BRPI0714221A2 - composições e métodos para o tratamento de mucormicose e outras doenças fúngicas - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES E MéTODOS PARA O TRATAMENTO DE MUCORMICOSE E OUTRAS DOENçAS FúNGICAS. A presente invenção refere-se a uma composição que inclui pelo menos um composto quelante de ferro e pelo menos um agente antifúngico. A composição pode incluir os compostos quelantes de ferro deferiprona ou deferasirox. Um agente antifúngico incluído na composição pode incluir um agente antifúngico poliênico, um agente antifúngico azol ou um agente antifúngico de equinocandina. A invenção fornece também um método para tratar ou prevenir uma condição fúngica. O método inclui administrar a um indivíduo que tem, ou é suscetível a ter, uma condição fúngica uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um composto quelante de ferro por um tempo suficiente para reduzir a gravidade de uma condição fúngica, onde o dito composto quelante de ferro compreende um não-sideróforo ou não xenossideróforo em relação à dita condição fúngica. Um método para tratar ou prevenir uma condição fúngica, fornecido pela invenção, pode incluir também administrar a um individuo que tem, ou é suscetível a ter, uma condição fúngica uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um composto quelante de ferro e pelo menos um agente antifúngico. é fornecido ainda pela invenção um método que inclui a administração profilática de pelo menos um composto quelante de ferro ou pelo menos um composto quelante de ferro e pelo menos um agente antifúngico antes do início da condição fúngica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÕES E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE MUCORMICOSE E OU- TRAS DOENÇAS FÚNGICAS".

Campo Técnico da Invenção A presente invenção refere-se geralmente ao tratamento de do-

enças infecciosas e, mais especificamente, a tratamentos eficazes de doen- ças fúngicas oportunistas. Antecedentes da Invenção

A mucormicose é uma infecção fatal causada por fungos da classe Zygomycetes, ordem Mucorales. Os fungos pertencentes à ordem Mucorales são distribuídos em seis famílias, todas as quais podem causar mucormicose (Ibrahim et ai, Zygomycosis, páginas 241-251, In W.E. Dismu- kes, P.G. Pappas e J.D. Sobel (editores), Clinicai Mycology, Oxford Univer- sity Press, New York (2003); Kwon-Chung, K.J. e J.E. Bennett, Mucormyco- s/s, páginas 524-559, Medicai Mycology, Lea & Febiger, Philadelphia (1992), e Ribes et ai, Zygomycetes in Human Disease, Clin. Micorbiol. Rev. 13:236- 301 (2000)). Entretanto, os fungos pertencentes à família Mucoraceae, e especificamente a espécie Rhizopus oryzae (Rhizopus arrhizus), são de lon- ge a causa mais comum de infecção (Ribes et al., supra). Casos crescentes de mucormicose foram relatados também devido à infecção por Cunningha- mella spp. na família Cunninghamellaceae (Cohen-Abbo et al., Clinicai Infec- tious Diseases 17:173-77 (1993); Kontoyianis et al., Clinicai Infectious Dise- ases 18:925-28 (1994); Kwong-Chung et al., American Journal of Clinicai Pathology 64:544-48 (1975); e Ventura et al., Câncer 58:1534-36 (1986)). As quatro famílias remanescentes da ordem Mucorales são causas menos fre- qüentes de doença (Bearer Journal of Clinicai Mibrobiology 32:1823-24 (1994); Kamalam e Thambiah, Sabouraudia 18:19-20 (1980); Kemna et al., Journal of Clinicai Mibrobiology 32:843-45 (1994); Lye et al., Pathology 28:364-65 (1996); e Ribes et ai, supra)). Os agentes de mucormicose são patógenos oportunistas que

afetam quase uniformemente hospedeiros imunocomprometidos (Spellberg et al., Clin. Micorbiol. Rev. 18:556-69 (2005)). Os pacientes cetoacidose dia- bética são singularmente suscetíveis à mucormicose, e desenvolvem estas infecções mais comumente do que as infecções causadas por outros fungos. Em contraste, frente a outras condições imunocomprometedoras, os pacien- tes predispostos a desenvolver mucormicose, incluindo neutropenia e terapia corticosteróide, a mucormicose é menos comum do que outras infecções fúngicas oportunistas, tais como aquelas causadas por Candida e Aspergil- Ius spp..

Globalmente, um estudo recente baseado em populações esti- mou a incidência de mucormicose como sendo de 1,7 casos por um milhão de pessoas, o que se traduz em aproximadamente 500 casos por ano nos Estados Unidos (Rees et ai, Clinicai Infectious Diseases 27:1138-47 (1998)). Contudo, em pacientes com risco mais alto, tais como aqueles que sofreram transplante alogênico de medula óssea, a prevalência de mucormicose foi descrita como sendo tão alta quanto 2-3% (Maertens et ai, Bone Marrow Transplantation 24:307-12 (1999); Marty et al., New Engl. J. Med. 350:950- 52 (2004)). Além disso, uma revisão recente encontrou um aumento acentu- ado na incidência de mucormicose duas as duas últimas décadas (Gleissner et al., Leuk. Lymphoma 45:1351-60 (2004)). Aumentos similares foram rela- tados pelos principais centros de transplantes de células-tronco. Por exem- pio, relatórios descreveram uma incidência mais que o dobro de mucormico- se durante as duas últimas décadas (Marr et al., Clin. Infect. Dis. 34:909-17 (2002); Kontoyianis et ai, Clin. Infect. Dis. 30:851-56 (2000)). Dada a preva- lência crescente de diabetes, câncer, e transplante de órgãos na população em envelhecimento dos Estados Unidos, prevê-se que a elevação na inci- dência de mucormicose continue não diminuída no futuro previsível.

As terapias disponíveis para mucormicose invasiva incluem ten- tativas para reverter os fatores para predisposição subjacentes, desbrida- mento cirúrgico disseminado emergente da área infectada, e terapia antifún- gica adjuntiva (Edwards, J., Jr. Zygomycosis, páginas 1192-1199. In P. Hoe- prich e M. Jordan (editores), Infectious Disease, A- edição, JB. Lippincott Co., Philadelphia (1989); Ibrahim et ai, (2003), supra; Kwon-Chung e Ben- nett, supra; Sugar, A.M., "Agent of Mucormycosis and Related Species", pá- ginas 2311-2321. In G. Mandell, J. Bennett, e R. Dolin (editors), "Principies and Practices of Infectious Diseases", 4â edição, Churehill Livingstone, New York (1995)). A anfoterieina B (AmB) permanece sendo o único agente anti- fúngico aprovado para o tratamento de mucormicose invasiva (Id.). Devido ao fato de que o fungo é relativamente resistente a AmB1 altas doses são necessárias, que freqüentemente causam nefrotoxicidade e outros efeitos adversos (Sugar, supra). Além disso, na ausência de remoção cirúrgica do foco infectado (tal como a excisão do olho em pacientes com mucormicose rinocerebral), a terapia antifúngica isoladamente é raramente curativa (Ed- wards, J. (1989), supra; Ibrahim et al. (2003), supra). Mesmo quando o des- bridamento cirúrgico é combinado com alta dose de AmB, a mortalidade as- sociada à mucormicose excede 50% (Sugar, supra). Em pacientes com a doença disseminada, a mortalidade se aproxima de 100% (Husain et al., Clin. Infect. Dis. 37:221-29 (2003)). Por causa da taxa de mortalidade inacei- tavelmente alta, e da extrema morbidez da terapia cirúrgica altamente desfi- guradora, foi imperativo desenvolver novas estratégias para tratar e prevenir mucormicose invasiva.

A nefrotoxicidade de AmB incitou os médicos na prática a adotar o uso de formulações lipídicas de AmB, que são menos nefrotóxicas do que AmB e podem ser administradas em doses mais altas por um período de tempo mais longo (Ibrahim et al., (2003), supra). Vários relatórios de casos de pacientes com mucormicose documentaram tratamentos exitosos com até 15 mg/kg/dia de formulações lipídicas de anfoterieina (Cagatay et al., BMC Infect. Dis. 1:22 (2001); Ericsson et al., Clinicai Infectious Diseases 16:585-56 (1993); Walsh et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45:3487-96 (2001)). Contudo, a mortalidade de pacientes tratados com formulações lipí- dicas de anfoterieina permanece alta, ressalta a necessidade por novos a- gentes terapêuticos para esta doença mortal.

O ferro é necessário por virtualmente todos patógenos para crescimento e virulência (Howard, D.H., Clin. Mlcrobiol. Rev. 12:394-404 (1999)). Em hospedeiros mamíferos, muito pouco ferro sérico está disponível para os microorganismos porque ele está altamente ligado a proteínas car- readoras tais como transferrina (Artis et ai, Diabetes 31:1109-14 (1982)). O seqüestro de ferro sérico é um mecanismo de defesa iportante do hospedei- ro contra R. oryzae particularmente (Artis et a!., supra). O organismo cresce deficientemente no soro e esta inibição do crescimento é revertida quando ferro exógeno é adicionado (Artis et al., supra; Boelaert et ai, J. Clin. Invest 91:1979-86 (1993)).

Os pacientes com níveis elevados de ferro sérico disponível são singularmente suscetíveis à infecção por R. oryzae e outros Zygomycetes, mas até um grau menor do que outros fungos patogênicos, tais como Candi- da ou Aspergillus (Ibrahim et ai, (2003), supra; Sugar, supra). Por exemplo, os pacientes tratados com o quelante de ferro, deferoxamina, têm uma inci- dência acentuadamente aumentada de mucormicose invasiva, que é associ- ada com uma mortalidade > 80% nestes pacientes (Boelaert et ai, Kidney International 45:667-71 (1994)). Embora a deferoxamina atue como quelante de ferro com relação ao hospedeiro humano, seu efeito sobre R. oryzae pa- rece ser justamente o contrário. A deferoxamina predispõe os pacientes à infecção por Rhizopus atuando como um sideróforo, que supre ferro anteri- ormente indisponível para o fungo (Boelaert et al. (1993), supra). Rhizopus obtém ferro a partir do complexo ferro/deferoxamina por transporte intracelu- lar do ferro reduzido sem internalização da deferoxamina (de Locht et al., Biochemical Pharmacology 47:1843-50 (1994)). Este transporte é similar- mente mediado por ferro permeases de alta afinidade. Portanto, o ferro séri- co disponível aumentado é um fator de risco para a patogênese de mucro- micose. Entretanto, os compostos quelantes de ferro podem funcionar como sideróforos para o patógeno, e assim sendo, podem não ser geralmente a- plicáveis para tratamentos terapêuticos.

Assim sendo, existe uma necessidade de se obter compostos e métodos que podem reduzir o risco de patogênese de mucormicose e pro- porcionam tratamento terapêutico eficaz. A presente invenção satisfaz a esta necessidade e proporciona também vantagens afins. Sumário da Invenção

A invenção fornece uma composição que inclui pelo menos um

20

25 composto quelante de ferro e pelo menos um agente antifúngico. A compo- sição pode incluir os compostos quelantes de ferro deferiprona ou deferasi- rox. Um agente antifúngico incluído na composição pode incluir um agente antifúngico poliênico, um agente antifúngico azol ou um agente antifúngico de equinocandinas. A invenção fornece também um método para tratar ou prevenir uma condição fúngica. O método inclui administrar a um indivíduo que tem, ou é suscetível de ter, uma condição fúngica, uma quantidade tera- peuticamente eficaz de pelo menos um composto quelante de ferro por um tempo suficiente para reduzir a gravidade de uma condição fúngica, onde o composto quelante de ferro compreende um não-sideróforo ou não- xenossideróforo em relação à condição fúngica. Um método para tratar ou prevenir uma condição fúngica fornecido pela invenção pode incluir também administrar a um indivíduo que tem, ou é suscetível de ter, uma condição fúngica, uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um com- posto quelante de ferro e pelo menos um agente antifúngico. A invenção for- nece ainda um método que inclui a administração profilática do pelo menos um composto quelante de ferro ou pelo menos um composto quelante de ferro e pelo menos um agente antifúngico antes do início da condição fúngi- ca.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 ilustra a relação entre Def e ferro e a sobrevida de camundongos DKA infectados com R. oryzae. Os camundongos (n > 20 em cada tratamento) foram tratados co deferiprona (Def) ou Def + FeCI3 (60 mg/kg) para reverter o efeito da quelação do ferro. Um braço tratado com LAmB foi incluído como um controle. O tratamento foi iniciado 24 h após a infecção. *, ρ < 0,003 comparado com não-tratados infectados ou não- tratados não-infectados + FeCI3.

A figura 2 ilustra que Exjade® (deferasirox) melhora a sobrevida de camundongos cetoacidóticos diabéticos infectados com R. oryzae. Os camundongos (n = 6 para placebo e 7 para Exjade®) foram infectados atra- vés de injeção na cauda com 2,2 χ 104 esporos de R. oryzae 99-892 (isolado clínico obtido a partir do pulmão do paciente infectado). Vinte e quatro horas depois da infecção, os camundongos foram tratados por gavagem oral co placebo, 1, 3 ou 10 mg/kg de Exjade® duas vezes ao dia por 7 dias consecu- tivos. *, ρ < 0,05 comparado com placebo.

A figura 3 ilustra a sobrevida de camundongos DKA infectados com R. oryzae e tratados com diferentes esquemas de tratamento com Def. Os camundongos (n = 6 por grupo) foram tratados 24 h depois da infecção com Def a 50, 100 ou 200 mg/kg cada dia (todos os dias, q.d.) ou a cada dois dias (q.o.d.) por um total de 4 doses. *, ρ < 0,05 comparado com não- tratados infectados.

A figura 4 ilustra o tratamento de mucormicose experimental com

uma combinação de Def e LAmB. Os camundongos (n = 11, para infectados não-tratados e Def e η = 6 com LAmB e Def + LAmB) foram infectados com R. oryzae e então tratados 24 h depois com ambos fármacos para um total de 4 doses. *, ρ < 0,05 comparado com camundongos infectados não- tratados.

A figura 5 ilustra a sobrevida de camundongos neutropênicos infectados com R. oryzae e tratados profilaticamente com Def, LAmB, ou ambos. Os camundongos (n = 9) foram tratados no Dia 1 com Def q.o.d., LAmB q.d., ou ambos por um total de 4 doses. *, ρ < 0,05 para LAmB + Def versus infectados não-tratados.

A figura 6 ilustra a carga sobre o cérebro por R. oryzae de ca- mundongos DKA (n = 6) tratados com deferiprona, LAmB ou placebo. Os camundongos foram infectados com 3,8 χ 103 esporos e os cérebros foram colhidos 54 h mais tarde depois de 2 doses de tratamento com qualquer um dos dois fármacos. Os dados estão apresentados como médias + faixas in- terquartis. O eixo y reflete o limite inferior de detecção do ensaio. *, ρ < 0,036 versus placebo pelo teste de Steel para múltiplas comparações.

A figura 7 ilustra uma seção congelada de mucosa nasal necróti- ca colorida com metanamina-prata, ilustrando fungos com hifas asseptadas largas semelhantes a bastões consistentes com Mucorales. Ampliação de 840x.

A figura 8 ilustra que deferasirox induz a expressão do gene rF- TR1 em Rhizopus oryzae. Especificamente, a figura 8(a) ilustra a expressão detectada por RT PCR do gene rFTR1 a partir de micélios de R. oryzae in- cubados em quelação de ferro repleta de ferro (deferasirox), ou reversão condições da quelação de ferro (deferasirox saturado com cloreto férrico). A expressão de 18s rDNA foi incluída para verificar a qualidade da extração do RNA. A figura 8(b) ilustra um diagrama que demonstra a estratégia para construir o vetor de expressão de GFP em R. oryzae. O promotor denota rFtrlp ou Actlp. A figura 8(c) ilustra a expressão de GFP em R. oryzae im- pulsionada por rFtrlp ou Actlp (determinada por microscopia confocal e ci- tometria de fluxo) de R. oryzae desenvolvido em deferasirox repleto de ferro, ou deferasirox saturado com meio que contém cloreto férrico. A expressão de GFP é revelada por células fluorescentes verdes por microscopia confo- cal, e a porcentagem de células no canal FL1 (eixo y) por citometria de fluxo.

A figura 9(a) ilustra a sobrevida de camundongos cetoacidóticos diabéticos (n > 7 por grupo) infectados com R. oryzae 99-892 (2,2 χ 104) e tratados com diferentes doses de deferasirox. Os camundongos foram trata- dos com placebo (carreador hidróxi-propil-celulose), deferasirox, ou deferasi- rox mais ferro (FeCI3, 10 mg/kg) para reverter o efeito da quelação de ferro. * ρ < 0,05 (de três experimentos separados com resultados similares) infecta- dos com R. oryzae 99-880 (inóculo médio 1,3 χ 103 esporos) e 24 h depois tratados com 10 mg/kg de deferasirox duas vezes ao dia (b.i.d.) por 7 dias. *, ρ < 0,003 comparado com placebo.

A figura 10(a) ilustra a carga fúngica sobre o cérebro e rim de camundongos cetoacidóticos diabéticos (n = 11 por grupo) infectados com R. oryzae 99-892 (4,2 χ 104 esporos) e tratados com pacebo, deferasirox (10 mg/kg b.i.d.), ou deferasirox mais ferro. Os órgãos foram colhidos no dia 4 depois de receberem quatro tratamentos diários. Os dados estão apresenta- dos como médias + faixas interquartis. O eixo y reflete o limite inferior de detecção do ensaio. A figura 10(b) ilustra seções do rim coloridas com he- matoxilina e eosina de camundongos cetoacidóticos diabéticos infectados com R. oryzae 99-892 e tratados com deferasirox, deferasirox mais cloreto férrico, ou placebo, como mencionado em 10(a). As setas indicam hifas de R. oryzae no tecido. Ampliação, X 400. * ρ < 0,002 para carga fúngica sobre o tecido comparado com placebo ou deferasirox mais cloreto férrico.

A figura 11 ilustra que a quelação de ferro aumenta as freqüên- cias de linfócitos Th 1 e Th2 esplênicos e aumenta os níveis de citocinas pró- inflamatórias em comparação com camundongos sobrecarregados com fer- ro. Particularmente, a figura 11 (a) ilustra as freqüências de linfócitos Th1 e Th2 esplênicos em camundongos diabéticos cetoacidóticos (n = 11) infecta- dos com 3,1 χ 104 esporos de R. oryzae 99-892 e, 24 h depois, tratados com placebo, deferasirox, ou deferasirox mais cloreto férrico. A figura 11 (b) ilustra os resultados de análise de citocinas em órgãos integrais por Cytometric Be- ad Array® dos mesmos camundongos (n = 11), mencionados em 11 (a), sa- crificados e os baços e rins coletados 4 dias depois da infecção. Os dados em 11 (a) e (b) estão apresentados como médias + faixas interquaertis. * ρ < 0,02 comparado com placebo ou deferasirox mais cloreto férrico. ** ρ < 0,05 comparado e ¥ ρ < 0,07 comparado com deferasirox mais cloreto férrico.

A figura 12 ilustra a eficácia contra mucormicose para deferasi- rox isoladamente, LAmB isoladamente e a combinação de deferasirox e LAmB juntos. A figura ilustra especificamente a sobrevida de camundongos diabéticos cetoacidóticos (n > 16 de dois experimentos separados com resul- tados similares) infectados com R. oryzae 99-880 (inóculo médio de 1,5 χ 103 esporos) e tratados com deferasirox isoladamente LAmB isoladamente, e a combinação de deferisirox (10 mg/kg b.i.d. por 7 dias) e LAmB (15 mg/kg por 4 dias).

A figura 13 ilustra a eficácia em reduzir infecção de órgãos-alvos para deferasirox isoladamente, Lamb isoladamente e a combinação de defe- rasirox e LAmB juntos. Mais especificamente, a figura ilustra a carga tecidual de R. oryzae nos cérebros e rins de camundongos (n > 7) infectados com R. oryzae 99-880. Nestes camundongos, o tratamento começou 24 h depois da infecção e consistiu em placebo, deferasirox (10 mg/kg, b.i.d.), LAmB (15 mg/kg/dia), ou uma combinação de ambos fármacos. Os órgãos foram colhi- dos no dia 3 depois de receberem dois tratamentos diários. Os dados estão apresentados como média + faixas interquartis. O eixo y reflete o limite infe- rior de detecção do ensaio. * ρ < 0,003 comparado com placebo. ** ρ < 0,003 comparado com placebo, deferasirox, ou LAmB. ¥ ρ < 0,01 comparado com placebo, ou deferasirox.

A figura 14 ilustra a eficácia de deferasirox em tratar infecções por R. oryzae em camundongos neutropênicos. Os camundongos tratados com ciclofosfamida (n = 19 de dois experimentos separados com resultados similares) foram infectados com 2,7 χ 10 3 esporos de R. oryzae 99-892. Os camundongos foram tratados 24 h depois da infecção com placebo, ou defe- rasirox (10 mg/kg) administrado a cada dia (q.d.) ou a cada dois dias (q.o.d.) por um total de 5 doses. * ρ = 0,037 comparado co placebo. Descrição Detalhada da Invenção

Esta invenção refere-se ao uso de compostos quelantes de ferro para o tratamento ou redução da gravidade de infecções fúngicas. Os com- postos quelantes de ferro são selecionados para terem baixa atividade side- rófora ou xenossiderófora em relação à condição fúngica visada. Em algu- mas modalidades, os compostos quelantes de ferro são selecionados para serem substancialmente isentos de atividade siderófora ou xenossiderófora em relação à condição fúngica visada. Em contraste, os quelantes de ferro que atuam como sideróforos ou xenossideróforos, que suprem ferro anteri- ormente indisponível para um fungo, os compostos quelantes de ferro não- siderofóricos e não-xenossiderofóricos carecem dessa atividade facilitadora ou transportadora. Portanto, os quelantes de ferro da invenção podem ser usados para a remoção de ferro do ambiente circundante. Um benefício da quelação de ferro para a terapia antifúngica é que ela reduz a disponibilidade de um mineral importante necessário por muitos patógenos microbianos pa- ra crescimento e/ou virulência.

Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma composição terapêutica que contém um composto quelante de ferro e um agente antifún- gico. O composto quelante de ferro pode ser deferiprona (1,2-dimetil-3- hidróxi-pirídio-4-1), ou deferasirox (ácido 4-[3,5-bis-(2-hidróxi-fenil)-1 H-1,2,4- triazol-1-il]-benzóico). Deferiprona e deferasirox têm sido usados em esque- mas terapêuticos para o tratamento de condições de sobrecarga de ferro e são, portanto, seguros e eficazes para terapia de quelação de ferro para o tratamento ou prevenção de condições fúngicas. Os agentes antifúngicos conhecidos nessas técnicas podem ser selecionados para combinação com um quelante de ferro da invenção. A combinação é benéfica para uso no tratamento ou prevenção de condições fúngicas.

Em outra modalidade, a invenção refere-se a um método para tratar ou prevenir uma condição fúngica. O método inclui administrar a um indivíduo um ou mais compostos quelantes de fero, que apresentam ativida- de quelante de ferro não-siderofórica ou não-xenossiderofórica contra a es- pécie fúngica visada. O método pode incluir também a coadministração de um agente antifúngico para atingir atividade intensificada em comparação com um quelante de ferro isoladamente. O composto quelante de ferro pode ser deferiprona, deferasirox ou pode ser selecionado entre outros compostos quelantes de ferro conhecidos nessas técnicas. Os métodos da invenção são particularmente benéficos para tratamentos terapêuticos e profiláticos porque a quelação de ferro visa à remoção de um mineral importante para a patogênese fúngica.

A invenção fornece uma composição que inclui pelo menos um composto quelante de ferro e pelo menos um agente antifúngico. O ferro é necessário para o crescimento, viabilidade e/ou viru-

lência da maioria dos sistemas fúngicos. Os fungos desenvolveram uma sé- rie de mecanismos de aquisição, captação e métodos de armazenamento para assegurar suprimentos suficientes deste metal importante. As composi- ções da invenção visam a este mineral importante para remoção do ambien- te hospedeiro para neutralizar patógenos fúngicos. As composições da in- venção incluem um composto quelante de ferro para depurar o ferro disponí- vel e inibir o crescimento, viabilidade e/ou virulência de um patógeno fúngi- co.

As composições da invenção incluem uma combinação de pelo menos um composto quelante de ferro junto com pelo menos um agente an- tifúngico. A inclusão de um composto quelante de ferro e também um agente antifúngico combina atividades antifúngicas que assestam duas vias diferen- tes usadas por fungos para crescimento, viabilidade e/ou virulência. Assestar duas ou mais vias fúngicas diferentes proporciona tratamento terapêutico eficaz de condições fúngicas, pois a possibilidade de evasão patogênica de ambas vias assestadas é baixa.

Como aqui utilizado, o termo "composto quelante de ferro" ou

"quelante de ferro" pretende significar um composto que se liga ao ferro en- tre dois ou mais sítios de ligação separados de modo a formar um anel ou anéis quelato. Um composto quelante de ferro ligado ou complexado com fero é aqui referido como um quelato de ferro. Um composto quelante de ferro pode ser bidentado, que se liga ao ferro usando dois sítios de ligação separados. Os compostos quelantes de ferro da invenção podem ser tam- bém tridentados, tetradentados ou compostos quelantes de ferro multidenta- dos de ordem mais alta, que se ligam ao ferro com três, quatro ou mais sítios de ligação separados, respectivamente. Os compostos quelantes de ferro da invenção incluem compostos de quelação que podem se ligar a todos esta- dos de oxidação do ferro, incluindo, por exemplo, estado de ferro (-II), estado de ferro (-I), estado de ferro (0), estado de ferro (I), estado de ferro (II) (terro- so), estado de ferro (III) (férrico), estado de ferro (IV) (ferrila) e/ou ferro (V). A terapia de quelação de ferro refere-se ao uso de um quelante de ferro para se ligar ao ferro in vivo para formar um quelante de ferro, de tal modo que o ferro perca seu efeito tóxico ou atividade fisiológica adversa. Alternativamen- te, o ferro quelado se torna indisponível para o organismo infeccioso.

Um composto quelante de ferro útil em uma composição da in- venção pode incluir qualquer quelante ou outra molécula que pode se ligar e impede a utilização do ferro pelo fungo ou fungos visados. Os exemplos es- pecíficos de compostos quelantes de ferro incluídos nas composições da invenção incluem, por exemplo, deferiprona e deferasirox. Estes compostos quelantes de ferro exemplificativos são particularmente úteis porque eles foram aprovados em vários países para indicações terapêuticas não relacio- nadas a condições fúngicas e estão, portanto, bem caracterizados, seguros e atóxicos em humanos.

O termo "deferiprona", como aqui utilizado, pretende significar um composto quelante de ferro que tem a estrutura (1,2-dimetil-3-hidróxi- pirídio-4-1). A deferiprona (Def) é conhecida também nessas técnicas como L1, CP20, Ferriprox, ou Kelfer. A deferiprona é um membro da classe a- ceto-hidróxi-piridinas de quelantes de ferro e está disponível comercialmen- te, por exemplo, na Apotex, Inc. (Weston, Ontário, Canadá).

O termo "deferasirox", como aqui utilizado, pretende significar um composto quelante de ferro que tem a estrutura ácido 4-[3,5-bis-(2- hidróxi-fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il]-benzóico, e tem um peso molecular de 373,4 dáltons. O deferasirox, conhecido também nessas técnicas como Ex- jade® ou ICI 670, é um membro da classe de quelantes de ferro tridentados referidos como bis-hidróxi-fenil-triazóis N-substituídos. O deferasirox está disponível comercialmente, por exemplo, na Novartis Corp. (Basel, Suíça), por exemplo, sob a marca comercial Exjade®. De acordo com a presente invenção, os termos "deferasirox", "ICL 670" e "Exjade®" significam o ingre- diente ativo ácido 4-[3,5-bis-(2-hidróxi-fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il]-benzóico, por exemplo, ácido 4-[3,5-bis-(2-hidróxi-fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il]-benzóico ou um seu sla farmaceuticamente aceitável. Deferasirox, seu processo de fabricação e seus usos estão descritos, por exemplo, nas patentes n— US 6.465.504B1 e 6.595.750B2 e na patente européia n2 EP 0914118. As pre- parações farmacêuticas que compreende ácido 4-[3,5-bis-(2-hidróxi-fenil)- 1H-1,2,4-triazol-1-il]-benzóico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável estão descritas, por exemplo, no pedido de patente internacional n2 WO 2004/035026.

Outros compostos quelantes de ferro também podem ser incluí- dos nas composições da invenção. Tais outros compostos quelantes de ferro são bem conhecidos nessas técnicas e incluem, por exemplo, sideróforos e xenossideróforos de ocorrência natural, tais como aqueles descritos abaixo, bem como compostos de ocorrência não-natural, tais como deferiprona e deferasirox.

Os compostos quelantes de ferro de ocorrência não-natural são

exemplificados por membros da classe hídróxi-piridin-4-ona (HPO) de que- lantes, tais como deferiprona, membros da classe bis-hidróxi-fenil-trizóis N- substituídos da quelantes, tais como deferasirox, ácido dietilenotriaminopen- tacético (DTPA) e deferoxamina. Deferiprona, deferasirox e qualquer um dos compostos quelantes de ferro exemplificativos acima, bem como outros bem conhecidos nessas técnicas, podem ser incluídos nas composições que con- têm composto quelante de ferro da invenção.

Os sideróforos e xenossideróforos incluem, por exemplo, hidro- xamatos e policarboxilatos. Os hidroxamatos contêm um grupamento Ν-δ- hidróxi-ornitina e são classsificados geralmente em quatro famílias exemplifi- cativas. Uma categoria inclui ácido rodotorúlico, que é a dicetopiperazina de N-ô-acetil-L-N-5-hidróxi-ornitina. Estão incluídos nesta categoria os deriva- dos tais como d iid roxa mato denominado ácido dimerúmico. Uma segunda categoria inclui os coprogenes, que contêm um grupamento N-ô-acil-L-N-ô- hidróxi-L-ornitina. Os coprogenes podem ser considerados também deriva- dos triidroxamatos do ácido rodotorúlico com uma estrutura linear. Uma ter- ceira categoria, que consiste em peptídeos cíclicos que contêm um tripeptí- deo de N-ô-acil-N-ô-hidróxi-ornitina e combinações de glicina, serina ou ala- nina. A quarta categoria exemplificativa inclui fusarinina, também denomina- da fusigens, que podem ser hidroxamatos lineares ou cíclicos. A fusarinia é um composto caracterizado por N-acilação de N-hidróxi-ornitina pelo ácido anidromevalônico.

Os policarboxilatos consistem em um policarboxilato que contém ácido cítrico denominado rizoferrina. A molécula contém duas unidades de ácido cítrico ligadas a diamino-butano. A rizoferrina está amplamente distri- buída entre os membros do filo Zygomycota, que foi observado na ordem Mucorales e na ordem Entomophthorales. Outras categorias de sideróforos úteis como compostos quelantes de ferro nas composições da invenção, incluem, por exemplo, a classe fenolato-catecolato de sideróforos, hemina, e β-cetoaldeído fitotoxinas.

A quantidade de composto quelante de ferro incluída em uma composição da invenção pode variar, mas será geralmente uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade que pode ser reconstituída ou diluída até uma quantidade terapeuticamente eficaz. Por exemplo, as quan- tidades eficazes de compostos quelantes de ferro da invenção estão descri- tas adicionalmente abaixo fazendo referência aos métodos da invenção. Uma quantidade de um, alguns ou todos compostos quelantes de ferro pode ser formulada em uma composição da invenção para corresponder a estas quantidades eficazes exemplificativas.

Um composto quelante de ferro pode ser formulado também em uma composição da invenção em quantidades maiores do que uma quanti- dade terapeuticamente eficaz para estocagem de curto ou longo prazo e o usuário pode diluir a formulação antes do uso até uma quantidade terapeuti- camente eficaz desejada. Alternativamente, um composto quelante de ferro incluído em uma composição da invenção pode ser Iiofilizado ou produzido em pó ou outra forma sólida, e o usuário pode reconstituir a formulação seca antes do uso até uma quantidade terapeuticamente eficaz.

As formulações secas ou concentradas ou as formulações que contêm uma quantidade eficaz de constituintes podem conter o composto quelante de ferro e o agente antifúngico isoladamente ou junto com quais- quer, excipientes, surfactantes, tonificadores, sais ou tampões desejados. A diluição ou reconstituição pode ser realizada em um meio farmaceuticamen- te aceitável que ajusta a formulação até a quantidade terapeuticamente efi- caz desejada do pelo menos um composto quelante de ferro e de pelo me- nos um agente antifúngico, e inclui quaisquer, excipientes, surfactantes, toni- ficadores, sais ou tampões desejados. As formulações farmacêuticas são bem conhecidas e praticadas na área farmacêutica. Qualquer uma dessas formulações bem conhecidas e componentes de formulações farmacêuticas são aplicáveis para uso com uma composição da invenção. As formulações farmacêuticas, excipientes, seu uso, a formulação e características são bem conhecidas nessas técnicas e podem ser encontradas, por exemplo, em "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", supra; Williams et ai, "Foyes Principies of Medicinal Chemistry", 5â edição, Lippincott Williams & Wilkins (2002); Allen et ai, "Ansels Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", 8â edição, Lippincott Williams & Wilkins (2004). Similar- mente, o surfactante, seu uso, formulação e características são bem conhe- cidas e podem ser encontradas descritas, por exemplo, em Holmberg et al., "Surfactants and Polymers in Aqueous Solution", supra; "Surfactants: A Prac- tical Handbook", K. Robert Lange, editor, supra; e vogel, A.I., "Vogels Text- book of Practical Organic Chemistry", supra.

As composições da invenção incluem também pelo menos um

agente antifúngico. O termo "agente antifúngico" ou"antifúngico", como aqui utilizado, pretende significar um agente que destrói fungos, ou inibe ou pre- vine o crescimento, viabilidade e/ou virulência fúngica. As categorias exem- plificativas de agentes antifúngicos incluem agentes antifúngicos poliênicos, agentes antifúngicos de azóis e agentes antifúngicos de equinocandinas. Os exemplos específicos de antes antifúngicos poliênicos incluem desoxicolato de anfotericina B, anfotericina B lipossômica, complexo lipídico de anfoterici- na B e Anfotec. Os exemplos específicos de agentes antifúngicos de azóis incluem posaconasol, voricoazol, fluconasol e itraconasol. Os exemplos es- pecíficos de agentes antifúngicos de equinocandinas incluem acetato de caspofungina e micafungina. Inúmeros outros agentes antifúngicos são bem conhecidos nessas técnicas e estão incluídos dentro do significado do termo conforme ele é aqui utilizado.

A combinação do pelo menos um composto quelante de ferro e de pelo menos um agente antifúngico deve ser selecionada dependendo da condição fúngica a ser assestada. Por exemplo, o complexo lipídico de anfo- tericina B pode ser um bom agente antifúngico contra, por exemplo, zigomi- cose, (mucormicose), aspergilose e/ou candidíase, e pode ser combinado com um composto quelante de ferro tal como deferiprona ou deferasirox. Similarmente, um dos agentes antifúngicos exemplificados acima ou outro conhecido nessas técnicas pode ser eficaz ou terapeuticamente desejável contra outra condição visada e um desses agentes antifúngicos pode ser combinado com um composto quelante de ferro para produzir uma composi- ção da invenção. Portanto, as composições da invenção são flexíveis em seus compostos quelantes de ferro constituintes e agentes antifúngicos constituintes e permitem que quaisquer e todas combinações e permutações do pelo menos um composto quelante de ferro e de pelo menos um agente antifúngico possam ser combinados, por exemplo, em uma única formula- ção.

Consequentemente, em uma modalidade, a invenção fornece uma composição que contém pelo menos um composto quelante de ferro e pelo menos um agente antifúngico. O composto quelante de ferro pode ser selecionado, entre, por exemplo, os compostos quelantes de ferro de ocor- rência não-natural descritos anteriormente, exemplificados por membros da classe hidróxi-piridin-4-ona (HPO) de quelantes, tais como deferiprona, membros da classe bis-hidróxi-fenil-trizóis N-substituídos da quelantes, tais como deferasirox, ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) e deferoxami- na. Os compostos quelantes de ferro podem ser selecionados também entre, por exemplo, os sideróforos e/ou xenossideróforos exemplificados, por e- xemplo, pelos hidroxamatos, os policarboxilatos, a classe de fenolatos- catecolatos de sideróforos, hemina ou as β-cetoaldeído fitotoxinas descritas anteriormente.

O agente antifúngico pode ser selecionado entre, por exemplo, um agente antifúngico poliênico, tal como desoxicolato de anfotericina B, anfotericina B lipossômica, complexo lipídico de anfotericina B e Anfotec. O agente antifúngico pode ser selecionado também entre, por exemplo, um agente antifúngico de azóis, tal como posaconasol, voricoazol, fluconasol e itraconasol. O agente antifúngico pode ser adicionalmente selecionado entre, por exemplo, um agente antifúngico de equinocandinas tais como acetato de caspofungina ou micafungina. Uma composição exemplificativa da invenção que tem um composto quelante de ferro para o pelo menos um composto quelante de ferro e que tem um agente antifúngico para pelo menos um a- gente antifúngico pode ser deferasirox e complexo lipídico de anfotericina B.

Da mesma forma que a quantidade de um composto quelante de ferro incluído em uma composição da invenção, a quantidade de agente anti- fúngico incluída em uma composição pode variar, mas deve ser geralmente uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade que pode ser reconstituída ou diluída até uma quantidade terapeuticamente eficaz. Por exemplo, as quantidades eficazes de agentes antifúngicos da invenção es- tão descritas adicionalmente abaixo e exemplificadas fazendo referência aos agentes antifúngicos poliênicos. Uma quantidade de um, alguns ou todos agentes antifúngicos pode ser formulada em uma composição da invenção para corresponder a estas quantidades eficazes exemplificativas para agen- tes antifúngicos poliênicos ou correspondente às quantidades eficazes co- nhecidas para outros agentes antifúngicos tais como agentes antifúngicos de azóis ou o agente antifúngico de equinocardinas. Similarmente, e como des- crito anteriormente com relação a um composto quelante de ferro incluído em uma composição da invenção, um agente antifúngico também pode ser formulado em uma composição da invenção na forma concentrada para es- tocagem por prazo curto ou longo, e o usuário final pode diluir a formulação antes do uso até uma quantidade terapeuticamente eficaz. Adicionalmente, um agente antifúngico incluído em uma composição da invenção pode ser produzido na forma liofilizada, em pó ou outra forma sólida e o usuário final pode reconstituir a formulação seca antes do uso até uma quantidade tera- peuticamente eficaz.

As formulações secas ou concentradas ou as formulações que contêm uma quantidade eficaz de constituintes podem conter o composto quelante de ferro e o agente antifúngico isoladamente ou junto com quais- quer, excipientes, surfactantes, tonificadores, sais ou tampões desejados. A diluição ou reconstituição pode ser realizada como descrito anteriormente e exemplificado, por exemplo, em "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", supra; Williams et ai, "Foyes Principies of Medicinal Chemistry", 5â edição, Lippincott Williams & Wilkins (2002); Allen et ai, "Ansels Pharma- ceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", 8â edição, Lippincott Williams & Wilkins (2004). Similarmente, o surfactante, seu uso, formulação e características são bem conhecidas e podem ser encontradas descritas, por exemplo, em Holmberg et ai, "Surfactants and Polymers in Aqueous So- lution", supra; "Surfactants: A Practical Handbook", K. Robert Lange, editor, supra; e vogel, A.I., "Vogels Textbook of Practical Organic Chemistry", su- pra.

As composições da invenção podem conter adicionalmente dois ou mais compostos quelantes de ferro. A inclusão de dois ou mais compos- tos quelantes de ferro permite assestar múltiplas condições fúngicas e/ou permite a inclusão de uma faixa de afinidades por ferro no componente que- Iante de ferro da composição. A inclusão de compostos quelantes de ferro que têm diferentes afinidades por ferro pode ser terapeuticamente benéfico para impedir ainda mais a evasão de patógenos fúngicos.

As composições da invenção devem conter geralmente entre cerca de 1 e 8, particularmente entre cerca de 2 e 7, mais particularmente entre cerca de 3 e 6 ou ainda mais particularmente entre cerca de 4 e 5 compostos quelantes de ferro. Compostos quelantes de ferro em número maior ou entre estas faixas também podem ser usados em uma composição da invenção. Por exemplo, pode ser produzida uma composição da invenção que contém essencialmente qualquer número desejado de diferentes com- postos quelantes de ferro, incluindo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 ou mais.

As composições da invenção podem conter adicionalmente dois ou mais agentes antifúngicos. Da mesma forma que na inclusão de dois ou mais compostos quelantes de fero, a inclusão de dois ou mais agentes anti- fúngicos permite assestar múltiplas condições fúngicas e/ou permite asses- tar diferentes mecanismos fúngicos usados para crescimento, viabilidade ou virulência. A inclusão de compostos agentes antifúngicos pode similarmente ser terapeuticamente benéfica para impedir ainda mais a evasão de patóge- nos fúngicos.

Similarmente, as composições da invenção devem conter geral- mente entre cerca de 1 e 8, particularmente entre cerca de 2 e 7, mais parti- cularmente entre cerca de 3 e 6 ou ainda mais particularmente entre cerca de 4 e 5 agentes antifúngicos. Agentes antifúngicos em número maior ou entre estas faixas também podem ser usados em uma composição da in- venção. Por exemplo, pode ser produzida uma composição da invenção que contém essencialmente qualquer número desejado de diferentes agentes antifúngicos, incluindo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 ou mais. As composições exemplificativas incluem deferasirox e um ou mais entre desoxicolato de anfotericina B, anfotericina B lipossômica, com- plexo lipídico de anfotericina B, Anfotec, posaconasol, voricoazol, fluconasol, itraconasol, acetato de caspofungina ou micafungina. Deferasirox e deferi- prona e um ou mais entre desoxicolato de anfotericina B, anfotericina B li- possômica, complexo lipídico de anfotericina B, Anfotec, posaconasol, vori- coazol, fluconasol, itraconasol, acetato de caspofungina ou micafungina. De forma particularmente útil, as composições incluem, por exemplo, deferasi- rox e/ou deferiprona e um, dois ou três ou mais agentes antifúngicos sele- cionados em cada categoria correspondente aos agentes antifúngicos poliê- nicos, agentes antifúngicos de azóis e agentes antifúngicos de equinocandi- nas. Portanto, a invenção fornece qualquer combinação de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 ou mais compostos quelantes de ferro junto com qualquer combinação de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 ou mais agentes antifún- gicos. Tais composições que contêm múltiplos compostos quelantes de ferro e/ou múltiplos agentes antifúngicos podem ser formuladas como descrito anteriormente.

As composições da invenção podem incluir também um meio farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizada, a expressão "meio farma- ceuticamente aceitável" significa que o meio misturado com um composto quelante de ferro da invenção é de pureza e qualidade suficiente para uso em humanos. Um meio farmaceuticamente aceitável inclui uma formulação que é substancialmente isenta de partículas e organismos contaminantes. Portanto, a expressão pretende incluir um meio que é compatível com um composto quelante de ferro da invenção e é seguro e atóxico quando admi- nistrado a humanos. Tais meios farmaceuticamente aceitáveis são bem co- nhecidos nessas técnicas.

A invenção fornece também um método para tratar ou prevenir uma condição fúngica. O método inclui administrar a um indivíduo que tem, ou é suscetível de ter, uma condição fúngica, uma quantidade terapeutica- mente eficaz de pelo menos um composto de ferro por um tempo suficiente para reduzir a gravidade de uma condição fúngica, onde o composto quelan- te de ferro compreende um não-sideróforo ou não-xenossideróforo em rela- ção à condição fúngica.

A invenção fornece adicionalmente um método para tratar ou prevenir uma condição fúngica, que inclui administrar a um indivíduo que tem, ou é suscetível de ter, uma condição fúngica, uma quantidade terapeu- ticamente eficaz de pelo menos um composto de ferro e pelo menos um a- gente antifúngico por um tempo suficiente para reduzir a gravidade de uma condição fúngica, onde o composto quelante de ferro compreende um não- sideróforo ou não-xenossideróforo em relação à condição fúngica. Os métodos da invenção incluem a terapia com quelação de fer-

ro isoladamente ou a terapia com quelação de ferro usada em conjunto com terapia antifúngica. No primeiro método, uma formulação que inclui pelo me- nos um composto quelante de ferro é administrada. No segundo método, uma formulação que inclui pelo menos um composto quelante de ferro e pelo menos um agente antifúngico é administrada. Tais formulações são selecio- nadas e preparadas como descrito anteriormente com relação às composi- ções da invenção. Portanto, uma composição da invenção pode ser prepa- rada sem pelo menos um agente antifúngico para uso na terapia de quela- ção de fero isoladamente ou ela pode ser preparada com pelo menos um agente antifúngico para uso na terapia de quelação de ferro combinada com a antifúngica. Portanto, os ensinamentos e orientações descritas anterior- mente com relação a uma composição da invenção podem ser similarmente empregadas para a seleção e preparação de uma formulação que contém pelo menos um composto quelante de ferro isoladamente, uma formulação que contém pelo menos um agente antifúngico ou uma formulação que con- tém ambos.

Para uso nos métodos da invenção, o composto quelante de fer- ro em uma formulação que contém pelo menos um composto quelante de ferro, uma primeira ou uma segunda preparação que contém pelo menos um composto quelante de ferro e/ou uma composição da invenção deve ser se- lecionada de modo a incluir um não-sideróforo ou não-xenossideróforo em relação à condição fúngica ou ao agente fúngico causador da condição. O termo "sideróforo", como aqui utilizado, significa um quelante de ferro que facilita a captação de ferro por um organismo. Por exemplo, sob condições de inanição de ferro, muitos fungos sintetizam sideróforos que funcionam na captação de ferro através da ligação e absorção de ferro. Os sideróforos são geralmente compostos de baixo peso molecular (por exem- plo, um peso molecular menor do que cerca de 2.000) e podem apresentar funções de absorção e/ou armazenamento celular de ferro. Os sideróforos são sintetizados pelo organismo utilizador. Em comparação com o termo "quelante de ferro", como aqui utilizado, é utilizado geralmente sem fazer referência à especificidade do organismo ou espécie, o termo "sideróforo", como aqui utilizado, refere-se a um quelante de ferro no contexto ou com relação ao organismo ou espécie produtora ou utilizadora do sideróforo. Consequentemente, embora os sideróforos quelantes de ferro se liguem ao ferro e diminuam os níveis de ferro do ambiente extracelular, porque eles facilitam a absorção e uso de ferro por um patógeno, eles têm valor terapêu- tico diminuído quando usados para terapia por quelação de ferro que asses- ta uma condição causada pelo organismo produtor do sideróforo. A síntese de sideróforos e seu uso podem ser encontrados, por exemplo, em Howard, D.H., Clinicai Microbiology Reviews 12:394-404 (1999). O termo "xenossideróforo", como aqui utilizado, significa um si-

deróforo não produzido pelo fungo ou organismo utilizador. O termo xenos- sideróforo refere-se a um quelante de ferro no contexto ou com relação or- ganismo ou espécie que utiliza o xenossideróforo. Similarmente ao siderófo- ros, os xenossideróforos apresentam valor terapêutico quando usados para terapia por quelação de ferro que assesta uma condição causada por um organismo não-utilizador. A síntese de sideróforos e xenossideróforos e seu uso podem ser encontrados, por exemplo, em Howard, D.H., Clinicai Micro- bioiogy Reviews 12:394-404 (1999).

Portanto, um composto quelante de ferro correspondente a um não-sideróforo ou um não-xenossideróforo com relação a uma condição fún- gica visada ou a um xenossideróforo não utilizado pelo agente fúngico cau- sador da condição fúngica. As formulações para quelação de ferro, as composições, que incluem uma primeira e uma segunda preparações constituintes, e os méto- dos da invenção são aplicáveis para tratar, reduzir a gravidade e curar uma condição fúngica. Uma aplicação particularmente útil das formulações, com- posições e métodos de quelação de ferro da invenção incluem a administra- ção profilática antes do início da condição fúngica.

O termo "tratar" ou "tratamento", como aqui utilizado, significa uma melhora de um sintoma clínico indicativo de uma condição fúngica. A melhora de um sintoma clínico inclui, por exemplo, um decréscimo ou redu- ção em pelo menos um sintoma de uma condição fúngica em um indivíduo tratado em comparação com os níveis pré-tratamento ou em comparação com um indivíduo com uma condição fúngica. O termo "tratar" inclui também a redução na gravidade de uma condição patológica, uma complicação crô- nica ou uma infecção fúngica oportunista que está associada com uma con- dição fúngica. Tais condições patológicas, complicações crônicas ou infec- ções oportunistas estão exemplificadas abaixo com relação à mucormicose. A mucormicose e outras dessas condições patológicas, complicações crôni- cas e infecções oportunistas podem ser encontradas também, por exemplo, em "Merck Manual", 16â Edição, 1992; e Spellberg et ai, Clin. Microbiol. Rev. 18:556-69 (2005).

Os sintomas de uma condição fúngica que podem ser melhora- dos por um método da invenção incluem, por exemplo, febre, calafrios, suo- res noturnos, anorexia, perda de peso, mal-estar, depressão e lesões pul- monares, cutâneas ou outras lesões. Outros sintomas ou manifestações ca- racterísticas incluem, por exemplo, disseminação a partir de um foco primá- rio, apresentações agudas ou subagudas, pneumonia progressiva, fungemia, manifestações de disseminação extrapulmonar, meningite crônica, histo- plasmose disseminada progressiva, como um envolvimento generalizado do sistema reticuloendotelial (fígado, baço, medula óssea) e blastomicose como únicas ou múltiplas lesões cutâneas. O tratamento eficaz de um indivíduo com uma condição fúngica, por exemplo, resultará em uma redução de um ou mais desses sintomas no indivíduo tratado. Inúmeros outros sintomas clínicos de condições fúngicas são bem conhecidos nessas técnicas e tam- bém podem ser usados como uma medida de melhora ou redução na gravi- dade de uma condição fúngica usando os métodos da invenção aqui descri- tos.

O diagnóstico de uma condição fúngica pode ser confirmado iso-

lando os fungos causadores, por exemplo, do esputo, urina, sangue, medula óssea, ou espécimes de tecidos infectados. Por exemplo, as infecções fún- gicas pode ser diagnosticadas por histopatologia com um alto grau de confi- abilidade, baseado em características morfológicas distintivas de fungos in- vasores e/ou por imunoistoquímica, e meios similares seletivos para identifi- car antígenos. A avaliação da atividade da infecção pode se basear também em culturas retiradas de muitos locais diferentes, febre, contagem de leucó- citos, parâmetros clínicos e laboratoriais relacionados a órgãos específicos envolvidos (por exemplo, testes de função hepática), e ensaios imunossoro- lógicos. A significância clínica de culturas de esputo positivas pode ser cor- roborada por confirmação de invasão tecidual. Tal corroboração pode ser particularmente benéfica com organismos comensais tais como Candida al- bicans ou quanto aos organismos prevalentes no ambiente, tais como As- pergillus sp.

O termo "prevenir" ou "prevenção", como aqui utilizado, significa

uma antecipação de um sintoma clínico indicativo de uma condição fúngica. Tal antecipação inclui, por exemplo, a manutenção de indicadores fisiológi- cos normais em um indivíduo em risco de infecção por um fungo ou fungos antes do desenvolvimento de sintomas manifestos da condição ou antes do diagnóstico da condição. Prevenir uma condição fúngica em um indivíduo pretende também incluir a inibição ou detenção do desenvolvimento da con- dição fúngica. Inibir ou deter o desenvolvimento da condição inclui, por e- xemplo, inibir ou deter a ocorrência de indicadores fisiológicos anormais ou sintomas clínicos tais como aqueles descritos acima e/ou bem conhecidos nessas técnicas. Portanto, uma prevenção eficaz de uma condição fúngica incluiria a manutenção da temperatura normal do corpo, peso, estado psico- lógico, bem como falta de lesões ou outras manifestações patológicas des- critas acima em um indivíduo predisposto a uma condição fúngica. Os indiví- duos predispostos a uma condição fúngica incluem, por exemplo, um indiví- duo com AIDS, azotemia, diabetes melito, bronquiectasia, enfisema, TB, Iin- foma, leucemia, ou queimaduras, ou um indivíduo com uma história de sus- cetibilidade a uma condição fúngica. Inibir ou deter o desenvolvimento da condição inclui também, por exemplo, inibir ou deter a progressão de uma ou mais condições patológicas, complicações crônicas ou suscetibilidade a uma infecção oportunista associada com uma condição fúngica.

Os métodos da invenção são úteis para o tratamento e/ou pre- venção de uma ampla série de condições fúngicas. O termo "condição fúngi- ca", como aqui utilizado, significa uma condição aberrante causada por uma infecção por fungo. As infecções fúngicas, ou micoses, de seres humanos e animais incluem, por exemplo, infecções fúngicas superficiais que afetam as camadas externas da pele; infecções fúngicas de membranas mucosas, in- cluindo as regiões bucais (afta), vaginais e anais, tais como aquelas causa- das por Candida albicans, e infecções fúngicas que afetam as camadas mais profundas da pele e órgãos internos, capazes de causar enfermidade séria freqüentemente fatal. As infecções fúngicas são bem conhecidas nessas técnicas e incluem, por exemplo, zigomicose, aspergilose, criptococese, candidíase, histoplasmose, coccidiomicose, paracoccidiomicose, fusariose (hialo-hifomicoses), blastomicose, piniciliose, ou esporotricose. Estas e ou- tras infecções fúngicas podem ser encontradas descritas, por exemplo, em "Merck Manual", 16â Edição, 1992; e Spellberg et ai, Clin. Microbiol. Rev. 18:556-69 (2005). As condições fúngicas exemplificativas descritas acima estão descritas adicionalmente abaixo.

Como aqui utilizado, o termo "zigomicose" significa uma condi- ção fúngica causada por fungos da classe Zygomycetes, compreendendo as ordens Mucorales e Entomophthorales. As Entomophthorales são causas de infecções subcutâneas e mucocutâneas conhecidas como entomoftoromico- ses que afligem amplamente hospedeiros imunocompetentes em países de- senvolvidos.

Como aqui utilizado, o termo "mucormicose" significa uma con- dição fúngica causada por fungos da ordem Mucorales. A mucormicose é uma infecção fúngica fatal que afeta quase uniformemente hospedeiros imu- nocomprometidos em países em desenvolvimento ou industrializados. Os fungos pertencentes à ordem Mucorales estão distribuídos em seis famílias, todas elas causando infecções cutâneas e profundas. As espécies perten- centes à família Mucorales são isoladas mais freqüentemente de pacientes com mucormicose do que qualquer outra família. Dentre as Mucoraceae, Rhizopus oryzae (Rhizopus arrhizus) é uma causa comum de infecção. Ou- tras espécies exemplificativas da família Mucoraceae que causam um es- pectro similar de infecções incluem, por exemplo, Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis, Absidia corybitera, Apophysomyces elegans, espécie Mu- cor, Rhizomucor pusillus e Cunninghamella spp. (família Cunninghamellace- ae). A mucormicose é bem conhecida nessas técnicas e inclui, por exemplo, mucormicose rinocerebral, mucormicose pulmonar, mucormicose gastroin- testinal, mucormicose disseminada, mucormicose óssea, mucormicose do mediastino, mucormicose traqueal, mucormicose renal, mucormicose perito- neal, mucormicose da veia cava superior ou mucormicose de otite externa.

Como aqui utilizado, o termo "candidíase" significa uma condi- ção fúngica causada por fungos do gênero Candida. A candidíase pode o- correr na pele e membranas mucosas da boca, trato respiratório e/ou vagina, bem como invadem a corrente sangüínea, especialmente em indivíduos i- munocomprometidos. A candidíase é conhecida também nessas técnicas como candidose ou monilíase. As espécies exemplificativas do gênero Can- dida incluem, por exemplo, Candida albicans, Candida krusei, Candida tropi- calis, Candida glabrata e Candida parapsilosis.

Como aqui utilizado, o termo "aspergilose" significa o grupo de doenças causadas pelo gênero Aspergillus. Os sintomas incluem, por exem- plo, febre, tosse, dor no peito e/ou falta de ar. Os pacientes com um sistema imunológico enfraquecido ou que sofrem de uma condição pulmonar são particularmente suscetíveis à aspergilose. As formas exemplificativas desta condição fúngica incluem aspergilose alérgica, que afeta asma, fibrose císti- ca e sinusite; aspergilose invasiva aguda, que apresenta incidência aumen- tada em pacientes com imunidade enfraquecida tais como em pacientes com câncer, pacientes que passam por quimioterapia e pacientes com AIDS; as- pergilose invasiva disseminada, que se espalha pelo corpo inteiro, e infecção oportunista por Aspergillus, que se caracteriza por inflamação e lesões do ouvido e outros órgãos. Aspergillus é um gênero com cerca de 200 fungos. As espécies Aspergillus causadoras de doença invasiva incluem, por exem- plo, Aspergillus fumigatus e Aspergillus flavus. As espécies Aspergillus cau- sadoras de doença alérgica incluem, por exemplo, Aspergillus fumigatus e Aspergillus clavatus. Outras espécies infecciosas Aspergillus exemplificati- vas incluem, por exemplo, Aspergillus terreus e Aspergillus nidulans.

Como aqui utilizado, o termo "criptococose" significa uma condi- ção fúngica causada pelo gênero Cryptococcus. A criptococose, também conhecida como doença de Busse-Buschke, se manifesta geralmente como uma infecção sistêmica que pode afetar qualquer órgão do corpo, incluindo, por exemplo, os pulmões, a pele, ou outros ógãos do corpo, mas ocorre mais freqüentemente no sistema nervoso central, tal como no cérebro e me- ninges. A criptococose é uma infecção oportunista para AIDS, embora paci- entes com Iinfoma de Hodgkin ou outros Iinfomas ou sarcoidose ou aqueles que recebem terapia corticosteróide de longo prazo também estão em risco aumentado. Os sintomas incluem, por exemplo, dor no peito, tosse seca, sudorese do abdome, cefaléia, visão embaçada e confusão. As formas e- xemplificativas desta condição fúngica incluem criptococose cutânea tais como aquelas que ocorrem em feridas, critococose pulmonar e meningite criptococócica. A meningite cripotococócica pode resultar da disseminação de Cryptococcus neoformans a partir de uma infecção pulmonar observada ou não-avaliada geralmente em pacientes imunocomprometidos. C. gattii causa infecções em pessoas imunocompetentes. A detecção de antígeno criptocócico (material capsular) por cultura de CSF, esputo e urina fornece um método útil de diagnóstico. Culturas de sangue também podem ser posi- tivas em infecções pesadas.

Como aqui utilizado, o termo "histoplasmose" significa uma con- dição fúngica causada pelo gênero Histoplasma, incluindo a doença infec- ciosa causada pela inalação de esporos de Histoplasma capsulatum. A his- toplasmose é conhecida também nessas técnicas como doença de Darling. A condição pode ser assintomática, mas pode também progredir para pneu- monia aguda ou um enfermidade semelhante à influenza que afeta princi- palmente os pulmões. A histoplasmose pode ser disseminada para outros órgãos e sistemas no corpo. Da mesma maneira que com outras formas dis- seminadas de condições fúngicas, esta histoplasmose disseminada pode ser fatal. Os sintomas podem ocorrer dentro de 3 a 17 dias depois da exposição. Entretanto, nas formas disseminadas, pode ser comum que os indivíduos infectados não apresentem quaisquer efeitos aparentes. A doença respirató- ria aguda pode ser caracterizada por sintomas respiratórios, uma sensação de enfermo, febre, dores no peito, e uma tosse seca improdutiva. Padrões distintos podem ser observados também em uma radiografia torácica. A do- ença pulmonar crônica se assemelha à tuberculose e pode piorar no decor- rer de messes ou anos.

Como aqui utilizado, o termo "coccidiomicose" significa uma condição fúngica causada pelo gênero Coccidioides, estando incluída no significado do termo a doença respiratória infecciosa causada por Coccidioi- des immitis ou C. posadasii, particularmente através da inalação de esporos, e que se caracteriza por febre e vários sintomas respiratórios. A coccidiomi- cose é conhecida também nessas técnicas coccidioidomicose e febre-do- vale. A coccidiomicose sistêica pode se disseminar do trato respiratório para, por exemplo, a pele, ossos, e sistema nervoso central. As manifestações da condição vão desde ausência completa de sintomas até infecção sistêmica e morte. Por exemplo, a infecção sintomática (cerca de 40% dos casos) pode- se apresentar como enfermidade semelhante à influenza com febre, tosse, cefaléias, exantema, e mialgia (dor muscular). Alguns pacientes podem não se recuperar e desenvolver infecção pulmonar crônica ou infecção dissemi- nada muito espalhada (afetando as meninges, tecidos moles, articulações, e ossos). Uma doença pulmonar grave pode se desenvolver, por exemplo, em pessoas infectadas com HIV e outras pessoas imunocomprometidas.

Como aqui utilizado, o termo "paracoccidiomicose" significa uma condição fúngica causada pelo gênero Paracoccidioides, incluindo, por e- xemplo, uma micose crônica causada por Paracoccidioides brasiliensis. A paracoccidiomicose se caracteriza por lesões primárias dos pulmões com disseminação para muitos órgãos internos, por granulomas ulcerativos conspícuos das membranas mucosas das bochechas e nariz com extensões para a pele, e por Iinfagite generalizada. A paracoccidiomicose é conhecida também nessas técnicas como paracoccidioidomicose, doença de Almeida, doença de Lutz-Splendore-Almeida, granuloma paracoccidióide e blastomi- cose sul-americana.

Como aqui utilizado, o termo "fusariose" ou "hialo-hifomicoses"

significa uma condição fúngica causada pelo gênero Fusarium. As espícies Fusarium causadoras da condição incluem, por exemplo, F. solani, F. oxys- porum e F. moniliforme. As infecções incluem ceratite, onicomicose e ocasi- onalmente peritonite e celulite. Os fatores de risco para fusariose dissemina- da incluem imunossupressão grave (neutropenia, linfopenia, doença de en- xerto versus hospedeiro, corticosteróides), colonização e dano tecidual. Den- tre pacientes imunocompetentes, degradação tecidual (causada por trauma- tismo, queimaduras graves ou corpo estranho) é o fator de risco para fusari- ose. A apresentação clínica inclui febre refratária, lesões cutâneas, e infec- ções sinopulmonares. As lesões cutâneas podem levar a diagnóstico em muitos pacientes e precedem fungemia em aproximadamente 5 dias. A fusa- riose disseminada pode ser diagnostica, por exemplo, por culturas de san- gue e outros métodos bem conhecidos descritos acima e abaixo.

Como aqui utilizado, o termo "blastomicose" significa uma condi- ção fúngica causada pelo gênero Blastomycete, originando-se geralmente como uma infecção respiratória, e usualmente se espalhando para os pul- mões, ossos, e pele. A blastomicose se caracteriza por múltiplas lesões in- flamatórias da pele, membranas mucosas, ou órgãos internos. Blastomyces dermatitidis é uma espécie causadora prevalente. Os sintomas da blastomi- cose incluem, por exemplo, uma enfermidade semelhante à gripe com febre, calafrios, mialgia, cefaléia, e uma tosse improdutiva; uma enfermidade agu- da que se assemelha a pneumonia bacteriana, com sintomas de febre alta, calafrios, uma tosse produtiva, e dor torácica pleurítica; uma enfermidade crônica que mimetiza tuberculose ou câncer pulmonar, com sintomas de fe- bre de baixo grau, uma tosse produtiva, sudorese noturna, e perda de peso; uma doença rápida, progressiva e grave que se manifesta como ARDS, com febre, respiração curta, taquipnéia, hipoxemia, e infiltrados pulmonares difu- sos; lesões da pele; lesões ósseas líticas; prostatite e/ou envolvimento larín- geo causador de rouquidão.

Como aqui utilizado, o termo "peniciliose" significa uma condição fúngica causada pelo gênero Penicillium. Uma espécie exemplificativa é Pe- nicillium marneffei, que é uma causa prevalente de infecções fúngicas opor- tunistas em indivíduos imunocomprometidos. O diagnostica pode ser feito por identificação dos fungos a partir de espécimes clínicos. As biopsias de lesões da pele, nodos linfáticos, e medula óssea podem demonstrar a pre- sença de organismos em histopatologia. Os sintomas incluem, por exemplo, febre, lesões da pele, anemia, Iinfoadenopatia generalizada, e hematomega- lia.

Como aqui utilizado, o termo "esporotricose" significa uma con- dição fúngica causada pelo gênero Sporothrix, incluindo a espécie S. s- chenckii. A condição se manifesta como uma infecção crônica caracterizada por nódulos ou úlceras nos nodos linfáticos e pele.

A esporotricose pode ser espalhada para o sangue e outras á- reas, incluindo, por exemplo, infecção das articulações, pulmões, olhos, uro- genitais e do sistema nervoso central. Geralmente, a esporotricose dissemi- nada ocorre em indivíduos imunocomprometidos tais como pacientes com AIDS, câncer, pacientes que passam por quimioterapia, e recebedores de transplantes em terapia imunossupressora.

Como aqui utilizado, os termos "quantidade eficaz" ou "quanti- dade terapeuticamente eficaz" significam uma quantidade de um composto quelante de ferro, um agente antifúngico ou de uma composto quelante de ferro e também um agente antifúngico da invenção, necessária para efetuar um decréscimo no grau, quantidade ou taxa de disseminação de uma condi- ção fúngica, quando administrada a um indivíduo. Portanto, uma quantidade eficaz quando usada fazendo referência a um composto quelante de ferro significa uma quantidade do composto quelante de fero suficiente para me- lhorar pelo menos um sintoma associado com uma condição fúngica visada.

A dosagem de um composto quelante de ferro, de um agente antifúngico ou de um composto quelante de ferro e também de um agente antifúngicos da invenção, necessária para ser terapeuticamente eficaz de- penderá, por exemplo, da condição fúngica a ser tratada, a afinidade do composto quelante de ferro por ferro, o nível de abundância e concentração de ferro, bem como o peso e condição do indivíduo, e de terapias anteriores ou concomitantes. A quantidade apropriada para ser considerada como sen- do uma dose eficaz para uma aplicação específica do método pode ser de- terminada pelos versados nessas técnicas, usando as orientações aqui for- necidas. Por exemplo, a quantidade pode ser extrapolada a partir de ensaios in vitro ou in vivo, como descrito abaixo. Os versados nessas técnicas de- vem reconhecer que a condição do paciente precisa ser monitorada durante o curso inteiro da terapia e que a quantidade da composição que é adminis- trada pode ser ajustada de acordo com a resposta à terapia.

As quantidades eficazes exemplificativas de compostos quelan- tes de ferro incluem, por exemplo, uma faixa de concentração entre cerca de 0,3 e 3,0 μg/mL, mas podem incluir concentrações tão baixas quanto 0,01 μg/mL ou mais baixas, e tão altas quanto 10 μg/mL ou mais altas. As quanti- dades de um agente antifúngico a serem administradas são bem conhecidas nessas técnicas e estão aqui incluídas dentro do significado do termo "quan- tidade eficaz".

Em investigações pré-clínicas de deferasirox, por exemplo, virtu-

almente nenhuma toxicidade foi observada e doses de até 400 mg/kg/dia em sagüis sobrecarregados com ferro (Nick et ai, Adv. Exp. Med. Biol. 509:185- 202 (2002)). Entretanto, uma toxicidade grave foi observada depois da ad- ministração crônica a sagüis não-sobrecarregados com ferro em doses de 80 mg/kg, confirmando que deferasirox é menos bem tolerado em hospedei- ros não-sobrecarregados com ferro (ibidem). Contudo, mesmo em sagüis não-sobrecarregados com ferro, nenhuma toxicidade foi observada depois de 39 semanas de tratamento com até 40 mg/kg/dia, e durante tratamento subagudo (4 semanas), doses de até 65 mg/kg/dia foram bem toleradas com nenhum efeito adverso. Em investigações clínicas de pacientes sobrecarre- gados com ferro (Nisbet-Brown et ai, Lancet 361:1597-1602 (2003); Gala- nello et ai, J. Clin. Pharmacol. 43:565-572 (2003); Cappellini et ai, Blood 107:3455-3462 (2006), deferasirox foi muito bem tolerado em doses de até 40 mg/kg/dia por até 12 dias, e em dosagem crônica, durante meses a anos, a até 30 mg/kg/dia.

Geralmente, um composto quelante de ferro deve ser incluído em uma formulação para terapia com quelação de ferro, uma primeira ou uma segunda formulação constituinte e/ou uma composição da invenção em uma concentração entre cerca de 0,01 e 10 μg/mL) cerca de 0,1-8 μg/mL, cerca de 0,2-6 μςΛηΙ-, particularmente entre cerca de 0,3-3,0 μ^/ιη1_, mais particularmente entre cerca de 0,6-2,0 μg/mL, ainda mais particularmente entre cerca de 0,8-1,0 μg/mL ou cerca de 0,9 μ^/ιτιΙ_. As concentrações e/ou quantidades do composto quelante de ferro menores, maiores ou entre estas faixas também podem ser usadas em uma formulação para terapia com que- lação de ferro, uma primeira ou segunda formulação constituinte e/ou uma composição da invenção. Por exemplo, um ou mais compostos quelantes de ferro podem ser incluídos em uma formulação ou composição que constitu- em menos do que cerca de 0,1 μg/mL. Similarmente, uma formulação ou composição pode conter uma concentração de um ou mais compostos que- lantes de ferro maior do que cerca de 10 μg/mL, particularmente quando formulada para estocagem. Consequentemente, pode ser produzida uma formulação ou composição útil nos métodos da invenção, que contém es- sencialmente qualquer concentração ou quantidade desejada de um ou mais compostos quelantes de ferro, incluindo, por exemplo, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5,6,7,8,9,10,11,12 μg/mL ou mais. As quantidades eficazes exemplificativas de agentes antifúngi-

cos incluem, por exemplo, aquelas exemplificadas abaixo com relação a a- gentes antifúngicos poliênicos. Por exemplo, o desoxicolato de anfotericina B é administrado geralmente, por exemplo, em uma dose menor do que cerca de 10 mg/kg de peso corporal e pode incluir taxas de cerca de 0,25-1,0 mg/kg/dia para administração intravenosa. A anfotericina B lipossômica (L- AmB) é administrada, por exemplo, em doses de 1-5 mg/kg. A anfotericina B lipossômica pode ser administrada também em doses tão altas quanto 15 mg/kg/dia especialmente em doença cerebral. O complexo lipídico de anfote- ricina B (ABLC) é administrado geralmente em uma dose de 5 mg/kg, mas pode ficar na faixa entre 0,5-15 mg/kg. Anfotec é administrado geralmente em doses únicas de cerca de 50-100 mg. Similarmente, para a terapia com- binada que usa um composto quelante de ferro e um agente antifúngico, as quantidades acima podem ser administradas em conjunto ou a quantidade do composto e/ou do agente pode ser modulada para cima ou para baixo. As quantidades eficazes de agentes antifúngicos de azóis e agentes antifúngi- cos de equinocandinas são similarmente bem conhecidas pelos versados nessas técnicas, e incluem geralmente dosagens dentro das faixas acima.

Dados os ensinamentos e orientações aqui fornecidas, os ver- sados nessas técnicas devem entender que as quantidades eficazes exem- plificadas acima podem ser moduladas com relação, por exemplo, ao tipo e quantidade do outro ingrediente ativo. Por exemplo, caso as dosagens do pelo menos um composto quelante de ferro estejam na faixa alta exemplifi- cada acima, caso desejado, pode-se diminuir a quantidade do um ou mais do pelo menos um agente antifúngico, e ao mesmo tempo, obter uma quan- tidade eficaz. Similarmente, caso as dosagens de pelo menos um agente antifúngico estejam na faixa alta ou mais alta do que aquelas exemplificadas acima, caso desejado, pode-se diminuir a quantidade de um ou mais de pelo menos um composto quelante de ferro. As dosagens dos dois ou mais com- postos quelantes de ferro e/ou as dosagens de dois ou mais de pelo menos um agente antifúngico também podem ser moduladas uma em relação à ou- tra. Todas outras modulações de tais quantidades eficazes combinadas po- dem ser utilizadas no método da invenção.

Deve-se entender que as modificações que não afetam substan- cialmente a atividade das várias modalidades desta invenção também estão incluídas dentro da definição da invenção aqui fornecida. Consequentemen- te, os exemplos que se seguem pretendem ilustrar, mas não limitar a pre- sente invenção. Exemplo I

Terapia por Quelação de Ferro para a Redução da Gravidade de

Doenças Fúngicas

Este exemplo descreve estudos preliminares que demonstram que deferiprona e Exjade® podem reduzir a patogênese de mucormicose.

Modelos animais demonstraram que a administração de defero- xamina ou ferro livre piora a sobrevida de animais infectados com Rhizopus, mas até um grau menor do que Candida albicans, ressaltando a necessida- de de ferro para a patogenecidade de Rhizopus (Abe et ai, Mycopathologia 110:87-91 (1990); Boelaert et ai., (1993), supra; Boelaert et ai., (1994), su- pra; van Cutsem e Boelaert, Kidney International 36:1061 -68 (1989)). Adicio- nalmente, estudos in vitro de captação de ferro radiomarcado a partir de de- feroxamina no soro indicou que Rhizopus acunulava quantidades 8 vezes e 40 vezes maior de ferro do que Aspergillus fumigatus e C. albicans, respecti- vamente (Boelaert et ai, (1993), supra). Esta captação maior de ferro por Rhizopus está linearmente correlacionada com seu crescimento no soro (Boelaert et ai, (1993), supra). Este crescimento aumentado no soro pode explicar a afinidade especial de Zygomycetes para penetrar diretamente e crescer através de vasos sangüíneos, o que resulta na propensão para trombose e necrose tecidual durante a doença (Edwards, (1989), supra; I- brahim et ai, (2003), supra; Ventura et ai, supra). Como descrito anteriormente, os pacientes com cetoacidose di-

abética também estão em risco de desenvolver mucormicose rinocerebral. Estes pacientes têm também níveis elevados de ferro sérico disponível, pos- sivelmente devido à liberação de ferro de proteínas Iigantes na presença de acidose (Artis et ai, supra). Os soros coletados de pacientes com cetoacido- se diabética sustentaram o crescimento de R. oryzae na presença de pH ácido (7,3-6,88), mas não na presença de pH alcalino (7,78-8,38). Os soros que não sustentaram o crescimento de R. orysae em pH ácido demonstra- ram ter menos ferro disponível do que os soros que sustentaram o cresci- mento fúngico. Além disso, adicionar ferro exógeno aos soros permitiu que R. oryzae crescesse profusamente em condições ácidas, mas não em pH > 7,4. Finalmente, condições acídóticas simuladas diminuíram a capacidade de ligação de ferro dos soros coletados de voluntários normais, sugerindo que a acidose rompe temporariamente a capacidade de a transferrina se ligar ao ferro. Portanto, a maior suscetibilidade à mucormicose de pacientes com cetoacidose diabética deve-se possivelmente, pelo menos em parte, a uma elevação no ferro sérico disponível durante a cetoacidose diabética. O papel do metabolismo do ferro na patogênese de mucormico-

se permite a possibilidade de utilizar quelantes de ferro eficazes para terapia antifúngica, incluindo como uma terapia antifúngica adjuntiva. Em contraste com deferoxamina, outros quelantes de ferro não permitiram que o organis- mo captasse ferro, e não sustenta seu crescimento in vitro na presença de ferro (vide, por exemplo, Boelaert et a!., (1994), supra). Além disso, enquan- to que a deferoxamina piorou significativamente a infecção por R. oryzae disseminada em porquinhos-da-índia, um dos outros quelantes não tiveram qualquer impacto sobre a infecção in vivo e o outro quelante mais do que dobrou o tempo médio de sobrevida de porquinhos-da-índia infectados Ta- bela 1).

Tabela 1

Efeitos de Quelantes de Ferro sobre a Sobrevida de porquinhos-da-índia Infectados com R. oryzae__

Tratamento Tempo Médio de Sobrevida (± desvio-padrão) (Dias) Solução salina 7,8 ±1,1 Deferoxamina 4,8 ±1,1 Deferiprona 16,2 ±4,0 CP94 8,7 ±1,0 *p < 0,05 versus controle com solução salina

Os dados in vitro e in vivo aqui descritos indicam que a deferi-

prona pode ser usada para tratar eficazmente infecções de mucormicose. A Tabela 1 indica os resultados de um estudo preliminar no qual a deíeriprona aumenta significativamente o tempo médio de sobrevida de animais infecta- dos. Estes estudos preliminares indicaram ainda que a deferiprona era alta- mente ativa in vitro contra R. oryzae, indicando o efeito estático em 24 horas, mas um efeito exterminador em 48 horas de incubação (concentração inibití- ra mínima CIM) e concentração fungicida mínima (CFM) de 6,25 μg/mL para ambas em 48 h). Em camundongos DKA infectados, a anfotericina B Iipos- sômica (LAmB), que é uma terapia genérica para mucormicose, ou a deferi- prona Def) aumentaram a sobrevida de 28 dias em comparação com place- bo (52% de sobrevida para LAmB versus 30% para Def versus 0% para pla- cebo, ρ < 0,003 pelo teste Log Rank para LAmB ou Def versus placebo; ρ = 0,15 para LAmB versus Def). A eficácia de Def foi anulada pela administra- ção de FeCI3 aos camundongos, confirmando que o mecanismo de proteção mediada por Def é quelação de ferro (figura 1). Este último agente, a deferi- prona, é aprovado para uso clínico como um quelante de ferro na Europa e índia, e está disponível em base de uso restrito nos Estados Unidos.

Exjade® (Novartis), que é outro quelante de ferro, foi aprovado para uso clínico em pacientes com sobrecarga de ferro nos Estados Unidos. Este fármaco foi testado contra R. oryzae in vitro e em modelos animais u- sando um modelo de camundongo cettoacidótico diabético. Os camundon- gos infectados com uma dose letal de R. oryzae e tratados com Exjade® a 1, 3, ou 10 mg/kg bis in diem sobreviveram por mais tempo do que os camun- dongos tratados com placebo (a sobrevivência em 28 dias foi 0% para pla- cebo versus 29% de sobrevivência para 1 mg/kg de Exjade® (p = 0,03), ver- sus 40% de sobrevivência para camundongos tratados com 3 mg/kg de Ex- jade® (p = 0,049) versus 57% de sobrevivência de camundongos tratados com 10 mg/kg de Exjade® pelo teste de Log Rank) (figura 2). Estes estudos demonstram a eficácia de usar Exjade® para tratar mucormicose. Estes es- tudos indicam adicionalmente que os quelantes de ferro acima podem ser aplicáveis para o tratamento de outras infecções fúngicas, incluindo mucor- micose em indivíduos neutropênicos, bem como outras infecções tais como candidíase e aspergilose disseminadas. Exemplo Il

Terapia por Quelação de Ferro para o Tratamento de Mucormicose

Este exemplo ilustra uma comparação da eficácia de deferiprona com anfotericina B lipossômica (LAmB) para tratar mucormicose em camun- dongos diabéticos cetoacidóticos (DKA) ou para a profilaxia contra mucormi- cose em camundongos neutropênicos.

R. oryzae é uma causa comum de mucormicose (Ibrahim et al., (2003), supra). Os pacientes com ferro sérico elevado disponível, tais como diabéticos em cetoacidose, estão em alto risco de desenvolver infecções de mucormicose (Artis et al., supra). Adicionalmente, a terapia por quelação de ferro com deferoxamina predispõe os pacientes a estas infecções. A defero- xamina atua como um xenossideróforo para suprir ferro anteriormente indis- ponível para o fungo (Boelaert et al., (1993), supra). Portanto, o uso de um quelante de ferro, que não pode ser utilizado pelo fungo para seqüestrar fer- ro do hospedeiro, foi avaliado quanto à eficácia contra mucormicose. Def é um quelante de ferro que não pode ser utilizado por Rhizopus para seqües- trar ferro (Boelaert et ai, (1994), supra).

Inicialmente, a atividade in vitro de deferiprona contra R. oryzae foi avaliada neste estudo. Resumidamente, R. oryzae 99-880 foi isolado a partir de um abscesso cerebral de um paciente diabético. O organismo foi desenvolvido sobre ágar de dextrose de batata (PDA) por 3 dias a 37 °C. Em alguns experimentos, R. oryzae foi privado de ferro pelo crescimento sobre PDA na presença de ácido ascórbico 1 mM e ferrozina. Os esporangióspo- ros foram coletados em PBS isento de endotoxinas, contendo 0,01% de Tween 80, lavados com PBS e depois contados como hematocitômetro para preparar os inóculos finais. Para os testes de suscetibilidade, a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração fungicida mínima (CFM) foram de- terminadas para Def e deferoxamina pelo método de Espinel-Ingroff (J. Clin. Microbiol. 39:954 (2001)).

Os resultados estão indicados na Tabela 2 abaixo. A deferiprona foi estática contra R. oryzae em 24 h (CIM e CFM = 3,12 e 100 μg/mL, res- pectivamente), mas demonstrou capacidade exterminadora em 48 horas de incubação (CIM e CFM = 6,25 μς/Γηί). Em contraste, a deferoxamina, que reconhecidamente supre ferro para R. oryzae, não inibiu o crescimento de R. oryzae (CIM e CFM > 100 μς/ηπί. depois de 24 ou 48 h), e de fato, por inspe- ção visual, o crescimento em poços que contêm deferoxamina foi maior do que nos poços de crescimento do controle (não contendo quaisquer quelan- tes de ferro).

Tabela 2

CIM90 e CFM de Def e Deferoxamina contra R. oryzae

Os valores estão expressos em mg/mL

Tempo (h) Deferiprona Deferoxamina CIM CFM CIM CFM 24 3,12 100 > 100 > 100 48 6,25 6,25 > 100 > 100

Confirmada sua atividade in vitro contra R. oryzae, usou-se o

presente modelo de camundongos DKA para avaliar o papel de deferiprona em tratar infecção disseminada por R. oryzae in vivo. Resumidamente, para infecção in vivo, camundongos BALB/c machos (> 20 g) foram tornados dia- béticos com uma única injeção intraperitoneal de 210 mg/kg de estreptozo- tocina em 0,2 ml_ de tampão de citrato 10 dias antes da inoculação fúngica. A glicosúria e cetonúria foram confirmadas em todos camundongos 7 dias depois do tratamento com estreptozotocina. Os camundongos foram infecta- dos através da veia da cauda com os inóculos apropriados de R. oryzae. Para confirmar os inóculos, diluições foram riscadas sobre placas de PDA e as colônias foram contadas depois de um período de incubação de 24 h à temperatura ambiente. O resultado da eficácia primária foi tempo para mor- rer. Como resultado secundário, a carga fúngica cerebral (órgão-alvo primá- rio) foi determinada por homogeneização rolando uma pipeta sobre os ór- gãos colocados em bolsas Whirl-Pak (Nasço, Fort Atkinson, Wl), contendo 2 mL de solução salina. O homogeneizado foi diluído serialmente em solução salina a 0,85% e depois cultivado quantitativamente sobre PDA. Os valores foram expressos como Iogi0 de cfu/g de tecido. Todos os procedimentos que envolveram camundongos foram aprovados pelo comitê de uso e cuidado de animais institucionais, seguindo as orientações do National Institutes of Heal- th para alojamento e cuidado de animais.

Quanto aos fármacos e esquemas de terapia, LAmB diluída em solução aquosa de dextrose a 5% foi obtida na Gilead Sciences e foi admi- nistrada a 15 mg/kg q.d. (uma vez ao dia) por via intravenosa através da veia da cauda. A deferiprona (Apotex Research, Inc.) foi dissolvida em água isen- ta de ferro e administrada por via intraperitoneal a 50, 100 ou 200 mg/kg q.d. ou q.o.d. (a cada dois dias). O tratamento foi iniciado 24 h depois da infec- ção e continuou por um total de 4 doses. Os grupos de controle foram trata- dos com o diluente, solução aquosa de dextrose a 5%.

Em alguns experimentos, uma dose saturadora de ferro livre foi administrada com deferiprona, em uma tentativa de reverter a eficácia da quelação de ferro. A deferiprona reconhecidamente forma complexos mole- culares com ferro férrico (FeCI3, peso molecular 162,22 g/mol) e deferiprona (peso molecular 139 g/mol), uma dose de 60 mg/kg de FeCI3 foi calculada para resultar em um excesso significativo de Fe3+ versus uma dose de 100 mg/kg de deferiprona dada a um camundongo de 18 g: moles de Fe3+ = (0,1 g/kg χ 0,018 kg (peso do camundongo)/139 g/mol) = 6,5 χ 10"6 mol versus moles de deferiprona = (0,1 g/kg χ 0,018 kg (peso do camundongo)/139 g/mol) = 1,3 χ 10"5 mol; razão = 1:2 moles de Fe3+ para deferiprona, que é mais do que o necessário para atingir uma razão saturadora 1:3.

A análise estatística foi realizada usando o teste de Iog rank não- paramétrico para determinar as diferenças nos tempos de sobrevida dos camundongos. As diferenças nas cargas fúngicas dos tecidos nos órgãos infectados foram comparadas pelo teste de Steel não-paramétrico para múl- tiplas comparações. O valores de ρ < 0,05 foram considerados significantes.

Inicialmente, foi realizada uma resposta à dose, usando doses baseadas em observações não-publicadas do fabricante (50, 100 ou 200 mg/kg de deferiprona administrada q.d. ou q.o.d.). Os camundongos foram infectados com 4,3 χ 103 esporos de R. oryzae e o tratamento com deferi- prona foi iniciado 24 h depois da infecção e continuou por um total de quatro doses. Os resultados estão ilustrados nas figuras 3 e 1, que indicam que a deferiprona protegeu os camundongos DKA contra infecção por R. oryzae. Uma dose de 100 mg/kg q.o.d. de deferiprona melhorou a sobrevida de ca- mundongos DKA em comparação com placebo (p = 0,027, figura 3). Doses mais altas que incluíam 100 mg/kg q.d. ou 200 mg/kg q.d. ou q.o.d., não me- Ihoraram a sobrevida, nem o fizeram as doses de 50 mg/kg q.d. ou q.o.d.

Como descrito anteriormente no Exemplo I, a eficácia de deferi- prona foi comparada também com um tratamento genérico de mucormicose, doose alta de LAmB. Uma dose de 15 mg/kg de LAmB administrada q.d. foi escolhida porque demonstrou-se que esta dose é mais protetora no presente modelo de camundongos DKA do que 1 mg/kg de desoxicolato de anfoterici- na B. Além disso, para confirmar que o mecanismo de proteção de deferi- prona era quelação de ferro, a eficácia de deferiprona mais uma dose satu- radora (60 mg/kg) de ferro livre na forma de FeCI3 também foi avaliada. Fe- Cl3 foi administrado por via intravenosa cada vez que a deferiprona foi dada aos animais.

LAmB ou deferiprona a 100 mg/kg q.o.d. melhorou a sobrevida em 28 dias em comparação com placebo (figura 1, ρ < 0,003 pelo teste de Log Rank para LAmB ou deferiprona versus placebo). Não houve qualquer diferença estatística na sobrevida de camundongos tratados com LAmB ver- sus camundongos tratados com deferiprona (p = 0,15). A eficácia de deferi- prona foi completamente anulada pela administração de cloreto férrico (figu- ra 1).

Em estudos adicionais, o tratamento de mucormicose experi- mental com uma combinação de Def e LAmB também foi avaliado. Resumi- damente, camundongos (n = 11 no caso de infectados não-tratados e trata- dos com Def, e η = 6 para LAmB e Def + LAmb) foram infectados com R. oryzae e então tratados 24 h depois com Def, LAmB, ou uma combinação de ambos fármacos por um total de 4 doses. Os resultados estão ilustrados na figura 4 e indicam a eficácia intensificada usando uma combinação de am- bos tratamentos (*, ρ < 0,005 em comparação com camundongos infectados não tratados).

Similarmente, a sobrevida de camundongos neutropênicos infec- tados com R. oryzae e tratados profilaticamente com Def1 LAmB1 ou ambos também foi avaliada. Os camundongos (n = 9) foram tratados no Dia 1 com Def q.o.d., LAmB q.d., ou ambos por um total de 4 doses. Estes resultados estão ilustrados na figura 5 e também indicam a eficácia intensificada usan- do uma combinação de um tratamento antifúngico combinado com quelação de ferro (* ρ < 0,05 para LAmB ou LAmB + Def versus infectados não trata- dos). Por exemplo, Def profilaticamente resultou em uma sobrevivência de 22% versus 0% de sobrevivência em camundongos tratados com placebo (p > 0,05); LAmB e também LAmB + Def resultaram em 100% de sobrevivência (p < 0,05 versus placebo para ambos).

Na qualidade de um marcador adicional da eficácia, o impacto da terapia com deferiprona sobre a carga fúngica do cérebro também foi avaliado, pois o cérebro é o órgão-alvo primário neste modelo animal. Os camundongos foram infectados com 3,8 χ 103 esporos e depois tratados com duas doses de LAmB (q.d.) ou deferiprona (q.o.d.). Nos estudos acima, os camundongos do controle começaram a morrer antes de a segunda dose ser administrada. Para permitir testar pelo menos duas doses de deferiprona a cada dois dias antes de determinar a carga fúngica do tecido, neste estudo a deferiprona foi administrada 30 min e 48 h depois da infecção, enquanto que LAmB foi dada 24 e 48 h depois da infecção. Os cérebros foram colhi- dos aproximadamente 54 h depois da infecção. Os resultados estão ilustra- dos na figura 6 e indicam que ambos fármacos reduziram a carga fúngica do cérebro em comparação com placebo (p < 0,036).

Os resultados acima indicam que a terapia de quelação de ferro com Def é eficaz para tratar mucormicose murina experimental e pode ter também uma eficácia profilática, inclusive no caso neutropênico. Particular- mente, Def inibiu o crescimento de R. oryzae in vitro, enquanto que a defe- roxamina não o fez. Def tem eficácia considerável para tratar mucormicose no modelo DKA e esta eficácia é comparável à terapia de alta dose com LAmB. A eficácia de Def deve-se possivelmente à sua capacidade de quelar ferro, pois a administração de ferro livre reverteu sua proteção. A profilaxia com Def não pareceu antagonizar o efeito protetor de LAmB no modelo mu- rino neutropênico de mucormicose. Exemplo Ill

Administração de Deferasirox para o Tratamento Terapêutico de Mucormicose

Este exemplo ilustra o uso de deferasirox, um agente quelante de ferro, como uma terapia salvadora para mucormicose rinocerebral.

Deferasorix (Exjade®) é um quelante de ferro inusitado de pri- meira classe disponível para via oral, aprovado recentemente pela United States Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento de sobrecarga de ferro em anemias dependentes de transfusão. Este estudo descreve o uso de deferasirox como terapia salvadora para um paciente com mucormi- cose rinocerebral para o qual a terapia antifúngica convencional máxima não funcionou.

Um homem de 40 anos de idade com cetoacidose diabética foi encaminhado para o atendimento de urgência de um hospital público com poliúria, polidipsia, dor retrobulbar esquerda, e uma paralisia de nervo crani- ano (CN) esquerdo VI. Uma varredura por tomografia computadorizada (TC) da cabeça indicou sinusite esfenóide e etmóide esquerda. O paciente pro- grediu para oftalmoplegia esquerda completa nas primeiras 24 horas. Mu- cormicose rinocerebral era suspeita, e o paciente começou a ser medicado com complexo lipídico de anfotericina B (ABLC) a 5 mg/kg/dia, junto com agentes antibacterianos empíricos, para tratamento da sinusite. No Dia 2 de internação no hospital, ele foi submetido a uma exploração esfenoetmóide endoscópica. Nenhum tecido ou escara necrótica foi encontrada, e múltiplas biópsias apresentaram inflamação inespecífica. Uma cultura fúngica deu ne- gativa e corantes especiais não descreveram quaisquer organismos. A cultu- ra bacteriana desenvolveu apenas a rara Enterobacter aerogenes.

Durantes os doze dias seguintes, o paciente desenvolveu ce- gueira e piora da proptose no olho esquerdo. Ele continuou o tratamento com ABLC e nenhuma cirurgia adicional foi realizada. Uma reprodução de imagens por ressonância magnética (MRI) serial da órbita e cérebro revelou progressão de pansinusite no lado esquerdo e espessamento e aumento dos músculos extra-oculares esquerdos. O paciente foi transferido para a instituição da requerente para controle adicional no Dia 14 de hospitalização. Imediatamente depois da chegada, ele foi submetido a uma exenteração orbital esquerda com enucle- ação e desbridamento extensivo dos seios e ressecção. As descobertas in- tra-operatórias incluíram um globo isquêmico com necrose circundante ex- tensiva dos músculos extra-oculares. Os espécimes patológicos apresenta- ram evidência de Mucorales (figura 7); as culturas fúngicas foram negativas. O paciente iniciou tratamento com anfotericina B lipossômica (LAmB) a 15 mg/kg/dia e caspofungina a 70 mg/kg/dia (baseado nos dados sobre camun- dongos publicados que demonstraram sinergia polieno/equinocardina). Uma CT da cabeça realizada dois dias depois da exenteração orbital indicou trombose do seio cavernoso esquerdo; esta descoberta foi confirmada no acompanhamento por MRI.

Apesar da ausência de novas descobertas neurológicas, uma MRI no dia 36 de hospitalização indicou progressão da trombose do seio cavernoso com lento fluxo na carótida interna esquerda e novo aumento de CN V consistente com mucormicose progressiva. A terapia antifúngica foi continuada. No dia 71 de hospitalização, uma MRI do cérebro indicou novo aumento na cisterna supra-selar, pela primeira vez, o desenvolvimento de uma lesão do tronco cerebral na ponte com edema circundante. Dada a lo- calização da lesão no aspecto superficial da ponte, uma dose intracisternal de anfotericina foi administrada, mas o paciente recusou doses adicionais. O paciente permaneceu clinicamente e neurologicamente inalterado. Devido à estabilização da reprodução de imagens subsequente, ele recebeu alta no dia 86 de hospitalização para continuar a monoterapia ambulatorial com LAmB três vezes por semana.

A doença dele permaneceu clinicamente e neurologicamente estável por vários meses. Por causa da piora da insuficiência renal (Cr 3,5- 4,0, a partir de um valor basal de 0,8) dez semanas depois da alta, a dose de LAmB foi reduzida para 10 mg/kg duas vezes por semana, e depois redu- zida para uma vez por semana durante quatro meses depois da alta. Um mês depois, uma repetição da MRI indicou novo aumento com edema cir- cundante no pedúnculo cerebelar mediano esquerdo e ângulo cerebelopon- tino esquerdo consistente com doença progressiva.

Baseado nos dados do quelante de ferro experimental, deferi- prona, bem como em observações não publicadas de deferasirox em ca- mundongos, deferasirox foi administrado em uma dose de 1.000 mg peroral (pela boca) diariamente por sete dias. LAmB foi continuada. No último dia do tratamento com deferasirox, o paciente desenvolveu uma erupção maculo- papular confluente, eritematosa ligeiramente prurítica sobre o tronco e ex- tremidades, consistente com uma provável exantema medicamentoso. O prurido foi controlado com defenidramina. Nenhum episódio adverso foi no- tado. Uma repetição da MRI do cérebro uma semana depois do tratamento com deferasirox demonstrou resolução do edema no pedúnculo cerebelar esquerdo. O acompanhamento por reprodução de imagens cinco semanas depois não indicou quaisquer lesões. Por causa da piora da insuficiência renal (Cr -5,5), e no estabelecimento da estabilidade das descobertas radio- gráficas depois da repetição da reprodução de imagens, LAmB foi desconti- nuada. Dez meses depois do seu diagnóstico inicial, o paciente permaneceu assintomático e neurologicamente intacto.

O paciente aqui descrito claramente não se curou da sua mu- cormicose invasiva apesar da cirurgia extensiva e meses de terapia antifún- gica, porque ele desenvolveu novas descobertas radiográficas consistentes com mucormicose progressiva depois de 7 meses de tratamento com doses máximas toleradas de LAmB. Entretanto, depois de 7 dias de tratamento com deferasirox, uma melhora radiográfica substancial foi notada. Dois me- ses depois da administração de deferasirox, toda terapia antifúngica foi des- continuada. O paciente permaneceu clinicamente assintomático e radiografi- camente estável depois disso, com nenhum sinal de progressão da doença. O paciente tolerou bem o deferasirox além de uma pequena reação medi- camentosa que pode ser atribuível ao quelante.

Neste caso descreveu-se um caso de mucormicose avançada, com envolvimento do tronco cerebral e seio cavernoso depois de um acen- tuado retardamento na cirurgia apropriada, com um resultado aparentemente exitoso depois do uso de deferasirox como terapia salvadora. O efeito preci- so do tratamento com deferasirox é um pouco confundido pela terapia con- comitante com polieno. Entretanto, o paciente claramente não respondeu à terapia agressiva com polieno antes da adição de deferasirox. Dados os re- sultados encorajadores neste caso, e as opções limitadas e prognóstico de- ficiente de mucormicose apesar das atuais terapias antifúngicas, um estudo adicional de quelação de ferro no tratamento de mucormicose é justificado. Exemplo IV

Efeitos de Deserasirox sobre Mucorales in vitro Este exemplo ilustra os efeitos de deferasirox sobre a expressão

do gene de ferro permease de alta a finidade (rFTR1) em Rhizopus oryzae. Este exemplo ilustra também as suscetibilidades a deferasirox de múltiplos isolados clínicos de Mucorales.

O texto que se segue descreve materiais e métodos usados nos procedimentos descritos neste exemplo e em outros exemplos. R. oryzae e condições de cultura

R. oryzae 99-880 é um isolado clínico de um abscesso cerebral de um paciente diabético. R. oryzae 99-892 é um isolado clínico pulmonar. R. oryzae M16 é um mutante pyrF null (pyrF codifica orotidina 5'-fosfato des- carboxilase, uma enzima necessária para a síntese de uracila) gerado a par- tir de R. oryzae 99-880 por mutagênese química. Este mutante apresentava um fenótipo estável para auxotrofia de uracila mesmo quando plaqueando mais do que 1 χ 109 esporos. Os organismos cresceram sobre ágar de dex- trose de batata (PDA) (formulação/litro: 4 g de amido de batata, 20 g de dex- trose, 15 g de ágar) por 4 dias a 37 0C. No caso de M16, PDA foi suplemen- tado com 100 μg de uracila. Em alguns experimentos, R. oryzae privado de ferro por crescimento sobre base nitrogenada para leveduras (YNB) (Dif- co/Becton Dickinson, de Sparks1 MD) suplementada com meio suplementar completo sem uracila (CSM-URA), (YNB+CSM-URA) (formulação/100 mL: 1,7 g de YNB sem aminoácidos, 20 g de glicose, 0,77 g de CSM-URA) na presença de ácido ascórbico 1 mM e ferrozina. Os esporangiosporos foram coletados em PBS isenta de endotoxinas, contendo 0,01% de Tween 80, lavados com PBS, e contados como um hemacitômetro para preparar os inóculos finais.

Análise de Expressão do gene de ferro permease de alta afinidade de R. oryzae (rFTRP

Tampões de R. oryzae 99-880 retirados de uma placa de PDA

confluente foram desenvolvidos em caldo de dextrose de batata durante a noite inteira a 37 0C com vascolejamento. Os micélios foram coletados de forma asséptica e transferidos para frascos de PDB frescos, contendo clore- to férrico 350 μΜ (para suprimir a expressão de xFTR1), cloreto férrico 350 μΜ mais deferasirox 2 mM para testar a quelação de ferro, ou deferasirox 2 mM mais cloreto férrico 6 mM para supersaturar o deferasirox adicionado. Os frascos foram incubados por 1 h a 37 0C com vascolejamento. Os micé- lios foram coletados por filtração e moídos em nitrogênio líquido usando al- mofariz e pilão. O RNA total foi extraído usando o kit RNeasy Plabt Mini® (Qiagen®) com tampão de RLC. O RNA foi transcrito de forma reversa com iniciador oligo(dT), usando o Sistema de Síntese de Primeiro Filamento Su- perScript® (Invitrogen®) para gerar DNAc de primeiro flamento. Os produtos foram diluídos e usados em PCR para detectar a expressão de FTR1 de R. oryzae e o gene 18s rDNA. As seqüências dos iniciadores da PCR são as seguintes: iniciador sense 5'-TCAGAGAAGGACTTGAAGC-3', e iniciador anti-sense 5'-TAAGTAGCCGTATTGTTCC-3' para rFTR1 a fim de ampliar R. oryzae] e iniciador sense 5'-CATGGTTGAGATTGTAAGATAG-3', e iniciador anti-sense 5'-AGTCAATGGACGTGGAGTC-3' para o gene 18s rDNA. Os produtos da PCR foram separados sobre um gel de 2% de agarose, conten- do 0,1 μg/mL de brometo de etídio. Conjuntos de ambos iniciadores foram desenhados para ampliar bandas de 400 pb. Ensaio da Proteína Verde Fluorescente (GFP) Repórter

Um fragmento de 1,5 kb a montante da ORF de rFTR1 foi ampli- ado por PCR usando o seguinte par de iniciadores: iniciador sense 5'- GCTCTAGATCAGTCTCAACACCATCAATT-3', e iniciador anti-sense 5'- TGCGGCCGTGCTTTTTAGTTCTCCTTGGA-3'. Um fragmento de 2,1 kb, contendo o promotor de actina expressado constitutivamente também foi ampliado por PCR para usar como um controle, usando o seguinte par de iniciadores: iniciador sense 5'-GCTCTAGATGGTATTATCGATTTAGA-3'; e iniciador anti-sense 5'-TACGGCCGCATACCGGAACCGTTATCG-3'. Os fragmentos ampliados foram ligados nos sítios Xbal e Eagl do plasmídeo pyr225b (35). A GFP foi ampliada a partir de pGFPB21 -43.31 (36), e clonada a jusante de qualquer promotor nos sítios Eagl-Sacl do plasmídeo a jusante de qualquer promotor. Finalmente, um fragmento de 2,1 kb que representa a ORF de pyrFe seu promotor nativo foi clonado nos sítios Spel-Clal do plas- mídeo para servir como um marcador de seleção. Os plasmídeos que con- têm GFP acionados por rFTRIp ou ACTIp foram transformados em R. ory- zae M16 com bombardeio de partículas de microprojéteis (Biorad®). Os transformantes foram selecionados sobre placas de YNB+CSM-URA desen- volvidos a 37 0C por 5-7 dias, depois do bombardeio. Os isolados foram en- tão testados quanto à auxotrofia de uracila e incubando as placas a 37 0C. Os transformantes purificados selecionados sobre placas negativas em ura- cila foram analisados por Southern blotting.

A expressão de rFTRIp e ACTIp foi estudada em transforman- tes desenvolvidos em meio repleto de ferro (isto é, YNB+CSM-URA) ou con- dições depletadas de ferro (isto é, YNB+CSM-URA suplementado com defe- rasirox 2 mM). Adicionalmente, para reverter o efeito de deferasirox, os transformantes foram desenvolvidos em YNB+CSM-URA suplementado com deferasirox 2 mM e cloreto férrico 6 mM supersaturador. Finalmente, M16 transformado com plasmídeo vazio (pyr225b-pyrF sem GFP) foi usado como controle negativo. Os esporos (1 χ 104/mL) foram inoculados no meio su- pramencionado e incubados durante a noite inteira a 37 0C. Uma gota da cultura foi montada em uma lâmina e a expressão foi visualizada em R. ory- zae com um microscópio confocal Leica DMRXE, usando um comprimento de onda de excitação de 488 nm. Adicionalmente, uma amostra de 1 mL de cada cultura também foi usado para quantificar a emissão de fluorescência usando um instrumento FACSCaliber® (Becton Dickinson®) equipado com um laser de argônio emitindo a 488 nm. Os esporos foram agrupador por dispersão frontal e lateral e fluorescência medida em FL1. Testes de Suscetibilidade

A concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração fungi- cida mínima (CFM) foram determinadas para deferasirox pelo método de Espinel-lngroff, usando esporos de R. oryzae privados de ferro (Espinel- Ingroff, (2001), supra). A capacidade exterminadora foi definida como uma diferença < 4 vezes entre CIM e CFM. Esquemas de Tratamento

Deferasirox (Novartis Pharmaceuticals, de Basel, Suíça) foi colo- cado em suspensão em hidróxi-propil-celulose (KIuceI) a 0,5% e administra- do por gavagem oral a 1, 3, ou 10 mg/kg duas vezes ao dia (q.d.) ou a cada dois dias (q.o.d.). O tratamento começou 24 h após a infecção e continuou por um total de 5 ou 7 doses. Os grupos de controle foram tratados com o diluente, solução aquosa de dextrose a 5% e 0,5% de Klucel. Em alguns ex- perimentos, uma dose saturadora de ferro livre foi administrada com defera- sirox. Deferasirox reconhecidamente forma complexos moleculares com fer- ro férrico (Fe3+) em uma razão 1:2 de ferro para deferasirox. Baseado nos pesos moleculares conhecidos de cloreto férrico (FeCh, pewso molecular 162,22 g/mol) e deferasirox (peso molecular 373,4 g/mol), uma dose de 2,8 mg/kg de FeCI3 foi calculada para resultar em um excesso significativo de Fe3+ versus uma dose de 10 mg/kg de deferasirox dada a um camundongo de 18 g: moles de Fe3+ = (0,0028 g/kg χ 0,018 kg (peso do camundon- go)/162,22 g/mol = 3 χ 10~7 mol versus moles de deferasorix = (0,01 g/kg χ 0,018 kg (peso do camundongo)/373,4 g/mol = 5 χ 10"7 mol; Razão = 1:1,7 mol de Fe3+ para deferasirox, que é mais do que necessário para atingir uma razão saturadora de 1:2. LAmB diluído em solução aquosa de dextrose a 5% foi obtida na Gilead Sciences® (Foster City, CA) e foi administrada em uma dose de 15 mg/kg (q.d.) diariamente por intermédio da veia da cauda por 4 dias.

Análise Estatística

O teste Iog rank não-paramétrico foi usado para determinar as

diferenças nos tempos de sobrevida dos camundongos. As diferenças nas cargas fúngicas teciduais, freqüências de linfócitos esplênicos, e citocinas de órgãos integrais nos órgãos infectados foram comparadas pelo teste U de Mann Whitney. Os valores de ρ < 0,05 foram considerados significantes.

Demonstrou-se anteriormente (em Fu et ai. FEMS Microbioi Lett. 235:169-176 (2004)) que a privação de ferro causa rápida expressão do gene de ferro permease de alta afinidade (rFTR1) em Rhizopus oryzae, a causa mais comum de mucormicose. Portanto, para confirmar que defesirox quelante ferro eficazmente de R. oryzae, definiu-se o impacto da exposição in vitro ao deferasirox sobre a expressão de rFTR1 em R. oryzae. Os espo- ros de R. oryzae 99-880 foram incubados durante a noite inteira em PDB. No dia seguinte, os micélios foram transferidos para dentro de PDB suplemen- tada com cloreto férrico 350 μΜ (repleto de ferro), cloreto férrico 350 μΜ mais deferasirox 2 mM (depletado de ferro), ou deferasirox 2 mM mais clore- to férrico 6 mM supersaturador. O RNA foi extraído dos esporos desenvolvi- dos em cada condição por 1 h a 37 0C, e a RT-PCR foi realizada para avaliar a expressão do gene. O gene rFTR1 foi expressado na presença de defera- sirox, mas não em meio suplementado com cloreto férrico ou na presnça de deferasirox mais cloreto férrico supersaturador (figura 8a).

Para confirmar a expressão de rFTRIp e a atividade do promo- tor de rFTR1 sob condições quelantes, o gene que codifica a proteína fluo- rescente verde (GFP) foi clonado atrás do promotor de rFTR1 (figura 8b). Os esporos de R. oryzae M16 transformados com a construção rFTR1::GFP ou ACT1p::GFP (controle positivo constitutivo) foram incubados durante a noite inteira com deferasirox, deferasirox mais cloreto férrico supersaturador, ou meio rico em ferro (repleto de ferro). A figura 8c ilustra que em contraste com GFP sob o controle do promotor de ACT1, que foi expressado constitutiva- mente independentemente das condições de crescimento, GFP sob o con- trole do promotor de rFTR1 foi expressada ou era ativa apenas na presença de condições quelantes de ferro (deferasirox). Como observado por micros- copia confocal, M16 transformado com a construção ACT1p::GFP constituti- va foi fluorescente independentemente das condições de crescimento. Em contraste, M16 transformado com rFTR1p::GFP foi fluorescente apenas na presença de deferasirox. Similarmente, por citometria de fluxo, menos do que 1% dos esporos não-transformados ou transformados com rF- TR1p::GFP desenvolvidos em condições repletas de ferro foram fluorescen- tes. Em contraste, 43% dos esporos transformados com rFTR1p::GFP e de- senvolvidos na presença de deferasirox foram fluorescentes. Coletivamente, estes dados confirmaram que deferasirox induziu uma resposta à privação de ferro em R. oryzae.

A seguir, determinou-se as suscetibilidades ao deferasirox de múltiplos isolados clínicos de Mucorales (Tabela 3). As CIM90S de deferasi- rox contra Mucor, não-Rhizopus oryzae spp., e R. oryzae foram 3,12 a 6,25 μς/ιηΙ-.. As CFMs foram similares às CIMs, e deferasirox foi exterminador para 28/29 (97%) dos isolados. É digno de nota que um ligeiro crescimento foi observado dentro das doze primeiras horas, mesmo em concentrações extremamente altas de deferasirox. Entretanto, os fungos estacam mortos em 24 horas, mesmo em baixas concentrações de deferasirox, sugerindo que a capacidade exterminadora era dependente do tempo, e não depen- dente da concentração. Além disso, as CIMs e CFMs de deferasirox contra estes isolados foram bem abaixo do pico clinicamente atingível (-38 μg/mL) e os níveis séricos terapêuticos de vale (trough) do fármaco no estado de equilíbrio quando administrado na dose de partida aprovada pela FDA (20 mg/kg/dia).

Este exemplo, além de demonstrar que deferasirox induziu uma resposta à privação de ferro em R. oryzae, indicou que deferasirox foi exter- minador para múltiplos isolados clínicos de dois gêneros diferentes da famí- lia Mucorales. Tabela 3

CIMs e CFMs de Deferasirox contra Mucorales

24 h 48 h Organismo CIM (μ g/ml) CFM (μ g/ml) Fungi- cida?* CIM (μο/mi) CFMfti g/ml) Fungi- cida?* Mucor 97-1083 3,12 3,12 Y 3,12 3,12 Y Mucor ramosissumus 97-1192 0,78 0,78 Y 0,78 0,78 Y Mueor sp. 99-932 3,12 3,12 Y 3,12 3,12 Y Mucor spp. MIC90/MFC90 3,12 3,12 Y 3,12 3,12 Y R. microsporus ATCC 62417 0,39 0,39 Y 0,39 0,39 Y Rhizopus sp. 99-1150 6,25 6,25 Y 3,12 3,12 Y Rhizopus sp. 99-1700 6,25 6,25 Y 1,56 1,56 Y Rhizopus sp. ATCC 20577 3,12 6,25 Y 3,12 6,25 Y Non-oryae Rhizopus MIC90/MFC90 6,25 6,25 Y 3,12 6,25 Y R. oryzae 729-02 12,5 12,5 Y 6,25 6,25 Y R. oryzae 99-133 6,25 6,25 Y 1,56 6,25 Y R. oryzae 99-880 3,12 3,12 Y 3,12 3,12 Y R. oryzae 99-892 1,56 1,56 Y 1,56 1,56 Y R. oryzae HUMC02 12,5 12,5 Y 1,56 1,56 Y R. oryzae pyrl 7 pryg-/- 0,78 0,78 Y 0,78 0,78 Y R. oryzae tipo I NRRL 10206 3,12 3,12 Y 3,12 3,12 Y R. oryzae tipo I NRRL 21251 3,12 6,25 Y 6,25 6,25 Y R. oryzae tipo I NRRL 6059 6,15 6,25 Y 1,56 6,25 Y R. oryzae tipo I NRRL 11823 3,12 3,12 Y 6,25 6,25 Y R. oryzae tipo I NRRL 13142 6,25 6,25 Y 3,12 3,12 Y R. oryzae tipo I NRRL 13440 1,56 12,5 N 1,56 12,5 N R. oryzae tipo I NRRL 13533 1,56 6,25 Y 1,56 6,25 Y R. oryzae tipo I NRRL 21396 12,5 12,5 Y 1,56 6,25 Y R. oryzae tipo I NRRL 21409 12,5 1,56 Y 1,56 1,56 Y R. oryzae tipo I NRRL 18148 0,78 0,78 Y 0,78 0,78 Y R. oryzae tipo Il NRRL 6,25 12,5 Y 6,25 6,25 Y 21446 R. oryzae tipo Il NRRL 21447 6,25 12,5 Y 6,25 6,25 Y R. oryzae tipo Il NRRL 21477 1,56 1,56 Y 1,56 1,56 Y R. oryzae tipo Il NRRL 21628 0,78 0,78 Y 0,78 0,78 Y R. oryzae tipo Il NRRL 21789 0,39 0,39 Y 0,39 0,39 Y R. oryzae tipo Il 10206 3,12 3,12 Y 3,12 3,12 Y R. oryzae CIM9o/CFM9o 12,5 12,5 Y 6,25 6,25 Y *Exterminador = CFM/CIM < 4 (37)

Exemplo V

Eficáciade Deferasirox contra R. oryzae in vivo

Este exemplo demonstra a eficácia in vivo de deferasirox ao tra- tar camundongos infectados com Mucorales.

O texto que se segue descreve materiais e métodos usados nos

procedimentos descritos neste exemplo ou em exemplos subsequentes. Modelos Murinos

Para infecção in vivo, camundongos BALB/c machos (> 20 g) foram tornados diabéticos com uma única injeção intraperitoneal de 210 mg/kg de estreptozotocina em 0,2 ml_ de tampão de citrato 10 dias antes da inoculação fúngica. Glicosúria e cetonúria foram confirmadas 7 dias depois do tratamento com estreptozotocina. Para o modelo de camundongos neu- tropênicos, os camundongos receberam injeção de uma única dose intraperi- toneal de 200 mg/kg de ciclofosfamida (Bristol Myer Squibb) 2 dias antes da infecção com R. oryzae. Este esquema de tratamento resultou em pancito- penia a partir dos dias 2 a 5 em relação à infecção, com recuperação das contagens celularesa partir do dia 6 após a infecção. Os camundongos fo- ram infectados pela veia da cauda com os inóculos apropriados de R. oryza- e. Para confirmar os inóculos, diluições foram raspadas sobre placas de PDA contendo 0,1% de Triton e as colônias foram contadas depois de um período de incubação de 24 h a 37 0C. O resultado primário da eficácia foi tempo para morrer. Como resultado secundário, a carga fúngica cerebral (órgão-alvo primário) foi determinada por homogeneização rolando uma pi- peta sobre os órgãos colocados em bolsas Whirl-Pak (Nasço, Fort Atkinson, Wl), contendo 2 mL de solução salina. O homogeneizado foi diluído serial- mente em solução salina a 0,85% e depois cultivado quantitativamente sobre PDA. Os valores foram expressos como Iog10 de cfu/g de tecido. Finalmente, para análise histopatológica, os órgãos infectados foram retirados dos ca- mundongos e fixados em foramlina com 10% de zinco. Os tecidos fixados foram embutidos em parafina, e seções de 5 mm foram coradas com hema- toxilina e eosina para exame microscópico. Todos os procedimentos que envolveram camundongos foram aprovados pelo comitê de uso e cuidado de animais institucionais, seguindo as orientações do National Institutes of Heal- th para alojamento e cuidado de animais.

Para determinar se a atividade de deferasirox in vitro se traduzi- ria em eficácia in vivo, foi utilizado o presente modelo murino de mucormico- se disseminada em camundongos diabéticos cetoacidóticos. Os camundon- gos diabéticos cetoacidóticos foram infectados pela veia da cauda com 2,2 χ 104 esporos de R. oryzae 99-892. Os camundongos foram tratados por ga- vagem oral com 1, 3, ou 10 mg/kg de deferasirox em hidróxi-propil-celulose (KIuceI) a 0,5% duas vezes ao dia (b.i.d.) por sete dias iniciando no dia se- guinte à infecção. Os camundongos de controle negativo foram tratados com o carreador hidróxi-propil-celulose (placebo) ou deferasirox mais cloreto fér- rico saturador (administrado por via subcutânea). Um controle negativo adi- cional consistiu em camundongos não-infectados tratados com cloreto férri- co. Deferasirox a 1, 3, ou 10 mg/kg b.i.d. melhorou significativamente a so- brevida em comparação com os controles (figura 9a).

Em um experimento separado, deferasiroux comprovou ser efi- caz contra um segundo isolado clínico de R. oryzae, o isolado 99-880. Os camundongos diabéticos cetoacidóticos foram infectados pela veia da cauda com 1,3 χ 103 esporos do R. oryzae 99-880 mais virulento e tratados con- forme acima com deferasirox a 10 mg/kg b.i.d. ou placebo por sete dias. De- ferasirox melhorou significativamente o tempo para morrer dos camundon- gos infectados com R. oryzae em comparação com placebo (figura 9b). Para determinar o impacto de deferasirox sobre a carga fúngica tecidual, camundongos diabéticos cetoacidóticos foram infectados pela veia da cauda com 4,2 χ 104 esporos de R. oryzae 99-892. Os camundongos fo- ram tratados com deferasirox (10 mg/kg b.i.d.), deferasirox mais cloreto férri- co saturador, ou placebo. O tratamento iniciou 16 h depois da infecção e administrado diariamente por 3 dias. Os rins e os cérebros foram removidos no Dia 4, homogeneizados, e cultivados quantitativamente. Deferasirox re- sultou em um decréscimo maior do que 10 vezes da carga fúngica no cére- bro e rim (órgãos-alvo primários) em comparação com os camundongos tra- tados com placebo ou deferasirox mais cloreto férrico saturador (Figuea 10a). Por histopatologia, os rins dos camundongos tratados com deferasirox não tiveram quaisquer hifas visíveis (como assinalado pelas setas na figura 10b), enquanto que os rins dos camundongos tratados com placebo ou defe- rasirox mais cloreto férrico saturador tiveram fungos extensivamente filamen- tados. Além disso, os camundongos tratados com ferro saturador tiveram uma ausência notável de influxo de neutrófilos para os locais da infecção, enquanto que o influxo de neutrófilos foi acentuado nos rins dos camundon- gos tratados com deferasirox (figura 10b).

Além de demonstrar os efeitos antifúngicos diretos de deferasi- rox, este exemplo demonstra que o efeito protetor de deferasirox pode ser revertido pela administração de ferro livre, o que confirma que o mecanismo de proteção do fármaco é por intermédio de quelação de ferro. Exemplo Vl

Efeitos da Quelação de Ferro e Excesso de Ferro sobre a Resposta Imune de Hospedeiros

Este exemplo ilustra uma comparação entre os efeitos de defe- rasirox e deferasirox mais cloreto férrico sobre a resposta imune de hospe- deiros.

O texto que se segue descreve materiais e métodos usados nos procedimentos descritos neste exemplo e em exemplos subsequentes.

Freqüência de Linfócitos Esplênicos e Ensaios de Citocinas em Órgãos Inte-

grais As freqüências de linfócitos esplênicos foram determinadas co- mo descrito anteriormente (Spellberg et al., Infect. Immun. 71:5756-5764 (2003)). Resumidamente, homogeneizados esplênicos foram passados atra- vés de filtros de 70 μιπ, e em seguida, Iise RBC com cloreto de amônio 0,15 M. As células foram fixadas com tampão Cytofix® (BD Pharmingen®), per- meabilizadas com tampão Cytoperm® (BD Pharmingen), e coradas com 10 μg/mL de anti-CD4 de camundongo conjungado com FITC (clone RM4-5), anti-IFN-γ do camundongo conjugado com PE (clone XMG1.2) ou controle de isótopo (clone R3-34), ou anti-IL-10 do camundongo conjugado com APC (clone JES5-16E3) ou controle de isótopo (clone A95-1) (todos da BD Phar- mingen). Em experimentos separados, a freqüência de células T reguladoras CD4+CD25+foxp3 foram determinadas usando o Kit células T Reguladoras do Camundongo Staining® (eBioscience®) de acordo com a recomendação do fabricante. A freqüência de apoptose foi determinada usando o Kit Anne- xin FITC Apoptosis® (BD Pharmingen®).

As células foram lavadas e uma citometria de fluxo em três cores foi realizada em um instrumento FACScan® da Becton-Dickinson, calibrado com pérolas CaliBRITE® (BD Pharmingen), usando o software FACSComp® conforme as recomendações do fabricante. Durante a obtenção de dados, os linfócitos CD4+ foram agrupador por concatenação de dispersão frontal e lateral, e propriedades de fluorescência de anticorpo FITC anti-CD4. Os a- dos para cada amostra foram obtidos até que 10.000 linfócitos CD4+ tives- sem sido analisados. Ensaio de Citocinas em Órgãos Integrais Os baços e rins foram homogeneizados em 1 mL de PBS. Os

homogeneizados foram peletizados em velocidade máxima em uma centrí- fuga de bancada a 4 0C. Os sobrenadantes foram testados quanto a citoci- nas usando o kit Cytometric Bead Array Murine Inflammatory Cytokine® (BD Pharmigen) de acordo com as instruções do fabricante. Por causa das alterações no influxo celular inflamatório observa-

do nos rins dos camundongos tratados com cloreto férrico saturador versus quelação de ferro, neste exemplo determinou-se o impacto da terapia com deferasirox sobre Th1/Th2 e respostas de citocinas inflamatórias em camun- dongos infectados. Os camundongos diabéticos cetoacidóticos foram infec- tados com 3,1 χ 104 esporos de R. oryzae 99-892 como acima e tratados com deferasirox, deferasirox mais cloreto férrico, ou placebo. No quarto dia após a infecção, os baços e rins foram processados para determinação de citocinas intracelulares e em órgãos integrais. Deferasirox resultou em um aumento significativo nas freqüências de esplenócitos Th1 e Th2 em compa- ração com os camundongos tratados com cloreto férrico saturador ou place- bo (figura 11a). As freqüências de esplenócitos CD4+IL-10+ ou CD4+CD25+foxp3+ não foram significativamente diferentes entre os grupos (dados não ilustrados). Não houve também qualquer diferença significativa na apoptose de esplenócitos entre os grupos (dados não ilustrados).

Os camundongos tratados com deferasirox tiveram níveis esplê- nicos significativamente mais altos das citocinas pró-inflamatórias canônicas, TNF e IFN-γ do que os camundongos tratados com ferro saturador ou place- bo (figura 11b). Os camundongos tratados com deferasirox também tiveram níveis renais significativamente mais altos de IFN-γ (figura 11b).

Este estudo demonstra que deferasirox estimulou de forma ines- pecífica a resposta inflamatória suprimida em camundongos diabéticos ceto- acidóticos, aumentando a freqüência de linfócitos Th1 e Th2, bem como os níveis esplênicos e renais de citocinas inflamatórias. Além disso, a reversão da quelação pela administração de uma dose de fero saturadora diminuiu o número de neutrófilos observados em rins infectados. Exemplo Vll

Deferasirox (Exiade®) Usado em Combinação com Anfotericina B Lipossô- mica para o Tratamento Terapêutico de Mucormicose Murina

Este exemplo demonstra os efeitos da terapia combinada usan- do o quelante de ferro, deferasirox (Exjade®), e Anfotericina B Lipossômica (LAmB) para o tratamento de mucormicose. Como descrito anteriormente, os dados dos modelos clínicos e

animais indicam que a presença de ferro sérico elevado disponível predispõe o hospedeiro à mucormicose. Como exemplificado nos exemplos acima, a terapia de quelação de ferro com deferasirox demonstrou melhorar a sobre- vida de camundongos diabéticos cetoacidóticos infectados com R. oryzae, a causa mais comum de mucormicose. Para corroborar a eficácia de deferasi- rox em terapia adjuntiva, a eficácia de deferasirox combinado com LAmB foi comparada com qualquer um dos dois fármacos isoladamente para o trata- mento de mucormicose murina no modelo animal.

Os métodos, procedimentos com animais e reagentes foram rea- lizados e/ou preparados como descrito anteriormente. Resumidamente, ca- mundongos BALB/c com DKA induzida por estreptozotocina foram infecta- dos pela veia da cauda com 2,0 χ 103 esporos de fí. oryzae. O tratamento foi iniciado 24 h depois da infecção com: (1) LAmB (15 mg/kg por via intraveno- sa) dada uma vez ao dia por 4 doses; (2) deferasirox (10 mg/kg peroral) da- do duas vezes ao dia por 4 doses; ou (3) LAmB e deferasirox usando as do- ses acima. Os camundongos de placebo receberam controle com veículo. Os resultados finais foram tempo para morrer e unidades formadoras de co- lônias (CFU).

Os resultados do estudo acima estão ilustrados nas figuras 12 e 13. A figura 12 ilustra a eficácia das monoterapias com deferasirox isolada- mente e LAmB isoladamente, bem como da terapia combinada com defera- sirox e LAmB juntos para tratar mucormicose. Os resultados indicam que ambas monoterapias melhorarama sobrevida em comparação com placebo (25% e 28% de sobrevivência paradeferasirox e LAmB, respectivamente, e 0% para placebo, ρ < 0,003). A terapia combinada melhorou acentuadamen- te o tempo de sobrevida e a sobrevivência total de camundongos DKA infec- tados (n > 16 por grupo) em comparação com todos os outros grupos (70% de sobrevivência para terapia combinada, ρ < 0,008 pelo teste de Log Rank para todas comarações).

Os resultados destes tratamentos com relação a órgãos-alvo estão ilustrados na figura 13. Os resultados indicam que nenhum dos dois fármacos isoladamente foi capaz de reduzir as CFUs no cérebro (órgão-alvo primário) em comparação com placebo. Entretanto, a terapia combinada com deferasirox e LAmB reduziu as CFUs em mais do que 2 Iogs em com- paração com todos os outros braços (p < 0,04). LAmB isoladamente e a te- rapia combinada foram capazes de reduzir CFUs do rim (órgão-alvo secun- dário) e comparação com camundongos tratados com placebo (p < 0,01).

Este estudo indica que a terapia de quelação de ferro e alta dose de LAmB pode ser igualmente eficaz para tratar mucormicose experimental em DΚΑ. A terapia combinada com LAmB e deferasirox foi mais eficaz do que qualquer um dos dois fármacos isoladamente. Estes dados corroboram mais ainda a eficácia terapêutica de usar quelação de ferro, tal como defera- sirox como uma terapia adjuntiva com uma formulação lipídica de anfoterici- na B para tratar infecções de mucormicose. Os resultados acima indicam adicionalmente que, quando usados em combinação, o quelante de fero de- ferasirox (Exjade®) e Anfotericina B Lipossômica resultam em um efeito si- nérgico para o tratamento de mucormicose em modelos animais. Exemplo Vlll

Eficácia de Defersirox em Camundongos Neutropênicos Infectados

Este exemplo demonstra a eficácia de deferasirox para tratar camundongos neutropênicos infectados com fí. oryzae.

Para determinar se deferasiros era eficaz também no estabele- cimento de neutropenia, camundongos sofreram ablação da medula com ciclofosfamida. Dois dias depois, os camundongos foram infectados pela veia da cauda com 2,7 χ 103 esporos de R. oryzae 99-892. Os estudos de resposta à dose inicial sugeriram que, em contraste com o modelo diabético cetoacidótico, resultados ótimos foram atingidos com dosagem de deferasi- rox a cada dois dias ao invés de todo dia (dados não ilustrados), como aqui anteriormente descrito com o quelante de ferro, deferiprona. O tratamento com deferasirox (10 mg/kg duas vezes ao dia (q.o.d.) por 5 doses iniciando 24 h após a infecção) melhorou significativamente o tempo para morrer em comparação com placebo (figura 14). Em contraste, deferasirox dosado duas vezes ao dia não melhorou significativamente o tempo para morrer versus placebo.

Este Estudo indica que a eficácia máxima de deferasirox em camundongos neutropênicos requereu dosagem menos freqüente do que no modelo de camundongo diabético cetoacidótico, e deferasirox pareceu ser algo mais eficaz em camundongos diabéticos cetoacidósticos do que em camundongos neutropênicos. Exemplo IX

Avaliação de Toxicidade Específica de Deferasirox em Camundongos Neu- tropênicos

Este exemplo demonstra os resultados da avaliação da toxicida- de em camundongos neutropênicos tratados com dose diária de deferasirox.

O texto que se segue descreve os materiais e métodos usados nos procedimentos descritos neste exemplo. Estudos da Toxicidade de Deferasirox

A toxicidade de deferasirox em camundongos neutropênicos foi avaliada. Os camundongos foram tornados neutropênicos como descrito a - cima e tratados com deferasirox a 10 mg/kg duas vezes ao dia ou a cada dois dias por 7 dias. Os camundongos de três grupos diferentes (isto é, pla- cebo, tratamento diário com deferasirox, e tratamento com deferasirox a ca- da dois dias) foram sacrificados no dia 3 ou 8 e o sangue foi coletado e envi- ado para Charles River Laboratories para avaliação. Adicionalmente, esfre- gaços da medula óssea foram preparados a partir dos fêmures, e os tecidos foram coletados, preservados em formalina tamponada com zinco, embebi- dos em parafina, seccionados em 5 μπη, e corados com hematoxilina e eosi- na. As lâminas resultantes foram examinadas por um patologista veterinário autorizado pela junta nos Charles River Laboratories.

Devido ao fato de que deferasirox na dosagem a cada dois dias foi ótimo no modelo neutropênico, buscou-se identificar qualquer toxicidade potencial causada pela dosagem diária de deferasirox em camundongos neutropênicos. Os camundongos foram tornados neutropênicos com ciclo- fosfamida, como descrito acima, mas não foram infectados. Os camundon- gos foram tratados com deferasirox a 10 mg/kg duas vezes ao dia por 7 dias, 10 mg/kg duas vezes a cada dois dias por 4 doses, ou placebo. Sangramen- tos terminais foram realizados no Dia 3 ou Dia 8 para medir a contagem sangüínea completa, químicas do soro, e testes de função hepática. A histo- patologia foi realizada em uma lista extensa de órgãos, incluindo o cérebro, coração, pulmões, fígado, vesícula biliar, baço, rins, trato gastrointestinal (incluindo o estômago, intestino delgado, e intestino grosso), e medula óssea (esfregaços e núcleo). Nenhuma diferença nas contagens de leucócitos, contagens absolutas de neutrófilos, contagens de plaquetas, níveis de he- moglobina, químicas séricas (incluindo creatinina, nitrogênio de uréia no sangue, ou eletrólitos), ou testes de função hepática (incluindo AST, ALT ou bilirrubina) foi identificada entre os três grupos em qualquer ponto no tempo. Por histopatologia, nenhuma toxicidade específica de órgão atribuível a defe- rasirox foi identificada , incluindo nenhuma evidência de alterações na hema- topoiese. Especificamente, não houve qualquer evidência de exacerbação ou recuperação retardada de ablação da medula óssea por quimioterapia, nem houve qualquer evidência de disfunção renal ou hepática por testes de laboratório, nem qualquer toxicidade específica de órgãos por avaliação his- topatológica.

O estudo demonstra que a atividade diminuída da dosagem diá- ria de deferasirox em camundongos neutropênicos não poderia ser devido a um efeito tóxico de deferasirox em tais camundongos, pois nenhuma evidên- cia de toxicidade foi encontrada. Neste pedido de patente inteiro, várias publicações foram refe-

renciadas entre parênteses. Os conteúdos destas publicações em sua totali- dade são incorporados como referência neste pedido de patente para des- crever mais completamente o estado da arte ao qual esta invenção pertence.

Embora a invenção tenha sido descrita fazendo referência às modalidades descritas, os versados nessas técnicas devem avaliar pronta- mente que os exemplos e estudos específicos detalhados acima são mera- mente ilustrativos da invenção. Deve-se entender que várias modificações podem ser feitas sem fugir do espírito da invenção. Consequentemente, a invenção está limitada apenas pelas reivindicações que se seguem.

Claims (44)

1. Composição que compreende pelo menos um composto que- Iante de ferro ou um seu sal farmaceuticamente aceitável e pelo menos um agente antifúngico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, onde o dito composto quelante de ferro compreende deferiprona ou deferasirox.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, onde o dito agente antifúngico compreende um agente antifúngico poliênico, um agente antifúngico azol ou um agente antifúngico de equinocandina.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, onde o dito agente antifúngico poliênico é selecionado entre desoxicolato de anfotericina B, anfontericina B lipossômica, complexo lipídico de anfotericina B ou anfo- tec.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 3, onde o dito antifúngico azol é selecionado entre posaconazol, voriconazol fluconazol ou itraconazol.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 3, onde o dito antifúngico de equinocandina é selecionado entre acetato de caspofungina ou micafungina.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, compreenden- do ainda dois ou mais agentes quelantes de ferro.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, onde os ditos dois compostos quelante de ferro compreendem deferiprona ou deferasirox.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, compreenden- do ainda dois ou mais agentes antifúngicos.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, onde os ditos dois ou mais agentes fúngicos são selecionados entre um agente antifúngico poliênico, um agente antifúngico azol ou um agente antifúngico de equino- candina.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, onde os di- tos agentes antifúngicos são selecionados entre desoxicolato de anfotericina B, anfontericina B lipossômica, complexo lipídico de anfotericina B, anfotec, posaconazol, voriconazol fluconazol, itraconazol, caspofungina ou micafun- gina.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, compreen- dendo ainda uma quantidade terapeuticamente eficaz do dito composto que- Iante de ferro, do dito agente antifúngico ou de ambos.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 1, compreen- dendo ainda um meio farmaceuticamente aceitável.

14. Método para tratar ou prevenir uma condição fúngica, com- preendendo administrar a um indivíduo que tem, ou é suscetível a ter, uma condição antifúngica uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo me- nos um composto quelante de ferro por um tempo suficiente para reduzir a gravidade de uma condição fúngica, onde o dito composto quelante de ferro compreende um não-sideróforo ou não-xenossideróforo em relação à dita condição fúngica.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, onde a dita con- dição fúngica compreende zigomicose, aspergilose, criptococose, candidía- se, histoplasmose, coccidiomicose, paracoccidiomicose, fusariose (hialo- hifomicoses), blastomicose, peniciliose ou esporotricose.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, onde a dita zi- gomicose compreende ainda mucormicose.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde a dita mu- cormicose compreende mucormicose rinocerebral, mucormicose pulmonar, mucormicose gastrointestinal, mucormicose disseminada, mucormicose ós- sea, mucormicose mediastino, mucormicose traqueal, mucormicose renal, mucormicose peritoneal, mucormicose da veia cava superior, ou mucormico- se de otite externa.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, onde a dita mu- cormicose está associada a um agente infeccioso da ordem Mucorales.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, onde o dito agen- te da ordem Mucorales é selecionado entre espécie Rhizopus que consiste em Rhizopus oryzae (Rhizopus arrhizus), Rhizopus microsporus var. rhizo- podiformis, Absidia corymbifera, Apophysomyces elegans, espécie Mucor, Rhizomucor pusillus e Cunninghamella spp (família das Cunninghamellace- ae).

20. Método, de acordo com a reivindicação 16, onde a dita can- didíase está associada a um agente infeccioso selecionado entre uma espé- cie Candida que consiste em Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida glabrata e Candida parapsilosis.

21. Método, de acordo com a reivindicação 15, onde a dita as- pergilose está associada a um agente infeccioso selecionado entre espécie Aspergillus que consiste em Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, As- pergillus terreus, Aspergillus nidulans e Aspergillus clavatus.

22. Método, de acordo com a reivindicação 14, onde o dito com- posto quelante de ferro compreende deferiprona ou deferasirox.

23. Método, de acordo com a reivindicação 14, compreendendo ainda dois ou mais compostos quelantes de ferro, onde cada composto que- Iante de ferro compreende um não-sideróforo ou não-xenossideróforo em relação à dita condição fúngica.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, onde os ditos dois ou mais compostos quelantes de ferro compreendem deferiprona e de- ferasirox.

25. Método, de acordo com a reivindicação 14, onde a dita pre- venção compreende a administração profilática do dito pelo menos um com- posto quelante de ferro antes do início da dita condição fúngica.

26. Método para tratar ou prevenir uma condição fúngica, com- preendendo administrar a um indivíduo que tem, ou é suscetível a ter, uma condição fúngica uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um composto quelante de ferro e pelo menos um agente antifúngico, por um tempo suficiente para reduzir a gravidade da dita condição fúngica, onde o dito composto quelante de ferro compreende um não-sideróforo ou não- xenossideróforo em relação à dita condição fúngica.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, onde a dita con- dição fúngica compreende zigomicose, aspergilose, criptococose, candidía- se, histoplasmose, coccidiomicose, paracoccidiomicose, fusariose (hialo- hifomicoses), blastomicose, peniciliose ou esporotricose.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, onde a dita zi- gomicose compreende ainda mucormicose.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, onde a dita mu· cormicose compreende mucormicose rinocerebral, mucormicose pulmonar, mucormicose gastrointestinal, mucormicose disseminada, mucormicose ós- sea, mucormicose mediastino, mucormicose traqueal, mucormicose renal, mucormicose peritoneal, mucormicose da veia cava superior, ou mucormico- se de otite externa.

30. Método, de acordo com a reivindicação 17, onde a dita mu- cormicose está associada a um agente infeccioso da ordem Mucorales.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, onde a dita mu- cormicose está associada a um agente infeccioso da ordem Mucorales.

32. Método, de acordo com a reivindicação 27, onde a dita can- didíase está associada a um agente infeccioso selecionado entre uma espé- cie Candida que consiste em Candida aibicans, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida glabrata e Candida parapsilosis.

33. Método, de acordo com a reivindicação 15, onde a dita as- pergilose está associada a um agente infeccioso selecionado entre espécie Aspergillus que consiste em Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, As- pergillus terreus, Aspergillus nidulans e Aspergillus clavatus.

34. Método, de acordo com a reivindicação 26, onde o dito com- posto quelante de ferro compreende deferiprona ou deferasirox.

35. Método, de acordo com a reivindicação 26, onde o dito agen- te antifúngico compreende um agente antifúngico poliênico, um agente anti- fúngico azol ou um agente antifúngico de equinocandina.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, onde o dito agen- te antifúngico poliênico é selecionado entre desoxicolato de anfotericina B, anfontericina B lipossômica, complexo lipídico de anfotericina B ou anfotec.

37. Método, de acordo com a reivindicação 35, onde o dito anti- fúngico azol é selecionado entre posaconazol, voriconazol fluconazol ou itra- conazol.

38. Método, de acordo com a reivindicação 35, onde o dito anti- fúngico de equinocandina é selecionado entre acetato de caspofungina ou micafungina.

39. Método, de acordo com a reivindicação 26, compreendendo ainda dois ou mais compostos quelantes de ferro, onde cada composto que- Iante de ferro compreende um não-sideróforo ou não-xenossideróforo em relação à dita condição fúngica.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, onde os ditos dois compostos quelantes de ferro compreendem deferiprona e deferasirox.

41. Método, de acordo com a reivindicação 26, compreendendo ainda dois ou mais agentes antifúngicos.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, onde os ditos dois agentes antifúngicos são selecionados entre um agente antifúngico po- liênico, um agente antifúngico azol ou um agente antifúngico de equinocan- dina.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, onde os ditos agentes antifúngicos são selecionados entre desoxicolato de anfotericina B, anfontericina B lipossômica, complexo lipídico de anfotericina B, anfotec, posaconazol, voriconazol fluconazol, itraconazol, caspofungina ou micafun- gina.

44. Método, de acordo com a reivindicação 26, onde dita pre- venção compreende a administração profilática do dito pelo menos um com- posto quelante de ferro e do dito pelo menos um agente antifúngico antes do início da dita condição fúngica.