BRPI0714888A2 - uso de sequÊncias acentuadoras de transformaÇço méltipla para melhorar a eficiÊncia de transformaÇço de planta - Google Patents

Abstract

USO DE SEQUÊNCIAS ACENTUADORAS DE TRANSFORMAÇçO MéLTIPLA PARA MELHORAR A EFICIÊNCIA DE TRANSFORMAÇçO DE PLANTA. A presente invenção refere-se a métodos e composições para melhora da eficiência de transformação de célula de planta medida por A-grobacterium e Rhizobacterium através do uso de sequências acentuadoras de transformação adicionais, tal como sequências de sobrestimação ou TSS, operavelmente ligadas a uma sequências de borda de T-DNA em um construto recombinante que compreende T-DNA.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE SE- QÜÊNCIAS ACENTUADORAS DE TRANSFORMAÇÃO MÚLTIPLA PARA MELHORAR A EFICIÊNCIA DE TRANSFORMAÇÃO DE PLANTA".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O presente pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente

Provisório U.S. N0 60/831.814 depositado em 19 de julho de 2006, cuja reve- lação é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.

1. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se em geral à biotecnologia de plan- ta. Mais especificamente, a invenção refere-se a métodos e composições para melhora da eficiência de transformação de planta bacterialmente medi- ada.

2. Descrição da Técnica Relacionada

Durante a transformação de células de planta mediada por A- grobacterium natural, um pedaço de DNA do plasmídeo Ti de A. tumefaciens ou plasmídeo Ri de A. rhizogenes é transferido para a célula da planta (por exemplo, Gelvin, 2003). Este fragmento de DNA transferido (T-DNA) é flan- queado por repetições diretas de 24 pb imperfeitas que são reconhecidas pela endonuclease de Agrobacterium VirD2 produzir um filamento T de fila- mento único ao fazer uma fenda (nicking) em um sítio específico em um fi- lamento de cada repetição. A repetição que inicia formação de filamento T de filamento único foi chamada a "borda da direita" (RB), enquanto a forma- ção de terminação de repetição de T-DNA de filamento único foi chamada a "borda da esquerda" (LB). A proteína VirD2 é ligada à extremidade 5' do fi- lamento após fazer a fenda, e guia o filamento T em células de planta onde o filamento T é integrado ao genoma da planta com a ajuda de outras proteí- nas codificadas por Agrobacterium e planta. Seqüências a jusante (em uma direção 5' a 3') da região T-DNA1 incluindo seqüência de estrutura principal de vetor, podem ser também transferidas (por exemplo, Kononov e outros, 1997). Isto provavelmente acontece por formação de fenda ineficiente de pelo menos uma das bordas em Agrobacterium antes de transferir para uma célula de planta. Comparação das seqüências RB e LB de uma variedade de li- nhagens de Agrobacterium indica que ambas RB e LB compartilham um mo- tivo de consenso (Canaday e outros, 1992), que indica que outros elementos podem estar envolvidos em modulação da eficiência de processamento de RB. Seqüências de ação eis próximas da RB estão presentes em muitas li- nhagens de Agrobacterium, incluindo A. tumefaciens e A. rhizogenes. Essas seqüências são necessárias para virulência do tipo selvagem (Veluthambi e outros, 1988; Shuvington e Ream, 1991; Toro e outros, 1989; Toro e ouros, 1988; Hansen e outros 1992). A seqüência em A. tumefaciens foi chamada uma sobrestimulação (overdrive) ou "realçador de transmissão de T-DNA" por Peralta e outros (1986). Em A. rhizogenes a seqüência foi chamada a "seqüência estimuladora de transferência de T-DNA" (TSS) por Hansen e outros (1992). A seqüência de sobrestimulação ("OD") foi inicialmente defini- da como um motivo de 24 pb particular imediatamente em frente da repeti- ção da RB de TL-DNA Ti octopina (Peralta e outros, 1986). Uma seqüência similar está presente em frente da repetição da RB da borda direita de TR- DNA Ti octopina e também em frente RB Ti nopalina e borda da direita TL Ri agropina (Peralta e outros, 1986, Shaw e outros, 1984, Barker e outros, 1983, Slighton e outros, 1985). Comparação adicional de linhagens A. tume- faciens diferentes revelou uma seqüência de núcleo de sobreposição de 8 pb presente em frente a todas as seqüências da borda da direita incluindo linhagem de nopalina pTiT37, linhagem de octopina pTiA6 e pRiA4 de A. rhizogenes (Peralta e outros, 1986).

A presença de seqüência de sobrestimulação de octopina au- mentou a formação de T-DNA de filamento único em células de Agobacteri- um e melhorou a transferência de T-DNA para células de planta, e era ne- cessária para virulência do tipo selvagem (Peralta e outros, 1986, Shurvinton e Ream, 1991). A repetição da LB de plasmídeo Ti de produção de nopalina pTiT37 é capaz de produzir T-DNA de filamento único com alta eficiência quando a seqüência de ação eis proximal da RB pTiT37 foi posta em frente a ela, indicando que uma seqüência tipo sobrestimulação na verdade também está presente em um plasmídeo Ti nopalina (Culianez-Macia e Hepburn, 1988, Peralta e outros, 1986), igual ao que está nos outros plasmídeos Ti identificados (produção de octopina). Integração de uma seqüência de so- brestimulação de octopina heteróloga em frente da RB de pTiT37 nopalina resultou em virulência muito maior do que a linhagem de origem que conti- nha apenas uma repetição da RB de pTiT37 (Peralta e outros, 1986).

A proteína VirCI se liga à sobrestimulação e é pensada melho- rar a formação de fenda de VirD2 (Toro e outros, 1988, 1989), enquanto mu- tação de virC resulta em virulência atenuada em plantas (Close e outros, 1987) e produção reduzida de seqüência de T-DNA de filamento único pro- cessada. Ambos plasmídeos Ti octopina e nopalina de A. tumefaciens con- têm VirC e podem complementar a mutação virC in trans para restaurar a virulência atenuada para nível do tipo selvagem (Close e outros, 1987).

A TSS encontrada em linhagens de A. rhizogenes 8196, A4 e 2659 desempenha um papel similar à seqüência de sobrestimulação em A. tumefaciens. Cada linhagem de A. rhizogenes tem uma seqüência diferente, mas relacionada (Hansen e outros, 1992). A seqüência de núcleo de TSS de 8 pb repete 5 vezes em pRiA4, 6 vezes em pRi8196 e 17 vezes (ao invés de 16x como Hansen e outros, 1992) em pRi2659 (No. De Acesso GenBank AJ271050). pRiA4 tem uma seqüência de núcleo de sobrestimulação de 8 pb conservada em adição às repetições. Repetições de seqüência de núcleo mais curtas em pRiA4 e pRi8196 não foram suficientes para virulência do tipo selvagem (Hansen e outros, 1992).

Depicker e outros (Publicação de Patente U.S. 2003/0140376 e publicação internacional correspondente WO01/44482) descrevem constru- tos combinantes com bordas de T-DNA modificadas a fim de diminuir ou prevenir transferência de seqüências de estrutura principal de vetor. Conner e outros (W005/121346) descrevem criação e uso de seqüências de regiões do tipo borda de T-DNA que compreendem seqüências derivadas de plan- tas. Heim e outros (Publ. U.S. 2003/0188345) descrevem vetores para trans- formação mediada por Agrobacterium de plantas com regiões de borda mo- dificadas. Lassner e outros (Publ. U.S. 2006/0041956) descreve modifica- ções de regiões de borda de T-DNA para permitir identificação de eventos transgênicos que não compreendem seqüências não-T-DNA.

Embora os estudos acima tenham aumentado a compreensão na técnica, o que é ainda necessário é um método para melhora da eficiên- cia de transformação de planta mediada por Agrobacterium. Embora a pre- sença de seqüências de sobrestimulação ou TSS aumente virulência de A- grobacterium do tipo selvagem e melhore a transferência de T-DNA para células de planta comparado com plasmídeos sem as seqüências, ainda per- manece obscuro como melhorar mais a eficiência de transformação incluin- do através do uso de seqüências de sobrestimulação ou TSS. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a invenção provê um método de aumento da eficiência de transformação de planta bacterialmente mediada compreen- dendo as etapas de: introdução de pelo menos uma seqüência realçadora de transformação adicional em um vetor de transformação de planta com- preendendo pelo menos uma região de borda de T-DNA; e b) transformação de uma célula de planta com o vetor através de transformação bacterialmen- te mediada, onde a bactéria é competente para a transformação da célula de planta. O método pode opcionalmente compreender regeneração de uma planta transgênica a partir da célula de planta. Em uma modalidade, a se- quência realçadora de transformação adicional compreende uma seqüência de núcleo consenso de TGTWTGTK (SEQ ID N0:20). Em outras modalida- des, a seqüência realçadora de transformação adicional é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 13 e uma seqüência complementar a qualquer uma da SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO:13. Em modalidades particulares, a invenção provê um construto de DNA re- combinante compreendendo SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 ou SEQ ID NO:16.

A seqüência realçadora de transformação usada com a invenção pode estar localizada próximo à região ou seqüência de borda de T-DNA, tal como a seqüência da borda da direita (RB), isto é, entre a seqüência de flanqueamento tal como seqüência de vetor e a seqüência de borda. A se- quência realçadora de transformação pode ser de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tal como um plasmídeo nopalina ou octopina, ou pode ser de um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Em certas modalidades, uma transfor- mação bacterialmente mediada pode utilizar uma técnica selecionada de transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por Rh- zobium e transformação mediada por Sinorzhibobium, Mesorhizobium ou Bradyrhizobium. Em certas modalidades, a seqüência realçadora de trans- formação pode compreender SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO: 18. Em modalidades adicionais, a região de borda de T-DNA pode compreender de a partir de 1 a cerca de 18 cópias da seqüência real- çadora de transformação, incluindo de a partir de cerca de 2 ou cerca de 4 a cerca de 18 cópias da seqüência realçadora de transformação.

Uma célula de planta de acordo com a invenção pode ser qual- quer célula de planta. Em certas modalidades, a célula de planta é de uma planta selecionada do grupo consistindo em soja, milho, algodão, canola, arroz, trigo, alfafa, feijão comum, milho, tabaco, girassol, cevada, beterraba, brócolis, repolho, cenoura, couve-flor, aipo, repolho Chinês, pepino, berinje- la, alho-poró, alface, melão, aveia, cebola, ervilha, pimenta, milho, batata, abóbora, rábano, sorgo, espinafre, abóbora squash, cana-de-açúcar, tomate e melancia. Em modalidades particulares, a célula de planta é uma célula de milho ou uma célula de soja.

Em outro aspecto, a invenção provê um construto de DNA re- combinante compreendendo uma seqüência de borda de T-DNA de um plasmídeo Ti ou Ri, operavelmente ligado a uma seqüência realçadora de transformação que compreende duas ou mais cópias de uma seqüência se- lecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:13, uma seqüência complementar a qual- quer uma da SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NO: 13 e combinações das mesmas. Em modalidades particulares, a invenção provê um construto de DNA recombinante compreendendo SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 ou SEQ ID NO:16.

Em tal construto, a seqüência realçadora pode compreender pe- Io menos cerca de quatro cópias da seqüência. A seqüência de borda pode ser uma seqüência de borda da direita (RB) ou borda da esquerda (LB). Em certas modalidades, o construto pode compreender SEQ ID NO: 10 e/ou SEQ ID NO:11. A seqüência de RB pode ser de um plasmídeo Ti nopalina, um plasmídeo Ti ou Ri agropina, manopina, succimanopina, cucumopina ou octopina e pode compreender SEQ ID NO:12.

Em outro aspecto, a invenção provê uma célula transformada com um construto provido aqui. A célula pode ser uma célula de planta ou bacteriana, incluindo uma célula de Agrobacterium e Rhizobium. Em uma modalidade, a célula de planta é de uma planta selecionada do grupo con- sistindo em soja, milho, algodão, canola, arroz, trigo, alfafa, feijão comum, milho, tabaco e girassol. A invenção também provê plantas transgênicas transformadas com um construto da invenção. Em modalidades particulares, a planta transgênica pode ser selecionada do grupo consistindo em soja, milho, algodão, canola, arroz, trigo, alfafa, feijão comum, milho, tabaco e gi- rassol.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos que seguem são parte do presente relatório e es- tão incluídos para demonstrar mais certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida com referência aos desenhos em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas apre- sentadas aqui.

FIGURA 1: Mostra de várias seqüências realçadoras de transformação usa- das para melhora da eficiência de transformação. FIGURA 2: Mapa esquemático de pMON87464. FIGURA 3: Mapa esquemático de pMON87465.

FIGURA 4: Seqüências da RB engenheiradas; seqüência de sobrestimula- ção em negrito e a seqüência de núcleo da RB de 24 pb subli- nhada. (A) Seqüência de sobrestimulação da RB+1x de nopalina (SEQ ID NO:14); (B) sobrestimulação da RB+4x de nopalina

(SEQ ID NO:15); (C) RB+18x TSS de nopalina (SEQ ID NO:16). DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE REFERÊNCIA SEQ ID N0:1 Primer avançado Xd463 para preparação da seqüência OD 2X.

SEQ ID N0:2 Primer reverso Xd464 para preparação da seqüência 0D2X.

SEQ ID N0:3 Primer avançado Xd465 para preparação da seqüência

TSS 6X.

SEQ ID N0:4 Primer reverso Xd466 para preparação de seqüência TSS 6X.

SEQ ID NO:5 núcleo de OD de 24 pb de pTiA6. SEQ ID NO:6 seqüência de 8 pb de TSS 1x.

SEQ ID NO:7 OD 1 χ de 30 pb de pTiA6; complemento reverso de SEQ ID N0:17.

SEQ ID N0:8 seqüência OD 1X de pTiAB3. SEQ ID N0:9 OD 1X de pTi15955. SEQ ID N0:10 OD empilhada 4X. SEQ ID N0:11 TSS empilhada 18X . SEQ ID NO: 12 Região de borda com seqüência OD 1X. SEQ ID NO:13 Seqüência OD parcial. SEQ ID N0:14 Região da RB de Nopalina com OD 1X. SEQ ID N0:15 Região da RB de Nopalina com OD 4X. SEQ ID N0:16 Região da RB de nopalina com TSS 18X. SEQ ID N0:17 OD 1X; complemento reverso de SEQ ID NO:7. SEQ ID NO: 18 OD empilhada 4X; complemento reverso da SEQ ID NO: 10. SEQ ID N0:19 Seqüência OD consenso (Toro e outros, 1988). SEQ ID N0:20 Seqüência OD de núcleo de 8 pb consenso. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O que segue é uma descrição detalhada da invenção provida para auxiliar aqueles versados na técnica na prática da presente invenção. Aqueles de habilidade comum na técnica podem fazer modificações e varia- ções nas modalidades descritas aqui sem se afastar do espírito ou escopo da presente invenção.

A invenção provê métodos e composições para melhora da efi- ciência de transformação mediada por Agrobacterium de células de planta. Sequenciamento da região T-DNA de 20 kb de A. rhizogenes K599, uma linhagem supervirulenta de soja, levou ao reconhecimento que o plasmídeo pRi em A. rhizogenes K599 é idêntico à linhagem NCPBB 2659 de A. rhizo- genes. A supervirulência da linhagem K599 pode então ser relacionada com o número de seqüências TSS presentes próximo à RB. Então, empilhamento de repetições de sobrestimulação e TSS múltiplas foi testado em vetores binários com uma RB de nopalina (por exemplo, de pTiT37) para melhorar eficiência de transformação. A sobrestimulação de 30 pb de plasmídeo Ti octopina (Shurvinton e Ream, 1991) de pTiA6, presente em 4 cópias, e a seqüência de núcleo de 8 pb de NCPBB2659 TSS de A. rhizogenes, presen- te em 18 cópias, foram usadas para realçar a eficiência de transmissão de DNA.

Estudos de transformação comparando o uso de construtos contendo números variáveis de seqüências de sobrestimulação e TSS de- monstraram que a presença de cópias "empilhadas" adicionais dessas se- qüências melhorou a eficiência de transformação melhorando a freqüência de transformação bem como a qualidade dos eventos transgênicos resultan- tes. Por exemplo, a proporção de eventos com inserções de cópia única, e também falta de seqüências de estrutura principal de vetor (por exemplo, oriV), foi aumentada. Freqüência de transformação aumentada e eventos de qualidade melhoraram a eficiência geral do processo de transformação ao reduzirem a quantidade de recursos requeridos para selecionar evento para desenvolvimento comercial adicional. A invenção então provê métodos aperfeiçoados para obtenção

de plantas transgênicas férteis e para a transformação de células ou tecidos de planta e regeneração das células ou tecidos transformados em plantas transgênicas férteis. Para iniciar um processo de transformação de acordo com a invenção, os componentes genéticos desejados ser inseridos nas cé- lulas ou tecidos de planta serão primeiro selecionados. Componentes gené- ticos podem incluir qualquer ácido nucléico que seja introduzido em uma cé- lula ou tecido de planta usando o método de acordo com a invenção. Com- ponentes genéticos podem incluir DNA de não-planta, DNA de planta ou DNA sintético.

Em certas modalidades da invenção, componentes genéticos são incorporados a uma composição de DNA tal como um plasmídeo de fi- lamento duplo, recombinante, ou molécula de vetor compreendendo compo- nentes genéticos tal como: (a) um promotor que funciona em células de planta para causar a produção de uma seqüência de RNA1 (b) uma seqüên- cia de DNA estrutural que causa a produção de uma seqüência de RNA que codifica uma proteína ou polipeptídeo desejado e (c) uma seqüência de DNA não-traduzida 3' que funciona em células de planta para causar a poliadeni- lação da extremidade 3' da seqüência de RNA. O vetor pode também conter componentes genéticos que facilitam a transformação e regulam expressão do(s) gene(s) desejado(s).

Os componentes genéticos são tipicamente orientados de modo a expressarem um mRNA, que em uma modalidade pode ser traduzido em uma proteína. A expressão de uma seqüência de codificação estrutural de uma planta (um gene, cDNA, DNA sintético ou outro DNA) que existe em forma de filamento duplo envolve transcrição de RNA mensageiro (mRNA) de um filamento do DNA através de RNA polimerase e subsequente proces- samento do transcrito primário de mRNA dentro do núcleo. Este processo envolve uma região 3' não-traduzida que inclui poliadenilação das extremi- dades 3' do mRNA.

Métodos gerais para preparação de plasmídeos ou vetores que contêm componentes genéticos desejados e podem ser usados para trans- formar plantas e métodos de fabricação desses vetores são conhecidos na técnica. Vetores tipicamente consistem em vários componentes genéticos, incluindo, mas não limitado a, elementos reguladores tal como promotores, líderes, íntrons e seqüências terminadoras. Elementos reguladores são tam- bém referidos como elementos reguladores eis ou trans, dependendo da proximidade dos elementos com as seqüências ou gene(s) que eles contro- lam. A região promotora contém uma seqüência de bases que sinaliza RNA polimerase para associar com o DNA e iniciar uma transcrição em mRNA usando um dos filamentos de DNA como um molde para fazer um filamento de RNA complementar correspondente.

Os construtos podem também conter os segmentos de DNA de estrutura principal de plasmídeo que provêem função de replicação e sele- ção de antibiótico em células bacterianas, por exemplo, uma origem de repli- cação de Escherichia coli tal como or/322, uma origem de replicação de faixa de hospedeiro ampla tal como orN ou oriRi, e uma região de codificação para um marcador selecionável tal como Spec/Strp que codifica Tn7 amino- glicosídeo adeniltransferase (aadA) conferindo resistência à espectinomicina ou estreptomicina, ou um gene marcador selecionável de gentamicina (Gm, Gent). Para transformação de planta, a linhagem bacteriana hospedeiro é freqüentemente ABI, C58, LBA4404, EHA101 e EHA105 de Agrobacterium tumefaciens carregando um plasmídeo tendo uma função de transferência para a unidade de expressão. Outras linhagens bacterianas conhecidas da- queles versados na técnica de transformação de planta podem funcionar na presente invenção, incluindo linhagens A. rhizogenes, Sinorhizobum sp., Mesorzhizobium sp., Bradyrhizobium sp. e Rhizobium sp.

Vários promotores que são ativos em células de planta foram descritos na literatura. Tais promotores incluem, mas não estão limitados a, promotores de nopalina sintase (NOS) e octopna sintase (OCS), que são carregados em plasmídeos de indução de tumor de A. tumefaciens; os pro- motores do caulimovírus tal como promotores do vírus do mosaico da couve- flor (CaMV) 19S e 35S e o promotor do vírus do mosaico da escrofulária (FMV) 35S; o promotor CaMV35S realçado (e35S); e o promotor induzível por luz da subunidade pequena de ribulose bifosfato carboxilase (ssRUBIS- CO, um polipeptídeo de planta muito abundante). Todos esses promotores têm sido usados para criar vários tipos de construtos de DNA que foram ex- pressos em plantas. Híbridos de promotor podem ser também construídos para aumentar a atividade transcripcional ou combinar atividade transcrip- cional, inducibilidade e especificidade de tecido ou desenvolvimental deseja- das.

Então, promotores que funcionam em plantas podem ser induzi- veis, virais, sintéticos, constitutivos conforme descrito, temporalmente regu- lados, espacialmente regulados e/ou espaço-temporalmente regulados. Ou- tros promotores que são aumentados em tecido, específicos de tecido ou desenvolvimentalmente regulados são também conhecidos na técnica e pre- tendidos ter utilidade na prática da presente invenção. Promotores úteis po- dem ser obtidos de uma variedade de fontes tal como plantas e vírus de DNA de planta. É preferido que o promotor particular selecionado deva ser capaz de causar expressão suficiente para resultar na produção de uma quantidade eficaz do produto de gene de interesse.

Os promotores usados nos construtos de DNA (isto é, genes de planta quiméricos/recombinantes) da presente invenção podem ser modifi- cados, se desejado, para afetar suas características de controle. Promotores podem ser derivados por meio de ligação com regiões operadoras, mutagê- nese aleatória ou controlada, etc. Ainda, os promotores podem ser alterados para conter "seqüências acentuadoras" múltiplas para auxiliar na elevação da expressão de gene.

O mRNA produzido por um construto de DNA da presente in- venção pode também conter uma seqüência líder não-traduzida 5'. Esta se- qüência pode ser derivada do promotor selecionado para expressar o gene e pode ser especificamente modificada de modo a aumentar a tradução do mRNA. As regiões não-traduzidas 5' podem ser também obtidas de RNAs virais, de genes eucarióticos adequados ou de uma seqüência de gene sin- tético. Tais seqüências "realçadoras" podem ser desejadas para aumentar ou alterar a eficiência de tradução do mRNA recombinante e são geralmente conhecidas como realçadores traducionais. Outros componentes genéticos que servem para realçar a expressão ou afetar transcrição ou tradução de um gene são também pretendidos como componentes genéticos. A região não-traduzida 3' dos construtos quiméricos de preferência contém um termi- nador transcripcional, ou um elemento tendo função equivalente, e um sinal de poliadenilação, que funciona em plantas para poliadenilar a extremidade 3' do RNA. Exemplos de regiões 3' adequadas são (1) as regiões não- traduzidas, transcritas, 3', contendo o sinal de poliadenilação de genes de plasmídeo (Ti) de indução de tumor de Agrobacterium, tal como o gene de nopalina sintase (nos) e (2) genes de planta tal como os genes de proteína de armazenamento de soja e a subunidade pequena do gene de ribulose- 1,5-bifosfato carboxilase (ssRUBISCO). Um exemplo de uma região 3' prefe- rida é aquela do gene de ssRUBISCO E9 de ervilha.

Tipicamente, seqüências de DNA localizadas algumas centenas de pares de base a jusante do sítio de poliadenilação servem para terminar transcrição. Essas seqüências de DNA são referidas aqui como regiões de terminação de transcrição. As regiões são requeridas para poliadenilação eficiente de RNA mensageiro transcrito (mRNA) e são conhecidas como re- giões não-traduzidas 3'. Polimerase de RNA transcreve uma seqüência de DNA de codificação através de um sítio onde poliadenilação acontece.

Em muitos sistemas de transformação, é preferido que o vetor de transformação contenha um gene marcador selecionável, avaliável ou classificável. Esses componentes genéticos são também aqui referidos co- mo componentes genéticos funcionais, uma vez que eles produzem um pro- duto que serve uma função na identificação de uma planta transformada, ou um produto de utilidade desejada.

O DNA que serve como um dispositivo de seleção pode funcio- nar em um tecido de planta regenerável para produzir um composto que confere ao tecido da planta resistência a um composto de outro modo tóxico. Genes de interesse para uso como um marcador selecionável, avaliável ou classificável incluiriam, mas não estão limitados a, β-glucuronidase (gus), proteína fluorescente verde (gfp), Iuciferase (Iux), antibióticos tal como ca- namicina (Dekeyser e outros, 1989), genes que permitem a tolerância a her- bicidas tal como glifosato (Della-Cioppa e outros, 1987), tal como CP4 EPSPS (Patente U.S. 5.627.061; Patente U.S. 5.633.435; Patente U.S. 6.040.497; Patente U.S. 5.094.945; WO 04/074443; W004/009761); glifosi- nato (Patente U.S. 5.646.024, Patente U.S. 5.561.236, Patente U.S. 5.276.268; Patente U.S. 5.637.489; Patente U.S. 5.273.894); 2,4-D (W005/10743) e dicamba, tal como DMO (Patente U.S. 7.022.896). Outros métodos de seleção podem ser também implementados incluindo, mas não limitado a, tolerância à fosfinotricina, bialafos e mecanismos de seleção posi- tivos (Joersbo e outros, 1998) e ainda se encaixariam no escopo da presente invenção. Exemplos de vários marcadores selecionáveis/avaliáveis/clãs- sificáveis e genes codificando-os são revelados em Miki e McHugh (2004).

A presente invenção pode ser usada com qualquer plasmídeo ou

vetor de transformação de planta adequado contendo um marcador selecio- nável ou avaliável e elementos reguladores associados conforme descrito, junto com um ou mais ácidos nucléicos (um gene estrutural de interesse) expressos de uma maneira suficiente para conferir uma característica dese- jável particular. Exemplos de genes estruturais adequados de interesse pre- vistos pela presente invenção incluem, mas não estão limitados a, genes para tolerância a inseto ou peste, genes para tolerância a herbicida, genes para aperfeiçoamentos em qualidade tal como rendimento, melhoras nutri- cionais, tolerâncias ambientais ou a estresse, ou genes para quaisquer mu- danças desejáveis em fisiologia de planta, crescimento, desenvolvimento, morfologia ou produto(s) de planta.

Alternativamente, as seqüências codificando DNA podem afetar esses fenótipos através da codificação de uma molécula de RNA não- traduzível que causa a inibição direcionada de expressão de um gene endó- geno, por exemplo, através de mecanismos mediados por RNA de filamento duplo, incluindo mecanismos mediados por antissenso e co-supressão (vide, por exemplo, Bird e outros, 1991). O RNA poderia ser também uma molécula de RNA catalítico (isto é, uma ribozima) engenheirada para clivar um produto de mRNA endógeno desejado (vide, por exemplo, Gibson e Shillitoe, 1997). Mais particularmente, para uma descrição de regulagem de antissenso de expressão de gene em células de planta vide Patente U.S. N0 5.107.065 e para uma descrição de supressão de gene em plantas através de transcrição de um dsRNA vide Patente U.S. N0 6.506.559, Publicação de Pedido de Pa- tente U.S. N0 2002/0168707 A1 e Pedidos de Patente U.S. Nos. de Série 09/423.143 (vide WO 98/53083), 09/127.735 (vide WO 99/53050) e 09/084.942 (vide WO 99/61631), todos aqui incorporados a título de referên- cia em sua totalidade. Uso de seqüências que resultam em silenciamento de outros genes endógenos (por exemplo, tecnologias RNAi incluindo miRNA) para resultar em um fenótipo é também previsto. Por exemplo, RNAi pode ser usado para silenciar um ou mais genes resultando em um fenótipo classifi- cável. Uma modalidade é montar um cassete de DNA que vai transcrever uma repetição de seqüências revertida, para produzir um RNA de filamento duplo (dsRNA), tipicamente pelo menos cerca de 19-21 pb de comprimento e correspondendo a uma porção de um ou mais genes direcionados para silenciamento. Então, qualquer gene que produza uma proteína ou mRNA que expresse uma mudança de fenótipo ou morfologia de interesse é útil para a prática da presente invenção.

Ácidos nucléicos exemplares que podem ser introduzidos atra- vés dos métodos compreendidos pela presente invenção incluem, por e- xemplo, seqüências de DNA heterólogo, isto é, seqüências ou genes de ou- tras espécies, ou até mesmo genes ou seqüências que se originam com ou estão presentes na mesma espécie, mas são incorporados em células reci- pientes através de métodos de engenharia genética ao invés de técnicas de reprodução ou geração clássicas. O termo heterólogo, no entanto, pretende também se referir a genes que não estão normalmente presentes na célula sendo transformada ou a genes que não estão presentes na forma, estrutu- ra, etc, conforme encontrado no segmento de DNA transformante ou a ge- nes que estão normalmente presentes, mas uma expressão diferente é de- sejável. Então, o termo gene ou DNA "heterólogo" pretende se referir a qual- quer gene ou segmento de DNA que é introduzido em uma célula recipiente, sem importar se um gene similar pode já estar presente em tal célula. O tipo de DNA incluído no DNA heterólogo pode incluir DNA que já está presente na célula de planta, DNA de outra planta, DNA de um organismo diferente ou DNA geralmente externo, tal como uma seqüência de DNA contendo uma mensagem de antissenso de um gene, ou uma seqüência de DNA codifican- do uma versão sintética ou modificada de um gene ou seqüência.

À luz da presente revelação, vários outros genes marcadores selecionáveis ou avaliáveis, elementos reguladores e outras seqüências de interesse possíveis estarão aparentes àqueles de habilidade na técnica. En- tão, a discussão acima pretende ser exemplar ao invés de exaustiva.

Após a construção do vetor ou construto de transformação de planta, a molécula de ácido nucléico, preparada como uma composição de DNA in vitro, é geralmente produzida em um hospedeiro adequado tal como Escherichia coli e emparceirada em outro hospedeiro adequado tal como Agrobacterium ou Rhizobium, ou diretamente transformada em Agrobaeteri- um ou Rhizobium competente. Essas técnicas são bem conhecidas daque- les de habilidade no campo e foram descritas para vários sistemas de planta incluindo soja, algodão e trigo (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.569.834 e 5.159.135 e WO 97/48814). Aqueles de habilidade na técnica reconheceriam a utilidade de métodos de transformação mediados por A- grobacterium. Linhagens podem incluir, mas não estão limitadas a, deriva- dos desarmados de linhagem A. tumefaciens C58, uma linhagem de nopali- na que é usada para mediar a transferência de DNA em uma célula de plan- ta; linhagens de octopina, tal como LBA4404; ou linhagens de agropina, por exemplo, EHA101, EHA105 ou R. Ieguminosarum USDA2370 com um plas- mídeo Ti ou Ri. O uso dessas linhagens para transformação de planta foi relatado, e os métodos são familiares àqueles de habilidade na técnica. Tecido de planta a ser transformado é tipicamente inoculado e

co-culturado com Agrobaeterium ou Rhizobium contendo um construto re- combinante compreendendo pelo menos uma seqüência de sobrestimulação ou TSS heteróloga, uma seqüência de interesse a ser transferida, e pelo menos uma seqüência de RB que serve para definir o DNA a ser transferido, e é selecionado sob condições apropriadas. Em certas modalidades, pelo menos uma seqüência de LB está também presente no construto recombi- nante. Em certas outras modalidades, uma seqüência de borda pode ser uma "sequência(s) do tipo borda derivada de planta". Métodos de identifica- ção e uso de tais seqüências são descritos em Rommens e outros, 2005; Rommens 2004a; Rommens e outros, 2004b.

A presente invenção pode ser usada com qualquer célula ou tecido transformável. Aqueles de habilidade na técnica vão reconhecer que tecido de planta transformável geralmente refere-se a tecido que pode ter DNA exógeno inserido em seu genoma e sob condições de cultura apropria- das pode formar em uma planta diferente. Tal tecido pode incluir, mas não é limitado a, suspensões de célula, tecido de calo, tecido hipocotiledôneo, coti- lédons, embriões, tecido meristemático, raízes e folhas. Por exemplo, teci- dos transformáveis podem incluir calos ou embrióides de anteras, microes- poros, inflorescences e tecidos de planta. Outros tecidos são também previs- tos ter utilidade na prática da presente invenção, e o desejo por um explante particular para uma espécie de planta particular é ou conhecido na técnica ou pode ser determinado através de avaliação de rotina e experimentos de teste com o que vários explantes são usados no processo de transformação e aqueles que são mais bem-sucedidos na produção de plantas transgêni- cas são identificados.

Métodos para transformação de dicotiledôneas através do uso de Agrobacterium ou Rhizobium e obtenção de plantas transgênicas foram publicados para várias culturas incluindo algodão, soja, Brassica e amendo- im. Transformação bem-sucedida de plantas monocotiledôneas através de métodos baseados em Agrobacterium ou Rhizobium foi também relatada. Transformação e regeneração de planta foram conseguidas e relatadas pelo menos em aspargos, cevada, milho, aveia, arroz, cana-de-açúcar, relva tall fescue e trigo. Técnicas que podem ser particularmente úteis no contexto de transformação de algodão são reveladas nas Patentes U.S. Nos. 5.846.797, 5.159.135, 5.004.863 e 6.624.344. Técnicas para transformação de plantas Brassica em particular são reveladas, por exemplo, na Patente U.S. 5.750.871. Técnicas para transformação de soja são reveladas em, por e- xemplo, Zhang e outros (1999) e Patente U.S. 6.384.301; e técnicas para transformação de milho são reveladas na, por exemplo, Patente U.S. N0 5.981.840, Patente U.S. 7.060.876, Patente U.S. 5.591.616, W095/06772 e Pub. de Patente U.S. 2004/244075. Em uma modalidade, após incubação em meio contendo antibió-

ticos para inibir crescimento de Agrobacterium ou Rhizobium sem agentes seletivos (meio de retardo), os explantes são culturados em meio de cresci- mento seletivo incluindo, mas não limitado a, um meio de indução de calo contendo um agente seletivo de célula de planta. Agentes seletivos típicos foram descritos e incluem, mas não estão limitados a, antibióticos tal como G418, parmomomicina, canamicina ou outros agentes químicos tal como glifosato, dicamba e glufosinato. As culturas de tecido de planta sobreviven- do no meio de seleção são subseqüentemente transferidas para um meio de regeneração adequado para a produção de mudas transformadas. Regene- ração pode ser realizada em várias etapas. Aqueles versados na técnica têm ciência de vários tipos de meios e necessidades de transferência que podem ser implementados e otimizados para cada sistema de planta para transfor- mação e regeneração de planta.

Os transformantes produzidos são subseqüentemente analisa- dos para determinar a presença ou ausência de um ácido nucléico particular de interesse contido no vetor de transformação. Análise molecular pode in- cluir, mas não está limitada a, análises Southern blots ou PCR (reações em cadeia de polimerase). Esses e outros métodos bem conhecidos podem ser realizados para confirmar a estabilidade das plantas transformadas produzi- das através dos métodos revelados, bem como o número de cópia de inser- ções, e a presença de seqüências de estrutura principal de vetor flanquean- do o T-DNA. Esses métodos são bem conhecidos daqueles versados na técnica e foram relatados (vide, por exemplo, Sambrook e outros, 1989).

A discussão acima é meramente um esboço amplo de protoco- los de transformação e regeneração padrão. Uma pessoa de habilidade co- mum na técnica sabe que culturas específicas e protocolos específicos po- dem variar um pouco do esboço amplo. Uma variedade de meios pode ser usada em cada sistema também. Aqueles de habilidade na técnica são fami- liares com a variedade de meio de cultura de tecido que, quando suplemen- tado apropriadamente, apóia crescimento e desenvolvimento de tecido de planta. Esses meios de cultura de tecido podem ou ser comprados como uma preparação comercial ou preparados adaptados a gosto e modificados por aqueles de habilidade na técnica. Exemplos de tais meios incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos por Murashige e Skoog (1962); Chu e outros (1975); Linsmaier e Skoog (1965); Uchimiya e Murashige (1962); Gamborg e outros (1968); Duncan e outros (1985); MeCown e Lloyd (1981); Nitseh e Nitseh (1969); e Sehenk e Hildebrandt (1972) ou derivações desses meios suplementados de acordo. Aqueles de habilidade na técnica têm ciên- cia que meios e suplementos de meio tal como nutrientes e reguladores de crescimento para uso em transformação e regeneração são geralmente oti- mizados para a cultura alvo particular ou variedade de interesse. Reagentes estão comercialmente disponíveis e podem ser comprados de vários forne- cedores (vide, por exemplo, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo). Seqüências de "sobrestimulação" foram identificadas em vários

plasmídeos Ti, incluindo pTiA6, pTiAB3 e pTi15955. Outras seqüências com similaridade para sobrestimulação ou TSS podem ser identificadas, por e- xemplo, usando o programa "BestFit", "Gap" ou "FASTA" do Sequence A- nalysis Software Packagei Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wis. 53711 ou usando o progra- ma "BLAST" (Altschul e outros, 1990) ou outro pacote de análise de seqüên- cia de DNA disponível. Tais seqüências quando presentes em multicópia próximo a uma seqüência de RB podem ser avaliadas quanto à atividade de aumento de transformação, similarmente às seqüências cuja atividade acen- tuadora é descrita abaixo.

"Freqüência de transformação", conforme aqui usado, refere-se à porcentagem de eventos transgênicos produzidos por explante ou a por- centagem de plantas transgênicas produzidas por explante.

"Seqüência de borda", por exemplo, borda da direita (RB) ou borda da esquerda (LB), refere-se a uma seqüência de ácido nucléico dire- tamente repetida definindo uma extremidade da região de DNA transferido (T-DNA), tipicamente cerca de 24 pb de comprimento. Seqüências de borda podem ser de um plasmídeo Ti ou Ri de Agrobacterium sp. ou podem ser seqüências derivadas de planta que funcionam similarmente. "Região de borda de T-DNA" refere-se à seqüência de RB ou LB

e seqüência de flanqueamento associada, tipicamente de cerca de 100 pb de comprimento, e, conforme encontrado na natureza, pode incluir uma se- quência realçadora de transformação.

"Eficiência de transformação" conforme aqui usado refere-se a qualquer aperfeiçoamento, tal como um aumento em freqüência de trans- formação e eventos de qualidade que impactam a eficiência geral do pro- cesso de transformação através da redução da quantidade de recursos re- queridos para selecionar evento para desenvolvimento comercial adicional.

"Realçador de transformação" conforme aqui usado refere-se a seqüências de sobrestimulação e TSS.

Uma primeira seqüência de ácido nucléico é "operavelmente ligada" com uma segunda seqüência de ácido nucléico quando as seqüên- cias são dispostas de modo que a primeira seqüência de ácido nucléico afe- ta o funcionamento da segunda seqüência de ácido nucléico. De preferência as duas seqüências são parte de uma única molécula de ácido nucléico con- tígua. A seqüência realçadora de sobrestimulação ou TSS pode ser posta imediatamente adjacente à seqüência de borda, tal como a seqüência de RB. Alternativamente, em certas modalidades a seqüência de sobrestimula- ção ou TSS está localizada cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 ou mais nucleotídeos da extremidade da seqüência de borda, incluindo todas as faixas intermediárias. A seqüência de sobrestimulação pode ser substituída em qualquer orientação com relação à borda. EXEMPLOS

Aqueles de habilidade na técnica vão compreender as muitas vantagens dos métodos e composições providos aqui pela presente inven- ção. Os exemplos que seguem são incluídos para demonstrar as modalida- des preferidas da invenção. Deve ser compreendido por aqueles de habili- dade na técnica que as técnicas reveladas nos exemplos que seguem repre- sentam técnicas constatadas pelos inventores funcionar bem na prática da invenção, e então podem ser consideradas constituir modos preferidos para sua prática. No entanto, aqueles de habilidade na técnica devem, à luz da presente revelação, compreender que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são reveladas e ainda obter um resultar igual ou similar sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Todas as referências citadas aqui são incorporadas aqui a título de referência até o ponto que elas suplementem, expliquem, provejam um background para ou ensinem metodologia, técnicas ou composições empregadas aqui. EXEMPLO 1

Síntese de seqüências realçadoras de transformação 1) Síntese de seqüência de sobrestimulacão 4x

Para sintetizar uma seqüência de sobrestimulação de 30 pb 4x

(OD)

(5' caaacaaacatacacagcgacttattcacacaaacaaacatacacagcgacttattcacacaaac aaacatacacagcgacttattcacacaaacaaacatacacagcgacttattcaca 3'; SEQ ID NO: 18), par de primer de sobrestimulação de 30 pb 2x 5' caaacaaacatacac agcgacttattcacacaaacaaacatacacagcgacttattcaca 3' (Xd463; SEQ ID NO:1) e 5' tgtgaataagtcgctgtgtatgtttgtttgtgtgaataagtcgctgtgtatgtttgtttg 3' (Xd464; SEQ ID NO:2) foram sintetizados, misturados e amplificados através de PCR por ciclos na presença de polimerase PfuTurbo® de alta fidelidade da Strata- gene (La Jolla1 CA). O produto de PCR foi fracionado em um gel de Agarose a 1%, e a porção do gel correspondendo ao tamanho variando entre 100-300 pb foi excisada, purificada e ligada em vetor de PCR embotado TOPO Zero da Invitrogen (Carlsbad, CA). O empilhamento de repetição foi confirmado através de sequenciamento. Seqüência de sobrestimulação de até 6x foi observada seguindo PCR, embora apenas inserto de 30 pb 4x fosse utiliza- do na clonagem subsequente de um construto de sobrestimulação multicó- pia.

2) Síntese de seqüência TSS18x

Pares de primer de repetição de TSS de 8 pb 6x: 5' ctgacgaactgacgaactgacgaactgacgaactgacgaactgacgaa 3'(Xd465; SEQ ID NO:3) e 5' ttcgtcagttcgtcagttcgtcagttcgtcagttcgtcagttcgtcag 3' (Xd466; SEQ ID NO:4) foram sintetizados e igualmente misturados e amplificados por 5 ciclos na presença de polimerase Pfu Turbo® da Stratagene (La Jolla, CA). A fatia de gel de tamanho de 100-300 pb foi cortada, purificada e ligada em vetor de PCR embotado TOPO Zero da Invitrogen. Repetição de TSS de até 35x foi confirmada através de sequenciamento, mas apenas repetição de TSS de 18x foi mantida para clonagem adicional. O tamanho da sobrestimu- lação e TSS era dependente dos ciclos de PCR e da posição de gel excisa- do.

EXEMPLO 2

Construção de vetores tendo RB com sobrestimulação, sobrestimulação adi- cional ou TSS 18x

Para pôr a sobrestimulação ou TSS em frente a uma RB de 24 pb, um sítio de EcoRI foi introduzido em uma RB nopalina, 11 pb distante a montante da RB (de pMON839ÜO). A sobrestimulação 4x ou TSS 18x foi ex- cisada do vetor de clonagem TOPO correspondente digerido através de E- coRI e inserida em pMON839ÜO aberto por EcoRI, resultando em pMON83903 e pMON83909, respectivamente.

A RB modificada contendo ou sobrestimulação 4x ou a TSS 18x de pMON83903 ou pMON83900 foi digerida com Hind\\\/Spe\ e usada para substituir a RB de sobrestimulação 1x de pMON83902 com fragmento Hin- c/lll/Spel compreendendo as seqüências realçadoras de sobrestimulação 4x ou TSS 18x, resultando em pMON87462 e pMON83864, respectivamente, para transformação de soja. Alternativamente, a RB de ρΜΟΝδΟΙΟδ foi mo- dificada de modo a compreender a sobrestimulação 4x ou TSS 18x através da inserção do fragmento SpeUSaIl de pMON83903 ou pMON83909 para dar pMON87465 e pMON87466m respectivamente, de transformação de milho. A RB modificada com seqüências realçadoras de transformação 1x, 4x e 18x é mostrada nas figuras 1 e 4 e SEQ ID NOS.: 14-16.

Um construto contendo seqüência de sobrestimulação 1x (SEQ ID NO: 17) foi sintetizado primeiro montando o oligonucleotídeo contendo a seqüência de sobrestimulação de 30 pb de acordo com protocolo padrão e então clonando-o em pBlueScript®ll (Stratagene Inc., La JOIIa1 CA) resultan- do em pMON80088. Então fragmento Spel e Not\ (cheios com polimerase) de pMON80088 foi inserido em pMON80105 digerido Spel e Smal, resultan- do em pMON80121 para transformação de milho. Para transformação de soja, construto de RB de sobrestimulação 1x, pMON83902 foi feito substitu- indo a RB em pMON83898 com o fragmento de RB de sobrestimulação 1x de pMON8C)121 usando sítios de enzima de restrição Pme\/Nde\. EXEMPLO 3

Transformação de Milho com seqüências de RB realçadas de Sobrestimula- ção ou TSS

Células de milho (Zea mays) foram transformadas com vetores

pMON80105, pMON80121, pMON87465 ou pMON87466 contendo oriV es- sencialmente conforme descrito na Publ. do Pedido de Patente U.S. 2004/244075 a fim de avaliar a habilidade de empilhamento de seqüências realçadoras de sobrestimulação e TSS adicionais para melhorar a freqüência de transformação e a proporção de eventos compreendendo inserção de T- DNA de número de cópia baixo e sem seqüência de estrutura principal de vetor (por exemplo, oriV derivada de E. coli). O tratamento controle consistia em transformação com pMON80105, sem uma seqüência de sobrestimula- ção ou TSS. Conforme mostrado na Tabela 1, uso de construtos compreen- di 5 dendo seqüências realçadoras empilhadas resultou em um aumento estatis- ticamente significante em freqüência de transformação. Com esses constru- tos, uma porcentagem maior de FT de qualidade foi também obtida. FT de qualidade combina FT e eventos com uma ou duas cópias. Também, a por- centagem de eventos tendo uma ou duas cópias aumentou. Tabela 1: Efeito de seqüências realçadoras de transformação sobre freqüên- cia de transformação e qualidade de evento em milho

Sobresti- mulação em RB Construto (pMON) % de Freqüência de Transformação (FT)a % de FT de qualidade % de um ou dois eventos de cópia sem importar a estrutura principal OD 4X 87465 25,3 12,7% 50,1 OD1 X 80121 24,1 10,4% 43,2 TSS 18X 87466 22,8 10.2% 44,7 Controle 80105 1.7,7 6,4% 39,0

a estipula significância estatística

EXEMPLO 4

Transformação de Soja com Seqüências RB Realçadas de Sobrestimulação ou TSS

Células de soja (Glycine max) foram transformadas com vetores pMOn83898, pMC>N83902, pMON87462 ou pMON87464 contendo oriV es- sencialmente conforme descrito na Patente U.S. 6.384.301 a fim de avaliar a habilidade de empilhamento de seqüências realçadoras de sobrestimulação e TSS para melhorar a freqüência de transformação e a proporção de even- tos compreendendo inserção de T-DNA de número de cópia baixo e sem seqüência de estrutura principal de vetor (por exemplo, oriV derivada de E. coli). As seqüências dos realçadores de sobrestimulação 4x e TSS 18x em- pilhados são encontradas nas SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO:11, respectiva- mente. O tratamento controle consistia em transformação com pMON83898, sem uma seqüência de sobrestimulação ou TSS. Conforme mostrado nas Tabelas 2-3, uso de construtos compreendendo seqüências realçadoras de transformação empilhadas resultou em um aumento na freqüência de trans- formação. A proporção de eventos de cópia única e livres de estrutura prin- cipal também aumentou (Tabela 3; coluna 5). Também, a porcentagem de eventos tendo uma ou duas cópias aumentou.

Tabela 2: Efeito de seqüências realçadoras de transformação sobre freqüên- cia de transformação em soja

Seqüência realçadora Plsmídeo pMON Freqüência de transformação (%) Controle 83898 2,79 Sobrestimulação 1X 83902 3,06 Sobrestimulação 4X 87462 4,22* TSS 18X 87464 4,10*

* Crescimento significante da estatística Tabela 3: Efeito de seqüências realçadoras de transformação sobre qualida- de do evento

Plasmídeo pMON Eventos totais positivo para oriV/ positivo da GOI total negativo para o- riV/ positiv o para GOI total 1 có- pia/negativ a para oriV 1 ou 2 cópias sem im- portar a presença ou ausên- cia de oriV 83898 (controle) 31 6/24 (25%) 18/24 (75%) 1 (4%) 19 (79%) 83902 (1X OD) 61 16/45 (35,5%) 29/45 (64,5%) 6 (13,3%) 30 (66,7%) 87462 (4X OD) 43 12/33 (36,4%) 21/33 (63,6%) 4 (12,1%) 23 (69,7%) 87464 (18X TSS) 71 10/50 (20%) 40/50 (80%) 17 (34%) 37 (74%)

EXEMPLO 5

Seqüências Realçadoras de Transformação Adicionais Em adição à seqüência de sobrestimulação de pTiA6 usada a-

cima (SEQ ID NO: 17), outras seqüências de sobrestimulação (incluindo as seqüências complementares reversas) são conhecidas na técnica (por e- xemplo, Shurvinton e Ream, 1991) e podem ser usadas similarmente. Essas seqüências podem incluir, mas não estão limitadas a, aquelas de pTiAB3 (GenBank M63056) (TGTGAATAAATCGCTGTGTATGTTTGTTTG; SEQ ID NO:8) e pTi15955 (GenBank AF242881) (TTGTCTAAATTTCTG- TATTTGTTTGTTTG; SEQ ID NO:9) e a seqüência consenso AAACAAACA- TACACAGCGACTTATTCACA (SEQ ID NO: 13) e TAARTYNCTG- TRTNTGTTTGTTTG; (SEQ ID NO: 19, Toro e outros, 1988) dentre outras. Primers podem ser sintetizados consequentemente e PCR realizada confor- me descrito no Exemplo 1 para criar segmentos de CDA compreendendo essas seqüências para uso em construção de plasmídeos recombinantes análogos a pMON83902, pMON80121, pMON87462 e pMON87465, dentre outros. Plantas de cultura podem ser transformadas com construtos compre- endendo uma ou mais dessas seqüências realçadoras de transformação e podem ser avaliadas quanto à sua habilidade em melhorar a freqüência de transformação e a proporção de eventos compreendendo inserção de T- DNA de número de cópia baixo e sem seqüência de estrutura principal de vetor.

Todas as composições e métodos revelados e reivindicados aqui

podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da pre- sente revelação. Embora as composições e métodos da presente invenção tenham sido descritos em termos das modalidades ilustrativas acima, será aparente àqueles de habilidade na técnica que variações, mudanças, modifi- cações e alterações podem ser aplicadas à composição, métodos e nas eta- pas ou na seqüência de etapas dos métodos descritos aqui, sem se afastar dos verdadeiros conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especifica- mente, será aparente que certos agentes que são ambos quimicamente e fisiologicamente relacionados podem substituir os agentes descritos aqui enquanto os mesmos resultados ou similares sendo obtidos. Todos tais substitutos e modificações similares aparentes àqueles versados na técnica são considerados estar dentro do espírito, escopo e conceito da invenção conforme definido pelas reivindicações apensas. REFERÊNCIAS

As referências que seguem, até o ponto que elas provêem deta-

lhes de procedimento ou outros exemplares àqueles mostrados aqui, são especificamente aqui incorporadas a título de referência. Patente U.S. 5,004,863, Patente U.S. 5,094,945; Patente U.S. 5,107,065; Patente U.S. 5,159,135; Patent U.S. 5.273.894; Patent U.S. 5.276.268; US Patent 5.561.236; Patente U.S. 5.569.834; Patente U.S. 5.591.616; Patente U.S. 5.627.061; Patente U.S. 5.633.435; Patent U.S. 5.637.489; Patent U.S. 5.646.024; Patente U.S. 5.750.871; Patente U.S. 5.846.797; Patente U.S. 5.981.840; Patente U.S. 6.040.497; Patente U.S. 6.506.559; Patente U.S. 6.624.344; Patent U.S. 6.384.301; Patente U.S. 7.022.896; Patente U.S. 7.060.876.

Patente U.S. Ser. 09/084.942; Patente U.S. Ser. 09/127.735; Patente U.S. Ser. 09/423.143 Pub. de Patente U.S. 2002/0168707 A1; Pub. de Patente U.S. 2003/0188345; Pub. de Patente U.S. 2004/0140376; Pub. de Patente U.S. 2004/244075; Pub. de Patente U.S. 2006/0041956 Altschul e outros. J. Moi Biol.. 215:403-410. 1990. Barker e outros. Plant Moi Bioi. 2:335-350. 1983.

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Zhang e outros. Plant Celi Tissue. and Organ Culture 56:37-46. 1999. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> GILBERTSON, LARRY YE, XUDONG

<120> USO DE SEQÜÊNCIAS ACENTUADORAS DE TRANSFORMAÇÃO MÚLTIPLA PARA MELHORAR A EFICIÊNCIA DE TRANSFORMAÇÃO DE PLANTA

<130> MONS:102WO

<14 0> DESCONHECIDO <141> 2007-07-18

<150> 60/831,814 <151> 2006-07-19

<160> 20

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1 <211> 60 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético

<4 00> 1

caaacaaaca tacacagcga cttattcaca caaacaaaca tacacagcga cttattcaca 60

<210> 2 <211> 60 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético

<400> 2

tgtgaataag tcgctgtgta tgtttgtttg tgtgaataag tcgctgtgta tgtttgtttg 60

<210> 3 <211> 48 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético

<400> 3

ctgacgaact gacgaactga cgaactgacg aactgacgaa ctgacgaa 48

<210> 4 <211> 48 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

5

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético

<400> 4

ttcgtcagtt cgtcagttcg tcagttcgtc agttcgtcag ttcgtcag 48

<210> 5 <211> 24 <212> DNA

<213> Agrobacterium tumefaciens <400> 5

taagtcgctg tgtatgtttg tttg 24

<210> 6

<211> 8

<212> DNA

<213> Agrobacterium rhizogenes

30

45

<4 00> 6 ctgacgaa

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Agrobacterium tumefaciens

<4 00> 7

tgtgaataag tcgctgtgta tgtttgtttg 30

40

<210> 8 <211> 30 <212> DNA

<213> Agrobacterium tumefaciens <400> 8

tgtgaataaa tcgctgtgta tgtttgtttg 30

50 <210> 9 <211> 30 <212> DNA

<213> Agrobacterium tumefaciens

55 <400> 9

tgtgaataag tcgctgtgta tgtttgtttg 30

<210> 10 60 <211> 120 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético

<4 00> 10

tgtgaataag tcgctgtgta tgtttgtttg tgtgaataag tcgctgtgta tgtttgtttg 60 tgtgaataag tcgctgtgta tgtttgtttg tgtgaataag tcgctgtgta tgtttgtttg 120

<210> 11 <211> 144

<212> DNA

<213> Agrobacterium tumefaciens <4 00> 11

ctgacgaact gacgaactga cgaactgacg aactgacgaa ctgacgaact gacgaactga 60 cgaactgacg aactgacgaa ctgacgaact gacgaactga cgaactgacg aactgacgaa 120

ctgacgaact gacgaactga cgaa 144

25

<210> 12 <211> 80 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens

<4 00> 12

tgatgatgct gactggcagg atatataccg ttgtaatttg agctcgtgtg aataagtcgc 60 tgtgtatgtt tgtttgattg 80

35

<210> 13 <211> 29 <212> DNA 40 <213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético

45

<4 00> 13

aaacaaacat acacagcgac ttattcaca 29

50 <210> 14

<211> 387

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

55 <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético

<4 00> 14

60 aggatttttc ggcgctgcgc tacgtccgcg accgcgttga gggatcaagc cacagcagcc 60 cactcgacct tctagccgac ccagacgagc caagggatct ttttggaatg ctgctccgtc 120

gtcaggcttt ccgacgtttg ggtggttgaa cagaagtcat tatcgcacgg aatgccaagc 180

actcccgagg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt 240

ttcacgccct tttaaatatc cgattattct aataaacgct ctttcaaaca aacatacaca 300

gcgacttatt cacatctctt aggtttaccc gccaatatat cctgtcaaac actgatagtt 360

taaactgaag gcgggaaacg acaatct 387

<210> 15 <211> 499 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético

<4 00> 15

aggatttttc ggcgctgcgc tacgtccgcg accgcgttga gggatcaagc cacagcagcc 60 cactcgacct tctagccgac ccagacgagc caagggatct ttttggaatg ctgctccgtc 120

gtcaggcttt ccgacgtttg ggtggttgaa cagaagtcat tatcgcacgg aatgccaagc 180

actcccgagg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt 240

ttcacgccct tttaaatatc cgattattct aataaacgct ctttgaattc gcccttcaaa 300

caaacataca cagcgactta ttcacacaaa caaacataca cagcgactta ttcacacaaa

360

caaacataca cagcgactta ttcacacaaa caaacataca cagcgactta ttcacaaagg 420

gcgaattctc ttaggtttac ccgccaatat atcctgtcaa acactgatag tttaaactga 480

40 aggcgggaaa cgacaatct 499

<210> 16 45 <211> 521

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

50 <223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético

<400> 16

aggatttttc ggcgctgcgc tacgtccgcg accgcgttga gggatcaagc cacagcagcc 60 55 cactcgacct tctagccgac ccagacgagc caagggatct ttttggaatg ctgctccgtc 120

gtcaggcttt ccgacgtttg ggtggttgaa cagaagtcat tatcgcacgg aatgccaagc 180

actcccgagg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt 60 240 ttcacgccct 300

cgaactgacg 360

ctgacgaact 420

cgaactgacg 480

aaacactgat 521

tttaaatatc aactgacgaa gacgaactga aactgacgaa agtttaaact

cgattattct ctgacgaact cgaactgacg gggcgaattc gaaggcggga

aataaacgct gacgaactga aactgacgaa tcttaggttt aacgacaatc

ctttgaattc cgaactgacg ctgacgaact acccgccaat t

gcccttctga aactgacgaa gacgaactga atatcctgtc

<210> 17 <211> 30 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético

<4 00> 17

caaacaaaca tacacagcga cttattcaca 30

<210> 18 <211> 120 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22 0>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético

<4 00> 18

caaacaaaca tacacagcga cttattcaca caaacaaaca tacacagcga cttattcaca 60 caaacaaaca tacacagcga cttattcaca caaacaaaca tacacagcga cttattcaca 120

<210> 19 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético

<220>

<221> modified_base

<222> (7)..(14)

<223> η = a, c, g and/or t/u

<400> 19

taartynctg trtntgtttg tttg 24

<210> 20 <211> 8 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético

<400> 20 tqtwtqt k

Claims (29)

1. Método de aumento da eficiência de transformação de planta bacterialmente mediada compreendendo as etapas de: a) introdução de pelo menos uma seqüência acentuadora de transforma- ção adicional em um vetor de transformação de planta compreendendo pelo menos uma região de borda de T-DNA incluindo uma seqüência acentuadora de transformação; e b) transformação de uma célula de planta com o dito vetor através de transformação bacterialmente mediada, em que a bactéria é competen- te para a transformação da dita célula de planta.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a seqüência acentuadora de transformação adicional compreende uma seqüência de nú- cleo consenso de SEQ ID N0:20.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a seqüência acentuadora de transformação adicional compreende uma seqüência sele- cionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:13 e uma seqüência complementar a qual- quer uma das SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:13.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a seqüência acentuadora de transformação está localizada próxima a uma seqüência de borda da direita (RB) do T-DNA.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a seqüência acentuadora de transformação é de um plasmídeo Ti de nopalina ou octopi- na de A. tumefaciens.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a seqüência acentuadora de transformação é de um plasmídeo Ri de A. rhizogenes.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a transfor- mação bacterialmente mediada é transformação mediada por Agrobacteri- um.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a transfor- mação bacterialmente mediada é transformação mediada por Rhizobia.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a transfor- mação mediada por Rhizobia é transformação mediada por Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium ou Bradyrhizobium.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a célula de planta é de uma planta selecionada do grupo consistindo em soja, milho, algodão, canola, arroz, trigo, alfafa, feijão comum, amendoim, tabaco, giras- sol, cevada, beterraba, brócolis, repolho, cenoura, couve-flor, aipo, repolho Chinês, pepino, berinjela, alho-poró, alface, melão, aveia, cebola, ervilha, pimenta, amendoim, batata, abóbora, rabanete, sorgo, espinafre, abóbora de inverno, cana-de-açúcar, tomate e melancia.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a seqüên- cia acentuadora de transformação compreende SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11 ou uma seqüência complementar à SEQ ID N0:10 ou SEQ ID NO:11.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a célula de planta é uma célula de milho ou soja.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a região da borda do T-DNA compreende de a partir de 1 a cerca de 18 cópias da dita seqüência acentuadora de transformação.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda a etapa de: a) regeneração de uma planta transgênica a partir da dita célula de plan- ta.

15. Construto de DNA recombinante compreendendo uma se- qüência de borda de T-DNA1 operavelmente ligada a uma seqüência acen- tuadora de transformação que compreende duas ou mais cópias de uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:13, uma seqüência comple- mentar a qualquer uma das SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:13 e combinações das mesmas.

16. Construto de acordo com a reivindicação 15, em que a se- qüência acentuadora compreende pelo menos cerca de quatro cópias da dita seqüência.

17. Construto de acordo com a reivindicação 15, em que a se- qüência de borda é uma seqüência de borda da direita (RB).

18. Construto de acordo com a reivindicação 15, em que a se- qüência de borda é uma seqüência de borda da esquerda (LB).

19. Construto de acordo com a reivindicação 15, em que o cons- truto compreende SEQ ID NO: 10.

20. Construto de acordo com a reivindicação 15, em que o cons- truto compreende SEQ ID NO:11.

21. Construto de acordo com a reivindicação 17, em que a se- quência de RB é de um plasmídeo Ti de nopalina.

22. Construto de acordo com a reivindicação 17, em que a se- qüência de RB é de um plasmídeo Ti de octopina.

23. Célula transgênica transformada com o construto como defi- nido na reivindicação 15.

24. Célula de acordo com a reivindicação 23, definida como uma célula de planta ou bacteriana.

25. Célula de acordo com a reivindicação 24, em que a célula é uma célula de Agrobacterium.

26. Célula de acordo com a reivindicação 24, em que a célula é uma célula de Rhizobium.

27. Célula de acordo com a reivindicação 24, em que a célula de planta é de uma planta selecionada do grupo consistindo em soja, milho, algodão, canola, arroz, trigo, alfafa, feijão comum, amendoim, tabaco, giras- sol, cevada, beterraba, brócoiis, repolho, cenoura, couve-flor, aipo, repolho Chinês, pepino, berinjela, alho-poró, alface, melão, aveia, cebola, ervilha, pimenta, amendoim, batata, abóbora, rabanete, sorgo, espinafre, abóbora de inverno, cana-de-açúcar, tomate e melancia.

28. Planta transgênica transformada com o construto como defi- nido na reivindicação 15.

29. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 28, defini- da conforme selecionado do grupo consistindo em soja, milho, algodão, ca- nola, arroz, trigo, alfafa, feijão comum, amendoim, tabaco, girassol, cevada, beterraba, brócolis, repolho, cenoura, couve-flor, aipo, repolho Chinês, pepi- no, berinjela, alho-poró, alface, melão, aveia, cebola, ervilha, pimenta, a- mendoim, batata, abóbora, rabanete, sorgo, espinafre, abóbora de inverno, cana-de-açúcar, tomate e melancia.