BRPI0712629B1 - método para a detecção da apoptose e método para a identificação de uma célula de câncer humano" - Google Patents

Abstract

método para a detecção da apoptose, método para a identificação de uma célula de câncer humano e kit para observar a apoptose. a invenção fornece materiais e métodos para observação de fragmentos de proteínas produzidos durante a apoptose a fim de observar esse processo em células de mamíferos. exemplos de realizações da presnete invenção podem ser utilizados, por exemplo, para observar apoptose a fim de examinar a sensibilidade de uma célula de câncer de mamífero a agentes indutores da apoptose.

Description

(54) Título: MÉTODO PARA A DETECÇÃO DA APOPTOSE E MÉTODO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE UMA CÉLULA DE CÂNCER HUMANO (51) Int.CI.: G01N 33/50 (30) Prioridade Unionista: 20/06/2006 US 60/814,955 (73) Titular(es): GENENTECH, INC.

(72) Inventor(es): CARY D. AUSTIN

1/123 “MÉTODO PARA A DETECÇÃO DA APOPTOSE E MÉTODO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE UMA CÉLULA DE CÂNCER HUMANO”

Pedidos Relacionados [001] O presente pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório US 60/814.955, depositado em 20 de junho de 2006, cujo teor é integralmente incorporado ao presente pedido pelas referências.

Campo da Invenção [002] A presente invenção está relacionada de maneira geral a métodos de observação da apoptose em células de mamíferos, como células de câncer humanas expostas a um agente que induz à apoptose.

Antecedentes da Invenção [003] O controle do número de células em mamíferos é determinado, em parte, pelo balanço entre a proliferação celular e a morte celular. Uma forma de morte celular, muitas vezes referida como morte celular necrótica, é tipicamente caracterizada como uma forma patológica de morte celular resultante de algum trauma ou injúria celular. Em contraste, existe outra forma “fisiológica” de morte celular que prossegue geralmente de uma forma ordenada ou controlada. Esta forma ordenada ou controlada de morte celular é frequentemente referida como “apoptose” (vide, por exemplo, Barr et al., Bio/Technology, 12:487-493 (1994); Steller et al., Science, 267:1445-1449 (1995)). A morte celular apoptótica ocorre naturalmente em muitos processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário humano e a seleção clonal no sistema imune (Itoh et al., Cell, 66:233-243 (1991)).

[004] Varias moléculas como, por exemplo, o fator de necrose tumoral-α (TNF-α), fator de necrose tumoral-β (TNF-β ou linfotoxina-a), linfotoxina-β (LT-β), ligante de CD30, ligante de CD27, ligante de CD40, ligante de OX-40, ligante de 4-1BB, ligante de Apo-1 (também referido como Fas ligante ou CD95 ligante), ligante de Apo-2(também referido como TRAIL), ligante de ApoPetição 870180009904, de 05/02/2018, pág. 11/139

2/123 (também referido como TWEAK), osteoprotegerina (OPG), APRIL, lingante de RANK (também referido como TRANCE), e TALL-1 (também referido como BlyS, BAFF ou THANK) têm sido identificadas como citocinas membros da família do fator de necrose tumoral (TNF) [vide, por exemplo, Gruss e Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992), documento WO 97/01633 publicado em 16 de janeiro de 1997; documento WO 97/25428 publicado em 17 de julho de 1997; Harsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Simonet et al. , Cell, 8_9:309-319 (1997); Chicheportiche et al., Biol. Chem,, 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); WO98/28426 publicado em 2 de julho de1998; WO98/46751 publicado em 22 de outubro de 1998; WO98/18921 publicado em 7 de maio de 1998; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:17471756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)]. Entre estas moléculas, o TNF-α, TNF-β, ligante de CD30, ligante de 4-1BB, ligante de Apo-1, ligante de Apo-2 (Apo2L/TRAIL) e ligante de Apo-3 (TWEAK) têm sido reportados como estando envolvidos na morte celular apoptótica. Tanto TNF-α quanto TNF-β foram descritos por induzir a morte apoptótica em células tumorais suscetíveis (Schmid et al., Proc, Natl.. Acad., 8_3: 1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17: 689 (1987)).

[005] Moléculas adicionais às quais se acreditava pertencerem à família das citocinas TNF são descritas por estarem envolvidas com o processo da apoptose. Por exemplo, em Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996), é descrita uma molécula designada como Apo-2 ligante. Vide também, documento WO 97/25428 publicado em 17 de julho de 1997. A ligante de Apo-2 humana de comprimento total é descrita como sendu um polipeptídeo de 281 aminoácidos

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3/123 que induz a apoptose em diferentes células de mamíferos. Outros pesquisadores descreveram polipeptídios relacionados referidos como TRAIL (Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); documento WO 97/01633 publicado em 16 de janeiro de 1997) e AGP-1 (documento WO 97/46686 publicado em 11 de dezembro de 1997).

[006] Várias moléculas na família de TNF também assumiram papel(éis) na função ou desenvolvimento do sistema imunológico (Gruss et al., Blood, 85: 3378 (1995)). Zheng et al. relataram que TNF está envolvida na apoptose pós-estímulo de células T CD8-positivas (Zheng et al., Nature, 377: 348-351 (1995)). Outros pesquisadores relataram que o ligante CD30 pode estar envolvido na deleção de células T autorreativas no timo (Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Abstr. n° 10 (1995)). O ligante CD40 ativa muitas funções das células B, que incluem a proliferação, secreção de imunoglobulinas, e sobrevivência (Renshaw et al., J. Exp. Med., 180: 1889 (1994)). Outra citocina da família do TNF recentemente identificada, TALL-1 (BlyS), foi relatada por induzir, sob certas condições, a proliferação de células B e a secreção de imunoglobulina (Moore et al., supra; Schneider et al., supra; Mackay et al., J. Exp. Med., 190: 1697 (1999)).

[007] Mutações no receptor Fas/Apo-1 de camundongo ou genes ligantes (denominados lpr e gld, respectivamente) foram associadas a algumas disfunções autoimunes, o que indica que o ligante Apo-1 pode desempenhar um papel na regulação da deleção clonal de linfócitos periféricos autorreativos (Krammer et al., Curr. Op. Immunol., 6: 279-289 (1994); Nagata et al., Science, 267: 1449-1456 (1995)). Também se relatou que o ligante Apo-1 induz a apoptose pós-estímulo em linfócitos T CD4-positivos e em linfócitos B, e pode estar envolvido na eliminação de linfócitos ativados quando a sua função não for mais necessária (Krammer et al., supra; Nagata et al., supra). Foram relatados anticorpos monoclonais agonistas de camundongos que se ligam

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4/123 especificamente ao receptor Apo-1 que exibem atividade matadora de células que é comparável ou similar à do TNF-α (Yonehara et al., J. Exp. Med., 169: 1747-1756 (1989)).

[008] A indução de diversas respostas celulares mediadas por ligantes da família do TNF são tipicamente ativadas por sua ligação a receptores específicos nas células. Alguns, mas não todos, ligantes da família do TNF se ligam e induzem as diversas atividades biológicas através da superfície celular ou receptores de morte para ativar as caspases, ou enzimas que realizam a morte celular ou a via da apoptose (Salvesen et al., Cell, 91: 443-446 (1997). Incluídos entre os membros da superfamília dos receptores de TNF identificados até o momento são TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (também denominado Apo-1 ou CD95), DR4 (também denominado como TRAIL-R1), DR5 (também denominado como Apo-2 ou TRAIL-R2), DcRl, DcR2, osteoprotegerina (OPG), RANK e Apo-3 (também denominado DR3 ou TRAMP) (vide, por exemplo, Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi e Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi e Dixit, Curr. Opin. Cell Biol, 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377-411;Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss e Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); HohMan et al., J.Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3127-3131 (1990); EP 417,563, publicado em 20 de março de 1991; Loetscher etal.. Cell, 61:351 (1990); Schall etal. , Cell, 61:361 (1990); Smith et al Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 2830-2834 (1991); Goodwin et al. , Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991); Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989); Mall et al., EMBO J., 9:1063-1068 (1990); Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997); Chicheportiche et al. , J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Pan al..

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Science, 276:111-113 (1997); Pan et al., Science, 277:815-818 (1997); Sheridan et al., Science 277: 818-821 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Tsuda et al., BBRC, 234: 137-142 (1997); Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997); vonBulow et al., Science, 278:138-141 (1997)).

[009] A maior parte desses membros da família de receptores de TNF partilha a estrutura típica de receptores da superfície celular, incluindo regiões extracelular, intracelular e transmembrana, enquanto outros são encontrados naturalmente como proteínas solúveis sem o domínio intracelular e transmembrana. A porção extracelular dos TNFRs contém uma sequência repetitiva padrão de aminoácidos dos quatro domínios ricos em cisteína (CDRs), partindo do NH2-terminal.

[010] O ligante denominado Apo-2L ou TRAIL foi identificado há muitos anos atrás como sendo uma citocina membro da família do TNF. (vide, por exemplo, Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); documento WO 97/01633; documento WO 97/25428; Patente US 5.763.223 publicada em 9 de junho de 1998;patente US 6.284.236 publicada em 4 de setembro de2001). A sequência polipeptídica nativa completa do Apo2L/TRAIL humano é uma sequência de 281 aminoácidos da proteína transmembrana Tipo II. Algumas células podem produzir uma forma solúvel natural de polipeptídio, pela clivagem enzimática da região extracelular dos polipeptídeos (Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)).

[011] Estudos por cristalografia de formas solúveis de

Apo2L/TRAIL revelam uma estrutura homotrimérica similar às estruturas do

TNF e outras proteínas relacionadas (Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)). Cha et al.. Immunity,

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11:253-261 (1999); Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)). Apo2L/TRAIL, diferentemente de outros membros da família do TNF, possui uma característica estrutural única em que três resíduos de cisteína (na posição 230 de cada subunidade no homotrímero) coordenam juntos um átomo de zinco, e que o zinco ligado é importante para a estabilidade do trímero e atividade biológica. (Hymowitz et al., supra; Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:2063220637 (2000)).

[012] Tem sido relatado na literatura que a Apo2L/TRAIL pode ter um papel importante na modulação do sistema imune, incluindo doenças autoimunes como, por exemplo, a artrite reumatóide (vide, por exemplo, Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)).

[013] Formas solúveis de Apo2L/TRAIL também foram relatadas como indutores de apoptose em uma variedade de células cancerosas in vitro, incluindo de tumores de cólon, pulmão, mama, próstata, bexiga, rim, ovário e cérebro, bem como melanoma, leucemia, e mieloma múltiplo (vide, por exemplo, Wiley et al., supra; Pitti et al., supra; Patente US 6.030.945 publicado em 29 de fevereiro de 2000; Patente US 6.746.668 publicado em 8 de junho de 2004; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)). Estudos in vivo em modelos de tumores murinos sugerem que a Apo2L/TRAIL, sozinha ou em combinação com quimioterapia ou radioterapia, pode exercer um efeito anti-tumor substancial. (vide, por

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7/123 exemplo, Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra; Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., supra; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999); pedido PCT US/00/15512; pedido PCT US/01/23691). Em contraste a muitos tipos de células cancerosas, a maioria das células humanas normais parece ser resistente à indução da apoptose por certas formas recombinantes de Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., supra; Walzcak et al., supra). Jo et al. Relatou que uma forma solúvel de Apo2L/TRAIL poli-histidina marcada induz à apoptose in vitro em hepatócitos humanos normais isolados, mas não em hepatócitos não humanos normais. (Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); vide também, Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). Acredita-se que determinadas preparações de Apo2L/TRAIL recombinante podem variar em termos de propriedades bioquímicas e de atividades biológicas em células doentes versus células normais, dependendo, por exemplo, da presença ou da ausência de uma molécula marcada, presença de zinco e % do conteúdo de trímeros (vide, Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)).

[014] A Apo2L/TRAIL foi encontrada por se ligar com pelo menos cinco diferentes receptores. Pelo menos dois dos receptores ao qual a Apo2L/TRAIL se liga contem um domínio de morte citoplasmático funcional. Um destes receptores é denominado “DR4” (e alternativamente denominado como TR4 ou TRAIL-R1) (Pan et al, Science 276:111-113 (1997); vide também, documento W098/32856 publicado em 30 de julho de 1998; documento W099/37684 publicado em 29 de julho de 1999; documento WO 00/73349 publicado em 7 de dezembro de 2000; Patente US 003/0036168 publicado em 20 de fevereiro de 2003; patente US 6.433.147 publicado em 13 de agosto de 2002; Patente US 6.461.823 publicado em de outubro de 2002, e Patente US 6.342.383 publicado em 29 de janeiro de 2002).

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8/123 [015] Outro receptor é descrito como sendo um receptor para a Apo2L/TRAIL, denominado também como DR5 (e alternativamente denominado como Apo-2, TRAIL-R ou TRAIL-R2,TR6 Tango-63, hAPO8, TRICK2 ou KILLER (vide, por exemplo, Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997), Pan et al., Science, 277:815-818(1997), W098/51793 publicado em 19 de novembro de 1998; W098/41629 publicado em 24 de setembro de 1998; Screaton et al. , Curr. Biol ,. 7:693-696 (1997); Walcak et al., EMBO J 16:5386-5387 (1997); Wu et al.. Nature Genetics, 17:141-143 (1997), W098/35986 publicado em 20 de agosto de 1998; EP870,827 publicado em 14 de outubro de 1998; W098/46643 publicado em 22 de outubro de 1998; W099/02653 publicado em 21de janeiro de 1999; W099/09165 publicado em 25 de Fevereiro de 1999; W099/11791 publicado em 11 de março de 1999; WO 03/042367 publicado em 22 de maio de 2003; WO 02/097033 publicado em 5 de dezembro de 2002; WO 03/038043 publicado em 8 de maio de 2003; Patente US 2002/0072091 publicado em 13 de agosto de 2002; Patente US 2002/0098550 publicado em 7 de dezembro de 2001; Patente US 6,313,269 publicado em 6 de dezembro de 2001; Patente US 2001/0010924 publicado em 2 de agosto de 2001; Patente US 2003/01255540 publicado em 3 de julho de 2003; Patente US 2002/0160446 publicado em 31 d outubro de 2002; Patente US 2002/0048785 publicado em 25 de abril de 2002; Patente US 2004/0141952 publicado em 21 de julho de 2004; Patente US 2005/0129699 publicado em 16 de junho de 2005; Patente US 2005/0129616 publicado em 16 de junho de 2005; Patente US 6.342.369 publicado em Fevereiro de 2002; Patente US 6.569.642 publicado em 27 de maio de 2003, Patente US 6.072.047 publicado em 6 de junho de 2000, Patente US 6.642.358 publicado em 4 de novembro de 2003; Patente US 6.743.625 publicado em 1° de junho de 2004). Como DR4, DR5 é reportado por conter um domínio de morte citoplasmático e ser capaz de sinalizar a apoptose após a ligação do ligante (ou a ligação de uma molécula, tal como um anticorpo antagonista, que imita a atividade do ligante). A estrutura

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9/123 de cristal do complexo formado entre Apo-2L/TRAIL e DR5 é descrita em Hymowitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1999). Outro receptor contendo um domínio de morte foi identificado e denominado como DR6 (Pan et al., FEBS Letters, 431: 351-356 (1998)).

[016] Sobre a ligação ao ligante, tanto DR4 quanto DR5 podem provocar o apoptose independentemente do recrutamento e ativação do iniciador da apoptose, caspase-8, através da molécula contendo o adaptador do domínio de morte referida como FADD/Mort1. (Kischkel et al., Immunity, 12:611-620 (2000); Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)).

[017] Foi descrito que Apo2L/TRAIL também se liga a receptores denominados DcR1, DcR2 e OPG, os quais se acreditava funcionar como inibidores, em vez de transdutores de sinalização (vide, por exemplo, DCR1 (também referido como TRID, LIT ou TRAIL-R3) (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); e Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998)); DCR2 (também denominado TRUNDD ou TRAIL-R4) (Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)) OPG (Simonet et al., supra). Em contraste ao DR4 e DR5, os receptores DcR1 e DcR2 não sinalizam a apoptose.

[018] Certos anticorpos que se ligam a receptores DR4, DR5 e/ou Fas são descritos na literatura. Por exemplo, anticorpos anti-DR4 dirigidos ao receptor DR4 e possuindo atividade agonística ou apoptótica em determinadas células de mamíferos são descritos em, por exemplo, documento WO 99/37684 publicado em 29 de julho de 1999; documento WO 00/73349 publicado em 12 de julho de 2000; documento WO 03/066661 publicado em 14

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10/123 de agosto de 2003. Vide, também, por exemplo, Griffith et al., J Immunol 162:2597-2605 (1999); Chuntharapai et al., J. Immunol. , 166:4891-4898 (2001); documento WO 02/097033 publicado em 2 de dezembro de 2002; documento WO 03/042367 publicado em 22 de maio de 2003; documento WO 03/038043 publicado em 8 de maio de 2003; documento WO 03/037913 publicado em 8 de maio de 2003; US 2003/0073187 publicado em 17 de abril de 2003; US 2003/0108516 publicado em 12 de junho de 2003. Certos anticorpos anti-DR5 também foram descritas, vide, por exemplo, documento WO 98/51793 publicado em 8 de novembro de 1998; Griffith et al., J Immunol., 162:2597-2605 (1999); Ichikawa et al., Nature Med. , 7:954-960 (2001); Hylander et al. An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice, Resumo, 2° Congresso Internacional de Anticorpos Monoclonais em Cânceres, 29 de Agosto - 1 de Setembro de 2002, Banff, Alberta, Canadá; documento WO 03/038043 publicado em 8 de maio de 2003; documento WO 03/037913 publicado em 8 de maio de 2003; US 2003/0180296 publicado em 25 de setembro de 2003;. Além disso, alguns anticorpos que possuem reatividade cruzada para ambos receptores DR4 e DR5 foram descritos (vide, por exemplo, Patente US 6252050 publicada em 26 de junho de 2001). Anticorpos agonistas anti-Fas que induzem à apoptose nas células alvo que expressam Fas, incluem, mas não estão limitadas a, mAbs, M2 e M3 (IgG; Alderson et al., 1995, J. Exp. Med. 181:71-77); anti Fas-mAb (IgM; Yonehara et al., 1989, J. Exp. Med. 169:1747-1756); mAb CH11 (IgM; Alderson et al., 1994, Int. Immunol. 6:1799-806); e anti-APO-1-(IgG; Dhein et al. de 1992, J. Immunol., 149:31663173).

[019] A apoptose desempenha um papel crucial no desenvolvimento e na homeostase dos organismos multicelulares (vide, por exemplo, Danial, N.N. et. al., Cell 116:205-19 (2004)). Dois dos principais

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11/123 mecanismos de sinalização, a via celular intrínseca e extrínseca, controlam a indução da apoptose (vide, por exemplo, Strasser, A., et. al., Annu Rev Biochem 69, 217-45 (2000)). Estas vias ativam proteases de cisteína, denominadas caspases, que clivam diversas proteínas celulares que são essenciais para a integridade da célula. As caspases reconhecem sequências tetrapeptídicas específicas contendo aspartato e clivam a ligação do peptídeo adjacente (vide, por exemplo, Thornberry, N.A. et. al., Science 281, 1312-6 (1998)). A ativação da via extrínseca celular ocorre em resposta a ligantes como, por exemplo, ligante de Fas (FasL) e ligante de Apo2 / ligante indutor de apoptose relacionado com TNF (Apo2L/TRAIL), por intermédio dos seus respectivos “receptores de morte” Fas na superfície celular (Apo1/CD95 ) e DR4 ou DR5 (vide, por exemplo, Nagata, S. Cell 288:355-65 (1997) e LeBlanc, H.N. et. al., Cell Death Differ 10:66-75 (2003)). O acoplamento do ligante ativa o recrutamento do adaptador FADD (domínio de morte associada a Fas) para um domínio de morte na cauda do receptor citoplasmático. O FADD recruta a protease iniciadora da caspase-8 para formar o “complexo de sinalização de indução de morte” (DISC) (vide, por exemplo, Kischkel, F.C. et al. EMBO J 14:5579-88 (1995)). Moléculas próximas à caspase-8 no DISC estimulam a atividade enzimática, resultando no auto-processamento (vide, por exemplo, Boatright, K.M. et al. Mol Cell 11:529-41 (2003)). A caspase-8 clivada é então liberada do DISC para o citoplasma e ativa proteoliticamente as caspases efetoras, tais como a caspase-3 e caspase-7. Em certos tipos de células a estimulação DR gera forte atividade da caspase-8, que ativa fortemente as caspases efetoras levando a célula à apoptose (vide, por exemplo, Scaffidi, C, et. al., J Biol Chem 274:1541-8 (1999)). Outros tipos celulares exigem amplificação de sinal pela via intrínseca: a caspase-8 cliva apenas a proteína Bid (BH3) domínio 3 de homologia à Bcl-2, que acopla a via intrínseca através do domínio multi-BH das proteínas Bax e Bak, reforçando a ativação da

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12/123 caspase efetora e da apoptose (vide, por exemplo, Danial, N.N. et. al., Cell 116:205-19 (2004) e Strasser, A., et. al., Annu Rev Biochem 69:217-45 (2000)).

[020] A apoptose é comumente caracterizada pela condensação e, marginalização da cromatina nuclear, e fragmentação da estrutura nuclear formando os chamados corpos apoptóticos. Este aspecto morfológico da apoptose pode ser observado através de colorações convencionais, corantes que se acumulam seletivamente nos núcleos, tais como iodeto de propídio ou Hoechst 33258, ou podem ser observados também por microscopia eletrônica. A fragmentação internucleossomal do DNA, que está frequentemente ligada, mas não é diagnóstica para, a morte celular por apoptose é também utilizada para identificar e quantificar a apoptose.

Descrição Resumida da Invenção [021] Os requerentes identificaram fragmentos de proteínas geradas em células sofrendo o processo de apoptose, que podem ser utilizadas como biomarcadores de morte celular por apoptose. Exemplos de realização da presente invenção fornecem métodos e materiais para a observação destes fragmentos protéicos, a fim de, por exemplo, observar a morte de células apoptóticas em células de mamíferos expostas a um ou mais agentes indutores de apoptose. Em um exemplo de realização ilustrativo da presente invenção, estes biomarcadores de apoptose são observados em células de câncer humano com o intuito de avaliar a eficácia de uma terapia que inclui a administração de um agente indutor de apoptose, como Apo2L/TRAIL, Fas-L ou um agonista de Apo2L/TRAIL ou FasL.

[022] Os requerentes da invenção possuem uma série de exemplos de realizações. Um exemplo de realização da presente invenção é um método para a detecção da apoptose em células de mamíferos, caracterizado pela exposição de um dos componentes da célula a um anticorpo que se liga a um fragmento de proteína produzido durante a apoptose, onde o

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13/123 anticorpo se liga a um fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4); determinando a quantidade de anticorpo que se ligou ao fragmento de proteína produzido durante a apoptose; e comparando a quantidade de anticorpos ligados nesta etapa com a quantidade de anticorpos que se ligou ao fragmento de proteína em uma célula de mamífero que não esta sofrendo apoptose, de modo que se esta quantidade for superior a quantidade encontrada nas células livres de apoptose, então a apoptose é detectada. Opcionalmente, as células de mamíferos examinados por este método são células humanas de câncer de cólon, colorretal, pulmão, mama, próstata, bexiga, rim, ovário, cérebro, melanoma, leucemia ou mieloma.

[023] Conforme descrito em detalhes abaixo, os métodos da invenção podem ser utilizados para observar a apoptose iniciada por uma série de diferentes receptores celulares. Em alguns exemplos de realização deste método, a apoptose nas células é desencadeada pelo receptor de morte 4 (SEQ ID NO: 5) ou receptor de morte 5 (SEQ ID NO: 6), por exemplo, pela exposição da célula com Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7) ou com um anticorpo que se liga ao receptor de morte 4 (SEQ ID NO: 5) ou receptor de morte 5 (SEQ ID NO: 6). Em outros exemplos de realização da presente invenção, a apoptose de células é iniciada pelo Fas (SEQ ID NO: 8), por exemplo, expondo a célula com FasL (SEQ ID NO: 9) ou com um anticorpo que se liga a Fas.

[024] Os métodos da invenção podem ainda ser adaptados para serem utilizados em diversos contextos. Por exemplo, este método de observação da apoptose pode ser utilizado para avaliar a sensibilidade de uma célula à Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7) ou de um anticorpo que se liga ao receptor de morte 4 (SEQ ID NO: 5) ou receptor de morte 5 (SEQ ID NO: 6). Em um exemplo específico da presente invenção, estes métodos podem ser usados para avaliar a eficácia da terapia que compreende a administração de

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Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7) ou um anticorpo que se liga ao receptor de morte 4 (SEQ ID NO: 5) ou receptor de morte 5 (SEQ ID NO: 6). Do mesmo modo, outros exemplos de realização da presente invenção podem ser utilizados para analisar a sensibilidade das células ao FasL (SEQ ID NO: 9) ou a um anticorpo que se liga a Fas, por exemplo para avaliar a eficácia de uma terapia que compreende a administração de FasL (SEQ ID NO: 9) ou um anticorpo que se liga a Fas.

[025] Como discutido em detalhe abaixo, os métodos da invenção podem observar a fragmentação apoptótica de uma série de proteínas diferentes dentro de uma célula usando qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas no estado da técnica, como imunoensaios utilizando anticorpos direcionados a um ou mais destes fragmentos apoptóticos. Por exemplo, em certas realizações da presente invenção o anticorpo se liga a um fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), por exemplo, um fragmento de cerca de 64 kDa ou 33 kDa. Em alguns exemplos de realização da presente invenção, o fragmento de proteína de AP2-a ligada pelo anticorpo compreende DVFD da SEQ ID NO: 1 ou GPAA da SEQ ID NO: 1. Outros exemplos de realização da presente invenção podem utilizar um anticorpo que se liga a um fragmento de cadeia pesada da proteína clatrina (SEQ ID NO: 2). Outros exemplos de realização da presente invenção podem utilizar um anticorpo que se liga a um fragmento de proteína AP1/2P (SEQ ID NO: 3). Outros exemplos de realização da presente invenção podem utilizar um anticorpo que se liga a um fragmento de proteína dinamina (SEQ ID NO: 4).

[026] Certos exemplos de realização da presente invenção são adequados para analisar um tipo específico de atividade apoptótica e/ou apoptose em um contexto fisiológico específico. Por exemplo, exemplos de realização da presente invenção podem ser utilizados para observar a apoptose em células de mamíferos mediada pelo receptor de morte 4 (SEQ ID

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NO: 5), receptor de morte 5 (SEQ ID NO: 6) ou Fas (SEQ ID NO: 8). Tipicamente, esses métodos incluem a exposição de célula a um receptor de morte 4, receptor de morte 5 ou ligante de Fas; avaliando as células expostas ao ligante pela presença de fragmentos da proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4); comparando a quantidade de fragmento de proteínas na célula com a quantidade de fragmento de proteínas em células controle não expostas ao ligante; onde a apoptose é observada quando a quantidade de fragmentos de proteínas presentes na célula exposta ao ligante é maior do que a quantidade de fragmentos de proteína na célula controle não exposta ao ligante. Normalmente, nestes métodos, o ligante do receptor de morte 4, 5 ou Fas é o Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7), um anticorpo que se liga ao receptor de morte 4, 5 ou FasL (SEQ ID NO: 9) ou um anticorpo que se liga a Fas.

[027] Outros exemplos de realização da presente invenção incluem a observação da sensibilidade de uma célula de mamífero à Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7) ou FasL (SEQ ID NO: 8) na apoptose induzida pela exposição de uma célula de mamífero à Apo2L/TRAIL ou FasL; examinando a célula exposta à Apo2L/TRAIL ou FasL na presença de fragmentos de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4); comparando a quantidade de fragmento de proteínas na célula de mamífero com a quantidade de fragmento de proteínas em uma célula de mamífero não exposta à Apo2L/TRAIL ou FasL; onde a apoptose é observada quando a quantidade de fragmentos de proteínas presentes na célula exposta ao Apo2L/TRAIL ou FasL é maior do que a quantidade de fragmentos de proteína na célula controle não exposta ao Apo2L/TRAIL ou FasL.

[028] Exemplos de realizações da presente invenção também fornecem artigos de manufatura e kits que incluem anticorpos que se ligam um

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16/123 fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4). Um exemplo de realização ilustrativo é um kit para caracterizar uma célula de mamíferos, onde o kit é composto por: um primeiro anticorpo que se liga a um fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4), um segundo anticorpo que se liga a um fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4), no qual o primeiro e o segundo anticorpos não se ligam ao mesmo epítopo (e opcionalmente não se ligam à mesma proteína), um recipiente para (a) e (b) e instruções para o uso do kit.

Breve Descrição das Figuras [029] A Figura 1 demonstra que a Apo2L/TRAIL induz a clivagem seletiva da maquinaria de endocitose dependente de clatrina. (a) As células foram tratadas a 37°C tanto com Apo2L/TRAIL trimérica (Colo205, HTC8) ou anticorpo reticulado, marcado com Apo2L/TRAIL (BJAB, Hela-M) e as células lisadas foram analisadas por imunoblot para a clivagem de caspase-8 (C8), caspase-3 (C3), adapitina (AP)2a, AP1/2P (o anticorpo não distingue as isoformas 1 e 2 da AP), cadeia pesada de clatrina (CHC), ou receptor Tf (TfR). (b) Células Colo205 foram tratadas como em (a) e analisadas por imunoblot para o processamento de componentes específicos de diversos tipos de transporte endocítico associado à clatrina.

[030] A Figura 2 demonstra o envolvimento de diferentes caspases na clivagem de AP2a e CHC. (a) Células BJAB foram tratadas com o inibidor pan-caspase zVAD-fmk (20 μΜ, 30 minutos) seguido pela reticulação com Apo2L/TRAIL (^g/mL) e analisadas por imunoblot para o processamento da caspase-8, caspase-3, AP2a e CHC. As setas abertas indicam produtos da clivagem e as setas fechadas indicam proteínas de comprimento total. (b-d)

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Células HCT116 Bax~ ou Bax+^- ou células MCF-7 deficientes de caspase-3 foram tratadas com Apo2/TRAIL e analisadas da mesma forma que em (a).

[031] A Figura 3 demonstra que o pré-tratamento com Apo2L/TRAIL inibe a endocitose Tf. (a,b) Células BJAB (a) ou Células Colo205 (b) foram pré-tratadas a 37°C com (a) ou sem (b) reticulação ao Apo2/TRAIL para os tempos indicados e resfriadas em gelo. As células foram então mantidas no gelo por 30 minutos. com Alexa-647 conjugado com Tf (TF⁶⁴⁷) e a captação a 37°C foi mensurada por citometria de fluxo. Cada valor de endocitose foi obtido a partir da curva da fase linear inicial de um gráfico da cinética de captação de 4 minutos (a, detalhe). As taxas foram normalizadas para que o observado na ausência de Apo2L/TRAIL (círculos brancos), fosse comparável à observada quando o ligante foi excluído na etapa de préincubação, mas presente durante a incubação da fase Tf no ensaio (diamantes negros, 0 minutos). (c) Células BJAB foram pré-expostas ao veículo DMSO ou zVAD-fmk por 30 minutos, e então tratadas por 4 horas com Apo2L/TRAIL reticulado, mantidas no gelo e analisadas pela taxa de endocitose de TF⁶⁴⁷ em (a) e (b). As taxas foram normalizadas para a amostra tratada com DMSO (±EPM).

[032] A Figura 4 apresenta uma caracterização da endocitose DR5. (a, b) Células Colo205 com mAb 5C7⁶⁴⁷ ligadas a suas superfícies foram incubadas em gelo por 30 minutos na ausência (diamantes), na presença (quadrados) de 10 pg/ml de trimérico ou reticulado com Apo2L/TRAIL, em seguida a temperatura foi modificada depois para 37°C pelo tempo indicado e rapidamente resfriadas com gelo. A fluorescência da superfície foi removida por meio da remoção com ácido e a captação de DR5 foi quantificada por citometria de fluxo. Os valores médios foram plotados (± EPM, em (b)). (c) Células Hela-m foram incubadas a 37°C com 5 pg/ml 5C7⁶⁴⁷ e 5 pg/ml de Apo2L/TRAIL reticulado, em seguida processados para microscopia de

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18/123 imunofluorescência (Bar: 20 μΜ). (d) Células Colo205 foram pré-equilibradas a 37°C com mAb 5C7 não marcado por 30 minutos para a ligação à superfície e reciclagem de um pool de DR5. As incubações foram mantidas com ou sem 10 μς/ml de Apo2L/TRAIL e, em seguida, as células foram rapidamente refrigeradas em gelo. A superfície celular exposta ao mAb 5C7 foi sondada com anticorpo CY5 anti-IgG de camundongo, quantificadas por citometria de fluxo e as médias foram colocadas na planilha (±EPM). (e) Células Colo205 foram pré-tratadas a 37°C com 10 μς/ml de Apo2L/TRAIL, e em seguida rapidamente refrigerada em gelo e realizada a análise para endocitose em (5C7⁶⁴⁷) Figura 3b e (Tf⁶⁴⁷). A taxa de endocitose foi normalizada pelo valor da célula sem tratamento prévio com Apo2L/TRAIL (± EPM). Resultados semelhantes foram observados quando as células foram preparadas como em (c) e o ensaio de endocitose com Fab anti-CY5 de camundongo ligado a superfície. (f-h) Células Colo205 com mAb 5C7 ligadas à superfície foram incubadas em gelo com Apo2L/TRAIL, e elevada a 37°C por 5 minutos e fixada. Cortes ultrafinos foram marcados com anticorpo de coelho anti-IgG de camundongo e Proteína A ouro (10 nm). O revestimento de clatrina tipicamente eletrodensos é indicado por setas. P = membrana plasmática. Escala das barras, 200 nm.

[033] A Figura 5 mostra que a inativação da dinamina inibe a endocitose DRS. (a-d) Células Hela com transferência de Dyn^G273D foram selecionadas com puromicina, a -induzida por doxiciclina, pré-incubadas por 20 minutos na temperatura indicada, em seguida, incubadas por mais 20 minutos, na presença de Tf (Tf⁴⁸⁸) conjugado com Alexa-488. As células foram então processadas para Microscopia de imunofluorescência utilizando um anticorpo específico para dinamina-1. (e, f) Células BJAB clonais transfectadas com Dyn^G273D ou não transfectadas (parentais) com (+ dox) ou sem (no dox) indução com doxiciclina foram testadas pela captação de Tf⁴⁸⁸ ou 5C7⁶⁴⁷, por um

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19/123 período de 20 minutos a 30°C (barras brancas) ou 38°C (barras pretas) por citometria de fluxo e as médias foram tabeladas (± DP).

[034] A Figura 6 exibe que a inativação da dinamina aumenta a ativação da caspase mediada por DR e a apoptose. (a) Células BJAB clonais transfectadas com Dyn^G273D, com ou sem indução com doxiciclina foram incubadas a 38°C por 20 minutos para inativar a dinamina como na figura 5, em seguida, incubadas por mais 4 horas com ou sem Apo2L/TRAIL reticulada e analisadas por imunoblot para avaliar o processamento das proteínas indicadas, (b) Células BJAB transfectadas com Dyn^G273D, com ou sem indução com doxiciclina foram incubadas a 30°C ou 38°C por 20 minutos, em seguida, incubadas por mais 2 horas com ou sem Apo2L/TRAIL reticulado e foi mensurada a atividade da caspase-3/7. (c) Células BJAB transfectadas com Dyn^G273D, com ou sem indução com doxiciclina foram pré-incubadas a 38°C por 20 minutos, em seguida, incubadas um adicionalmente por 4 horas com ou sem Apo2L/TRAIL reticulada ou um Apo2L/TRAIL mutado seletivo para DR5 (D5-sel.) e a fragmentação do DNA, foi mensurada (± EPM).

[035] A Figura 7 exibe o processamento dos componentes da via da clatrina em linhagens de células de câncer, (a) As linhagens de célula indicadas foram tratadas com Apo2L/TRAIL e a clivagem de AP2a ou CHC foram analisadas por imunoblot. (b) Células BJAB foram tratadas com Apo2L/TRAIL ou FasL reticulados e o processamento da AP2a ou CHC foi analisado por imunoblot. (c) Células BJAB foram tratadas com Apo2L/TRAIL reticulados e o processamento da dinamina foi determinado por imunoblot.

[036] A Figura 8 mostra a necessidade da Caspase para a clivagem de AP2a e CHC. (a) Células BJAB foram pré-incubadas com ou sem zVAD-fmk (20 pM, 30 minutos) e tratadas com Apo2L/TRAIL reticulado (1 pg/mL) como indicado por 24 hs. A transformação da caspase-8, caspase-9, caspase-3 e AP2a nas células foram analisadas por imunoblot. (b) As

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20/123 seguintes linhagens de células T Jurkat: A3 (tipo-selvagem), I9.2, (deficiente de caspase-8) e E1 (deficiente de FADD) foram tratadas com Apo2L/TRAIL ou FasL reticulados pelo tempo indicado, e o processamento dos componentes da endocitose mediada pela via da clatrina foi analisada como na figura 1. (c) Células HT1080 de fibrossarcoma foram transfectadas com siRNA específico da caspase-3 (C3) ou siRNA controle, tratados com Apo2L/TRAIL pelo tempo indicado, e analisadas por imunoblot para avaliar a clivagem da AP2a ou CHC ou a depleção da caspase-3 pelo siRNA.

[037] Figura 9: Determinação do sítio de clivagem da AP2a; (a) O fragmento C-terminal da AP2a clivada foi imunoprecipitado a partir de células BJAB estimuladas por Apo2L/TRAIL e digerido com tripsina e analisado por espectrometria de massa para verificar a sua identidade ou isolado por eletroforese em gel e transferido pelo método Western e submetido ao sequenciamento do N-terminal. Peptídeos trípticos foram identificados por espectrometria de massas tandem e alinhados com a sequência C-terminal de AP2a. O sequenciamento N-terminal identifica o sítio de clivagem como um motivo de reconhecimento da caspase DXXD (sublinhado). (b) A mapa do sítio de clivagem para a região de “articulação” do AP2a, que esta acoplada aos domínios funcionalmente distintos “orelha” e “tronco”.

[038] Figura 10: Os mutantes Dyn^G273D sensíveis à temperatura e Dyn^K44A dominante-negativo inibem a endocitose do Tf e DR5 em células HelaM. (a, b) Duas linhagens clonais derivadas de uma população de células HelaM transfectadas retroviralmente na fig. 6, ts3 e ts1, com (+ dox) ou sem (no dox) indução por doxiciclina foram avaliadas por citometria de fluxo a capacidade de a captação de Tf⁴⁸⁸ (A) ou 5C7⁶⁴⁷ (b) durante um período de 20 minutos a 30°C (barras brancas) ou 38°C ( barras pretas), como descrito nos procedimentos experimentais e as médias foram tabeladas (± DP). (c) células Hela-M transfectadas e não transfectadas (parentais) com Dyn^K44A com ou sem

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21/123 indução por doxiciclina foram avaliadas pela taxa da endocitose do Tf⁴⁸⁸ e 5C7⁶⁴⁷ (± DP), conforme descrito na Fig. 5d sem normatização.

[039] A figura 11 exibe a montagem de DISC na ausência de endocitose. (a) Células BJAB foram equilibradas com Tf⁶⁴⁷ no gelo, incubadas pelo período de captação indicado, a 37°C ou em gelo, em seguida, a fluorescência foi quantificada por citometria de fluxo. (b) Células BJAB foram tratadas com Apo2L/TRAIL reticulado (1 pg/mL) a 37°C ou em gelo durante o período de tempo indicado e o DISC foi imuno-precipitado através do ligante, como descrito em Materiais e Métodos. O FADD e caspase-8 associados ao DISC foram visualizados por imunoblot. (c, d) Células BJAB transfectadas com Dyn^G273D foram tratadas com tampão (no Dox) ou doxiciclina (Dox) e elevadas à 38°C por 20 minutos para inativar a dinamina. As células foram tratadas com Apo2L/TRAIL reticulado pelo período de tempo indicado e o DISC foi imunoprecipitado. O FADD e caspase-8 associados ao DISC foram visualizados por imunoblot (c) ou a atividade da caspase-8 associado ao DISC foi mensurada como descrito anteriormente (Sharp et al. J Biol Chem 280, 19401 -409, 2005).

[040] A Figura 12 demonstra que agentes que causam danos ao DNA induzem a clivagem dos componentes da via da clatrina. Células BJAB ou Colo205 foram tratadas com vimblastina ou adriamicina pelo tempo indicado e analisadas por imunoblot como na Fig. 1.

Descrição Detalhada Da Invenção [041] As técnicas e os procedimentos descritos neste documento ou referenciados são em geral bem compreendidos e comumente empregados utilizando metodologias convencionais pelos técnicos hábeis no estado da técnica. Conforme necessário, os procedimentos que envolvem a utilização de reagentes e kits disponíveis comercialmente serão realizados de acordo com os protocolos e/ou parâmetros definido pelo fabricante a manos que apontado de outra forma. Salvo quando definido de outra maneira, todos os termos do

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22/123 estado da técnica, anotações e outras terminologias científicas utilizadas na presente invenção são destinados para descrever o sentido e significado aos técnicos conhecedores do estado da técnica ao qual pertence a presente invenção. Em alguns casos, termos com significados comumente entendidos são aqui definidos por motivo de clareza e/ou rápida referência, e a inclusão de tais definições neste documento não devem necessariamente ser interpretadas de forma a representar uma diferença substancial sobre o qual é geralmente entendido no estado da técnica. Além disso, certas abreviações são usadas neste documento, incluindo: 488 -: conjugado com Alexa 488; 647 -: conjugado com Alexa -647; Apo2L/TRAIL: ligante de Apo2 / ligante indutor de apoptose relacionado com TNF; BSA: albumina sérica bovina; DR: receptor de morte; PBS: tampão fosfato salina; Tf: transferrina; e zVAD-fmk: N-benziloxicarbonilVal-Ala-Asp-fluorometilcetona.

I. Definições [042] O termo “apoptose” e “atividade apoptótica” são usados no sentido amplo e refere-se à morte celular ordenada ou controlada em mamíferos que é tipicamente acompanhada por uma ou mais alterações celulares características, incluindo a condensação do citoplasma, perda da microvilosidade da membrana plasmática, segmentação do núcleo, degradação do DNA microssomal ou perda da função mitocondrial. Esta atividade pode ser determinada e mensurada usando técnicas, por exemplo, pelo ensaio de viabilidade celular, análise FACS ou eletroforese de DNA e mais especificamente pela ligação da anexina V, fragmentação do DNA, retração celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de vesículas da membrana (chamadas de corpos apoptóticos).

[043] Os termos ligante de Apo-2, Apo-2L, ou “TRAIL” são utilizados no presente pedido para se referir ao polipeptídeo que inclua os resíduos 95-281, inclusive 114-281, inclusive os resíduos 91-281, inclusive os

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23/123 resíduos 92-281, inclusive os resíduos 41-281, inclusive os resíduos 15-281, inclusive os resíduos 1-281, inclusive a sequência de aminoácidos demonstrado na figura 1A de Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996), bem como fragmentos biologicamente ativos e variantes delecionais, insercionais, e substitucionais das sequências acima. Em uma incorporação, a sequência polipeptídica compreende dos resíduos 114-281. Opcionalmente, a sequência polipeptídica tem pelo menos os resíduos 91-281 ou resíduos 92281. Em outra incorporação preferida, os fragmentos biologicamente ativos ou variantes tiveram a identidade da sequência de aminoácidos de pelo menos 80% aproximadamente, mais preferencialmente a identidade da sequência de aminoácidos de ao menos 90% aproximadamente e mais preferencialmente ainda a identidade da sequência de aminoácidos de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com qualquer uma das sequências acima. A definição abrange variantes substitucionais do ligante Apo-2 compreendendo de aminoácidos 91-281 da fig. 1A de Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996) em que ao menos um dos aminoácidos nas posições 203, 218 ou 269 (usando a numeração da sequência fornecida em Pitti et al.) são substituídos por resíduos de alanina. A definição abrange o ligante Apo-2 isolado de uma fonte de ligante Apo-2, como de tipos de tecidos humanos ou de outra fonte ou preparado por métodos sintéticos recombinantes. O termo ligante Apo-2 também se refere ao polipeptídeo descrito no WO 97/25428, supra, e WO97/01633, supra.

[044] O receptor do ligante Apo-2 inclui os receptores referidos no estado da técnica como DR4 e DR5. Pan et al. descreveram o membro da família do receptor de TNF referido como DR4 (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); vide também o Documento WO98/32856 publicado em 30 de julho de 1998). O receptor DR4 foi reportado por conter um domínio citoplasmático de morte capaz de acoplar o instrumento do suicídio da célula.

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Pan et al. divulgaram que o DR4 é acreditado como sendo um receptor para o ligante conhecido como Apo2L/TRAIL. Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) e Pan et al., Science, 277:815-818 (1997) descreveram outro receptor para Apo2L/TRAIL (vide também, WO98/51793 publicado em 19 de novembro de1998; WO98/41629 publicado em 24 de setembro de 1998). Este receptor é referido como DR5 (o receptor foi referido alternativamente também como Apo2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 ou KILLER; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO98/35986 publicado em 20 de agosto de 1998; EP870,827 publicado em 14 de outubro de 1998; WO98/46643 publicado em 22 de outubro de 1998; WO99/02653 publicado em 21 de janeiro de 1999; WO99/09165 publicado em 25 de fevereiro de 1999; WO99/11791 publicado em 11 de março de 1999). Como DR4, DR5 é reportado por conter um domínio citoplasmático de morte e ser capaz de sinalizar a apoptose. Como descritos acima, outros receptores para Apo-2L incluem DcR1, DcR2, e OPG (vide, Sheridan et al., supra; Marsters et al., supra; e Simonet et al., supra). O termo receptor Apo-2L quando usado no presente pedido abrange a sequência nativa e variante do receptor. Estes termos abrangem o receptor de Apo-2L expresso em uma variedade dos mamíferos, incluindo humanos. O receptor de Apo-2L pode ser expresso endogenamente como ocorre naturalmente em uma variedade de linhagem de tecidos humanos, ou pode ser expresso por métodos recombinantes ou sintéticos. Uma sequência nativa do receptor Apo-2L compreende de um polipeptídeo que tem a mesma sequência de aminoácido que um receptor de Apo-2L derivado da natureza. Assim, uma sequência nativa do receptor Apo-2L pode ter a sequência de aminoácido do receptor natural de Apo-2L de qualquer mamífero. Tal sequência nativa do receptor Apo-2L pode ser isolada da natureza ou pode ser produzido por métodos recombinantes ou sintéticos. O termo sequência nativa do receptor

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Apo-2L abrange especificamente truncados derivado da natureza ou forma secretadas do receptor (por exemplo, um forma solúvel que contêm, por exemplo, uma sequência do domínio extracelular), formas naturais variantes (por exemplo, formas com splicing alternativos) e variantes alélicos naturais. Os receptores variantes podem incluir fragmentos ou deleções mutantes da sequência nativa do receptor Apo-2L.

[045] O termo Fas é utilizado no presente pedido para se referir ao polipeptídeo que inclua os resíduos de aminoácidos 1-319 como mostrado no N° de Acesso NCBI AAA63174 e descrito em Itoh et al. , Cell 66 (2):233-243 (1991), bem como fragmentos biologicamente ativos e variantes delecionais, insercionais, e substitucionais das sequências acima. Este polipeptídeo é denominado como “Apo-1” e “CD95”, em certas referências no estado da técnica. O termo “ligante de Fas” ou “FasL” é utilizado no presente pedido para referir-se a um polipeptídeo que inclui os resíduos de aminoácidos 1-281 como exibido no N° de acesso do NCBI NP_000630 e descrito em Suda et al., Cell 75 (6):1169-1178 (1993), bem como fragmentos biologicamente ativos e variantes delecionais, insercionais, e substitucionais da sequência acima. A ligação do FasL ao Fas, ou ligação cruzada do Fas com um anticorpo agonístico de Fas induz a apoptose de células resultando na morte (vide, por exemplo, Nagata, S. Ann. Rev. Genet. 33:29, 1999; e Labroille et al., Cytometry 39 (3):195-202 (2 000)). A ligação de FasL ao Fas ativa uma cascata de caspases via um adaptador FADD (domínio de morte com proteína associada a Fas), que conduz a uma clivagem de diversos substratos celulares e a fragmentação de DNA.

[046] “Percentual (%) de identidade de sequências de aminoácidos” com respeito às sequências de polipeptídeo identificadas no presente pedido é definida como percentual de identidade de sequências de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido em uma sequência, após o alinhamento das sequências e

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26/123 introdução dos gaps, se necessário, para conseguir a porcentagem de identidade máxima e não considerar todas as substituições conservadoras como a parte da identidade da sequência. O alinhamento para a finalidade de determinar a porcentagem de identidade da sequência de aminoácidos pode ser conseguido de várias maneiras que estão dentro de habilidades no estado da técnica, por exemplo, usando softwares de computador públicos disponíveis, como pro exemplo, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Aqueles hábeis no estado da técnica podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de medição, incluindo todos os algoritmos necessários para conseguir o alinhamento máximo sobre toda extensão das sequências que estão sendo comparadas. Opcionalmente, os valores da % da sequência de aminoácidos idênticas são obtidos usando o programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2 foi desenvolvido pela Genentech, Inc. e o código de fonte foi depositado com a documentação do usuário no Escritório Norte Americano de Direitos Autorais, Washington, DC, 20559 Estado Unidos, onde está registrado sob o n° de registro de direitos autorais Norte Americano TXU510087. O programa ALIGN-2 esta publicamente disponível pela Genentech Inc., South San Francisco, Califórnia. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para o uso em um sistema operacional UNIX, preferivelmente o UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros da comparação da sequência são ajustados pelo programa ALIGN-2 e não variam. Entretanto, a % da sequência de aminoácidos idêntica pode ser também determinada usando o programa de comparação de sequência NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). O programa de comparação de sequência NCBI-BLAST2 pode ser baixado do http://www.ncbi.nlm.nih.gov. O NCBIBLAST2 usa diversos parâmetros de busca, em que todos os parâmetros de busca são ajustados aos valores padrão incluindo, por exemplo, unmask = yes,

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27/123 strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0.01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 e scoring matrix = BLOSUM62.

[047] O termo “anticorpo” é utilizado no presente pedido no sentido mais amplo e incluem especificamente anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmento de anticorpos. A expressão “anticorpo monoclonal”, da forma como utilizada no presente pedido, designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou ligam o mesmo epítopo, exceto por possíveis variantes que surgem durante a produção do anticorpo monoclonal, em que tais variantes estão geralmente presentes em quantidades menores. Anticorpos monoclonais são altamente específicos e se ligam diretamente com um único sítio antigênico. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpos policlonais que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante sobre o antígeno. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos pelo fato de poderem ser sintetizados por cultura de hibridoma, não sendo contaminados por outras imunoglobulinas. O adjetivo “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea e não deve ser considerado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser preparados por meio do método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser fabricados por meio de métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, US

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4.816.567). Os “anticorpos monoclonais” podem também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos, utilizando as técnicas descritas, por exemplo, em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991). Anticorpo “que liga” ao antígeno de interesse, é aquele capaz de ligar a tal antígeno com afinidade suficiente para que o anticorpo seja útil como agente terapêutico marcando a célula que expressa o antígeno.

[048] “Anticorpo para receptor de Morte” é geralmente utilizado no presente pedido para designar um anticorpo ou anticorpos direcionados a um receptor pertencente a superfamília do receptor do fator de necrose tumoral que contém uma domínio de morte capaz de sinalização a apoptose, e esses anticorpos incluem anticorpo DR5, anticorpo DR4 e anticorpos anti-Fas.

[049] “Anticorpo para receptor DR5”, “anticorpos DR5” ou anticorpo anti-DR5” é usado no sentido amplo para se referir a anticorpos que se ligam a pelo menos uma forma do receptor DR5. Opcionalmente o anticorpo DR5 está fundido ou é ligado a uma molécula ou sequência heteróloga. Preferencialmente a sequência heteróloga permite ou ajuda o anticorpo a formar complexos de ordem superior ou oligoméricos. Opcionalmente, o anticorpo DR5 se liga a receptores DR5 mas não se liga nem reage cruzadamente com qualquer receptor adicional de Apo-2L (por exemplo, DR4, DcRl, ou DcR2). Opcionalmente o anticorpo é um agonista da atividade de sinalização de DR5 (vide, por exemplo, os pedidos de Patentes US 20040005314 e US 20060188498).

[050] “Anticorpo para receptor DR4”, “anticorpos DR4” ou anticorpo anti-DR4” é usado no sentido amplo para se referir a anticorpos que se ligam a pelo menos uma forma do receptor DR4. Opcionalmente o anticorpo DR4 está fundido ou é ligado a uma molécula ou sequência heteróloga. Preferencialmente a sequência heteróloga permite ou ajuda o anticorpo a formar complexos de ordem superior ou oligoméricos. Opcionalmente, o

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29/123 anticorpo DR4 se liga a receptores DR4, mas não se liga nem reage cruzadamente com qualquer receptor adicional de Apo-2L (por exemplo, DR5, DcRl, ou DcR2). Opcionalmente o anticorpo é um agonista da atividade de sinalização de DR4 (vide, por exemplo, os pedidos de Patentes US 20040005314 e US 20060188498).

[051] “Anticorpos Fas” ou “anticorpos anti-Fas” são utilizados no presente pedido no sentido amplo para se referir a anticorpos que se ligam a pelo menos uma forma de Fas ou domínio extracelular deste. Opcionalmente o anticorpo Fas está fundido ou é ligado a uma molécula ou sequência heteróloga. Preferencialmente a sequência heteróloga permite ou ajuda o anticorpo a formar complexos de ordem superior ou oligoméricos. Opcionalmente, o anticorpo Fas se liga ao receptor Fas, mas não se liga nem reage cruzadamente com qualquer receptor adicional de FasL. Opcionalmente o anticorpo é um agonista da atividade de sinalização de Fas (vide, por exemplo, Nagata, S. Ann. Rev. Genet. 33:29, 1999; e Labroille et al., Cytometry 39 (3):195-202 (2000)).

[052] Os anticorpos monoclonais no presente pedido incluem especificamente anticorpos “quiméricos” (imunoglobulinas), em que uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica, ou pertencentes a uma classe ou subclasse específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (US 4.816.567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

[053] As formas “humanizadas” de anticorpos não-humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas

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30/123 ou fragmentos destas (como por exemplo, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outros anticorpos subseqüentes que se ligam ao antígeno) que contêm a sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos da região determinada por complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de um CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos nãohumanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem nas sequências importadas do CDR ou da estrutura. Estas modificações são feitas para refinar e maximizar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondam aos de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado ótimo também compreenderá de pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) da imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). O anticorpo humanizado inclui um anticorpo PRIMATIZED™ em que a região do anticorpo de ligação com o antígeno é derivada de um anticorpo produzido pela imunização de macacos do tipo macaque com o antígeno do interesse.

[054] Anticorpos são tipicamente proteínas ou polipeptídeos que apresentam especificidade de ligação a um antígeno específico. Anticorpos nativos são geralmente glicoproteínas heterotetraméricas composta de duas

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31/123 cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Tipicamente, Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto o número de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isótopos de imunoglobulina. Cada cadeia leve e pesada também contém pontes dissulfeto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada contém, em uma extremidade, um domínio variável (Vh) seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve contém um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve é alinhado ao domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácidos específicos formam uma superfície intermediária entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. (Chothia et al., J. Mol. Biol., 186:651-663 (1985); Novotny e Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596 (1985)). As cadeias leves de anticorpos de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, anticorpos podem ser atribuídos a classes diferentes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de anticorpos são denominados alfa, delta, épsilon, gama, e mu, respectivamente.

[055] “Fragmentos de anticorpos” compreendem uma porção de anticorpo intacto, que compreende, preferencialmente, um sítio de ligação de antígenos. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab',

F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia

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32/123 única e anticorpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticorpos.

[056] O termo “variável” é utilizado no presente pedido para descrever que certas porções dos domínios variáveis diferem extensamente na sequência entre os anticorpos e são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico ao seu antígeno específico. Entretanto, a variabilidade não é, entretanto, distribuída regularmente ao longo dos domínios variáveis de anticorpos. É tipicamente concentrado em três segmentos denominados de regiões determinadas por complementaridade (CDRs) ou regiões hiervariáveis nos domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. As porções altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas de região de estrutura (FR). Os domínios variáveis de cadeias leve e pesada nativas compreendem quatro FRs cada um, adotando em grande parte uma configuração folha-β, conectadas por três CDRs, que formam alças que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura folha-β. Os CDRs de cada cadeia são mantidas unidas em boa proximidade pelas FRs e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígenos de anticorpos (vide, Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem diversas funções efetoras, tais como a participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpos.

[057] Os anticorpos monoclonais no presente pedido incluem os anticorpos quiméricos, híbridos e recombinantes produzidos pelo splicing do domínio variável (incluindo hipervariável) de um anticorpo anti-receptor Apo-2L com um domínio constante (por exemplo, anticorpos humanizados), ou uma cadeia leve com uma cadeia pesada, ou uma cadeia de uma espécie com uma cadeia de outra espécie, ou de fusões com proteínas heterólogas, não obstante a espécie de origem ou da classe ou da subclasse das imunoglobulinas, bem como

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33/123 fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, F(ab')2, e Fv), contanto que eles apresentem a atividade ou as propriedades biológicas desejadas. Vide, por exemplo, patente US 4.816.567 e Mage et al., em Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97 (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987).

[058] Um “anticorpo humano é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponda aquela de um anticorpo produzido por um ser humano ou/e seja feita usando algumas das técnicas para fazer anticorpos humanos como divulgado no presente pedido. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende de resíduos não humanos de ligação ao antígeno. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando as várias técnicas conhecidas. Em uma incorporação, o anticorpo humano é selecionado de uma biblioteca de fagos, em que essa biblioteca de fagos expressa anticorpos humanos. (Vaughan et al. Nature Biotechnology, 14:309-314 (1996): Sheets et al. PNAS, (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Os anticorpos humanos podem também ser feitos pela introdução do loci da imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos em que os genes das imunoglobulinas endógena estiveram parcialmente ou completamente inativas. Mediante desafio, é observada a produção de anticorpos humanos, que relembra de perto a observada em humanos em todos os aspectos, incluindo a rearranjo gênico, montagem e repertório de anticorpos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas patentes US 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, e nas seguintes publicações científicas: Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995).

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Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado via imortalização de linfócitos B humanos produzindo um anticorpo direto contra o antígeno alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo ou podem ter sidos imunizados in vitro). vide, por exemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991); e patente US 5.750.373.

[059] O termo região Fc é usado definir a região do C-terminal de uma cadeia pesada da imunoglobulina que possa ser gerada pela digestão da papaína em um anticorpo intacto. A região de Fc pode ser uma sequência nativa ou variante da região Fc. Embora os limites da região Fc da cadeia pesada de uma imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada da IgG humana é normalmente definida como se estendendo a partir de um resíduo de aminoácidos por volta da posição Cys226, ou por volta da posição Pro230, até a região carboxi-terminal da região Fc. (usando no presente pedido o sistema de numeração de acordo com Kabat et al., supra). A região de Fc de uma imunoglobulina compreende geralmente dois domínios constantes, um domínio CH2 e um domínio CH3, e compreende opcionalmente um domínio CH4.

[060] Cadeia da região Fc no presente pedido significa uma das duas cadeias de polipeptídio da região Fc.

[061] O “domínio CH2” de uma região Fc da IgG humana (também referida como o domínio “Cy2”) estende geralmente de um resíduo de aminoácido aproximadamente na posição 231 a um resíduo do aminoácido perto da posição 340. O domínio CH2 é exclusivo por não parear-se fortemente com outro domínio. Por outro lado, duas cadeias de carboidratos ramificadas N-ligadas são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula intacta de IgG nativa. Especula-se que o carboidrato pode fornecer um substituto para o pareamento entre domínios e ajuda estabilizar o domínio CH2. Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985). O domínio CH2 no presente pedido pode ser uma

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35/123 sequência nativa ou variante do domínio CH2.

[062] O domínio CH3 compreende a extensão do resíduo Cterminal de um domínio CH2 em uma região Fc (isto é, um resíduo do aminoácido aproximadamente na posição 341 a um resíduo do aminoácido na posição 447 de uma IgG). A região CH3 no presente pedido pode ser uma sequência nativa ou variante do domínio CH3 (por exemplo, um domínio CH3 com uma protuberância” introduzida em uma de suas cadeias e uma “cavidade” introduzida na outra cadeia deste, vide a patente US 5.821.333).

[063] “Região de articulação” é definida geralmente como a estendendo-se de cerca de Glu216 ou Cys226 até Pro230 da IgG1 humana (Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)). As regiões de articulação de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência IgG1 colocando o primeiro e os últimos resíduos de cisteína formando uma ligação S-S entre as cadeia pesadas nas mesmas posições. A região de articulação no presente pedido pode ser uma sequência nativa ou variante da região de articulação. As duas cadeias de polipeptídeos de uma região de articulação variante retêm geralmente pelo menos um resíduo do cisteína por cadeia polipeptídica, de modo que as duas cadeias de polipeptídeos da região de articulação variante possam formar uma ligação de dissulfeto entre as duas cadeias. A região de articulação preferida no presente pedido é uma região de articulação humana de sequência nativa, por exemplo, uma sequência nativa da região de articulação da IgG1 humana.

[064] Uma região Fc funcional possui pelo menos uma função efetora” de uma sequência nativa da região Fc. Exemplos de função efetora inclui a ligação do componente C1q; citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação ao receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa “down regulation” dos receptores da superfície celular (por exemplo, receptor de célula

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B; BCR), etc. Tais funções efetoras requer geralmente que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável do anticorpo) e podem ser avaliadas usando os vários ensaios conhecidos no estado da técnica para avaliar tais funções efetoras do anticorpo.

[065] Uma sequência nativa da região FC compreende de uma sequência de aminoácido idêntica à sequência de aminoácido da região Fc encontrada na natureza. Uma “sequência variante da região Fc compreende uma sequência de aminoácidos que difere da sequência nativa da região Fc pelo mérito de ter pelo menos uma modificação de aminoácido. Preferencialmente, a região Fc variante tem ao menos uma substituição de aminoácido comparada a sequência da região Fc nativa ou a região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, de aproximadamente uma a dez substituições de aminoácidos, e preferivelmente de aproximadamente uma a cinco substituições de aminoácidos na sequência nativa da região Fc ou na região Fc de um polipeptídeo parental. A região Fc variante do presente possuirá preferencialmente pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental e, de maior preferência, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com ele, de maior preferência, pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência com ele.

[066] As expressões “receptor Fc” ou “FcR” são utilizadas para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas divididas desses receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um “receptor de ativação”) e FcyRIIB (um “receptor de inibição”), que possuem sequências de aminoácidos similares que diferem,

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37/123 principalmente, nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcyRIIA contém uma unidade de ativação imuno-receptora baseada em tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contém uma unidade de inibição imuno-receptora baseada em tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático (revisado em Daèron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs são revisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:45792 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Outras FcRs, incluindo aquelas a serem identificadas no futuro, são englobadas pelo termo “FcR” no presente pedido. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

[067] Anticorpo “maturado por afinidade” é aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais de suas CDRs, o que resulta em aumento da afinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação com anticorpo parental que não possui essa(s) alteração(ões). Os anticorpos maturados por afinidade preferidos possuirão afinidades nanomolares ou até picomolares para o antígeno alvo. Os anticorpos maturados por afinidade são produzidos através de procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992) descreve a maturação por afinidade através de troca de domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos de estrutura e/ou CDR é descrita por: Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154 (7): 3310-9 (1995); e Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992).

[068] O termo marcador, quando utilizado no presente pedido documento refere-se a um composto ou composição, que é acoplado ou fundido direta ou indiretamente ao reagente como um anticorpo e facilita a

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38/123 detecção do reagentes ao qual o anticorpo está acoplado ou fundido. O marcador pode ser detectável per se (por exemplo, marcador radioisótopo, marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, que pode catalisar a alteração química de uma composição composta de substrato, que é detectável.

[069] O termo “antagonista” é utilizado no sentido amplo da palavra e inclui qualquer molécula que bloqueie, iniba ou neutralize completamente ou parcialmente uma ou mais atividade biológica do Apo2L/TRAIL, DR4 ou DR5, FasL ou Fas in vitro, in sito ou in vivo. Exemplos de tais atividades biológicas do Apo2L/TRAIL, DR4 ou DR5 incluem a ligação do Apo2L/TRAIL ao DR4 ou DR5, indução da apoptose, bem como as novas atividades relatadas na literatura. Exemplos de tais atividades biológicas do FasL e Fas incluem a ligação do FasL ao Fas, indução da apoptose, bem como aquelas adicionalmente relatadas na literatura. Um antagonista pode ter função de forma direta ou indireta. Por exemplo, o antagonista pode ter a função de bloquear parcial ou totalmente, inibir ou neutralizar uma ou mais atividades biológicas de Apo2L/TRAIL, de maneira in vitro, in situ, ou in vivo, como resultado da sua ligação direta ao DR4 ou DR5. O antagonista pode também ter função indireta para bloquear parcial ou totalmente, inibir ou neutralizar uma ou mais atividades biológicas da Apo2L/TRAIL, DR4 ou DR5, in vitro, in situ, ou in vivo, como um resultado, por exemplo, de bloqueio ou inibição outra molécula efetora. A molécula antagonista pode incluir uma atividade antagonista dupla no qual a molécula é capaz de bloquear parcial ou totalmente, inibindo ou neutralizando uma atividade biológica da Apo2L/TRAIL, DR4 ou DR5, Fas ou FasL.

[070] O termo “agonista” é utilizado no sentido amplo da palavra e inclui qualquer molécula que melhore, estimule ou ative completamente ou parcialmente uma ou mais atividade biológica Apo2L/TRAIL, DR4 ou DR5,

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FasL ou Fas, in vitro, in sito ou in vivo. Exemplos de tais atividades biológicas da ligação ao Apo2L ao DR4 ou DR5, é a apoptose, bem como as novas atividades relatadas na literatura. Exemplos de tais atividades biológicas da ligação do Fas ou FasL é a ligação do FasL ao Fas, inibição da apoptose, bem como as novas atividades relatadas na literatura. Um agonista pode ter função de forma direta ou indireta. Por exemplo, o agonista pode ter a função de melhorar, estimular ou ativar parcial ou totalmente uma ou mais atividades biológicas de DR4 ou DR5, de maneira in vitro, in situ, ou in vivo, como resultado da sua ligação direta à DR4 ou DR5 que causa a ativação do receptor ou transdução de sinal. O agonista pode também ter função indireta para melhorar, estimular ou ativar parcial ou totalmente uma ou mais atividades biológicas de DR4 ou DR5, in vitro, in situ, ou in vivo, por exemplo, estimulando outra molécula efetora que culminará na ativação ou transdução de sinal de DR4 ou DR5. Contempla-se que um agonista pode atuar como um acentuador “enhancer’ que funciona indiretamente para melhorar ou aumentar a ativação ou atividade de DR4 ou DR5. Por exemplo, um agonista pode melhorar a atividade endógena do Apo-2L em um mamífero. Isto poderia ser obtido, por exemplo, pela pré-complexando DR4 ou DR5 ou estabilizando complexos nativos formado entre Apo-L2 e DR4 ou DR5.

[071] Isolado quando utilizado para descrever as várias proteínas descritas no presente pedido, indica a proteína que foi identificada e separada e/ou recuperada de um componente de seu ambiente natural. Os componentes concomitantes de seu ambiente natural são os materiais que poderiam tipicamente interferir com o uso diagnóstico ou terapêutico da proteína, e pode incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em incorporações preferidas, a proteína será purificada (1) até um grau suficiente para se obter pelo menos 15 resíduos N-terminal ou a sequência interna do aminoácido pelo uso de um sequenciador de copo de

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40/123 fiação (spinning cup), ou (2) até a homogeneidade por SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras utilizando o azul de Coomassie (Coomassie blue) ou, preferencialmente, corante prata. A proteína isolada inclui a proteína in situ dentro de células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural da proteína não estará presente. Entretanto, normalmente a proteína isolada será preparada por pelo menos uma etapa de purificação.

[072] “Atividade biológica” ou “biologicamente ativo” para das finalidades no presente pedido significa que (a) têm a habilidade de induzir ou estimular a apoptose em pelo menos um tipo de célula de mamíferos, tal como uma célula cancerosa ou células infectadas por vírus ou bactérias, in vivo ou ex vivo; (b) é capaz de aumentar os anticorpos, isto é, imunogênico; ou (c) retendo a atividade de um polipeptídeo nativo ou natural do ligante Apo-2.

[073] Um “agente inibidor de crescimento” quando usado n presente refere-se a um composto ou a uma composição que iniba o crescimento de uma célula in vitro e/ou in vivo. Assim, o agente inibidor de crescimento pode ser aquele que reduz significativamente a porcentagem de células na fase S. Os exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem os agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em outra fase com exceção da fase S), como os agentes que induzem à parada do ciclo celular em G1 parada da fase M. Os bloqueadores clássicos da fase M incluem os vincas (vincristina e vimblastina), TAXOL®, e inibidores de topo II, tais como, a doxorubicina, a epirubicina, a daunorubicina, a etoposida, e a bleomicina. Estes agentes que param o ciclo celular em G1 também se difundem para a suspensão da fase S, por exemplo, agentes alquilantes do DNA como o tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracil, e ara-C. Informações adicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado

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Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente na pg. 13.

[074] O termo “pró-fármaco”, da forma como utilizada no presente pedido, designa uma forma precursora ou derivada de substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica para células cancerosas em comparação com o fármaco parental e é capaz de ser ativada de forma enzimática ou convertida na forma parental mais ativa. Vide, por exemplo, Wilman, Prodrugs in Cancer Chemotherapy, Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615- Reunião de Belfast (1986) e Stella et al., Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), págs. 247-267, Humana Press (1985). Os pró-fármacos de acordo com a presente invenção incluem, porém não se limitam a, prófármacos que contêm fosfato, pró-fármacos que contêm tiofosfato, prófármacos que contêm sulfato, pró-fármacos que contêm peptídeos, prófármacos modificados por D-aminoácidos, pró-fármacos glicosilados, prófármacos que contêm β-lactama, pró-fármacos que contêm fenoxiacetamida opcionalmente substituídos ou pró-fármacos que contêm fenilacetamida opcionalmente substituídos, 5-fluorocitosina e outros pró-fármacos de 5fluorouridina que podem ser convertidos no fármaco livre citotóxico mais ativo. Exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivados em uma forma de pró-fármaco para o uso na presente invenção incluem, mas não se limitam a, agentes quimioterápicos descritos abaixo.

[075] A expressão “agente citotóxico”, da forma como utilizada no presente pedido, indica uma substância que inibe ou evita o funcionamento das células e/ou causa destruição das mesmas. A expressão destina-se a incluir isótopos radioativos (por exemplo, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos e toxinas tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem

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42/123 bacteriana, fúngica, vegetal ou animal ou seus fragmentos.

[076] “Agente quimioterápico” é um composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN™); sulfonatos de alquila tais como busulfana, improsulfana e piposulfana; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas, que incluem altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente, bulatacina e bulatacinona); camptotecina (incluindo seu análogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente a criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo seus análogos sintéticos, KW-2189 e CBI-TMI), eleuterobina; pancratistatina; sarcodictina; spongistatina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloridrato óxido de mecloretamina, melfalana, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosuréias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como, por exemplo, os antibióticos de enedina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina (1' e caliqueamicina 2'1, vide, por exemplo, Agnew Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; bem como as neocarzinostatina cromofora e antibióticos cromóforas relacionados com a cromoproteína enedina), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-Lnorleucina, doxorubicina (incluindo doxorubicina morfolina, doxorubicinacianomorfolina, 2-doxorubicina-pirrolina e deoxidoxorubicina), epirubicina,

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43/123 esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, streptonigrina, streptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinana; lonidamina; maitansinóides, como por exemplo maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitacrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilidrazida; procarbazina; PSK^®, razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2”triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmenete a toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosida (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, tais como paclitaxel (TAXOL, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton NJ, Estados Unidos) e docetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucila; gencitabina; 6tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona;

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44/123 teniposida; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; capecitabina e os sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima. Também estão incluídos nesta definição agentes antihormonais que agem para regular ou inibir a ação hormonal sobre tumores, tais como anti-estrógenos, incluindo, por exemplo, tamoxifeno, raloxifeno, inibidores da aromatase 4-(5)-imidazóis, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston); e anti-andrógenos, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.

[077] O termo “citocina” é um termo genérico para proteínas liberadas por uma população celular que agem sobre outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos dessas citocinas são linfocinas, monocinas e hormônios de polipeptídeos tradicionais. Encontram-se incluídos entre as citocinas hormônios do crescimento, tais como hormônio do crescimento humano, hormônio do crescimento humano N-metionila e hormônio do crescimento bovino; hormônio paratireóide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; pró-relaxina; hormônios de glicoproteínas tais como hormônio folículo-estimulante (FSH), hormônio estimulante da tireóide (TSH) e hormônio luteinizante (LH); fator do crescimento hepático; fator de crescimento dos fibroblastos; prolactina; lactogênio da placenta; fator de necrose tumoral α e β; substância inibidora mülleriana; peptídeo associado a gonadotropina de camundongos; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento neural tais como NGFβ; fator de crescimento das plaquetas, fatores de crescimento de transformação (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; fator de crescimento similar à insulina I e II; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferons, tais como interferon-α, β e γ; fatores estimulantes de colônias (CSFs) tais como de macrófago-CSF (MPetição 870180009904, de 05/02/2018, pág. 54/139

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CSF); de granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF) e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1 α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL9, IL-11, IL-12; fator de necrose tumoral tal como TNF-α ou TNF-β; e outros fatores de polipeptídeos que incluem LIF e ligante de kits (KL). Da forma como utilizada no presente pedido, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura celular recombinantes e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de sequências nativas.

[078] “Tratamento” ou “terapia” designa um tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas.

[079] A expressão “quantidade eficaz” refere-se uma quantidade de fármaco que é eficaz para tratar uma doença ou desordem em um mamífero. No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz da droga pode reduzir o número de células cancerígenas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (ou seja, reduzir até certo ponto e, preferencialmente, suspender) a infiltração de células cancerígenas em órgãos periféricos; inibir (ou seja, reduzir até certo ponto e, preferencialmente, suspender) a metástase tumoral; inibir, até certo ponto, o crescimento de tumores; e/ou melhorar, até certo ponto, um ou mais dos sintomas associadas a doença. Para extensão a droga pode impedir o crescimento e/ou matar as células cancerígenas existentes, Esta pode ser citostática e/ou citotóxica. Para a terapia do câncer, a eficácia in vivo pode, por exemplo, ser medida avaliando a carga tumoral ou o volume, o tempo de progressão da doença (TTP) e/ou determinando a taxa de resposta (RR).

[080] “Mamífero”, para os propósitos de tratamento ou terapia, designa qualquer animal classificado como mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de criação e animais de zoológico, esportivos ou de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas etc. Preferencialmente, o mamífero é humano.

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46/123 [081] “Paciente” ou “indivíduo” na presente invenção significa a um único paciente no qual se deseja a terapêutica, incluindo os seres humanos. Também destinado a ser incluído como qualquer individuo envolvido na pesquisa clínica julgamentos não demonstrando qualquer sinal clínico da doença, ou indivíduos envolvidos em estudos epidemiológicos, ou indivíduos utilizados como controle.

[082] Os termos “câncer”, “canceroso” e “maligno” designam ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas sem limitar-se a, carcinoma, linfoma, blastoma, melanoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem câncer de cólon, câncer colorretal, câncer retal carcinoma de células escamosas, câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão de células não-pequenas, linfoma de Hodgkin e não-Hodgkin, câncer testicular, mieloma, câncer esofagiano, câncer gastrointestinal, câncer renal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, glioma, câncer hepático, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, carcinoma endometrial, carcinoma de glândula salivar, câncer renal, câncer de próstata, câncer da vulva, câncer de tireóide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer da cabeça e do pescoço.

[083] O termo biomarcador, da formo como é utilizado no presente pedido se refere geralmente a uma molécula, incluindo um gene, proteína ou fragmento de proteína, estrutura de carboidrato ou glicolipídio, a expressão de que pode ser detectada pelos métodos padrão em ou sobre um tecido mamífero ou célula (métodos divulgado aqui) e é preditivo de sensibilidade a um agente indutor da apoptose de uma célula ou tecido mamífero, tal como Apo2Ii/TRAIL ou anticorpo de receptor de morte. Tais biomarcadores contemplados na presente invenção incluem, mas não são

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47/123 limitados a, um fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4) como divulgado no presente pedido (vide, por exemplo, Figs. 1 e 2).

[084] Os termos amostra de tecido ou célula entende-se uma coleção de células similares obtidas a partir de um tecido do paciente ou indivíduo. A origem da amostra de tecido ou célula pode ser sólida, a partir de um tecido fresco, congelado e/ou órgão conservado ou amostra de tecido ou biópsia ou aspirado; sangue ou quaisquer constituintes do sangue, fluidos corporais, tais como fluido cérebro-espinhal, líquido amniótico, líquido peritoneal, ou fluido intersticial; células de qualquer período de gestação ou desenvolvimento do indivíduo. A amostra de tecido pode também ser primária ou de linhagens de cultura celulares. Opcionalmente, a amostra de tecido ou célula é obtida a partir de um tumor primário ou metastático. A amostra de tecido pode conter compostos que não são naturalmente misturados com o tecido, como conservantes, anticoagulantes, tampões, fixadores, nutrientes, antibióticos ou similares.

[085] Para os fins do presente corte de uma amostra tecidual significa uma única peça ou pedaço de uma amostra de tecido, por exemplo, uma fina fatia de tecido ou célula cortada a partir de uma amostra tecidual. Entende-se que vários cortes de amostras de tecido podem ser coletadas e submetidas à análise de acordo com a presente invenção.

[086] O termo associado ou correlacionado destina-se a comparação, por qualquer forma, desempenho e/ou resultados da primeira análise ou protocolo com o desempenho e/ou resultado de uma segunda análise ou protocolo. Por exemplo, uma análise ou protocolo pode usar os resultados da primeira análise ou protocolo na realização de uma segunda análise ou protocolo e/ou resultados da primeira análise ou protocolo para determinar se a segunda análise ou protocolo deve ser executada. No que diz

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48/123 respeito aos vários exemplos de realização divulgados no presente pedido, uma análise ou protocolo pode usar os resultados de um ensaio analítico como, por exemplo, um que identifica os fragmentos de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada clatrina (SEQ ID NO: 2), APL1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4) produzidos durante a apoptose para determinar se um determinado regime terapêutico utilizando um agente indutor de apoptose Apo2L/TRAIL, FasL, anticorpo de receptor de morte ou similar deve ser realizado.

II. Materiais e Métodos

A. Métodos [087] Em geral, os materiais e métodos da invenção são usados para detectar e/ou monitorar a apoptose em células de mamíferos, por exemplo, contatando a célula com um anticorpo que se liga a um fragmento de proteína produzida durante a apoptose, no qual o anticorpo se liga a um fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4); determinando a quantidade de anticorpo que se liga ao fragmento de proteína gerado durante a apoptose; e, em seguida, comparando a quantidade de anticorpos ligados nas células de mamíferos com a quantidade de anticorpos que se ligou no fragmento de proteína em uma célula de mamífero livre de apoptose, de modo que se o valor na célula a ser analisada for maior do que a quantidade na célula livre de apoptose, então apoptose é detectada. Como ilustrado nos exemplos fornecido no presente pedido, o contato da célula com o um anticorpo que se liga a um fragmento de proteína produzida durante a apoptose inclui métodos que permitem o contato com componentes celulares das células. Normalmente, a célula é pré-tratada, por exemplo, por extração (por exemplo, no procedimento de Western Blot citado no presente pedido aqui) para facilitar o contato do anticorpo com os componentes da célula.

[088] Os métodos e ensaios divulgados no presente pedido

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49/123 podem ser utilizados em diversos contextos. Por exemplo, existem algumas populações de tipos de células humanas doentes (como certas populações de células cancerosas), que são resistentes aos efeitos de morte celular induzida pela Apo2L/TRAIL ou anticorpo de receptor de morte. Acredita-se deste modo, que os métodos e ensaios divulgados podem fornecer meios cômodos, eficientes e potencialmente rentáveis de se obter dados e informações úteis na avaliação adequada ou terapias eficazes para tratar pacientes. Por exemplo, um paciente com diagnóstico de câncer ou de condição imune relacionada poderia ser submetido a uma biópsia de modo a se obter uma amostra de células ou tecidos, e a amostra pode ser analisada por vários ensaios in vitro da presente invenção para determinar se as células do paciente são sensíveis a um agente terapêutico tais como Apo2/TRAIL ou anticorpo de receptor de morte.

[089] Para a preparação das amostras, pode ser utilizada uma amostra de tecido ou célula de um mamífero (normalmente de um paciente humano). Exemplos de amostras incluem, mas não se limitam a, células de câncer, como células de câncer de cólon, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de pâncreas, linfoma e leucemia. Opcionalmente, as amostras incluem células de câncer de pulmão de não pequenas células, câncer pancreático ou células de linfoma não-Hodgkin. A amostra pode ser obtida por uma variedade de procedimentos conhecidos no estado da técnica, incluindo, mas não se limitando a, excisão cirúrgica, aspiração ou biópsia.

[090] A invenção divulgada no presente pedido documento possui diversos exemplos de realizações. Por exemplo, certos exemplos de realizações da presente invenção podem ser utilizados para observar a apoptose celular, e condições associadas em um paciente tal como um mamífero e, especificamente, um paciente humano. Em um exemplos de

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50/123 realização ilustrativo, métodos da invenção são utilizados para observar a presença (ou ausência) de apoptose em células de mamíferos, com o intuito de analisar a sensibilidade de uma célula mamífera a um mais agentes indutores de apoptose, como a Apo2/TRAIL ou FasL, para avaliar, por exemplo, a eficácia de uma terapia que inclui a administração de tais agentes. Os métodos da presente invenção também podem ser usados para determinar a extensão da atividade de um composto candidato na diminuição ou aumento da atividade apoptótica em células de mamíferos, por exemplo, um que module a atividade de um agente que induz a apoptose como, por exemplo, Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7), FasL (SEQ ID NO: 9), um anticorpo agonista de Fas, um anticorpo agonista de DR4 ou um anticorpo agonista DR5. Exemplos de realização da presente invenção também são úteis para a identificação de compostos que inibem ou estimulam a morte de células por apoptose, determinando se os compostos que inibem ou estimulam a formação de fragmentos de proteínas gerados na apoptose.

[091] Um exemplo de realização típico é um método de detecção de apoptose em células de mamíferos que é caracterizada pelo contato da célula a um anticorpo que se liga a um fragmento de proteína produzida durante a apoptose, onde o anticorpo se liga a um fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4); determinando a quantidade de anticorpo que se liga ao fragmento de proteína gerado durante a apoptose; e, em seguida, comparando a quantidade de anticorpos que se ligou nas células de mamíferos com a quantidade de anticorpos que se ligou aos fragmentos de proteína em uma célula livre de apoptose, de modo que, se, a quantidade nas células de mamíferos for maior do que nas célula livre de apoptose, então a apoptose é detectada. Uma ampla variedade de células de mamíferos pode ser utilizada nesses métodos. Em certas realizações da presente invenção, a

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51/123 célula é uma célula de câncer humano de cólon, colorretal, de pulmão, de mama, de próstata, de bexiga, de rim, de ovário, de cérebro, de melanoma, leucemia ou mieloma.

[092] Outro exemplo de realização da invenção é um método para a identificação de uma célula de câncer humano que é suscetível de responder, ou é responsiva a um agente terapêutico que induz a apoptose em células de câncer humano. Este exemplo de realização da invenção inclui as etapas de exposição das células de câncer humano ao agente terapêutico; avaliação das células de câncer expostas ao agente terapêutico pela presença de fragmentos de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4), comparando a quantidade de fragmentos de proteína nas células humanas de câncer com a quantidade de fragmentos de proteína em células-controle de câncer humano não expostas ao ligante. Neste exemplo de realização da invenção, a apoptose é observada quando a quantidade de fragmento de proteínas presentes nas células de câncer humano expostas ao agente terapêutico for maior do que a quantidade de fragmentos de proteína nas células-controle de câncer humano não expostas ao agente terapêutico, e uma observação da apoptose nas células de câncer humano identifica as células de câncer humano como suscetíveis de responder, ou são responsivas ao agente terapêutico. Em certos exemplos de realização, as células de câncer humano são obtidas de uma paciente diagnosticado com câncer e são então cultivadas in vitro em cultura por menos de um mês, normalmente inferior a 2 semanas, ou menos de uma semana. Em realizações alternativas, a célula de câncer humano é uma linhagem imortalizada de células obtidas a partir de uma cultura in vitro.

[093] Em exemplos de realizações típicos, a quantidade de anticorpos ligados nas células de mamíferos que está sendo observada pela

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52/123 presença de apoptose, por exemplo, uma célula de mamíferos exposta a um agente indutor apoptose, é comparada com a quantidade de anticorpos ligados ao fragmento de proteína de células de mamíferos livre de apoptose, por exemplo, uma célula controle que não tenha sido exposta ao agente indutor de apoptose. Aqueles conhecedores da técnica compreenderão que estas células controle são aquelas selecionadas por serem similares as células experimentais de mamíferos que estão sendo testadas pela presença de apoptose, exceto pela variável a ser testada (por exemplo, a exposição a um agente que induz a apoptose). Em um exemplo de realização da presente invenção, a célula controle é uma célula originada da mesma fonte (por exemplo, de uma amostra de biópsia do local de tumor primário ou metastático) e/ou é uma célula mamífera da mesma linhagem experimental das células que estão sendo testadas pela presença de apoptose exceto pelo fato de que as células controle não são expostas ao agente que inicia sinalização do Receptor de Morte 4 (SEQ ID NO: 5), Receptor de Morte 5 (SEQ ID NO: 6) ou Fas (SEQ ID NO: 8). Em certos exemplos de realização da presente invenção, o padrão de fragmentação da AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4), em tais células controle já foram caracterizados e este padrão de fragmentação caracterizado anteriormente na célula controle são é comparado com o padrão de fragmentação da AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4) em células de mamíferos, que estão sendo observadas pela presença de apoptose. Tais realizações são utilizadas, por exemplo, com a finalidade de eliminar as desnecessárias e redundantes caracterizações dos controles celulares, por exemplo, controles caracterizados como células livres de apoptose.

[094] Realizações da presente invenção podem ser utilizadas para estudar células sofrendo apoptose induzidas por qualquer um de uma

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53/123 grande variedade de fatores conhecidos como iniciadores da morte celular programada, por exemplo, calor, radiação e agentes químicos. Estas realizações normalmente observam a apoptose em células iniciaram a apoptose através de um receptor na superfície celular, por exemplo, Receptor de Morte 4 (SEQ ID NO: 5), Receptor de Morte 5 (SEQ ID NO: 6) ou Fas (SEQ ID NO: 8). Em certas realizações da presente invenção, a célula e estimulada pelo contato com polipeptídio, como Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7), FasL (SEQ ID NO: 9), um anticorpo agonista de Fas, um anticorpo agonista de DR4 ou um anticorpo agonista de DR5, e os métodos descritos para a detecção da apoptose (que não incluem a detecção da não apoptose) são utilizados, por exemplo, para se obter informações sobre a eficácia de uma terapia que inclui a administração de tais agentes.

[095] Os métodos da invenção também podem ser utilizados para identificar novos agentes indutores da apoptose e/ou moduladores de agentes indutores da apoptose. Exemplos de realizações Ilustrativas podem incluir uma etapa de exposição da célula de mamífero a um ou mais agentes a serem testados e, em seguida, utilizando os métodos de presente invenção observar a apoptose, com a detecção da apoptose em células de mamíferos, identificando um ou mais agentes que estão sendo testados como um indutor da apoptose nas células de mamíferos. Os métodos da presente invenção também podem ser combinados com métodos complementares de análise celular, por exemplo, avaliação do perfil genético. Tal realização da presente invenção, inclui uma etapa de análise da expressão de pelo menos um RNAm nas células de mamíferos em que a apoptose é observada.

[096] O método da presente invenção inclui a observação de proteínas celulares que são mostradas no presente pedido por se fragmentarem nas células em apoptose. Estes fragmentos de proteínas, por exemplo, fragmentos de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina

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54/123 (SEQ ID NO: 2), ΑΡ1/2β (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4) podem ser observados por qualquer uma, de uma ampla variedade de experimentos conhecido no estado da técnica. Tipicamente, tais fragmentos são observados utilizando as técnicas de immunoblotting, ensaio imunoadsorvente enzimaassociado ou imuno-histoquímica. Além disso, os métodos da invenção podem ser utilizados para analisar uma série de fragmentos de proteínas identificados no presente documento, por exemplo, um fragmento de proteína AP2a que possui um peso molecular de aproximadamente 64 kDa ou 33 kDa. Em certas realizações da invenção, o fragmento de proteína ligado pelo anticorpo é identificado pela sequência específica de aminoácidos desse fragmento, por exemplo, a sequência de aminoácida AP2-a: DVFD SEQ ID NO: 1 ou GPAA SEQ ID NO: 1.

[097] Tal como referido acima, realizações da presente invenção incluem métodos para determinar se um paciente humano com diagnóstico de câncer é susceptível de responder ao tratamento com um ou mais agentes indutores de apoptose, por exemplo, Apo-2/TRAIL. Estes métodos podem ser adaptados para serem utilizados com uma variedade de outros métodos conhecidos no estado da técnica que facilitam a determinar se um paciente com diagnóstico de câncer provavelmente responderá ou responde ao tratamento com um(alguns) agente(s) tal como, um agente indutor da apoptose , por exemplo, aqueles métodos que analisam a expressão de pelo menos um gene (por exemplo, a presença ou o nível de RNAm ou proteína codificada por esse RNAm) em um paciente humano com diagnóstico de câncer (por exemplo, em um tumor primário ou metástase). Estes métodos de perfis genéticos são bem conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, no pedido de Patente US 2006/0015952.

[098] Um desses exemplos de realização da presente invenção pode incluir a etapa de observação de fragmentos gerados durante a apoptose,

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55/123 incluindo fragmentos da proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4) nas células cancerosas obtidas do paciente, em combinação com a etapa de obtenção de um perfil de expressão gênica múltiplos genes e comparando-a com um perfil de expressão gênica de uma mesma linhagem celular não cancerosa e/ou células cancerosas obtidas a partir de um modelo animal que é sabidamente responsivo (ou, que não reage) ao tratamento com um ou mais agentes indutores da apoptose. Tipicamente, esses métodos podem incluir a etapa de identificar o paciente com mais probabilidade de vir a se beneficiar pelo tratamento com um ou mais agentes indutores da apoptose, por exemplo, se as células cancerosas obtidas do paciente apresentam um perfil de expressão gênica semelhante ao perfil de expressão gênica de células cancerosas obtidas de pacientes (ou modelo animal de câncer), que são sabidas por se beneficiarem pelo tratamento com um ou mais agentes indutores da apoptose.

[099] Para os fins do presente, semelhante significa que os perfis de expressão se assemelham ou acompanham mutuamente uma ou mais formas, mostrando os que os padrões de expressão estão dentro de cerca de 80% a 100% de identidade em quantidade ou outro parâmetro de expressão mensurável dependendo da dosagem ou técnica utilizada para avaliar o perfil de expressão gênica, como descrito mais detalhadamente adiante, preferencialmente em cerca de 90 a 100%, e adicionalmente de preferência em 95 a 100% de identidade. Os perfis de expressão gênica a partir de células cancerígenas do paciente e do modelo animal são geralmente obtidos através da mesma técnica ou de ensaios para facilitar a comparação destes.

[0100] Os métodos para obtenção do perfil de expressão genética são bem conhecidos na técnica e baseiam-se tipicamente na análise de

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56/123 hibridização de polinucleotídeos ou sequenciamento de polinucleotídeos. Os métodos mais comumente utilizados conhecidos no estado da técnica para a quantificação da expressão de RNAm em amostras incluem Northern Blot e hibridização in situ (Parker e Barnes, Methods in Molecular Biology, 106: 247283 (1999)); testes de proteção de RNAse (Hod, Biotechniques, 13: 852-854 (1992)); e reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) (Weis et al, Trends in Genetics, 8: 263-264 (1992)). Alternativamente, podem ser empregados anticorpos que podem reconhecer duplexes específicos, incluindo duplex de DNA, duplex de RNA e duplex híbridos de DNA e RNA e duplex de DNA e proteína. Métodos representativos de análise de expressão gênica baseada no sequenciamento incluem; Análise Serial da Expressão Genética (SAGE) e análise de expressão genética por meio de sequenciamento de assinaturas massivamente paralelas (MPSS). Qualquer destes métodos ou outros métodos conhecidos na técnica pode ser utilizado para determinar o perfil de expressão gênica de célula de tumor obtida do paciente, tal como um paciente humano, e um animal que serve de modelo experimental de câncer que é responsivo a um antagonista de TGF-β, tal como modelo de camundongo. No caso de pacientes humanos, a fonte de células de tumor pode ser uma amostra de tecido fresco, congelado ou fixado e emblocado em parafina, do qual o RNAm pode ser extraído e submetido a análise de expressão gênica.

[0101] Alternativamente, métodos proteômicos também podem ser utilizados para comparar o perfil de expressão de célula de câncer humano e a célula de referência (como, por exemplo, de camundongo). O perfil proteômico é a representação do padrão de expressão de uma série de proteínas na amostra biológica, tal como o tecido de câncer. O perfil de expressão pode ser representado como um espectro de massa, mas outras representações baseadas em quaisquer propriedades bioquímicas ou físico-químicas das

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57/123 proteínas também estão incluídas. Desta forma, o perfil de expressão pode ser baseado, por exemplo, em diferenças das propriedades eletroforéticas de proteínas, conforme determinado por meio da eletroforese bidimensional em gel, tal como por 2-D PAGE, e pode ser representado, por exemplo, na forma de uma série de pontos no gel de eletroforese bidimensional. Métodos proteômicos são bem conhecidos na estado da técnica e descritos, por exemplo, nos livros a seguir: Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics (Principies and Practice), M. R. Wilkins et al, eds., Springer Verlag, 1007; 2-D Proteome Analysis Protocols, Andrew L. Link, editor, Humana Press, 1999; Proteome Research: Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Identification Methods (Principles and Practice), T. Rabilloud editor, Springer Verlag, 2000; Proteome Research: Mass Spectrometry (Principles and Practice), P. James editor, Springer Verlag, 2001; Introduction to Proteomics, D. C. Liebler editor, Humana Press, 2002; Proteomics in Practice: A Laboratory Manual of Proteome Analysis, R. Westermeier et al, eds., John Wiley & Sons, 2002.

[0102] Fragmentos de proteína gerados durante a apoptose, incluindo fragmentos de proteínas de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), ΑΡ1/2β (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4); em uma amostra pode ser analisada por uma variedade de meios bem conhecido no estado da técnica. Protocolos usuais para avaliação de tais fragmentos de proteínas foram encontrados, por exemplo, em Ausubel et al. Ed. 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidade 15 (Immunoblotting). Imunoensaios, que podem ser utilizados em certos exemplos de realização da presente invenção incluem, mas não estão limitados a: Western blot, imunoprecipitação, slot blot ou dot blot, imunocoloração, RIA, ensaio de cintilação por proximidade, imunoensaio fluorescente utilizando anticorpos conjugados ou antígeno conjugados de substâncias fluorescentes como a

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58/123 fluoresceína ou rodamina, análise por método de dupla difusão de Ouchterlony, ELISA, ELISA baseado em células, ELISA ligado a filtro, inibição de ELISA, e imunoensaios que empreguem um sistema de detecção avidina-biotina ou estreptavidina-biotina.

[0103] Em algumas realizações da invenção, um anticorpo utilizado no imunoensaio liga-se tanto a proteínas intactas quanto ao fragmento de proteína, e o fragmento de proteína é reconhecido pelo seu tamanho caracteristicamente menor, por exemplo, em um processo de Western Blot. O anticorpo utilizado em uma realização da presente invenção pode ser, por exemplo, um dos anticorpos exemplares divulgados no presente documento ou um anticorpo que se liga a um epítopo acoplado a um dos anticorpos exemplares divulgados no presente pedido. Em outras realizações da presente invenção, os anticorpos que reconhecem especificamente os fragmentos de proteína gerados na apoptose, mas não podem ser usado em proteínas intactas. Estes anticorpos podem ser preparados por métodos normais de imunização utilizando o fragmento como imunógeno e, em seguida, identificando os anticorpos gerados que se ligam aos fragmentos de proteína produzidos na apoptose, mas não se ligam na proteína intacta.

[0104] Em realizações típicas da presente invenção, a análise é realizada em proteínas obtidas a partir de células lisadas que foram separados por meio de eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (PAGE). O anticorpo é colocado em contato com as proteínas e a análise é realizada, preferencialmente por imunoensaio, para determinar a presença de fragmentos de proteínas que se ligam aos anticorpos. A comparação pode ser feita com um controle constituído por proteínas semelhantes a partir de células lisadas (por exemplo, células da mesma fonte e/ou linhagem) sabidamente livres de apoptose. Qualquer um dos imunoensaios descritos acima pode ser utilizado para analisar uma amostra de tecido retirada de um indivíduo vivo. Possíveis

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59/123 amostras biológicas para esta análise incluem células do sangue ou amostras de biópsia de tecido ou células, que pode ser obtidas por métodos padrões. O níveis de fragmentos de peptídeos gerados pela apoptose da amostra biológica descrita acima pode ser determinada por qualquer um dos imunoensaios descritos acima que utilizam anticorpos que se ligam especificamente aos fragmentos da proteínas de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4). Os níveis de fragmentos de peptídeos gerados pela apoptose determinado na amostra biológica do indivíduo em análise é comparada com os níveis encontrados em uma célula de um paciente não afetado, ou um padrão conhecido. Um padrão exemplar pode ser, por exemplo, a presença e/ou concentração de um ou mais fragmentos de proteínas normalmente observados em células que não estão passando pelo processo de apoptose (por exemplo, nas células controle não expostas a um agente indutor de apoptose). Tais realizações podem ser utilizadas, por exemplo, para diagnosticar condições caracterizadas pela apoptose anormal. Em certos exemplos de realizações da presente invenção, um nível de apoptose é observado na célula, com, por exemplo, um aumento de fragmentos de peptídeos gerados pela apoptose em, pelo menos, 10, 20, 30, 40 ou 50 por cento, 100 ou 150 por cento, quando comparado a uma amostra controle, sendo assim considerado como indicativo de um estado patológico. Em outros exemplos de realizações, um nível de apoptose é observada na célula, com, por exemplo, um aumento de fragmentos de peptídeos gerados pela apoptose em, pelo menos 10 vezes, 100 vezes ou 1000 vezes, quando comparado a uma amostra controle, sendo assim considerado como indicativo de um estado patológico.

[0105] Exemplos de realizações da presente invenção podem ser adaptadas para utilização em testes imunológicos úteis na detecção e

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60/123 quantificação de fragmentos de proteínas de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4). Esses testes podem incluir um ou mais anticorpos capazes de reconhecer e se ligar a um fragmento de proteína, como apropriado. Estes ensaios são realizados em diversas formas de ensaios imunológicos bem conhecidos no estado da técnica, Incluindo, mas não limitado a vários tipos de testes de Western Blot, radioimunoensaio, ensaio imunoadsorvente enzimaassociado (ELISA), ensaio imunoadsorvente fluorescente-associado (ELIFA) e similares.

[0106] Nos métodos ilustrativos, a amostra pode ser contactada com um anticorpo específico para um biomarcador, tal como um fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4); em condições suficientes para a formação de um complexo anticorpo-biomarcador e, em seguida, o dito complexo é detectado. A detecção da presença de um fragmento de proteína biomarcada pode ser obtida de várias maneiras, tais como pela técnica de Western blotting (com ou sem um passo de imunoprecipitação) e ensaio de ELISA para avaliar uma vasta variedade de tecidos e amostras, incluindo o plasma ou soro. Uma vasta variedade de técnicas de imunoensaio utilizando tal modelo está disponível, vide, por exemplo, as Patentes US 4.016.043, US 4.424.279 e US 4.018.653. Estas incluem tanto ensaios de sítio único, dois sítios ou do tipo “sanduíche” do tipo não-competitivo, bem como nos ensaios de ligação competitiva tradicionais. Estes ensaios incluem também a ligação direta do anticorpo marcado direcionado ao biomarcador.

[0107] Ensaios do tipo “sanduíche” estão entre os ensaios mais úteis e comumente utilizados. Existem uma série de variações nas técnicas de ensaios do tipo “sanduíche”, e todas são englobadas pela presente invenção.

Resumidamente, em um ensaio típico futuro, um anticorpo não marcado é

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61/123 imobilizado sobre um substrato sólido, e a amostra a ser testada é colocada em contato com a molécula ligada. Após um período adequado de incubação, por um período de tempo suficiente para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo, um segundo anticorpo específico para o antígeno, marcado com uma molécula repórter capaz de produzir um sinal detectável é então adicionado e incubado, por um tempo suficiente para permitir a formação de outro complexo de anticorpo anti-anticorpo marcado. Qualquer material que não reagiu é retirado por lavagem, e a presença do antígeno é determinada pela observação da molécula sinal produzida pela molécula repórter. Os resultados podem ser qualitativos, através de uma simples observação do sinal visível, ou pode ser quantitativos pela comparação com uma amostra controle contendo quantidades conhecidas de biomarcador.

[0108] Variações sobre os ensaios seguintes incluem uma análise simultânea, no qual ambas as amostras e anticorpos marcados são adicionados simultaneamente ao anticorpo acoplado. Estas técnicas são bem conhecidas por aqueles conhecedores do estado da técnica, incluindo as eventuais variações menores que serão facilmente perceptíveis. Em um ensaio do tipo “sanduíche” típico, um primeiro anticorpo com especificidade para o biomarcador é ligado covalentemente ou acoplado de forma passiva a uma superfície sólida. A superfície sólida é tipicamente de vidro ou de polímero, os polímeros mais comumente utilizados são: celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, policloreto de vinil ou polipropileno. Os suportes sólidos podem ser na forma de tubos, esferas, discos de microplacas, ou qualquer outra superfície adequada para realizar um imunoensaio. Os processos de ligação são bem conhecidos no estado da técnica e, geralmente consistem da adsorção física ligada covalentemente por ligação cruzada, o complexo anticorpo-polímero é lavado na preparação da amostra para análise. Uma alíquota da amostra para ser testada é então adicionada ao complexo da fase sólida e incubada por um

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62/123 período de tempo suficiente (por exemplo, 2-40 minutos, ou, se conveniente, overnight) e em condições adequadas (por exemplo, da temperatura ambiente até 40 °C, como entre 25 °C e 32 °C, inclusive) para permitir a ligação de qualquer subunidade presente no anticorpo. Em seguida, após o período de incubação, a subunidade do anticorpo na fase sólida é lavada, seca e incubada com um segundo anticorpo específico para a fração do biomarcador. O segundo anticorpo é ligada a uma molécula repórter, que é usada para indicar a ligação do segundo anticorpo ao marcador molecular.

[0109] Um método alternativo envolve a imobilização de um biomarcador de interesse na amostra e em seguida, expondo o biomarcador imobilizado ao anticorpo específico, que pode ou não ser marcado para detecção com uma molécula repórter. Dependendo da quantidade de molécula alvo e da intensidade de sinal da molécula repórter, a molécula alvo ligada pode ser detectada pela marcação direta com o anticorpo. Alternativamente, um segundo anticorpo marcado, específico para o primeiro anticorpo é exposto ao primeiro complexo primeiro anticorpo-alvo para formar um complexo terciário segundo anticorpo anti-primeiro anticorpo-alvo. O complexo é detectado pelo sinal emitido pela molécula repórter. moléculas repórteres” da forma com utilizada na presente especificação refere-se uma molécula que, pela sua natureza química, fornece um sinal analiticamente reconhecível que permite a detecção da ligação antígeno-anticorpo. As moléculas repórteres mais comumente utilizadas neste tipo de ensaio são enzimas, fluoróforos ou moléculas que contêm radionuclídeos (ou seja, radioisótopos) e moléculas quimioluminescentes.

[0110] No caso de um ensaio imunoenzimático, uma enzima é conjugada com o segundo anticorpo, em geral por meio de glutaraldeído ou periodato. Como será facilmente reconhecido, no entanto, existe uma grande variedade de diferentes técnicas de conjugação, que são facilmente disponíveis

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63/123 para os técnicos hábeis no assunto. Enzimas comumente utilizadas incluem: enzima peroxidase, glicose oxidase, galactosidase e fosfatase alcalina, entre outras. Os substratos para serem utilizados com as enzimas específicas são geralmente escolhidos pela produção, mediante a hidrólise pela enzima correspondente, de mudança de cor detectável. Os exemplos de enzimas adequadas incluem fosfatase alcalina e peroxidase. Também é possível empregar substratos fluorogênicos, que produzem um produto fluorescente ao invés do substrato cromogênico acima citado. Nos casos típicos, o anticorpo marcado com enzima é adicionado ao complexo primeiro anticorpo-marcador molecular, permitindo sua ligação e, então, o excesso de reagente é lavado fora. Uma solução contendo o substrato adequado é então adicionada ao complexo do anticorpo-antígeno -anticorpo. O substrato vai reagir com a enzima ligada ao segundo anticorpo, dando um sinal visual qualitativo, que pode ainda ser quantificado espectrofotometricamente, para dar uma indicação da quantidade de biomarcador presente na amostra. Alternativamente, os compostos fluorescentes, como a fluoresceína e rodamina, podem ser acoplados quimicamente aos anticorpos sem alterar ou limitar sua capacidade. Quando ativado pela iluminação com um comprimento de onda específico, o anticorpo marcado com fluorocromo absorve a energia da luz, induzindo um estado de excitabilidade na molécula seguido pela emissão de luz na cor característica visualmente detectável com um microscópio óptico. Tal como no EIA, é permitido que os anticorpos marcados fluorescentes se liguem ao complexo primeiro anticorpo-marcador molecular. Após a lavagem dos reagentes que não acoplados, o complexo terciário remanescente é então exposto à luz em um comprimento de onda adequado, a fluorescência observada indica a presença do marcador molecular de interesse. Técnicas de imunofluorescência e EIA são ambas muito bem estabelecidas no estado da técnica. No entanto, outras moléculas repórteres, tais como o radioisótopo,

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64/123 moléculas quimioluminescentes ou bioluminescentes, também podem ser empregadas.

[0111] Tal como acima citado, exemplos de realização da presente invenção pode usar anticorpos que se ligam a fragmentos de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: l), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), ΑΡ1/2β (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4), mas não a proteína completa (por exemplo, anticorpos que se ligam a ao epítopo produzido pela clivagem da proteína total). Tais exemplos de realizações podem ser utilizados para examinar os fragmentos de proteína em uma célula por técnicas de imunohistoquímica. Nas técnicas de imuno-histoquímica, uma amostra de tecidos pode ser fixado (ou seja, preservado) pelo método convencional (vide, por exemplo, “Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology” 3^â edição (1960) Lee G. Luna, HT Editora (ASCP), The Blakston Division McGraw-Hill Book Company Company, Nova York; Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Instituto de Patologia das Forças Armadas, American Registry of Pathology, Washington, DC). Os técnicos conhecedores do assunto irão apreciar que a escolha do fixador é determinado pela finalidade pelo qual o tecido será histologicamente corado ou de outra forma analisado. Uma técnico hábil no assunto também irá apreciar o fato de que o tempo de fixação depende do tamanho da amostra de tecido e do fixador utilizado. A título de exemplo, a formalina tamponada neutra, Bouin's ou paraformaldeído, podem ser utilizados para fixar uma amostra de tecido. Após a preparação dos tecidos, um corte de tecido pode ser submetido a uma de uma variedade de técnicas de imuno-histoquímica conhecidas no estado da técnica.

B. Materiais [0112] Uma variedade de materiais podem ser utilizados na prática da presente invenção incluindo quaisquer de uma ampla variedade de

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65/123 agentes indutores da apoptose, bem como anticorpos que se ligam a fragmentos de proteínas revelados no presente pedido que são gerados durante a morte de células por apoptose. Exemplo de agentes indutores da apoptose incluem Apo2L, anticorpos agonistas anti-DR4 ou anti-DR5, FasL e anticorpos agonistas anti-Fas. A Apo-2L que pode ser empregada nos métodos inclui os polipeptídeos de Apo-2L descritos em Pitti et al., supra, documento WO 97/25428, supra, e documento WO97/01633, supra (os polipeptídeos estão referidos com TRAIL). Contempla-se que as várias formas de Apo-2L podem ser usadas como, por exemplo, o polipeptídeo completo bem como as formas solúveis de Apo-2L que contém uma sequência de domínio extracelular (ECD). Os exemplos de tais sequências ECD solúveis incluem os polipeptídeos que compreendem da sequência de aminoácidos 114-281, 95-281, 91-281 ou 92281 da Apo-2L, mostrada na figura 1A de Pitti et de al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996). Acredita-se atualmente que o polipeptídeo que contém os aminoácidos 92-281 é uma forma naturalmente clivada de Apo-2L. Os requerentes expressaram Apo-2L humana em células CHO e encontraram que o polipeptídeo 92-281 é a forma expressa da Apo-2L. As formas modificadas de Apo-2L, tais como as formas modificadas covalentemente descritas em WO 97/25428 estão incluídas. Em particular, a Apo-2L ligada a um polímero não proteináceo tal como o polietileno glicol está incluído para o uso no presente método. O polipeptídeo da Apo-2L pode ser feito de acordo com alguns dos métodos descritos no documento WO 97/25428.

[0113] As variantes do ligante de Apo-2 que tem atividade apoptótica e podem ser usada nos métodos incluem, por exemplo, aquelas identificadas pela técnica de varredura da alanina. As variantes substitucionais particulares compreendem os aminoácidos 91-281 da figura 1A de Pitti et de al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996) em que pelo menos um dos aminoácidos nas posições 203, 218 ou 269 é substituído por um resíduo da

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66/123 alanina. Opcionalmente, as variantes do ligante Apo-2 podem incluir uma ou mais destas três diferentes substituições locais.

[0114] Contempla-se que uma molécula que mimetize a atividade apoptótica da Apo-2L pode alternativamente ser empregada nos métodos divulgados no presente pedido. Os exemplos de tais moléculas incluem os anticorpos agonísticos que podem induzir a apoptose ao menos de maneira comparável ou parecida a Apo-2L. Particularmente, estes anticorpos agonistas poderiam compreender de anticorpos que se ligam a um ou mais receptores para Apo-2L. Preferencialmente, o anticorpo agonista é dirigido a um receptor Apo-2L que incluí um domínio citoplasmático de morte, tal como DR4 ou DR5. Mais preferivelmente, a ligação do anticorpo agonista a tal receptor pode ser determinada, por exemplo, usando FACS ou ELISA. Anticorpos agonistas direcionados ao receptor denominado DR5 (ou Apo-2) foram preparados usando técnicas de fusão tais como descrito abaixo. Um dos anticorpos agonistas do receptor DR5 ou Apo-2 é referido como 3F11.39.7 e foi depositado no ATCC como depósito n° HB-12456 em 13 de janeiro de 1998. A atividade do anticorpo agonista do receptor Apo-2L pode ser determinada usando vários métodos para avaliar a atividade apoptótica, e opcionalmente, a atividade apoptótica de tal anticorpo pode ser determinada, dosando o anticorpo sozinho ou na forma reticulada usando o Fc da imunoglobulina ou o complemento.

[0115] Adicionalmente, anticorpos agonistas direcionados a outro receptor Apo-2L, denominado de DR4, também foram preparados. Um dos anticorpos agonistas de DR4 exemplar é denominado como 4H6.17.8 e foi depositado no ATCC com depósito n° HB-12455 em 13 de janeiro de 1998. A atividade dos anticorpos agonistas do receptor Apo-2L pode ser determinada usando vários métodos de ensaios para avaliar a atividade apoptótica, e opcionalmente, a atividade apoptótica de tal anticorpo pode ser determinada,

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67/123 dosando o anticorpo sozinho ou na forma reticulada usando o Fc da imunoglobulina ou o complemento.

[0116] Os anticorpos agonistas contemplados pela invenção incluem os anticorpos que ligam a um único receptor Apo-2L ou a mais de um receptor Apo-2L. Um anticorpo que a liga a mais de um receptor Apo-2L pode ser caracterizado como um anticorpo que reage cruzadamente com dois ou mais antígenos diferentes e é capaz de se ligar a cada um dos antígenos, por exemplo, como determinado por ELISA ou por FACS, como no exemplo descrito abaixo. Opcionalmente, um anticorpo que reage cruzadamente de maneira específica com dois ou mais antígenos diferentes é aquele que se liga ao primeiro antígeno e se liga adicionalmente a um segundo antígeno diferente, de modo que a capacidade de ligação do anticorpo ao segundo antígeno a uma concentração de anticorpo de aproximadamente 10 ng/mL é de cerca de 50% a 100% (preferencialmente, cerca de 75% a 100%) da capacidade de ligação do anticorpo ao primeiro antígeno como determinado em uma captura por ELISA (tal como, nos exemplos abaixo). Por exemplo, o anticorpo pode se ligar especificamente a DR5 (o primeiro antígeno) e ter reação cruzada específica com outro receptor de Apo-2L tal como DR4 (o segundo antígeno), em que a extensão da ligação a cerca de 10:g/mL do anticorpo ao DR4 é de aproximadamente 50% a 100% da capacidade e ligação para o DR5 em uma captura por ELISA. Os vários anticorpos com reatividade cruzada aos receptores Apo-2L são descritos com mais detalhe no pedido de patente internacional número PCT/US99/13197.

[0117] Como descritos abaixo, os formas exemplares de tais anticorpos incluem anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos humanizados, biespecíficos e heteroconjugados.

1. Anticorpos Policlonais [0118] Os anticorpos da invenção podem compreender de

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68/123 anticorpos policlonais. Os métodos de preparação de anticorpos policlonais são bem conhecidos pelos hábeis no assunto. Os anticorpos policlonais podem ser obtidos em um mamífero, por exemplo, por um ou mais injeção de agente imunizantes, e se desejado, de um adjuvante. Tipicamente, o agente imunizante e/ou o adjuvante serão injetados no mamífero por múltiplas injeções subcutâneas ou intraperitoneais. O agente imunizante pode incluir, por exemplo, um polipeptídeo completo ou parcial de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: l), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4), ou uma fusão de proteína deste. Pode ser útil conjugar o agente imunizante a uma proteína conhecida por ser imunogênica no mamífero que é imunizado. Os exemplos de tais proteínas imunogênicas incluem, mas não se limitam a hemocianina (keyhole limpet hemocyanin), a albumina do soro, a tiroglobulina bovina e o inibidor do tripsina de soja. Os exemplos dos adjuvantes que podem ser empregados incluem o adjuvante completo de Freund e o adjuvante MPL-TDM (monofosforil lipídio A, dicorinomicolato de trealose sintético). O protocolo de imunização pode ser selecionado por um técnico hábil no assunto. O mamífero pode então ser sangrado, e o título de anticorpo mensurado no soro. Se desejado, o mamífero pode ser estimulado até que o título de anticorpo aumente ou chegue a um platô.

2. Anticorpos Monoclonais [0119] Os anticorpos da invenção podem, alternativamente, ser anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser fabricados pelo uso do método de hibridoma descrito por Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). No método de hibridoma, um camundongo, hamster, ou outro animal hospedeiro apropriado, é tipicamente imunizado com um agente imunizante para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam de forma especifica a proteína utilizada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro.

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69/123 [0120] Geralmente, outros linfócitos periféricos do sangue (PBLs) são usados se as células de desejadas forem origem humana, ou células do baço ou linfonodos são usadas se forem desejadas células de mamíferos não humanos. Os linfócitos são fundidos em seguida com uma linhagem de células imortalizada, utilizando um agente de fusão apropriado, tal como o polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, págs. 59 a 103 (Academic Press, 1986)). Linhagens de células imortalizadas são geralmente células de mamíferos transformadas, particularmente células de mielomas de roedores, bovinos e de origem humana. Geralmente, são utilizadas linhagens celulares de mieloma de ratos e camundongos. Normalmente as células de hibridoma podem ser cultivadas em um meio de cultura apropriado que contém, preferencialmente, uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células imortalizadas não-fundidas. Por exemplo, se as células parentais não contenham a enzima hipoxantina-guaninafosforribosiltransferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência em HGPRT.

[0121] Células imortalizadas preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, apóiam a produção estável em alto nível de anticorpos pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. As linhagens de células imortalizadas mais preferidas são linhagens de mieloma murino que podem ser obtidas no caso pela Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Um exemplo de tal linhagem de células de mieloma é P3X63AgU.1. Mieloma humano e heteromieloma humano/camundongo também foram descritas para a produção

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70/123 de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, Estados Unidos, 1987)).

[0122] O meio de cultura em que as células de hibridoma são cultivadas pode então ser testado para determinar a presença dos anticorpos monoclonais dirigidos contra o imunógeno desejado. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada através de imunoprecipitação ou ensaio de ligação in vitro, tais como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoenzimático (ELISA). Tais técnicas e ensaios são conhecidas no estado da técnica. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, através da análise de Scatchard descrita em Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

[0123] Após a identificação de células de hibridoma que produzem anticorpos com especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados através da limitação de procedimentos de diluição e cultivados através de métodos padrão (Goding, supra). Meios de cultura apropriados para este propósito incluem, por exemplo, o meio Dulbecco's Modified Eagle's (D-MEM) ou RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo na forma de tumores de ascite em mamíferos.

[0124] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser isolados ou purificados do meio de cultura, liquido ascítico por meio de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade.

[0125] Os anticorpos monoclonais podem também ser feitos por métodos de DNA recombinante, tais como aqueles descritos na patente US

4.816.567. O DNA codificador dos anticorpos monoclonais da invenção é

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71/123 facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de se ligar, especificamente, a genes codificadores das cadeias pesada e leve de anticorpos murinos). As células de hibridoma da invenção servem como fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida para células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símios, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem a proteína de imunoglobulina, para se obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O DNA pode também ser modificado, por exemplo, pela substituição das sequências humanas do domínio constante das cadeias leve e pesada pelas sequências murinas homólogas (patente US 4.816.567; e Morrison et al., supra) ou por meio de ligação covalente da sequência codificadora de imunoglobulina, no todo ou em parte, com a sequência codificadora para um polipeptídeo não-imunoglobulina. Tais polipeptídeos que não são imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo da invenção ou são substituídos pelos domínios variáveis de um sítio de combinação do antígeno de um anticorpo da invenção para criar um anticorpo bivalente quimérico. Opcionalmente, os anticorpos quiméricos podem ser construídos, o que inclui, pelo menos, um domínio variável ou hipervariável de um anticorpo, como um dos anticorpos divulgados no presente pedido.

[0126] Opcionalmente, os anticorpos da presente poderão se ligar ao(s) mesmo(s) epítopo(s) como qualquer um dos anticorpos divulgados no presente pedido. Isso pode ser determinada através de vários testes, tais como os descritos a seguir. Por exemplo, para determinar se um anticorpo monoclonal tem a mesma especificidade como os anticorpos especificamente mencionados no presente pedido, pode-se comparar a sua atividade em um

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72/123 ensaio de apoptose.

[0127] Os anticorpos da invenção incluem anticorpos “reticulados”. O termo reticulado usado no presente pedido refere-se a ligação de pelo menos duas moléculas de IgG unidas formando uma (ou única) molécula. O anticorpo pode ser reticulado utilizando várias moléculas de ligação, opcionalmente os anticorpos podem ser reticulados usando uma molécula de anti-IgG, complemento, modificada quimicamente ou por engenharia molecular. É apreciado por aqueles hábeis na técnica que o complemento tenha uma afinidade relativamente elevada às moléculas de anticorpo uma vez que o anticorpo estiver ligado à superfície da membrana celular. Acredita-se que o complemento pode ser usado como uma molécula da ligação entre dois ou mais anticorpos ligados à superfície da membrana celular. Entre os vários isotipos de Ig murino, o IgM, IgG2a e IgG2b são conhecidos por fixar o complemento.

[0128] Os anticorpos utilizados na prática da presente invenção podem opcionalmente compreender de anticorpos diméricos, bem como formas multivalentes de anticorpos. Os técnicos no assunto podem construir esses dímeros ou formas multivalentes através de métodos conhecidos no estado da técnica usando o anticorpo anti-receptor Apo-2L do presente.

[0129] Os anticorpos utilizados na prática da presente invenção podem também compreender de anticorpos monovalentes. Métodos para a preparação de anticorpos monovalentes são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, a expressão recombinante de cadeia leve de imunoglobulina e cadeia pesada modificada. A cadeia pesada geralmente é truncada em qualquer ponto da região Fc, de forma a evitar a reticulação da cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes são substituídos com outro resíduo de aminoácido ou são deletados, de forma a evitar a reticulação.

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73/123 [0130] Métodos in vitro são também apropriados para preparar anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir fragmentos deste, particularmente, fragmentos Fab, pode ser realizada usando técnicas rotineiras conhecidas. Por exemplo, a digestão pode ser executada usando a papaína. Os exemplos da digestão por papaína estão descritos no documento WO 94/29348 publicado em 22/12/94 e patente US 4.342.566. A digestão dos anticorpos pela papaína produz tipicamente dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, chamados de fragmentos de Fab, cada qual com um único sítio de ligação de antígenos e um fragmento Fc residual. O tratamento com pepsína gera um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de combinação de antígenos e ainda é capaz de reticular o antígeno.

[0131] Os fragmentos Fab produzidos na digestão do anticorpo também contêm os domínios constantes da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no carbóxi-terminal do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab'-SH é a denominação do presente para Fab', em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contém(êm) um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos Fab' que contêm cisteínas articuladas entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.

[0132] Fragmentos Fv de cadeia simples podem também ser produzidos, tal como descrito em Iliades et al., FEBS Letters, 409: 437-441 (1997). O acoplamento desses fragmentos de cadeia simples utilizando vários ligantes é descrito em Kortt et al., Protein Engineering, 10: 423-433 (1997).

[0133] Além dos anticorpos descritos acima, é contemplado que anticorpos quiméricos ou híbridos possam também ser preparados in vitro,

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74/123 utilizando métodos conhecidos na química de proteínas sintéticas, incluindo aqueles que envolvem agentes reticulantes. Imunotoxinas, por exemplo, podem ser construídas utilizando uma reação de troca de dissulfeto ou através da formação de ligação tioéter. Exemplos de reagentes apropriados para este propósito incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.

[0134] Os anticorpos utilizados na prática da presente invenção podem adicionalmente constar de anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Formas humanizadas de anticorpos não-humanos (tais como murinos) são imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação de antígenos de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não-humana. Anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do paciente são substituídos por resíduos de uma CDR de espécie não-humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato ou coelho que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de estrutura Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos nãohumanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem nas sequências de estrutura ou CDR importadas. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois, domínios variáveis nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá idealmente de pelo menos uma porção de um domínio ou região constante da imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina

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75/123 humana. (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)).

[0135] Métodos de humanização de anticorpos não-humanos são bem descritos no estado da técnica. Preferencialmente, um anticorpo humanizado contém um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácidos nãohumanos são muitas vezes denominados resíduos “importados”, que são tipicamente retirados de um domínio variável “importado”. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), por meio de substituição de sequências de regiões hipervariáveis pelas sequências correspondentes de anticorpo humano. Conseqüentemente, tais anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos (Patente US 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pela sequência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos CDR e, possivelmente, alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

[0136] A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método denominado “melhor adequação”, a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é selecionada em comparação com toda a biblioteca de sequências de domínio variável humano conhecida. A sequência humana mais próxima da sequência do roedor é aceita como a região de estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296-2308 (1993); Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). Outro método utiliza

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76/123 uma região de estrutura específica derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 89:4285-4289 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623-2632 (1993)).

[0137] É adicionalmente importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção da alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por meio de um processo de análise das sequências parentais e diversos produtos humanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e são familiares para os técnicos no assunto. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveis estruturas de conformação tridimensional de possíveis sequências de imunoglobulina selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise da provável função dos resíduos no funcionamento da possível sequência de imunoglobulina, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar ao seu antígeno. Desta forma, os resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências receptora e importada, de forma que seja atingida a característica desejada, tal como maior afinidade para o(s) antígeno(s) alvo(s). Geralmente, os resíduos CDR estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação de antígenos. (Vide, documento WO 94/04679 publicado em 3 de março de 1994).

[0138] Anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados utilizando uma adaptação do método de hibridoma descritos pela primeira vez por Kohler e Milstein, usando linfócitos B humanos como parceiros da fusão.

Os linfócitos B humanos que produzem o anticorpo de interesse podem ser, por

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77/123 exemplo, isolados de um indivíduo humano, após ter sido obtido o consentimento informado. Por exemplo, o indivíduo pode produzir anticorpos contra uma auto antígeno como o que ocorre com determinados doenças, tais como, o lúpus eritematoso sistêmico (Shoenfeld et al. J. Clin. Invest., 70:205 (1982)), trombocitopenia púrpura imuno mediada (ITP) (Nugent et al. Blood, 70(1): 16-22 (1987)), ou câncer. Alternativamente ou adicionalmente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Por exemplo, a exposição in vitro de linfócitos isolados do sangue periférico humano a um agente lisomotrófico (e.g. éster de Lleucina-O-methil, éster do ácido dimetil L-glutamico ou éster de L-leucil-Lleucina-O-metil) (patente US 5.567.610, Borrebaeck et al.); e/ou linfócitos de sangue periférico humano com células T depletadas podem ser tratadas in vitro com adjuvantes tal como 8-mercaptoguanosina e citocinas (patente US 5.229.275, Goroff et al.).

[0139] Os linfócitos B recuperados do paciente ou imunizado in vitro, é então geralmente imortalizada a fim de gerar um anticorpo monoclonal humano. As técnicas imortalização do linfócito B incluem, mas não são limitadas a: (a) fusão de linfócitos B humano com células de mielomas humanos, murinos e hetromielomas de camundongos humanos; (b) transformação viral (por exemplo, com um vírus Epstein-Barr; vide, por exemplo, Nugent et al., supra); (c) fusão com uma linhagem de células linfoblatóide; ou (d) fusão com células de linfomas.

[0140] Os linfócitos podem ser fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão apropriado, tal como o polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). As células de hibridoma preparadas desta forma são germinadas e cultivadas em um meio de cultura apropriado que contém, preferencialmente, uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais

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78/123 não-fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não contenham a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase (HGPRT ou HPRT) o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência em HGPRT. As linhagens celulares apropriadas de mieloma humano e heteromieloma humano/de camundongos também foram descritas (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). O meio de cultura em que são cultivadas células de hibridoma é analisado para determinar a produção de anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por meio de imunoprecipitação ou de um teste de ligação in vitro, tal como o radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoenzimático (ELISA).

[0141] Após a identificação de células de hibridoma que produzem anticorpos de especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados por meio da limitação de procedimentos de diluição e cultivados por meio de métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura apropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI1640. Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro por meio de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade.

[0142] Anticorpos humanos podem ser produzidos também usando hospedeiros não humanos como, por exemplo, o camundongo, que é capaz de produzir anticorpos humanos. Como citado acima, camundongos

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79/123 transgênicos agora disponíveis são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. Foi descrito, por exemplo, que a deleção homozigótica do gene da região de ligação de cadeia pesada de anticorpos (JH) em camundongos quiméricos e mutantes de linhagem germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do conjunto de genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana nesses camundongos com mutação da linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante desafio dos antígenos. vide, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); patente US 5.591.669; patente US 5.589.369; e patente US 5.545.807. Anticorpos humanos também podem ser preparados utilizando o camundongo SCID-hu (Duchosal et al. Nature 355:258-262 (1992)).

[0143] Em outro exemplo de realização, o anticorpo humano pode ser selecionado a partir de anticorpos gerados por bibliotecas de fagos. A preparação das bibliotecas de anticorpos ou de fragmentos destes é bem conhecida no estado da técnica e alguns dos métodos conhecidos podem ser usados para construir uma família de vetores de transformação que podem ser introduzidos na célula hospedeira. Bibliotecas da cadeia leve e cadeia pesada no fago (Huse et al., ciência, 246:1275 (1989)) ou da fusão de proteínas no fago ou fagomídeo podem ser preparadas de acordo com procedimentos conhecidos. Vide, por exemplo, Vaughan et al., Nature Biotechnology 14:309314 (1996); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:7978-7982 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:44574461 (1992); Griffiths et al., EMBO Journal, 13:3245-3260 (1994); de Kruif et al., J. Mol. Biol., 248:97-105 (1995); documento WO 98/05344; documento WO

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98/15833; documento WO 97/47314; documento WO 97/44491; documento WO 97/35196; documento WO 95/34648; patente US 5.712.089; patente US 5.702.892; patente US 5.427.,908; patente US 5.403.484; patente US 5.432.018; patente US 5.270.170; documento WO 92/06176; documento WO 99/06587; Patente US 5.514.548; documento WO97/08320; e patente US 5.702.892. O antígeno do interesse é selecionado de encontro à biblioteca do fago usando os procedimentos conhecidos neste campo para selecionar os anticorpos-fagos que se ligam ao antígeno alvo.

[0144] Os anticorpos descritos no presente pedido possuirão opcionalmente uma ou mais atividades ou propriedades biológicas desejadas. Tais anticorpos podem incluir, mas não estão limitados a; anticorpo quimérico, humanizado, humano e anticorpos maturados por afinidade. Como descrito acima, os anticorpos podem ser construídos ou projetado usando várias técnicas para se obter as atividades ou propriedades desejadas. Em uma incorporação, o anticorpo terá afinidade de ligação de pelo menos 10⁵ M^-1, preferivelmente pelo menos na escala de 10⁶ M^-1 a 10⁷ M^-1, mais preferivelmente, pelo menos na escala de 10⁸ M^-1 a 10¹² M^-1 e mais preferivelmente ainda, pelo menos na escala de 10⁹ M^-1 a 10¹² M^-1. A afinidade de ligação do anticorpo pode ser determinada sem experimentação excessiva testando o anticorpo de acordo com técnicas conhecidas, incluindo a análise de Scatchard (vide Munson et al.., supra).

[0145] Em outro exemplo de realização, o anticorpo da invenção pode se ligar no mesmo epítopo do qual os anticorpos descritos acima se ligam ou liga a uma epítopo que coincide ou se sobrepõe com epítopo ao qual os anticorpos descritos acima se ligam. A propriedade de ligação do anticorpo ao epítopo da presente invenção pode ser determinada usando técnicas conhecidas. Por exemplo, o anticorpo pode ser testado por ensaio in vitro, tal como um ensaio de inibição competitiva, para determinar a habilidade do

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81/123 anticorpo de inibir ou bloquear a interação de ligação conhecida.

3. Anticorpos Biespecíficos [0146] Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, preferencialmente humanos ou humanizados, que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Os métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos no estado da técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina, no qual as duas cadeias pesadas possuem especificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Devido à seleção aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, dos quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que normalmente é realizada através de etapas de cromatografia de afinidade. Procedimentos similares são descritos no documento WO 93/08829, publicado em 13 de maio de 1993 e em Traunecker et al., EMBO 10, 3655-2659 (1991).

[0147] Domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de antígeno-anticorpo) podem ser fundidos em sequências de domínios constantes de imunoglobulina. A fusão ocorre preferencialmente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões de articulação, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são co-transfectados em um organismo hospedeiro apropriado. Para detalhes adicionais sobre a geração de

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82/123 anticorpos biespecíficos, vide, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

4. Anticorpos Heteroconjugados [0148] Os anticorpos heteroconjugados também se encontram dentro do escopo da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos ligados covalentemente. Tais anticorpos são propostos, por exemplo, para direcionar células do sistema imune a células indesejadas (patente US 4.676.980) e para o tratamento de infecções por HIV (documento WO 91/00360; documento WO 92/200373; EP 03089). Contemplase que os anticorpos podem também ser preparados in vitro, utilizando métodos conhecidos na química de proteínas sintéticas, incluindo aqueles que envolvem agentes reticulantes. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas utilizando uma reação de troca de dissulfeto ou através da formação de ligação tioéter. Exemplos de reagentes apropriados para este propósito incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e aqueles descritos, por exemplo, na patente US 4.676.980.

5. Triacorpos [0149] Triacorpos também se encontram dentro do escopo da presente invenção. Estes anticorpos são descritos, por exemplo, em Iliades et al., supra, e Kortt et al., supra.

6. Outras Modificações [0150] Outras modificações do anticorpo são contempladas na presente invenção. Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser modificados através de conjugação do anticorpo a um agente citotóxico (como uma molécula de toxina) ou uma enzima ativadora de pró-drogas que converte uma pró-droga (por exemplo, um agente quimioterápico de peptidíla, vide documento WO 81/01145) em uma droga anti-câncer ativa. Vide, por exemplo, o documento WO 88/07378 e a Patente US 4.975.278. Esta

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83/123 tecnologia também é denominada “Terapia de Pró-Drogas Mediada por Enzima Dependente de Anticorpos” (ADEPT).

[0151] O componente de enzima do imuno-conjugado útil para o ADEPT inclui qualquer enzima capaz de atuar sobre uma pró-droga, de forma a convertê-la na sua forma citotóxica mais ativa. Enzimas que são úteis no método de acordo com a presente invenção incluem, mas sem limitar-se a, fosfatase alcalina útil para a conversão de pró-drogas que contêm fosfato em drogas livres; arilsulfatase útil para a conversão de pró-drogas que contêm sulfato em drogas livres; citosina deaminase útil para a conversão de 5fluorocitosina não-tóxica na droga anti-câncer, 5-fluorouracil; proteases, tais como serratia protease, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas B e L) que são úteis para a conversão de pró-drogas que contêm peptídeos em drogas livres; caspases, tais como caspase-3; Dalanilcarboxipeptidases, úteis para a conversão de pró-drogas que contêm substituintes D-aminoácidos; enzimas que clivam de carboidratos, tais como beta-galactosidase e neuraminidase, úteis para a conversão de pró-drogas glicosiladas em drogas livres; beta -lactamase útil para a conversão de drogas derivadas com beta-lactamas em drogas livres; e penicilina amidases, tais como penicilina V amidase ou penicilina G amidase, úteis para a conversão de drogas derivadas nos seus nitrogênios amina com grupos fenoxiacetila ou fenilacetila, respectivamente, em drogas livres. Alternativamente, anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos na técnica como “abzimas”, podem ser utilizados para converter as pró-drogas de acordo com a presente invenção em drogas ativas livres (vide, por exemplo, Massey, Nature 328: 457458 (1987)). Conjugados de anticorpo e abzima podem ser preparados conforme descrito no presente pedido para fornecimento da abzima a uma população de células tumorais.

[0152] As enzimas podem ser ligadas covalentemente aos

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84/123 anticorpos por meio de técnicas bem conhecidas no estado da técnica, tais como o uso de reagentes reticulantes heterobifuncionais. Alternativamente, as proteínas de fusão que compreendem pelo menos a região de ligação de antígenos de um anticorpo de acordo com a presente invenção ligada a pelo menos uma parte funcionalmente ativa de uma enzima de acordo com a presente invenção podem ser construídas utilizando métodos de DNA recombinante bem conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984).

[0153] Como é conhecido no estado da técnica, anticorpos, tais como os utilizados nos imunoensaios para a detecção de um fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4); pode ser conjugado com uma variedade de agentes de formação de imagem diagnóstica. A conjugação pode ser feita diretamente entre os anticorpos e os agentes de formação de imagem diagnóstica ou ligando, ou podem ser fornecidos grupos moleculares intermediadores entre os anticorpos e o agente de formação de imagem. Reticulantes frequentemente utilizados facilitam a conjugação fornecendo penhora sítios de acoplamento de cada agrupamento. Reticulantes podem incluir grupos moleculares adicionais que servem como espaçadores para separar cada fração evitando interferências nas atividades entre eles.

[0154] A imagem pode ser obtida por muitos processos bem conhecidos pelos técnicos do assunto e agentes de formação de imagem apropriados úteis em tais procedimentos podem ser conjugados com um anticorpo bem por meios bem conhecidos no estado da técnica. As imagens podem ser realizadas, por exemplo, visualizando os resultados de um procedimento Western, por radio cintigrafia, imagem por ressonância nuclear magnética (MRI) ou tomografia computadorizada (CT scan). Agentes de cintilografia comumente empregados incluem iodo e índio radioativo. Imagens por tomografia

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85/123 computadorizada pode empregar um metal pesado, como quelato de ferro. Varreduras por MRI podem empregar quelatos de manganês ou de gadolínio. Adicionalmente, a Tomografia por Emissão de Pósitrons (PET) é possível utilizar emissores de pósitron de oxigênio, nitrogênio, ferro, carbono ou gálio. Exemplos de radionuclídeos úteis em procedimentos de obtenção de imagens incluem: K⁴³, Fe⁵², Co⁵⁷, Cu⁶⁷, Ga⁶⁷, Ga⁶⁸, Br⁷⁷, Rb⁸¹, In¹¹¹, In¹¹³, I¹²³, I¹²⁵, Cs¹²⁷, Cs¹²⁹, I¹³¹, I¹³², Hg¹⁹⁷, Pb²⁰³ e Bi²⁰⁶, Magerstadt, M. (1991) Antibody Conjugates And Malignant Disease, CRC Press, Boca Raton, Flórida, e Barchel, PB e Rhodes, BH, (1983) Radioimaging and Radiotherapy, Editora Elsevier, NY, cada um dos quais é incorporado ao presente documento pela referência, ensina a conjugação de vários radionuclídeos terapêuticos e diagnóstico para aminoácidos de anticorpos. Estas reações podem ser aplicadas para conjugar radionuclídeos a anticorpos com um ligante adequado. Marcadores adequados incluem, por exemplo, radionuclídeos, enzimas (por exemplo, peroxidase do rábano silvestre), substratos, co-fatores, inibidores, fluoróforos, quimioluminescentes e/ou partículas magnéticas. Vide, por exemplos, patentes que ensinam o uso de tais marcadores, Patentes US 3817837, US 3850752, US 3939350, US 3996345, US 4277437, US 4275149 e US 366241, todas as quais são incorporadas pela referência.

[0155] São contempladas modificações adicionais de anticorpos. Por exemplo, o anticorpo pode estar ligado a um dentre uma variedade de polímeros não-proteináceos, tais como polietilenoglicol, polipropilenoglicol, polioxialquilenos ou copolímeros de polietilenoglicol e polipropilenoglicol. O anticorpo pode também ser acondicionado em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de aglutinação ou por polimerização interfacial (por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metacrilato de metila), respectivamente), em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Estas

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86/123 técnicas são descritas em Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16^a edição, Oslo, A., Ed. (1980). Para aumentar a meia-vida do anticorpo em soro pode-se incorporar um epítopo de ligação de receptores salvos ao anticorpo (especialmente fragmento de anticorpo), conforme descrito, por exemplo, na Patente US 5.739.277. Da forma utilizada no presente pedido, a expressão “epítopo de ligação de receptores salvos” designa um epítopo da região Fc de uma molécula IgG (tal como IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da meia-vida em soro in vivo da molécula IgG.

7. MÉTODOS Recombinantes [0156] A presente invenção também fornece ácidos nucléicos isolados que codificam anticorpos um polipeptídeo de interesse como, por exemplo, fragmentos de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4) e/ou anticorpos descritos no presente pedido, vetores e células hospedeiras que compreendem o ácido nucléico e técnicas recombinantes para a produção do anticorpo.

[0157] Para a produção recombinante do polipeptídeo de interesse, o ácido nucléico que o codifica é isolado e inserido em um vetor replicável para clonagem adicional (amplificação do DNA) ou para expressão. O DNA codificador do polipeptídeo é facilmente isolado e sequenciado através da utilização de procedimentos convencionais (utilizando-se, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes codificadores do polipeptídeo de interesse). Muitos vetores são disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não se limitam a, um ou mais dos seguintes componentes: sequência sinalizadora, origem de replicação, um ou mais genes marcadores, elemento amplificador, promotor e sequência de término de transcrição.

[0158] Os métodos do presente incluem métodos para a produção

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87/123 de anticorpos quiméricos ou recombinantes que se liga a fragmentos de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4) e que compreende as etapas de fornecimento do vetor contendo uma sequência de DNA que codifica uma cadeia pesada ou cadeia leve de anticorpo (ou ambas, cadeia leve e cadeia pesada), transfecção ou transformação da célula hospedeira com o vetor e a cultura da(s) célula(s) hospedeira(s) sob condições suficientes para produzir o produto recombinante.

(I) Componente Sequência Sinalizadora [0159]O polipeptídeo de interesse de acordo com a presente invenção pode ser produzido de forma recombinante não apenas diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo que é, preferencialmente, uma sequência sinalizadora ou outro polipeptídeo que possui um sítio de clivagem específico no N-terminal do polipeptídeo ou proteína madura. A sequência sinalizadora heteróloga selecionada é, preferencialmente, aquela que é reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase sinalizadora) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam a sequência sinalizadora de anticorpo nativo, a sequência sinalizadora é substituída por uma sequência sinalizadora procariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou líderes de enterotoxina II estáveis ao calor. Para secreção de leveduras, a sequência sinalizadora nativa pode ser substituída, por exemplo, pelo líder de invertase de levedura, líder do fator α (que inclui líderes de fatores α de Saccharomyces e Kluyveromyces) ou líder de fosfatase ácida, o líder de glicoamilase de C. albicans ou o sinal descrito no documento WO 90/13646. Na expressão de células de mamíferos, são disponíveis sequências sinalizadora de mamíferos, bem como líderes de secreção viral, tais como o sinal gD da herpes simplex.

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88/123 [0160] O DNA para essa região precursora é ligado na matriz de leitura ao DNA codificador do polipeptídeo.

(II) Componente Origem De Replicação [0161] Tanto os vetores de expressão como de clonagem contêm uma sequência de ácido nucléico que permite que o vetor replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clonagem, esta sequência é aquela que permite que o vetor replique independentemente do DNA cromossômico hospedeiro e inclui origens de replicação ou sequências de replicação autônoma. Estas sequências são bem conhecidas para uma série de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é apropriada para a maior parte das bactérias gram-negativas, a origem de plasmídeo 2μ é apropriada para levedura e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para a clonagem de vetores em células de mamíferos. Geralmente, a origem do componente de replicação não é necessária para vetores de expressão de mamíferos (a origem SV40 pode ser tipicamente utilizada somente porque contém o promotor inicial).

(iii) Componente Gene de Seleção [0162] Os vetores de clonagem e de expressão podem conter um gene de seleção, também denominado marcador selecionável. Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, tais como ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina; (b) complementam deficiências auxotróficas ou (c) fornecem nutrientes importantes não-disponíveis a partir de meios complexos, tais como o gene codificador de D-alanino racemase para Bacilli.

[0163] Um exemplo de seleção que utiliza uma droga para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas com sucesso por um gene heterólogo que produz uma proteína

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89/123 que confere resistência a drogas e, desta forma, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos desta seleção dominante utilizam as drogas neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

[0164] Outro exemplo de marcadores selecionáveis apropriados para células de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células competentes para absorver o ácido nucléico, tal como DHFR, timidino quinase, metalotioneína I e II, preferencialmente, genes da metalotioneína de primatas, adenosina deaminase, ornitina decarboxilase etc.

[0165] Células transformadas pelo gene de seleção DHFR são, por exemplo, identificadas em primeiro lugar pela cultura de todos os transformantes em um meio de cultura que contenha metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando é utilizado o gene DHFR do tipo selvagem é a linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO) com deficiência na atividade DHFR.

[0166] Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente, hospedeiras do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou cotransformadas com sequências de DNA que codificam o polipeptídeo de interesse, proteína DHFR do tipo selvagem e outro marcador selecionável tal como aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas através do crescimento celular em um meio que contém um agente de seleção para o marcador selecionável tal como antibiótico aminoglicosídico, por exemplo canamicina, neomicina ou G418. Vide a Patente US 4.965.199.

[0167] Um gene de seleção apropriado para uso em levedura é o gene trp1 presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)). O gene trp1 fornece um marcador de seleção para uma linhagem mutante de levedura que não possui a capacidade de crescer em triptofano, tal como ATCC N° 44076 ou PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). A presença da lesão trp1 no genoma de célula hospedeira de levedura

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90/123 fornece então um ambiente eficaz para detectar a transformação através de crescimento na ausência de triptofano. De forma similar, linhagens de levedura com deficiência de Leu2 (ATCC 20.622 ou 38.626) são complementadas por plasmídeos conhecidos que contêm o gene Leu2.

[0168] Além disso, vetores derivados do plasmídeo circular pKD1 podem ser utilizados para a transformação de leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, um sistema de expressão para a produção em larga escala de quimosina de bezerro recombinante foi descrita para a K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Também foram descritos vetores de expressão de múltiplas cópias estáveis para secreção de albumina de soro humano recombinante madura por linhagens industriais de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991).

(iv) Componente Promotor [0169] Os vetores de expressão e clonagem normalmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operacionalmente ligado ao ácido nucléico. Os promotores apropriados para utilização com hospedeiros procarióticos incluem o promotor phoA, sistemas promotores de lactose e β-lactamase, fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos, tais como o promotor tac. Entretanto, são apropriados outros promotores bacterianos conhecidos. Os promotores para uso em sistemas bacterianos também conterão uma sequência ShineDalgarno (S. D.) operacionalmente ligada ao DNA que codifica o polipeptídeo de interesse.

[0170] São conhecidas sequências promotoras para eucariontes.

Virtualmente todos os genes eucarióticos contêm uma região rica em AT localizada a cerca de 25 a 30 bases à montante (uspstream) do sítio onde é iniciada a transcrição. Outra sequência localizada a 70 a 80 bases à montante (uspstream) do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT

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91/123 onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maior parte dos genes eucarióticos, encontra-se uma sequência AATAAA que pode ser o sinal para adição da calda poli-A na extremidade 3' da sequência de codificação. Todas estas sequências são inseridas de maneira adequada em vetores de expressão eucarióticos.

[0171]Exemplos de sequências promotoras apropriadas para uso com hospedeiros de leveduras incluem os promotores para 3fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato decarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glicoquinase.

[0172] Outros promotores de levedura, que são promotores induzíveis que possuem a vantagem adicional da transcrição controlada pelas condições do crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradantes associadas ao metabolismo de nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3fosfato desidrogenasse e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Os vetores apropriados e promotores para uso na expressão de levedura encontram-se adicionalmente descritos na Patente EP 73.657. Amplificadores de leveduras também são utilizados vantajosamente com promotores de leveduras.

[0173] A transcrição de vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como vírus de polioma, vírus da catapora, adenovírus (tal como adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e, de maior preferência, Vírus Símio 40 (SV40), a partir de promotores de mamíferos heterólogos, tais como o

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92/123 promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que esses promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

[0174] Os promotores inicial e final do vírus SV40 são obtidos convenientemente na forma de fragmento de restrição SV40 que também contém a origem viral SV40 de replicação. O promotor inicial imediato do citomegalovírus humano é obtido convenientemente na forma de fragmento de restrição HindlII E. Um sistema de expressão de DNA em hospedeiros mamíferos utilizando o vírus de papiloma bovino como vetor é descrito na Patente US 4.119.446. Uma modificação deste sistema é descrita na Patente US 4.601.978. Vide também Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982) sobre a expressão de cDNA de interferon-γ humano em células de camundongos sob o controle de um promotor timidina quinase de vírus da herpes simplex. Alternativamente, a repetição terminal longa de vírus do sarcoma de Rous pode ser utilizada como promotor.

(v) Componente Elemento Amplificador [0175] A transcrição de um DNA que codifica um polipeptídeo de interesse de acordo com a presente invenção por eucariontes superiores é frequentemente aumentada através da inserção de uma sequência amplificadora no vetor. Muitas sequências amplificadoras são agora conhecidas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, entretanto, será utilizado um amplificador de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o amplificador SV40 sobre o lado oposto da origem de replicação (100-270 bp), o amplificador promotor inicial de citomegalovírus, o amplificador de polioma na extremidade co-lateral da origem de replicação e amplificadores de adenovírus. Vide também Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) sobre elementos de promoção para a ativação de promotores eucarióticos. O amplificador pode também sofrer splicing no vetor em posição

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5' ou 3' para a sequência codificadora de anticorpo, mas encontra-se localizado, preferencialmente, em um sítio a 5' do promotor.

(vi) Componente Término de Transcrição [0176] Os vetores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (leveduras, fungos, insetos, plantas, animais, seres humanos ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão sequências necessárias para o término de transcrição e para a estabilização do RNAm. Estas sequências são comumente disponíveis a partir das regiões não-traduzidas 5' e, ocasionalmente, 3' de cDNAs ou DNAs virais ou eucarióticos. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos na forma de fragmentos poliadenilados na porção não-traduzida do RNAm codificador do anticorpo multivalente. Um componente de término de transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. Vide o documento WO 94/11026 e o vetor de expressão nele descrito.

(vii) Seleção e Transformação de Células Hospedeiras [0177] As células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores do presente são as células de procariontes, leveduras ou eucariontes superiores descritas acima. Os procariontes apropriados para este propósito incluem eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo, enterobactérias tais como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P descrito na Patente DD 266.710, publicada em 12 de abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outras linhagens tais como E. coli B, E. coli

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X1776 (ATCC 31.537) e E. coli W3110 (ATCC 27.325) sejam apropriadas. Estes exemplos são ilustrativos e não-limitadores.

[0178] Além de procariontes, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de expressão ou clonagem apropriados para vetores. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura comum de padaria, é o mais comumente utilizado entre microorganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. Entretanto, uma série de outros gêneros, espécies e linhagens estão comumente disponíveis e são úteis no presente pedido, como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros Kluyveromyces, tais como K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K . thermotolerans e K. marxianus; yarrowia (Patente EP 402.226); Pichia pastoris (Patente EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (Patente EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos, tais como Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e hospedeiros Aspergillus, tais como A. nidulans e A. niger.

[0179] As células hospedeiras apropriadas para a expressão do polipeptídeo de interesse são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas variantes e linhagens bacilovirais e células hospedeiras de insetos permissivas correspondentes de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca das frutas) e Bombyx mori. Uma série de linhagens virais para transfecção está disponível ao público, tais como a variante L-1 de Autographa californica NPV e a linhagem Bm-5 de Bombyx mori NPV e esses vírus podem ser utilizados como o vírus do presente de acordo com a presente invenção, particularmente, para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

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95/123 [0180] Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e fumo podem também ser utilizadas como hospedeiros.

[0181] Entretanto, tem aumentado o interesse sobre células de vertebrados e a propagação destas células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos), que tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 4216 (1980)); células sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de buffalo rat (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; linhagem de hepatoma humano (Hep G2); e células de mieloma ou linfoma (tais como células Y0, J558L, P3 e NS0) (vide Patente US 5.807.715).

[0182] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de clonagem ou expressão descritos acima para a produção do polipeptídeo de interesse e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para a indução de promotores, seleção de transformantes ou amplificando os genes codificadores das sequências desejadas.

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96/123 (viii) Cultura das Células Hospedeiras [0183] As células hospedeiras utilizadas para a produção do polipeptídeo de interesse de acordo com a presente invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios de cultura. Meios comercialmente disponíveis tais como F10 de Ham (Sigma), Meio Mínimo Essencial (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificado da Dulbecco (DMEM, Sigma) são apropriados para a cultura de células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes US 4.767.704, US 4.657.866, US 4.927.762,US 4.560.655 ou US 5.122.469; Documento WO 90/03430; Documento WO 87/00195; ou Patente US 30.985 podem ser utilizados como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores do crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como droga GENTAMYCIN™), elementos de traço (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário pode também ser incluído em concentrações apropriadas conhecidas dos técnicos no assunto. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, são as utilizadas anteriormente com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para os técnicos no assunto.

(IX) Purificação [0184] Quando técnicas recombinantes são utilizadas, o polipeptídeo de interesse pode ser produzido de forma intracelular, no espaço periplásmico ou secretado diretamente no meio. Caso o anticorpo seja

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97/123 produzido de forma intracelular, como primeira etapa, os fragmentos particulados, sejam células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, através de centrifugação ou ultrafiltragem. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) descrevem um procedimento de isolamento de anticorpos que são secretados para o espaço periplásmico da E. coli. Resumidamente, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) durante cerca de 30 minutos. Restos celulares podem ser removidos através de centrifugação. Quando o e interesse for secretado para o meio sobrenadante desses sistemas de expressão, eles são, primeiramente concentrados em utilizando-se um filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente, tal como unidade de ultrafiltragem Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer uma das etapas anteriores para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para evitar o crescimento de eventuais contaminantes.

[0185] A composição preparada a partir das células pode ser purificada utilizando-se, por exemplo, cromatografia de hidroxiapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia por afinidade, sendo a cromatografia por afinidade a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína A como ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer região Fc de imunoglobulina que se encontra presente no anticorpo. A Proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas γ1, γ2, ou γ4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongos e para γ3 humano (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). A matriz à qual o ligante de afinidade é acoplado, frequentemente é agarose, mas outras matrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro de poros controlados ou poli-(estirenodivinil)-benzeno, permitem

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98/123 velocidades de fluxo maiores e tempos de processamento mais curtos do que os que podem ser atingidos com agarose. Quando o anticorpo compreender um domínio Ch3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg NJ é útil para purificação. Outras técnicas de purificação de proteínas, tais como fracionamento sobre uma coluna de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina Sepharose^™, cromatografia em uma resina de troca aniônica ou catiônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação de sulfato de amônio também são disponíveis, dependendo do anticorpo a ser recuperado.

III. Artigos Manufaturados [0186] Em outro exemplo de realização da presente invenção, é fornecido um artigo manufaturado que contém materiais úteis para a pratica das realizações descritas acima. O artigo manufaturado compreende um recipiente e um rótulo. Os recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, ampolas, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados por uma série de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para a observação da apoptose e pode apresentar um orifício de aceso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, uma ampola ou saco de solução intravenosa que contém uma tampa perfurável por agulha de injeção hipodérmica). Os agentes na composição podem incluir um ou mais anticorpos que se liga a um fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1), cadeia pesada de clatrina (SEQ ID NO: 2), AP1/2P (SEQ ID NO: 3) ou dinamina (SEQ ID NO: 4). O rótulo sobre o recipiente ou associado a ele indica que a composição é utilizada para a observação da apoptose. O artigo manufaturado pode compreender adicionalmente um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como uma solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele

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99/123 pode incluir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e de um usuário, que incluem outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções de uso.

[0187] Em um desses exemplos de realização, a presente invenção fornece kits que podem ser usados na detecção da apoptose celular e no diagnóstico de doenças a ela relacionadas. Um destes kits inclui: (1) um anticorpo primário capaz de se ligar a um fragmento de proteína produzido durante a apoptose, (2) um anticorpo secundário conjugado com um marcador que produz um sinal detectável, sendo que o anticorpo secundário se liga ao anticorpo primário, e (3) um reagente produtor de sinal terciário capaz de reconhecer o anticorpo secundário marcado. Outro kit que é útil para a detecção de fragmentos de proteína gerados nas apoptose de acordo com a presente invenção inclui (1) um primeiro anticorpo capaz de se ligar ao fragmentos de proteína gerados durante a apoptose; e (2) um segundo anticorpo conjugado com um marcador produtor de sinal, sendo o segundo anticorpo também reativo com os fragmentos de proteína gerado na apoptose, mas que se liga a um sítio diferente daquele ao qual o primeiro anticorpo se liga.

[0188] Em realizações de kits da presente a invenção, o marcador produtor de sinal ligado ao anticorpo secundário pode ser, por exemplo, uma enzima, tal como a peroxidase ou fosfatase alcalina. Preferencialmente, tanto a enzima quanto o substrato são fornecidos no kit. O kit pode também incluir um suporte não revestido sobre o qual a amostra a ser analisada, ou o primeiro anticorpo, pode ser imobilizado.

IV. Utilizando Os Métodos e Materiais da Invenção Para Examinar Os

Processos Celulares Associados À Apoptose [0189] Os métodos e materiais da invenção podem ser usados para examinar uma ampla variedade de processos celulares, tal como a

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100/123 endocitose. Certos exemplos de realização da presente invenção observam, por exemplo, as alterações na taxa de endocitose celular como um indicador de apoptose, com uma inibição na endocitose como evidencia de apoptose. A endocitose é fundamental para diversos aspectos da homeostase celular. A endocitose internaliza proteínas-(PM) associadas à membrana plasmática através de vesículas ligadas a membrana, dando suporte a várias funções celulares, incluindo a absorção de nutriente, sinalizando fatores de crescimento e manutenção da homeostase da membrana (vide, por exemplo, Conner, SD et. al., Nature 422, 37-44 (2003)). Uma das vias mais bem caracterizadas da endocitose conta com a proteína clatrina (vide, por exemplo, Bonifacino, JS et. al., Annu. Rev Biochem 72,395-447 (2003)). Adaptadores de clatrina, como o proteína adaptadora 2 (AP2), liga a clatrina aos determinantes de carga endocítica durante a formação da invaginação da PM conhecida como cavidades revestidas de clatrina. Adaptadores também desempenham funções de “andaimes” na endocitose, pelo recrutamento de acessórios ou proteínas reguladoras (vide, por exemplo, Owen, DJ, et. al., P.R. Annu Rev Dev Biol Cell 20:153-91 (2004)). A hidrólise de GTP pela dinamina direciona a cisão dos poços revestidos profundamente invaginados para a liberação das vesículas de transporte endocíticas da PM. Após perderem o seu revestimento de clatrina, as vesículas se fixam e se fundem com endossomas primários, quando a carga é distribuída a diferentes destinos, por exemplo, membranas túbulo-vesicular endossomal para recompor a PM, ou membranas internas dos endossomas multivesiculares de degradação lisossomal.

[0190] Utilizando os materiais é métodos da presente invenção demonstra-se que receptores de morte pró-apoptóticos (DRs) ativam a destruição seletiva da maquinaria da endocitose dependente de clatrina. A estimulação de DR induz rapidamente, a clivagem mediada pela caspase dos componentes chaves da via da clatrina, parando a captação celular da proteína

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101/123 de transporte clássica transferrina. O iniciador da caspase proximal DR cliva a subunidade do adaptador AP2a da clatrina entre os diferentes domínios funcionais, enquanto as caspases efetoras processam as cadeias pesadas de clatrina. É demonstrado que DR5 sofre endocitose mediada por clatrina dependente de ligante, dando provas de que a interiorização do complexo de sinalização DR-clatrina facilita a transferência da via da clatrina pelas caspases. Um bloqueador de endocitose, o gene dinamina-1 sensível à temperatura mutantes atenuados leva a interiorização de DR, amplificando a estimulação das caspases à jusante de DR e aumentando a apoptose. Assim, a atividade da caspase ativada por DR desorganiza a endocitose dependente de clatrina, levando a amplificação da morte celular programada.

[0191] Aplicações ilustrativas adicionais dos métodos e materiais da invenção são descritas a seguir.

A Ativação De DR Induz A Clivagem Da Maquinaria Endocítica Dependente

De Clatrina Mediada Pela Caspase [0192] Nos estudos sobre DR5 na endocitose, observou-se que o ligante de DR5 Apo2L/TRAIL desencadeada uma clivagem proteolítica da subunidade da AP2 (AP2a). A análise de várias linhagens celulares de câncer mostrou que Apo2L/TRAIL promove não só a esperada transformação da caspase-8 e caspase-3, mas também cliva a AP2a, AP1/2P e a cadeia pesada de clatrina (CHC) (Fig. 1a). Estes eventos ocorreram no intervalo de 2 horas, e foram restritos às linhagens de células sensíveis à apoptose induzida pela Apo2L/TRAIL, tais como Colo205, BJAB, e Hela-M, em comparação com linhagens de células resistentes, como a HCT8 (Fig. 1a). Outras linhagens celulares confirmaram esta observação (Fig. 7a). A clivagem da AP2A estimulada pelo FasL e CHC em células BJAB comparada à Apo2L/TRAIL (Fig. 7b). A Apo2L/TRAIL também induziu a clivagem da dinamina, levando a depleção da proteína de comprimento total que iniciou em 1 hora de

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102/123 estimulação (Fig. 7c). Em um intervalo de tempo semelhante, a Apo2L/TRAIL não induziu a proteólise de adaptadores estruturalmente análogos que medeiam outros tipos de eventos de transporte vesicular dependentes de clatrina (Fig. 1b). Estes incluíram AP1a, AP3P e γ, e AP4s, que dão suporte ao transporte entre as redes de transporte entre o complexo de Golgi e os endossomas, e as subunidades COP-I, β-COP ou a COP-II subunidade Sec23, que medeiam o transporte entre retículo endoplasmático e aparelho de Golgi (vide, por exemplo, Bonifacino, JS et. al., Anna Rev Biochem 72:395-447 (2003) e McMahon, HT et. al., Curr Opin Cell Biol 16:379-91 (2004)). Portanto, a ativação de DR promove a clivagem rápida e específica de proteínas envolvidas na endocitose dependente de clatrina.

[0193] O pré-tratamento com o inibidor da pancaspase Nbenziloxicarbonil-Val-Ala-Asp-fluorometilcetona (zVAD-fmk), na dose que inibiu o processamento da caspase-8 e caspase-3 induzida pelo ligante e impediu a clivagem e AP2a e CHC (Fig. 2a), bem como da AP2a em células BJAB (Fig. 8a), indicando uma condição para a atividade da caspase. Além disso, embora Apo2L/TRAIL e FasL induziram a clivagem da AP2a e CHC em células T Jurkat wt, nenhum dos dois ligantes estimulou o processamento desses alvos nas linhagens de células Jurkat mutantes deficientes de caspase-8 ou deficientes de FADD (Fig. 8b). a clivagem de AP2a foi rápida e se correlacionou com um tempo de processamento da caspase-8 enquanto que esta precede o processamento da caspase-3 (Fig. 1a). Em contrapartida, a clivagem de CHC foi relativamente mais lenta e se correlacionou melhor com o tempo de processamento da caspase-3. Nas células HCT116, a ativação da caspase-3 e a indução da apoptose pela Apo2L/TRAlL necessitou de Bax, enquanto a estimulação da caspase-8 não (vide, por exemplo, LeBlanc, HN et. al., Cell Death Differ 10:66-75 (2003). Como esperado, o estímulo com Apo2L/TRAIL processou ambas as caspase-8 e -3 nas células 'HCT116 Bax+^/-, mas apenas a

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103/123 caspase-8 nas células HCT116 Bax~ (Fig. 2b, c). A clivagem de AP2a foi independente de Bax, enquanto que a clivagem de CHC exigiu Bax (Fig. 2b, c). Em células MCF7, que são deficientes de caspase-3, a Apo2L/TRAIL induziu um processamento da caspase-8 e AP2a relativamente fraco e lento, mas não estimulou a clivagem de CHC (Fig. 2d) (vide, por exemplo, Kischkel, FC et al., Immunity 12, 611-20 (2000)). Além disso, o bloqueio “knockdown” da caspase3 com siRNA nas células HT1080 bloqueou o processamento da CHC induzida por ligante mas não bloqueou o processamento da AP2a (Fig. 8c). Estes resultados fornecem evidências de que o iniciador das caspases na via do DR cliva a AP2a, enquanto as caspases efetoras processam CHC.

[0194] AP2a contém duas grandes partes funcionais, ligadas por uma região de articulação: o domínio C-terminal “orelha” e domínio N-terminal “tronco” (vide, por exemplo, Owen, DJ, et. al, Annu Rev Dev Biol Cell 20:153-91 (2004)). Para definir o sítio primário da clivagem da AP2a, o produto da clivagem de 33 kDa do C-terminal foi imunopurificado de células BJAB e a identidade de seus peptídeos trípticos foram confirmados por espectrometria de massa (Fig. 9a). O sequenciamento do N-terminal revelou GPAAQPSLGPTPEEAFLS, uma sequência imediatamente à montante de DVFD (Fig. 9a), uma sequência tetrapeptídica que se assemelha ao sítio de reconhecimento da caspase bem caracterizado (vide, por exemplo, Stennicke, HR, et. al, Biochem J 350 Pt 2, 563 -8 (2000)). O sítio de clivagem possui Asp e Gly nas respectivas posições P1 e P1' flanqueando as ligações cindíveis, e uma Asp na posição P4, que é em tolerada pela caspase-8 (vide, por exemplo, Blanchard, H. et al. J Mol Biol 302: 9-16 (2000)). Enquanto esta sequência do sítio de clivagem tetrapeptídica está presente na isoforma A do AP2a, ela está ausente na isoforma C.

[0195] Coerente com esta diferença, a Apo2L/TRAIL não induziu a clivagem da isoforma C, que estava muito menos abundante do que a isoforma

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A, nas células BJAB, Colo205, LS1034 e SW948. Essa sítio de clivagem AP2a esta presente na região articulada (Fig. 9b), fornecendo evidencias de que a sua hidrólise pode perturbar a função de AP2. Em certas linhagens de células a estimulação pelo ligante por um período maior de tempo, levaram ao processamento adicional da AP2a em um sítio secundário, que parece estar presente nos fragmentos iniciais de 33 kDa (Fig. 7a e b).

[0196] Para avaliar as consequências funcionais destes eventos de clivagem mediados pela caspase, a captação da transferrina (Tf) foi estudada. A internalização da Tf acoplada ao receptor ocorre através de vesículas revestidas de clatrina e exige estritamente a AP2 (vide, por exemplo, Bonifacino, JS et. al., Annu Rev Biochem 72:395-447 (2003)). Para determinar a taxa de endocitose de Tf marcadas com fluorescentes, as medições foram restritas a fase inicial da captação linear, antes da internalização da proteína sofre reciclagem endocítica para a PM (Fig. 3a, encarte). A Apo2L/TRAIL inibiu a taxa de endocitose da Tf em células BJAB e Colo205 em cerca de 75%-85% (Fig. 3a, b); o tratamento prévio com zVAD-fmk inverteu substancialmente essa inibição (Fig. 3c). Portanto, a ativação do DR leva à interrupção da endocitose mediada pela clatrina dependente de caspase.

A Apo2L/TRAIL Induz A Endocitose De DR5 Mediada Pela Clatrina [0197] A clivagem rápida e seletiva dos componentes da via da clatrina forneceu provas de que a proximidade física dos DRs com as proteínas de revestimento clatrina poderiam facilitar eventos proteolíticos. Desta forma, pergunto-se, se o DR sofre estimulo mediante um ligante da endocitose mediada pela clatrina. Um anticorpo monoclonal (mAb 5C7) que reconhece o domínio extracelular do receptor sem competição pela ligação com o ligante foi utilizado (vide, por exemplo, Kischkel, FC et al., Immunity 12:611-20 (2000)). Incubação com quantidades saturadas de 5C7 a 37°C não afetou os níveis de DR5 na superfície, conforme detectado por outro, mAb que não se sobrepõe ao

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105/123 primeiro, verificando que o 5C7 por si não altera a endocitose de DR5. Foi preparado um conjugado fluorescente de mAb 5C7 (5C7⁶⁴⁷), vinculada a células Colo205 a 0 °C, e sem seguida foi mensurada a cinética da endocitose de DR5 a 37°C (Fig. 4a). A exposição da Apo2L/TRAIL a formas triméricas ou multiméricas (anticorpo-reticulado) acelerou de forma similar a taxa de endocitose de DR5 em cerca de 2 vezes (Fig. 4a), levando a internalização de ~ 1/3 do receptor durante 2h, principalmente nos 30 min iniciais (Fig. 4b). De modo correspondente, o DR5 na superfície da célula diminuiu durante os primeiros 30 minutos de estimulação, após o qual este pool de DR5 se estabilizou (Fig. 4c). Resultados semelhantes foram observados nas células BJAB. Em contraste com os dados obtidos após a breve exposição ao ligante, a 37°C (Fig. 4a), a exposição estendida por 2 hrs inibiu a endocitose de DR5 concomitantemente com o da Tf, reduzindo a taxa de endocitose em 2,5 ou 5 vezes respectivamente (Fig. 4d). Estes resultados fornecem evidências de que o a via da clatrina auxilia a endocitose de DR5. Além disso, em células Colo205 brevemente tratadas com Apo2L/TRAIL, foi localizada uma pequena fração da 5C7 da superfície celular nas vesículas revestidas de clatrina por microscopia eletrônica (EM), que não foi detectável na superfície de invaginações e cavéolas não-revestidas (Fig. 4f, h).

[0198] Em seguida, foi utilizada uma estratégia de intervenção estabelecida, que se baseou na expressão de uma dinamina-1 GTPase sensível a temperatura regulada pela doxiciclina (dyn^G273D) em células infectadas com retrovírus. Este mutante inibiu rápida e reversivelmente a endocitose dependente da clatrina após a mudança de uma temperatura permissiva (30°C) para uma temperatura não permissiva (38 °C) (vide, por exemplo, Damke, H., et al., J Cell Biol 131:69-80 (1995)). As primeiras experiências em células Hela-M confirmaram que a indução por doxiciclina interrompe a captação da Tf a 38 °C em células expressando dyn^G273D, mas

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106/123 não na células próximas que não expressam nem mesmo a 30°C (Fig. 5a-d, e fig. 10a) . Enquanto a expressão induzível de dyn^G273D nas células Hela-M ou Colo205 não foram suficientemente estáveis, esta expressão manteve-se estável na linhagem de células BJAB transfectadas, com um forte bloqueio na captação da Tf a 38 °C (Fig. 5e). A expressão de dyn^G273D estimulada pela doxiciclina também diminuiu a captação de DR5 induzida por ligante em ~25% a 30°C e ~10% a 38 °C. Em contrapartida, a endocitose foi semelhante em ambas as temperaturas na ausência de doxiciclina (Fig. 5f). Nas células Hela-M a indução de dyn^G273D seguida de modificação da temperatura para 38 °C também atenuou a captação de DR5 induzida por ligante; este efeito foi mais fraco do que nas células BJAB, provavelmente devido à diminuição da expressão de dyn^G273D (Fig. 10b). Para excluir a possibilidade pouco provável de que a diminuição da captação do DR5 nestes experimentos de captação de 20 min foi atribuída ao aumento da reciclagem endocítica, em vez de redução na taxa de endocitose melhor mensurada durante um intervalo de 4 min de captação, foi utilizado um mutante de dinamina dominante-negativo (dinamina^K44A) que interrompe incondicionalmente a endocitose dependente da clatrina (vide, por exemplo, Damke, H., et al., J Cell Biol 127:915-34 (1994)). A dinamina^K44A inibiu tanto a endocitose de Tf e quanto a de DR5 induzida em células Hela-M (Fig. 10c).

[0199] Juntamente com os dados da EM, estes resultados indicam que a captação de DR5 induzida pela Apo2L/TRAIL ocorre principalmente através da endocitose dependente de clatrina. Portanto, a proximidade física do DISC nos componentes das vesículas revestidas de clatrina pode facilitar as sua clivagem. Se verdadeiro, a montagem do DISC e a ativação de iniciadores da caspase não necessitariam da atual internalização das vesículas revestidas. Para testar esta hipótese, células BJAB foram mantidas em gelo para bloquear a endocitose de Tf (Fig. 11a). Apesar do bloqueio, a Apo2L/TRAIL e FasL e

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107/123 ainda recrutaram FADD e caspase-8 para seus respectivos receptores e processou a caspase-8 (Fig. 11b). Além disso, Apo2L/TRAIL induziu a formação comparável de DISC, processamento da caspase-8, e atividade da caspase-8 no DISC a 38 °C, apesar da inibição da endocitose por dyn^G273D (Fig. 11e e d).

Inibição Da Endocitose Mediada Pela Clatrina Aumenta A Ativação Da

Caspase Induzida Por DR E Apoptose [0200] A rápida clivagem das proteínas da via da clatrina fornece evidencias de que a interrupção da endocitose pode promover a ativação da caspase induzida por ligantes e a apoptose. De fato, o bloqueio da endocitose mediada pela dyn^G273D aumentou evidentemente o processamento induzido por ligante do pool celular total de caspase-8, Bid, AP2a e caspases-3 e -7 efetoras do lisado de toda a célula (Fig. 6a), sem alterar significativamente formação ou ativação do DISC (Fig. 11e e d). A análise quantitativa mostrou um aumento substancial na atividade enzimática das caspase-3/7 estimulada por ligante após a indução com dyn^G273D e da mudanças de temperatura para 38 °C em comparação com a temperatura de 30°C (Fig. 6b). Além disso, esta condição também resultou no aumento da apoptose (Fig. 6c), um efeito observado após o estímulo com seu ligante tipo-selvagem ou uma variante seletiva de DR5 (vide, por exemplo, Kelley, RF et al., J Biol Chem 280:2205-12 (2005)). Sensibilização foi evidente não só pelo desvio a esquerda da curva de doseresposta, mas também pelas porcentagens maximizadas de células com DNA fragmentado (Fig. 6c). Estes resultados indicam que o bloqueio da endocitose dependente de clatrina amplifica a ativação da caspase à jusante de DISC, levando a uma maior estimulação da apoptose.

[0201] Conforme descrito acima, usando métodos e materiais da presente invenção, foi descoberta uma interação inesperada entre a via extrínseca da apoptose e a maquinaria endocítica dependente de clatrina. Em

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108/123 minutos de ação de DR pró-apoptótico, caspases ativadas começam a clivar proteínas que medeiam a endocitose dependente de clatrina. A cinética relativamente rápida da clivagem de AP2a, o recrutamento de FADD e caspase-8 para este evento e a independência de Bax e caspase-3 fornecem evidências de que caspases proximais a DR, mais provavelmente caspase-8 e/ou caspase-10, realizam o processamento inicial da AP2a. De fato, o sítio de clivagem da caspase na articulação da AP2a se encaixa com sequências que caspase-8 é capaz de reconhecer (vide, por exemplo, Nicholson, DW, Cell Death Differ6:1028-42 (1999)).

[0202] A inibição da endocitose dependente de clatrina pela ativação de DR ocorreu no período de tempo que a estimulação da caspase e foi revertida pelo zVAD-fmk, demonstrando a sua dependência com a atividade da caspase. Foi mapeado o sítio de processamento primário da AP2a para a região de articulação. A articulação se liga ao domínio “orelha”, que auxilia o recrutamento da proteína acessória, para o domínio “tronco”, que medeia a associação da PM e carga de ligação em conjunto com outras subunidades AP2 (vide, por exemplo, Owen, DJ, et. al, Annu Rev Cell Biol Dev 20:153-91 (2004)). A superexpressão do domínio “orelha” da AP2a nas células COS7 inibe endocitose dependente de clatrina, um efeito abolido por mutações que impedem a ligação de proteínas acessórias (vide, por exemplo, Owen, DJ et al., Cell 97:805-15 (1999)). De modo contrário, em estudos com Drosophila nos quais algumas células expressam somente que AP2a sem o domínio “orelha” fornecer evidências que o domínio “orelha” não é necessário em geral para a endocitose (vide, por exemplo, Berdnik, D., et al., Dev Cell 3, 221-31 (2002)) . Desta forma, não está claro se apenas a clivagem da AP2a pela caspase é suficiente para bloquear a endocitose, ou se o processamento de outros componentes da via da clatrina também contribui com este bloqueio. Independentemente, a ativação da caspase mediada por DR interrompe

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109/123 rapidamente a endocitose dependente de clatrina.

[0203] Considerando que caspases ativadas acessam substratos revestidos de clatrina, os dados fornecem evidências que a estimulação com Apo2L/TRAIL, movimenta uma porção substancial de DR5 da superfície para dentro da célula através da endocitose dependente de clatrina. Estudos preliminares com microscopia eletrônica (EM) confirmam que DR5 está associado a vesículas revestidas de clatrina. Trabalhos recentes indicam que o bloqueio “knockdown” mediado com RNAi inibi a sinalização apoptótica da clatrina e AP2 através de Fas, a interpretação deste resultado revela que a endocitose requer um receptor de sinalização (vide, por exemplo, Lee, KH et al., EMBO J 25:1009-23 (2006 )). Em consideração as observações de que a montagem, ativação e apoptose pela Apo2L/TRAIL DISC, pode ainda ocorrer quando a endocitose é inibida pela incubação no gelo ou através da inativação da dinamina, sumariza-se que DR5 pode se ligar a FADD e caspase-8, enquanto permanece na superfície da célula, possivelmente dentro das vesículas revestida de clatrina. Com Isso, o bloqueio da endocitose pela incubação no gelo coma dinamina sensível a temperatura não interfere com a formação de vesículas revestidas e com o recrutamento da carga (vide, por exemplo, Damke, H., et al., J Cell Biol 131:69-80 (1995)). A ativação de DR causou a destruição quase completa da AP2a. Em contrapartida, o processamento da CHC e APl/2p envolveu apenas uma fração das proteínas totais da célula, possivelmente a fração que participou diretamente na endocitose de DR. Assim, a ativação da caspase próxima da internalização de DISC associado ao DR pode levar à destruição local dos componentes específicos da via da clatrina.

[0204]Uma dedução direta da constatação de que a caspase interrompe a endocitose mediada pela clatrina é que a eliminação deste mecanismo pode representar uma parte não reconhecida anteriormente do

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110/123 programa apoptótico; uma célula que esta sofrendo apoptose já não precisa captar nutrientes, responder a fatores de crescimento, ou manter a homeostase da membrana. Porém é pouco provável que essas clivagens por si só ativem a apoptose, enquanto ambas, clatrina e AP2 foram interrompidas “knocked down” eficientemente usando siRNAs por uma variedade de laboratórios diferentes, se nenhum deles relatarem um aumento na apoptose. Notavelmente, drogas citotóxicas que causam danos ao DNA, vinblastina e adriamicina induziram também a clivagem de componentes da maquinaria da clatrina, embora com uma cinética muito mais lenta do que os ligantes de DR (Fig. 12). Por outro lado, o processamento de adaptadores de clatrinas mediada por caspases podem desempenhar um papel importante também na modulação de células não apoptóticas: Nas células dendríticas imaturas, a atividade basal da caspase leva a clivagem de várias subunidades da adaptina, enquanto a inibição deste efeito com zVAD promove a maturação da célula dendrítica (vide, por exemplo, Santambrogio, L. et al., Nat Immunol 6:1020-8 (2005)).

[0205]Uma segunda dedução, talvez mais surpreendente, da interação entre os DRs e a maquinaria endocítica da clatrina é que essa interação proporciona um ciclo de feedback positivo que reforça a ativação da caspase através da via extrínseca. De acordo com este modelo, a endocitose dos DRs ativados se opõe a sinalização apoptótica para preservar a sobrevida das células se a maquinaria da clatrina permanece intacta, por exemplo, em resposta aos níveis sub-limiar de ligante. Entretanto, se a estimulação de DR gera uma estimulação suficiente na atividade da caspase para perturbar a endocitose, então o sinal persiste, ampliando ainda mais a ativação da caspase e promovendo a apoptose. É concebível, que a endocitose de DR poderia opor-se a sinalização de DR através da degradação lisossomal, alguma outra forma de terminação de

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111/123 sinal, ou a indução de sinais anti-apoptóticos concorrentes. A endocitose não regula a ativação da caspase durante a associação inicial de DISC. No entanto, a inativação da dinamina melhora o processamento da caspase-8 total da célula, e progressivamente, da caspase-3 e -7, levando a uma maior ativação da apoptose, fornecendo evidências de que a endocitose regula adicionalmente a ativação da caspase à jusante do DISC inical.

[0206] Em resumo, uma relação bidirecional entre a apoptose induzida por DR e a endocitose dependente de clatrina é divulgada no presente pedido: A ativação de DR mediada pela caspase leva a destruição de importantes componentes da maquinaria endocítica da clatrina, parando assim este processo. O interrompimento da endocitose dependente de clatrina aumenta a ativação da caspase à jusante dos DRs e aumenta a apoptose, dando provas de um circuito de feedback positivo que amplifica a ativação da caspase e a execução da apoptose.

[0207] Os exemplos a seguir são oferecidos como forma de ilustração e não como forma de limitação. As descrições de todas as citações no relatório descritivo são expressamente incorporadas ao presente como referência.

Exemplos

Exemplo 1

Materiais e métodos Ilustrativos

Identificação do sítio de clivagem da caspase na AP2a [0208] Células BJAB (5 x 10⁸) foram estimuladas com Apo2L/TRAIL por 30 min, e, em seguida, lisadas, imunoprecipitatadas utilizando anti- C-terminal de AP2a específico (AP6, # MA1-064 da ABR) e coletadas em agarose proteína A/G (Pierce ). O fragmento C-terminal foi separado por SDS-PAGE e eluído para clivagem tríptica e posterior análise por cromatografia líquida- espectrometria de massas por ionização por electrospray

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112/123 ou separado em um IP, transferidos para uma membrana PVD para o sequenciamento N-terminal.

Endocitose, captação e ensaio de infra-regulação da superfície celular [0209] Para medições de rotina de Tf, 10⁶ células suspendidas foram pré-tratadas pelo tempo indicado a 37°C, com 1-10 pg/ml de Apo2L/TRAIL. Em alguns estudos, as células foram pré-tratadas com DMSO 0,25% ± 50 mM de zVADfmk por 30 min a 37°C antes de ser acrescentado a Apo2L/TRAIL. Após o estímulo com Apo2L/TRAIL, as células foram mantidas por 30 min no gelo com 5 pg/ml de Tf fluorescente no meio de ligação (DME livre de soro, 3% BSA, Hepes 20 mM, pH 7,2), a temperatura é modificada para 37°C por 0-5 min, conforme indicado, em seguida, refrigerado rapidamente em gelo para bloquear a endocitose. As células sedimentadas foram resuspensas em 2% de paraformaldeído/PBS gelado e a intensidade média da fluorescência de 10.000 células foi quantificada com um citômetro de fluxo Coulter Epics Elite-ESP (Hialeah, FL). A taxa de endocitose foi determinada a partir da curva linear da constante de equilíbrio dos valores interno/superfície (vide, por exemplo, Wiley, HS et. al, J Biol Chem 257, 4222-9 (1982)). Para os experimentos de mudança de temperatura, incubações de ligação no gelo foram evitadas. Em vez disso, as células foram condicionas por 20 min e mantidos a 30°C ou 38 °C no meio de ligação, incubando um controle adicional 0 (controle) ou 20 min com Tf⁶⁴⁷, refrigeradas em gelo durante 30 min, e analisado por citometria de fluxo para determinar a relação interna/superfície de Tf⁶⁴⁷.

[0210] Para medições de DR5, as células foram saturadas com 5 pg/ml de 5C7⁶⁴⁷ em meio de ligação no gelo, lavados por 3 vezes com médio de ligação gelado, e em seguida, incubadas por 30 min em gelo com ou sem pg/ml de Apo2L/TRAIL. A temperatura das células foi então modificada para

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37°C durante o tempo indicado, e rapidamente refrigeradas, e foi realizada ou não a remoção com ácido por três vezes com uréia 2M fria, glicina 50 mM, NaCl 150 mM, pH 2,4. As células foram analisadas por citometria de fluxo e a internalização foi calculada de forma semelhante ao método descrito anteriormente com a equação: % de captação = 100 x [(St-S0)/(N-S0)], onde St e S0 são os valores das amostras com remoção por acido, incubadas pelo tempo = t e tempo = 0, respectivamente, e N é a fluorescência não removida, que se mantive praticamente inalterada durante o tempo de incubação a 37°C (vide, por exemplo, Austin, C.D. et al., Mol Biol Cell 15, 5268 -- 82 (2004)).

[0211] Para mudança de temperatura, as células foram condiciona por 20 min e mantidos a 30°C ou 38 °C, pré-equilibradas com 5 pg/ml 5C7⁶⁴⁷ por 3 min, tratadas com 10 pg/ml de Apo2L/TRAIL por 0 (controle) ou 20 min, em seguida, refrigeradas em gelo por 30 minutos. A fluorescência nas células foi submetida ou à remoção por acido e quantificada por citometria de fluxo.

[0212] Para o ensaio de infra-modulação de DR5 na superfície, uma suspensão de células foi pré-equilibrada a 37°C por 30 min com 5C7 não marcado para ligar a superfície e reciclagem do pool de DR5, tratadas pelo tempo indicado, com ou sem 10 pg/ml de Apo2L/TRAIL, e refrigerada sobre o gelo. A 5C7 da superfície foi sondada com CY5 anti-IgG de camundongo e quantificado por citometria de fluxo. Esta técnica foi utilizada para evitar a redução na eficiência de sondagem na superfície atribuída ao agrupamento de receptores induzido pela Apo2L/TRAIL, como pode ser visto mediante sondagem direta com 5C7⁶⁴⁷.

Ensaio da atividade da caspase [0213] O ensaio para caspase-3/ -7 foi realizado utilizando o kit

Apo-One Homogenous Caspase-3/7 Assay (Promega). As células foram coletadas, contadas, aliquotadas em número igual para cada tratamento e tratados com doses de Apo2L/TRAIL variando em até 4 horas a 30°C ou 38°C

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114/123 e, em seguida, lisadas no reagente do kit “Homogeneous Caspase-3/7 Reagenf (que contém o substrato das caspase-3 / -7 Z-DEVD-R110). Os lisados foram incubadas a temperatura ambiente durante 1 hora antes da leitura em um fluorímetro a 485/530 nM.

Ensaio de Apoptose [0214] As células foram coradas com iodeto de propídio após a fixação com etanol e tratamento com RNAse e uma quantidade de DNA subdiplóide foi analisada por citometria de fluxo como descrito anteriormente, utilizando o software Expo32 com um citômetro Epics XL.MCL (Beckman Coulter), (vide, por exemplo, Nicholson , DW, Cell Death Differ 6:1028-42 (1999)).

Imunoprecipitação de DISC [0215] Células BJAB (1 x 10⁷ por ponto de tempo) foram tratadas com Flag-Apo2L/TRAIL reticulada por anticorpos anti-FLAG M2, coletadas, lisadas e imunoprecipitadas e então o DISC foi analisado como descrito (vide, por exemplo, Kischkel, FC et al ., Immunity 12:611-20 (2000)).

Linhagens celulares e reagentes.

[0216] Células Colo205 de adenocarcinoma colorretal humano, células B humanas BJAB de linfoma e células Jurkat T humanas de carcinoma do tipo selvagem (clone A3), deficientes de FADD (E1) e deficientes de caspase-8 (19.3) foram cultivadas em meio RPMI 1640 + 10% de fetal soro bovino (FBS) + 2 mM de glutamina + 1000 U/ml de penicilina-estreptomicina (Life Technologies). Células de carcinoma cervical humano Hela-M e de adenocarcinoma de mama humano MCF7 e adenocarcinoma colorretal HCT15, HCT8, SW948, Colo320, de fibrossarcoma humano HT180 (ATCC), HCT116 Bax (-/-), HCT116 Bax (+/-) foram cultivadas em meio 50: 50 de Meio Eagle Modificado da Dulbecco e F12 + 10% FBS + 1000 U/ml de penicilinaestreptomicina. Clones de cDNA que codifica dinamina sensível a temperatura

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115/123 foram as dinamininas-1 mutantes G273D e a dominante negativa K44A (Dyn^G273D e Dyn^K44A, respectivamente). A Dyn^G273D foi expressa a partir do pHUSH-Proex, um plasmídeo único retroviral com sistema de expressão induzível por tetraciclina construído na Genentech. O cDNA foi clonado em um primeiro plasmídio de transferência “shuttle” contendo uma sequência amplificadora-promotora CMV com duas cópias do operador Tet02 da tetraciclina, então transfectado via recombinação in vitro baseado em fago lamda, ou tecnologia Gateway (Invitrogen, Carlsbad), uma vetor baseado no vírus da leucemia murina de Moloney no qual o repressor de Tet do tipo selvagem é acionado separadamente por um promotor P-actina e seguido por uma sequência de entrada interna ribossomal e cassete da seleção de puromicina. Dyn^K44A foi expressa do sistema de expressão retroviral induzível por tetraciclina partir de 2 vetores, pRevTet-On/pRev-Tre (Clontech), utilizando infecções seriais. Os vetores retrovirais foram transfectados em células acondicionadoras do vírus de leucemia murina amfotrópico Phoenix utilizando Lipofectamina 2000 (Stratagene). As partículas retrovirais foram coletadas e utilizadas nas células Hela-M e BJAB, como descrito anteriormente (Simpson et al. J Cell Biol 137:835-45, 1997). Células tranfectadas com Dyn^G273D foram selecionados com puromicina (2-3 pg/ml) por 1-2 semanas e clonada, tanto pela coleta manual das colônias individuais de Hela M quanto por triagem por FACS das células BJAB resistentes (controlado pela exclusão de iodeto de propídio) e uma única semeadura de células em placas de 96-poços utilizando um EPICS ELITE-ESP equipado com um dispositivo Autoclone (Coulter, Hialeah, FL). Os clones celulares foram selecionados para a uniformidade da expressão da dinamina-1 induzível pela doxiciclina por microscopia de imunofluorescência. As células transfectadas com Dyn^K44A foram selecionadas por 1-2 semanas com higromocina B (400 ng/ml) e G418 (1 mg/ml). A indução com doxiciclina (1 pg/ml) foi realizada a 32°C durante 72 horas como descrito

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116/123 anteriormente (Damke et al. J Cell Biol 131, 69-80 1995). Vincristina sulfato (# T-117), Adriamycin.HCL (GR-319) foram comprados da Biomol, tetraciclina isenta de FBS da Hyclone, Puromicina da Clontech e Doxiciclina da Sigma. zVAD-fmk (ASN-benziloxicarbonil-Val-Ala-Asp-fluorometilcetona) foi obtido pela MD Biosciences (# FK-009).

Proteínas recombinantes, anticorpos e marcadores fluorescentes [0217] Apo2L/TRAIL humana solúvel recombinante nas versões não-marcada ou marcada com Flag e FasL foram preparadas conforme descrito (Sharp et al. J Biol Chem 280, 19401-409, 2005). Para a análise por imunoblot foram utilizados os seguintes anticorpos: anti-Caspase-8 (1C12, #9746) e anti-Caspase-7 (C7, # 9494) da Cell Signaling, anti-Caspase-8 (5F7, #IM3148) da Immunotech, anti-FADD (# 610399), anti-AP2a. (# 610501), antiAP1/2a (610381) anti-AP1y (# 610385), anti-AP3õ (#611328), anti-CHC (# 610499), anti - AP4s (# 612018), anti-Bid (# 550365) e anti-dinamina 1/2 (# 610245) da Transduction BD, a anticorpo anti-Caspase-3 (SA-320) da Biomol, anti-Caspase 9 (AB2, #AM47) da Oncogene, anti-receptor Tf (# 13-6800) da Zymed, anti-pcop (M3A5, # G2279) da Sigma, o anti-Sec23 (# GTX22913) de Gentex, anticorpo monoclonais anti-DR5 (3H3 e 5C7) foram produzidos na Genentech, Inc., e anti-AP3p como descrito anteriormente (vide , por exemplo, Simpson et al., J Cell Biol. Volume 137, No. 4, págs 835-845 (1997)). Como reagentes secundários os seguintes anticorpos conjugados com peroxidase de rábano silvestre (HRP) foram utilizados: anti- IgG1 de camundongo (# 559626) a partir da BD Bioscience; e anti-IgG2b de camundongo (# 190-05) da Southern Biotechnology Associates, anti-IgG de coelho (# 711-035-152) da Jackson ImmunoResearch. Para os experimentos de imunoprecipitação foram utilizados os seguintes anticorpos: anti-Flag (M2, Sigma) e anti-AP2a (AC1-M11, # MA3061) ou (AP6, # Mal-064) da ABR. Para a citometria de fluxo, microscopia de imunofluorescência, Tf⁴⁸⁸ (T-13342), Tf⁶⁴⁷ (T-23366), anti- IgG⁵⁹⁴ de coelho (#

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A-11037), e anti-IgG⁵⁹⁴ de cabra (# A-11058) da Molecular Probes. Fragmento anti-IgG de camundongo (# 115-177-003) da Jackson ImmunoResearch, antidinamina-1 (# sc-6402) da Santa Cruz Biotechnology e anticorpo policlonal antiAlexa 647 de coelho produzido pela Genentech, Inc. utilizando albumina de soro bovina conjugada com Alexa 647 (Molecular Probes, Inc.) como antígeno purificado por afinidade em uma coluna Sepharose Alexa-647 criada para reação (CNBr)- cadaverina Sepharose ativada com Alexa Fluor 647 (Molecular Probes, Inc.). Alexa-647 foi conjugada com mAb 5C7 (6475C7) pela reação com Alexa-647 sucinimidíl éster (Molecular Probes, Inc.), seguindo as instruções do fabricante.

Microscopia de imunofluorescência [0218] Para imagens de células que captaram 5C7⁶⁴⁷, estas foram incubadas a 37°C com 5C7⁶⁴⁷ e reticuladas com Apo2L/TRAIL pelo tempo indicado. As células sensíveis a temperatura para experimentos foram prétratadas em meio de ligação por 20 minutos. a 30°C vs 38°C, em seguida, adicionados Tf⁴⁸⁸ e incubado continuamente com a respectiva temperatura pelo tempo indicado. As células foram então fixadas por 20 minutos com 3% paraformaldeído, 0,4% de permeabilizador saponina, e marcado com anti-IgG de coelho Alexa-647 seguido de anti-IgG⁵⁹⁴ de coelho (captação de 5C7⁶⁴⁷) ou com anticorpo anti-dinamina-1 seguido por anti-IgG⁵⁹⁴ de cabra (experimentos com células sensíveis a temperatura). As imagens foram adquiridas utilizando um microscópio (Axiovert 200; Carl Zeiss Microimaging, Inc.) equipado com uma objetiva Plan-Apochromat 1.4 NA 63x, uma câmera CCD (AxioCam; Microimaging Carl Zeiss, Inc.), e um filtro de passagem Quad set (Chroma Technology Corp), todos controlados pelo software AxioVison 3.1 (Carl Zeiss Microimaging, Inc.)

Microscopia imunoeletrônica [0219] Células Colo205 suspensas foram incubadas por 30

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118/123 minutos em gelo com 10 pg/ml 5C7 em meio de ligação, lavadas, incubadas em gelo por 30 minutos com 10 mg/ml de Apo2L/TRAIL em meio de ligação, e então a temperatura foi modificada para 37°C por 5 minutos e fixadas em paraformaldeído 0.2%/glutaraldeído 2% e processado como descrito anteriormente (Austin et al. Mol Biol Cell 15:5268-82, 2004) para imunomarcação com ouro de criocortes ultrafinos com anticorpo coelho anti-IgG de camundongo (Dako, Glostrup, Dinamarca).

[0220] O relatório descritivo acima é considerado suficiente para permitir que os técnicos no assunto pratiquem a presente invenção. A presente invenção não deve ter seu escopo limitado pelo exemplo apresentado no presente pedido. Na realidade, várias modificações da presente invenção, além das exibidas e descritas no presente pedido, tornar-se-ão evidentes para os técnicos no assunto a partir do relatório descritivo acima e se encontrarão dentro do escopo das reivindicações anexas.

Tabelas

Tabela 1

Polipeptídeos Exemplares Úteis Na Prática Da Presente Invenção

AP2a (SEQ ID NO:1) N° de acesso NCBI: CAB66859

MPAVSKGDGMRGLAVFISDIRNCKSKEAEIKRINKELANIRSKFK

GDKALDGYSKKKYVCKLLFIFLLGHDIDFGHMEAVNLLSSNKYTEKQIGYLFISV

LVNSNSELIRLINNAIKNDLASRNPTFMCLALHCIANVGSREMGEAFAADIPRIL

VAGDSMDSVKQSAALCLLRLYKASPDLVPMGEWTARWHLLNDQHMGWTAA

VSLITCLCKKNPDDFKTCVSLAVSRLSRIVSSASTDLQDYTYYFVPAPWLSVKL

LRLLQCYPPPEDAAVKGRLVECLETVLNKAQEPPKSKKVQHSNAKNAILFETIS

LIIHYDSEPNLLVRACNQLGQFLQHRETNLRYIjALESMCTLASSEFSHEAVKTH

IDTVINALKTERDVSWQRAADLLYAMCDRSNAKQIVSEMLRYLETADYAIREEI

VLKVAILAEKYAVDYSWYVDTILNLIRIAGDWSEEVWYRVLQIVTNRDDVQGYA

AKTVFEALQAPACHENMVKVGGYILGEFGNLIAGDPRSSPPVQFSLLHSKFHL

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CSVATRALLLSTYIKFINLFPETKATIQGVLRAGSQLRNADVELQQRAVEYLTLS

SVASTDVLATVLEEMPPFPERESSILAKLKRKKGPGAGSALDDGRRDPSSNDI

NGGMEPTPSTVSTPSPSADLIjGIiRAAPPPAAPPASAGAGNLIiVDVFDGPAAQ

PSLGPTPEEAFLSPGPEDIGPPIPEADELLNKFVCKNNGVLFENQIiLQIGVKSE

FRQNLGRMYLFYGNKTSVQFQNFSPTWHPGDLQTQLAVQTKRVAAQVDGGA

QVQQVLNIECLRDFLTPPLLSVRFRYGGAPQALTLKLPVTINKFFQPTEMAAQD

FFQRWKQLSLPQQEAQKIFKANHPMDAEVTKAKLLGFGSALLDNVDPNPENF

VGAGIIQTKALQVGCLLRLEPNAQAQMYRLTLRTSKEPVSRHLCELLAQQF

Cadeia Pesada da Clatrina (SEQ ID NO: 2), N° de acesso NCBI: NP 004850

MAQILPIRFQEHLQLQNLGINPANIGFSTLTMESDKFICIREKVGE

QAQVVIIDMNDPSNPIRRPISADSAIMNPASKVIAIiKAGKTLQIFNIEMKSKMKA

HTMTDDVTFWKWISLNTVAIJVTDNAVYHWSMEGESQPVKMFDRHSSLAGC

QIINYRTDAKQKWLLLTGISAQQNRWGAMQLYSVDRKVSQPIEGHAASFAQFK

MEGNAEESTLFCFAVRGQAGGKLHIIEVGTPPTGNQPFPKKAVDVFFPPEAQ

NDFPVAMQISEKHDVVFLITKYGYIHLYDLETGTCIYMNRISGETIFVTAPHEAT

AGIIGVNRKGQVLSVCVEEENIIPYITNVIIQNPDLALRMAVRNNLAGAEELFAR

KFNALFAQGNYSEAAKVAANAPKGILRTPDTIRRFQSVPAQPGQTSPLLQYFGI

LLDQGQLNKYESLELCRPVLQQGRKQLLEKWLKEDKLECSEELGDLVKSVDP

TLALSVYLRANVPNKVIQCFAETGQVQKIVLYAKKVGYTPDWIFLLRNVMRISP

DQGQQFAQMLVQDEEPLADITQIVDVFMEYNLIQQCTAFIiLDAIiKNNRPSEGP

LQTRLLEMNLMHAPQVADAILGNQMFTHYDRAHIAQLCEKAGLLQRALEHFTD

LYDIKRAWHTHLLNPEWLVNYFGSLSVEDSLECLRAMLSANIRQNLQICVQVA

SKYHEQLSTQSLIELFESFKSFEGLFYFLGSIVNFSQDPDVHFKYIQAACKTGQI

KEVERICRESNCYDPERVKNFLKEAKLTDQLPLIIVCDRFDFVHDLVLYLYRNN

LQKYIEIYVQKVNPSRLPIGGLLDVDCSEDVIKNLILVVRGQFSTDELVAEVEKR

NRLKLLLPWLEARIHEGCEEPATHNALAKIYIDSNNNPERFLRENPYYDSRWG

KYCEKRDPHLACVAYERGQCDLELilNVCNENSIiFKSLSRYLVRRKDPELWGS

VLLESNPYRRPLIDQWQTAIiSETQDPEEVSVTVKAFMTADLPNELIELLEKIVLD

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NSVFSEHRNLQNI.LIIÍTAIKADRTRVMEYINRLDNYDAPDIANIAISNELFEEAFA

IFRKFDVNTSAVQVLIEHIGNLDRAYEFAERCNEPAVWSQLAKAQLQKGMVKE

AIDSYIKADDPSSYMEWQAANTSGNWEELVKYLQMARKKARESYVETELIFAIi

AKTNRLAELEEFINGPNNAHIQQVGDRCYDEKMYDAAKLLYNNVSNFGRLAST

LVHLGEYQAAVDGARKANSTRTWKEVCFACVDGKEFRLAQMCGLHIWHADE

LEELINYYQDRGYFEELITMLEAALGLERAHMGMFTELAILYSKFKPQKMREHL

ELFWSRVNIPKVLRAAEQAHLWAELVFLYDKYEEYDNAIITMMNHPTDAWKEG

QFKDIITKVANVELYYRAIQFYLEFKPLLLNDLLMVLSPRLDHTRAVNYFSKVKQ

LPLVKPYLRSVQNHNNKSVNESLNNLFITEEDYQALRTSIDAYDNFDNISLAQR

LEKHELIEFRRIAAYLFKGNNRWKQSVELCKKDSLYKDAMQYASESKDTELAE

ELLQWFLQEEKRECFGACLFTCYDLLRPDWLETAWRHNIMDFAMPYFIQVMK

EYLTKVDKLDASESLRKEEEQATETQPIVYGQPQLMLTAGPSVAVPPQAPFGY

GYTAPPYGQPQPGFGYSM

AP1/23 (SEQ ID NO: 3), N° de acesso NCBI: P63010

MTDSKYFTTNKKGEIFELKAELNNEKKEKRKEAVKKVIAAMTVGK

DVSSLFPDVVNCMQTDNLELKKLVYLYLMNYAKSQPDMAIMAVNSFVKDCED

PNPLIRALAVRTMGCIRVDKITEYLCEPLRKCLKDEDPYVRKTAAVCVAKLHDI

NAQMVEDQGFLDSLRDLIADSNPMVVANAVAALSEISESHPNSNLLDLNPQNI

NKLLTALNECTEWGQIFILDCLSNYNPKDDREAQSICERVTPRLSHANSAVVLS

AVKVLMKFLELLPKDSDYYNMLLKKLAPPLVTLLSGEPEVQYVALRNINLIVQK

RPEILKQEIKVFFVKYNDPIYVKLEKLDIMIRLASQANIAQVLAELKEYATEVDVD

FVRKAVRAIGRCAIKVEQSAERCVSTLLDLIQTKVNYVVQEAIVVIRDIFRKYPN

KYESIIATLCENLDSLDEPDARAAMIWIVGEYAERIDNADELLESFLEGFHDEST

QVQLTLLTAIVKLFLKKPSETQELVQQVLSLATQDSDNPDLRDRGYIYWRLLST

DPVTAKEVVLSEKPLISEETDLIEPTLLDELICHIGSLASVYHKPPNAFVEGSHGI

HRKHLPIHHGSTDAGDSPVGTTTATNLEQPQVIPSQGDLLGDLLNLDLGPPVN

VPQVSSMQMGAVDLLGGGLDSLVGQSFIPSSVPATFAPSPTPAVVSSGLNDL

FELSTGIGMAPGGYVAPKAVWLPAVKAKGLEISGTFTHRQGHIYMEMNFTNKA

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LQHMTDFAIQFNKNSFGVIPSTPLAIHTPLMPNQSIDVSLPLNTLGPVMKMEPL

NNLQVAVKNNIDVFYFSCLIPLNVLFVEDGKMERQVFLATWKDIPNENELQFQI

KECHLNADTVSSKLQNNNVYTIAKRNVEGQDMLYQSLKLTNGIWILAELRIQPG

NPNYTLSLKCRAPEVSQYIYQVYDSILKN

Dinamina (SEQ ID NO: 4), N° de acesso NCBI: NP 001005336

MGNRGMEDLIPLVNRLQDAFSAIGQNADLDLPQIAVVGGQSAGKS

SVLENFVGRDFLPRGSGIVTRRPLVLQLVNATTEYAEFLHCKGKKFTDFEEVRLE

IEAETDRVTGTNKGISPVPINLRVYSPHVLNLTLVDLPGMTKVPVGDQPPDIEFQI

RDMLMQFVTKENCLILAVSPANSDLANSDALKIAKEVDSQGQRTIGVITKLDLMD

EGTDARDVLENKLLPLRRGYIGVVNRSQKDIDGKKDITAALAAERKFFLSHPSYR

HLADRMGTPYLQKVLNQQLTNHIRDTLPGLRNKLQSQLLSIEKEVEEYKNFRPD

DPARKTKALLQMVQQFAVDFEKRIEGSGDQIDTYELSGGARINRIFHERFPFELV

KMEFDEKELRKEISYAIKNIHGIRTGLFTPDMAFETIVKKQVKKIREPCLKCVDMVI

SELISTVRQCTKKLQQYPRLREEMERIVTTHIREREGRTKEQVMLLIDIELAYMNT

NHEDFIGFANAQQRSNQMNKKKASGNQDEILVIRKGWLTINNIGIMKGGSKEYW

FVLTAENLSWYKDDEEKEKKYMLSVDNLKLRDVEKGFMSSKHIFALFNTEQRNV

YKDYRQLELACETQEEVDSWKASFLRAGVYPERVGDKEKASETEENGSDNFM

HSMDPQLERQVETIRNLVDSYMAIVNKTVRDLMPKTIMHLMINNTKEFIFSELLAN

LYSCWDQNTLMEESAEQEQRRDEDAALVTPPLKEGFGIIGRHQNDHMSARQCP

PWGGAAHLFLPCPLLPVARRSPTSSPTPQRRAPAVPPARPGSRGPAPGPPPAG

SALGGAPPVPSRPGASPDPFGPPPQVPSRPNRAPPGVPRITISDP

Receptor de Morte 4 (SEQ ID NO: 5), N° de acesso NCBI: 000220

MAPPPARVHLGAFLAVTPNPGSAASGTEAAAATPSKVWGSSAGRI

EPRGGGRGALPTSMGQHGPSARARAGRAPGPRPAREASPRLRVHKTFKFVVV

GVLLQVVPSSAATIKLHDQSIGTQQWEHSPLGELCPPGSHRSEHPGACNRCTEG

VGYTNASNNLFACLPCTACKSDEEERSPCTTTRNTACQCKPGTFRNDNSAEMC

RKCSRGCPRGMVKVKDCTPWSDIECVHKESGNGHNIWVILVVTLVVPLLLVAVLI

VCCCIGSGCGGDPKCMDRVCFWRLGLLRGPGAEDNAHNEILSNADSLSTFVSEQ

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122/123

QMESQEPADLTGVTVQSPGEAQCLLGPAEAEGSQRRRLLVPANGADPTETLMLF

FDKFANIVPFDSWDQLMRQLDLTKNEIDVVRAGTAGPGDALYAMLMKWVNKTGR

NASIHTLLDALERMEERHAKEKIQDLLVDSGKFIYLEDGTGSAVSLE

Receptor de Morte 5 (SEQ ID NO: 6), N° de acesso NCBI: AAB67103

MEQRGQNAPAASGARKRHGPGPREARGARPGLRVPKTLVLVV

AAVLLLVSAESALITQQDLAPQQRAAPQQKRSSPSEGLCPPGHHISEDGRDCI

SCKYGQDYSTHWNDLLFCLRCTRCDSGEVELSPCTTTRNTVCQCEEGTFRE

EDSPEMCRKCRTGCPRGMVKVGDCTPWSDIECVHKESGIIIGVTVAAVVLIVA

VFVCKSLLWKKVLPYLKGICSGGGGDPERVDRSSQRPGAEDNVLNEIVSILQP

TQVPEQEMEVQEPAEPTGVNMLSPGESEHLLEPAEAERSQRRRLLVPANEG

DPTETLRQCFDDFADLVPFDSWEPLMRKLGLMDNEIKVAKAEAAGHRDTLYT

MLIKWVNKTGRDASVHTLLDALETLGERLAKQKIEDHLLSSGKFMYLEGNADS

ALS

Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7), N° de acesso NCBI: NP 003801

MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQ

MQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRT

SEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALG

RKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKN

DKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRI

FVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG

Fas (SEQ ID NO: 8), N° de acesso NCBI: AAA63174

MLGIWTLLPLVLTSVARLSSKSVNAQVTDINSKGLELRKTVTTVE

TQNLEGLHHDGQFCHKPCPPGERKARDCTVNGDEPDCVPCQEGKEYTDKA

HFSSKCRRCRLCDEGHGLEVEINCTRTQNTKCRCKPNFFCNSTVCEHCDPCT

KCEHGIIKECTLTSNTKCKEEGSRSNLGWLCLLLLPIPLIVWVKRKEVQKTCRK

HRKENQGSHESPTLNPETVAINLSDVDLSKYITTIAGVMTLSQVKGFVRKNGV

NEAKIDEIKNDNVQDTAEQKVQLLRNWHQLHGKKEAYDTLIKDLKKANLCTLA

EKIQTIILKDITSDSENSNFRNEIQSLV

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Ligantes Fas (SEQ ID NO: 8), N° de acesso NCBI: NP 000630

MQQPFNYPYPQIYWVDSSASSPWAPPGTVLPCPTSVPRRPGQ

RRPPPPPPPPPLPPPPPPPPLPPLPLPPLKKRGNHSTGLCLLVMFFMVLVALV

GLGLGMFQLFHL.QKELAELRESTSQMHTASSLEKQIGHPSPPPEKKELRKVA

HLTGKSNSRSMPLEWEDTYGIVLLSGVKYKKGGLVINETGLYFVYSKVYFRGQ

SCNNLPLSHKVYMRNSKYPQDLVMMEGKMMSYCTTGQMWARSSYLGAVFN

LTSADHLYVNVSELSLVNFEESQTFFGLYKL

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1/4

Claims (17)

1. Reivindicações

   1. MÉTODO PARA A DETECÇÃO DA APOPTOSE, em células de mamíferos, caracterizado pelo fato de compreender:

   (a) exposição da célula a um anticorpo que se liga a um fragmento de proteína produzido durante a apoptose, onde o anticorpo se liga a um fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1);

   (b) determinação da quantidade de anticorpo que se ligou ao fragmento de proteína produzido durante a apoptose; e (c) comparação da quantidade de anticorpos ligados na etapa (b) com a quantidade de anticorpos que se ligou ao fragmento de proteína em uma célula de mamífero que não está sofrendo apoptose, de modo que se a quantidade da etapa (b) for superior a quantidade encontrada nas células livres de apoptose, então a apoptose é detectada em que a apoptose na célula é iniciada pelo Receptor de Morte 4 (SEQ ID NO: 5), Receptor de Morte 5 (SEQ ID NO: 6) ou Fas (SEQ ID NO: 8).
2. 2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a apoptose na célula ser desencadeada pelo contato da célula com Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7), FasL (SEQ ID NO: 9), um anticorpo agonista de Fas, um anticorpo agonista de DR4 ou um anticorpo agonista de DR5.
3. 3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o método compreender adicionalmente a etapa de usar a detecção de apoptose para se obter informações sobre a eficácia de uma terapia que compreende a administração de Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7), FasL (SEQ ID NO: 9), um anticorpo agonista de Fas, um anticorpo agonista de DR4 ou um anticorpo agonista de DR5.
4. 4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o anticorpo se ligar a um fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1) e o fragmento de proteína de AP2- a ligado pelo anticorpo é de 64 kDa

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   2/4 ou 33 kDa.
5. 5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o fragmento de proteína ligado pelo anticorpo conter DVFD de SEQ ID NO: 1 ou GPAA de SEQ ID NO: 1.
6. 6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a célula ser de câncer humano de cólon, colorretal, pulmão, mama, próstata, bexiga, rim, ovário, cérebro, melanoma, leucemia ou mieloma.
7. 7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1) ser observado utilizando as técnicas de immunoblotting, ensaio imunoadsorvente enzimaassociado ou imunohistoquímica.
8. 8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a análise da expressão de pelo menos um RNAm na célula de mamíferos.
9. 9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a exposição da célula de mamífero a um ou mais agentes de testes antes de contatar a célula com um anticorpo de modo que a detecção da apoptose na célula de mamíferos identifique um ou mais agentes de testes como um indutor de apoptose na célula de mamíferos.
10. 10. MÉTODO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE UMA CÉLULA DE CÂNCER HUMANO, que é suscetível de responder, ou é responsiva a um agente terapêutico que induz a apoptose em células de câncer humano, caracterizado pelo fato de compreender:

    exposição da célula de câncer humano ao agente terapêutico, em que o agente terapêutico compreende Apo2L/TRAIL (SEQ ID NO: 7), FasL (SEQ ID NO: 9), um anticorpo agonista de Fas, um anticorpo agonista de DR4 ou um anticorpo agonista de DR5;

    avaliação da célula de câncer exposta ao agente terapêutico para

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    3/4 a presença de um fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1);

    comparação da quantidade de fragmento de proteína na célula humana de câncer com a quantidade de fragmento de proteína em uma célulacontrole de câncer humano não exposta ao ligante;

    em que:

    a apoptose é iniciada pelo Receptor de Morte 4 (SEQ ID NO: 5), Receptor de Morte 5 (SEQ ID NO: 6) ou Fas (SEQ ID NO: 8);

    a apoptose é observada quando a quantidade de fragmento de proteína presente na célula de câncer humano exposta ao agente terapêutico for maior do que a quantidade de fragmento de proteína na célula-controle de câncer humano não exposta ao agente terapêutico; e uma observação de apoptose na célula de câncer humano identifica a célula de câncer humano como susceptível de responder, ou responsiva ao agente terapêutico.
11. 11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o agente terapêutico induzir a sinalização do Receptor de Morte 4 (SEQ ID NO: 5), Receptor de Morte 5 (SEQ ID NO: 6) ou Fas (SEQ ID NO: 8).
12. 12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o fragmento de proteína de AP2-a (SEQ ID NO: 1) ser observado utilizando as técnicas de immunoblotting, ensaio imunoadsorvente enzimaassociado ou imunohistoquímica.
13. 13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de compreender ainda a análise da expressão de pelo menos um RNAm na célula de câncer humano.
14. 14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de compreender ainda a análise da expressão de pelo menos dois RNAm diferentes na célula de câncer humano.
15. 15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado

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    4/4 pelo fato de a célula de câncer humano ser de cólon, colorretal, pulmão, mama, próstata, bexiga, rim, ovário, cérebro, melanoma, leucemia ou mieloma.
16. 16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de a célula de câncer humano ser obtida a partir de uma biópsia e ser cultivada em cultura in vitro por menos de um mês.
17. 17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o fragmento de proteína ser um fragmento de proteína de AP2-a contendo DVFD de SEQ ID NO: 1 ou GPAA de SEQ ID NO: 1.

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