BRPI0718273A2 - Vacina para aves domésticas, para enterite necrótica, compreendendo um antígeno de toxina clostridium perfringens mutante, e métodos de produção da vacina - Google Patents

Description

Relatório descritivo da Patente de Invenção para "VACINA PARA AVES DOMÉSTICAS, PARA ENTERITE NECRÓTICA, COMPREENDENDO UM ANTÍGENO DE TOXINA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS MUTANTE, E MÉTODOS DE PRODUÇÃO DA VACINA".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O Clostridium perfríngens {"Cp”), um anaeróbio gram-positivo, está associado a diversas doenças, incluindo gangrena gasosa, síndrome de morte súbita infantil e enterite necrótica em galinhas (Titball e co/s., 1999). A enterite necrótica (NE) é uma doença séria, fatal e prevalente na indústria de aves de criação (Justin e co/s., 2002) que é caracterizada por enterotoxemia aguda, que resulta em necrose do intestino delgado e até 50% de mortalida- de, primariamente em galinhas e perus com 2-12 semanas de idade.

O tratamento preventivo com antibióticos é o método predomi- nante atualmente empregado para evitar as infecções por Cp na indústria de aves de criação. Em função da preocupação disseminada em relação ao desenvolvimento de cepas bacterianas resistentes a antibióticos, há uma necessidade antiga de um método alternativo.

O Clostridium perfríngens codifica um gene para uma exotoxina definida como α-toxina. A α-toxina de Cp (cpa) é relatada como o principal determinante de virulência da enterite necrótica, induzindo as lesões necróti- cas debilitantes (Logan e co/s., 1991). A cepa do tipo A de C. perfríngens é a cepa ambiental mais prevalente e produz níveis elevados de α-toxina (Ginter e co/s., 1996).

A α-toxina é uma fosfolipase C (PLC) zinco-dependente de 370 aminoácidos (AA) que possui propriedades tanto enzimáticas quanto tóxicas (Justin e co/s., 2002). Embora a cpa seja uma fosfolipase C com preferência por fosfatidilcolina (PC-PLC), a toxicidade resulta de sua habilidade para hi- drolisar substratos fosfolipídicos fosfatidilcolina e esfingomielina, ambos componentes cruciais de membranas de células eucarióticas (Justin e co/s., 2002). Além das propriedades explícitas de hemólise, necrose, permeabili- zação vascular e agregação plaquetária, a toxina desperta diversos efeitos sutis no metabolismo de células eucarióticas, incluindo a ativação da cascata do ácido araquidônico e a estimulação da atividade de proteína quinase C (Ginter e cols., 1996).

A α-toxina consiste em dois domínios, um domínio a-helicoidal do terminal N e um domínio em sanduíche β de oito fitas do terminal C. O 5 terminal N (resíduos de AA 1-246) contém o sítio ativo de fosfolipase C e três sítios de ligação de íon zinco associados. O terminal C (resíduos de AA 256-370) é responsável pela ligação à membrana cálcio-dependente. Seu papel é facilitar a interação da α-toxina com fosfolipídeos da membrana. O domínio do terminal C é necessário para o reconhecimento de fosfolipídeo, 10 bem como para a atividade hemolítica da α-toxina (Titball e co/s., 1999).

Fragmentos da α-toxina de Clostridium perfringens foram produ- zidos e testados quanto a uma função independente. Em camundongos, fo- ram induzidos anticorpos que reagiam de forma cruzada com a α-toxina de comprimento total após imunização com o domínio do terminal N (Cpa1-249) 15 ou do terminal C (Cpa247-370) da toxina. Fragmentos menores da a-toxina não induziram anticorpos que reagem de forma cruzada. In vitro, anti-Cpal-

249 neutralizou a atividade de fosfolipase C, mas não a atividade hemolítica da toxina. Anti-Cpa247-370 neutralizou tanto a atividade de fosfolipase C quanto a atividade hemolítica. Dos fragmentos do domínio do terminal N e 20 do terminal C, somente a imunização com Cpa247-370 induziu proteção contra os efeitos letais da toxina in vivo. Adicionalmente, a imunização com Cpa247-370 forneceu proteção em um modelo de camundongo contra o or- ganismo inteiro, C. perfringens do tipo A. Esse estudo confirmou o papel es- sencial da α-toxina e, especificamente, do domínio do terminal C da cpa na 25 patogênese da gangrena gasosa (Williamson e Titball, 1993).

A Patente U.S. N2 5.851.827 (Titball e Williamson) está relacio- nada aos peptídeos e às vacinas para a indução da produção de anticorpos dirigidos contra α-toxina de Clostridium perfringens em animais. Aqueles peptídeos compreendem a seqüência de aminoácidos da alfa-toxina dos a- 30 minoácidos 247 a 370, mas não possuem os epitopos necessários para a atividade de hidrólise de fosfolipase C e/ou esfingomielina entre os aminoá- cidos 1 a 240. São ainda fornecidos antisoros e anticorpos despertados con- tra os peptídeos e vacinas e, particularmente, anticorpos monoclonais e li- nhagens de células de hibridoma para sua produção.

A α-toxina produzida pela cepa NCTC 8237 de Clostridium per- fringens demonstrou diferir das α-toxinas produzidas pela maioria das cepas 5 de C. perfringens isoladas de seres humanos e bezerros nas seguintes posi- ções de AA: Ala174 a Asp174; Thr177 a Ala177; Ser335 a Pro335. No en- tanto, essas diferenças não alteravam as propriedades tóxicas da proteína. Além disso, demonstrou-se que uma vacina do domínio do terminal C deri- vada dessa cepa protege contra a α-toxina de uma cepa entérica bovina de 10 C. perfringens (Ginter e cols., 1996).

A mutagênese sítio-dirigida da α-toxina de Clostridium perfrin- gens foi o tema de vários estudos para elucidar os aminoácidos essenciais para as propriedades tóxicas dessa proteína. Nagahama e cols. (1995) rela- taram uma única mutação pontual em AA H-68 ou H-148 substituído com G 15 (H68G ou H148G) resultou na perda completa das atividades hemolíticas, de fosfolipase C, de esfingomielinase e letais da toxina. No entanto, a antigeni- cidade para o antisoro de α-toxina do tipo selvagem era mantida. O mesmo resultado surgiu em decorrência de uma substituição de H148L. Uma muta- ção de H126G, H136G ou H136A reduziu significativamente, mas não elimi- 20 nou, as atividades tóxicas. A mutação em H-46, -207, -212 ou -241 não a- presentou efeitos sobre as atividades biológicas, o que indica que esses re- síduos não são essenciais à toxicidade. A toxina do tipo selvagem e as toxi- nas variantes em H-68, -126 e -136 continham dois átomos de zinco. A toxi- na variante em H-148 possuía somente um átomo de zinco, o que sugere 25 que H-148 se liga firmemente a um átomo de zinco, o que é essencial para o sítio ativo da α-toxina, e que nenhum átomo de zinco associado à toxina do tipo selvagem está associado a H-68, -126 ou -136.

Guillouard e cols. (1996) basearam uma série de estudos de mu- tagênese sítio-dirigida sobre a estrutura cristal de uma PC-PLC de Bacillus cereus, na medida em que o domínio do terminal N da α-toxina de Clostridi- um perfringens é altamente homólogo à sua fosfolipase C completa. As substituições de AA de D56N, H126S, H68S, H148S, H136S, E152S, H11S ou W1S resultaram em uma redução significativa ou eliminação completa das atividades biológicas.

Também com base na estrutura conhecida de B. cereus, Naga- hama e cols. (1997) investigaram o papel de D-56, D-130 e E-152 nas ativi- 5 dades hemolíticas, de fosfolipase C (PLC) e de esfingomielinase (SMase) da α-toxina de Clostridium perfringens. A substituição de D-56 na α-toxina com E1 N1 G ou S resultou na perda completa das atividades hemolíticas, de PLC e de SMase. As toxinas variantes em D-130 mostraram uma redução de a- proximadamente 100 vezes das atividades biológicas, comparadas com as 10 da toxina do tipo selvagem. A substituição de G para E-152 causou a perda completa dessas atividades e manteve a antigenicidade para o antisoro de α-toxina do tipo selvagem. No entanto, E152Q ou E152D resultou em uma redução significativa, mas não na eliminação completa, da toxicidade.

Martin e Hergenrother (1998) estudaram o papel de D-55 na ca- tálise de base geral pela PC-PLC de B. cereus, a posição de AA análoga a D-56 na α-toxina de Clostridium perfringens. Foram feitas substituições com L, N ou E, com L resultando na maior redução da atividade catalítica (9x10' 5% do tipo selvagem).

A seqüência disponível da α-toxina de Clostridium perfringens (cpa) é altamente conservada em isolados bovinos e de mamíferos, como determinado pelos registros no GenBank. Muitas seqüências de DNA dispo- níveis publicamente de isolados de galinha não se estendem no domínio do terminal C (Números de Acesso no GenBank AAL85329, AAL85330, A- AL85331, AAL85332). Foi publicada uma seqüência de alfa-toxina de com- primento total de cisne (Número de Acesso no GenBank AF204209), e a pro- teína codificada é altamente divergente da alfa-toxina isolada da Cepa 13, um isolado humano (Acesso no GenBank CLOPLC05) (Justin e cols., 2002). Recentemente, foram comparadas seqüências da proteína de comprimento total de cpa de 25 isolados de galinha de C. perfringens (Sheedy e co/s., 2004), e verificou-se que contêm apenas pequenas diferenças na seqüência de aminoácidos (uma a seis diferenças da Cepa 13-padrão). Essas variantes de seqüência foram agrupadas em cinco tipos (l-V). BREVE SUMÁRIO PA INVENÇÃO

Esta invenção pertence, em parte, ao desenvolvimento de uma vacina para aves de criação contra enterite necrótica (NE). Esta invenção utiliza fatores virulentos de exotoxina como vacinas, após introdução de mu- 5 tações apropriadas para abolir sua toxicidade. A presente invenção fornece uma vacina para aves de criação contra NE. A vacina utiliza um novo antí- geno protetor que é uma exotoxina de α-toxina de Clostridium perfringens (Cp) (Mcpa) mutada, de comprimento total não-tóxica. A utilidade dessa va- cina foi demonstrada em galinhas por redução da gravidade da lesão da NE 10 após ataque de Cp, por exemplo.

Também são aqui descritos novas abordagens para a produção dessa vacina em quantidades significativas. Uma abordagem exemplificada está relacionada aos sistemas bacterianos de expressão, de preferência ao sistema bacteriano de expressão que utiliza Pseudomonas fluorescens (Pf). Também é revelada uma nova alfa-toxina do Tipo Vl de isolados

de galinha de Cp.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A figura 1 mostra um alinhamento de várias seqüências de ami- noácidos de α-toxina de Clostridium perfringens, isoladas de galinhas, cis- nes, hospedeiros humanos e bovinos.

A figura 2 é um dendograma que ilustra o relacionamento entre seqüências de isolados de Cp de galinha, com base na seqüência de ami- noácidos deduzida de a-toxina.

A figura 3 ilustra as etapas de clonagem envolvidas no construc- to de um vetor para expressão de Mcpa com cauda de histidina no terminal C em E. coli.

A figura 4 ilustra as etapas de clonagem envolvidas no construc- to de um vetor para expressão de Mcpa com cauda de histidina no terminal N em E. coli.

A figura 5 mostra sítios de restrição de um constructo produzida

para a expressão de Mcpa com cauda de histidina em Pseudomonas fluo- rescens. A figura 6 é um mapa de restrição de um constructo produzida para a expressão de Mcpa sem cauda de histidina em Pseudomonas fluo- rescens.

A figura 7 mostra a recuperação de Mcpa sem cauda de histidina de cultura de P. fluorescens com o uso de purificação por cromatografia por troca aniônica e SDS-PAGE de frações eluídas.

A figura 8 demonstra a perda da atividade hemolítica em Mcpa sem cauda de histidina purificada; também é mostrada a presença de hemó- Iise em conseqüência da existência de detergente residual na amostra.

A figura 9 mostra a ausência de atividade de Iecitinase em a- mostras purificadas de Mcpa.

A figura 10 é um gráfico em mosaico de pontuações de lesão por grupo de tratamento, resultantes de um estudo clínico para avaliar a utilidade de Mcpa formulada como uma vacina subcutânea para proteção contra NE. BREVE DESCRIÇÃO DAS TABELAS

A Tabela 1 mostra variações em alfa-toxinas de Cp isoladas de

galinhas.

A Tabela 2 mostra valores para preferência de códons em espé- cies de arroz e tabaco, bem como valores de preferência ponderados usa- dos para o design de genes com expressão ótima tanto no arroz quanto no tabaco.

A Tabela 3 mostra composições de códon de regiões codificado- ras para a proteína de Mcpa.

A Tabela 4 resume resultados finais da atividade hemolítica de amostras de Mcpa purificada e controles.

A Tabela 5 descreve o design do estudo clínico para avaliação de antígenos de Mcpa em galinhas jovens.

A Tabela 6 mostra as pontuações de lesão por grupo de trata- mento do experimento clínico.

A Tabela 7 inclui resultados da análise estatística das pontua- ções de lesão. BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS

O ID. DE SEQ. Ne: 1 é a seqüência de nucleotídeos para a regi- ão codificadora de alfa-toxina nativa de isolados de galinha de C. perfrin- gens.

O ID. DE SEQ. N2: 2 é a proteína de alfa-toxina nativa de isola-

dos de galinha de C. perfringens codificada pelo ID. DE SEQ. Ne: 1.

O ID. DE SEQ. N2: 3 é a seqüência de nucleotídeos para a regi- ão codificadora de planta otimizada para a alfa-toxina madura mutada de C. perfringens.

O ID. DE SEQ. N2: 4 é a seqüência de aminoácidos da alfa-

toxina madura mutada de C. perfringens codificada pelo ID. DE SEQ. N2: 3.

O ID. DE SEQ. N2: 5 é a seqüência de DNA de planta otimizada para peptídeo direcionado ao retículo endoplasmático modificado de zeína de 15 kDa.

O ID. DE SEQ. N2: 6 fornece a seqüência de proteína para o

peptídeo direcionado ao retículo endoplasmático modificado de zeína de 15 kDa.

O ID. DE SEQ. N2: 7 fornece a seqüência de DNA de planta oti- mizada que codifica proteína de alfa-toxina madura mutada de C. perfrin-

gens (Mcpa) com peptídeo dirigido ao retículo endoplasmático de zeína de 15 kDA, e peptídeo de retenção de KDEL ER.

O ID. DE SEQ. N2: 8 fornece uma proteína de fusão da proteína de alfa-toxina madura mutada de C. perfringens (Mcpa) com peptídeo dirigi- do ao retículo endoplasmático de zeína de 15 kDA, e peptídeo de retenção

de KDEL ER.

O ID. DE SEQ. N2: 9 fornece uma seqüência de DNA que codifi- ca Mcpa expressa em Pseudomonas fiuorescens com uma cauda de histidi- na, um sítio de reconhecimento de trombina, uma cauda de S (S-tag) e um sítio de reconhecimento de enteroquinase.

O ID. DE SEQ. N2: 10 fornece uma seqüência de proteína de

Mcpa expressa em Pseudomonas fiuorescens com uma cauda de histidina, um sítio de reconhecimento de trombina, uma cauda de S e um sítio de re- conhecimento de enteroquinase.

O ID. DE SEQ. N-: 11 fornece uma seqüência de DNA que codi- fica Mcpa expressa em Pseudomonas fiuorescens, sem uma cauda de histi- dina, sítio de reconhecimento de trombina, cauda de S e sítio de reconheci- 5 mento de enteroquinase.

O ID. DE SEQ. Ns: 12 fornece uma seqüência de proteína de Mcpa expressa em Pseudomonas fiuorescens, sem uma cauda de histidina, sítio de reconhecimento de trombina, cauda de S e sítio de reconhecimento de enteroquinase.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Esta invenção pertence, em parte, ao desenvolvimento de uma vacina para aves de criação contra enterite necrótica (NE). Esta invenção envolve a utilização de fatores virulentos como, por exemplo, exotoxinas, como vacinas, após serem introduzidas mutações apropriadas para abolir 15 sua toxicidade. A presente invenção fornece uma vacina para aves de cria- ção contra NE. A vacina utiliza uma α-toxina de comprimento total de Clos- tridium perfringens (cpa) que é mutada. A utilidade dessa vacina foi demons- trada por redução da gravidade da lesão da NE em experimentos de ataque por NE.

Caso um antígeno de α-toxina pudesse ser eficaz para proteção

contra NE em aves de criação, ele teria que ser liberado com sucesso para sensibilização e subsequente neutralização da α-toxina, antes do surgimento de lesões necróticas no intestino. Ele também teria que ser não tóxico.

A proteína de comprimento total de α-toxina foi selecionada para 25 avaliação de acordo com a presente invenção em uma tentativa de assegu- rar um enovelamento correto e uma apresentação de antígeno eficaz. No entanto, é necessária uma versão não-tóxica para uso como vacina. Isso pode ser obtido projetando-se várias mutações em cpa para eliminar as ati- vidades tóxicas e minimizar a probabilidade de reversão em um sistema de 30 expressão heterólogo. A vacina de α-toxina produzida de acordo com a pre- sente invenção foi projetada com mutações em 3 sítios específicos (D56L, H148G e E152G) para abolir a toxicidade. A seqüência de cpa disponível publicamente é altamente con- servada em isolados de bovinos e de mamíferos, como determinado a partir dos registros no GenBank. Foi publicada uma seqüência de α-toxina de comprimento total de cisne, mas ela é altamente divergente (Justin e cols., 5 2002). Foi obtido DNA genômico de dois isolados de Cp derivada de intesti- no de galinha (Benchmark Biolabs, Inc., Lincoln, NE) e os genes de a-toxina foram totalmente sequenciados. Não foi detectada nenhuma diferença entre os dois isolados de galinha. A seqüência de aminoácidos resultante foi ali- nhada com dados publicados e foi determinada como sendo altamente ho- 10 móloga e um isolado intestinal bovino CER89L43 (veja a Figura 1). A Figura

1 mostra um alinhamento da seqüência de alfa-toxina em questão de isola- dos de Clostridium perfringens, BBL1 e BBL2 (alfa-toxina de galinha BBL) com as seqüências dos Tipos I-V de Sheedy e cols. (2004) e com as se- qüências de cpa de cisne, humana, bovina e mutante em questão. Como 15 ilustrado na Figura 2, o gene de BBL parece ser um exemplo de um novo Tipo VI, mais relacionado intimamente ao Tipo IN. A Figura 2 é um dendo- grama que ilustra o relacionamento dos isolados de Cp de galinha. Essa no- va classe de toxinas e genes é um aspecto da presente invenção.

Foram selecionadas três posições de aminoácidos de cpa para 20 mutação para a produção de uma versão não-tóxica de cpa, potencialmente retendo-se ao mesmo tempo a imunogenicidade. A posição 56 (ácido aspár- tico) é um sítio catalítico de cpa. Foram selecionadas duas posições para uma possível interferência com a ligação de zinco: histidina em #148 e ácido glutâmico em #152. Portanto, foram feitas as seguintes substituições na se- 25 quência de cpa derivada de galinha para uso como o antígeno de NE de comprimento total mutado: D56L; H1480; E152G (veja a Figura 1).

Também é aqui descrita uma nova abordagem para a produção dessa vacina em quantidades significativas. A abordagem exemplificada es- tá relacionada aos sistemas bacterianos de expressão — de preferência, um sistema bacteriano de expressão que utiliza o sistema de Pseudomonas flu- orescens descrito, por exemplo, na Patente U.S. N2 4.861.595.

Os estudos feitos até hoje indicam que a proteína de a-toxina mutada pode ser expressa em quantidades significativas em P. fiuorescens. A proteína purificada superexpressa foi testada in vitro e verificou-se que não possui atividades hemolíticas ou de lecitinase. In vivo, ela demonstrou eficácia como vacina. Esses resultados exemplificam o uso de P. fluores- 5 cens como um sistema muito adequado para a expressão de proteínas can- didatas à vacina. Esse sistema não apenas gera um nível de expressão ele- vado de vacinas para a saúde animal, mas a maioria das proteínas produzi- das está na forma solúvel. Os rendimentos variam de 10 a 100 mg/l em "shake flask", dependendo do tipo de proteína; sob condições controladas do 10 fermentador, esses rendimentos podem ser aumentados várias vezes, o que torna a produção de vacina rentável e econômica.

Um dos objetivos desse trabalho foi gerar antígeno expresso para proteger aves domesticadas contra enterite necrótica (NE). Dessa for- ma, a presente invenção está relacionada às estratégias projetadas para 15 combater a doença NE. Uma estratégia (e uma modalidade) da presente invenção envolve a produção, em culturas bacterianas, de uma versão mu- tada de um fator de virulência crucial, α-toxina de Cp, para uso como vacina. Adicionalmente, uma proteína recombinante purificada pode ser usada para aplicações que incluem a produção de antisoros (coelho ou camundongo), 20 avaliação de monoclonais para desenvolvimento/otimização de ensaios imu- noabsorventes ligados à enzima (ELISA), e para a geração de um controle positivo no desenvolvimento/otimização de Western blot.

Uma alfa-toxina mutada de comprimento total (Mcpa) foi testada como um candidato a vacina. Para validá-la como candidato a vacina, foi 25 necessária uma quantidade suficiente de proteína pura para a realização de estudos clínicos para examinar se Mcpa fornece proteção contra NE. Para permitir a realização dos estudos clínicos e para desenvolver reagentes para avaliação da expressão de antígenos de NE em sistemas heterólogos, a pro- teína foi expressa e purificada de células bacterianas. Mcpa foi expressa até 30 um nível muito elevado em E. coli como uma fusão de glutationa S- transferase (GST); no entanto, os esforços para purificar Mcpa da cauda de GST com o uso de um sítio de clivagem de enteroquinase (EK) foram preju- dicados em função da sensibilidade da Mcpa à EK.

Portanto, Mcpa foi produzida em Pseudomonas fiuorescens (Pf) com uma cauda menor, purificada, testada quanto à ausência de toxicidade, e foi obtida uma quantidade suficiente para os experimentos clínicos e para 5 a produção de anticorpos. A proteína produzida por Pf despertou uma res- posta imunológica em galinhas e, quando administrada como uma vacina subcutânea, reduziu a gravidade de lesões de NE induzidas por Cf.

Adicionalmente, foi produzido um antígeno de Mcpa sem cauda para caracterizar mais plenamente a capacidade antigênica da proteína. 10 Dessa forma, o gene foi modificado para excluir todas as caudas molecula- res. A Mcpa sem cauda de histidina foi expressa em P. fiuorescens, subse- quentemente purificada, e testada quanto à ausência de toxicidade. A Mcpa sem cauda de histidina também despertou uma resposta imunológica em galinhas e reduziu a gravidade de lesões de NE, quando administrada como 15 uma vacina subcutânea.

Além disso, foi iniciado um projeto de pesquisa para explorar a possibilidade de produção de uma vacina contra NE (alfa-toxina) em cultura de células em suspensão de planta para uso comercial no controle de NE na indústria de aves de criação. Foi gerada um constructo binária de planta pa- 20 ra expressar uma forma não ativa da α-toxina (os sítios de fosfolipase de ligação de zinco foram mutados por meio de 3 substituições únicas de ami- noácido) em um esforço para determinar se a proteína gerada por plantas poderia produzir uma resposta imunológica à toxina mutada. A seqüência de nucleotídeos também foi reprojetada para utilizar códons para expressão 25 otimizada, de preferência, em células de plantas de arroz e/ou tabaco.

Foi obtida nesses sistemas de plantas, com sucesso, a expres- são. Embora os testes clínicos de antígenos produzidos por plantas não te- nham gerado inicialmente indicações de eficácia, formulações de liberação específica e semelhantes poderiam ser otimizados para solucionar essas questões.

Uma planta, célula de planta "transgênica", e semelhantes, é definida como uma planta inteira, uma célula de planta, uma cultura de célu- Ias de plantas, linhagem de células de plantas, cultura de tecido de planta, planta inferior, cultura de células de plantas monocotiledôneas, cultura de células de plantas dicotiledôneas, ou prole destas derivada de uma célula de planta transformada ou protoplasto que contém DNA estranho, introduzido 5 por técnicas laboratoriais, que não está presente originalmente em uma célu- la de planta nativa não transgênica da mesma espécie. Os termos "planta transgênica” e "planta transformada" foram usados algumas vezes na técni- ca como termos sinônimos para definir uma planta cujo DNA contém uma molécula de DNA exógeno. Uma planta transgênica pode ser transformada 10 de forma estável para conter DNA estranho que funciona e é incorporado no DNA genômico da planta, ou é uma planta transgênica que foi transformada por vetores de base viral e que expressou transitoriamente o DNA estranho.

Para a prática da presente invenção, pode ser preferível trans- formar linhagens de células de plantas que possam ser cultivadas e escalo- 15 nadas rapidamente. O uso de culturas de células de plantas evita a produ- ção em campo aberto e reduz acentuadamente as probabilidades de escape de gene e contaminação de alimentos. Culturas de células de tabaco em suspensão como, por exemplo, NT-1 e BY-2 (Kato e cols. 1972, "Proc. IV IFS: Ferment. Technol. Today" 689-695; An, G., 1985 Plant Physiol. 79, 568- 20 570; Nagata e cols. 1992, "International Review of Cytology" 132, 1-30.), são algumas das modalidades preferidas, pois essas linhagens são particular- mente suscetíveis à manipulação em cultura, são prontamente transforma- das, produzem eventos integrados de forma estável, e são passíveis de crio- preservação.

Dessa forma, a linhagem de células de tabaco em suspensão,

NT-1, é adequada à prática da presente invenção. As células NT-1 foram desenvolvidas originalmente a partir de Nicotiana tabacum L.cv. bright yellow 2. A linhagem de células NT-1 é amplamente usada e facilmente disponível; no entanto, praticamente qualquer linhagem de células em suspensão (de tabaco ou de outro tipo) pode ser usada para a prática da invenção. Além disso, a linhagem de células é variável e irá se alterar em resposta às condi- ções de cultura. Células NT-1 adequadas ao uso estão disponíveis pela "A- merican Type Culture Collection" sob número de acesso ATCC N2 74840. Veja também a Patente U.S. N2 6.140.075.

Culturas de células de plantas para a produção das vacinas em questão podem conter linhagens de células de plantas transformadas deri- vadas de uma planta inferior, uma planta dicotiledônea, ou uma planta mo- nocotiledônea. Exemplos não-limitantes de plantas dicotiledôneas das quais as linhagens de células transformadas podem ser derivadas são tomate, ba- tata, batata doce, mandioca, legumes, incluindo alfafa e soja, cenoura, mo- rango, alface, carvalho, bordo, noz, rosa, hortelã, girassol, açafroa, algodão, tabaco, abóbora, margarida, canola ou cacto. Algumas linhagens preferidas incluem linhagens de células de tabaco como, por exemplo, NT-1 ou BY-2. Quando a linhagem de células de plantas transformadas for derivada de uma planta monocotiledônea, poderão ser utilizadas plantas como trigo, grama, gramados, cereal, milho, arroz, aveia, trigo, cevada, sorgo, orquídea, íris, lírio, cebola, banana, cana de açúcar, sorgo ou palmeira para estabelecer a linhagem de células de plantas. Adicionalmente, podem ser estabelecidas linhagens de células a partir de plantas inferiores como, por exemplo, sa- mambaias, gimnospermas, coníferas, cavalinhas, "dub mosses", "liver warts", "hornworts", musgos, algas vermelhas, algas marrons, gametófitos, esporófitos de pteridófitos ou algas vermelhas. Algumas culturas de células de plantas preferidas podem ser derivadas de plantas de milho, arroz ou ta- baco.

O constructo de cassetes gênicos para a transformação de plan- tas ou de culturas de células de plantas transformadas pode ser facilmente obtida pela utilização de métodos bem conhecidos, tais como aqueles reve- lados em Sambrook e cols. (1989); e Ausubel e co/s., (1987) "Current Proto- cols in Molecular Biology", John Wiley e Sons, Nova York, NY.

Após a preparação de uma linhagem de células de plantas trans- formadas de forma estável, as culturas podem ser finalizadas por confirma- ção da inserção gênica (evento genético) com o uso de amplificação por PCR da inserção gênica inteira, seguida por digestão com enzima de restri- ção. Os meios para as placas de ágar e culturas de suspensão podem se basear em meios comuns de cultura de plantas (Murashige e Skoog; MS). Dessa forma, a presente invenção inclui culturas de células de plantas e métodos de cultivo e armazenamento de células de plantas para a produção de vacinas para NE. Outros aspectos da invenção fornecem um sistema de produção de vacina produzida por célula de planta.

O termo "aves de criação" é aqui definido como qualquer ave domesticada mantida para a produção de ovos ou carne, especialmente ga- linha, peru e avestruz.

Os termos "isolado" e "purificado" sugerem a "mão do homem", e podem se aplicar aos polinucleotídeos e às proteínas. Um polinucleotídeo clonado é um polinucleotídeo isolado, por exemplo.

Uma vacina é uma composição usada para vacinar um animal, que contém pelo menos um agente proteináceo que induz a estimulação do sistema imunológico do hospedeiro e evita ou atenua a patologia indesejada subsequente associada às reações do hospedeiro às exposições subse- quentes do patógeno.

Um organismo patogênico é uma bactéria, um vírus, um fungo ou protozoário que causa uma doença ou uma condição fisiológica induzi- da/controlada em um animal ou hospedeiro o qual infectou.

Um adjuvante é uma substância que acentua, aumenta, modera ou intensifica a resposta imunológica a um imunógeno ou antígeno. Adjuvan- tes tipicamente intensificam tanto a resposta imunológica humoral quanto a resposta imunológica celular, mas uma resposta aumentada de um tipo na ausência do outro também define um adjuvante. Além disso, adjuvantes e seus usos são bem conhecidos pelos imunologistas, e são tipicamente em- pregados para intensificar a resposta imunológica quando as doses de imu- nógeno são limitadas, quando o imunógeno é fracamente imunogênico ou quando a via de administração é subótima. Dessa forma, o termo "quantida- de de adjuvante" é aquela quantidade de adjuvante capaz de intensificar a resposta imunológica a certo imunógeno ou antígeno. A massa que eqüivale a uma "quantidade de adjuvante" irá variar, e depende de diversos fatores que incluem, sem limitação, as características do imunógeno, a quantidade de imunógeno administrada, a espécie do hospedeiro, a via de administra- ção e o protocolo para administração do imunógeno. A "quantidade de adju- vante" pode ser facilmente quantificada por experimentação de rotina, consi- derando certo conjunto de circunstâncias específico. Isso faz parte dos co- nhecimentos daqueles versados na técnica e tipicamente utiliza determina- ções rotineiras de dose-resposta às quantidades variáveis administradas de imunógeno e de adjuvante. As respostas são medidas por determinação das titulações séricas de anticorpo ou de respostas mediadas por células desper- tadas contra o imunógeno com a utilização de ensaios imunoabsorventes ligados à enzima, radioimunoensaios, ensaios de hemaglutinação e seme- lhantes.

Uma "dosagem eficaz" é uma quantidade necessária para indu- zir uma resposta imunológica em um animal suficiente para que o animal efetivamente resista a um ataque montado por um agente patogênico. As dosagens administradas a esse animal serão determinadas por um médico, veterinário ou cientista treinado à Iuz das circunstâncias relevantes, que in- cluem a partícula imunoprotetora específica ou combinação de partículas, a condição e o tamanho do animal, e a via de administração escolhida. Algu- mas dosagens eficazes serão apresentadas nos Exemplos abaixo.

Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser modifica- dos para que tenham uso de códons que seja otimizado para expressão em vários sistemas heterólogos. Essas técnicas são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. 6.013.523 e 6.015.891. O gene de Mc- pa aqui revelado foi códon-otimizado para expressão em cultura de células de plantas de tabaco ou arroz. Surpreendentemente, a mesma seqüência de nucleotídeos resultou em um rendimento elevado em E. coli e P. fluores- cens. P. fiuorescens é o sistema de expressão preferido para recuperação de antígeno de Mcpa solúvel.

A presente invenção também inclui seqüências de DNA que possuem homologia de seqüência substancial com as seqüências descritas que codificam antígenos imunoprotetores. Como usado no presente pedido, o termo "homologia de seqüência substancial" é usado para indicar que uma seqüência de nucleotídeos (no caso de DNA ou RNA) ou uma seqüência de aminoácidos (no caso de uma proteína ou polipeptídeo) exibe equivalência funcional ou estrutural substancial com outra seqüência de nucleotídeos ou aminoácidos. Quaisquer diferenças funcionais ou estruturais entre sequên- 5 cias que possuem homologia, identidade ou similaridade de seqüência subs- tancial serão mínimas; ou seja, elas não afetarão a habilidade da seqüência para funcionar como indicado no presente pedido. Seqüências que possuem homologia de seqüência substancial com as seqüências aqui reveladas são normalmente variantes da seqüência revelada, por exemplo, mutações, mas 10 também podem ser seqüências sintéticas.

Modalidades da presente invenção podem incluir variantes que possuem 90, 91, 92, 93 e 94% de identidade e, mais preferivelmente, aque- las que possuem 95, 96, 97, 98 e 99% de identidade com uma seqüência exemplificada, e que funcionam como equivalentes substanciais. Essas alte- 15 rações, incluindo alterações conservadoras e/ou, em alguns casos, não con- servadoras, ocorrem em partes dessas seqüências que não são críticas para a funcionalidade. Técnicas exemplares para a modificação de seqüências de oligonucleotídeos incluem a utilização de mutagênese sítio-dirigida mediada por polinucleotídeos, e são descritas, por exemplo, em Zoller e cols. (1984); 20 Higuchi e cols. (1988); Ho e cols. (1989); Horton e cols. (1989); e "PCR Te- chnology: Principies and Applications for DNA Amplification", (ed.) Erlich (1989).

O uso de metodologias de engenharia genética é bem conhecido na técnica. A reconstrução apropriada do gene e o seu posicionamento ade- 25 quado em um vetor de plasmídeo hospedeiro entre um promotor, possivel- mente um promotor regulado forte e finalizadores de transcrição/tradução podem obter a expressão da Mcpa em um hospedeiro estranho em particu- lar. A adequabilidade de qualquer hospedeiro desse tipo também pode ser testada por meios conhecidos por aqueles versados na técnica.

Após as células microbianas transformadas (preferivelmente

Pseudomonas fiuorescens) terem expressado a Mcpa até um nível desejado (geralmente um nível elevado), as células podem ser coletadas, lisadas, pu- rificadas e formuladas com adjuvante. Nesse aspecto da invenção, são pre- paradas composições que contêm proteínas recombinantes purificadas, que podem ser administradas em quantidades suficientes para induzir um efeito biológico desejado.

A presente invenção fornece composições de Mcpa ativa, inclu- indo aquelas nas quais a Mcpa foi produzida em sistemas microbianos. As células da presente invenção podem ser liberadas por meio de administra- ção oral, nasal, ocular ou por injeção parental. Esses métodos de inoculação também podem ser usados para o tratamento de animais que não são aves. Os métodos da presente invenção também podem ser usados para abreviar a NE. Essas vacinas podem ser intensificadas por um adjuvante e/ou acele- rador da resposta imunológica por meio da administração da proteína re- combinante purificada e do adjuvante em quantidades suficientes para indu- zir um efeito biológico desejado.

Células microbianas adequadas para uso na presente invenção incluem procariotas (organismos tanto Gram-positivos quanto Gram- negativos) e eucariotas inferiores, por exemplo, fungos. As espécies de célu- las bacterianas adequadas na presente invenção incluem aquelas dos gêne- ros: 1) Enterobacteriaceae, incluindo as espécies dos gêneros Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella e Proteus; 2) Bacillaceae\ 3) Rhizobiaceae, por exemplo, Rhizobium\ 4) Spirillaceae, por exemplo, fotobactérias, Zymomo- nas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, DesuIfovibrio, Spirillum] 6) Lactobacillace- ae; 7) Pseudomonadaeeae, por exemplo, Pseudomonas e Aeetobaeter, 8) Azotobaeteraceae e Nitrobaeteraeeae. Outros organismis adequados inclu- em eucariotas inferiores, fungos (por exemplo, Phycomyeetes e Ascomyee- tes), leveduras (por exemplo, Saccharomyees e Schizosaceharomyees), le- vedura Basidiomyeetes (por exemplo, Rhodotorula, Aureobasidium, Sporo- bolomyees), e semelhantes.

O hospedeiro celular que contém um ou mais genes heterólogos pode crescer em qualquer meio nutriente conveniente, no qual o constructo de DNA forneça uma vantagem seletiva (por exemplo, crescimento em um meio seletivo contendo antibióticos), pelo fornecimento de um meio seletivo de tal forma que substancialmente todas as células retenham o(s) gene(s) heterólogo(s). Essas células podem então ser coletadas de acordo com for- mas convencionais.

Podem ser usadas vários constructos, o que inclui sistemas de replicação de plasmídeos, vírus ou centrômeros em combinação com seg- mentos replicantes autônomos (ars) para manutenção estável. Quando se deseja somente integração, podem ser usadas construções que possam permitir a replicação, e sejam transposons ou possuam atividade de inserção semelhante a transposon ou apresentem homologia com o genoma do hos- pedeiro. Frequentemente são empregadas seqüências de DNA que possu- em o gene heterólogo entre seqüências que são homólogas às seqüências no genoma do hospedeiro, cromossômica ou de plasmídeo. O(s) gene(s) heterólogo(s) pode estar presente em múltiplas cópias. Veja, por exemplo, a Patente U.S. N2 4.399.216. Dessa forma, podem ser empregadas conjuga- ção, transdução, transfecção e transformação para introdução do gene hete- rólogo.

Em modalidades nas quais é empregado um elemento extra- cromossômico, o constructo de DNA desejavelmente incluirá um marcador que permite uma seleção daquelas células hospedeiras que contêm o cons- tructo. O marcador é comumente um que forneça resistência a biocidas, por exemplo, resistência a antibiótico ou resistência a metal pesado, comple- mentação que permita prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, ou semelhan- te. Os sistemas de replicação podem fornecer propriedades especiais, por exemplo, replicação "runaway", podem envolver células COS ou outros re- cursos especiais.

Gene(s) heterólogo(s), que possuem sinais reguladores da inici- ação e terminação da transcrição e da tradução reconhecidos pela célula hospedeira, podem ser empregados em conjunto com o gene heterólogo. A seqüência de DNA pode ser manipulada de tal forma que seja fornecida uma seqüência reguladora de iniciação da transcrição que seja diferente daquela natural.

Existe uma ampla variedade seqüências de iniciação da trans- crição para uma ampla variedade de hospedeiros. A seqüência pode permitir a expressão constitutiva do gene de Mcpa ou a expressão regulada, em que a regulação pode ser indutível por uma substância química, por exemplo, um metabólito, por temperatura ou por um repressor regulável. Veja, por exem- 5 pio, a Patente U.S. N2 4.374.927. A escolha específica do promotor depen- derá de diversos fatores, da potência do promotor, da interferência do pro- motor com a viabilidade das células, do efeito dos mecanismos reguladores endógenos á célula sobre o promotor, e semelhantes. Há diversos promoto- res disponíveis por várias fontes, incluindo fontes comerciais.

Vetores adequados à expressão da Mcpa são conhecidos por

aqueles versados na técnica. Da mesma forma, genes heterólogos que codi- ficam cpas nativos são conhecidos por aqueles versados na técnica. Se- qüências de polipeptídeos e seqüências codificadoras podem ser obtidas de diversas fontes, incluindo várias bases de dados de patentes e outras bases 15 de dados disponíveis publicamente (por exemplo, as bases de dados de áci- dos nucléicos e de proteínas encontradas na "National Library of Medicine" ou no "European Molecular Biology Laboratory"). Em alguns aspectos da presente invenção, as células microbianas são manipuladas para expressar várias combinações de cpas.

A presente invenção fornece métodos de indução e/ou acelera-

ção de uma resposta imunológica em um indivíduo que compreendem as etapas de administração a uma ave de criação de uma composição que compreende Mcpa purificada e uma ou mais moléculas adjuvantes em uma quantidade eficaz para despertar uma resposta imunológica no referido ani- mal.

A presente invenção fornece métodos para a estimulação e/ou modulação do sistema imunológico de uma ave de criação em que o referido método compreende a administração de uma composição que contém prote- ína de Mcpa expressa de acordo com os ensinamentos da presente inven- ção.

Em outras modalidades, a presente invenção inclui composições que contêm uma (pelo menos uma) nova Mcpa da presente invenção, que modulam um efeito biológico desejado. Essas composições são administra- das em quantidades eficazes para estimular, modular, afetar ou produzir um efeito biológico desejado (por exemplo, resistência bacteriana).

O efeito biológico desejado pode ser selecionado, por exemplo, 5 do grupo que consiste em: 1) ativação ou estimulação de macrófagos em um indivíduo; 2) estimulação ou modulação do sistema imunológico de um indi- víduo; e 3) aumento da resistência bacteriana em um indivíduo.

Dessa forma, a presente invenção fornece diversas modalidades e aspectos não-limitantes que incluem:

- Vacina que compreende proteína derivada de um ou mais ge-

nes heterólogos que codificam um antígeno protetor modificado contra uma alfa-toxina de C. perfringens (Mcpa);

- a referida vacina, em que os genes heterólogos estão contidos em um único vetor;

- a referida vacina, em que os genes heterólogos estão contidos

em vários vetores;

- a referida vacina, em que a célula microbiana é de organismos Gram-positivos, Gram-negativos ou de um eucariota inferior, por exemplo, fungos;

- a referida vacina, em que o sistema de expressão microbiano é

Pseudomonas fiuorescens.

A presente invenção também inclui um método de indução e/ou aceleração de uma resposta imunológica em uma ave de criação individual, incluindo um indivíduo em diversas aves de criação, a um antígeno ou imu-

25 nógeno, que compreende as etapas de administração, ao referido indivíduo:

- uma vacina que compreende um ou mais genes heterólogos que codificam uma Mcpa;

- e, opcionalmente, um lipopolissacarídeo (LPS), por exemplo, em uma quantidade eficaz para despertar uma resposta imunológica.

Modalidades adicionais da presente invenção podem ser usadas

para evitar NE em aves de criação (por exemplo, galinhas), incluindo a pro- teção de galinhas recém-nascidas, adolescentes e adultas do surgimento da referida doença ou sintomas da doença.

As composições da presente invenção podem ser administradas por via oral, parenteral, como sprays (incluindo sprays de inalação), por via tópica, retal, nasal, bucal, vaginal ou por meio de um reservatório implanta- do. O termo "parenteral", como aqui usado, inclui injeção subcutânea, intra- dérmica, intravenosa, intra-atrial, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intra-esternal ou intracraniana, e outras técnicas de infusão. As composições podem ser formuladas em qualquer veículo adequado, in- cluindo, por exemplo, veículos descritos em E.W. Martin1S "Remington's Pharmaceutical Science", Mack Publishing Company, Easton, PA.

Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios e publicações aqui referidas ou citadas são incorporadas por referência em sua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas, na medida em que não sejam inconsistentes com os ensinamentos explícitos desta especificação.

A seguir, serão apresentados exemplos que ilustram procedi- mentos para a prática da invenção. Esses exemplos não devem ser conside- rados como limitantes. Todas as percentagens são por peso, e todas as pro- porções de misturas solventes são por peso, a menos que observado de forma diferente.

Abreviações usadas: SDS-PAGE, dodecil sulfato de sódio- eletroforese em gel de poliacrilamida; dl, deionizada; DTT, ditiotreitol; TRIS, cloridrato de tris(hidroximetil) aminometano; MWCO, valor de corte do peso molecular; bp, pares de base; TAE, Tris Acetato EDTA, MSG, glutamato mo- nossódico; CV, volume de coluna; PBS, solução salina tamponada com fos- fato

EXEMPLOS EXEMPLO 1

CLONAGEM E SEQUENCIAMENTO DE UM GENE DE ALFA-TOXINA DE COMPRIMENTO TOTAL (cpa) DE ISOLADOS DE C. PERFRINGENS DE- RIVADOS DE GALINHAS

Este exemplo descreve o isolamento e determinação da se- qüência de base de fragmentos de DNA que contêm porções superpostas de um gene que codifica uma proteína de alfa-toxina (cpa) de duas cepas de Clostridium perfringens. Essas cepas (BBL1 e BBL2) foram isoladas em Benchmark BioLabs (Lincoln, Nebraska) do intestino de galinhas diagnosti- cadas com enterite necrótica de ocorrência natural. Os dois isolados vieram 5 de aves diferentes do mesmo rebanho e tinham características diferentes quando crescidos em laboratório (por exemplo, diferiam na quantidade de cpa que secretaram nos filtrados da cultura).

DNA genômico foi preparado a partir de células de BBL1 e BBL2 e usado como o modelo para reações em cadeia de polimerase (PCR) para amplificar fragmentos superpostos dos genes de cpa. Foram projetadas se- qüências iniciadoras pelas seqüências de DNA dos genes de cpa altamente conservados de isolados humanos de C. perfringens (Números de Acesso no GenBank CLOPLC, CL0PLC05 e NC 003366). Foram escolhidos pares de iniciadores para amplificar fragmentos superpostos que juntos continham a seqüência de DNA de toda a região codificadora proteína de cpa e uma pequena quantidade de seqüências flanqueadoras 5' e 3'. O Par de Iniciado- res Um consistiu no Iniciador Direto (forward) PLC 5'ES (5'- GGTATAATTT- CAGTGCAAGTGTTAATCGTTATC-3') e no Iniciador Reverso PLC INTR1 (5-CCATCCTTTGTTTTGATTCCAAAATAC-3') e produziu um produto de amplificação de 1.019 pares de base. O Par de Iniciadores Dois consistiu no Iniciador Direto PLC INTF1 (5- GAAAATTTTCAGCATTAGCTAGATATGA- ATGG-3') e no Iniciador Reverso PLC 3'R (5'- AGCTTTTATTTTGTAAA- TACCACCAAAACC-3') e produziu um produto de amplificação de 869 pares de base. Os dois produtos de amplificação eram superpostos em 558 pares de base. As reações de PCR continham (volume final de 25 μΙ) 214 ng (B- BL1) ou 275 ng (BBL2) de modelo de DNA, 50 pmol de cada um dos Inicia- dores Diretos e Reversos apropriados, 1 X Tampão D FailSafe® (Epicentre®, Madison, Wisconsin), e 1,25 unidades de Mistura de Enzima FailSafe®. A amplificação ocorreu durante 20 ciclos de: 96°, 30 seg; 45°, 30 seg; 72°, 30 seg; seguida por extensão por 10 minutos a 72°. Os produtos de PCR foram clonados no vetor TOPO TA 2.1 de acordo com as instruções do fornecedor (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) e transformados por métodos padronizados em células TopIO de Escherichia coli (E. coli) (Invitrogen). Os tamanhos da inserção de plasmídeos recombinantes preparados de colônias individuais foram analisados por digestão com enzima de restrição, e foram preparados plasmídeos de clones que possuem os tamanhos adequados para análise 5 de seqüência de DNA. As seqüências de DNA das inserções de um clone de cada produto de amplificação de cada cepa foram determinadas por "Dye Terminator Cycle Sequencing Quick Start Master Mix", de acordo com as recomendações do fornecedor (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, Califórnia). As seqüências superpostas de cada cepa foram montadas em uma única 10 seqüência de DNA que contém um quadro de leitura aberta (ORF) não inter- rompido que codifica uma proteína de alfa-toxina (cpa). A comparação das seqüências de DNA dos ORFs de cpa de BBL1 e BBL2 mostrou que elas eram idênticas (ID. DE SEQ. N-: 1) e, dessa forma, codificavam proteínas idênticas (ID. DE SEQ. N-: 2). A proteína de pró-toxina alfa de 398 aminoá- 15 cidos dessas cepas de BBL constitui uma nova classe (Tipo VI) de alfa- toxinas de galinha, como resumido na Tabela 1. A Tabela 1 mostra os resí- duos de aminoácidos (AA) presentes nas posições variantes das proteínas de alfa-toxina; todos os aminoácidos são idênticos nas 7 proteínas examina- das.

De acordo com os resultados de estudos de proteínas de alfa-

toxina de outros isolados de C. perfringens, é previsto que os primeiros 28 resíduos de aminoácidos do ID. DE SEQ. Ns: 2 constituem um peptídeo si- nalizador de secreção que é removido durante a secreção da pró-toxina pela célula bacteriana, e que a alfa-toxina madura compreende os aminoácidos 29-398 do ID. DE SEQ. Ns: 2 (370 aminoácidos).

EXEMPLO 2

PROJETO E SÍNTESE DE UM GENE MUTADO DE ALFA-TOXINA (Mcpa) DE COMPRIMENTO TOTAL GENE PARA EXPRESSÃO EM CÉLULAS DE PLANTA

Otimização de seqüências para expressão em plantas. Para se

obter alta expressão de genes heterólogos em plantas, pode ser preferível remodelar os referidos genes de forma que eles sejam expressos mais efici- entemente em células de plantas. Arroz e tabaco são duas dessas plantas nas quais pode ser preferível remodelar o(s) gene(s) heterólogo(s), antes da transformação para aumentar o nível de expressão (ou seja, produzir mais proteína) em uma célula de planta transgênica. Portanto, uma etapa no pro- 5 jeto de genes que codificam uma alfa-toxina bacteriana para expressão em plantas (ou seja, além do fornecimento de elementos promotores de gene de planta, íntrons, regiões não traduzidas 3' etc.) é a remodelação de uma regi- ão codificadora de proteína do gene heterólogo para expressão ótima.

Um motivo para a remodelagem de uma seqüência codificadora de alfa-toxina bacteriana para expressão em células de plantas é por causa do teor não ótimo de G + C do gene nativo. Por exemplo, o teor de G + C muito baixo de muitos genes bacterianos nativos (e conseqüente desvio em direção ao alto teor de A + T) resulta na geração de seqüências que mimeti- zam ou duplicam seqüências de controle de gene de planta são sabidamen- te altamente ricas em A + T. A presença de algumas seqüências ricas em A + T dentro do DNA codificador de proteína de genes introduzidos em plantas (por exemplo, regiões TATA box normalmente encontradas em promotores de gene de planta) pode resultar na transcrição aberrante dos genes. Por outro lado, a presença de outras seqüências reguladoras que residem no mRNA transcrito (por exemplo, seqüências sinalizadoras de poliadenilação (AAUAAA), ou seqüências complementares aos pequenos RNAs nucleares envolvidos no splicing pré-mRNA), pode levar à instabilidade do RNA. A aná- lise intensa dos 1.197 pares de base (bp) da seqüência de DNA da região codificadora nativa da alfa-toxina de C. perfringens aqui revelada como ID. DE SEQ. Ne: 1 revelou a presença de vários motivos de seqüência que su- postamente são prejudiciais à expressão de planta ótima, além de uma composição de códon não ótima. Dessa forma, um objetivo no design dos genes de planta otimizados que codificam uma alfa-toxina bacteriana é a geração de uma seqüência de DNA que tenha natureza mais "próxima de planta", e na qual as modificações da seqüência não prejudiquem a tradução ou criem instabilidade do mRNA.

Existem várias bases de dados de seqüências de DNA disponí- veis publicamente nas quais é possível encontrar informações sobre os teo- res de G + C de genomas de planta ou de regiões codificadoras de proteína de vários genes de planta. Uma dessas bases de dados está localizada no endereço da Internet (URL) http://vvww.kazusa.or.jp/codon/. Nessa página 5 da Internet, pode-se verificar que o teor de G + C médio de seqüências codi- ficadoras de proteína do tabaco (Nicotiana tabacum) é de 43,3% (análise de 1.268 seqüências que compreendem 453.797 códons). Pode-se também verificar que o teor de G + C médio de seqüências codificadoras de proteína do arroz (Oryza sativa cultivar japonica) é de 55% (análise de 32.630 se- 10 quências que compreendem 12.783.238 códons). Em comparação, o teor de G + C da seqüência codificadora da proteína de alfa-toxina de C. perfringens revelada no ID. DE SEQ. N2: 1 é de 33,3%. Dessa forma, pode ser vantajo- so quando se projeta um gene de alfa-toxina para expressão em células de arroz ou tabaco elevar o teor de G + C da região codificadora de proteína até 15 uma faixa de 40-55%. Portanto, um objetivo no projeto de genes que codifi- cam uma toxina bacteriana para expressão de planta, mais preferivelmente denominado genes de plantas otimizados, é a geração de uma seqüência de DNA que possua um teor de G + C preferivelmente próximo àquele dos ge- nes de planta nativos do hospedeiro que codificam enzimas metabólicas.

Em função da plasticidade gerada pela redundância/degenera-

ção do código genético (ou seja, alguns aminoácidos são especificados por mais de um códon), a evolução dos genomas em diferentes organismos ou classes de organismos resultou no uso diferencial de códons sinônimos. Es- sa "preferência de códons" é refletida na composição de base média de re- 25 giões codificadoras de proteína. Por exemplo, organismos que possuem ge- nomas com teores relativamente baixos de G + C utilizam mais códons que possuem A ou T na terceira posição de códons sinônimos, enquanto aqueles que possuem teores de G + C mais elevados utilizam mais códons que pos- suem G ou C na terceira posição. Por exemplo, verificou-se que em regiões 30 codificadoras do tabaco, G ou C é encontrado como a terceira base de 39,84% dos códons, enquanto em regiões codificadoras de arroz, G ou C é encontrado como a terceira letra de 61,29% dos códons. Além disso, acredi- ta-se que a presença de códons "menores" dentro de um mRNA possa re- duzir a taxa de tradução absoluta daquele mRNA, especialmente quando a abundância relativa do tRNA carregado que corresponde ao códon menor é baixa. Uma extensão desse raciocínio é que a diminuição da taxa de tradu- ção por códons menores individuais seria pelo menos aditiva para múltiplos códons menores. Portanto, mRNAs que possuem teores relativos elevados de códons menores teriam, de forma correspondente, taxas baixas de tradu- ção. Essa taxa se refletiria por níveis correspondentemente baixos da prote- ína codificada.

No projeto de genes que codificam uma alfa-toxina bacteriana para expressão em arroz ou tabaco (ou outras plantas como, por exemplo, milho, algodão ou soja), seria útil se a preferência de códons das prováveis plantas hospedeiras fosse determinada. A preferência de códons é a distri- buição estatística de códons que a planta utiliza para a codificação dos ami- noácidos de suas proteínas, e os usos de códons preferidos para arroz e tabaco são mostrados na Tabela 2. A preferência de códons pode ser calcu- lada como a frequência na qual um único códon é usado em relação aos códons para todos os aminoácidos. Alternativamente, a preferência de có- dons pode ser calculada como a frequência na qual um único códon é usado para codificar um aminoácido em particular, em relação a todos os outros códons para aquele aminoácido (códons sinônimos). No projeto de regiões codificadoras para expressão em plantas de alfa-toxinas bacterianas, devem ser determinados os códons primários ("primeira escolha") preferidos pela planta, assim como a segunda, terceira, quarta etc. escolhas de códons pre- feridos, quando existirem múltiplas escolhas. Pode então ser projetada uma nova seqüência de DNA que codifica a seqüência de aminoácidos da alfa- toxina bacteriana, mas a nova seqüência de DNA difere da seqüência de DNA bacteriana nativa (que codifica a toxina) pela substituição de códons de planta (primeiro preferido, segundo preferido, terceiro preferido ou quarto preferido etc.) para especificar o aminoácido em cada posição dentro da se- qüência de aminoácidos da toxina. A nova seqüência é então analisada quanto aos sítios de enzima de restrição que podem ter sido criados pelas modificações. Os sítios identificados são ainda modificados por substituição dos códons por códons preferidos de primeira, segunda, terceira ou quarta escolha. Outros sítios na seqüência que poderiam afetar a transcrição ou tradução do gene de interesse são as junções éxon:íntron (5’ ou 3'), sinais 5 de adição poli A ou sinais de terminação de RNA polimerase. A seqüência é ainda analisada e modificada para reduzir a frequência de dupletos TA ou GC. Além dos dupletos, blocos de seqüência G ou C que possuem mais do que cerca de seis resíduos que sejam iguais podem afetar a transcrição ou tradução da seqüência. Portanto, esses blocos são vantajosamente modifi- 10 cados por substituição dos códons de primeira ou segunda escolha etc. pelo códon de escolha preferido seguinte.

O método descrito acima permite que aqueles versados na téc- nica modifiquem gene(s) que são estranhos para uma planta em particular de tal forma que os genes sejam expressos otimamente em plantas. O mé- 15 todo é ainda ilustrado no pedido PCT WO 97/13402. Dessa forma, os genes sintéticos que são funcionalmente equivalentes às toxinas/genes da presen- te invenção podem ser usados para transformar hospedeiros, incluindo plan- tas. Diretrizes adicionais em relação à produção de genes sintéticos podem ser encontradas, por exemplo, na Patente U.S. N2 5.380.831.

Para o projeto de um gene de planta otimizado que codifica uma

alfa-toxina bacteriana, foi projetada uma seqüência de DNA para codificar a seqüência de aminoácidos da toxina da proteína, utilizando um código gené- tico redundante estabelecido a partir de uma tabela de preferência de có- dons compilada a partir das seqüências codificadoras de proteína para as 25 plantas hospedeiras em particular (arroz e tabaco). Na Tabela 2, as Colunas C. D, I e J apresentam as distribuições (em % de uso para todos os códons para aquele aminoácido) de códons sinônimos para cada aminoácido, como encontrado nas regiões codificadoras de genes de Oryza sativa (arroz) e Nicotiana tabacum (tabaco). Os códons mais preferidos por cada tipo de 30 planta são indicados com fonte em negrito, e a segunda, terceira ou quarta escolhas de códons podem ser identificadas quando existirem múltiplas es- colhas. É evidente que alguns códons sinônimos para alguns aminoácidos só são encontrados raramente em genes de planta (por exemplo, TTA no arroz e GCG no tabaco). Além disso, plantas de arroz e tabaco diferem no uso de códons (por exemplo, o códon Alanina GCC ocorre mais frequente- mente em genes de arroz do que em genes de tabaco, enquanto o códon Arginina AGA é usado mais frequentemente em genes de tabaco do que em genes de arroz). Dessa forma, é óbvio que uma região codificadora de prote- ína projetada para refletir a composição de códons ótima de genes de uma espécie de planta pode ter uma subcomposição de códons ótima para ex- pressão em outra espécie de planta. Portanto, no processo de planejamento da criação de uma seqüência de DNA codificadora de proteína que se apro- xime de uma distribuição de códons média de genes tanto de arroz quanto de tabaco, foi excluído qualquer códon que não seja usado frequentemente em relação aos outros códons sinônimos para aquele aminoácido em qual- quer tipo de planta (indicado por DNU nas Colunas F e L da Tabela 2). Nor- malmente, um códon era considerado como sendo usado raramente caso ele se apresentasse em cerca de 10% ou menos do tempo para codificar o aminoácido relevante em genes de qualquer um dos tipos de planta (indica- do por NA nas Colunas E e K da Tabela 2). Para equilibrar a distribuição das escolhas de códons restantes para um aminoácido, foi calculada uma repre- sentação da Média Ponderada para cada códon, com o uso da fórmula:

Média Ponderada % de C1 = 1 / (%C1 + %C2 + %C3 + etc.) x %C1 x 100 em que C1 é o códon em questão e %C2, %C3 etc. representam as médias dos valores % para arroz e tabaco de códons sinônimos restantes (valores % médios para os códons relevantes são tomados das Colunas E e K) da Tabela 2.

O valor % da Média Ponderada para cada códon é apresentado nas Colunas F e L da Tabela 2.

Uma nova seqüência de DNA que codifica essencialmente a se- qüência de aminoácidos da proteína de alfa-toxina de C. perfringens do ID. DE SEQ. Ns: 2 foi projetada para expressão ótima em células tanto de arroz quanto de tabaco com o uso de uma distribuição de códons equilibrada de códons usados frequentemente em genes de arroz e de tabaco. Como men- cionado acima, os primeiros 28 aminoácidos da seqüência da pró-toxina descrita no ID. DE SEQ. N2: 2 compreendem um sinalizador de secreção peptídeo. Consequentemente, foi projetada uma seqüência de DNA de plan- ta otimizada (ID. DE SEQ. N2: 3) para codificar apenas a porção da proteína 5 madura do ID. DE SEQ. N2: 2 (aminoácidos 29-398), mas que havia sido modificada para conter três alterações de aminoácidos para remover a ativi- dade enzimática de fosfolipase C, como discutido acima e descrito no ID. DE SEQ. N2: 4. Essas alterações estão resumidas abaixo:

Ácido aspártico 84 da pró-toxina (resíduo 56 da proteína madu- ra) mutado para Leucina

Histidina 176 da pró-toxina (resíduo 148 a proteína madura) mu- tada para Glicina

Ácido glutâmico 180 (resíduo 152 da proteína madura) mutado

para Glicina

A nova seqüência de DNA difere da seqüência de DNA bacteria-

na nativa que codifica a proteína de alfa-toxina pela substituição de códons de planta (primeiro preferido, segundo preferido, terceiro preferido ou quarto preferido) para especificar o aminoácido apropriado em cada posição dentro da seqüência de aminoácidos da proteína. O projeto da seqüência de DNA 20 de planta otimizada foi iniciado por tradução reversa da seqüência de proteí- na do ID. DE SEQ. N2: 4 com o uso de uma tabela de preferência de códons equilibrada de arroz-tabaco construída a partir das Colunas F e L da Tabela

2. A seqüência inicial foi então modificada por compensação de alterações de códons (mantendo-se a representação de códons média ponderada glo- 25 bal) para remover ou adicionar sítios de reconhecimento de enzima de res- trição, remover estruturas secundárias intrafita altamente estáveis e remover outras seqüências que possam ser prejudiciais às manipulações de clona- gem ou expressão do gene projetado em plantas.

A seqüência de DNA foi então re-analisada quanto aos sítios de reconhecimento de enzima de restrição que possam ter sido criados pelas modificações. Os sítios identificados foram ainda modificados por substitui- ção dos códons relevantes com códons preferidos de primeira, segunda, * terceira ou quarta escolha. Outros sítios na seqüência que poderiam afetar a transcrição ou tradução do gene de interesse incluem as junções éxon:íntron (5' ou 3'), sinais de adição poli A ou sinais de terminação de RNA polimera- se. A seqüência modificada foi ainda analisada e ainda modificada para re- duzir a frequência de dupletos de TA ou CG1 e para aumentar frequência de dupletos de TG ou CT. Além desses dupletos, blocos de seqüência que pos- suem mais do que cerca de seis resíduos consecutivos de [G+C] ou [A+T] podem afetar a transcrição ou tradução da seqüência. Portanto, esses blo- cos de seqüência também foram modificados por substituição dos códons de primeira ou segunda escolha etc. por outros códons de escolha preferidos. Os códons raramente usados não são incluídos em um grau substancial no projeto do gene, sendo usados apenas quando necessário para acomodar um critério de projeto diferente da composição de códons por si (por exem- plo, adição ou eliminação de sítios de reconhecimento de enzima de restri- ção).

A seqüência de DNA resultante possui um grau mais elevado de diversidade de códons, uma composição de bases desejada, contém sítios de reconhecimento de enzima de restrição colocados estrategicamente, e não possui seqüências que possam interferir com a transcrição do gene, ou 20 com a tradução do mRNA do produto. A Tabela 3 apresenta uma compara- ção das composições de códon das regiões codificadoras para a proteína madura de alfa-toxina, como encontradas no gene nativo e na versão de planta otimizada, e compara ambas com as recomendações de composição de códons para uma seqüência de planta otimizada calculada a partir das 25 Colunas F e L da Tabela 2.

Foram feitas outras modificações para a seqüência de planta otimizada que codifica a alfa-toxina madura de C. perfringens. Uma dessas modificações foi a adição de uma seqüência de DNA que codifica o peptídeo direcionado ao retículo endoplasmático (ER) derivado do gene de alfa zeína 30 do milho (Zea mays) de 15 kDa (Número de Acesso no Genbank M72708). Essa seqüência de DNA compreende 63 bases, e foi modificada da seqüên- cia de milho original por substituições de códon para tornar sua composição mais compatível com a expressão em células de arroz e tabaco (como des- crito acima) e pela adição de um códon OCT para Alanina imediatamente após o códon de partida ATG (Metionina). A adição desse códon GCT colo- ca o códon de partida da tradução ATG em um contexto de seqüência que é favorável à iniciação da tradução em plantas. A seqüência de DNA otimizada de arroz-tabaco para o peptídeo de direcionamento ao ER de zeína de 15 kDa é descrita como o ID. DE SEQ. N-: 5, e o peptídeo codificado é descrito como ID. DE SEQ. N-: 6. Quando a seqüência de DNA do ID. DE SEQ. N2: é colocada no início da seqüência de DNA do ID. DE SEQ. N2: 3, é criado um quadro de leitura de comprimento total de 1.239 bases que codifica uma proteína de fusão que compreende o peptídeo de direcionamento ao ER de zeína de 15 kDa ligado à proteína de alfa-toxina madura de C. perfringens. Quando esse quadro de leitura é introduzido em células de plantas como um gene funcional, a proteína traduzida a partir do mRNA será dirigida para den- tro do lúmen do retículo endoplasmático. Sabe-se na técnica que após pene- trarem no ER, as proteínas heterólogas são frequentemente secretadas pela célula. Sabe-se ainda que algumas seqüências peptídicas pequenas, quan- do adicionadas ao terminal carbóxi de proteínas dirigidas ao ER, podem ini- bir a secreção das proteínas assim modificadas pela célula. Na medida em que é um objetivo dessa invenção acumular níveis elevados da proteína de alfa-toxina mutada de C. perfringens em células de arroz e tabaco, uma mo- dificação adicional ao DNA revelado no ID. DE SEQ. N2: 3 foi a adição de códons que codificam um peptídeo KDEL (Lisina-Ácido aspártico-Ácido glutâ- mico-Leucina) (conhecido por facilitar a retenção de proteínas dentro do ER) à extremidade 3' da seqüência. Na prática, como a proteína de alfa-toxina madu- ra de C. perfringens revelada no ID. DE SEQ. N2: 4 termina em Lisina, só foram adicionados ao ID. DE SEQ. N2: 3 códons que especificam DEL (ou seja, GATGAGCTT). A seqüência de DNA de planta de comprimento total otimizada que codifica essa proteína de fusão é revelada no ID. DE SEQ. N2: 7, e a proteína de fusão codificada é revelada no ID. DE SEQ. N2: 8.

Após uma seqüência de DNA de planta otimizada ter sido proje- tada no papel ou no computador, moléculas DNA reais podem ser sintetiza- < das no laboratório para corresponder em seqüência precisamente à seqüên- cia projetada. Essas moléculas de DNA sintético podem ser clonadas e de outras formas manipuladas exatamente como se fossem derivadas de fontes naturais ou nativas. A síntese de um fragmento de DNA que compreende o 5 ID. DE SEQ. N-: 7 foi realizada por um fornecedor comercial (PicoScript, Houston. TX USA). O DNA sintético foi então clonado em vetores de expres- são e introduzido em cultura de células, como descrito nos Exemplos 3 e 4. EXEMPLO 3

EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE Mcpa QX-HIS-TAGGED PARA ESTU- 10 DOS CLÍNICOS E VALIDAÇÃO DE ANTÍGENO

Construção de vetor de expressão de E coli para Mcpa Ses- mento de 6 resíduos de histidina no C-erminal. O plasmídeo DAS28P7B2 foi obtido de PicoScript (Houston, TX), e contém o gene de Mcpa sintetizado otimizado de planta entre os sítios de restrição Ncol e Saci. O fragmento 15 Ncol/Sacl foi clonado em pET-41a(+) (Novagen, N2 de Catálogo: 70556-3) e usado para expressão em E. coli. Esse vetor gerou uma proteína truncada. Um exame mais detalhado da seqüência de DNA indicou que a seqüência de Mcpa não estava in frame com o OST do terminal N pET-41a(+), S e His- tags. Para corrigir o quadro de leitura e para expressar Mcpa como uma fu- 20 são de OST do terminal N e His-teg do terminal C, foi usada a seguinte es- tratégia.

Um fragmento de DNA foi projetado e sintetizado de forma habi- tual em PicoScript para gerar seqüência contida em DASPIC019. DASPI- C019 do sítio Spel de pET-41a(+) ao sítio site Ncol, não incluindo o ses- 25 mento de 6 resíduos de histidina no C-terminal (região entre o tag de GST do terminal Neo sítio múltiplo de clonagem). Isso foi seguido por uma pe- quena região vinculadora mais a seqüência de DNA do sítio EcoRV ao sítio Sacl de DAS28P7B2. Esse fragmento sintético foi usado para desenvolver o vetor de expressão para Mcpa, pDAB2448. As etapas de clonagem envolvi- 30 das no constructo de vetor de expressão de E. coli de Mcpa com 6X-his-tag no terminal C, pDAB2448, estão ilustradas na Figura 3. Um fragmento E- coRV/Ncol de 1,1 kb de DAS28P7B2 foi clonado em DASPIC019, para for- mar pDAB2447. Um fragmento Spel/Sacl de pDAB2447 foi clonado em pET- 41 a(+) para criar pDAB2448.

Expressão de Mcpa com cauda de histidina no terminal C. pDAB2448 foi introduzido na cepa BL21(DE3) de E. coli, e os transformantes 5 de E. coli que expressam a proteína de Mcpa cresceram de um dia para o outro para se obter a semeadura. A cultura da semeadura foi inoculada em 50 ml de Caldo de Luria (LB) contendo 50 pg/ml de canamicina em frascos de 250 ml. A cultura foi desenvolvida até uma OD6oo de 0,5 a 1,0, e depois foi induzida com isopropil-beta-D-tiogalactopiranosida (IPTG) 1 mM e incu- 10 bada a 37°C. Foram então coletadas amostras da cultura de 2 ml para análi- se de proteína em 4 h e aproximadamente 24 h após a indução. As células foram então Iisadas em 200 μΙ de tampão de amostra e 5 μΙ de cada amostra foram analisados em gel de SDS-PAGE. Os resultados mostraram que toda a proteína de Mcpa estava no pélete; isso foi confirmado por hibridização por 15 Western blot. Tentativas para se obter expressão solúvel por modificação das condições de indução (ou seja, concentrações de IPTG, temperatura e tempo de indução) não tiveram qualquer impacto sobre a expressão de pro- teína solúvel.

Construção de vetor de expressão de E. coli para Mcpa 6X-his- 20 taaaed no terminal N. Foi testado o efeito de uma cauda de histidina (His- tag) no terminal N sobre a expressão solúvel de Mcpa. Foi feito um novo ve- tor de expressão por clonagem de um fragmento BglIl/EcoRV de pDAB2448 no constructo out-of-frame descrita previamente. Esse novo vetor de expres- são foi designado pDAB2449 (Figura 4).

Expressão de Mcpa com cauda de histidina no terminal N.

pDAB2449 foi transformado em E. coli e a expressão de Mcpa induzida com uso de condições padronizadas, como descrito previamente. Novamente, os resultados mostraram Mcpa como uma proteína insolúvel. As condições de indução foram otimizadas variando-se a temperatura e as concentrações de 30 IPTG para se obter expressão solúvel (variáveis testadas: 20°C e 37°C; 20, 100, 250, e 1.000 50 μΜ de IPTG; 4 horas e indução de um dia para o ou- tro). Uma quantidade significativa de proteína solúvel foi obtida com culturas * desenvolvidas a 20°C e induzidas com 250 μΜ de IPTG de um dia para o outro, ou desenvolvidas a 37°C e induzidas com 50 μΜ IPTG por 4 horas. As culturas fora escalonadas sob ambas as condições, e a proteína foi purifica- da por cromatografia em glutationa sefarose. O pélete de células de 1 litro de 5 cultura foi Iisado em PBS com 0,6 mg/ml de Iisozima por 30 min em tempera- tura ambiente, seguido por sonificação por 4 x 30 seg em um sonificador de Branson. O extrato de células clarificado foi usado para purificar Mcpa com o uso de 10 ml de resina de glutationa sefarose 4B (Amersham). A proteína purificada foi incubada em um tampão contendo 25 mM de Tris-HCI, pH 8, e 10 4 mM de CaCI2 (New England Biolabs), com quantidades variáveis de ente- roquinase (EK) por tempos de incubação variáveis para clivar a cauda de UST (UST-íag) e liberar a proteína de Mcpa. A reação foi incubada em tem- peratura ambiente com agitação, e as amostras foram analisadas por SDS- PAGE. Tentativas de clivar a cauda de GST e reter a Mcpa de comprimento 15 total não tiveram sucesso em função da sensibilidade da porção do terminal N de Mcpa á clivagem inespecífica de EK. Várias tentativas para otimizar as condições de clivagem produziram alfa-toxina truncada. Portanto, a proteína foi expressa em Pseudomonas fiuorescens como uma proteína 6X-his- tagged sem cauda de GST.

Construção de plasmídeo de expressão de Pseudomonas fluo-

rescens para Mcpa 6X-his-tagoed. O gene de Mcpa (ID. DE SEQ. N2: 9) foi amplificado por PCR a partir do vetor de expressão de E.coli, pDAB2449, que continha o gene de Mcpa de comprimento total como modelo de DNA, usando iniciadores de PCR diretos e reversos (lntegrated DNA Technologi- es, Skokie, IL).

Iniciador direto: 5' aga gaa cta gta aaa agg aga aat cca tgc ate acc ate acc ate act ccg cgg 3'

Iniciador reverso: 5' aga gac tcg age tat cat ttg ata ttg tag gtt gaa ttg c 3'

Um sítio de restrição Spel foi introduzido 5' do sítio de ligação ribossômico otimizado com o uso do iniciador direto e um sítio Xhol foi intro- duzido abaixo do códon de parada de tradução com o uso do iniciador rever- so. Isso permitiu a clonagem do gene de Mcpa em um vetor de expressão de pf, resultando no constructo pDAB2454 (Figura 5). A ligação do gene de Mcpa sintetizado QX-his-tagged no terminal N nos sítios Spel e Xho\ foi obti- da de acordo com Sambrook e cols. (1989). A verificação do gene clonado foi feita com um sistema de análise de DNA Beckman Coulter CEQ 2000XL 5 e analisada com o software Sequencher.

Expressão de Mcpa com cauda de histidina no terminal N em P. fiuorescens. Células de P. fiuorescens capazes de transformação foram pre- paradas por inoculação de 5 ml de LB com estoque em glicerol congelado de P. fiuorescens, cepa MB324, obtida da coleção de culturas de Dow AgroSci- 10 ences (DAS), e desenvolvida de um dia para o outro a 30°C, agitada a 300 rpm. No dia seguinte, 750 μΙ de cultura de um dia para o outro foram inocu- Iados em 50 ml de LB contidos em um frasco de 250 ml. As células cresce- ram até uma OD6oo de 0,2-0,4. Após ter sido alcançada a densidade ade- quada, a amostra da cultura foi resfriada em gelo por 5-10 minutos, transfe- 15 rida para um tubo cônico de 50 ml, e centrifugada a 7.000 rpm por cinco mi- nutos em uma centrífuga de chão Sorvall RC5C com utilização de um rotor GSA. As células peletizadas foram lavadas e ressuspensas três vezes com água deionizada estéril gelada, antes da suspensão final de células em 400 μΙ de água estéril. O DNA ligado foi precipitado com etanol até um volume de 20 10 μΙ. A alíquota de 10 μΙ de DNA ligado foi adicionada a 100 μΙ de suspen- sões de células lavadas em cadinhos de eletroporação de 0,2 cm, e subme- tidas à eletroporação com um BioRad GenePuIser a 200 Ohms, 25 μΡ e 2,25 kV em constantes de tempo de 4,6 a 4,8. Permitiu-se que os transformantes se recuperassem por 2 horas a 30°C, 300 rpm , e depois eles foram plaque- 25 ados sobre placas de ágar LB contendo 30 μg/ml de tetraciclina. As placas foram incubadas a 30°C por 36-48 horas. Os transformantes foram avaliados e o constructo de expressão de Pfcontendo Mcpa de comprimento total 6X- his-tagged no terminal N, pDAB2454, foi verificada por análise de enzima de restrição e sequenciamento das junções Spel e Xhol com a utilização do 30 sequenciador de Beckman e do software Sequencher. Estoques em glicerol de Pt que expressa Mcpa 6X-his-tag no terminal N foram feitos e armazena- dos a -80°C. < Crescimento e indução de P. fiuorescens que expressa Mcpa

6X-his-tagoed. Uma alíquota de 200 μΙ de estoque em glicerol foi inoculada em 50 ml de meio LB em frascos de 250 ml, suplementado com tetraciclina até uma concentração final de 30 μg/ml. As culturas foram incubadas em 5 uma máquina de agitação New Brunswick Innova a 30°C por aproximada- mente 16 horas a 300 rpm. As culturas de semeadura de um dia para o outro foram então usadas para inocular 1 litro de meio de cultura (veja o Apêndic- xe para os Exemplos 3 e 4) distribuído igualmente em cinco frascos de 1 litro (inóculo de 2% e 30 μg/ml de tetraciclina). Os frascos foram incubados em 10 uma máquina de agitação New Brunswick Innova a 300 rpm e 30°C por 24 horas, e depois foram induzidos com IPTG até uma concentração final de 0,3 mM. As culturas foram incubadas por mais 48 horas, antes da coleta.

Purificação de Mcpa 6X-his-tacicied. Após indução e expressão de 1 litro de células de cultura de Pf recombinante contendo a proteína de Mcpa QX-his-tagged (ID. DE SEQ. Ns: 10), as células foram peletizadas por centrifugação da cultura a 7.500 rpm por 20 minutos, e foram transferidas para o recipiente de um beadbeater de 400 ml com 200 ml de glóbulos de vidro de 0,1 mm (BioSpec). O recipiente foi preenchido com tampão de fos- fato (tampão de fosfato de sódio 50 mM, pH 7,5, NaCI 0,3 M), e depois foram adicionados 2 ml de coquetel de inibidor de protease Sigma para proteínas com cauda de histidina. O pélete de células foi Iisado por agitação com os glóbulos 8 vezes por 1 minuto cada, separado por intervalos 1 minuto no gelo. Após o ciclo final de agitação com glóbulos, os glóbulos ficaram em repouso por 5 minutos no gelo, antes da decantação das células Iisadas em tubos de Falcon de 50 ml. As células Iisadas foram então centrifugadas a 12.000 rpm por 15 minutos para separar o Iisado do pélete.

Uma coluna de gravidade contendo 20 ml de resina de metal imobilizado de cromatografia por afinidade TALON® (BD Biosciences) foi usada para purificar a proteína de Mcpa com cauda de histidina do lisado. A 30 resina foi equilibrada com 20 volumes de coluna de tampão de fosfato 50 mM, pH 7,5, contendo NaCI 0,3 M, e o sobrenadante foi cuidadosamente passado através da coluna três vezes. O fluxo através da amostra foi coleta- do e colocado no gelo. A coluna foi então lavada novamente com 20 volu- mes de coluna de tampão de equilíbrio, seguidos por 5 volumes de coluna de tampão de equilíbrio contendo imidazol 10 mM. O fluxo foi retido separa- damente. Finalmente, 5 volumes de coluna de tampão de equilíbrio contendo 5 imidazol 200 mM (tampão de eluição) foram usados para eluir a proteína de Mcpa QX-his-tagged da resina. Foram feitas análises por SDS-PAGE (gel de Bis-Tris 10%, Invitrogen Corporation) e Western blot com o uso de 10 μΙ de cada fluxo: lavagem sem imidazol, lavagem com imidazol 10 mM e eluição com imidazol 200 mM, para confirmar a presença de Mcpa nas frações puri- 10 ficadas. A proteína purificada foi quantificada por análise de Bradford.

Liofilização de proteína. As proteínas foram dialisadas em um tampão contendo Tris-HCI 3 mM, pH 7,5. Elas foram então quantificadas com a utilização do ensaio de proteína baseado em Bradford PIERCE, e foi calculada a proteína total. Para isso, foi adicionada trehalose 0,5%, e a a- 15 mostra foi Iiofilizada de um dia para o outro. O peso do pó Iiofilizado de pro- teína foi medido, e o percentual de pureza foi estimado após subtração do peso de tampão de Tris-HCI, trehalose e água residual. O rendimento da proteína purificada final foi > 80 mg.

EXEMPLO 4

EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE Mcpa SEM CAUDA PARA ESTUDOS CLÍNICOS VALIDAÇÃO DE ANTÍGENO

Construção de plasmídeo de expressão de Pseudomonas fluo- rescens para Mcpa sem cauda de histidina. O gene de Mcpa foi amplificado a partir do constructo pDAB2454 (Exemplo 3) por uma reação de PCR que utiliza iniciadores designados com o software Vector NTI 8 para excluir a cauda de histidina, cauda de S e sítios de trombina.

Iniciador Direto: 5' aga gaa cta gta aaa agg aga aat cca tga gtt ggg atg gaa aga ttg atg gca ctg g 3'

Iniciador Reverso: 5 aga gac tcg age tat cat ttg ata ttg tag gtt gaa ttg c 3'

Para fins de clonagem e expressão, os iniciadores incluíam um

sítio de ligação de ribossomo mais os sítios de clonagem Spel e Xho\. A rea- ção de PCR foi realizada com o uso do Protocolo de PCR FailSafe de EPI- * CENTRE e com o sistema de PCR FailSafe (N2 de Catálogo: FS99060) com 2x Pré-mistura de PCR FailSafe (A, Ns de Catálogo: FSP995A) por 30 ciclos de PCR (94°C, 2 min.; 94°C, 1 min.; 52°C, 1 min.; 72°C, 1 min.; 4°C manter; Ciclador Térmico MJ Research DNA Engine DYAD Peltier). Os produtos de 5 reação foram purificados a partir de um gel de agarose 1 % após extração do gel de agarose QIAEXII (N- de Catálogo: 20051), e digeridos com Spel e Xho\. A verificação do produto de PCR foi feita com um sistema de análise de DNA Beckman Coulter CEQ 2000XL e analisado com o software Se- quencher.

10 O produto de PCR foi ligado em um vetor TOPO® TA (pCR2.1)

com o uso do Kit de Clonagem Invitrogen TOPO® TA (N2 de Catálogo: K4500-01), e depois transformado quimicamente em células competentes de E. coli (TOPIOF', N2 de Catálogo: K4550-40). Os transformantes foram pla- queados sobre placas de ágar LB ampicilina (100 μg/ml) X-galactosidase, e incubados a 37°C por 24 horas (agitadora incubadora refrigerada New Brunswick Scientific Innova 4230). Os transformantes foram avaliados, e o novo vetor, pDAB3909, foi verificado por análise de enzima de restrição úni- ca, BamH\ e Not\. Além disso, os clones positivos foram ainda verificados por sequenciamento das junções Spel e Xho\, de acordo com o Protocolo de Sequenciamento de Beckman (N2 de Catálogo: 608120) com 45 ciclos (96°C, 2 min.; 96°C, 20 seg.; 50°C, 20 seg.; 60°C, 4 min.; 4°C, co; Gene Amp PCR System 9700) e analisados com Sequencher 4.1.4 (Gene Codes Corp,). A eletroforese em gel do DNA revelou que clones positivos conti- nham o gene de Mcpa em aproximadamente 1,2 kb. Estoques em glicerol de pDAB3909 foram feitos e armazenados a -80°C.

O constructo do vetor de expressão de Mepa sem cauda de his- tidina para P. fiuorescens foi completada por clonagem do gene de Mcpa sem cauda de histidina (ID. DE SEQ. N2: 11) por pDAB3909 no plasmídeo de expressão de Pf usado para se obter pDAB2454. O gene foi extraído de 30 pDAB3909 e ligado no plasmídeo de expressão de Pf utilizando os sítios Spel e Xho\. A reação de ligação ocorreu de um dia para o outro em uma imersão a 16°C (Ciclador Térmico de DNA Perkin Elmer Cetus). A transfor- mação do produto ligado foi feita por eletroporação com a utilização do se- guinte protocolo: foram preparadas células competentes de P. fiuorescens por inoculação de 5 ml de LB com um estoque em glicerol congelado de P. fiuorescens, cepa MB324, e foram desenvolvidas de um dia para o outro a 5 30°C, agitadas a 300 rpm (agitadora incubadora refrigerada New Brunswick Scientific Innova 4230). No dia seguinte, 750 μΙ de cultura de um dia para o outro foram inoculados em 50 ml de LB contidos em um frasco de 250 ml. As células cresceram até uma OD6oo de 0,2-0,4. Após ter sido alcançada a den- sidade adequada, a amostra da cultura foi resfriada em gelo por 5-10 minu- 10 tos, transferida para um tubo cônico de 50 ml e centrifugada a 7.000 rpm por cinco minutos em uma centrífuga de chão Sorvall RC5C com utilização de um rotor GSA. As células peletizadas foram lavadas e ressuspensas três vezes com água deionizada estéril gelada, antes da suspensão final de célu- las em 400 μΙ de água estéril. O DNA ligado foi precipitado com etanol até 15 um volume de 10 μΙ. A alíquota de 10 μΙ de DNA ligado foi adicionada a 100 μΙ de suspensões de células lavadas em cadinhos de eletroporação de 0,2 cm, e submetidas à eletroporação com um BioRad GenePuIser a 200 Ohms, 25 μΡ e 2,25 kV, em constantes de tempo de 4,6 a 4,8. Permitiu-se que os transformantes se recuperassem por 2 horas a 30°C, 300 rpm, e depois eles 20 foram plaqueados sobre placas de ágar LB contendo 30 μg/ml de tetracicli- na. As placas foram incubadas a 30°C por 36-48 horas. Os transformantes foram então avaliados, e o constructo final, pDAB3910, foi verificada por análise de enzima de restrição. Estoques em glicerol de pDAB3910 (Figura 6) foram feitos e armazenados a -80°C.

Crescimento e indução de P. fiuorescens que expressa Mcpa

sem cauda de histidina. Estoques congelados em glicerol de Pseudomonas fiuorescens contendo plasmídeo, pDAB3910, foram usados para expressão de proteína de Mcpa sem cauda de histidina (ID. DE SEQ. N2: 12). Uma alí- quota de 200 μΙ de estoque em glicerol foi inoculada em 50 ml de meio LB 30 em frascos de 250 ml, suplementado com tetraciclina até uma concentração final de 30 μg/ml. As culturas foram incubadas em uma máquina de agitação New Brunswick Innova a 30°C por aproximadamente 16 horas a 300 rpm. As culturas de semeadura de um dia para o outro foram então usadas para ino- cular 1 litro de meio de cultura (veja o Apêndicxe para os Exemplos 3 e 4) distribuído igualmente em cinco frascos de 1 litro (inóculo de 2% e 30 μg/ml de tetraciclina). Os frascos foram incubados em uma máquina de agitação 5 New Brunswick Innova a 300 rpm e 30°C por 24 horas, e depois foram indu- zidos com IPTG até uma concentração final de 0,3 mM. As culturas foram incubadas por mais 48 horas, antes da coleta.

Após 48 horas, as culturas foram derramadas em garrafas de centrífuga estéreis de 500 ml, e centrifugadas em uma centrífuga Sorvall 10 RC5C a 8.165 x g por 15 minutos. Os sobrenadantes foram descartados e os péletes foram armazenados a -80°C. Cada cultura foi subsequentemente avaliada e o constructo final, pDAB3910, foi verificada por análise de enzima de restrição e por sequenciamento das junções Spel e Xhol utilizando o Pro- tocolo de Sequenciamento de Beckman por 45 ciclos (96°C, 2 min.; 96°C, 20 15 seg.; 50°C, 20 seg.; 60°C, 4 min.; 4°C manter; Gene Amp PCR System 9700) e analisada com Sequencher 4.1.4 (Gene Codes Corp.). Foram feitos um aumento de escala de 2 litros e a coleta de células transformadas de Pf com o gene de Mcpa sem cauda de histidina seguindo os procedimentos descritos acima.

Purificação de proteína de Mcpa sem cauda de histidina. Uma

alíquota de 24 g de pasta de células foi ressuspensa em 200 ml de tampão de Iise (Tris 50 mM, pH 8,0, 5% (v/v) glicerol, EDTA 20 mM, Triton X-1000,5% (v/v), DTT 1 mM) e 1 X coquetel de inibidor de protease (N2 de Catálogo Sigma: P8465) e Iisada por agitação com glóbulos de vidro de 0,1 mm em uma câ- 25 mara de rompimento de 450 ml (BioSpec). As células foram processadas 7 vezes em intervalos de um minuto, separados por períodos de repouso de 1 minuto no gelo, para evitar o superaquecimento. Adicionalmente, a câmara foi resfriada com gelo. O Iisado foi colocado em garrafas de centrífuga de

250 ml e centrifugado a 14.000 x g em um rotor SLC-1500 por 20 minutos. O sobrenadante foi filtrado três vezes (0,85 μιη, 0,45 μΐη e 0,22 μΐη). O pélete foi descartado.

A amostra clarificada foi purificada por cromatografia por troca aniônica por carga em uma coluna de Sefarose Q XK 26/11 equilibrada com Tampão A (Tris 50 mM, pH 8,0, glicerol 5% (v/v), EDTA 20 mM, Triton X-100

0,5% (v/v), DTT 1 mM) a 5 ml/min. A proteína de Mcpa foi eluída com gradi- ente linear de 10 volumes de coluna (CV) até Tampão B 50% (Tampão A + 5 NaCI 1 M) por 100 minutos, e depois Tampão B 100%. Foram coletadas fra- ções de 10 ml, e foi obtido o perfil de eluição (Figura 7).

A análise por SDS-PAGE das frações eluídas indicou a presença de proteína de Mcpa em aproximadamente 42 kDa. Foi preparada uma am- pliação do cromatograma superposto a uma fotografia da análise por SDS- PAGE das frações retiradas. A localização da proteína de Mcpa sem cauda de histidina na SDS-PAGE foi anotada.

As proteínas fracionadas por SDS-PAGE foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose em tampão de Tris-glicina com metanol 20% a 100 volts por 60 minutos para análise "Western blot". O blot foi incu- 15 bado brevemente em PBS-Tween (Pierce, Rockford, IL), e depois bloqueado em tampão de bloqueio de leite 5% v/v e Tween 20 0,5% dissolvido em PBS por 60 minutos em temperatura ambiente. Anti-CPA de coelho (Dow AgroS- ciences, Lote N2: DAS1041-156-2) foi usado como anticorpo primário. O an- ticorpo foi diluído até 1 μg/ml em uma alíquota fresca de tampão de bloquei- 20 o, e incubado com o blot por 60 minutos em temperatura ambiente. O blot foi lavado com PBS 2 vezes por 15 minutos em temperatura ambiente. Anticor- po de cabra anti-lgG de coelho (N2 de Catálogo KPL: 075- 1506) com um conjugado de fosfatase alcalina foi usado para detectar o anticorpo primário.

O anticorpo foi diluído até 1/1.000 em uma alíquota fresca de tampão de bloqueio, e incubado com o blot por 60 minutos em temperatura ambiente. O blot foi lavado em PBS 3 vezes por 10 minutos em temperatura ambiente. O blot foi desenvolvido com NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL N2 de Catálogo: 34042) e lavado com água destilada e seco ao ar.

Foram preparados um SDS-PAGE e um Western blot a partir das frações 56-70 reunidas em pool, comparadas com Mcpa purificada com cauda (Exemplo 3) e um controle negativo (lisado de células transformadas com vetor vazio). O gel indicou aproximadamente 90% de pureza da amos- tra de Mcpa sem cauda de histidina. No Western Blot, foram observadas al- gumas ocorrências de agregação e degradação da banda de Mcpa. Além disso, foi observada reatividade cruzada no controle negativo.

Espectrometria de massa por dessorção a laser com auxílio de matriz no modo tempo de vôo (MALDI-TOF) e sequenciamento do terminal N de Mcpa sem cauda de histidina também foram usados para verificar a iden- tidade da proteína purificada. A seqüência do terminal N da amostra (S W D G K I D G T G) combinava com a seqüência de Mcpa esperada dos resíduos

# 2 a 11 no terminal N. Após digestão da amostra por tripsina, os peptídeos 10 detectados por MALDI-TOF foram comparados com a impressão digital da massa peptídica (PMF) esperada da de Mcpa com o uso do software PAWS (Genomic Solutions, Inc.). Foi identificado um total de 18 peptídeos de Mcpa sem cauda de histidina, gerando uma cobertura de PMF de 56%. Essa aná- lise indicava fortemente que a PMF da amostra combinava com a seqüência 15 teórica de Mcpa sem cauda de histidina.

As frações mais limpas (Frações 56-70) foram reunidas em pool e concentradas até aproximadamente 35 ml com concentradores por centri- fugação Millipore 10K-MWCO (usados de acordo com as instruções do fabri- cante). O concentrado foi injetado em cassetes de diálise "Snake Skin Slide- 20 A-Lyzer" (3,5-k MWCO, N2 de Catálogo: GD96524) e dialisado de um dia para o outro contra 2 litros de IX PBS pH 8,0 a 4°C. A amostra dialisada foi distribuída em duas alíquotas de aproximadamente 25 ml, congelada em tubos cônicos de Falcon pré-tarados de 50 ml e Iiofilizada por 2 dias (Virtis Freezemobile 25 EL). A liofilização gerou 1,13 g de pó, que foi armazenado 25 a 4°C. A concentração de proteína total foi determinada (ensaio de Bradford) e a pureza calculada em 2,2% por peso, gerando aproximadamente 25 mg de Mcpa sem cauda de histidina.

Em resumo, uma amostra de Mcpa sem cauda de histidina de 25 mg foi purificada a partir de 400 ml de cultura de Pf por meio de cromatogra- fia por troca aniônica. O esquema de purificação pode ser otimizado ainda mais. Adicionalmente, a diálise contra Tris 3 mM pH, 8,0, com trehalose

0,5%, em vez de 1X tampão PBS, é recomendada para estabilidade de Ion- go prazo da proteína. A Mcpa sem cauda de histidina gerada foi usada como um antígeno de teste.

APÊNDICE PARA OS EXEMPLOS 3 E 4 Meio para o frasco de semeadura de Pseudomonas fiuorescens 5 Meio LB (pode ser Miller ou Lennox)

Dividir 50 ou 100 ml de meio em um frasco de 250 ml.

Fechar com uma rolha de espuma e tampar.

Autoclavar por 20 min a 121 °C.

EXEMPLO 5

TESTE DE TOXICIDADE DE PROTEÍNAS DE CPA RECOMBINANTES PURIFICADAS

Foram desenvolvidos dois ensaios in vitro, cada um para detec- ção de uma atividade característica de alfa-toxina de Cp nativa, hemólise de células sanguíneas vermelhas (RBC) ou de lecitinase. No ensaio de hemóli- 15 se, células sanguíneas vermelhas (RBCs) foram incubadas com uma supos- ta cpa não-tóxica e observadas quanto aos efeitos hemolíticos, comparado com controles positivos e negativos. O ensaio foi útil para determinar a ativi- dade ou concentração aproximada de fosfolipase C (PLC) em amostras ex- perimentais, com base em um padrão contendo uma quantidade conhecida 20 de unidades de PLC.

Lecitina (L-α fosfatidilcolina) é o fosfoglicerídeo mais abundante, um fosfolipídeo que serve como um componente estrutural importante de membranas celulares. Quando a alfa-toxina é secretada por Cp, ela se liga de forma nativa às membranas da célula hospedeira, cliva Iecitina e desen- 25 cadeia uma cascata de eventos que resulta na diminuição de oxigênio no sítio infectado pela bactéria e na proliferação de Cp. Um segundo ensaio foi desenvolvido e usado para medir a atividade de lecitinase de amostras expe- rimentais e, dessa forma, determinar a atividade ou concentração aproxima- da de PLC por comparação com um padrão (Logan, 1991). A atividade de 30 lecitinase foi detectada e quantificada in vitro por incubação de proteínas de cpa recombinantes com uma solução de lecitinase. A turvação aumentada, medida por espectrofotometria, indicou atividade de clivagem. Ambos os en- saios serviram de instrumento para demonstrar um design eficaz de antíge- nos na remoção ou redução das atividades hemolíticas e de lecitinase tóxi- cas, antes do início dos estudos animais.

Ensaio de Iise de RBC para detecção de atividade de alfa-toxina de Clostri- dium perfringens

Preparação de padrão de PLC. O padrão de PLC Iiofilizado (Sigma P-4039, 500 unidades, Lote N2: 014K86152) foi aberto em uma câ- mara de biossegurança limpa. O conteúdo do frasco de PLC foi reidratado com DPBS estéril (N2 de Catálogo Cellgro: 21-031-CV) até uma concentra- 10 ção final de 106 unidades de PLC/ml, para uso como solução de estoque. A solução de estoque foi armazenada em alíquotas de 50 em tubos criogêni- cos a -80°C até ser utilizada.

Tampão de borato de cálcio. Foi usado tampão de borato de cál- cio para diluir todas as amostras testadas. O tampão foi preparado com o 15 uso do seguinte procedimento: ácido bórico 200 mM (Sigma) e cloreto de cálcio 1,3 mM (Sigma) dissolvidos em 500 ml de água RO/Dl. pH até 7,6 com 100 mM tetraborato de sódio (Borax) (19 g/500 ml de água RO/Dl); vo- lume ajustado até 1 litro. O tampão foi armazenado em temperatura ambien- te, com uma data de validade de um ano.

Solução a 1% (v/v) de células sanguíneas vermelhas. Uma solu-

ção a 1% (v/v) de RBCs de galinha (cRBC) (Colorado Serum Company: N2 de Catálogo CS 1151) foi preparada using DPBS para lavagem e diluição da seguinte forma:

1. Transferir 5 ml de cRBCs em solução de Alsevers em um tubo cônico de 15 ml.

2. Centrifugar a 250 x g por 10 minutos para peletizar as cRBCs.

3. Aspirar o sobrenadante e as células sanguíneas brancas da parte de cima do pélete.

4. Ressuspendero pélete em 10 ml de solução salina.

5. Peletizar as células a 250 x g por 10 minutos.

6. Repetir as etapas 3-5 mais duas vezes, ou até que o sobre- nadante esteja transparente (caso o sobrenadante permaneça vermelho a- pós a terceira lavagem em solução salina, as cRBCs do estoque estão muito velhas e devem ser destruídas. Observe que as cRBCs em solução de Alse- vers são estáveis por aproximadamente 2 semanas a 2-7°C).

7. Após a lavagem final em solução salina, aspirar o sobrena- dante e salvar o pélete de cRBC compactado.

8. Diluir as cRBCs até 1% (v/v) em tampão de DPBS. Observe que são necessários aproximadamente 5 ml da solução de cRBC 1% por placa no teste.

9. Determinar a absorbância a 540 nm das células sanguíneas Iisadas na solução a 1%. A faixa aceitável é de 0,4 - 0,5 de A540.

i. Transferir 400 litros da solução de cRBC a 1% (v/v) para um tubo pequeno e adicionar 1,6 ml de água RO/Dl.

ii. Turbilhonar na maior velocidade por 20 segundos para Iisar as

células.

iii. Zerar o espectrofotômetro com 400 μΙ de tampão de DPBS

em 1,6 ml de água a 540 nm.

iv. Transferir a solução de cRBCs Iisadas para um cadinho e Ier a absorbância a 540 nm.

v. Caso a absorbância a 540 nm seja de 0,4 a 0,5, a solução 1 % é aceitável para uso no ensaio. Caso a absorbância a 540 nm seja < 0,4 ou

> 0,5, a solução 1% deve ser ajustada por adição de tampão de DPBS para diminuir a absorbância até a faixa adequada ou por adição de mais cRBCs do pélete de células para aumentar a absorbância. Caso a solução 1% seja ajustada em função de uma absorbância a 540 nm que esteja fora dos Iimi- 25 tes, a solução de cRBC ajustada deve ser lisada, e a nova A540 determinada. Alternativamente, pode ser preparada uma nova solução de cRBC 1%, e essa testada novamente, caso a solução 1% inicial esteja fora da faixa.

Procedimento do ensaio. Os poços de uma placa de 96 poços com fundo em "U" (N2 de Catálogo Falcon: 35-3918) foram carregados com 50 μΙ de tampão de borato de cálcio. A amostra ou a solução de estoque de PLC (50 μΙ) foi então adicionada ao primeiro poço de uma fileira ou coluna. A amostra ou o controle foi misturado e diluído serialmente aos poços subse- quentes por transferência de 50 μΙ, até a diluição final desejada ser obtida. Os 50 μΙ restantes foram removidos do último poço de diluição e descarta- dos, de tal forma que cada poço contivesse 50 μΙ de amostra ou controle. Cinqüenta μΙ de solução de RBCs 1 % foram então adicionados a todos os 5 poços e a placa foi misturada em uma agitadora de placas por 30 segundos. A placa foi incubada a 37°C ± 2°C por uma hora. Uma leitora de placas foi usada para determinar a absorbância de cada poço a 620 nm. Uma imagem da placa também foi capturada com a utilização de um dispositivo de registro de imagens "Syngene GeneGenius Bio Imaging System".

Os dados da Iise de RBC foram analisados com o uso dos valo-

res de A62o- bem como por uma análise visual qualitativa dos poços na placa. A Iise completa de RBCs era indicada por um valor de A62O baixo e por um poço turvo sem células coletadas no fundo da placa. A Iise parcial produz um poço turvo com um pequeno "botão" de RBC no fundo da placa que é menor 15 do que os poços de controle. A ausência de Iise era indicada por uma cole- ção completa de todos os RBCs no fundo do poço e um tampão transparen- te acima da coleção de RBCs. A Iise de RBCs era uma indicação in vitro de atividade biológica da amostras e/ou dos controles.

As amostras foram testadas ao lado de padrões contendo con- 20 centrações conhecidas de PLC, o que permite a determinação da concentra- ção de PLC em uma amostra por comparação com uma curva-padrão. Os controles negativos incluíam tampão sem amostra ou padrão e RBCs 1% sem tampão. A validade do ensaio dependia dos controles negativos que indicam ausência de atividade de Iise em qualquer diluição.

Teste de proteínas de Mcpa recombinantes purificadas de fontes

bacterianas. A cpa mutante (Mcpa) foi expressa e purificada a partir de Pseudomonas fiuorescens (Pf) para uso como um antígeno de referência (Exemplos 3 e 4). A versão 6X-his-tagged de Mcpa (ID. DE SEQ. N2: 10. Lote N2: DAS F1041-188-2, Exemplo 3) foi avaliada no ensaio de Iise de 30 RBC e não foi detectada nenhuma atividade hemolítica na concentração máxima testada (500 ±g/ml, Tabela 4). Também foi gerada em Pfuma ver- são não-marcada (Mcpa NHT, ID. DE SEQ. N2: 12, Exemplo 4) e purificada (Ns de Lote: E2036-70-1072295). No entanto, verificou-se que essa proteína lisa RBCs em concentrações tão reduzidas quanto 7,81 μςΑηΙ. Na medida em que a cauda de histidina (His-tag) não estava presente para purificação, foi usado um método alternativo que inclui o detergente Triton X-100 (0,5% 5 v/v) no tampão de purificação. Foi especulado que o Triton X-100 residual na preparação talvez seja responsável pela hemólise. Foi produzido outro lote de Mcpa NHT (N2 de Lote: E2036-88-96) com uma remoção mais cuidadosa do detergente, e testado no ensaio de Iise de RBC. Os resultados indicaram que, quando o Triton X-100 era removido mais completamente, a atividade 10 de Iise de RBC não era detectada (Figura 8). O Lote E2036-88-96 de Mcpa NHT na ausência de Triton X-100 residual não Iisou RBCs de galinha até uma concentração de 500 μρ/ιτιΙ. Os pontos finais da atividade de PLC em todos os três lotes de Mcpa estão resumidos na Tabela 4.

Ensaio de lecitinase para detecção de atividade de alfa-toxina de Clostridium perfringens.

Emulsão de gema de ovo. Emulsão de gema de ovo (Oxoid SR0047C) foi usada como a fonte de Iecitina para o ensaio in vitro. A emul- são foi centrifugada a 10.000 x g por 20 minutos. O sobrenadante foi coleta- do e diluído a 1:8 com tampão de borato de cálcio 0,9% (CaCI 0,002 M, H3BO3 0,2 M, pH 7,6).

Procedimento do ensaio. Alíquotas de 50 μΙ de amostras de tes- te e controle positivo de fosfolipase C (PLC) (descrito previamente, Sigma P- 4039) foram adicionados aos poços de uma placa de 96 poços. Cada amos- tra foi diluída serialmente em tampão de borato de cálcio, mantendo um vo- 25 lume total de 50 μΙ por poço. Cinqüenta μΙ de emulsão de gema de ovo fo- ram então adicionados por poço. A placa foi colocada em uma agitadora por 30 segundos, e lida a 620 nm para uma leitura basal. A placa foi incubada a 37°C por 1 hora, e foi feita uma leitura final da placa a 620 nm. Foi calculado o aumento dos valores da A62o em 1 hora em relação à leitura basal. A ativi- 30 dade de PLC foi interpretada como um aumento de 50% ou mais na turva- ção do poço. Os cálculos foram feitos com o uso da seguinte equação:

% de aumento da turvação = [100 X (leitura em 1 hora / leitura a O hora)] - 100

Teste de proteínas de Mcpa recombinantes purificadas de fontes bacterianas. Mcpa com cauda de histidina e Mcpa sem cauda de histidina (Mcpa NHT) dos Exemplos 3 e 4, expressas e purificadas por P. fiuorescens 5 foram avaliadas quanto à atividade de lecitinase. A proteína de Mcpa com cauda de histidina demonstrou ausência de atividade de PLC no ensaio de lecitinase, quando testada até uma concentração de 1.000 μς/ιτιΙ. Os antíge- nos de Mcpa NHT não exibiram atividade lecitinase até a concentração má- xima testada, 500 μg/ml (Figura 9).

A avaliação de lecitinase e de hemólise dos antígenos de Mcpa

purificada demonstraram que essas atividades de α-toxina foram acentua- damente reduzidas ou eliminadas por meio do design de novas mutações pontuais da proteína de comprimento total.

EXEMPLO 6

VACINAÇÃO SUBCUTÂNEA COM ALFA TOXINA RECOMBINANTE MU- TANTE PARA PROTEÇÃO DE GALINHAS CONTRA ENTERITE NECRÓ- TICA

Preparação da vacina. Amostras Iiofilizadas de Mcpa purificada e Mcpa NHT, como descritas nos Exemplos 3 e 4 (Números de Lote 20 DASF1197-08-03, Mcpa (Pf)\ e DASE2036-88-96, Mcpa sem cauda de histi- dina (PJ)) foram armazenadas a -20°C antes de sua utilização. Para formu- lação da vacina, os antígenos foram reidratados com água estéril e EDTA 1 mM foi adicionado. Mcpa e Mcpa NHT foram formuladas com polímero acrí- lico de Iecitina mais colesterol Quil A (LAP/QAC) com uma proporção de Quil 25 A:colesterol de 1:1 ou 4:1 por peso, como indicado no design do estudo (Ta- bela 5).

Procedimento do estudo. Frangos Cornish Rock foram recebidos no dia da eclosão (Dia 0) de McMurray Hatchery, Webster City. IA, e abriga- dos em chocadeiras em tabuleiro em serragem com iluminação contínua. 30 "Low-protein-Fish Meal Starter" (LP-FM Starter, Número de Lote 092505) suplementado com zinco até 400 ppm foi fornecido (APÊNDICE para o E- xemplo 6) na quantidade de aproximadamente 750 g por dia por grupo de tratamento; os pintos tiveram livre acesso à água.

As aves foram vacinadas nos 5o e 15° Dias, como indicado no design do estudo. As vacinas foram formuladas no dia da injeção e adminis- tradas por via subcutânea na parte posterior do pescoço.

5 No 8o Dia, a dieta dos pintos foi mudada para "High Protein-Fish

Meal Grower" (HP-FM Grower, Número de Lote 100405) suplementado com zinco até 400 ppm pela duração do estudo (APÊNDICE para o Exemplo 6).

A ração foi retirada no 24° Dia por aproximadamente 20 horas. Após o ataque, duas vezes por dia, por 4 dias, com Cp cepa JGS 4143 na 10 ração (100 g de ração por 125 ml de cultura). O componente de Cp da mistu- ra foi preparado da seguinte forma: culturas de Cp armazenadas a -80°C foram inoculadas em volumes de 100 ml de meios líquidos de tioglicolato (FTG) e incubadas a 37 ± 2°C por 18 horas. Um inóculo de 5% foi transferido em volumes de 100 ml de meio de carne cozida (CMM), seguido por incuba- 15 ção a 37°C ± 2°C por 18 horas. Finalmente, volumes de 1 litro de FTG inocu- Iados com 5% da cultura de CMM foram incubados a 37°C ± 2°C por 18 ho- ras, antes da mistura com a ração.

As aves foram observadas quanto aos sinais de NE (depressão, inapetência, mal estar, diarréia, penas desordenadas), e as que exibem si- nais severos foram sacrificadas para necropsia e pontuação da lesão. As aves sobreviventes foram submetidas à necropsia e as pontuações de lesão registradas no 29° Dia.

Sistema de pontuação para necropsia 0: sem lesões macroscópicas 1+: intestino delgado dilatado e com paredes finas ou friáveis;

contém conteúdo amarelo/marrom, aquoso, com cheiro ruim; camada muco- sa espessada separada da muscular da mucosa; erosão ou desprendimento das pontas das vilosidades, acúmulo de restos necróticos, fibrina e bactérias 2+: edema e hiperemia; necrose focal ou ulceração do intestino delgado; erosão moderada das pontas das vilosidades

3+: grandes placas de necrose e ulceração; hemorragia; des- prendimento da mucosa * 4+: necrose de todo o revestimento do intestino, incluindo des-

prendimento completo em áreas distintas; pseudomembrana frequentemente presente; erosão das vilosidades; típico de casos de campo

Análise dos dados. As pontuações das lesões para todos os tra- 5 tamentos foram analisadas, inicialmente, em conjunto como uma lista sim- ples de tratamentos sem estrutura. A seguir, um subconjunto de tratamentos T4-T7 foi adicionalmente analisado como uma Fatorial com dois níveis. O primeiro nível comparou Mcpa Tagged vs Non-tagged e o Segundo nível comparou as proporções de LAP/QAC de 1:1 a 4:1. Os dados de pontuação 10 da lesão foram analisadas como uma medida categórica ordenada e a análi- se foi uma análise de Contingência. Se essa análise fosse significante, os tratamentos individuais eram então comparados com o uso de análises de contingência simples de cada par de tratamentos possível. Todas as análi- ses foram realizadas com a utilização do pacote estatístico JMP.

Pontuações das lesões. A frequência de pontuações da lesão

por grupo de tratamento é resumida na Tabela 6. A análise mostrou diferen- ças significantes entre os tratamentos (p = 0,001). Um gráfico em mosaico (Figura 10) ilustra a frequência de pontuações de lesão por grupo, com aves não pontuáveis removidas do conjunto de dados. A análise revelou que to- 20 dos os tratamentos atacados foram significativamente diferentes do controle não atacado e que o tratamento T4 (Mcpa(P/)[LAP/QAC 4:1]) e o tratamento T6 (Mcpa sem cauda de histidina(PALAP/QAC 4:1]) foram significativamente diferentes dos controles atacados não vacinados (p = 0,0239 e p = 0,0116, respectivamente, Tabela 7). Esses dados indicam fortemente que as alfa- 25 toxinas recombinantes mutantes derivadas de Pf, tagged ou nontagged, com o adjuvante LAP/QAC 4:1 foram eficazes na redução da gravidade de lesões de enterite necrótica em pintos, quando administradas como uma vacina subcutânea. APÊNDICE PARA O EXEMPLO 6 Composição da racão

"Low Protein --- Fish Meal Starter" (L P-FM) Componente % de Composição Trigo (FeedmiII) 85,00 Farelo de soja (BuIk) 3,00 Farelo de peixe 6,00 Gordura líquida (BuIk) 2,00 Di-Cal (Co-Phos) 0,74 Calcário 0,90 Sal grosso 0,36 Microminerais 0,10 Vitaminas A-D-E 0,10 Metionina 0,10 Dyna K KCI 0,80 Lisina 0,90 Total I 100,00 Zinco suplementado até aproximadamente 400 ppm

"High Protein-Fish Meal Grower" (HP-FM Grower) Componente % de Composição Trigo (FeedmiII) 33,5 Farelo de soja (BuIk) 14,7 Farelo de peixe 50,0 Gordura líquida (BuIk) 1,25 Calcário 1,75 Sal grosso 0,225 Microminerais 0,075 Vitaminas A-D-E 0,075 Total 100 Zinco suplementado até aproximadamente 400 ppm

Tabela 1. Variações em alfa-toxinas de galinha comparadas com Cepa 13 (isolado humano) AA No. Str13* Tipo I* Tipo II* Tipo III* Tipo IV* Tipo V* Tipo Vl 13 T A A T A A T 15 A A A V A A A 22 A A A V A A A 47 V V V V V V I 54 L L L M M L L 71 E E E D E E Q 149 L L L I L L L 202 D D D D D A A 205 A A A A A T A 373 I I V V I I V *Sheedy e cols. (2004) Tabela 2. Representação de códon sinônimos em regiões codificadoras de 32.630 genes de Oryza sativa (arroz) (Colunas C e I), e 1.268 genes de Nicotiana tabacum (tabaco) (Colunas D e J). Os valores para uma representação equilibrada de códons ajustados para um design de gene sintético otimizado de planta estão nas Colunas FeL

A B C D E F G H I J K L Aminoácido Códon Arroz % Tabaco % Média arroz - Média Ponderada Aminoácido Códon Arroz % Tabaco % Média arroz - Média tabaco tabaco Ponderada ALA (A) GCA 18,8 31,0 24,9 30,4 LEU (L) CTA 9,0 10,5 NA DNU GCC 32,3 17,3 24,8 30,2 CTC 27,3 13,0 20,2 25,6 GCC 27,9 8,1 NA DNU CTG 22,6 11,2 16,9 21,4 GCT 21,0 43,6 32,3 39,4 CTT 16,8 25,9 21,3 27,0 ARG (R) AGA 15,0 31,7 23,3 32,8 TTA 7,3 15,3 NA DNU AGG 21,8 24,6 23,3 32,6 TTG 16,9 24,0 20,5 26,0 CGA 10,4 11,9 11,2 15,7 LYS (K) AAA 34,3 50,0 42,1 42,1 CGC 22,5 8,1 NA DNU AAG 65,7 50,0 57,9 57,9 CGG 19,4 7,7 NA DNU MET (M) ATG 100,0 100,0 100,0 100,0 CGT 11,0 16,00 13,5 19,0 PHE (F) TTC 61,6 41,9 51,8 51,8 A B C D E F G H I J K L Aminoácido Códon Arroz % Tabaco % Média arroz - Média Ponderada Aminoácido Códon Arroz % Tabaco % Média arroz - Média tabaco tabaco Ponderada ASN (N) AAC 54,7 39,4 47,1 47,1 TTT 38,4 58,1 48,2 48,2 AAT 45,3 60,6 52,9 52,9 PRO (P) CCA 24,8 38,9 31,8 31,8 ASP (D) GAC 52,2 31,1 41,6 41,6 CCC 21,1 13,6 17,3 17,3 GAT 47,8 68,9 58,4 58,4 CCG 30,5 10,0 20,3 20,3 CYS (C) TGC 65,2 42,6 53,9 53,9 CCT 23,7 37,5 30,6 30,6 TGT 47,8 57,4 46,1 46,1 SER (S) AGC 20,3 12,5 16,4 18,5 END TAA 24,7 42,6 33,7 AGT 11,6 17,3 14,5 16,3 TAG 31,8 19,6 25,7 TCA 15,5 22,6 19,0 21,5 TGA 43,5 37,8 40,6 TCC 20,5 14,1 17,3 19,6 GLN (Q) CAA 41,0 58,9 50,0 50,0 TCG 15,8 7,2 NA DNU CAG 59,0 41,1 50,0 50,0 TCT 16,4 26,2 21,3 24,1 GLU (E) GAA 36,9 55,7 46,3 46,3 THR (T) ACA 23,7 32,7 28,2 33,7 GAG 63,1 44,3 53,7 53,7 ACC 30,5 19,1 24,8 29,6 Oi

-F=> A B C D E F G H I J K L Aminoácido Códon Arroz % Tabaco % Média arroz - Média Ponderada Aminoácido Códon Arroz % Tabaco % Média arroz - Média tabaco tabaco Ponderada GLY (G) GGA 21,4 34,6 28,0 28,0 ACG 23,6 8,8 DNU DNU CCC 37,0 16,2 26,6 26,6 ACT 22,3 39,4 30,8 36,8 GGG 22,3 15,4 18,9 18,9 TRP (W) TGG 100,0 100,0 100,0 100,0 GGT 19,3 33,7 26,5 26,5 TYR (Y) TAC 58,8 41,4 50,1 50,1 HIS(H) CAC 54,5 38,3 46,4 46,4 TAT 41,2 58,6 49,9 49,9 CAT 45,5 61,7 53,6 53,6 VAL (V) GTA 10,7 18,3 NA DNU ILE (!) ATA 20,8 25,8 23,3 23,3 GTC 29,8 17,0 23,4 27,4 ATC 45,2 24,6 34,9 34,9 GTG 36,1 24,3 30,2 35,3 ATT 34,0 49,6 41,8 41,8 GTT 23,4 40,4 31,9 37,3 **ΝΑ = Não aplicável

***DNU = Não usar Tabela 3. Composições de códons de regiões codificadoras para proteína madura de alfa-toxina (370 aminoácidos). A região codificadora da alfa-toxina nativa de C. perfringens é comparada com uma versão otimizada de planta contendo três mutações.

Aminoác. Códon Gene Gene Gene de Gene de Recomend. Aminoác. Códon Gene Gene Gene de Gene de Recomend. nativo # nativo % planta planta pI planta nativo # nativo % planta planta pI planta otim. # otim. % otimizada otim. # otim. % otimizada ALA (A) GCA 12 44,4 7 25,9 30,4 LEU (L) CTA 4 25,0 0 0,0 DNU GCC 0 0,0 9 33,3 30,2 CTC 0 0,0 4 23,5 25,6 GCG 0 0,0 0 0,0 DNU CTG 1 6,3 4 23,5 21,4 GCT 15 55,6 11 40,7 39,4 CTT 2 12,5 4 23,5 27,0 ARG (R) AGA 8 88,9 3 33,3 32,8 TTA 9 56,3 0 0,0 DNU AGG 1 11,1 3 33,3 32,6 TTG 0 0,0 5 29,4 26,0 CGA 0 0,0 1 11,1 15,7 LYS (K) AAA 25 69,4 14 38,9 42,1 CGC 0 0,0 0 0,0 DNU AAG 11 30,6 22 61,1 57,9 CGG 0 0,0 0 0,0 DNU MET (M) ATG 8 100,0 8 100,0 100,0 CGT 0 0,0 2 22,2 19,0 PHE (17) TTC 6 40,0 9 60,0 51,8 ASN (N) AAC 6 23,1 11 42,3 47,1 TTT 9 60,0 6 40,0 48,2 AAT 20 76,9 15 57,7 52,9 PRO (P) CCA 6 60,0 3 30,0 31,8 Aminoác. Códon Gene Gene Gene de Gene de Recomend. Aminoác. Códon Gene Gene Gene de Gene de Recomend. nativo # nativo % planta planta pI planta nativo # nativo % planta planta pI planta otim. # otim. % otimizada otim. # otim. % otimizada ASP (D) GAC 5 14,3 15 44,1 41,6 CCC 0 0,0 2 20,0 17,3 GAT 30 85,7 19 55,9 58,4 CCG 1 10,0 2 20,0 20,3 CYS (C) TGC I 100,0 1 100,0 53,9 CCT 3 30,0 3 30,0 30,6 TGT 0 0,0 0 0,0 46,1 SER (S) AGC 0 0,0 4 16,7 18,5 END TAA 1 100,0 0 0,0 ACT 9 37,5 4 16,7 16,3 TAG 0 0,0 0 0,0 TCA 11 45,8 6 25,0 21,5 TGA 0 0,0 1 100,0 1,0 TCC 1 4,2 4 16,7 19,6 GLN (Q) CAA 9 81,8 6 54,5 50,0 TCG 0 0,0 0 0,0 DNU CAG 2 18,2 5 45,5 50,0 TCT 3 12,5 6 25,0 24,1 GLU (E) GAA 14 63,6 10 47,6 46,3 THR (T) ACA 10 41,7 7 29,2 33,7 GAG 8 36,4 11 52,4 53,7 ACC 0 0,0 6 25,0 29,6 GLY (G) GGA 16 64,0 8 29,6 28,0 ACG 0 0,0 0 0,0 DNU GCC 1 4,0 8 29,6 26,6 ACT 14 58,3 11 45,8 36,8 GGG 2 8,0 3 11,1 18,9 TRP (W) TGG 10 100,0 10 100,0 100,0 GGT 6 24,0 8 29,6 26,5 TYR (Y) TAC 4 15,4 14 53,8 50,1 Aminoác. Códon Gene Gene Gene de Gene de Recomend. Aminoác. Códon Gene Gene Gene de Gene de Recomend. nativo # nativo % planta planta pI planta nativo # nativo % planta planta pI planta otim. # otim. % otimizada otim. # otim. % otimizada HIS (H) CAC 2 22,2 5 62,5 46,4 TAT 22 84,6 12 46,2 49,9 CAT 7 77,8 3 37,5 53,6 VAL (V) GTA 8 57,1 0 0,0 DNU ILE (I) ATA 11 50,0 5 22,7 23,3 GTC 0 0,0 4 28,6 27,4 ATC 3 13,6 8 36,4 34,9 GTG 1 7,1 4 28,6 35,3 ATT 8 36,4 9 _ 40,9 41,8 GTT J 35,7 6 42,9 37,3 Totais 188 187 Totais 183 184 Tabela 4. Ponto final da atividade hemolítica de amostras de Mcpa purificadas e controle. Amostra ou padrão Número de Lote Ponto final da atividade hemolítica diluição/concentração Padrão de PLC 014K86152 0,265 unidades/ml Mcpa DAS F1041-188-2 > 500 ng/ml Mcpa NHT E2036-70-1072295 15,63 μοι/ιτιΙ Mepa NHT E2036-88-96 > 500 μς/ml NHT = nontagged

Tabela 5. Design do estudo clínico para avaliação de antígenos de Mcpa em galinhas jovens. Grupo Tratamento (dias 5 e 15) Ataque n= Vacina (dose/ Ne volume) Antígeno Tampão Adjuvante 1 NA NA NA Não 15 NA 2 Nenhum PBS LAP/QAC (1:1) Sim 15 Nenhum/0,5 ml 3 Mcpa tagged (Pf) PBS + EDTA 1 mM LAP/QAC (1:1) Sim 15 40 mg/0,5 ml 4 Mcpa tagged (Pf) PBS + EDTA 1 mM LAP/QAC (4:1) Sim 15 40 mg/0,5 ml Vlcpa nontagged PBS + EDTA 1 mM LAP/QAC (1:1) Sim 15 40 mg/0,5 ml [Pf) 6 Vlcpa nontagged PBS + EDTA 1 mM LAP/QAC (4:1) Sim 15 40 mg/0,5 ml Pf) PBS = solução salina tamponada com fosfato

LAP/QAC = polímero acrílico de Iecitina mais colesterol Quil A

SQ = administração subcutânea

LAP/QAC (1:1) = polímero acrílico de Iecitina e colesterol Quil A (Quil A : co- lesterol = proporção de 1:1 por peso)

LAP/QAC (4:1) = polímero acrílico de Iecitina e colesterol Quil A (Quil A : co- lesterol = proporção de 4:1 por peso) Tabela 6. Pontuações das lesões por grupo de tratamento. Grupo N- Pontuações das lesões 0 1 + 2+ 3+ 4+ Não pontuá- veis 1 15 2 2 5 6 2 3 1 6 6 2 4 3 4 2 2 5 1 7 3 2 1 6 4 6 2 2 * morte antes do término do estudo; autólise do intestino impediu a pontuação

Tabela 7. Resultados de análise de contingência por pontuações de lesão. Tratamento grupo comparação valor p PBS + atacado vs PBS + não atacado <0,0001 Mcpa + atacado LAP/QAC 1:1 vs PBS + não atacado <0,0001 Mcpa + atacado LAP/QAC 4:1 vs PBS + não atacado <0,0001 Mcpa sem cauda de histidina + atacado LAP/QAC 1:1 vs PBS + não atacado <0,0001 Mcpa sem cauda de histidina + atacado LAP/QAC 4:1 vs PBS + não atacado <0,0001 Mcpa + atacado LAP/QAC 1:1 vs PBS + atacado 0,1374 Mcpa + atacado LAP/QAC 4:1 vs PBS + atacado 0,0239 Mcpa sem cauda de histidina + atacado LAP/QAC 1:1 vs PBS + atacado 0,0743 Mcpa sem cauda de histidina + atacado LAP/QAC 4:1 vs PBS + atacado 0,0116 Mcpa + atacado LAP/QAC 1:1 vs Mcpa + atacado LAP/QAC 4:1 0,4034 Mcpa + atacado LAP/QAC 1:1 vs Mcpa sem cauda de histidina + atacado 0,8125 LAP/QAC 1:1 Mcpa + atacado LAP/QAC 1:1 vs Mcpa sem cauda de histidina + atacado 0,2630 LAP/QAC 4:1 Mcpa + atacado LAP/QAC 4:1 vs Mcpa sem cauda de histidina + atacado 0,5914 LAP/QAC 1:1 Mcpa + atacado LAP/QAC 4:1 vs Mcpa sem cauda de histidina + atacado 0,9799 LAP/QAC 4:1 Mcpa sem cauda de histidina + atacado LAP/QAC 1:1 vs Mcpa sem cauda 0,5381 de histidina + atacado LAP/QAC 4:1 LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> Ainley, William M.

Armstrong, Janna Madduri, Krishna Merlo, Donald Joseph Smith, Kelley A.

Thompson, Mark Webb, Steven R.

Shen, Liu Yin

<120> Vacina para aves domésticas, para enterite necrótica, compreendendo um

antígeno de toxina alfa mutado de clostridium perfringens mutante, e métodos

de produção da vacina

<130> DAS-I37X

<14 0> 60/854 , 741 <141> 2006-10-27

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1197

<212> DNA

<213> Clostridium perfringens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (1194)

<223> Sequencia que codifica proteína <220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (84)

<223> Codifica peptideo sinalizador de secreção nativo

<4 00> 1

atgaaaagaa agatttgtaa ggcacttatt tgtgctacgc tagcaactag cctatgggct 60 ggggcatcaa ctaaagtcta cgcttgggat ggaaagattg atggaacagg aactcatgct 120 atgattgtaa ctcaagggat ttcaatctta gaaaatgatc tgtccaaaaa tgaaccagaa 180 agtgtaagaa aaaacttaga gattttaaag cagaacatgc atgaacttca attaggttct 240 acttatccag attatgataa gaatgcttat gatctatatc aagatcattt ctgggatcct 300 gatacagata ataatttctc aaaggataat agttggtatt tagcttattc tatacctgat 360 acaggggaat cacaaataag aaaattttca gcattagcta gatatgaatg gcaaagagga 420 aactataaac aagctacatt ctatcttgga gaggctatgc actattttgg tgatatagat 480 actccatat c atcctgctaa tgttactgca gttgatagtg caggacatgt taagtttgag 540 acttttgcag ciCJCJclclclCíââÕ agagcagtat aaaataaata caqcaggttg caaaactaat 600 gaggcttttt atgctgatat cttaaaaaac aaagatttta atgcatggtc aaaagaatat 660 gcaaggggtt ttqctaaaac aggaaaatca atatactaca gtcatgctag tatgagtcat 720 agttgggatg attgggatta tgcagcaaaa gtaactctag ctaactctca aaaaggaaca 780 gcaggatata tttatagatt cttacacgat gtatcagagg gtaatgatcc atcagttggc 840 aagaatgtaa aagaactagt agcttacata tcaactagtg gtgaaaaaga tgctggaaca 900 gatgactaca tgtattttgg aatcaaaaca aaggatggaa aaactcaaga atgggaaatg 960 gacaacccgg gaaatgactt tatgactgga agtaaagata cttatacttt caagttaaag 1020 gatgaaaatc taaaaattga tgacatacaa aatatgtgga ttagaaaaag aaaatataca 1080 gcattcccag atgcttataa gccagaaaat ataaaggtaa tagcaaatgg aaaagttgta 1140 gtggacaaag atataaatga gtggatttca ggaaattcaa cttataatat aaaataa 1197 <210> 2

<211> 398

<212> PRT

<213> Clostridium perfringens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) . . (28)

<223> Peptídeo sinalizador de secreção <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (29)..(398)

<223> Proteína madura

<4 00> 2

Met Lys Arg Lys He Cys Lys Ala Leu He Cys Ala Thr Leu Ala Thr 10 15

Ser Leu Trp Ala Gly Ala Ser Thr Lys Val Tyr Ala Trp Asp Gly Lys 20 25 30

He Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met He Val Thr Gln Gly He Ser 35 40 45

He Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu Ser Val Arg Lys 50 55 60

Asn Leu Glu He Leu Lys Gln Asn Met His Glu Leu Gln Leu Gly Ser 65 70 75 80

Thr Tyr Pro Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp Leu Tyr Gln Asp His

85 90 95

Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys Asp Asn Ser Trp 100 105 110

Tyr Leu Ala Tyr Ser He Pro Asp Thr Gly Glu Ser Gln He Arg Lys 115 12 0 125 Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg Gly Asn Tyr Lys Gln 130 135 140

Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe Gly Asp He Asp 145 150 155 160

Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Asp Ser Ala Gly His 165 170 175

Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu Gln Tyr Lys Ile 180 185 190

Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Ala Phe Tyr Ala Asp Ile Leu 195 200 205

Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr Ala Arg Gly Phe 210 215 220

Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His Ala Ser Met Ser His 225 230 235 240

Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr Leu Ala Asn Ser 245 250 255

Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg Phe Leu His Asp Val Ser 260 265 270

Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys Glu Leu Val Ala 275 280 285

Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr Asp Asp Tyr Met 290 295 300

Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln Glu Trp Glu Met 305 310 315 320

Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys Asp Thr Tyr Thr 325 330 335

Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp Ile Gln Asn Met 340 345 350

Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp Ala Tyr Lys Pro

355 360 365

Glu Asn Ile Lys Val Ile Ala Asn Gly Lys Vdl Val Val Asp Lys Asp 370 375 380

He Asr. Glu Trp He Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn Ile Ly 385 390 395 » <210> <211> <212 > <213>

<220>

<221>

<222>

<223>

DNA

<220>

<221>

<222>

<22 3>

kDa

<220>

<221> misc_feature

<222> (229)..(231)

<223> Codifica Mutação D84L (Ácido aspártico a Leucina no aminoácido 84 da proteína nativa)

<220>

<221> misc_feature

<222> (505) .. (507)

<223> Codifica Mutação H176G (Histidina a Glicina no aminoácido 176 da proteína nativa)

<22 0>

<221> misc_feature

<222> (517)..(519)

<223> Codifica Mutação E180G (Ácido glutâmico a Glicina no aminoácido 180 da proteína nativa)

<22 0>

<221> misc_feature

<222> (1171) . . (1182)

<223> Codifica sinal de retenção do Retículo Endoplasmático KDEL <220>

<221> misc_feature

<222> (1185) .. (1211)

<223> Parada da translação de seis-quadro

<4 00> 3

tgggatggaa agattgatgg cactggcact catgccatga ttgtgactca agggatttcc 60 atcttggaaa atgacctctc caagaatgag ccagaaagtg tgaggaagaa cctggagatt 120 ttgaagcaga acatgcatga actccagctt ggttctacct atccgttgta tgacaagaat 180 gcttatgatc tgtaccaaga tcacttctgg gaccctgata cagataacaa tttcagcaag 240 gacaactcat ggtacctggc ttattcaatt ccagacaccg gggaatccca gataaggaag 300 ttctctgcac ttgcaagata tgaatggcaa cgtggcaact acaaacaagc aacattctat 360 cttggtgagg ccatgcacta ct ttggtgat atagacacac cctaccaccc tgccaatgtc 420 actgctgttg acagtgctgg cggtgttaag tttgggacct ttgctgaaga gagaaaagag 480 3

1113

DNA

Clostridium perfringens

misc_feature (1)·■(1211)

Fosfolipase C de Clostridium perfringens mutante isolada de uma ave com sinais direcionado e de retenção ao RE. Esta sequencia de

tem o uso de códons re-trabalhado otimizado para a expressão em tabaco e arroz

misc_feature (1)..(63)

Codifica o sinal direcionado ao retículo endoplasmático de zeína de cagtacaaga taaacacagc aggctgcaaa acaaatgagg ctttctatgc tgacatcttg 540 aagaacaaag atttcaatgc ctggtcaaaa gagtatgcca gaggttttgc caaaactgga 600 aaatccatct attacagcca tgccagcatg agccacagtt gggatgactg ggattatgct 660 gcaaaagtta ctttggcaaa ctctcagaaa ggaactgctg gttacatcta ccgattcctc 720 catgatgtca gtgagggcaa tgatccctct gttggcaaga atgtgaaaga gcttgttgct 780 tacatatcaa cttctggtga gaaagatgct ggaactgatg actacatgta tttcggaatc 840 aagacaaagg atggaaagac ccaagaatgg gaaatggaca accctggaaa tgactttatg 900 acaggttcaa aggacactta cactttcaag ctgaaggatg aaaatctcaa gattgatgac 960 attcaaaaca tgtggattcg taaaaggaaa tacacagcat ttccagatgc ctataagccg 1020 gaaaacatca aggtcatagc aaatggaaag gttgtcgtgg acaaggatat caatgagtgg 1080 atttctggca attcaaccta caatatcaaa tga 1113 <210> 4

<211> 370

<212> PRT

<213> Clostridium perfringens

<22 0>

<221> MISC_FEATURE

<222> (56)..(56)

<223> Resíduo mutado D56L

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (148) .. (148)

<223> Resíduo mutado H148G

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (152) .. (152)

<223> Resíduo mutado E152G

<4 00> 4

Trp Asp Gly Lys Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met Ile Val Thr 10 15

Gln Gly Ile Ser Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu 20 25 30

Ser Val Arg Lys Asn Leu Glu Ile Leu Lys Gln Asn Met His Glu Leu 35 40 45

Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Pro Leu Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp Leu 50 55 60

Tyr Gln Asp His Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys 65 70 75 80

Asp Asn Ser Trp Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly Glu Ser 85

90

95

Gln He Arg Lys Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg Gly 100 105 110

Asn Tyr Lys Gln Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe 115 120 125

Gly Asp Ile Asp Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Asp 130 135 140

Ser Ala Gly Gly Val Lys Phe Gly Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu 145 150 155 160

Gln Tyr Lys Ile Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Ala Phe Tyr 165 170 175

Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr 180 185 190

Ala Arg Gly Phe Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His Ala 195 200 205

Ser Met Ser His Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr 210 215 220

Leu Ala Asn Ser Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg Phe Leu 225 230 235 240

His Asp Val Ser Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys 245 250 255

Glu Leu Val Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr 260 265 270

Asp Asp Tyr Met Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln 275 280 285

Glu Trp Glu Met Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys 290 295 300

Asp Thr Tyr Thr Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp 305 310 315 320

Ile Gln Asn Met Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp 325 330 335

Ala Tyr Lys Pro Glu Asn Ile Lys Val Ile Ala Asn Gly Lys Val Val 340 345 350 Val Asp Lys Asp Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn 355 360 365

Ile Lys 370

<210> 5 <211> 63 <212> DNA

<213> Sequencia artificial <220>

<223> Sequencia de DNA de planta otimizada quimicamente sintetizada para

peptideo direcionado ao retículo endoplasmático de zeína de 15 kDa

modificado

<400> 5

atggctaaga tggtcattgt gcttgttgtg tgcttggctc tctctgctgc ctcagcttct 60

gcc 63 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Sequencia artificial <220> <223> Sequeneia de aminoácido quimicamente sintetizada do peptídeo direcio nado ao retículo endoplasmático de zeína de 15 kDa modificado codificada pela SEQ ID NO:5 <400> 6 Met Ala Lys Met Val Ile Val Leu Val Val Cys Leu Ala Leu Ser Ala 1 5 10 15 Ala Ser Ala Ser Ala 20 <210> 7 <211> 1185 <212> DNA <213> Sequencia artificial <220> <223> Sequencia de DNA de planta otimizada quimicamente sintetizada codifi- cando

proteína de alfa-toxina madura mutada de C. perfringens com peptídeo direcionado ao retículo endoplasmático de zeína de 15 kDa modificado,

e

peptídeo de retenção KDEL ER

<220>

<221> raisc_feature

<222> (1)..(63)

<223> Peptídeo direcionado ao RE com zeína de 15 kDa <220>

<221> mi sc feature <222> (64) .. (1173)

<223> Proteína de alfa-toxina madura mutada de C. perfringens <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1171) .. (1182)

<223> Peptídeo de retenção KDEL ER

<4 00> 7

atggctaaga tggtcattgt gcttgttgtg tgcttggctc tctctgctgc ctcagcttct 60 gcctgggatg gaaagattga tggcactggc actcatgcca tgattgtgac tcaagggatt 120 tccatcttgg aaaatgacct ctccaagaat gagccagaaa gtgtgaggaa gaacctggag 180 attttgaagc agaacatgca cgaactccag cttggttcta cctatccgtt gtatgacaag 240 aatgcttatg atctgtacca agatcacttc tgggaccctg atacagataa caatttcagc 300 aaggacaact catggtacct ggcttattca attccagaca ccggggaatc ccagataagg 360 aagttctctg cacttgcaag atatgaatgg caacgtggca actacaaaca agcaacattc 420 tatcttggtg aggccatgca ctactttggt gatatagaca caccctacca ccctgccaat 480 gtcactgctg ttgacagtgc tggcggtgtt aagtttggga cctttgctga agagagaaaa 540 gagcagtaca agataaacac agccggctgc aaaacaaatg aggctttcta tgctgacatc 600 ttgaagaaca aagatttcaa tgcctggtca aaagagtatg ccagaggttt tgccaaaact 660 ggaaaatcca tctattacag ccatgccagc atgagccaca gttgggatga ctgggattat 720 gctgcaaaag ttactttggc aaactctcag aaaggaactg ctggttacat ctaccgattc 780 ctccatgatg tcagtgaggg caatgatccc tctgttggca agaatgtgaa agagcttgtt 840 gcttacatat caacttctgg tgagaaagat gctggaactg atgactacat gtatttcgga 900 atcaagacaa aggatggaaa gacccaagaa tgggaaatgg acaaccctgg aaatgacttt 960 atgaccggtt caaaggacac ttacactttc aagctgaagg atgaaaatct caagattgat 1020 gacattcaaa acatgtggat tcgtaaaagg aaatacacag catttccaga tgcctataag 1080 ccggaaaaca tcaaggtcat agcaaatgga aaggttgtcg tggacaagga tatcaatgag 1140 tggatttctg gcaattcaac ctacaatatc aaagatgagc tttga 1185 <210> 8 <211> 394 <212> PRT

<213> Sequencia artificial <22 0>

<223> Proteína de fusão quimicamente sintetizada da proteína de alfa-toxina madura mutada de C. perfringens do peptídeo direcionado ao retículo endo- plasmático de zeína de 15 kDa, e peptídeo de retenção KDEL ER

<22 0>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (21)

<22^' R.E cciT; zGíric. cis 15 kDs psptídsc cüirsci-onâcJc

< 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (22) . . (391)

<223> Proteína de alfa-toxina madura mutada de C. perfringens

<220>

<221> misc_feature <222> (391) . . (394)

<223> Peptídeo de retenção KDEL ER <4 00> 8

Met Ala Lys Met Val Ile Val Leu Val Val Cys Leu Ala Leu Ser Ala 15 10 15

Ala Ser Ala Ser Ala Trp Asp Gly Lys Ile Asp Gly Thr Gly Thr His 20 25 30

Ala Met Ile Val Thr Gln Gly Ile Ser Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser 35 40 45

Lys Asn Glu Pro Glu Ser Val Arg Lys Asn Leu Glu Ile Leu Lys Gln 50 55 60

Asn Met His Glu Leu Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Pro Leu Tyr Asp Lys

65 70 75 80

Asn Ala Tyr Asp Leu Tyr Gln Asp His Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp 85 90 95

Asn Asn Phe Ser Lys Asp Asn Ser Trp Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro 100 105 110

Asp Thr Gly Glu Ser Gln Ile Arg Lys Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr 115 120 125

Glu Trp Gln Arg Gly Asn Tyr Lys Gln Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu 130 135 140

Ala Met His Tyr Phe Gly Asp Ile Asp Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn 145 150 155 160

Val Thr Ala Val Asp Ser Ala Gly Gly Val Lys Phe Gly Thr Phe Ala 165 170 175

Giu Glu Arg Lys Glu Gln Tyr Lys Ile Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr 180 185 190

Asn Glu Ala Phe Tyr Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala 195 200 205

Trp Ser Lys Glu Tyr Ala Arg Gly Phe Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile 210 215 220 Tyr Tyr Ser His Ala Ser Met Ser His Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr * 225 230 235 240

Ala Ala Lys Val Thr Leu Ala Asn Ser Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr 245 250 255

Ile Tyr Arg Phe Leu His Asp Val Ser Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val 260 265 270

Gly Lys Asn Val Lys Glu Leu Val Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu 275 280 285

Lys Asp Ala Gly Thr Asp Asp Tyr Met Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys 290 295 300

Asp Gly Lys Thr Gln Glu Trp Glu Met Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe 305 310 315 320

Met Thr Gly Ser Lys Asp Thr Tyr Thr Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn 325 330 335

Leu Lys Ile Asp Asp Ile Gln Asn Met Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr 340 345 350

Thr Ala Phe Pro Asp Ala Tyr Lys Pro Glu Asn Ile Lys Val Ile Ala

355 360 365

Asn Gly Lys Val Val Val Asp Lys Asp Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly 370 375 380

Asn Ser Thr Tyr Asn Ile Lys Asp Glu Leu 385 390

<210> 9 <211> 1265 <212> DNA

<213> Sequencia artificial <220>

<223> Codifica fosfolipase C mutante com cauda de histidina, sitio de reco nhecimento

de trombina, cauda de S and sítio de reconhecimento de enteroquinase

<220>

<221> misc_feature <222> (1) . . (1269)

<2 2 0>

<221> miscfeature <222> (1) (159)

<223> Sequencia codificando para cauda de histidina, sítio de reconhecimen to de

trombina, Cauda de S e sítio de reconhecimento de enteroquinase <220>

<221> misc_feature

<222> (325)..(327)

<223> Codifica Mutação D84L (Ácido aspártico a Leucina no aminoácido 84 da proteína nativa)

<220>

<221> misc_feature

<222> (601)..(603)

<223> Codifica Mutação H176G (Histidina a Glicina no aminoácido 176 da proteína nativa)

<220>

<221> misc_feature

<222> (613) .. (615)

<223> Codifica Mutação E180G (Ácido glutâmico a Glicina no aminoácido 180 da proteína nativa)

<400> 9

atgcatcacc atcaccatca ctccgcgggt ctggtgccac gcggtagtac tgcaattggt 60 atgaaagaaa ccgctgctgc taaattcgaa cgccagcaca tggacagccc agatctgggt 120 accggtggtg gctccggtga tgacgacgac aagagtccat gggatggaaa gattgatggc 180 actggcactc atgccatgat tgtgactcaa gggatttcca tcttggaaaa tgacctctcc 240 aagaatgagc cagaaagtgt gaggaagaac ctggagattt tgaagcagaa catgcacgaa 300 ctccagcttg gttctaccta tccgttgtat gacaagaatg cttatgatct gtaccaagat 360 cacttctggg accctgatac agataacaat ttcagcaagg acaactcatg gtacctggct 420 tattcaattc cagacaccgg ggaatcccag ataaggaagt tctctgcact tgcaagatat 480 gaatggcaac gtggcaacta caaacaagca acattctatc ttggtgaggc catgcactac 540 tttggtgata tag acaca.cc ctaccaccct gccaatgtca ctgctgttga cagtgctggc 600 ggtgttaagt ttgggacctt tgctgaagag agaaaagagc agtacaagat aaacacagcc 660 ggctgcaaaa caaatgaggc tttctatgct gacatcttga agaacaaaga tttcaatgcc 720 tggtcaaaag agtatgccag aggttttgcc aaaactggaa aatccatcta ttacagccat 780 gccagcatga gccacagttg ggatgactgg gattatgctg caaaagttac tttggcaaac 840 tctcagaaag gaactgctgg ttacatctac cgattcctcc atgatgtcag tgagggcaat 900 gatccctctg ttggcaagaa tgtgaaagag cttgttgctt acatatcaac ttctggtgag 960 aaagatgctg gaactgatga ctacatgtat ttcggaatca agacaaagga tggaaagacc 1020 caagaatggg aaatggacaa ccctggaaat gactttatga ccggttcaaa ggacacttac 1080 actttcaagc tgaaggatga aaatctcaag attgatgaca ttcaaaacat gtggattcgt 1140 aaaaggaaat acacagcatt tccagatgcc tataagccgg aaaacatcaa ggtcatagca 1200 aatggaaagg 11 gtcgtgga caagqatatc aatgagtgga tttctggcaa ttcaacctac 1260 aatatcaaa 1269 <210> 10 <2 11 > 423 <212 > PRT <213> Sequencia artificial

*

<220>

<223> Proteína quimicamente sintetizada codificada pela SEQ ID NO:9

<220>

<221> misc_feature <222> (1) . . (423)

<223> Fosfolipase C mutante com cauda de histidina, sítio de reconhecimento de

trombina, cauda de S e sítio de reconhecimento de enteroquinase

<220>

<221> misc__feature <222> (1)..(53)

<223> Cauda de histidina, sítio de reconhecimento de trombina, cauda de S e sítio de reconhecimento de enteroquinase

<22 0>

<221> misc_feature <222> (109)..(109)

<223> Mutação D84L (Ácido aspártico a Leucina no aminoácido 84 da proteína nativa)

<22 0>

<221> misc_feature <222> (201)..(201)

<223> Mutação H176G (Histidina a Glicina no aminoácido 176 da proteína nativa)

<22 0>

<221> misc_feature <222> (205)..(205)

<223> Mutação E180G (Ácido glutãmico a Glicina no aminoácido 180 da proteína nativa)

<4 00> 10

Met His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser 15 10 15

Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln 20 25 30

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly Asp Asp 35 4 0 4 5

Asp Asp Lys Ser Pro Trp Asp Gly Lys Ile Asp Gly Thr Gly Thr His 50 55 60

Ala Met Ile Val Thr Gln Gly Ile Ser Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser

65 70 75 80

Lvs Asn Glu Pro Glu Ser Val Arg Lys Asn Leu Glu Ile Leu Lys Gln 85 90 95

Asn Met His Glu Leu Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Pro Leu Tyr Asp Lys 100 105 110 Asn Ala Tyr Asp Leu Tyr Gln Asp His Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp 115 120 125

Asn Asn Phe Ser Lys Asp Asn Ser Trp Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro 130 135 140

Asp Thr Gly Glu Ser Gln Ile Arg Lys Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr 145 150 155 160

Glu Trp Gln Arg Gly Asn Tyr Lys Gln Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu 165 170 175

Ala Met His Tyr Phe Gly Asp Ile Asp Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn 180 185 190

Val Thr Ala Val Asp Ser Ala Gly Gly Val Lys Phe Gly Thr Phe Ala 195 200 205

Glu Glu Arg Lys Glu Gln Tyr Lys Ile Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr 210 215 220

Asn Glu Ala Phe Tyr Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala 225 230 235 240

Trp Ser Lys Glu Tyr Ala Arg Gly Phe Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile 245 250 255

Tyr Tyr Ser His Ala Ser Met Ser His Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr 260 265 270

Ala Ala Lys Val Thr Leu Ala Asn Ser Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr 275 280 285

Ile Tyr Arg Phe Leu His Asp Val Ser Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val 290 295 300

Gly Lys Asn Val Lys Glu Leu Val Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu 305 310 315 320

Lys Asp Ala Gly Thr Asp Asp Tyr Met Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys 325 330 335

Asp Gly Lys Thr Gln Glu Trp Glu Met Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe 340 345 350

Met Thr Gly Ser Lys Asp Thr Tyr Thr Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn 355 360 365

Leu Lys He Asp Asp Ile Gln Asn Met Trp He Arg Lys Arg Lys Tyr 370 375 380 Thr Ala Phe Pro Asp Ala Tyr Lys Pro Glu Asn Ile Lys Val He Ala 385 390 395 400

Asn Gly Lys Val Val Val Asp Lys Asp Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly 405 410 415

Asn Ser Thr Tyr Asn Ile Lys 420

<210> 11

<211> 1116

<212> DNA

<213> Sequencia artificial <22 0>

<223> Codifica fosfolipase C mutante com dois aminoácidos extras

<220>

<221> misc_feature <222> (1) . . (1116)

<223> Sequencia que codifica proteína <22 0>

<221> misc_feature <222> (1) . . (6)

<223> Sequencia codificando para dois aminoácidos introduzidos durante amplificação PCR

<220>

<221> misc_feature <222> (172) . . (174)

<223> Codifica Mutação D84L (Ácido aspártico a Leucine no aminoácido 84 da proteína nativa)

<220>

<221> misc_feature <222> (448) . . (450)

<223> Codifica Mutação H176G (Histidina a Glicina no aminoácido 176 da proteína nativa)

<22 0>

<221> misc_feature <222> (460) .. (462)

<223> Codifica Mutação E180G (Ácido glutâmico a Glicina no aminoácido 180 da proteína nativa)

<4 00> 11 atggaaagat tgatggcact ggcactcatg ccatgattgt gactcaaggg 60 atgagttggg atttccatct tggaaaatga cctctccaag aatgagccag aaagtgtgag gaagaacctg 120 gagattttga agcagaacat gcacgaactc cagcttggtt ctacctatcc gttgtatgac 180 aagaatgctt atgatctgta ccaagatcac ttctgggacc ctgatacaga taacaatttc 240 agcaaggaca actcatggta cctggcttat tcaattccag acaccgggga atcccagata 300 aggaagttct ctgcacttgc aagatatgaa tggcaacgtg gcaactacaa SCââÇCââCâ 360 ttctatcttg gtgaggccat gcactacttt rr rr Ί- rr --- +■ j t- 3 .-t acacacccta CCSCCCt'5 C C 4 2 0 aatgtcactg ctgttgacag tgctggcqgt qttaaqtttg ggacctttgc tqaagagaga aaagagcagt acaagataaa cacagccggc tgcaaaacaa atgaggcttt ctatgctgac 540 atcttgaaga acaaagattt caatgcctgg tcaaaagagt atgccagagg ttttgccaaa 600 actggaaaat ccatctatta cagccatgcc agcatgagcc acagttggga tgactgggat 660 tatgctgcaa aagttacttt ggcaaactct cagaaaggaa ctgctggtta catctaccga 720 ttcctccatg atgtcagtga gggcaatgat ccctctgttg gcaagaatgt gaaagagctt 780 gttgcttaca tatcaacttc tggtgagaaa gatgctggaa ctgatgacta catgtatttc 840 ggaatcaaga caaaggatgg aaagacccaa gaatgggaaa tggacaaccc tggaaatgac 900 tttatgaccg gttcaaagga cacttacact ttcaagctga aggatgaaaa tctcaagatt 960 gatgacattc aaaacatgtg gattcgtaaa aggaaataca cagcatttcc agatgcctat 1020 aagccggaaa acatcaaggt catagcaaat ggaaaggttg tcgtggacaa ggatatcaat 1080 gagtggattt ctggcaattc aacctacaat atcaaa 1116 <210> 12

<211> 372

<212> PRT

<213> Sequencia artificial

<220>

<223> Proteína sintetizada quimicamente codificada pela SEQ ID NO:11

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) . . (423)

<223> Fosfolipase C mutante com dois aminoácidos extras <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) . . (2)

<223> dois aminoácidos introduzidos durante a amplificação PCR <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (58) . . (58)

<223> Mutação D84L (Ácido aspártico a Leucina no aminoácido 84 da proteína nativa)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (150) . . (150)

<223> Mutação H176G (Histidina a Glicina no aminoácido 176 da proteína nativa)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (154) . . (154)

<223;· Mutação E180G (Ácido glutãmico a Glicina no aminoácido 180 da proteína nativa)

<4 00> 12

Met Ser Trp Asp Gly Lys Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met Ile 10 15 Val Thr Gln Gly Ile Ser Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu 20 25 30

Pro Glu Ser Val Arg Lys Asn Leu Glu Ile Leu Lys Gln Asn Met His 35 40 45

Glu Leu Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Pro Leu Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr 50 55 60

Asp Leu Tyr Gln Asp His Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe 65 70 75 80

Ser Lys Asp Asn Ser Trp Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly 85 90 95

Glu Ser Gln Ile Arg Lys Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln 100 105 110

Arg Gly Asn Tyr Lys Gln Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His 115 120 125

Tyr Phe Gly Asp Ile Asp Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala 130 135 140

Val Asp Ser Ala Gly Gly Val Lys Phe Gly Thr Phe Ala Glu Glu Arg 145 150 155 160

Lys Glu Gln Tyr Lys Ile Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Ala 165 170 175

Phe Tyr Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys 180 185 190

Glu Tyr Ala Arg Gly Phe Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser 195 200 205

His Ala Ser Met Ser His Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys 210 215 220

Val Thr Leu Ala Asn Ser Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg 225 230 235 240

Phe Leu His Asp Val Ser Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn 245 250 255

Val Lys Glu Leu Val Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Giu Lys Asp Al; 260 265 270

31y Thr Asp Asp Tyr Met Tyr Phe Gly He Lys Thr Lys Asp Gly Lys 275 280 285 Thr Gln Glu Trp Glu Met Asp Asn 290 295

Ser Lys Asp Thr Tyr Thr Phe Lys 305 310

Asp Asp Ile Gln Asn Met Trp Ile 325

Pro Asp Ala Tyr Lys Pro Glu Asn I 340 3

Val Val Val Asp Lys Asp Ile Asn 355 360

Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly 300

Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile 315 320

Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe 330 335

e Lys Val Ile Ala Asn Gly Lys 350

u Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr 365

Tyr Asn Ile Lys

370

Claims (11)

1. Antígeno protetor para a imunização de aves contra enterite necrótica, o referido antígeno compreendendo o ID. DE SEQ. N2: 4.

2. Polinucleotídeo que codifica o antígeno de acordo com a rei- vindicação 1.

3. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 2, compreenden- do uma seqüência selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. Ns: 3, ID. DE SEQ. N2: 7, ID. DE SEQ. Ne: 9 e ID. DE SEQ. N2: 11.

4. Antígeno de acordo com a reivindicação 1, em que o referido antígeno compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N2: 8, ID. DE SEQ. N2: 10 e ID. DE SEQ. N2: 12.

5. Método para a produção de um antígeno protetor como defini- do na reivindicação 1, o referido método compreendendo o constructo de um vetor de expressão de planta que contém uma seqüência de ácidos nucléi- cos que codifica o referido antígeno, a transformação de uma célula de plan- ta com o referido vetor de expressão de planta, o cultivo da referida célula de planta transformada sob condições adequadas à produção do referido antí- geno e o enriquecimento do referido antígeno da referida célula de planta transformada.

6. Método para a produção de um antígeno protetor como defini- do na reivindicação 1, o referido método compreendendo o constructo de um vetor de expressão procariótico que contém um polinucleotídeo que codifica o referido antígeno, a transformação de uma célula procariótica com o referi- do vetor de expressão procariótico, o cultivo da referida célula procariótica transformada sob condições adequadas à produção do referido antígeno e o enriquecimento do referido antígeno da referida célula procariótica transfor- mada.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a referida célula procariótica é uma célula de Pseudomonas fluorescens.

8. Polinucleotídeo isolado que codifica uma proteína que com- preende os resíduos 29 a 398 do ID. DE SEQ. N2: 2.

9. Proteína que compreende os resíduos 29 a 398 do ID. DE SEQ. N2: 2.

10. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 8, que codifi- ca o ID. DE SEQ. N2: 2.

11. Proteína de acordo com a reivindicação 9, que codifica o ID. DE SEQ. N2: 2.