M9-MOPS contendo 0,8% de glicose e antibióticos (veja Tabela 7 para a composição do meio M9-MOPS). As células são armazenadas a -80°C em crio-frascos em 1 mL de alíquotas de estoque composto de 400

de glicerol estéril 50% e 600 \iL de cultura líquida.

Tabela 7 - Composição do Meio de Cultura M9-MOPS Componente Quantidade (por L) Na2HPO4 7H20 12,8 g KH2PO4 3g NaCl 0,5 g NH4Cl 1 g MgSO4 2mmol CaCl2 0,1 mmol Tiamina 0,1 f-tg Tampão MOPS pH 7,4 100 mmol (NH3)6Mo70244H20 3,7 μg H3BO4 25 μg CoCl2 7,1 μg CuSO4 2,4 μg MnCl2 16 μg ZnSO4 2,9 μg FeSO4 0,28 mg Exemplo 7

Este exemplo descreve a geração de cepas de Saccharomyces

cerevisiae úteis na invenção.

Saccharomyces cerevisiae cepas CEN.PK2-1C (Y002) (MATa; ura3-52;trpl-289; leu2-3,112; his3Al; MAL2-8C; SUC2) e CEN.PK2-1D (Y003) (MATalpha; ura3-52; trpl-289; leu2-3,112; his3Al;

MAL2-8C; SUC2) (van Dijken et al. (2000) Enzyme Microb. Technol. 26(9- 10):706-714) foram preparadas pela introdução de genes de via MEV induzíveis pela substituição do promotor ERG9 pelo promotor MET3 de Saccharomyces cerevisiae, e a ADEl ORF pelo gene Candida glabrata LEU2 (CgLEU2). Isto foi feito por amplificação por PCR da região KanMX-PMET3 de vetor pAM328 (SEQ ID NO: 11) usando iniciadores 50-56-pwl00-G (SEQ ID NO: 87) e 50-56-pwl01-G (SEQ ID NO: 88), que incluem 45 pares de bases de homologia com o promotor nativo ERG9, transformando 10 μ§ de produto de PCR resultante em células Y002 e Y003 crescendo 5 exponencialmente Y002 e Y003 usando Poli(etileno-glicol) 3350 40% p/p (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), Acetato de Lítio 100 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), e 10 μg de DNA de Esperma de Salmão (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), e incubando as células a 3 0°C por 30 minutos seguido por choque calorífico delas a 42°C por 30 minutos (Schiestl e Gietz. (1989) Curr. 10 Genet. 16, 339-346). Recombinantes positivos foram identificados por sua capacidade para crescerem em meio rico contendo 0,5 μg/mL de Geneticina (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), e colônias selecionadas foram confirmadas por PCR diagnostica. Os clones resultantes receberam as designações Y93 (ΜΑΤ A) e Y94 (MAT alfa). O locus genômico CgLEU2 de 3,5 kb foi então 15 amplificado de DNA genômico de Candida glabrata (ATCC, Manassas, VA) usando iniciadores 61-67-CPK066-G (SEQ ID NO: 85) e 61-67-CPK067-G (SEQ ID NO: 86), que contêm 50 pares de bases de homologia de flanco à ADEl ORF, e 10 μg de produto de PCR resultantes foram transformados em células Y93 e Y94 crescendo exponencialmente, recombinantes positivos 20 foram selecionados para crescimento na ausência de suplementação de leucina, e clones selecionados foram confirmados por PCR diagnostica. Os clones resultantes receberam as designações Yl76 (MAT A) e Yl77 (MAT alfa).

Cepa Yl 88 foi então gerada por digestão de 2 pg de DNA 25 plasmídeo pAM491 e pAM495 até completitude usando enzima de restrição PmeI (New England Biolabs, Beverly, MA), e introduzindo os insertos de DNA purificados nas células Yl 76 crescendo exponencialmente. Recombinantes positivos foram selecionados para crescimento sobre meio faltante de uracila e histidina, e integração no locus genômico correto foi confirmado por PCR diagnostica. Cepa 1189 foi a seguir gerada por digestão de 2 μg de DNA plasmídeo pAM489 e pAM497 até completitude usando enzima de restrição Pmel, e introduzindo os insertos de DNA purificados em células Yl 17 crescendo exponencialmente. Recombinantes positivos foram selecionados para crescimento sobre meio faltante de triptofano e histidina, e integração no locus genômico correto foi confirmado por PCR diagnostica.

Aproximadamente I X IO7 células de cepas Yl88 e Yl89 foram misturadas sobre uma placa de meio YPD por 6 horas na temperatura ambiente para permitir acasalamento. A cultura de célula mista foi colocada em placa em meio faltante de histidina, uracila, e triptofano para selecionar para crescimento de células diplóides. Cepa Y238 foi gerada por transformação de células diplóides usando 2 μg de pAM493 plasmídeo DNA que havia sido digerido até completitude usando enzima de restrição PmeI, e introduzindo o inserto de DNA purificado nas células diplóides crescendo exponencialmente. Recombinantes positivos foram selecionados para crescimento sobre meio faltante de adenina, e integração no locus genômico correto foi confirmado por PCR diagnostica.

Cepa haplóide Y211 (MAT alfa) foi gerada por esporulação de cepa Y238 em meio líquido de Acetato de Potássio 2% e Rafinose 0,02%, isolando aproximadamente 200 tétrades genéticos usando um micromanipulador da série MSM300 da Singer Instrument (Singer Instrument LTD, Somerset, UK), identificando isolados genéticos independentes contendo o complemento apropriado de material genético introduzido por sua capacidade para crescer na ausência de adenina, histidina, uracila, e triptofano, e confirmando a integração de todo o DNA introduzido por PCR diagnostica.

Finalmente, cepas hospedeiras 9 até 12 são geradas pela transformação de cepa Y211 com plasmídeo de expressão pRS425-leu2d- GTS, pRS425-leu2d-TS, pRS425-leu2d-LMS, ou pRS425-leu2d-PHS. Transformantes de célula hospedeira são selecionados sobre meios sintéticos definidos, contendo 2% de glicose e todos aminoácidos exceto leucina (SM- glu). Colônias individuais são transferidas para frascos de cultura contendo 5 5 mL de SM-glu líquido faltante de leucina, e as culturas são incubadas por agitação a 3O0C até crescimento alcançar fase estacionária. As células são armazenadas a -80°C em crio-frascos em 1 mL de alíquotas congeladas compostas de 400 μί. de glicerol estéril 50% e 600 μί de cultura líquida.

Exemplo 8

Este exemplo descreve a produção de γ-terpineno, terpinoleno,

limoneno, e β-felandreno via a via MEV em cepas hospedeiras de Escherichia coli.

Culturas de semente das cepas hospedeiras 1 até 4 são estabelecidas pela adição de uma alíquota de estoque de cada cepa em frascos de 125 mL separados contendo 25 mL de M9-MOPS, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedo, e antibióticos como detalhado em Tabela 6, e pelo crescimento das culturas durante a noite. As culturas de semente são usadas para inocular em uma OD600 inicial de aproximadamente 0,05 frascos de 250 mL separados contendo 40 mL de M9-MOPS, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedo, e antibióticos. Culturas são incubadas a 30°C em um agitador rotativo a 250 rpm até alcançarem uma OD600 de aproximadamente 0,2, em cujo ponto a produção do composto de interesse nas células hospedeiras é induzida pela adição de 40 μΐ^ de IPTG I M no meio de cultura. O composto de interesse é separado do meio de cultura através de extração em solvente- solvente, ou por sedimentação e decantação se o título do composto de interesse for suficientemente grande para saturar o meio e para formar uma segunda fase.

Exemplo 9

Este exemplo descreve a produção de γ-terpineno, terpinoleno, limoneno, e β-felandreno via a via DXP em cepas hospedeiras de Escherichia coli.

Culturas de semente das cepas hospedeiras 5 até 8 são estabelecidas pela adição de uma alíquota de estoque de cada cepa em frascos de 125 mL separados contendo 25 mL de M9-MOPS, 0,8% de glicose, 0,5% de extrato de levedo, e antibióticos como detalhado em Tabela 6, e pelo crescimento das culturas durante a noite. As culturas de semente são usadas para inocular em uma OD600 inicial de aproximadamente 0,05 frascos de 250 mL separados contendo 40 mL de M9-MOPS, 45 μg/mL de Tiamina, micronutrientes, l,00E-5 mol/L FeSO4, MOPS 0,1 M, 2% de glicose, 0,5% de extrato de levedo, e antibióticos. Culturas são incubadas a 30°C em um agitador incubador umidificado a 250 rpm até alcançarem uma OD600 de 0,2 a 0,3, em cujo ponto a produção do composto de interesse nas células hospedeiras é induzida pela adição de 40 \iL· de IPTG I M no meio de cultura. O composto de interesse é separado do meio de cultura através de extração em solvente-solvente, ou por sedimentação e decantação se o título do composto de interesse for suficientemente grande para saturar o meio e para formar uma segunda fase.

Exemplo 10

Este exemplo descreve a produção de γ-terpineno, terpinoleno, limoneno, e β-felandreno em cepas hospedeiras de Saccharomyees cerevisiae.

Culturas de semente de cepas hospedeiras 9 até 12 são estabelecidas pela adição de alíquotas de estoque em frascos de 125 mL separados contendo 25 mL de SM-glu faltante de leucina, e crescimento de cada cultura durante a noite. A cultura de semente é usada para inocular em uma OD600 inicial de aproximadamente 0,05 um frasco de 250 mL com defletor contendo 40 mL de meio sintético definido contendo 0,2% de glicose e 1,8% de galactose, e faltante de leucina. A cultura é incubada a 30°C em um agitador rotativo a 200 rpm. O composto de interesse é separado do meio de cultura através de extração em solvente-solvente, ou por sedimentação e decantação se o título do composto de interesse for suficientemente grande para saturar o meio e para formar uma segunda fase.

Exemplo 11

Este exemplo descreve a hidrogenação de limoneno a primariamente limonano.

Em um vaso de reação, limoneno e catalisador 10% Pd/C [paládio, 10% em peso sobre carbono ativado, Aldrich #205699] são adicionados em carregamento de 6 g/L. O vaso é fechado e purgado com gás nitrogênio, então evacuado sob vácuo. Para iniciar a reação, o vaso é agitado enquanto adiciona-se gás hidrogênio comprimido a 552 kPa (manométrico). A reação suavemente exotérmica prossegue na temperatura ambiente. Conversão fmal é 100%, marcada pelo final do consumo de hidrogênio e verificada por cromatografia a gás com detecção por ionização de chama. A mistura de produto-catalisador é separada via filtração por gravidade através de um gel de sílica 60 A. É esperado que a concentração do produto final seja na maior parte limonano com menos do que 5% de p-cimeno.

Exemplo 12

Este exemplo descreve a hidrogenação de limoneno a principalmente limonano com algum p-cimeno.

No vaso de reação, limoneno e catalisador Pd 10%/C [paládio, 10% em peso sobre carbono ativado, Aldrich #205699] são adicionados em carregamento de 6 g/L. O vaso é fechado, purgado com gás nitrogênio, então evacuado sob vácuo. O vaso é agitado enquanto se aumenta a temperatura para 105°C. Uma carga inicial de gás hidrogênio comprimido é adicionada a 552 kPa (manométrico) e totalizando aproximadamente 0,05 mol de hidrogênio por mol limoneno. Devido ao consumo de hidrogênio, pressão cairá para zero. Após tempo de reação de 12 horas, a temperatura é diminuída para 750C e continuamente adicionado hidrogênio comprimido a 552 kPa (manométrico). Conversão final é 100%, marcada pelo final do consumo de hidrogênio e verificada por cromatografia a gás com detecção por ionização de chama. A mistura de produto-catalisador é separada via filtração por gravidade através de um gel de sílica 60 A. É esperado que a concentração do produto final esteja entre cerca de 80% e cerca de 90% de limonano e entre cerca de 10% e cerca de 20% de p-cimeno.

Exemplo 13

Este exemplo descreve a hidrogenação de limoneno a limonano e p-cimeno.

No vaso de reação, limoneno e catalisador Pd 10%/C [paládio, 10% em peso sobre carbono ativado, Aldrich #205699] são adicionados em carregamento de 6 g/L. O vaso é fechado, purgado com gás nitrogênio, então evacuado sob vácuo. O vaso é agitado enquanto se aumenta a temperatura para 120°C. Uma carga inicial de gás hidrogênio comprimido é adicionada a 552 kPa (manométrico) e totalizando aproximadamente 0,05 mol de hidrogênio por mol limoneno. Devido ao consumo de hidrogênio, pressão cairá para zero. A carga inicial de hidrogênio permite a formação de 4-isopropil-l-metil-ciclo-hex-l-eno que é então prontamente convertido a p-cimeno. Após tempo de reação de 12 horas, diminuir a temperatura para 75°C e continuamente adicionar hidrogênio comprimido a 552 kPa (manométrico). Conversão final é 100%, marcada pelo final do consumo de hidrogênio e verificada por cromatografia a gás com detecção por ionização de chama. A mistura de produto-catalisador é separada via filtração por gravidade através de um gel de sílica 60 A. É esperado que a concentração de produto final esteja entre cerca de 70% e 80% de limonano e entre cerca de 20% e cerca de 30% de p-cimeno.

Exemplo 14

A composição de combustível (chamada de AMJ-300) compreendendo 97,1% de limonano e 1,6% de p-cimeno é misturada com várias quantidades de jato A. Os componentes de AMJ-300 foram identificados por cromatografia gasosa/detector por ionização de chama (GC/FID). AMJ-300 inclui 1,3% de compostos não identificados, dos quais acredita-se que 0,9% é 2,6-dimetil-octano.

Os resultados de várias misturas para sua capacidade para atender ASTM D 1655 são mostrados em Figura 8: Jato A, 100%) AMJ-300, 50% AMJ-300 e 50% Jato A, e 20% AMJ-300 e 80% Jato A.

Exemplo 15

A composição de combustível (chamada de AMJ-310) compreendendo 81,0% de limonano e 17,5% de p-cimeno é misturada com várias quantidades de jato A. Os componentes de AMJ-310 foram identificados por cromatografia gasosa/detector por ionização de chama (GC/FID). AMJ-310 inclui 1,5% de compostos não identificados, dos quais acredita-se que 0,9% é 2,6-dimetil-octano.

Os resultados de várias misturas para sua capacidade para atender ASTM D 1655 são mostrados em Figura 8: Jato A, 100% AMJ-310, 50% AMJ- 310 e 50% Jato A, e 20% AMJ-310 e 80% Jato A. Figura 9 mostra as curvas de destilação para um Jato A e certas misturas de jato A, AMJ-300, e AMJ-310.

As composições de combustível aqui descritas podem ser produzidas em uma maneira efetiva em termos de custo e ambientalmente benéfica. Vantajosamente, os compostos isoprenóides usados nas composições de combustível aqui podem ser produzidos por um ou mais microorganismos. Estes compostos isoprenóides podem assim proporcionar uma fonte de energia renovável para combustíveis de jato ou diesel, em particular as composições de combustível aqui proporcionadas. Ademais, estes compostos isoprenóides podem diminuir dependência de fontes de combustível, componentes de combustível e/ou aditivos de combustível não renováveis. Em certas modalidades, a composição de combustível aqui proporcionada compreende um limonano bioengenheirado.

Embora a invenção tenha sido descrita com respeito a um número limitado de modalidades, as características específicas de uma modalidade não devem ser atribuídas a outras modalidades da invenção. Nenhuma modalidade individual é representativa de todos os aspectos do assunto reivindicado. Em algumas modalidades, as composições ou os métodos podem incluir numerosos compostos ou numerosas etapas aqui não mencionados(as). Em outras modalidades, as composições ou os métodos não incluem, ou estão substancialmente livres de, quaisquer compostos ou etapas não aqui enumerados(as). Existem variações e modificações das modalidades descritas. Deve ser notado que a aplicação das composições de combustível de jato aqui mostradas não é limitada aos motores a jato; podem ser usadas em qualquer equipamento que exige um combustível de jato. Embora haja especificações para a maioria dos combustíveis de jato, nem todas as composições de combustível de

r

jato aqui mostradas necessitam atendem todas as exigências nas especificações. E notado que os métodos para preparar e usar as composições de combustível de jato aqui mostradas são descritos com referência a numerosas etapas. Estas etapas podem ser praticadas em qualquer seqüência. Uma ou mais etapas podem ser omitidas ou combinadas mas ainda alcançam substancialmente os mesmos resultados. As reivindicações anexadas intencionam cobrir todas tais variações e modificações que caem dentro do escopo da invenção.

Todas as publicações e todos os pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados como referências na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado para ser incorporado como referência. Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendimento, será prontamente evidente para aquelas pessoas ordinariamente experientes na técnica à luz dos ensinamentos desta invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas na mesma sem se desviarem do espírito ou do escopo das reivindicações anexadas. I LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

SEQ ID NO: 1

operon MevT66 (5' a 3')

GAATTCAAAGGAGGAAAATAAAATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCTGCGGTC

CGCACGGCGATCGGCAGCTTTAACGGCTCTTTAGCGAGCACCTCTGC AATCGA

TCTGGGTGCGACGGTCATTAAGGCCGCCATTGAACGCGCCAAAATCGACAGC

CAGCACGTTGATGAGGTGATCATGGGCAATGTGTTACAAGCCGGCCTGGGTC

AAAACCCAGCGCGTCAAGCACTGTTAAAATCTGGTCTGGCCGAGACCGTGTG

TGGCTTCACCGTCAATAAGGTTTGCGGCTCTGGCCTGAAGAGCGTGGCCCTGG

CAGCACAAGCGATTCAAGCCGGTCAGGCACAAAGCATCGTTGCGGGTGGCAT

GGAGAACATGTCTCTGGCGCCGTACTTATTAGATGCCAAAGCCCGCAGCGGT

TATCGCCTGGGCGATGGTCAGGTGTACGACGTCATCTTACGCGATGGCTTAAT

GTGCGCGACCCACGGTTACCACATGGGTATTACGGCCGAAAACGTGGCGAAA

GAATACGGCATTACGCGCGAGATGCAGGATGAATTAGCACTGCACTCTCAGC

GC AAAGC AGC AGCCGCG ATCG AGTCTGGTGCGTTTACGGCGGAAATCGTGCC

AGTTAACGTGGTCACGCGCAAGAAGACGTTCGTTTTCAGCCAGGACGAGTTC

CCGAAGGCAAACAGCACCGCGGAGGCCTTAGGTGCCTTACGCCCAGCCTTTG

ACAAAGCGGGCACGGTCACCGCCGGTAATGCGAGCGGCATCAATGATGGTGC

AGCGGCACTGGTCATCATGGAAGAGAGCGCCGCATTAGCAGCGGGTCTGACC

CCATTAGCGCGCATTAAATCTTATGCCAGCGGCGGCGTCCCACCAGCCCTGAT

GGGCATGGGTCCGGTCCCAGCCACGCAAAAAGCCCTGC AATTAGC GGGCCTG

CAACTGGCCGACATTGATCTGATCGAGGCGAACGAGGCGTTTGCAGCGCAGT

TCCTGGCGGTGGGTAAGAATCTGGGCTTCGACAGCGAGAAAGTCAATGTGAA

CGGTGGCGCGATTGCGTTAGGCCATCCGATTGGTGCAAGCGGCGCACGCATC

TTAGTGACGTTACTGCACGCCATGCAGGCACGCGACAAGACCTTAGGCCTGG

CGACCTTATGTATTGGTGGCGGTCAAGGTATCGCCATGGTGATCGAACGCCTG

AACTGAAGATCTAGGAGGAAAGCAAAATGAAACTGAGCACCAAGCTGTGCT

GGTGTGGCATCAAGGGTCGCCTGCGCCCACAAAAGCAGCAACAGCTGCACAA

CACGAACCTGCAAATGACCGAGCTGAAAAAGCAGAAGACGGCCGAGCAAAA

GACCCGCCCGCAGAACGTTGGCATCAAGGGCATCCAGATTTATATCCCGACG

CAGTGTGTCAACCAATCTGAGCTGGAGAAATTCGATGGCGTCAGCCAGGGTA

AGTACACCATCGGCCTGGGCCAGACCAACATGAGCTTCGTGAACGACCGTGA

GGACATCTATTCTATGAGCCTGACGGTGCTGTCTAAGCTGATCAAGAGCTACA ACATCGACACGAATAAGATCGGTCGTCTGGAGGTGGGTACGGAGACGCTGAT

TGACAAGAGCAAAAGCGTGAAGTCTGTCTTAATGCAGCTGTTCGGCGAGAAC

ACGGATGTCGAGGGTATCGACACCCTGAACGCGTGTTACGGCGGCACCAACG

CACTGTTCAATAGCCTGAACTGGATTGAGAGCAACGCCTGGGATGGCCGCGA

TGCGATCGTCGTGTGCGGCGATATCGCCATCTATGACAAGGGTGCGGCACGT

CCGACCGGCGGTGCAGGCACCGTTGCGATGTGGATTGGCCCGGACGCACCAA

TTGTCTTCGATTCTGTCCGCGCGTCTTACATGGAGCACGCCTACGACTTTTACA

AGCCGGACTTCACGAGCGAATACCCGTACGTGGACGGCCACTTCTCTCTGACC

TGCT ATGTG AAGGCGCT GG ACCAGGTTT AT AAGTCTT AT AGC AA AAAGGCG A

TTTCTAAGGGCCTGGTCAGCGACCCGGCAGGCAGCGACGCCCTGAACGTGCT

GAAGTATTTCGACTACAACGTGTTCCATGTCCCGACCTGCAAATTAGTGACCA

AATCTTATGGCCGCCTGTTATATAATGATTTCCGTGCCAACCCGCAGCTGTTC

CCGGAGGTTGACGCCGAGCTGGCGACGCGTGATTACGACGAGAGCCTGACCG

ACAAGAACATCGAGAAGACCTTCGTCAACGTCGCGAAGCCGTTCCACAAAGA

GCGTGTGGCCCAAAGCCTGATCGTCCCGACCAACACGGGCAACATGTATACC

GCGTCTGTCTACGCGGCATTCGCGAGCCTGCTGAATTACGTCGGTTCTGACGA

CCTGCAGGGCAAGCGCGTTGGCCTGTTCAGCTACGGTAGCGGCTTAGCGGCC

AGCCTGTATAGCTGCAAAATTGTCGGCGACGTCCAGCACATCATCAAGGAGC

TGGACATCACCAACAAGCTGGCGAAGCGCATCACCGAGACGCCGAAAGATTA

CGAGGCAGCGATCGAGTTACGCGAGAATGCGCATCTGAAGAAGAACTTCAAG

CCGCAAGGTAGCATCGAGCACCTGCAGAGCGGCGTCTACTACCTGACGAACA

TTGACGACAAGTTCCGCCGTTCTTATGACGTCAAAAAGTAACTAGTAGGAGG

AAAACATCATGGTGCTGACGAACAAAACCGTCATTAGCGGCAGC AA GGTGAA

GTCTCTGAGCAGCGCCCAAAGCTCTAGCAGCGGCCCGTCTAGCAGCAGCGAG

GAGGACGACAGCCGTGACATTGAGTCTCTGGACAAGAAGATCCGCCCGCTGG

AGGAGTTAGAGGCCCTGCTGAGCAGCGGCAACACCAAGCAGCTGAAGAACA

AGGAAGTTGCAGCGCTGGTGATCCACGGTAAGCTGCCACTGTATGCGCTGGA

AAAGAAACTGGGCGATACGACGCGTGCGGTCGCGGTGCGTCGC AAAGC CTTA

AGCATCTT AGCGGAGGCCCCGGTGTT AGCC AGCG ACCGCCTGCCGT ACAAGA

ACTACGACTACGACCGCGTGTTTGGCGCGTGCTGCGAGAATGTCATTGGCTAC

ATGCCGTTACCGGTTGGTGTGATCGGCCCGCTGGTCATTGATGGCACGAGCTA

TCACATTCCAATGGCGACCACGGAAGGTTGCTTAGTCGCCAGCGCCATGCGT

GGCTGTAAGGCGATTAACGCCGGCGGTGGCGCGACGACCGTGTTAACCAAGG

ATGGTATGACGCGCGGTCCGGTCGTCCGCTTCCCAACGCTGAAGCGCAGCGG CGCGTGTAAGATTTGGCTGGATTCTGAGGAGGGCCAAAACGCGATCAAGAAA

GCCTTCAACTCTACGAGCCGTTTCGCGCGTTTACAGCATATCCAGACCTGCCT

GGCCGGCGACCTGCTGTTCATGCGCTTCCGCACCACCACGGGCGATGCGATG

GGCATGAACATGATCAGCAAGGGCGTCGAATATAGCCTGAAACAAATGGTGG

AAGAATATGGCTGGGAGGACATGGAGGTTGTCTCTGTGAGCGGCAACTATTG

CACCGACAAGAAGCCGGCAGCCATTAACTGGATTGAGGGTCGCGGCAAAAGC

GTCGTGGCAGAAGCGACCATCCCAGGCGACGTGGTCCGTAAGGTTCTGAAGA

GCGACGTCAGCGCCCTGGTTGAGTTAAATATCGCGAAAAACCTGGTCGGCAG

CGCGATGGCGGGCAGCGTGGGTGGCTTTAACGCACATGCAGCGAATCTGGTT

ACGGCGGTTTTCTTAGCCTTAGGTCAGGACCCAGCCCAAAATGTCGAGAGCA

GCAACTGCATTACCTTAATGAAAGAGGTTGACGGTGACCTGCGCATCAGCGT

TTCTATGCCGTCTATCGAGGTCGGCACGATCGGCGGCGGCACCGTTTTAGAAC

CGCAAGGTGCGATGCTGGATCTGCTGGGCGTGCGCGGCCCACATGCAACGGC

CCCAGGCACCAATGCCCGCCAACTGGCCCGTATCGTGGCCTGCGCGGTTCTGG

CGGGTGAGCTGAGCCTGTGCGCCGCATTAGCCGCGGGCCATTTAGTTCAATCT

CACATGACCCACAACCGCAAGCCGGCAGAACCAACCAAGCCAAATAACCTGG

ACGCAACCGACATTAACCGTCTGAAGGATGGCAGCGTCACGTGCATTAAAAG

CTGAGCATGCTACTAAGCTT

SEQ ID NO: 2

geranil-difosfato-sintase de Arabidopsis thaliana códon-otimizada para expressão em Escherichia coli e com sítios de restrição NotI e SacI flanqueando (5' a 3')

GCGGCCGCGGAAAAGGAGGCCGGCCGGCATGCTGCTGTCTAATAAACTGCGT

GAAATGGTTCTGGCTGAAGTACCTAAACTGGCCTCCGCAGCAGAATATTTCTT

CAAGCGTGGCGTTCAGGGCAAACAGTTCCGTAGCACCATCCTGCTGCTGATG

GCTACCGCCCTGGACGTGCGTGTCCCGGAAGCCCTGATCGGCGAATCCACCG

ACATCGTGACCTCTGAACTGCGTGTTCGTCAGCGTGGTATCGCGGAAATCACC

GAAATGATCCACGTTGCGTCTCTGCTGCACGACGATGTGCTGGACGATGCAG

ACACCCGTCGTGGTGTTGGTTCCCTGAACGTGGTGATGGGTAACAAAATGAG

CGTGCTGGCAGGCGACTTTCTGCTGTCTCGCGCCTGTGGTGCTCTGG CTGCGC

TGAAGAACACCGAGGTAGTGGCACTGCTGGCGACTGCCGTAGAGCACCTGGT

TACCGGCGAAACGATGGAAATTACTTCTTCCACCGAACAGCGTTACTCCATGG

actactacatgcagaagacttactataaaaccgcgtccctgattagCaactct

TGTAAAGCAGTAGCAGTACTGACTGGCCAAACTGCAGAAGTAGCGGTGCTGG CTTTCGAGTACGGTCGTAACCTGGGTCTGGCTTTCCAGCTGATCGATGACATC

CTGGACTTTACTGGTACCAGC GC AAGCCTGGGTAAAGGTTCCCTGTCTGACAT

TCGTCACGGCGTTATCACCGCTCCGATTCTGTTCGCGATGGAAGAATTCCCGC

AGCTGCGTGAAGTTGTTGACCAGGTTGAAAAAGACCCGCGTAACGTCGATAT

CGCACTGGAATACCTGGGCAAATCCAAAGGTATCCAACGCGCGCGTGAACTG

GCTATGGAGCACGCCAACCTGGCAGCAGCAGCAATTGGCTCTCTGCCGGAAA

CCGACAACGAAGATGTTAAACGCAGCCGTCGTGCACTGATCGACCTGACTCA

TCGTGTAATCACCCGCAACAAATAAGATTGAGTGATGTTCCTGAGCATCCACC

AGAACATTCCGCACTTTATCTGTCGTATTCTGCTGGTGCAATTCGTAAGCCGC

TGATAATAGGAGCTC

SEQ ID NO: 3

inserto ERG20-PGAL-tHMGR de pAM489 (5’ a 3')

GTTTAAACTACTATTAGCTGAATTGCCACTGCTATCGTTGTTAGTGGCGTTAG

TGCTTGCATTCAAAGACATGGAGGGCGTTATTACGCCGGAGCTCCTCGACAG

CAGATCTGATGACTGGTCAATATATTTTTGCATTGAGGCTCTGTTTGGAATTA

TATTTTGAGATGACCCATCTAATGTACTGGTATCACCAGATTTCATGTCGTTTT

TTAAAGCGGCTGCTTGAGTCTTAGCAATAGCGTCACCATCTGGTGAATCCTTT

GAAGG AACCACTGACGAAGGTTTGGACAGTGACGAAGAGGATCTTTCCTGCT

TTGAATTAGTCGCGCTGGGAGCAGATGACGAGTTGGTGGAGCTGGGGGCAGG

ATTGCTGGCCGTCGTGGGTCCTGAATGGGTCCTTGGCTGGTCCATCTCTATTCT

GAAAACGGAAGAGGAGTAGGG AATATTACTGGCTGAAAATAAGTCTTGAATG

AACGTATACGCGTATATTTCTACCAATCTCTCAACACTGAGTAATGGTAGTTA

TAAGAAAGAGACCGAGTTAGGGACAGTTAGAGGCGGTGGAGAT ATTCCTT AT

GGCATGTCTGGCGATGATAAAACTTTTCAAACGGCAGCCCCGATCTAAAAGA

GCTGACACCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAATTCTTTCTATATATG

CACGAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGACGTACAAACTATAAAGTAAATA

TTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTGCTTCTTTTTCAAGAGAATACCAATGA

CGTATGACTAAGTTTAGGATTTAATGCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGA

TTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTTTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTG

TTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATA

AGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGCAACTATTCTTGCTAATTGACGT

GCGTTGGTACCAGG AGCGGT AGC ATGT GGGCCTCTT ACACCTAAT AAGTCC A

ACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCACCACCGATGGTACCTACTTCG ATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAA

TGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCA

AGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTGCGTTAAATCCACCAACAGA

CCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATG

CGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAACATCACCAGGAATAGTAGCT

TCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTT

TTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGC

CATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTCGACACCCTTAGAAATCATAT

TCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCT

CCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTT

AAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACA

GGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATAC

CATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAG

CCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATG

ATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGC

ATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATA

ATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAATACAGGAGCTTCTGCCAAAATTG

AAAGAGC CTTCCTACGTACCGCAACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTC

TCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTT

TGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTAATAATGCTTCTAATTCTTCTAA

AGGACGTATTTTCTTATCCAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACT

AGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTT

TCGATCC AG AAATG ACTGTTTTATTGGTTAAAACTGGTGTAG A AGCCTTTTGT

ACAGGAGCAGTAAAAGACTTCTTGGTGACTTCAGTCTTCACCAATTGGTCTGC

AGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAAT

TTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAAT

gttgaaagtattagttaaagtggttatgcagcttttgcatttatatatctgtta

ATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAA

AAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAG

GTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAAGCTA

GTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGT

TTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTC

GGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATG

AGCAGTTAAGCGT ATT ACT GA AAGTTCC A AAG AG AAGGTTTTTTT AGGCTAA GATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGAT

ATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATT ATTAAACTTCTTTGCGTCCAT

CCA AAAAAAAAGT AAGAATTTTTGAAAATTCAATAT AAATGGCTTCAGAAAA

AGAAATTAGGAGAGAGAGATTCTTGAACGTTTTCCCTAAATTAGTAGAGGAA

TTGAACGCATCGCTTTTGGCTTACGGTATGCCTAAGGAAGCATGTGACTGGTA

TGCCCACTCATTGAACTACAACACTCCAGGCGGTAAGCTAAATAGAGGTTTGT

CCGTTGTGGACACGTATGCTATTCTCTCCAACAAGACCGTTGAACAATTGGGG

CAAGAAGAATACGAAAAGGTTGCCATTCTAGGTTGGTGCATTGAGTTGTTGC

AGGCTTACTTCTTGGTCGCCGATGATATGATGGACAAGTCCATTACCAGAAGA

GGCCAACCATGTTGGTACAAGGTTCCTGAAGTTGGGGAAATTGCCATCAATG

ACGCATTCATGTTAGAGGCTGCTATCTACAAGCTTTTGAAATCTCACTTCAGA

AACGAAAAATACTACATAGATATCACCGAATTGTTCCATGAGGTCACCTTCCA

AACCGAATTGGGCCAATTGATGGACTTAATCACTGCACCTGAAGACAAAGTC

GACTTG AGTAAGTTCTCCCTAAAGAAGCACTCCTTC ATAGTTACTTTC AAGAC

TGCTTACTATTCTTTCTACTTGCCTGTCGCATTGGCCATGTACGTTGCCGGTAT

CACGGATGAAAAGGATTTGAAACAAGCCAGAGATGTCTTGATTCCATTGGGT

GAATACTTCCAAATTCAAGATGACTACTTAGACTGCTTCGGTACCCCAGAACA

GATCGGTAAGATCGGTACAGATATCCAAGATAACAAATGTTCTTGGGTAATC

AACAAGGCATTGGAACTTGCTTCCGCAGAACAAAGAAAGACTTTAGACGAAA

ATTACGGTAAGAAGGACTCAGTCGCAGAAGCCAAATGCAAAAAGATTTTCAA

TGACTTGAAAATTGAACAGCTATACCACGAATATGAAGAGTCTATTGCCAAG

GATTTGAAGGCCAAAATTTCTCAGGTCGATGAGTCTCGTGGCTTCAAAGCTGA

T GTCTT AACTGCGTTCTTGA AC AA AGTTT AC AAGAG AAGC A AAT AGAACT AA

CGCT AATCGAT AA A ACATT AGATTTCAA ACTAGATAAGGACC ATGTATAAGA

ACTATATACTTCC AATATAATATAGTATAAGCTTTAAGATAGTATCTCTCGAT

CTACCGTTCCACGTGACTAGTCCAAGGATTTnTTTAACCCGGGATATATGTG

TACTTTGCAGTTATGACGCCAGATGGCAGTAGTGGAAGATATTCTTTATTGAA

AAATAGCTTGTCACCTTACGTACAATCTTGATCCGGAGCTTTTCTTTTTTTGCC

GATTAAGAATTCGGTCGAAAAAAGAAAAGGAGAGGGCCAAGAGGGAGGGCA

TTGGTGACTATTGAGCACGTGAGTATACGTGATTAAGCACACAAAGGCAGCT

TGGAGTATGTCTGTTATTAATTTCACAGGTAGTTCTGGTCCATTGGTGAAAGT

TTGCGGCTTGCAGAGCACAGAGGCCGCAGAATGTGCTCTAGATTCCGATGCT

GACTTGCTGGGTATTATATGTGTGCCCAATAGAAAGAGAACAATTGACCCGG

TTATTGCAAGGAAAATTTCAAGTCTTGTAAAAGCATATAAAAATAGTTCAGG CACTCCGAAATACTTGGTTGGCGTGTTTCGTAATCAACCTAAGGAGGATGTTT

TGGCTCTGGTCAATGATTACGGCATTGATATCGTCCAACTGCATGGAGATGAG

TCGTGGCAAGAATACCAAGAGTTCCTCGGTTTGCCAGTTATTAAAAGACTCGT

ATTTCC AAAAGACTGCAACATACTACTCAGTGCAGCTTCACAGAAACCTCATT

CGTTTATTCCCTTGTTTGATTCAGAAGCAGGTGGGACAGGTGAACTTTTGGAT

TGGAACTCGATTTCTGACTGGGTTGGAAGGCAAGAGAGCCCCGAAAGCTTAC

ATTTTATGTTAGCTGGTGGACTGACGCCGTTTAAAC

SEQ ID NO: 4

inserto ERG13-PGAL-tHMGR de pAM491 (5' a 3')

GTTTAAACTTGCTAAATTCGAGTGAAACACAGGAAGACCAGAAAATCCTCAT

TTCATCCATATTAACAATAATTTCAAATGTTTATTTGCATTATTTGAAA CTAGG

GAAGACAAGCAACGAAACGTTTTTGAAAATTTTGAGTATTTTCAATAAATTTG

TAGAGGACTCAGATATTGAAAAAAAGCTACAGCAATTAATACTTGATAAGAA

GAGTATTGAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTCATGGATCTGCACATGAACAA

ACACCAGAGTCAAACGACGTTGAAATTGAGGCTACTGCGCCAATTGATGACA

ATACAGACGATGATAACAAACCGAAGTTATCTGATGTAGAAAAGGATTAAAG

ATGCTAAG AGATAGTGATGAT ATTTC ATAAATAATGT AATTCT ATATATGTT A

ATTACCTTTTTTGCGAGGCATATTTATGGTGAAGGATAAGTTTTGACCATCAA

AGAAGGTTAATGTGGCTGTGGTTTCAGGGTCCATACCCGGGAGTTATGACAA

TTAC AAC AAC AGAATTCTTTCT AT ATATGCACGAACTTGTAAT AT GGAAGAAA

TTATGACGTACAAACTATAAAGTAAATATTTTACGTAACACATGGTGCTGTTG

TGCTTCTTTTTCAAGAGAATACCAATGACGTATGACTAAGTTTAGGATTTAAT

GCAGGTGACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGT

TAGGTnTGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCA

AATGGCCGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGC

ACAGGC AACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCAT

GTGGGCCTCTTACACCTAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACA

GTACCACCACCGATGGTACCTACTTCGATGGATGGCATGGATACGG AAATTCT

CAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATT

TTGTGCAGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTG

CATGTGCGTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATT

CTTAGCAATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTC

TGACAACATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCT TCGATCCAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAAC

GGAGACAACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATG

AGTATTCGACACCCTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTT

GTTCTAAATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTG

CAGACGTGCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTC

CCTCTTCTGAGTCTAACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGG

AAACGGACTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGC

ACCACCGCCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAA

CAACCCTCTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAA

GGGGCCTATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAA

CAAGCGCCAAATACGCGGTCGTAGTCATAATTTTTATATGGTAAACGATCAG

AT GCT AAT AC AGG AGCTTCT GCC AAAATTG AAAGAGCCTTCCT ACGTACCGC

AACCGCTCTCGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACT

TACCGTGAATAACCAAGGCAGCGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTC

CACT ACTTAAT AATGCTTCT aattcttct AAAGGACGTATTTTCTTATCCAAGC

TTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAG

CTCGATTGCGCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTT

ATTGGTTAAAACTGGTGTAGAAGCCTTTTGTACAGGAGCAGTAAAAGACTTCT

TGGTGACTTCAGTCTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTT

GACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACA

TTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTG

GTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTC

GCTGATT AATT ACCCCAG AAAT AAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATT ATCCT

ATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGC

CAATTTTTCCTCTTCATAACCATAAAA GCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTC

GGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAG

ACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGC

GGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAA

CACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATG TAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTT TGAAAATTCAATATAAATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTTGGTGTGGTATTA AAGGAAGACTTAGGCCGC AAAAGC AACAACAATTACACAATACAAACTTGCA AATGACT GAACTA AAAAAAC AAAAG AC CGCT GAAC AAAAAACC AGACCTCA AAATGTCGGTATTAAAGGTATCCAAATTTACATCCCAACTCAATGTGTCAACC

AATCTGAGCTAGAGAAATTTGATGGCGTTTCTCAAGGTAAATACACAATTGGT

CTGGGCCAAACCAACATGTCTTTTGTCAATGACAGAGAAGATATCTACTCGAT

GTCCCTAACTGTTTTGTCTAAGTTGATCAAGAGTTACAACATCGACACCAACA

AAATTGGTAGATTAGAAGTCGGTACTGAAACTCTGATTGACAAGTCCAAGTC

TGTCAAGTCTGTCTTGATGCAATTGTTTGGTGAAAACACTGACGTCGAAGGTA

TTGACACGCTTAATGCCTGTTACGGTGGTACCAACGCGTTGTTCAACTCTTTG

AACTGGATTGAATCTAACGCATGGGATGGTAGAGACGCCATTGTAGTTTGCG

GTGATATTGCCATCTACGATAAGGGTGCCGCAAGACCAACCGGTGGTGCCGG

TACTGTTGCTATGTGGATCGGTCCTGATGCTCCAATTGTATTTGACTCTGTAAG

AGCTTCTTACATGGAACACGCCTACGATTTTTACAAGCCAGATTTCACCAGCG

AATATCCTTACGTCGATGGTCATTTTTCATTAACTTGTTACGTCAAGGCTCTTG

ATCAAGTTTACAAGAGTTATTCCAAGAAGGCTATTTCTAAAGGGTTGGTTAGC

GATCCCGCTGGTTCGGATGCTTTGAACGTTTTGAAATATTTCGACTACAACGT

TTTCCATGTTCCAACCTGTAAATTGGTCACAAAATCATACGGTAGATTACTAT

ATAACGATTTCAGAGCCAATCCTCAATTGTTCCCAGAAGTTGACGCCGAATTA

GCTACTCGCGATTATGACGAATCTTTAACCGATAAGAACATTGAAAAAACTTT

TGTTAATGTTGCTAAGCCATTCCACAAAGAGAGAGTTGCCCAATCTTTGATTG

TTCCAACAAACACAGGTAACATGTACACCGCATCTGTTTATGCCGCCTTTGCA

TCTCTATTAAACTATGTTGGATCTGACGACTTACAAGGCAAGCGTGTTGGTTT

ATTTTCTTACGGTTCCGGTTTAGCTGCATCTCTATATTCTTGCAAAATTGTTGG

TGACGTCCAACATATTATCAAGGAATTAGATATTACTAACAAATTAGCCAAG

AGAATCACCGAAACTCCAAAGGATTACGAAGCTGCCATCGAATTGAGAGAAA

ATGCCCATTTGAAGAAGAACTTCAAACCTCAAGGTTCCATTGAGCATTTGCAA

AGTGGTGTTTACTACTTGACCAACATCGATGACAAATTTAGAAGATCTTACGA

TGTTAAAAAATAATCTTCCCCCATCGATTGCATCTTGCTGAACCCCCTTCATA

AATGCTTTATTTTTTTGGCAGCCTGCTTTTTTTAGCTCTCATTTAATAGAGTAG

TTTTTTAATCTATATACTAGGAAAACTCTTTATTTAATAACAATGATATATATA

TACCCGGGAAGCTTTTCAATTCATCTTTTTTTTTTTTGTTCTTTTTTTTGATTCC

GGTTTCTrTGAAATTTTTTTGATTCGGTAATCTCCGAGCAGAAGGAAGAACGA

AGGAAGGAGCACAGACTTAGATTGGTATATATACGCATATGTGGTGTTGAAG

AAACATGAAATTGCCCAGTATTCTTAACCCAACTGCACAGAACAAAAACCTG

CAGGAAACGAAGATAAATCATGTCGAAAGCTACATATAAGGAACGTGCTGCT

ACTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCCAAGCTATTTAATATCATGCACGAAAAGCA AACAAACTTGTGT GCTTCATTGG ATGTTCGT ACC ACC AAGGAATT ACTGGAGT

TAGTTGAAGCATTAGGTCCCAAAATTTGTTTACTAAAAACACATGTGGATATC

TTGACTGATTTTTCCATGGAGGGCACAGTTAAGCCGCTAAAGGCATTATCCGC

CAAGTACAATTTTTTACTCTTCGAAGACAGAAAATTTGCTGACATTGGTAATA

CAGTCAAATTGCAGTACTCTGCGGGTGTATACAGAATAGCAGAATGGGCAGA

CATTACGAATGCACACGGTGTGGTGGGCCCAGGTATTGTTAGCGGTTTGAAG

CAGGCGGCGGAAGAAGTAACAAAGGAACCTAGAGGCCTTTTGATGTTAGCAG

AATTGTCATGCAAGGGCTCCCTAGCTACTGGAGAATATACTAAGGGTACTGTT

GACATTGCGAAGAGCGACAAAGATTTTGTTATCGGCTTTATTGCTCAAAGAG

ACATGGGTGGAAGAGATGAAGGTTACGATTGGTTGATTATGACACCCGGTGT

GGGTTT AGATGACAAGGGAGACGCATTGGGTCAACAGT ATAGAACCGTGGAT

GATGTGGTCTCTACAGGATCTGACATTATTATTGTTGGGTTTAAAC

SEQ ID NO: 5

inserto IDIl-PGAL-tHMGR de pAM493 (5' a 3')

GTTTAAACT ACTC AGT ATATT A AGTTTCGAATTGAAGGGCG A ACTCTT ATTCG

AAGTCGGAGTCACCACAACACTTCCGCCCATACTCTCCGAATCCTCGTTTCCT

AAAGTAAGTTTACTTCCACTTGTAGGCCTATTATTAATGATATCTGAATAATC

CTCTATTAGGGTTGGATCATTCAGTAGCGCGTGCGATTGAAAGGAGTCCATGC

CCGACGTCGACGTGATTAGCGAAGGCGCGTAACCATTGTCATGTCTAGCAGC

TATAGAACTAACCTCCTTGACACCACTTGCGGAAGTCTCATCAACATGCTCTT

CCTTATTACTCATTCTCTTACCAAGCAGAGAATGTTATCTAAAAACTACGTGT

ATTTCACCTCTTTCTCGACTTGAACACGTCCAACTCCTTAAGTACTACCACAG

CCAGGAAAGAATGGATCCAGTTCTACACGATAGCAAAGCAGAAAACACAAC

CAGCGTACCCCTGTAGAAGCTTCTTTGTTTACAGCACTTGATCCATGTAGCCA

TACTCGAAATTTCAACTCATCTGAAACTTTTCCTGAAGGTTGAAAAAGAATGC

CATAAGGGTCACCCGAAGCTTATTCACGCCCGGGAGTTATGACAATTACAAC

AACAGAATTCTTTCTATATATGCACGAACTTGTAATATGGAAGAAATTATGAC

GTACAAACTATAAAGTAAATATTTTACGTAACACATGGTGCTGTTGTGCTTCT

TTTTCAAGAGAATACCAATGACGTATGACTAAGTTTAGGATTTAATGCAGGTG

ACGGACCCATCTTTCAAACGATTTATATCAGTGGCGTCCAAATTGTTAGGTTT

TGTTGGTTCAGCAGGTTTCCTGTTGTGGGTCATATGACTTTGAACCAAATGGC

CGGCTGCTAGGGCAGCACATAAGGATAATTCACCTGCCAAGACGGCACAGGC

AACTATTCTTGCTAATTGACGTGCGTTGGTACCAGGAGCGGTAGCATGTGGGC CTCTTACACCTAATAAGTCCAACATGGCACCTTGTGGTTCTAGAACAGTACCA

CCACCGATGGT ACCT ACTTCGATGGATGGCATGGATACGGAAATTCTCAAATC

ACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGC

AGGATCTTGTCCTAATGCCAAGAAAACAGCTGTCACTAAATTAGCTGCATGTG

CGTTAAATCCACCAACAGACCCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTCTTAGC

AATGTTCAACTCAACCAATGCGGAAACATCACTTTTTAACACTTTTCTGACAA

CATCACCAGGAATAGTAGCTTCTGCGACGACACTCTTACCACGACCTTCGATC

CAGTTGATGGCAGCTGGTTTTTTGTCGGTACAGTAGTTACCAGAAACGGAGAC

AACCTCCATATCTTCCCAGCCATACTCTTCTACCATTTGCTTTAATGAGTATTC

GACACCCTTAGAAATCATATTCATACCCATTGCGTCACCAGTAGTTGTTCTAA

ATCTCATGAAGAGTAAATCTCCTGCTAGACAAGTTTGAATATGTTGCAGACGT

GCAAATCTTGATGTAGAGTTAAAAGCTTTTTTAATTGCGTTTTGTCCCTCTTCT

GAGTCT AACCATATCTTACAGGCACCAGATCTTTTCAAAGTTGGGAAACGGA

CTACTGGGCCTCTTGTCATACCATCCTTAGTTAAAACAGTTGTTGCACCACCG

CCAGCATTGATTGCCTTACAGCCACGCATGGCAGAAGCTACCAAACAACCCT

CTGTAGTTGCCATTGGTATATGATAAGATGTACCATCGATAACCAAGGGGCCT

ATAACACCAACGGGCAAAGGCATGTAACCTATAACATTTTCACAACAAGCGC

CAAAT ACGCGGTCGT AGTCAT AATTTTTATATGGTAAACGATCAGATGCTAAT

ACAGGAGCTTCTGCCAAAATTGAAAGAGCCTTCCTACGTACCGC AACCGCTCT

CGTAGTATCACCTAATTTTTTCTCCAAAGCGTACAAAGGTAACTTACCGTGAA

TAACCAAGGCAGCGACCTCTTTGTTCTTCAATTGTTTTGTATTTCCACTACTTA

AT AATGCTTCT AATTCTTCTAAAGG ACGTATTTTCTTATCC AAGCTTTC AATAT

CGCGGG AATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGC

GCAGATGATAAACTTTTGACTTTCGATCCAGAAATGACTGTTTTATTGGTTAA

AACTGGTGTAGAAGCCTTTTGTACAGGAGCAGTAAAAGACTTCTTGGTGACTT

CAGTTTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAA

GTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAA

GAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTÀTGCAG

CTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAA

TTACCCCAGAAATAAGGCTAAAA AACT AATCGCATT ATT ATCCTATGGTTGTT

AATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCC

TCTTC ATAACCAT AAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGC AGTG

CGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACG

CACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAA TCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAA

GAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATA

TAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGAT

T ATTAAACTTCTTrGCGTCC ATCC AAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTC

AATATAAATGACTGCCGACAACAATAGTATGCCCCATGGTGCAGTATCTAGTT

ACGCCAAATTAGTGCAAAACCAAACACCTGAAGACATTTTGGAAGAGTTTCC

TGAAATTATTCCATTACAACAAAGACCTAATACCCGATCTAGTGAGACGTCA

AATGACGAAAGCGGAGAAACATGTTTTTCTGGTCATGATGAGGAGCAAATTA

AGTrAATGAATGAAAATTGTATTGTTTTGGATTGGGACGATAATGCTATTGGT

GCCGGTACCAAGAAAGTTTGTCATTTAATGGAAAATATTGAAAAGGGTTTAC

TACATCGTGCATTCTCCGTCTTTATTTTCAATGAACAAGGTGAATTACTTTTAC

AACAAAGAGCCACTGAAAAAATAACTTTCCCTGATCTTTGGACTAACACATG

CTGCTCTCATCCACTATGTATTGATGACGAATTAGGTTTGAAGGGTAAGCTAG

ACGATAAGATTAAGGGCGCTATTACTGCGGCGGTGAGAAAACTAGATCATGA

ATTAGGTATTCCAGAAGATGAAACTAAGACAAGGGGTAAGTTTCACTTTTTA

AACAGAATCCATTACATGGCACCAAGCAATGAACCATGGGGTGAACATGAAA

TTGATTACATCCTATTTTATAAGATCAACGCTAAAGAAAACTTGACTGTCAAC

CCAAACGTCAATGAAGTTAGAGACTTCAAATGGGTTTCACCAAATGATTTGA

AAACTATGTTTGCTG ACCC AAGTTACAAGTTT ACGCCTT GGTTT AAGATTATT

TGCGAGAATTACTTATTCAACTGGTGGGAGCAATTAGATGACCTTTCTGAAGT

GGAAAATGACAGGCAAATTCATAGAATGCTATAACAACGCGTCAATAATATA

GGCTACATAAAAATCATAATAACTTTGTTATCATAGCAAAATGTGATATAAA

ACGTTTCATTTCACCTGAAAAATAGTAAAAATAGGCGACAAAAATCCTTAGT

AATATGTAAACTTTATTTTCTTTATTTACCCGGGAGTCAGTCTGACTCTTGCGA

GAGATGAGGATGTAATAATACTAATCTCGAAGATGCCATCTAATACATATAG

ACATACATATATATATATATACATTCTATATATTCTTACCCAGATTCTTTGAGG

TAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCAGTTGGTACTATTAAGAACAATCGAAT

CATAAGCATT GCTTAC AAAG A AT ACACAT AC GAAAT ATTAACGATAATGT CA

ATTACGAAGACTGAACTGGACGGTATATTGCCATTGGTGGCCAGAGGTAAAG

TTAGAGACATATATGAGGTAGACGCTGGTACGTTGCTGTTTGTTGCTACGGAT

CGTATCTCTGCATATGACGTTATTATGGAAAACAGCATTCCTGAAAAGGGGAT

CCTATTGACCAAACTGTCAGAGTTCTGGTTCAAGTTCCTGTCCAACGATGTTC

GTAATCATTTGGTCGACATCGCCCCAGGTAAGACTATTTTCGATTATCTACCT

GCAAAATTGAGCGAACCAAAGTACAAAACGCAACTAGAAGACCGCTCTCTAT TGGTTCACAAACATAAACTAATTCCATTGGAAGTAATTGTCAGAGGCTACATC

ACCGGATCTGCTTGGAAAGAGTACGTAAAAACAGGTACTGTGCATGGTTTGA

AACAACCTCAAGGACTTAAAGAATCTCAAGAGTTCCCAGAACCAATCTTCAC

CCCATCGACCAAGGCTGAACAAGGTGAACATGACGAAAACATCTCTCCTGCC

CAGGCCGCTGAGCTGGTGGGTGAAGATTTGTCACGTAGAGTGGCAGAACTGG

CTGTAAAACTGTACTCCAAGTGCAAAGATTATGCTAAGGAGAAGGGCATCAT

CATCGCAGACACTAAATTGTTTAAAC

SEQ ID NO: 6

inserto ERG10-PGAl-ERG12 de pAM495 (5' a 3')

GTTTAAACTATTGTGAGGGTCAGTTATTTCATCCAGATAT AACCCGAGAGG AA

ACTTCTTAGCGTCTGTTTTCGTACCATAAGGCAGTTCATGAGGTATATTTTCGT

TATTGAAGCCCAGCTCGTGAATGCTTAATGCTGCTGAACTGGTGTCCATGTCG

CCTAGGTACGCAATCTCCACAGGCTGCAAAGGTTTTGTCTCAAGAGCAATGTT

ATTGTGCACCCCGTAATTGGTCAACAAGTTTAATCTGTGCTTGTCCACCAGCT

CT GTCGTAACCTTC AGTTC ATCG ACT ATC TG AAG AAATTTACT AGGAATAGT G

CCATGGTACAGCAACCGAGAATGGCAATTTCTACTCGGGTTCAGCAACGCTG

C AT A A ACGCTGTTGGT GCCGTAGACATATTCG AAGAT AGGATTAT CATT CATA

AGTTTCAGAGCAATGTCCTTATTCTGGAACTTGGATTTATGGCTCTTTTGGTTT

AATTTCGCCTGATTCTTGATCTCCTTTAGCTTCTCGACGTGGGCCTTTTTCTTG

CCATATGGATCCGCTGCACGGTCCTGTTCCCTAGCATGTACGTGAGCGTATTT

CCTTTTAAACCACGACGCTTTGTCTTCATTCAACGTTTCCCATTGTTTTTTTCTA

CTATTGCTTTGCTGTGGGAAAAACTTATCGAAAGATGACGACTTTTTCTTAAT

TCTCGTTTTAAGAGCTTGGTGAGCGCTAGGAGTCACTGCCAGGTATCGTTTGA

ACACGGCATTAGTCAGGGAAGTCATAACACAGTCCTTTCCCGCAATTTTCTTT

TTCTATTACTCTTGGCCTCCTCTAGTACACTCTATATTTTTTTATGCCTCGGTA

GATTGGCATT ATCACATAATGAATT ATAC ATTAT AT AAAGTAATGTGATTTCT

TCGAAGAATATACTAAAGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCC

AGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCT

CAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTA

TAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTA

CGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCG

TTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTT GCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAG

TTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGCAGAACCAGCCCAAAAAA

AGCAAAAACAAACTGTTCAGGAGCGCAAGGCGTTTATCTCCCGTATCACTAA

TGAAACTAAAATTCAAATCGCTATTTCGCTGAATGGTGGTTATATTCAAATAA

AAGATTCGATTCTTCCTGCAAAGAAGGATGACGATGTAGCTTCCCAAGCTACT

C AGTCAC AGGTC ATCG ATATTCAC AC AGGTGTTGGCTTTTTGG ATC ATATGAT

CCATGCGTTGGCAAAACACTCTGGTTGGTCTCTTATTGTTGAATGTATTGGTG

ACCTGCACATTGACGATCACCATACTACCGAAGATTGCGGTATCGCATTAGG

GCAAGCGTTCAAAGAAGCAATGGGTGCTGTCCGTGGTGTAAAAAGATTCGGT

ACTGGGTTCGCACCATTGGATGAGGCGCTATCACGTGCCGTAGTCGATTTATC

TAGTAGACCATTTGCT GT AATCGACCTTGGATTGAAGAGAGAGATGATT GGT

GATTTATCCACTGAAATGATTCCACACTTTTTGGAAAGTTTCGCGGAGGCGGC

CAGAATTACTTTGCATGTTGATTGTCTGAGAGGTTTCAACGATCACCACAGAA

GTGAGAGTGCGTTCAAGGCTTTGGCTGTTGCCATAAGAGAAGCTATTTCTAGC

AATGGCACCAATGACGTTCCCTCAACCAAAGGTGTTTTGATGTGAAGTACTGA

CAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATAT

GACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCG

TCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAACGC

CGCCATCCACCCGGGATGGTCTGCTTAAATTTCATTCTGTCTTCGAAA GCTGA

ATTGATACTACGA AAAATTTTTTTTT GTTTCTCTTTCTATCTTT ATTACAT AAA

ACTTCATACACAGTTAAGATTAAAAACAACTAATAAATAATGCCTATCGCAA

ATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTGTTTCCTGGCAATAATAGATCGT

C AATTTGTTGCTTTGTGGT AGTTTT ATTTTCAAATAATTGGAATACT AGGGATT

TGATTTTAAGATCTTTATTCAAATTTTTTGCGCTTAACAAACAGCAGCCAGTC

CCACCCAAGTCTGTTTCAAATGTCTCGTAACTAAAATCATCTTGCAATTTCTTT

TTGAAACTGTCAATTTGCTCTTGAGTAATGTCTCTTCGTAACAAAGTCAAAGA

GCAACCGCCGCCACCAGCACCGGTAAGTTTTGTGGAGCCAATTCTCAAATCAT

CGCTCAGATTTTTAATAAGTTCTAATCCAGGATGAGAAACACCGATTGAGAC

AAGCAGTCCATGATTTATTCTTATCAATTCCAATAGTTGTTCATACAGTTCATT

ATTAGTTTCTACAGCCTCGTCATCGGTGCCTTTACATTTACTTAACTTAGTCAT

GAT CTCTAAGCCTTGTAGGGCACATTC ACCC ATGGC ATCTAGAATT GGCTT CA

TAACTTCAGGAAATTTCTCGGTGACCAACACACGAACGCGAGCAACAAGATC

TTTTGTAGACCTTGGAATTCTAGTATAGGTTAGGATCATTGGAATGGCTGGGA AATCATCTAAGAACTTAAAATTGTnGTGTTTATTGTTCCATTATGTGAGTCTT

TTTCAAATAGCAGGGCATTACCATAAGTGGCCACAGCGTTATCTATTCCTGAA

GGGGTACCGTGAATACACTTTTCACCTATGAAGGCCCATTGATTCACTATATG

CTTATCGTTTTCTGACAGCTTTTCCAAGTCATTAGATCCTATTAACCCCCCCAA

GTAGGCCATAGCTAAGGCCAGTGATACAGAAATAGAGGCGCTTGAGCCCAAC

CCAGCACCGATGGGTAAAGTAGACTTTAAAGAAAACTTAATATTCTTGGCAT

GGGGGCATAGGCAAACAAACATATACAGGAAACAAAACGCTGCATGGTAGT

GGAAGGATTCGGATAGTTGAGCTAACAACGGATCCAAAAGACTAACGAGTTC

CTGAGACAAGCCATCGGTGGCTTGTTGAGCCTTGGCCAATTTTTGGGAGTTTA

CTTGATCCTCGGTGATGGCATTGAAATCATTGATGGACCACTTATGATTAAAG

CTAATGTCCGGGAAGTCCAATTCAATAGTATCTGGTGCAGATGACTCGCTTAT

TAGCAGGTAGGTTCTCAACGCAGACACACTAGCAGCGACGGCAGGCTTGTTG

TACACAGCAGAGTGTTCACCAAAAATAATAACCTTTCCCGGTGCAGAAGTTA

AG A ACGGTAAT G AC ATTAT AGTTTTTTCTCCTTG ACGTT AAAGT ATAG AGGTA

TATTAACAATTTTTTGTTGATACTTTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACA

AACCGAAAATGTTGAAAGTATTAGTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTA

TATATCTGTTAATAGATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAA

ATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCG

TTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACC

ATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGG

CACATCTGCGTTTCAGGAACGCGACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAG

AGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCGCCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCA

ATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTT

TTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGAT

TAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTT

CTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAGTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATG

TCTCAGAACGTTTACATTGTATCGACTGCCAGAACCCCAATTGGTTCATTCCA

GGGTTCTCTATCCTCCAAGACAGCAGTGGAATTGGGTGCTGTTGCTTTAAAAG

GCGCCTTGGCTAAGGTTCCAGAATTGGATGCATCCAAGGATTTTGACGAAATT

ATTTTTGGTAACGTTCTTTCTGCCAATTTGGGCCAAGCTCCGGCCAGACAAGT

TGCTTTGGCTGCCGGTTTGAGTAATCATATCGTTGCAAGCACAGTTAACAAGG

TCTGTGCATCCGCTATGAAGGCAATCATTTTGGGTGCTCAATCCATCAAATGT

GGTAATGCTGATGTTGTCGTAGCTGGTGGTTGTGAATCTATGACTAACGCACC

ATACTACATGCCAGCAGCCCGTGCGGGTGCCAAATTTGGCCAAACTGTTCTTG TTGATGGTGTCGAAAGAGATGGGTTGAACGATGCGTACGATGGTCTAGCCAT

GGGTGTACACGCAGAAAAGTGTGCCCGTGATTGGGATATTACTAGAGAACAA

CAAGACAATTTTGCCATCGAATCCTACCAAAAATCTCAAAAATCTCAAAAGG

AAGGTAAATTCGACAATGAAATTGTACCTGTTACCATTAAGGGATTTAGAGG

TAAGCCTGATACTCAAGTCACGAAGGACGAGGAACCTGCTAGATTAC ACGTT

GAAAAATTGAGATCTGCAAGGACTGTTTTCCAAAAAGAAAACGGTACTGTTA

CTGCCGCTAACGCTTCTCCAATCAACGATGGTGCTGCAGCCGTCATCTTGGTT

TCCGAAAAAGTTTTGAAGGAAAAGAATTTGAAGCCTTTGGCTATTATCAAAG

GTTGGGGTGAGGCCGCTCATCAACCAGCTGATTTTACATGGGCTCCATCTCTT

GCAGTTCCAAAGGCTTTGAAACATGCTGGCATCGAAGACATCAATTCTGTTGA

TTACTTTGAATTCAATGAAGCCTTTTCGGTTGTCGGTTTGGTGAACACTAAGA

TTTTGAAGCTAGACCCATCTAAGGTTAATGTATATGGTGGTGCTGTTGCTCTA

GGTCACCCATTGGGTTGTTCTGGTGCTAGAGTGGTTGTTACACTGCTATCCAT

CTTACAGCAAGAAGGAGGTAAGATCGGTGTTGCCGCCATTTGTAATGGTGGT

GGTGGTGCTTCCTCTATTGTCATTGAAAAGATATGATTACGTTCTGCGATTTTC

TCATGATCTTTTTCATAAAATACATAAATATATAAATGGCTTTATGTATAACA

GGCAT AATTT AAAGTTTT ATTTGCGATTCATCGTTTTTCAGGT ACTC AAACGCT

GAGGTGTGCCTTTTGACTTACTTTTCCCGGGAGAGGCTAGCA GAATTACCCTC

CACGTTGATTGTCTGCGAGGCAAGAATGATCATCACCGTAGTGAGAGTGCGT

TCAAGGCTCTTGCGGTTGCCATAAGAGAAGCCACCTCGCCCAATGGTACCAA

CGATGTTCCCTCCACCAAAGGTGTTCTTATGTAGTGACACCGATTATTTAAAG

CTGCAGCATACGATATATATACATGTGTATATATGTATACCTATGAATGTCAG

TAAGTATGTATACGAACAGTATGATACTGAAGATGACAAGGTAATGCATCAT

TCTATACGTGTCATTCTGAACGAGGCGCGCTTTCCTTTTTTCTTTTTGCTTTTTC

GGAAAAAGTTAGTTGTGGTGATAGGTGGCAAGTGGTATTCCGTAAGAACAAC AAGAAAAGCATTTCATATTATGGCTGAACTGAGCGAACAAGTGCAAAATTTA AGCATCAACGACAACAACGAGAATGGTTATGTTCCTCCTCACTTAAGAGGAA AACC AAG AAGTGCC AG AAAT AACAGT AGC AACT ACAAT AAC AAC AAC GGCG GCGTTT AAAC

SEQ ID NO: 7

inserto ERG8-Pgal-ERG19 de pAM497 (5' a 3') GTTTAAACTTTTCCAATAGGTGGTTAGC AATCGTCTTACTTTCT AACTTTTCTT

A CCTTTTAC ATTTC AGC A ATATATATATATATATTT C AAGG AT AT ACCATT CTA

ATGTCTGCCCCTAAGAAGATCGTCGTTTTGCCAGGTGACCACGTTGGTCAAGA

AATCACAGCCGAAGCCATTAAGGTTCTTAAAGCTATTTCTGATGTTCGTTCCA

ATGTCAAGTTCGATTTCGAAAATCATTTAATTGGTGGTGCTGCTATCGATGCT

ACAGGTGTTCCACTTCCAGATGAGGCGCTGGAAGCCTCCAAGAAGGCTGATG

CCGTTTTGTTAGGTGCTGTGGGTGGTCCTAAATGGGGTACCGGTAGTGTTAGA

CCTGAACAAGGTTTACTAAAAATCCGTAAAGAACTTCAATTGTACGCCAACTT

AAGACCATGTAACTTTGCATCCGACTCTCTTTTAGACTTATCTCCAATCAAGC

CACAATTTGCTAAAGGTACTGACTTCGTTGTTGTCAGAGAATTAGTGGGAGGT

ATTTACTTT GGTAAG AG AAAGGAAG ACGTTTAGCTTGCCTCGTCCCÇGCCGGG

TCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGAC

GTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACA

TCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGAA

GCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCT

CACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAA

GGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTG

CTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGCAGAACC

AGCCCAAAAAAAGCAAAAACAAACTGTTCAGGAGCGCAAGGCGTTT ATCTCC

CGTATCACTAATGAAACTAAAATTCAAATCGCTATTTCGCTGAATGGTGGTTA

TATTCAAATAA AAG ATTC G ATTCTT CCTGC AAAG AAGG AT GACGATGT A GCTT

CCCAAGCTACTCAGTCACAGGTCATCGATATTCACACAGGTGTTGGCTTTTTG

GATCATATGATCCATGCGTTGGCAAAACACTCTGGTTGGTCTCTTATTGTTGA

ATGTATTGGTGACCTGCACATTGACGATCACCATACTACCGAAGATTGCGGTA

TCGCATTAGGGCAAGCGTTCAAAGAAGCAATGGGTGCTGTCCGTGGTGTAAA

AAGATTCGGTACTGGGTTCGCACCATTGGATGAGGCGCTATCACGTGCCGTA

GTCGATTT ATCTAGT AGACCATTTGCTGTAATCGACCTTGGATTGAAGAGAGA

GATGATTGGTGATTTATCCACTGAAATGATTCCACACTTnTGGAAAGTTTCG

CGGAGGCGGCCAGAATTACTTTGCATGTTGATTGTCTGAGAGGTTTCAACGAT

CACCACAGAAGTGAGAGTGCGTTCAAGGCTTTGGCTGTTGCCATAAGAGAAG

CTATTTCTAGCAATGGCACCAATGACGTTCCCTCAACCAAAGGTGTTTTGATG

TGAAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATA AATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTC

GATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGTTTCTCATTCAAGTGGTAACTGCTGTT

AAAATTAAGATATTT ATAAATTG AAGCTTGGTCGTT CCGACC AATACCGT AGG

GAAACGTAAATTAGCTATTGTAA AA AAAGGAAAAGAAAAGAA AAGAAA AAT

GTTACATATCGAATTGATCTTATTCCTTTGGTAGACCAGTCTTTGCGTCAATCA

AAGATTCGTTTGTTTCTTGTGGGCCTGAACCGACTTGAGTTAAAATCACTCTG

GC AACATCCTTTTGCAACTCAAGATCCAATTCACGTGCAGTAAAGTTAGATGA

TTCAAATTGATGGTTGAAAGCCTCAAGCTGCTCAGTAGTAAATTTCTTGTCCC

ATCCAGGAACAGAGCCAAACAATTTATAGATAAATGCAAAGAGTTTCGACTC

ATTTTCAGCTAAGTAGTACAACACAGCATTTGGACCTGCATCAAACGTGTATG

C AACGATTGTTTCTCCGT AAAACTG ATT AATGGTGTGGCACC AACTG ATGAT A

CGCTTGGAAGTGTCATTCATGTAGAATATTGGAGGGAAAGAGTCCAAACATG

TGGCATGGAAAGAGTTGGAATCCATCATTGTTTCCTTTGCAAAGGTGGCGAA

ATCTTTTTCAACAATGGCTTTACGCATGACTTCAAATCTCTTTGGTACGACATG

TTCAATTCTTTCTTTAAATAGTTCGGAGGTTGCCACGGTCAATTGCATACCCTG

AGTGG AACTCACATCCTTTTTAATATCGCTGACAACTAGGACACAAGCTTTCA

TCTGAGGCCAGTCAGAGCTGTCTGCGATTTGTACTGCCATGGAATCATGACCA

TCTTCAGCTTTTCCCATTTCCCAGGCCACGTATCCGCCAAACAACGATCTACA

AGCTGAACCAGACCCCTTTCTTGCTATTCTAGATATTTCTGAAGTTGACTGTG

GTAATTGGTATAACTTAGCAATTGCAGAGACCAATGCAGCAAAGCCAGCAGC

GGAGGAAGCTAAACCAGCTGCTGTAGG AAAGTTATTTTCGGAGACAATGTGG

AGTTTCCATTGAGATAATGTGGGCAATGAGGCGTCCTTCGATTCCATTTCCTT

TCTTAATTGGCGTAGGTCGCGCAGACAATTTTGAGTTCTTTCATTGTCGATGCT

GTGTGGTTCTCCATTTAACCACAAAGTGTCGCGTTCAAACTCAGGTGCAGTAG

CCGCAGAGGTCAACGTTCTGAGGTCATCTTGCGATAAAGTCACTGATATGGA

CGAATTGGTGGGCAGATTCAACTTCGTGTCCCTTTTCCCCC AAT ACTT AAGGG

TTGCGATGTTGACGGGTGCGGTAACGGATGCTGTGTAAACGGTCATTATAGTT

TTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTTTTGTTGATACT

TTTATGACATTTGAATAAGAAGTAATACAAACCGAAAATGTTGAAAGTATTA

GTTAAAGTGGTTATGCAGCTTTTGCATTTATATATCTGTTAATAGATCAAAAA

TC ATCGCTTCGCTG ATTAATTACCCC AGAAAT AAGGCT AA AAAACT AAT CGCA

TT ATTATCCTATGGTTGTTAATTTGATTCGTTGATTTGAAGGTTTGTGGGGCCA

GGTTACTGCC AATTTTTCCTCTTC ATAACCATAAAAGCTAGT ATTGT AGAATC

TTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGG AACGCG ACCGGTGAAGACCAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCGTCGGAGGGCTGTCG

CCCGCTCGGCGGCTTCTAATCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCG

TATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTC

TTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGG

TATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCAAAAAAAAAG

TAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGTCAGAGTTGAGAGCCTTCAGTGCC

CCAGGG AAAGCGTTACTAGCTGGTGGATATTTAGTTTTAGATCCGAAATATGA

AGCATTTGTAGTCGGATTATCGGC AAGAATGCATGCTGTAGCCCATCCTTACG

GTTCATTGCAAGAGTCTGATAAGTTTGAAGTGCGTGTGAAAAGTAAACAATTT

AAAGATGGGGAGTGGCTGTACCATATAAGTCCTAAAACTGGCTTCATTCCTGT

TTCGATAGGCGGATCTAAGAACCCTTTCATTGAAAAAGTTATCGCTAACGTAT

TTAGCTACTTTAAGCCTAACATGGACGACTACTGCAATAGAAACTTGTTCGTT

ATTGAT ATTTTCTCTGATGATGCCTACCATTCTCAGGAGGACAGCGTTACCGA

ACATCGTGGCAACAGAAGATTGAGTTTTCATTCGCACAGAATTGAAGAAGTT

CCCAAAACAGGGCTGGGCTCCTCGGCAGGTTTAGTCACAGTTTTAACTACAGC

TTTGGCCTCCTTTTTTGTATCGGACCTGGAAAATAATGTAGACAAATATAGAG

AAGTTATTCATAATTTATCACAAGTTGCTCATTGTCAAGCTCAGGGTAAAATT

GGAAGCGGGTTTGATGTAGCGGCGGCAGCATATGGATCTATCAGATATAGAA

GATTCCCACCCGCATTAATCTCTAATTTGCCAGATATTGGAAGTGCTACTTAC

GGCAGTAAACTGGCGCATTTGGTTAATGAAGAAGACTGGAATATAACGATTA

AA AGTAA CCATTT ACCTTCGGGATT AACTTT ATGGATGGGCGAT ATT AAGAAT

GGTTCAGAAACAGTAAAACTGGTCCAGAAGGTAAAAAATTGGTATGATTCGC

ATATGCCGGAAAGCTTGAAAATATATACAGAACTCGATCATGCAAATTCTAG

ATTTATGGATGGACTATCTAAACTAGATCGCTTACACGAGACTCATGACGATT

ACAGCGATCAGATATTTGAGTCTCTTGAGAGGAATGACTGTACCTGTCAAAA

GTATCCTGAGATCACAGAAGTTAGAGATGCAGTTGCCACAATTAGACGTTCCT

TTAGAAAAATAACTAAAGAATCTGGTGCCGATATCGAACCTCCCGTACAAAC

TAGCTTATTGGATGATTGCCAGACCTTAAAAGGAGTTCTTACTTGCTTAATAC

CTGGTGCTGGTGGTTATGACGCCATTGCAGTGATTGCTAAGCAAGATGTTGAT

CTTAGGGCTCAAACCGCTGATGACAAAAGATTTTCTAAGGTTCAATGGCTGG

ATGTAACTCAGGCTGACTGGGGTGTTAGGAAAGAAAAAGATCCGGAAACTTA

TCTTGATAAATAACTTAAGGTAGATAATAGTGGTCCATGTGACATCTTTATAA

ATGTGAAGTTTGAAGTGACCGCGCTTAACATCTAACCATTCATCTTCCGATAG

TACTTGAAATTGTTCCTTTCGGCGGCATGATAAAATTCTTTTAATGGGTACAA GCTACCCGGGCCCGGGAAAGATTCTCTTTTTTTATGATATTTGTACATAAACT

TTATAAATGAAATTCATAATAGAAACGACACGAAATTACAAAATGG AATATG

TTCATAGGGT AG ACG A A ACT AT AT ACGC AAT CTACAT ACATTTATC AAG AAG

GAGAAAAAGGAGGATGTAAAGGAATACAGGTAAGCAAATTGATACTAATGG

CTCAACGTGATAAGGAAAAAGAATTGCACTTTAACATTAATATTGACAAGGA

GGAGGGCACCACACAAAAAGTTAGGTGTAACAGAAAATCATGAAACTATGAT

TCCTAATTTATATATTGG AGGATTTTCTCT AAAAAA AAA A A AATAC AAC A AAT

AAAAAACACTCAATGACCTGACCATTTGATGGAGTTTAAGTCAATACCTTCTT

GAACCATTTCCCATAATGGTGAAAGTTCCCTCAAGAATTTTACTCTGTCAGAA

ACGGCCTTAACGACGTAGTCGACCTCCTCTTCAGTACTAAATCTACCAATACC

AAATCTGATGGAAGAATGGGCTAATGCATCATCCTTACCCAGCGCATGTAAA

ACATAAGAAGGTTCTAGGGAAGCAGATGTACAGGCTGAACCCGAGGATAATG

CGATATCCCTTAGTGCCATCAATAAAGATTCTCCTTCCACGTAGGCGAAAGAA

ACGTT AACACGTTTAAAC

SEQ ID NO: 8

γ-terpineno sintase de Citrus limon códon-otimizada para expressão em

Escherichia coli e com sítios de restrição Xmal e XbaI flanqueando (5' a 3')

GGAATTCCCGGGCGAGCTCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGT

GGAATTGTGAGCGGATAACAATTGAATTCAAAGGAGGAAAATAAAATGAGCT

TCGATTATATTCAGAGCCTGGATTCTAAGTACAAGGGTGAATCTTACGCCCGT

CAGCTTGAGAAACTGAAAGAACAAGTGTCCGCAATGCTGCAGCAGGACAACA

AAGTCGTTGACCTGGACCCACTGCATCAGCTGGAACTGATCGATAATCTGCAC

CGTCTGGGCGTGAGCTACCATTTCGAGGATGAGATCAAACGTACCCTGGATC

GTATCCACAACAAAAACACCAACAAAAGCTTGTATGCGCGTGCGCTGAAATT

CCGCATCCTGCGTCAGTACGGCTATAAGACCCCGGTTAAGGAAACGTTCTCTC

GCTTCATGGACGAAAAAGGCAGCTTCAAACTGTCCTCTCATTCTGATGAATGC

AAAGGCATGCTGGCTCTGTACGAAGCTGCATATCTCCTGGTTGAAGAAGAAT

CTTCCATCTTCCGTGATGCGATCCGCTTTACCACGGCATACCTGAAAGAATGG

GTAGCGAAACACGATATTGATAAAAACGATAACGAATATCTGTGCACCTTGG

TGAAACACGCACTGGAACTGCCGCTGCATTGGCGCATGCGTCGTCTGGAGGC

TCGCTGGTTCATCGACGTCTATGAGTCTGGCCCGGATATGAACCCGATCCTGC

TGGAGCTGGCCAAAGTTGACTACAACATCGTTCAGGCTGTGCACCAGGAGGA CCTGAAATACGTTTCCCGTTGGTGGAAGAAAACTGGTCTGGGCGAAAAACTG

AACTTCGCACGTGATCGTGTTGTGGAAAACTTCTTCTGGACCGTTGGCGATAT

CTTCGAACCGCAGTTCGGCTACTGCCGCCGTATGTCTGCTATGGTAAACTGTC

TGCTGACCTCCATTGATGATGTATACGATGTTTATGGTACTCTGGATGAACTT

GAACTGTTCACTGATGCGGTAGAACGCTGGGATGCTACCACTACTGAACAGT

TGCCTTATTACATGAAGTTGTGTTTCCACGCGCTGTACAACTCCGTAAACGAA

ATGGGCTTCATCGCTCTGCGTGATCAGGAAGTAGGTATGATTATTCCATATCT

GAAGAAAGCATGGGCGGATCAGTGTAAATCCTACCTGGTGGAAGCAAAATGG

TACAACTCTGGCTACATTCCTACTCTGCAGGAGTACATGGAGAACGCGTGGAT

CTCCGTTACCGCGCCTGTAATGCTGTTGCACGCGTACGCATTCACCGCTAACC

CAATCACCAAGGAAGCACTGGAATTTCTGCAGGACTCGCCGGATATCATCCG

TATCTCCTCCATGATCGTGCGTCTGGAAGACGATCTGGGTACCTCCAGCGATG

AACTGAAACGTGGTGACGTCCCGAAAAGCATCCAGTGTTACATGCACGAAAC

CGGCGTTTCTGAAGACGAGGCTCGTGAACATATTCGTGACCTCATTGCAGAA

ACCTGGATGAAGATGAACTCTGCGCGTTTCGGTAACCCGCCGTACCTGCCGG

ATGTTTTTATCGGTATCGCGATGAACCTGGTGCGTATGTCCCAATGTATGTAT

TTGTACGGCGATGGTCATGGTGTACAGGAAAACACTAAAGACCGCGTCCTGT

CTCTGTTCATCGATCCGATCCCGTGATAGTAATCTAGAGG AATTT

SEQ ID NO: 9

terpinoleno sintase de Ocimum basilieum códon-otimizada para expressão em

Escherichia eoli e com sítios de restrição Xmal e XbaI flanqueando (5' a 3')

GG AATTCCCGGGCGAGCTCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGT

GGAATTGTGAGCGGATAACAATTGAATTCAAAGGAGGAAAATAAAATGGATT

TTAACTATCTGCAGTCTCTGAATAATTACCACCACAAAGAGGAACGTTACCTG

CGCCGCCAGGCCGATCTGATCGAAAAAGTGAAAATGATTCTGAAAGAGGAGA

AAATGGAGGCCCTGCAACAGCTGGAGCTGATCGACGACCTGCGTAACCTGGG

CCTGTCTTACTGCTTTGACGATCAAATTAACCATATCCTGACGACCATCTATA

ACCAGCACTCCTGCTTCCACTATCACGAAGCGGCTACCTCTGAGG AAGCGAA

CCTGT ACTT C ACCGCCCT GGGTTTCCGTCTGCT GCGCGAAC ACGGCTT CAAAG

TGAGCCAGGAAGTGTTCGATCGTTTTAAGAACGAAAAAGGCACCGATTTCCG

TCCGGATCTGGTTGATGATACCCAGGGTCTGCTGCAACTGTATGAAGCAAGCT

TTCTGCTGCGTGAAGGCGAGGACACTCTGGAATTCGCACGCCAATTCGCAAC

GAAATTCCTGCAAAAGAAAGTCGAAGAAAAGATGATTGAAGAAGAAAACCT GCTGTCTTGGACCCTGCACAGCCTGGAACTGCCGCTGCACTGGCGTATCCAGC

GTCTGGAAGCGAAATGGTTCCTGGATGCGTACGCTTCTCGCCCAGACATGAA

CCCGATTATTTTCGAACTGGCCAAACTGG AATTTAATATCGCTCAGGCACTGC

AGCAGGAAGAACTGAAGGACCTGAGCCGTTGGTGGAACGATACTGGTATCGC

GGAAAAACTGCCGTTCGCGCGTGATCGTATCGTGGAATCCCACTACTGGGCT

ATCGGCACCCTGGAGCCGTACCAGTACCGTTACCAGCGCTCTCTGATCGCGAA

AATCATCGCTCTGACCACGGTGGTTGACGATGTGTACGACGTTTACGGTACTC

TGGACGAACTGCAGCTGTTCACCGATGCAATCCGTCGTTGGGATATCGAATCT

ATCAACCAACTGCCGTCTTATATGCAACTGTGTTACCTGGCGATCT ATAACTT

TGTGTCTGAACTGGCCTATGACATCTTCCGCGACAAAGGTTTCAATTCCCTGC

CGTACCTGCACAAAAGCTGGCTGGACCTGGTAGAAGCGTATTTCCAGGAGGC

GAAGTGGTATCACAGCGGCTACACCCCGTCCCTGGAACAGTACCTGAACATT

GCACAGATCAGCGTGGCGTCTCCGGCGATCCTGTCTCAGATCTACTTCACCAT

GGCGGGCAGCATTGACAAACCGGTGATTGAAAGCATGTACAAATATCGTCAT

ATTCTGAATCTGTCCGGCATCCTGCTGCGTCTGCCAGACGATCTGGGCACCGC

CTCCGACGAACTGGGCCGTGGTGACCTGGCAAAAGCGATGCAGTGCTACATG

AAAGAGCGTAACGTTAGCGAAGAAGAAGCGCGCGATCACGTTCGTTTCCTGA

ACCGTGAAGTTTCCAAACAGATGAATCCGGCACGTGCTGCTGATGATTGCCC

GTTCACTGACGATTTTGTGGTCGCAGCAGCCAACCTGGGTCGCGTAGCTGACT

TCATGTACGTGGAAGGTGATGGTCTGGGCCTGCAATACCCTGCTATCCACCAG

CACATGGCGGAACTGCTGTTCCATCCGTATGCCTAATGATAGTAATCTAGAGG

AATTT

SEQ ID NO: 10

terpinoleno sintase de Pseudotsuga menziesii códon-otimizada para expressão

em Eseheriehia coli e com sítios de restrição Xmal e XbaI flanqueando (5' a

3')

GGAATTCCCGGGCGAGCTCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGT

GGAATTGTGAGCGGATAACAATTGAATTCAAAGGAGGAAAATAAAATGGAT

GACAACTTTATTCAGTCTCTGTCCAGCCCGTATGAAGAATCTTCTTACGGCGA

TCGTGCCGAAACTCTGATCGGCGAAGTAAAGGAGATCTTCAACAGCÇTGTCT

ATGACTGGTGTAGTTAGCCCGCTGAACGACCTGCTGCAGCGTCTGCTGATGGT

GGATAACGTTGAGCGTCTGGGTATCGAACGCCACTTCCAGAACGAAATCAAG

AGCGCCCTGCAGTATGTGTACTCTTACTGGTCTGAGAATGGTATTGGCTGCGG

TAAAGACTCCGTTAGCACCGACCTGAACACCACTGCACTGGGCTTCCGTATCC TGCGCCTGCATGGTTATACCGTGTTCTCCGACGTACTGGAACAGTTCAAAGAC

CAGAAAGGCCAGTTCGCGAGCGCTTGGTCCGCGAACCATACCGAACGCCAAA

TCCGTTCCGTCCTGAACCTGTTTCGCGCTTCCCTGATCGCGTTCCCAGGTGAA

AAAGTGATGGAAGAGGCACAAATCTTCTCCGCGACCTATCTGAAAGAGGCGC

TGCAGACTATCCCGCTGTCTGGCCTGTCTCAGGAAATCCAGTACGCGCTGGAA

TACCGTTGGCATTCTAACCTGCCGCGCCTGGAAGTTCGTAGCTATATTGATAT

CCTGGCAGAAAATACTATTAACGAAATGAGCTACCCGAAGGTTGAGAAACTG

CTGGAGCTGGCGAAACTGGAATTCAACATCTTCCATAGCCTGCAGCAGAAGG

AGCTGCAGTGTATCTGGCGCTGGTGGAAAGAATCCGGCTCTCCGGAGCTGAC

GTTTGTGCGTCATCGTTATGTAGAGTACTACACCCTGGTGGCTGGCATCGATA

TGGAACCGCAGCACTCTGCCTTCCGCATCGCGTACGTCAAGATGTGCCACCTG

ATCACCATTCTGGATGATATGTATGATACTTTCGGCACCATCGACGAGCTGCG

TCTGTTCACTGCTGCCGTAAAACGCTGGGACCGTAGCCCGACCGAGTGCCTGC

CGCAGTACATGAAAGGTGTCTATATGGTGCTGTACGACACGGTTAATGAAAT

GGCCTGTGAAGCTCTGAAAAGCCAGGGCTGGG AT ACGCTG AATT ATGCTCGC

CAGGCTTTCGAAGATTACATCGATTCTTACCTGAAGGAGGCAGAATGGATCTC

CACTGGTTACCTGCCGACCTTCGAAGAATATCTGGAAAACGGTAAAGTGTCCT

CCGCGCACCGTGTTGCAACCCTGCAGCCGATCCTGACCCTGGATATCCCGTTT

CCACTGCACATCATCCAGGAAATCGACTTCCCGTCCAAATTTAACGATTCCGC

TTCCTCTATCCTGCGTCTGCGTGGCGATACCCGTTGTTATCAAGCGGATATGG

CACGCGGTGAAGAGGCATCCTCTATCTCCTGCTATATGCACGATAATCCGGGC

TCTACTGAAGAAGATGCGCTGAACCACATTAACGGTATGATCGAGGACATTA

TCAAAGAACTGAACTGGGAACTGCTGCGTAAGGACATCAACGTTCCGATTAG

CTGCAAAAAGCATGCGTTCGAAATTTCTCGTGGCTTCCACCACTTTTACAAAG

ATCGCGACGGTTACACTGTCTCTAACATCGAAACCAAGGATCTGGTAATGAA

AACTGTCCTGGAACCGGTGCCTCTGTAATGATAGTAATCTAGAGGAATTT

SEQ ID NO: 11

região KanMX-PMET3 de pAM328 (5’ a 3') GAATTCGCCCTTNTGGATGGCGGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGC GACCAGCATTCACATACGATTGACGCATGATATTACTTTCTGCGCACTTAACT TCGCATCTGGGCAGATGATGTCGAGGCGAAAAAAAATATAAATCACGCTAAC ATTTGATTAAAATAGAACAACTACAATATAAAAAAACTATACAAATGACAAG TTCTTGAAAACAAGAATCTTTTTATTGTCAGTACTGATTAGAAAAACTCATCG AGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTT

TTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCAT

AGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAAT

ACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCAC

CATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTC

CAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATC

AACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGA

TCGCTGTT AAAAGG ACAATT ACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGC AGGA

ACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAAT

ACCTGGAATGCTGTTTTGCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATC

AGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGC

CAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCC

ATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGAT AGATTG

TCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCA

GCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAAACGTGAGTCTTTTCCTTACC

CATGGTTGTTTATGTTCGGATGTGATGTGAGAACTGTATCCTAGCAAGATTTT

AAAAGGAAGTATATGAAAGAAGAACCTCAGTGGCAAATCCTAACCTTTTATA

TTTCTCTACAGGGGCGCGGCGTGGGGACAATTCAACGCGTCTGTGAGGGGAG

CGTTTCCCTGCTCGCAGGTCTGCAGCGAGGAGCCGTAATTTTTGCTTCGCGCC

GTGCGGCCATCAAAATGTATGGATGCAAATGATTATACATGGGGATGTATGG

GCTAAATGTACGGGCGACAGTCACATCATGCCCCTGAGCTGCGCACGTCAAG

ACTGTCAAGGAGGGTATTCTGGGCCTCCATGTCGCTGGCCGGGTGACCCGGC

GGGGACGAGGCAAGCTAAACAGATCTGATCTTGAAACTGAGTAAGATGCTCA

GAATACCCGTCAAGATAAGAGTATAATGTAGAGTAATATACCAAGTATTCAG

CATATTCTCCTCTTCTTTTGTATAAATCACGGAAGGGATGATTTATAAGAAAA

ATGAATACTATTACACTTCATTTACCACCCTCTGATCTAGATTTTCC AACGATA

TGTACGTAGTGGTATAAGGTGAGGGGGTCCACAGATATAACATCGTTTAATTT

AGTACTAACAGAGACTTTTGTCACAACTACATATAAGTGTACAAATATAGTAC

AGATATGACACACTTGTAGCGCCAACGCGCATCCTACGGATTGCTGACAGAA

AAAAAGGTCACGTGACCAGAAAAGTCACGTGTAATTTTGTAACTCACCGCAT

TCTAGCGGTCCCTGTCGTGCACACTGCACTCAACACCATAAACCTTAGCAACC

TCC AAAGG AAATC ACCGT AT AAC AAAGCC ACAGTTTT AC AACTT AGTCTCTT A

TGAAGTTACTTACCAATGAGAAATAGAGGCTCTTTCTCGAGAAATATGAATAT

GGATATAT ATATAT AT AT ATATAT ATATAT ATATATAT GT AAACTTGGTTCTTT TTTAGCTTGTGATCTCTAGCTTGGGTCTCTCTCTGTCGTAACAGTTGTGATATC

GNAAGGGCGAATTC

SEQ ID NO: 12

segmento amplificado por PCR de gene leu2 de pAM178 (5' a 3') TCGACTACGTCGTAAGGC CGTTTCT G AC AG AGTAAAATT CTT G AGGG AACTTT CACCATTATGGGAAATGCTTCAAGAAGGTATTGACTTAAACTCCATCAAATG GTCAGGTCATTGAGTGTTTTTTATTTGTTGTATTTTTTTTTTTTTAGAGAAAATC CTCCAATATCAAATTAGGAATCGTAGTTTCATGATTTTCTGTT ACACCTAACTT TTTGTGTGGTGCCCTCCTCCTTGTCAATATTAATGTTAAAGTGCAATTCTTTTT CCTT ATC ACGTTG AGCCATT AGT ATC AATTTGCTTACCTGT ATTCCTTT ACT AT CCTCCTTTTTCTCCTTCTTGATAAATGTATGTAGATTGCGTATATAGTTTCGTC TACCCT ATGAACATATTCCATnTGTAATTTCGTGTCGTTTCTATTATGAATTT CATTTATAAAGTTTATGTACAAATATCATAAAAAAAGAGAATCTTTTTAAGCA AGGATTTTCTT AACTT CTTCGGCG AC AGCATC ACCG ACTT CGGTGGTACTGTT GGAACCACCTAAATCACCAGTTCTGATACCTGCATCCAAAACCTTTTTAACTG CATCTTCAATGGCCTTACCTTCTTCAGGCAAGTTCAATGACAATTTCAACATC ATTGC AGC AG AC A AG AT AGT GGCGATAGGGTC A ACCTTATTCTTTGGC AAAT CTGGAGCAGAACCGTGGCATGGTTCGTACAAACCAAATGCGGTGTTCTTGTCT GGCAAAGAGGCCAAGGACGCAGATGGCAACAAACCCAAGGAACCTGGGATA ACGGAGGCTTCATCGGAGATGATATCACCAAACATGTTGCTGGTGATTATAAT ACCATTTAGGTGGGTTGGGTTCTTAACTAGGATCATGGCGGCAGAATCAATCA ATTGATGTTGAACCTTCAATGTAGGGAATTCGTTCTTGATGGTTTCCTCCACA GTTTTTCTCCATAATCTTGAAGAGGCCAAAAGATTAGCTTTATCCAAGGACCA AATAGGC AATGGTGGCTCATGTTGTAGGGCCATGAAAGCGGCCATTCTTGTG ATTCTTTGCACTTCTGGAACGGTGTATTGTTCACTATCCCAAGCGACACCATC ACCATCGTCTTCCTTTCTCTTACC AAAGTAAATACCTCCCACTAATTCTCTGAC AACAACGAAGTCAGTACCTTTAGCAAATTGTGGCTTGATTGGAGATAAGTCT AAAAGAGAGTCGGATGCAAAGTTACATGGTCTTAAGTTGGCGTACAATTGAA GTTCTTTACGGATTTTTAGTAAACCTTGTTCAGGTCTAACACTACCGGTACCCC ATTTAGGACCAGCCACAGCACCTAACAAAACGGCATCAACCTTCTTGGAGGC TTCC AGCGCCTCATCTGGAA GTGG AAC ACCTGTAGC ATCGATAGCA GCACC A CCAATTAAATGATTTTCGAAATCGAACTTGACATTGGAACGAACATCAGAAA T AGCTTT A AG AACCTT AATGGCTTCGGCTGT GATTTCTT G ACC AACGT GGTCA CCTGGC AAAACGACGATCTTCTTAGGGGCAGACATTACAATGGTATATCCTTG AAATATATATAGTGAAATACCGCACAGATGC

SEQ ID NO: 13

Iniciador 4-49 mvaA SpeI (de 5' a 3')

GCT ACTAGTAGGAGGAAAACATCATGCAAAGTTTAGATAAGAATTTCCG SEQ ID NO: 14

Iniciador 4-49 mvaARXbal (de 5' a 3')

GCTTCT AGACTATTGTTGTCTAATTTCTTGTAAAATGCG SEQ ID NO: 15

Iniciador HMGS 5' Sa mvaS-S (de 5' a 3”) GAACTGAAGATCTAGGAGGAAAGCAAAATGACAATAGGTATCGACAAAATA AACT

SEQ ID NO: 16

Iniciador HMGS 3' Sa mvaS-AS (de 5' a 3') TTGCATGATGTTTTCCTCCTACTAGTTACTCTGGTCTGTGATATTCGCGAAC

SEQ ID NO: 17 Iniciador 67-1A-C (de 5' a 3') ACACTCGAGGAGGAATAAATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG

SEQ ID NO: 18 Iniciador 67-IB-C (de 5' a 3') TGATGGTACCTTATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTGGC

SEQ ID NO: 19 Iniciador 67-IC-C (de 5' a 3') ACTAGGTACCAGGAGGAATAAATGAAGCAACTCACCATTCTGGGC

SEQ ID NO: 20 Inieiador 67-ID-C (de 5’ a 3’)

AATTGATGGGCCCTCAGCTTGCGAGACGCATCACCTC

SEQ ID NO:21

Iniciador 67-IE-C (de 5' a 3') CAT AAAGGGCCCAGGAGGAATAAATGGC AACCACTCATTTGGATG

SEQ ID NO: 22 Iniciador 67-1F-C (de 5' a 3')

TATTGTTCAT ATGTTATGTATTCTCCTGATGGATGGTTCG

SEQ ID NO: 23 Inieiador 67-IG-C (de 5’ a 3')

AACTAAC AC ATATG AGGAGGAATAA ATGCGG AC AC AGT GGCCCTC

SEQ ID NO: 24 Inieiador 67-1H-C (de 5' a 3')

TGTTAGTTACGCGTTTAAAGCATGGCTCTGTGC AATGG

SEQ ID NO: 25 Inieiador 67-2A-C (de 5' a 3') ACGGGATCCAGGAGGAATAAATGCGAATTGGACACGGTTTTGACG

SEQ ID NO: 26 Inieiador 67-2B-C (de 5' a 3') TTTAGTTGGGCCCTCATTTTGTTGCCTTAATGAGTAGCGCC

SEQ ID NO: 27 Inieiador 67-2C-C (de 5’ a 3') TACTAAGGGCCCAGGAGGAAATAATGCATAACCAGGCTCCAATTCAACG

SEQ ID NO: 28 Inieiador 67-2D-C (de 5' a 3')

TCCGGGTACCTTATTTTTCAACCTGCTGAACGTCAATTCG

SEQ ID NO: 29 Inieiador 67-2E-C (de 5' a 3')

AACAGGTACCAGGAGGAAATAATGCAGATCCTGTTGGCCAACC

SEQ ID NO: 30 Inieiador 67-2F-C (de 5' a 3')

TGGATGAAGTCGACTT AATCG ACTTC AC GAAT ATCGAC ACGC AGC SEQ ID NO: 31 Iniciador 67-2G-C (de 5' a 3') CATCAAGTCGACAGGAGGAAATAATGCAAACGGAACACGTCATTTTATTG

SEQ ID NO: 32 Inieiador 67-2H-C (de 5' a 3') TAATGCAAGCTTATTTAAGCTGGGTAAATGCAGATAATCG

SEQ ID NO: 33 Inieiador 67-2I-C (de 5' a 3')

CAGTAAAGCTTAGGAGGAAATAATGGACTTTCCGCAGCAACTCG

SEQ ID NO: 34 Inieiador 67-2J-C (de 5' a 3') TAGTTCCATGGTTATTTATTACGCTGGATGATGTAGTCCGC

SEQ ID NO: 35 Inieiador 9-156A (de 5' a 3')

ACATAGACGTCGGGAAAGCGAGGATCTAGGTAGGG

SEQ ID NO: 36 Inieiador 9-156B (de 5' a 3”)

TTCCCGCTCGAGGTGGCGGACCATATAGGCAGATCAG

SEQ ID NO: 37

Inieiador 61-67-CPK001-G (de 5' a 3')

GTTT AAACT ACT ATT AGCT GAATTGCC ACT SEQ ID NO: 38

Inieiador 61-67-CPK002-G (de 5' a 3')

ACTGCAAAGTACACATATATCCCGGGTGTCAGCTCTTTTAGATCGG

SEQ ID NO: 39

Inieiador 61-67-CPK003-G (de 5' a 3') CCGATCTAAAAGAGCTGACACCCGGGATATATGTGTACTTTGCAGT

SEQ ID NO: 40 Iniciador 61-67-CPK004-G (de 5' a 3') GTTTAAACGGCGTCAGTCCACCAGCTAACA

SEQ ID NO: 41

Inieiador 61-67-CPK005-G (de 5’ a 3') GTTTAAACTTGCTAAATTCGAGTGAAACAC

SEQ ID NO: 42

Inieiador 61-67-CPK006-G (de 5' a 3') AAAGATGAATTGAAAAGCTTCCCGGGTATGGACCCTGAAACCACAG SEQ ID NO: 43

Inieiador 61-67-CPK007-G (de 5' a 3') CTGTGGTTTCAGGGTCCATACCCGGGAAGCTTTTCAATTCATCTTT

SEQ ID NO: 44

Inieiador 61-67-CPK008-G (de 5' a 3') GTTTAAACCCAACAATAATAATGTCAGATC

SEQ ID NO: 45

Inieiador 61-67-CPK009-G (de 5' a 3')

GTTT AAACT ACTC AGTAT ATTAAGTTTCG A

SEQ ID NO: 46

Inieiador 61-67-CPK010-G (de 5' a 3’) ATCTCTCGCAAGAGTCAGACTGACTCCCGGGCGTGAATAAGCTTCGGGTGAC CCTTATGGCATTCTTTTT

SEQ ID NO: 47

Inieiador 61-67-CPK011-G (de 5' a 3') AAAAAGAATGCCATAAGGGTCACCCGAAGCTTATTCACGCCCGGGAGTCAGT CTGACTCTTGCGAGAGAT

SEQ ID NO: 48

Inieiador 61-67-CPK012-G (de 5’ a 3’)

GTTTAAACAATTT AGTGTCTGCGATGATGA SEQ ID NO: 49

Iniciador 61-67-CPK013-G (de 5' a 3’) GTTTAAACTArrGTGAGGGTCAGTTATTTC

SEQ ID NO: 50

Inieiador 61-67-CPK014alt-G (de 5' a 3')

GCGGGGACGAGGCAAGCTAAACTTTAGTATATTCTTCGAAGAAA

SEQ ID NO: 51

Inieiador 61-67-CPK015alt-G (de 5' a 3’) TTTCTTCGAAGAATATACTAAAGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGC

SEQ ID NO: 52

Inieiador 61-67-CPK016-G (de 5’ a 3')

CAATCAACGTGGAGGGTAATTCTGCTAGCCTCTCCCGGGTGGATGGCGGCGTT

AGTATCG

SEQ ID NO: 53

Inieiador 61-67-CPK017-G (de 5' a 3')

CGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGAGAGGCTAGCAGAATTACCCTCCAC GTTGATTG

SEQ ID NO: 54

Inieiador 61-67-CPK018-G (de 5' a 3')

GTTTAAACGCCGCCGTTGTTGTTATTGT AG

SEQ ID NO: 55

Inieiador 61-67-CPK019-G (de 5' a 3’) GTTTAAACTTTTCCAATAGGTGGTTAGCAA

SEQ ID NO: 56

Inieiador 61-67-CPK020-G (de 5' a 3')

GGGTGACCCGGCGGGGACGAGGC AAGCTAAACGTCTTCCTTTCTCTTACCAA AGT

SEQ ID NO: 57

Inieiador 61-67-CPK021-G (de 5' a 3’) ACTTTGGTAAGAGAAAGGAAGACGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCA

CCC

SEQ ID NO: 58

Iniciador 61-67-CPK022-G (de 5' a 3’)

AATATCATAAAAAAAGAGAATCTTTCCCGGGTGGATGGCGGCGTTAGTATCG

AATCGACAGC

SEQ ID NO: 59

Inieiador 61-67-CPK023-G (de 5' a 3’)

GCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCACCCGGGAAAGATTCTCTTTTTT

TATGATATT

SEQ ID NO: 60

Inieiador 61-67-CPK024-G (de 5' a 3’) GTTTAAACGTGTTAACGTTTCTTTCGCCTACGTGGAAGGAGAATC

SEQIDNO :61

Inieiador 61-67-CPK025-G (de 5' a 3')

TCCCCCCGGGTTAAA AAAAATCCTTGGACTAGTCA

SEQ ID NO: 62

Inieiador 61-67-CPK031-G (de 5* a 3*)

TCCCCCCGGGAGTTATGACAATTACAACAACAGAA

SEQ ID NO: 63

Inieiador 61-67-CPK032-G (de 5’ a 3')

TCCCCCCGGGTATAT AT ATATC ATTGTTAT SEQ ID NO: 64

Inieiador 61-67-CPK035-G (de 5' a 3')

TCCCCCCGGG AAAAGTAAGTCAAAAGGCAC SEQ ID NO: 65

Inieiador 61-67-CPK040-G (de 5’ a 3')

TCCCCCCGGGATGGTCTGCTTAAATTTCAT SEQ ID NO: 66 Iniciador 61-67-CPK041-G (de 5' a 3’)

TCCCCCCGGGT AGCTTGT ACCC ATTAA AAG A ATTTT ATCATGCCG

SEQ ID NO: 67

Inieiador 61-67-CPK046-G (de 5’ a 3') TCCCCCCGGGTTTCTCATTCAAGTGGTAAC

SEQ ID NO: 68

Inieiador 61-67-CPK047-G (de 5' a 3’)

TCCCCCCGGGT AAAT AAAGAAAATAAAGTT

SEQ ID NO: 69

Inieiador 61-67-CPK050-G (de 5’ a 3’) AATrTTTGAAAATTCAATATAAATGGCTTCAGAAAAAGAAATTAGGA

SEQ ID NO: 70

Inieiador 61-67-CPK051-G (de 5' a 3') TCCTAATTTCTTTTTCTGAAGCCATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

SEQ ID NO: 71

Inieiador 61-67-CPK052-G (de 5' a 3') AGTTTTCACCAATTGGTCTGCAGCCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTA

SEQ ID NO: 72

Inieiador 61-67-CPK053-G (de 5' a 3')

TAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGGCTGCAGACCAATTGGTGAAAACT

SEQ ID NO: 73

Inieiador 61-67-CPK054-G (de 5' a 3')

AATTnTGAAAATTCAATATAAATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTT

SEQ ID NO: 74

Inieiador 61-67-CPK055-G (de 5' a 3') AACAAAGTTTAGTTGAGAGTTTCATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

SEQ ID NO: 75

Inieiador 61-67-CPK056-G (de 5' a 3*) AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGTCTCAGAACGTTTACATTGTAT

SEQ ID NO: 76

Iniciador 61-67-CPK057-G (de 5' a 3')

AT AC AATGTA AACGTTCTGAGACATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

SEQ ID NO: 77

Inieiador 61-67-CPK058-G (de 5' a 3')

TGC AG A AGTT AAG A ACGGTAAT GAC ATT AT AGTTTTTTCTCCTTGACGTTA

SEQ ID NO: 78

Inieiador 61-67-CPK059-G (de 5' a 3')

TAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGCA

SEQ ID NO: 79

Inieiador 61-67-CPK060-G (de 5' a 3')

A ATTTTT GA AAATTCAATATAAATGT C AG AGTT GAGAGC CTT CAGT G

SEQ ID NO: 80

Inieiador 61-67-CPK061-G (de 5' a 3’) CACTGAAGGCTCTCAACTCTGACATTTATATTGAATTTTCAAAAATT

SEQ ID NO: 81

Inieiador 61-67-CPK062-G (de 5’ a 3’)

GGTAACGGATGCTGTGTAAACGGTCATTATAGTTTTTTCTCCTTGACGTTA

SEQ ID NO: 82

Inieiador 61-67-CPK063-G (de 5' a 3*) TAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGACCGTTTACACAGCATCCGTTACC

SEQ ID NO: 83

Inieiador 61-67-CPK064-G (de 5’ a 3’) AATTTTTGAAAATTCAATATAAATGACTGCCGACAACAATAGTATGC

SEQ ID NO: 84

Inieiador 61-67-CPK065-G (de 5' a 3') GCATACTATTGTTGTCGGCAGTCATTTATATTGAATTTTCAAAAATT SEQ ID NO: 85

Iniciador 61-67-CPK066-G (de 5* a 3')

GGTAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCAGTTGGTACTATTAAGAACAATCAC AGGAAACAGCTATGACC

SEQ ID NO: 86

Iniciador 61-67-CPK067-G (de 5' a 3')

TTCK:GTTTTGTACTTTGGTTCGCTCAATTTTGCAGGTAGATAATCGAAAAGTT GTAAAACGACGGCCAGT

SEQ ID NO: 87

Inieiador 50-56-pwl00-G (de 5' a 3')

GAGTGAACCTGCTGCCTGGCGTGCTCTGACTCAGTACATTTCATAGTGGATGG CGGCGTT AGT ATC

SEQ ID NO: 88

Inieiador 50-56-pwl01-G (de 5' a 3') CGTGTATACGTTTTCCGCTTCTGCTCTTCGTCTTTTCTCTTCTTCCGAT ATCACA ACTGTTACGA

SEQ ID NO: 89

Inieiador PW-91-079-CPK373-G (de 5' a 3') TCGACTACGTCGTAAGGCCGT

SEQ ID NO: 90

Inieiador PW-91-079-CPK374-G (de 5' a 3') GCATCTGTGCGGTATTTCACTATATATATTTCAAGGATATAC

SEQ ID NO: 91

Inieiador PW-91-079-CPK376-G (de 5' a 3*) TATGGTGCACTCTCAGTACAATCTG

SEQ ID NO: 92

Inieiador PW-91-079-CPK375-G (de 5' a 3') GTAT ATCCTTGAAAT ATAT ATAGTGAAATACCGCACAGATGC

Claims (25)

1. Composição de combustível, caracterizada pelo fato de compreender ou de ser obtenível de uma mistura de: (a) limonano; (b) um combustível baseado em petróleo; e (c) um aditivo de combustível, sendo que a quantidade do composto limonano é pelo menos cerca de 11% em volume e a quantidade do combustível baseado em petróleo é pelo menos cerca de 5% em volume, ambas quantidades baseadas no volume total da composição, e sendo que a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C.

2. Composição de combustível, caracterizada pelo fato de compreender ou de ser obtenível de uma mistura de: (a) limonano; (b) um combustível baseado em petróleo; (c) um aditivo de combustível; e (d) um composto aromático, sendo que a quantidade do composto limonano é pelo menos cerca de 11% em volume, a quantidade do combustível baseado em petróleo é pelo menos cerca de 5% em volume, todas as quantidades baseadas no volume total da composição, e sendo que a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C.

3. Composição de combustível de jato, caracterizada pelo fato de compreender: (a) limonano; (b) um combustível baseado em petróleo; e (c) aditivo de combustível de jato, sendo que a quantidade do composto limonano é pelo menos cerca de 11% em volume, a quantidade do combustível baseado em petróleo é pelo menos cerca de 5% em volume, ambas as quantidades baseadas no volume total da composição de combustível de jato, e sendo que a composição de combustível tem uma densidade de cerca de 750 kg/m a cerca de 850 kg/m a 15°C, um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C.

4. Composições de combustível de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadas pelo fato de que o limonano é: <formula>formula see original document page 113</formula> ou uma combinação dos mesmos das mesmas.

5. Composições de combustível de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadas pelo fato de que a quantidade de o limonano é de cerca de 11% em volume a cerca de 15% em volume, baseada no volume total da composição.

6. Composições de combustível de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadas pelo fato de que a quantidade de o limonano é de cerca de 15% em volume a cerca de 80% em volume, baseada no volume total da composição.

7. Composições de combustível de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadas pelo fato de que a quantidade de o limonano é de cerca de 20% em volume a cerca de 75% em volume, baseada no volume total da composição.

8. Composições de combustível de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadas pelo fato de que a quantidade de o limonano é de cerca de 25% em volume a cerca de 75% em volume, baseada no volume total da composição.

9. Composição de combustível de acordo com a reivindicação2, caracterizada pelo fato de que a composição compreende p-cimeno.

10. Composição de combustível de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a quantidade de o composto aromático é no máximo cerca de 25% em volume, baseada no volume total da composição.

11. Composição de combustível de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o combustível baseado em petróleo é querosene.

12. Composição de combustível de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a composição de combustível tem uma densidade de cerca de 750 kg/m3 a cerca de 850 kg/m3 a 15°C.

13. Composição de combustível de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o combustível baseado em petróleo é Jato A, Jato A-I ou Jato B.

14. Composição de combustível de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a composição de combustível atende à especificação ASTM D 1655 para jato A.

15. Composição de combustível de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a composição de combustível atende à especificação ASTM D 1655 para jato A-1.

16. Composição de combustível de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a composição de combustível atende à especificação ASTM D 1655 para jato B.

17. Composição de combustível de jato de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o aditivo de combustível é pelo menos um aditivo selecionado do grupo consistindo de um oxigenado, um antioxidante, um melhorador de estabilidade térmica, um estabilizador, um melhorador de fluxo a frio, um melhorador de combustão, um antiespumante, um aditivo anti-névoa, um inibidor de corrosão, um melhorador de lubricidade, um inibidor de formação de gelo, um aditivo de limpeza de injetor, um supressor de fumaça, um aditivo redutor de arrasto, um desativador de metal, um dispersante, um detergente, um desemulsifieador, um corante, um marcador, um dissipador estático, um biocida, e combinações dos mesmos.

18. Método para preparar uma composição de combustível, caracterizado pelo fato de compreender: (a) contactar um material de partida isoprenóide com hidrogênio na presença de um catalisador para formar um limonano; e (b) misturar o limonano com um combustível baseado em petróleo para preparar a composição de combustível; sendo que a quantidade do composto limonano é pelo menos cerca de 11% em volume e a quantidade do combustível baseado em petróleo é pelo menos cerca de 5% em volume, ambas quantidades baseadas no volume total da composição, e sendo que a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o material de partida isoprenóide é limoneno, β-felandreno, γ-terpineno, terpinoleno, ou uma combinação dos mesmos.

20. Método para preparar uma composição de combustível a partir de um açúcar simples, caracterizado pelo fato de compreender: (c) contactar uma célula capaz de preparar um material de partida isoprenóide com o açúcar simples sob condições adequadas para preparar o material de partida isoprenóide; (d) converter o material de partida isoprenóide em limonano; e (c) misturar o limonano com um combustível baseado em petróleo para preparar a composição de combustível, sendo que a quantidade do composto limonano é pelo menos cerca de 11% em volume e a quantidade do combustível baseado em petróleo é pelo menos cerca de 5% em volume, ambas quantidades baseadas no volume total da composição, e sendo que a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o material de partida isoprenóide é limoneno, β-felandreno, γ-terpineno, terpinoleno, ou uma combinação dos mesmos.

22. Composição de combustível, caracterizada pelo fato de ser preparada pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 21.

23. Veículo, caracterizado pelo fato de compreender um motor de combustão interna, um tanque de combustível conectado no motor de combustão interna, e a composição de combustível no tanque de combustível, sendo que a composição de combustível é uma composição de combustível como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, sendo que a quantidade do composto limonano é pelo menos cerca de 11% em volume e a quantidade do combustível baseado em petróleo é pelo menos cerca de 5% em volume, ambas quantidades baseadas no volume total da composição, e sendo que a composição de combustível tem um ponto de vaporização instantânea igual a ou maior do que 38°C, e sendo que a composição de combustível é usada para acionar o motor de combustão interna.

24. Método para acionar um motor, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de comburir uma composição de combustível como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 no motor.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o motor é um motor a jato.