BRPI0709506A2 - uso de uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um rna de interferência (irna) que tem um cumprimento de 19 a 49 nucleotìdeos, uso de uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um rna de interferência de um único cordão que tem um cumprimento de 19 a 49 nucleotìdeos, uso de uma composição que compreende uma molécula de sirna de cordão duplo que regula para baixo a expressão de um gene de syk através da interferência do rna e composição - Google Patents

Abstract

USO DE UMA COMPOSIçãO QUE COMPREENDE UMA QUANTIDADE EFICAZ DE UM RNA DE INTERFERêNCIA (IRNA) QUE TEM UM COMPRIMENTO DE 19 A 49 NUCLEOTìDEOS, USO DE UMA COMPOSIçãO QUE COMPREENDE UMA QUANTIDADE EFICAZ DE UM RNA DE INTERFERêNCIA DE UM UNICO CORDãO QUE TEM UM COMPRIMENTO DE 19 A 49 NUCLEOTìDEOS, USO DE UMA COMPOSIçãO QUE COMPREENDE UMA MOLéCULA DE SIRNA DE CORDãO DUPLO QUE REGULA PAPA BAIXO A EXPRESSãO DE UM GENE DE SYK ATRAVéS DA INTERFERêNCIA DO RNA E COMPOSIçãO. O RNA de interferência é provido para a inibição da expressão do mRNA de tirosina quinase do baço (Syk), particularmente para o tratamento de pacientes que têm uma condição inflamatória relacionada com a Syk ou correndo o risco de desenvolver uma condição inflamatória relacionada com a Syk, tal como conjuntivite alérgica, inflamação ocular, dermatite, rinite, asma, alergia, ou doença de células mastóideas.

Description

USO DE UMA COMPOSIÇÃO QUE COMPREENDE UMA QUANTIDADEEFICAZ DE UM RNA DE INTERFERÊNCIA (IRNA) QUE TEM UMCOMPRIMENTO DE 19 A 49 NUCLEOTÍDEOS, USO DE UMA COMPOSIÇÃOQUE COMPREENDE UMA QUANTIDADE EFICAZ DE UM RNA DEINTERFERÊNCIA DE UM ÚNICO CORDÃO QUE TEM UM COMPRIMENTO DE 19A 49 NUCLEOTÍDEOS, USO DE UMA COMPOSIÇÃO QUE COMPREENDE UMAMOLÉCULA DE SIRNA DE CORDÃO DUPLO QUE REGULA PARA BAIXO AEXPRESSÃO DE UM GENE DE SYK ATRAVÉS DA INTERFERÊNCIA DO RNA E

COMPOSIÇÃO

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo decomposições RNA de interferência para silenciar a tirosinaquinase do baço (Syk) e para o tratamento de uma condiçãoinflamatória relacionada com a Syk. Tais condições incluem aconjuntivite alérgica, a inflamação ocular, a dermatite, arinite, a asma, a alergia, ou a doença de células mastóideas,por exemplo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A conjuntivite alérgica, a inflamação ocular, adermatite, a rinite, a asma, a alergia, e a doença de célulasmastóideas têm sido tratadas historicamente com um regime deanti-histaminas orais, intranasais ou tópicas, ou deesteróides orais ou intranasais, ou, no caso da alergia, umtratamento com injeção de alérgeno. 0 tratamento sistêmicorequer tipicamente concentrações mais elevadas do composto dadroga a ser administrado para se obter uma concentraçãoeficaz para alcançar local de tratamento necessário. Oscompostos de anti-histamina são conhecidos como dotados deuma atividade no sistema nervoso central; a tontura e asecura das membranas do muco são um efeito colateral comum douso de antihistaminas.

A sinalização através de imunoreceptores tais comoo receptor de IgE (FcsRI) envolve o recrutamento e a ativaçãode componentes múltiplos da cascata de sinalização, incluindoa tirosina quinase que não de receptor, Syk. A ativação daSyk conduz à ativação de passagens PLCy e PI3K e finalmente àdesgranulação e ativação de células mastóideas. A focalizaçãodo mRNA de Syk deve reduzir os níveis de proteína de Syk einterromper a passagem de FcsRI. Esta ação deve interferir nadesgranulação das células mastóideas mediada por IgE e naliberação de histamina e outros mediadores pró-inflamatórios.

A inibição da inflamação alérgica nas passagensutilizando o de anti-sentido em aerossol da quinase Syk érelatada por Stenton, G.R. et al., (J. Immunol. 169:1028-1036(2002)). A inibição da expressão de Syk por meio do RNA deinterferência (siRNA) pequeno em uma linhagem de célulasepiteliais bronquiais HS-24 e em um modelo de rato de asmainduzida por ovalbumina (O-A) inibiu reconhecidamente aexpressão das indicações da resposta inflamatória induzida(pedido de patente internacional publicado WO 2005007623). Ainibição da expressão dos genes envolvidos na produção de IgEutilizando um RNA pino fino curto focalizando FceRIA e otratamento de doenças mediadas por IgE, tais como a asma e arinite alérgica, foi relatada no pedido de patenteinternacional publicado WO 2005085443. Nenhum destesdocumentos apresenta os RNAs de interferência da presenteinvenção.

Agentes adicionais e métodos de tratamento seriamdesejáveis para focalizar a tirosina quinase Syk, desse modobloqueando as ações da desgranulação de células mastóideasendógenas, e a liberação da histamina e outros mediadorespró-inflamatórios enquanto são evitados os efeitos colateraisdo tratamento sistêmico com anti-histamina. As realizações dapresente invenção satisfazem a necessidade no estado datécnica quanto a tais agentes e métodos de tratamento.DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

As realizações da presente invenção superam estes eoutros inconvenientes da técnica anterior ao apresentar otratamento, a prevenção ou a intervenção altamente potentes eeficazes de uma condição inflamatória relacionada com a Syk.Em um aspecto, os métodos da invenção incluem o tratamento deum indivíduo que tem uma condição inflamatória relacionadacom a Syk ou está correndo o risco de desenvolver umacondição inflamatória relacionada com a Syk, mediante aadministração RNAs de interferência que silenciam a expressãodo mRNA de Syk, desse modo interferindo nas passagens desinalização de PLCy e PI3K e impedindo uma cascata de eventosrelacionados à desgranulação de células mastóideas, e aliberação de histamina e outros mediadores pró-inflamatóriosem uma condição inflamatória relacionada com a Syk.

A presente invenção refere-se a RNAs deinterferência que focalizam o mRNA de Syk e desse modointerferem na expressão do mRNA de Syk. Os RNAs deinterferência da invenção são úteis para o tratamento depacientes com uma condição relacionada com a Syk ou correndoo risco de desenvolver uma condição relacionada com a Syk.

Uma realização da invenção é um método de atenuar aexpressão do mRNA de Syk de um indivíduo, em que o métodocompreende a administração ao indivíduo de uma composição quecompreende uma quantidade eficaz de um RNA de interferênciaque tem um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículofarmaceuticamente aceitável. A expressão do mRNA de Syk édesse modo atenuada.

Uma outra realização da invenção consiste em ummétodo de tratamento de uma condição inflamatória relacionadacom a Syk em um indivíduo com necessidade do mesmo. O métodocompreende a administração ao indivíduo de uma composição quecompreende uma quantidade eficaz de um RNA de interferênciaque tem um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos, e um veículofarmaceuticamente aceitável. A condição inflamatóriarelacionada com a Syk é desse modo tratada. Em umarealização, o indivíduo é um ser humano e o ser humano tem uma condição inflamatória relacionada com a Syk, e em umaoutra realização, o indivíduo é um ser humano e o ser humanoestá correndo o risco de desenvolver uma condiçãoinflamatório relacionada com a Syk.

Para as realizações acima citadas, o RNA deinterferência compreende uma região de pelo menos 13nucleotídeos contíguos que têm uma complementaridade deseqüência de pelo menos 90%, ou uma identidade de seqüênciade pelo menos 90%, com os penúltimos treze nucleotídeos daextremidade 3' de um mRNA que corresponde a qualquer umadentre a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 13 - SEQ ID NO: 40, e SEQ IDNO:44 - SEQ ID NO:47.

Em outras realizações dos métodos acima citados, acomposição compreende adicionalmente um segundo RNA deinterferência que têm um comprimento de 19 a 4 9 nucleotídeose que compreendem uma região de pelo menos 13 nucleotídeoscontíguos que têm uma complementaridade de seqüência de pelomenos 90%, ou uma identidade da seqüência de pelo menos 90%com os penúltimos treze nucleotídeos da extremidade 3' de umsegundo mRNA que corresponde a qualquer uma dentre a SEQ IDNO: 2, SEQ ID NO: 13 - SEQ ID NO: 40, e SEQ ID NO: 44 - SEQ IDNO:4 7.

Em ainda uma outra realização da invenção, ummétodo de atenuação da expressão do mRNA de Syk de umindivíduo compreende a administração ao indivíduo de umacomposição que compreende uma quantidade eficaz do RNA deinterferência que tem um comprimento de 19 a 49 nucleotídeose um veículo farmaceuticamente aceitável e o RNA deinterferência compreende um cordão de nucleotídeo de sentido,um cordão de nucleotídeo de anti-sentido, e uma região decomplementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelomenos dezenove nucleotídeos onde o cordão de anti-sentidohibridiza sob condições fisiológicas a uma porção do mRNA que corresponde à SEQ ID NO :1 que compreende o nucleotídeo#lista. A expressão do mRNA de Syk é desse modo atenuada. Emuma realização adicional, a composição compreende umaquantidade eficaz de um RNA de interferência que tem umcomprimento de 19 a 4 9 nucleotídeos onde o cordão de anti- sentido hibridiza sob condições fisiológicas a uma porção domRNA que corresponde à SEQ ID NO :1 que compreende onucleotídeo 1007, 1698 ou 1769. Em uma realização, o cordãode anti-sentido hibridiza a uma porção do mRNA quecorresponde à SEQ ID N0:1 começando com o nucleotídeo 1007, 1698, ou 1769 e tem um comprimento de dezenove ou vintenucleotídeos.

Um método de tratamento de uma condiçãoinflamatória relacionada com a Syk em um indivíduo comnecessidade do mesmo é uma realização da invenção, em que ométodo compreende a administração ao indivíduo de umacomposição que compreende uma quantidade eficaz do RNA deinterferência que tem um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos,e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o RNA deinterferência compreende um cordão de nucleotídeo de sentido, um cordão de nucleotídeo de anti-sentido, e uma região decomplementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelomenos dezenove nucleotídeos; em que o cordão de anti-sentidohibridiza sob condições fisiológicas a uma porção do mRNA quecorresponde à SEQ ID NO :1 que compreende o nucleotídeo #lista. A condição inflamatório relacionada com a Syk é dessemodo tratada. Em uma realização adicional, a composiçãocompreende uma quantidade eficaz do RNA de interferência quetem um comprimento de 19 a 4 9 nucleotídeos onde o cordão deanti-sentido hibridiza sob condições fisiológicas a umaporção do mRNA que corresponde à SEQ ID NO:1 que compreende onucleotídeo 1007, 1698, ou 1769. Em uma realização, o cordãode anti-sentido hibridiza a uma parcela do mRNA quecorresponde à SEQ ID N0:1 começando com o nucleotídeo 1007,1698, ou 1769 e tem dezenove ou vinte nucleotídeos decomprimento.

Um segundo RNA de interferência que tem umcomprimento de 19 a 4 9 nucleotídeos também poderia seradministrado ao indivíduo; o segundo RNA de interferência quecompreende um cordão de nucleotídeo do sentido, um cordão denucleotídeo de anti-sentido, e uma região decomplementaridade pelo menos quase perfeita de pelo menosdezenove nucleotídeos em que o cordão de anti-sentido dosegundo RNA de interferência hibridiza sob condiçõesfisiológicas a uma segunda porção do mRNA que corresponde àSEQ ID NO:1 que compreende o nucleotídeo #lista. Um segundoRNA de interferência que tem um comprimento de 19 a 4 9nucleotídeos poderia ser administrado ao indivíduo, onde ocordão de anti-sentido hibridiza sob condições fisiológicas auma porção do mRNA que corresponde à SEQ ID NO :1 quecompreende o nucleotídeo 1007, 1698 ou 1769. Em umarealização, o cordão de anti-sentido hibridiza a uma porçãodo mRNA que corresponde à SEQ ID NO :1 começando com onucleotídeo 1007, 1698 ou 1769 e tem dezenove ou vintenucleotídeos de comprimento.

Um método de atenuar a expressão do mRNA de Syk deum indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo deuma composição que compreende uma quantidade eficaz de um RNAde interferência de um único cordão que tem um comprimento de19 a 49 nucleotídeos, e um veículo farmaceuticamenteaceitável, onde o RNA de interferência de um único cordãohibridiza sob condições fisiológicas a uma porção do mRNA quecorresponde à SEQ ID NO :1 que compreende os nucleotídeosidentificados acima é uma realização adicional da invenção.

A invenção inclui como uma realização adicional umacomposição que compreende um RNA de interferência que tem umcomprimento de 19 a 4 9 nucleotídeos, e compreende umaseqüência de nucleotídeo que corresponde a qualquer umadentre a SEQ ID NO: 2, de SEQ ID NO: 13 - SEQ ID NO: 40, e SEQID NO: 44 - SEQ ID NO: 47, ou um complemento da mesma; e umveículo farmaceuticamente aceitável. Uma composição quecompreende um RNA de interferência que tem um comprimento de19 a 4 9 nucleotídeos, e compreende uma seqüência denucleotídeo que corresponde a qualquer uma dentre a SEQ IDNO: 41 - SEQ ID NO: 47, ou um complemento da mesma; e umveículo farmaceuticamente aceitável é uma realizaçãoadicional da invenção.

Um método de tratamento de inflamação ocular ou deconjuntivite em um indivíduo com necessidade do mesmo é umarealização da invenção. 0 método compreende a administraçãoao indivíduo de uma composição que compreende uma molécula desiRNA de cordão duplo que regula para baixo a expressão de umgene de Syk através da interferência de RNA, em que cadacordão da molécula do siRNA tem independentementeaproximadamente 19 a aproximadamente 2 7 nucleotídeos decomprimento; e um cordão da molécula de siRNA compreende umaseqüência de nucleotídeo que tem uma complementaridadesubstancial a um mRNA que corresponde ao gene de Syk de modoque a molécula do siRNA dirige a clivagem do mRNA através dainterferência de RNA. Em uma realização adicional destemétodo, cada cordão da molécula do siRNA temindependentemente de aproximadamente 19 nucleotídeos aaproximadamente 25 nucleotídeos de comprimento, ou deaproximadamente 19 nucleotídeos a aproximadamente 21nucleotídeos de comprimento.O uso de qualquer uma das realizações tal como aquidescrito na preparação de um medicamento para atenuar aexpressão do mRNA de Syk tal como aqui indicado também é umarealização da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A FIGURA 1 apresenta uma transferência de Westernde SYK de células 293FT transfectadas com siRNAs de SYK # 2,#5, #6e#8, eum siRNA de controle livre de RISC, cada umdeles a 10 nM, 1 nM e 0,1 nM; um siRNA de controle sem focalização (NTC2) a 10 nM; e um controle de tampão (-siRNA).As setas indicam as posições do SYK de 72 kDa e as faixas deactina de 42 kDa.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As referências aqui citadas, até a extensão em que fornecem procedimentos exemplificadores ou outros detalhessuplementares àqueles aqui apresentados, são especificamenteincorporadas a título de referência.

Os elementos versados na técnica, à luz da presentedescrição, irão apreciar que modificações óbvias dasrealizações aqui apresentadas podem ser feitas sem que sedesvie do caráter e âmbito da invenção. Todas as realizaçõesaqui apresentadas podem ser feitas e executadas semexperimentação inadequada à luz da presente descrição. 0âmbito amplo da invenção é indicado na descrição e suas realizações equivalentes. O relatório descritivo não deve serinterpretado como estreitando inadequadamente o âmbito amplode proteção a que a presente invenção é designada.

Conforme aqui empregados e a menos que estejaindicado de alguma outra maneira, os termos "um" e "uma" são empregados para se referir a "um", "pelo menos um" ou "um oumais".

A expressão "uma condição inflamatória relacionadacom a Syk", tal como aqui empregada, inclui a histamina eoutras respostas mediadas pró-inflamatórias envolvidas nascondições tais como a conjuntivite alérgica, a inflamaçãoocular, a dermatite, a rinite, a asma, a alergia, e a doençade células mastóideas, e inclui as alterações celularesresultantes da expressão de Syk-mRNA que conduzem direta ouindiretamente à condição inflamatória relacionada com a Syk.O RNA de interferência aqui indicado propicia talsilenciamento enquanto evita os efeitos colateraisindesejáveis devido a agentes não-específicos.

A expressão "conjuntivite alérgica", tal como aquiempregada, refere-se à inflamação da conjuntiva que é amembrana delicada que reveste as pálpebras e cobre asuperfície exposta da esclera. A expressão "conjuntivitealérgica" inclui, por exemplo, a queratoconjuntivite atópica,a conjuntivite papilar gigante, a conjuntivite da febre dofeno, a conjuntivite alérgica perene, e a queratoconjuntivitevernal.

O termo "dermatite", tal como aqui empregado,refere-se à inflamação da pele e inclui, por exemplo, adermatite de contato alérgica, a dermatite asteatótica (peleseca na região inferior das pernas), a dermatite atópica, adermatite cercarial, a dermatite de contato incluindo adermatite de contato irritante e adermatite de contatoinduzida por urushiol, a dermatite herpetiforme, a dermatitedisidrótica, o eczema, a dermatite gravitacional, a dermatiteinfectiva, a dermatite numular, a otite externa, a dermatiteperioral, a dermatite causada por Pseudomonas (erupção debanheira quente), e a dermatite seborréica.

0 termo "rinite", tal como aqui empregado, refere-se à inflamação das membranas mucosas do nariz e inclui, porexemplo, a rinite alérgica, a rinite atópica, a riniteinfecciosa, a rinite irritante, a rinite não-alérgicaeosinofílica, a rinite medicamentosa, e a rinosinusiteneutrofílica.

O termo "asma", tal como aqui empregado, refere-seà inflamação das passagens de ar resultando no estreitamentodas vias aéreas que transportam o ar do nariz e da boca aospulmões e inclui, por exemplo, a asma alérgica, a asmaatópica, a asma mediada por IgE bronquial atópica, a asmabronquial, a bronquiolite, a asma enfisematosa, a asmaessencial, a asma induzida por exercícios, a asma extrínsicacausada por fatores ambientais, a asma incipiente, a asmaintrínseca causado por distúrbios patofisiológicos, a asmanão-alérgica, a asma não-atópica, e a síndrome infantil derespiração ofegante.

O termo "alergia", tal como aqui empregado, refere-se a uma reação anormal do sistema imunológico a umasubstância que não é geralmente prejudicial e inclui, porexemplo, alergias da pele tais como a dermatite atópica,urticária, e angioedema; alergias respiratórias, tal como arinite alérgica, e reações à poeira ou fungo; alergias aalimentos tais como reações às proteínas do leite de vaca, àclara do ovo, a amendoins, ao trigo, à soja, a amoras, amariscos, ao milho, a feijões, ao corante de alimento amarelonúmero 5 e à goma arábica; alergias a drogas tais comoreações à penicilina, a sulfas, a barbituratos, aanticonvulsantes, à insulina, a anestésicos locais e aagentes de contraste; e alergias a picadas de insetos taiscomo reações ao veneno de picadas de abelhas, vespas,marimbondos, vespas americanas e formigas lava-pés.

A expressão "doença de células mastóideas", talcomo aqui empregada, refere-se à mastocitose sistêmica que écaracterizada pela acumulação de células mastóideas nostecidos. Tal acumulação pode afetar órgãos tais como a medulaóssea, a pele, o trato gastrointestinal, o fígado e o baço.Os médicos diagnosticam a mastocitose sistêmica quandoencontram células mastóideas em partes do corpo com exceçãoda pele e geralmente a tratam com antihistaminas.

A expressão "uma região de pelo menos trezenucleotídeos contíguos que tem uma complementaridade deseqüência de pelo menos 90%, ou uma identidade da seqüênciade pelo menos 90% com os penúltimos treze nucleotídeos daextremidade 31 de um mRNA que corresponde a qualquer de umidentificador de seqüência" permitem uma substituição de umnucleotídeo. Duas substituições de nucleotídeo (isto é, 11/13= 85% identidade/complementaridade) não são incluídas em talespressão.

"Hibridização" refere-se a um processo em queácidos nucléicos de um único cordão com seqüências basecomplementares ou quase complementares interagem para formarcomplexos ligados com hidrogênio denominados híbridos. Asreações de hibridização são sensíveis e seletivas. In vitro,a especificidade de hibridização (isto é, a estringência) écontrolada pelas concentrações de sal ou formamida emsoluções de pré-hibridização e hibridização, por exemplo, epela temperatura de hibridização; tais procedimentos são bemconhecidos no estado da técnica. Particularmente, aestringência é aumentada ao reduzir a concentração do sal, aoaumentar a concentração de formamida, ou ao elevar atemperatura de hibridização.

Tal como aqui empregada, a expressão "porcentagemde identidade" descreve a porcentagem de nucleotídeoscontíguos em uma primeira molécula de ácido nucléico que é amesma que em um conjunto de nucleotídeos contíguos do mesmocomprimento em uma segunda molécula de ácido nucléico. Aexpressão "porcentagem de complementaridade" descreve aporcentagem de nucleotídeos contíguos em uma primeiramolécula de ácido nucléico que pode ser o par base no sentidode Watson-Crick com um conjunto de nucleotídeos contíguos emuma segunda molécula de ácido nucléico.

Atenuação da expressão de um mRNA: A expressão"atenuação da expressão de um mRNA", tal com aqui empregada,significa a administração ou expressão de uma quantidade de RNA de interferência (por exemplo, um siRNA) para reduzir atranslação do mRNA alvo na proteína, tanto através daclivagem de mRNA quanto através da inibição direta datranslação. A redução na expressão do mRNA alvo ou daproteína correspondente é normalmente indicada como "knock- down" e é relatada em relação aos níveis presentes depois daadministração ou expressão de um RNA de controle nãofocalizado (por exemplo, um siRNA de controle nãofocalizado). 0 knock-down da expressão de uma quantidade queinclui entre 50% e 100% é contemplada pelas presentesrealizações. No entanto, não é necessário que tais níveis deknock-down sejam conseguidos para as finalidades da presenteinvenção. Em uma realização, um único RNA de interferênciaque focaliza o mRNA de Syk é administrado. Em outrasrealizações, dois ou mais RNAs de interferência que focalizam o mRNA de Syk são administrados.

"Hibridização" refere-se a um processo em queácidos nucléicos de um único cordão com seqüências basecomplementares ou quase complementares interagem para formarcomplexos ligados com hidrogênio denominados híbridos. Asreações de hibridização são sensíveis e seletivas. In vitro,a especificidade de hibridização (isto é, a estringência) écontrolada pelas concentrações de sal ou formamida emsoluções de pré-hibridização e hibridização, por exemplo, epela temperatura de hibridização; tais procedimentos são bem conhecidos no estado da técnica. Particularmente, aestringência é aumentada ao reduzir a concentração do sal, aoaumentar a concentração de formamida, ou ao elevar atemperatura de hibridização.Por exemplo, condições de elevada estringênciapoderiam ocorrer a aproximadamente 50% de formamida a 370C -42°C. Condições de estringência reduzida poderiam ocorrer aaproximadamente 35% a 25% de formamida a 30°C - 35°C.

Exemplos de condições de estringência para a hibridização sãofornecidos em Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.Outros exemplos de condições de hibridização estringenteincluem 4 00 mM de NaCl, 4 0 mM de PIPES, pH 6,4, 1 mM de EDTA,50°C ou 70°C por doze a dezesseis horas, seguida por umalavagem, ou hibridização a 70°C em 4XSSC ou a 50°C em 4XSSC,50% de formamida, seguida por uma lavagem a 70°C em 0,3XSSC,ou a hibridização a 70°C em 4XSSC ou a 50°C em 4XSSC, 50% eformamida seguida por uma lavagem a 67°C em IXSSC. Atemperatura para a hibridização é aproximadamente 5-10°C maisbaixa do que a temperatura de fusão (Tm) do híbrido onde a Tmé determinada para os híbridos entre 19 e 49 pares base nocomprimento ao utilizar o seguinte cálculo: Tm °C = 81,5 +16,6 (loglO [Na+] ) + 0,41 (% G+C) - (600/N) onde N é o númerode bases no híbrido, e [Na+] é a concentração de íons sódiono tampão de hibridização.

O knock-down é avaliado normalmente ao medir osníveis de mRNA utilizando a amplificação de reação de cadeiade polimerase quantitativa (qPCR) ou ao medir os níveis deproteína por transferência de Western ou o ensaioimunosorvente ligado por enzima (ELISA). A análise do nívelde proteína fornece uma avaliação de ambas a clivagem do mRNAbem como da inibição da translação. Outras técnicas paramedir o knock-down incluem a hibridização da solução de RNA,a proteção de nuclease, a hibridização de Northern, omonitoramento da expressão dos genes com uma microdisposição,a ligação de anticorpos, um radioimunoensaio, e uma análisede célula ativada por fluorescência.A interferência de RNA (RNAi) é ura processo pormeio do qual o RNA de cordão duplo (dsRNA) é utilizado parasilenciar a expressão do gene. Embora não se deseje ficarlimitado pela teoria, o RNAi começa com a clivagem de dsRNAsmais longos em RNAs de interferência pequenos (siRNAs) poruma enzima parecida com RNaseIII, dicer. Os SiRNAs são dsRNAsque têm normalmente aproximadamente 19 a 28 nucleotideos, ou20 a 25 nucleotideos, ou 21 a 22 nucleotideos de comprimento,e contêm freqüentemente extensões 31 de dois nucleotideos, eterminais 5' fosfato e terminais hidroxila 31. Um cordão dosiRNA é incorporado em um complexo de ribonucleoproteínaconhecido como complexo de silenciamento induzido por RNA(RISC). O RISC utiliza esse cordão de siRNA para identificaras moléculas de mRNA que são pelo menos parcialmentecomplementares ao cordão de siRNA incorporado, e então clivaesses mRNAs alvos ou inibe a sua translação. Portanto, ocordão de siRNA que é incorporado no RISC é conhecido comocordão guia ou cordão de anti-sentido. O outro cordão desiRNA, conhecido como o cordão passageiro ou cordão desentido, é eliminado do siRNA e é pelo menos parcialmentehomólogo ao mRNA alvo. Os elementos versados na técnica irãoreconhecer que, em princípio, um ou outro cordão de um siRNApode ser incorporado ao RISC e funcionar como um cordão guia.No entanto, o desenho do siRNA (por exemplo, estabilidadediminuída do duplex do siRNA na extremidade '5 do cordão deanti-sentido) pode favorecer a incorporação do cordão deanti-sentido no RISC.

A clivagem mediada por RISC dos mRNAs que têm umaseqüência pelo menos parcialmente complementar ao cordão guiaconduz a uma diminuição no nível de estado estável desse mRNAe da proteína correspondente codificada por este mRNA.Alternativamente, o RISC também pode diminuir a expressão daproteína correspondente através da repressão translacionalsem clivagem do mRNA alvo. Outras moléculas do RNA emoléculas parecidas com RNA também podem interagir com o RISCe a expressão do gene de silenciamento. Os exemplos de outrasmoléculas de RNA que podem interagir com o RISC incluem oRNAs pino finos curtos (shRNAs), siRNAs de um único cordão,microRNAs (miRNAs), e duplex de 27-mers de substrato dedicer. 0 termo "siRNA", tal como aqui empregado, refere-se aum RNA de interferência de cordão duplo, a menos que estejaindicado de alguma outra maneira. Os exemplos de moléculasparecidas com RNA que podem interagir com o RISC incluem asmoléculas de RNA que contêm um ou mais nucleotídeosquimicamente modificados, um ou mais desoxiribonucleotídeos,e/ou uma ou mais ligações não-fosf odiéster. Para asfinalidades da presente discussão, todo RNA ou moléculasparecidas com RNA que podem interagir com o RISC e participardas mudanças mediadas por RISC na expressão do gene serãoaqui indicados como "RNAs de interferência". SiRNAs, shRNAs,miRNAs, e duplexes de 27 mers de substrato de dicer são,portanto, subconjuntos de "RNAs de interferência."

0 RNA de interferência das realizações da invençãoparece agir de uma maneira catalítica para a clivagem do mRNAalvo, isto é, o RNA de interferência pode efetuar a inibiçãodo mRNA alvo em quantidades subestequiométricas. Emcomparação às terapias de anti-sentido, significativamentemenos RNA de interferência é requerido para propiciar umefeito terapêutico sob tais condições de clivagem.

A presente invenção refere-se ao uso do RNA deinterferência para inibir a expressão do mRNA de Syk, umatirosina quinase de não-receptor. A sinalização através dosimunoreceptores, tal como o receptor de IgE (FcsRI), envolveo recrutamento e a ativação de componentes múltiplos dacascata de sinalização, incluindo o Syk. A ativação do Sykconduz à ativação de passagens PLCy e PI3K e finalmente àdesgranulação e ativação de células mastóideas. A focalizaçãodo mRNA de Syk deve reduzir os níveis de proteína de Syk einterromper a passagem de FcsRI. Esta ação deve interferir nadesgranulação das células mastóideas mediada por IgE e naliberação de histamina e outros mediadores pró-inflamatórios.De acordo com a presente invenção, os RNAs de interferênciaprovidos exogenamente ou expressos endogenamente sãoparticularmente eficazes no silenciamento do mRNA de Syk.

As seqüências de ácido nucléico aqui citadas sãoescritas em uma direção 5' a 3' a menos que esteja indicadode alguma outra maneira. A expressão "ácido nucléico", talcomo aqui empregada, refere-se ao DNA ou o RNA ou a uma formamodificada do mesmo que compreende as bases de purina oupirimidina presentes no DNA (adenina "A", "citosina "C",guanina "G", timina "T") ou no RNA (adenina "A", citosina"C", guanina "G", uracil "U"). Os RNAs de interferência aquiapresentados podem compreender bases de "T", particularmentenas extremidades 3', mesmo que as bases de "T" não ocorramnaturalmente no RNA. "Ácido nucléico" inclui os termos"oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" e pode se referir auma molécula de um único cordão ou uma molécula de cordãoduplo. Uma molécula de cordão duplo é formada peloemparelhamento de bases de Watson-Crick entre as bases de A eT, as bases de C e G, e entre as bases de A e U. Os cordõesde uma molécula de cordão duplo podem ter umacomplementaridade parcial, substancial ou completa entre si eirão formar um híbrido duplex, cuja força de ligação édependente da natureza e do grau de complementaridade daseqüência das bases.

Uma seqüência do mRNA é deduzida imediatamente daseqüência da seqüência de DNA correspondente. Por exemplo, aSEQ ID NO :1 fornece a seqüência de cordão de sentido do DNAque corresponde ao mRNA para Syk. A seqüência do mRNA éidêntica à seqüência do cordão de sentido do DNA com as basesde "T" substituídas pelas bases de "U". Portanto, a seqüênciado mRNA de Syk é conhecida a partir da SEQ ID N0:1.

mRNA de tirosina quinase do baço (Syk) : O banco dedados GenBank provê a seqüência do DNA para Syk como númerode acesso NM_003177, fornecido na "Lista gem de Seqüência"como SEQ ID N0:1. A SEQ ID NO: 1 provê a seqüência de cordãode sentido do DNA que corresponde ao mRNA que codifica Syk(com exceção das bases de "T" para bases de "U"). A seqüênciade codificação para Syk é dos nucleotídeos 148 - 2055.

Os equivalentes da seqüência do mRNA de Syk acimacitada são formas de emendas alternativas, formas alélicas,isozimas, ou um cognato das mesmas. Um cognato é um mRNA detirosina quinase do baço de uma outra espécie de mamífero queé homóloga à SEQ ID NO:1 (isto é, um ortólogo). As seqüênciasde ácido nucléico de Syk relacionadas à SEQ ID NO: 1 incluemaquelas que têm os números de acesso B0001645, B0002962,L28824, X73568, BC011399 e Z29630 do GenBank.

A inibição de Syk também pode ser determinada invitro pelo monitoramento da liberação de histamina em célulasmastóideas imunologicamente estimuladas tal como segue. Ospreparados de células mastóideas humanas mono-dispersasliberam mediadores pró-inflamatórios com a ativaçãoimunológica. O grau de ativação é determinado pelaquantificação da histamina liberada no sobrenadante dacultura com a estimulação das células com antígeno ou IgEanti-humano. (Consultar Miller et al. , Ocular ImmunolInflamm. 4:39-49, 2006). O estímulo imunológico de célulasmastóideas transfectadas com o RNA de interferência quefocaliza o Syk resulta em uma liberação de histaminasignificativamente menor do que aquela observada com oestímulo imunológico de células mastóideas não-transfectadasou células mastóideas transfectadas com um RNA deinterferência de controle sem focalização.

A inibição de Syk também pode ser determinada aoexaminar a liberação mediada por IgE de histamina in vitro aoutilizar células mastóideas de tecido da conjuntiva humana oucélulas mastóideas LAD2. As células mastóideas de tecido daconjuntiva humana são obtidas ao empregar a metodologiaesboçada na patente norte-americana n°. 5.3 60.720, porexemplo. As células mastóideas LAD2 são licenciadas peloLaboratory of Allergic Diseases, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD (Leuk Res. 27 de agosto de 2003 (8) :677-82). Resumidamente, as células mastóideas do tecido daconjuntiva humana são liberadas enzimaticamente dos tecidosda conjuntiva humana e então enriquecidas parcialmente pelacentrifugação com densidade sobre uma almofada de PERC0LL®. Asuspensão de células monodispersas é obtida a partir dapelota resultante, e estas células são utilizadas para umensaio de liberação de histamina. As células sãotransfectadas com de um RNA de interferência de Syk ou um RNAde interferência de controle 72 horas antes da estimulação deIgE anti-humana, que ativa a desgranulação das célulasmastóideas e a liberação da histamina para o sobrenadante. Ahistamina é medida então no sobrenadante por RIA (BeckmanCoulter), EIA (Beckman Coulter) ou por um outro método deconhecimento de um elemento versado na técnica. Umadiminuição na liberação da histamina nas célulastransfectadas com o RNA de interferência de Syk em relação àscélulas transfectadas de controle ou às células não-transfectadas indica que um RNA de interferência é eficaz naatenuação do Syk e na interrupção da passagem de sinalizaçãode FcsRI.

A linhagem de células mastóideas LAD2 é utilizadaquase que da mesma maneira, com a exceção do fato que ascélulas são sensibilizadas passivamente com o mieloma de IgEhumano antes da estimulação com o IgE não-humano parareticular o IgE ligado a receptor e ativar a desgranulação.

A inibição de Syk também é inferida em um serhumano ou um mamífero ao observar uma melhora em um sintomade uma condição relacionada ao Syk, tal como a melhora nossintomas relacionados à conjuntivite alérgica, à inflamaçãoocular, à dermatite, à rinite, à asma, a um alergia, ou umadoença de células mastóideas. A melhora em qualquer um dentreum edema, coceira, inflamação, ou tolerância a estímulosambientais, por exemplo, é indicativa da inibição de Syk.

RNA de interferência: Em uma realização dainvenção, o RNA de interferência (por exemplo, siRNA) tem umcordão de sentido e um cordão de anti-sentido, e os cordõesde sentido e de anti-sentido compreendem uma região decomplementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelomenos dezenove nucleotídeos. Em uma realização adicional dainvenção, o RNA de interferência (por exemplo, siRNA) tem umcordão de sentido e um cordão de anti-sentido, e o cordão deanti-sentido compreende uma região de complementaridadecontígua pelo menos quase perfeita de pelo menos dezenovenucleotídeos a uma seqüência alvo do mRNA de Syk, e o cordãode sentido compreende uma região de identidade contígua pelomenos quase perfeita de pelo menos dezenove nucleotídeos comuma seqüência alvo do mRNA de Syk. Em uma realizaçãoadicional da invenção, o RNA de interferência compreende umaregião de pelo menos 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 nucleotídeoscontíguos que têm porcentagens de complementaridade deseqüência ou, que têm porcentagens de identidade de seqüênciacom os penúltimos 13, 14, 15, 16, 17, ou 18 nucleotídeos,respectivamente, da extremidade 3' da seqüência alvocorrespondente dentro de um mRNA.O comprimento de cada cordão do RNA deinterferência compreende de 19 a 4 9 nucleotídeos, e podecompreender um comprimento de 29, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27, 28, 29, 30,31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, ou 49 nucleotídeos.

O cordão de anti-sentido de um siRNA é o agenteguia ativo do siRNA em que o cordão de anti-sentido éincorporada no RISC, permitindo desse modo que o RISCidentifique mRNAs alvo com uma complementaridade pelo menosparcial para o cordão de siRNA de anti-sentido para aclivagem ou a repressão translacional.

Nas realizações da presente invenção, as seqüênciasalvo do RNA de interferência (por exemplo, seqüências alvo dosiRNA) dentro de uma seqüência do mRNA alvo são selecionadasao utilizar ferramentas de desenho disponíveis. Os RNAs deinterferência que correspondem a uma seqüência alvo de Syksão então testados pela transfecção das células que expressamo mRNA alvo seguida pela avaliação do knockdown tal comodescrito acima.

Técnicas para selecionar seqüências alvo parasiRNAs são fornecidas por Tuschl, T. et al·, "The siRNA UserGuide117 revisado em 06 de maio de 2004, disponível no site daweb da Rockefeller University; pelo Boletim Técnico # 506,"siRNA Design Guidelines", Ambion Inc. no site da web daAmbion; e por outras ferramentas de desenho baseadas na web,por exemplo, os sites na web da Invitrogen, Dharmacon,Integrated DNA Technologies, Genscript, ou Proligo. Osparâmetros de busca inicial podem incluir índices de G/Centre 35% e de 55% e comprimentos de siRNA entre 19 e 27nucleotídeos. A seqüência alvo pode ficar localizada naregião de codificação ou nas regiões não-transladadas 5' ou31 dos mRNAs.

Uma realização de uma seqüência alvo de DNA de 19nucleotídeos para o mRNA de Syk está presente nosnucleotídeos 789 a 807 da SEQ ID NO:l:

5' - GCACTATCGCATCGACAAA -3' SEQ ID NO:2.

Um siRNA da invenção para focalizar uma seqüênciacorrespondente do mRNA da SEQ ID NO:2 e contendo cordões com21 nucleotídeos e uma extensão 3' de dois nucleotídeos é:

5' - GCACUAUCGCAUCGACAAANN -3' SEQ ID NO:3

3* - NNCGUGAUAGCGUAGCUGUUU -5' SEQ ID NO:4.

Cada resíduo "N" pode ser qualquer nucleotídeo (A,C, G, U T) ou um nucleotídeo modificado. A extremidade 3'pode ter um número de "N" resíduos entre e incluindo um,dois, três, quatro, cinco e seis. Os "N" resíduos no cordãopodem ser o mesmo resíduo (por exemplo, UU, AA, CC, GG ou TT)ou podem ser diferentes (por exemplo, AC, AG, AU, CA, CG, CU,GA, GC, GU, UA, UC ou UG) . As extensões 3' podem ser asmesmas ou podem ser diferentes. Em uma realização, ambos oscordões têm uma extensão 31UU.

Um siRNA da invenção para focalizar uma seqüênciacorrespondente do mRNA de SEQ ID NO: 2 e contendo cordões de21 nucleotídeos e uma extensão 3'UU em cada cordão é:

5' - GCACUAUCGCAUCGACAAAUU -3' SEQ ID NO:5

3' - UUCGUGAUAGCGUAGCUGUUU-51 SEQ ID NO:6.

O RNA de interferência pode também ter uma extensão51 de nucleotídeos ou pode ter extremidades rombudas. Um siRNA da invenção para focalizar uma seqüência correspondentedo mRNA da SEQ ID NO: 2 e contendo cordões de 19 nucleotídeose extremidades rombudas é:

5' - GCACUAUCGCAUCGACAAA -3' SEQ ID NO: 7

3' - CGUGAUAGCGUAGCUGUUU- 5' SEQ ID NO:8.

Os cordões de um RNA de interferência de cordãoduplo (por exemplo, um siRNA) podem ser conectados paraformar uma estrutura de pino delgado ou de haste-laço (porexemplo, um shRNA) . Um shRNA da invenção que focaliza umaseqüência correspondente do mRNA da SEQ ID NO:2 e que tem umaregião de haste de cordão duplo de 10] 9 bp e uma extensão3'UU é:

<formula>formula see original document page 23</formula>

N é um nucleotídeo A, T, C, G, U, ou uma formamodificada conhecida por um elemento versado na técnica. Onúmero de nucleotídeos N no laço é um número entre eincluindo 3 a 23, ou 5 a 15, ou 7 a 13, ou 4 a 9, ou 9 a 11,ou o número de nucleotídeos N é 9. Alguns dos nucleotídeos nolaço podem ser envolvidos em interações de pares base comoutros nucleotídeos no laço. Os exemplos das seqüências deoligonucleotídeo que podem ser utilizadas para formar o laçoincluem 5'-UUCAAGAGA-31 (Brummelkamp, T. R. et al. (2002)Science 296:550) e 51-UUUGUGUAG-3' (Castanotto, D. et al.(2002) RNA 8:1454). Deve ser reconhecido por um elementoversado na técnica que o oligonucleotídeo de cadeia simplesresultante forma uma estrutura de haste-laço ou de pino finoque compreende uma região de cordão duplo com capacidade deinteração com a maquinaria de RNAi.

A seqüência alvo do siRNA identificada acima podeser estendida na extremidade 31 para facilitar o desenho deduplexes de 27 mers de substrato de dicer. A extensão daseqüência alvo do DNA de 19 nucleotídeos (SEQ ID NO: 2)identificada na seqüência do DNA de Syk (SEQ ID N0:1) porseis nucleotídeos resulta em uma seqüência alvo do DNA de 25nucleotídeos presente nos nucleotídeos 789 a 813 da SEQ IDNO: 1 :5' - GCACTATCGCATCGACAAAGACAAG-31 SEQ ID NO:10.Ura duplex de 27 mers de substrato de dicer dainvenção para focalizar uma seqüência correspondente do mRNAda SEQ ID NO:10 é:5* - GCACUAUCGCAUCGACAAAGACAAG-31 SEQ ID NO:11

3' - UUCGUGAUAGCGUAGCUGUUUCUGUUC-51 SEQ ID NO:12.Os dois nucleotídeos na extremidade 3' do cordão desentido (isto é, os nucleotídeos AG da SEQ ID NO: 11) podemser desoxinucleotídeos para um processamento intensificado. 0

desenho do duplex de 27 mers de substrato de dicer deseqüências alvo de 19-21 nucleotídeos, tal como aquiapresentado, é discutido ainda mais pelo site na web deIntegrated DNA Technologies (IDT) e por Kim, D.H., et al. ,(fevereiro, 2005) Nature Biotechnology 23:2; 222-226.

Quando os RNAs de interferência são produzidos pelasíntese química, a fosforilação na posição 5' do nucleotídeona extremidade 5' de um ou ambos os cordões (quandopresentes) pode intensificar a eficácia e a especificidade docomplexo de RISC ligado mas não é requerida, uma vez que afosforilação pode ocorrer intracelularmente.

Aqui também é apresentado um método de atenuação daexpressão do mRNA de Syk de um indivíduo, o qual compreende:

a administração ao indivíduo de uma composição quecompreende uma quantidade eficaz de um RNA de interferência (iRNA) que tem um comprimento de 19 a 4 9 nucleotídeos e umveículo farmaceuticamente aceitável, em que o RNA deinterferência compreende uma região selecionada do grupo queconsiste em:

uma região de pelo menos treze nucleotídeos contíguos que têm uma complementaridade de seqüência de pelomenos 90%, ou uma identidade de seqüência de pelo menos 90%com os penúltimos treze nucleotídeos da extremidade 3' de ummRNA que corresponde a qualquer uma dentre a SEQ ID NO:2 e aSEQ ID NO:13 - SEQ ID NO:40;

uma região de pelo menos catorze nucleotídeoscontíguos que têm uma complementaridade de seqüência de pelomenos 85%, ou uma identidade de seqüência de pelo menos 85%com os penúltimos catorze nucleotídeos da extremidade 3' deum mRNA que corresponde a qualquer uma dentre a SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:13 - SEQ ID NO:40, e SEQ ID NO:44 - SEQ ID NO:47; euma região de pelo menos 15, 16, 17, ou 18nucleotídeos contíguos que têm uma complementaridade deseqüência de pelo menos 80%, ou uma identidade de seqüênciade pelo menos 80% com os penúltimos 15, 16, 17 ou 18nucleotídeos, respectivamente, da extremidade 3' de um mRNAque corresponde a qualquer uma dentre a SEQ ID NO: 2, SEQ IDNO:13 - SEQ ID NO:40, e SEQ ID NO:44 - SEQ ID NO:47,

em que a expressão do mRNA de Syk é desse modoatenuada.

Também é apresentado um método de tratamento de umacondição inflamatória relacionada com a Syk em um indivíduocom necessidade do mesmo, o qual compreende:

a administração ao indivíduo de uma composição quecompreende uma quantidade eficaz de um RNA de interferênciaque tem um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos, e um veículofarmaceuticamente aceitável, em que

o RNA de interferência compreende uma regiãoselecionada do grupo que consiste em:

uma região de pelo menos treze nucleotídeoscontíguos que têm uma complementaridade de seqüência de pelomenos 90%, ou uma identidade de seqüência de pelo menos 90%com os penúltimos treze nucleotídeos da extremidade 3' de ummRNA que corresponde a qualquer uma dentre a SEQ ID NO:2, SEQID NO:13 - SEQ ID NO:40, e SEQ ID NO:44 - SEQ ID NO:47;

uma região de pelo menos catorze nucleotídeoscontíguos que têm uma complementaridade de seqüência de pelomenos 85%, ou uma identidade de seqüência de pelo menos 85%aos penúltimos catorze nucleotideos da extremidade 31 de ummRNA que corresponde a qualquer uma dentre a SEQ NO: 2 e SEQID NO:13 - SEQ ID NO:40; e

uma região de pelo menos 15, 16, 17 ou 18nucleotideos contíguos que têm uma complementaridade deseqüência de pelo menos 8 0%, ou uma identidade de seqüênciade pelo menos 80% com os penúltimos 15, 16, 17, ou 18nucleotideos, respectivamente, da extremidade 3' de um mRNAque corresponde a qualquer uma dentre a SEQ ID NO: 2, SEQ IDNO:13 - SEQ ID NO:40, e SEQ ID NO:44 - SEQ ID NO:47,

em que a condição inflamatória relacionada com aSyk é desse modo tratada.

Outras realizações compreendem um método deatenuação da expressão do mRNA de Syk de um indivíduo, o qualcompreende:

a administração ao indivíduo de uma composição quecompreende uma quantidade eficaz de um RNA de interferênciaque tem um comprimento de 19 a 4 9 nucleotideos e um veículofarmaceuticamente aceitável, em que o RNA de interferênciacompreende:

um cordão de nucleotídeo de sentido, um cordão denucleotídeo de anti-sentido, e uma região de umacomplementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelomenos dezenove nucleotideos;

em que o cordão de anti-sentido hibridiza sobcondições fisiológicas a uma porção do mRNA selecionada dogrupo que consiste em:

um mRNA que corresponde à SEQ ID NO :1 quecompreende o nucleotídeo #lista, e

um mRNA que corresponde à SEQ ID NO :1 quecompreende o nucleotídeo 1007, 1698, ou 1769,

em que a expressão do mRNA de Syk é desse modoatenuada.

Aqui também são apresentados métodos de tratamentode uma condição inflamatória relacionada com a Syk em umindivíduo com necessidade do mesmo, o qual compreende:a administração ao indivíduo de uma composição quecompreende uma quantidade eficaz do RNA de interferência quetem um comprimento de 19 a 4 9 nucleotídeos, e um veículofarmaceuticamente aceitável, em que o RNA de interferênciacompreende um cordão de nucleotídeo de sentido, um cordão denucleotídeo de anti-sentido, e uma região de umacomplementaridade contíguo pelo menos quase perfeita de pelomenos dezenove nucleotídeos;

em que o cordão de anti-sentido hibridiza sobcondições fisiológicas a uma porção do mRNA selecionado dogrupo que consiste em:

um mRNA que corresponde à SEQ ID NO :1 quecompreende o nucleotídeo #lista, e

um mRNA que corresponde à SEQ ID NO :1 quecompreende o nucleotídeo 1007, 1698 ou 1769,em que a condição inflamatória relacionada com aSyk é desse modo tratada.

Outras realizações compreendem um método deatenuação da expressão do mRNA de Syk de um indivíduo, o qualcompreende:

a administração ao indivíduo de uma composição quecompreende uma quantidade eficaz de um RNA de interferênciade um único cordão que tem um comprimento de 19 a 4 9nucleotídeos, e um veículo farmaceuticamente aceitável, emque o RNA de interferência de um único cordão hibridiza sobcondições fisiológicas a uma porção do mRNA selecionada dogrupo que consiste em:

um mRNA que corresponde à SEQ ID NO :1 quecompreende o nucleotídeo #lista, eum mRNA que corresponde à SEQ ID NO :1 quecompreende o nucleotídeo 1007, 1698 ou 1769,

e o RNA de interferência tem uma região de umacomplementaridade contígua pelo menos quase perfeita com aporção de hibridização do mRNA que corresponde à SEQ ID NO: I7em que a expressão do mRNA de Syk é desse modoatenuada.

Também é apresentado o método de tratamento deinflamação ocular ou de conjuntivite em um indivíduo com10 necessidade do mesmo, o qual compreende:

a administração ao indivíduo de uma composição quecompreende uma molécula de siRNA de cordão duplo que regulapara baixo a expressão de um gene de Syk através dainterferência do RNA, em que:

cada cordão da molécula de siRNA temindependentemente aproximadamente 19 a aproximadamente 27nucleotídeos de comprimento; e

um cordão da molécula do siRNA compreende umaseqüência de nucleotídeo que tem uma complementaridadesubstancial a um mRNA que corresponde ao gene de Syk de modoque a molécula de siRNA dirige a clivagem do mRNA através dainterferência do RNA.

Também são apresentadas várias composições quecompreendem um RNA de interferência que tem um comprimento de19 a 49 nucleotídeos, e compreendem uma seqüência denucleotídeo que corresponde a qualquer uma dentre a SEQ IDNO: 2, SEQ ID NO: 13 - SEQ ID NO: 40, e SEQ ID NO: 44 - SEQ IDNO:47, ou um complemento destes; e um veículofarmaceuticamente aceitável. Várias outras composiçõescompreendem um RNA de interferência que tem um comprimento de19 a 49 nucleotídeos, e consistem essencialmente em umaseqüência de nucleotídeo que corresponde a qualquer umadentre a SEQ ID NO: 41 - SEQ ID NO: 47, ou um complementodestes; e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Embora uma realização particular da invenção tenhasido mostrada e descrita, numerosas variações e realizaçõesalternativas ocorrerão aos elementos versados na técnica.

Consequentemente, pretende-se que a invenção seja limitadasomente em termos das reivindicações anexas.

A invenção pode ser englobada em outras formasespecíficas sem que se desvie do seu caráter oucaracterísticas essenciais. As realizações descritas devemser consideradas em todos os respeitos somente comoilustrativas e não restritivas. O âmbito da invenção éindicado, portanto, pelas reivindicações anexas e não peladescrição acima. Todas as mudanças nas reivindicações que seenquadram dentro do significado e da faixa de equivalênciadas reivindicações devem ser englobadas dentro de seu âmbito.

Além disso, todos os documentos, patentes, e pedidospublicados aqui mencionados são aqui incorporados a título dereferência, como se fossem apresentados em sua totalidade.

Exemplos

A Tabela 1 lista exemplos das seqüências alvo doDNA de Syk da SEQ ID NO :1 de que os siRNAs da presenteinvenção são designados de uma maneira tal como indicadoacima. A Syk codifica a tirosina quinase do baço, tal comoindicado acima.

Tabela 1. Seqüências alvo de Syk para siRNAs

<table>table see original document page 29</column></row><table>CAGCTAGTCGAGCATTATT 862 16AGTCGAGCATTATTCTTAT 867 17GTCGAGCATTATTCTTATA 868 18AGTTATTAGCAGAAGCAAA 1394 19CGTACATCGTGCGCATGAT 1436 20GAGTCCTGGATGCTAGTTA 1471 21AGTCCTGGATGCTAGTTAT 1472 22ACAGACATGTCAAGGATAA 1535 23AGGATAAGAACATCATAGA 1547 24TGATTTCGGACTCTCCAAA 1680 25CATGGAAAGTGGCCTGTCA 1738 26ATGGAAAGTGGCCTGTCAA 1739 27CTCCGGAATGCATCAACTA 1766 28GAAGTGAAGTCACCGCTAT 1880 29GATGTACGATCTCATGAAT 1947 30GCTGCGCAATTACTACTAT 2022 31ACTATGACGTGGTGAACTA 2036 32TTACGATCTGTTTCCAAAT 2328 33TACGATCTGTTTCCAAATC 2329 34CTTAGCATGTGACTCCTGA 2473 35AGGAATTTGGCTGCTTCTA 2509 36TGCTTCTACGGCCATGAGA 2520 37TCTACGGCCATGAGACTGA 2524 38AAGCTTTCCTGACAATAAA 2558 39CCAGTGCAGTTTCTAAGCA 2613 40

Tabela 2. Outras seqüências alvo de Syk para siRNAs

<table>table see original document page 30</column></row><table><table>table see original document page 31</column></row><table>

Conforme citado nos exemplos acima, um elementoversado na técnica pode utilizar as informações da seqüênciaalvo fornecida na Tabela 1 para desenhar RNAs deinterferência que têm um comprimento mais curto ou mais longo do que as seqüências fornecidas na Tabela 1 mediantereferência à posição da seqüência na SEQ ID NO:1 e a adiçãoou a deleção de nucleotídeos complementares ou quasecomplementares à SEQ ID N0:1.

A reação de clivagem do RNA alvo guiada por siRNAs e outras formas de RNA de interferência é altamenteespecifica de seqüência. Geralmente, o siRNA que contém umcordão de nucleotideo de sentido idêntico na seqüência a umaporção do mRNA alvo e um cordão de nucleotideo de anti-sentido exatamente complementar a uma porção do mRNA alvo constituem realizações do siRNA para a inibição dos mRNAsaqui citados. No entanto, 100% de complementaridade deseqüência entre o cordão de siRNA de anti-sentido e o mRNAalvo, ou entre o cordão de siRNA de anti-sentido e o cordãode siRNA de sentido, não são requeridos para praticar apresente invenção. Desse modo, por exemplo, a invençãopermite variações de seqüência que podem ser esperadas devidoà mutação genética, ao polimorfismo de cepa, ou à divergênciaevolucionária.

Em uma realização da invenção, o cordão de anti- sentido de siRNA tem uma complementaridade contígua pelomenos quase perfeita de pelo menos dezenove nucleotídeos como mRNA alvo. "Quase perfeita", tal como aqui empregado,significa que o cordão de anti-sentido de siRNA é"substancialmente complementares a", e que o cordão desentido de siRNA é "substancialmente idêntico a" pelo menosuma porção do mRNA alvo. "Identidade", como é do conhecimentode um elemento versado na técnica, é o grau de relação deseqüência entre as seqüências de nucleotideos tal comodeterminado pela combinação da ordem e identidade dosnucleotideos entre as seqüências. Em uma realização, o cordãode anti-sentido de um siRNA que tem 80% e entre 80% e 100% decomplementaridade,por exemplo, 85%, 90% ou 95% decomplementaridade, à seqüência do mRNA alvo, é consideradauma complementaridade quase perfeita e pode ser utilizada napresente invenção. A complementaridade contígua "perfeita" éo emparelhamento de base de Watson-Crick padrão de pares baseadjacentes. A complementaridade contígua "pelo menos quaseperfeita" inclui a complementaridade "perfeita" conforme aquiempregado. Métodos de computador para determinar a identidadeou a complementaridade são projetados para identificar o maior grau de combinação de seqüências de nucleotideos, porexemplo, BLASTN (Altschul, S.F., et al. (1990) J. Mol. Biol.215 :403-410) .

A relação entre um mRNA alvo (cordão de sentido) eum cordão de um siRNA (o cordão de sentido) é aquele daidentidade. 0 cordão de sentido de um siRNA também édenominado cordão de passageiro, se estiver presente. Arelação entre um mRNA alvo (cordão de sentido) e o outrocordão de um siRNA (o cordão de anti-sentido) é aquela decomplementaridade. 0 cordão de anti-sentido de um siRNAtambém é denominado cordão guia.

A penúltima base em uma seqüência de ácido nucléicoque é escrita em uma direção 51 a 3' é a base anterior àúltima, isto é, a base subseqüente à base 3'. As penúltimastreze bases de uma seqüência de ácido nucléico escrita em umadireção 5' a 3' são as últimas treze bases de uma seqüênciasubseqüente à base 31 e não incluindo a base 31 .Similarmente, as penúltimas 14, 15, 16, 17 ou 18 bases de umaseqüência de ácido nucléico escrita em uma direção 5' a 3'são as últimas 14, 15, 16, 17 ou 18 bases de uma seqüência,respectivamente, subseqüente à base 3' e não incluindo a base 3'.

Em uma realização da invenção, a região denucleotídeos contíguos é uma região de pelo menos catorzenucleotídeos contíguos que têm uma complementaridade deseqüência de pelo menos 85%, ou uma identidade de seqüênciade pelo menos 85% com os penúltimos catorze nucleotídeos daextremidade 3' de um mRNA que corresponde à seqüênciaidentificada por cada identificador de seqüência. Duassubstituições de nucleotídeo (isto é, 12/14 = 86%identidade/complementaridade) são incluídas em tal expressão.

Em uma realização adicional da invenção, a regiãode nucleotídeos contíguos é uma região de pelo menos 15, 16,17 ou 18 nucleotídeos contíguos que têm uma complementaridadede seqüência de pelo menos 80%, ou uma identidade deseqüência de pelo menos 80% com os penúltimos catorzenucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA que corresponde àseqüência do identificador de seqüência. Três substituiçõesdo nucleotídeo são incluídas em tal expressão.

A seqüência alvo nos mRNAs que correspondem à SEQID NO: 1 pode estar nas regiões não-transladadas 5' ou 31 domRNA, bem como na região de codificação do mRNA.

Um ou ambos os cordões do RNA de interferência decordão duplo podem ter uma extensão 3' de um a seisnucleotídeos, que podem ser ribonucleotídeos oudesoxiribonucleotídeos ou uma mistura destes. Os nucleotídeosda extensão não são emparelhados em bases. Em uma realizaçãoda invenção, o RNA de interferência compreende uma extensão31 de TT ou UU. Em uma outra realização da invenção, o RNA deinterferência compreende pelo menos uma extremidade rombuda.

Os terminais têm geralmente um grupo fosfato 51 ou um grupohidroxila 3'. Em outras realizações, o cordão de anti-sentidotem um grupo fosfato 5', e o cordão do sentido tem um grupohidroxila 51. Em ainda outras realizações, os terminais sãomodificadas ainda pela adição covalente de outras moléculasou grupos funcionais.

Os cordões de sentido e de anti-sentido do siRNA decordão duplo podem estar em uma formação duplex de doiscordões individuais tal como descrito acima, ou podem ser umaúnica molécula onde as regiões de complementaridade sãoemparelhadas em bases e ligadas covalentemente por uma formade laço de pino fino de modo a formar um único cordão.Acredita-se que o pino fino seja clivado intracelularmentepor uma proteína denominada dicer para formar um RNA deinterferência de duas moléculas emparelhadas em basesindividuais do RNA.

Os RNAs de interferência podem diferir do RNA deocorrência natural pela adição, deleção, substituição oumodificação de um ou mais nucleotídeos. 0 material de não-nucleotídeo pode ser ligado ao RNA de interferência, tanto naextremidade 51 quanto na extremidade 3', ou internamente.Tais modificações são normalmente destinadas a aumentar aresistência a nuclease dos RNAs de interferência, melhorar aabsorção celular, incrementar a escolha de alvos celulares,ajudar a rastrear o RNA de interferência, melhorar ainda maisa estabilidade, ou reduzir o potencial para a ativação depassagem de interferon. Por exemplo, os RNAs de interferênciapodem compreender um nucleotídeo de purina nas extremidadesdas extensões. A conjugação do colesterol à extremidade 3' docordão de sentido de uma molécula do siRNA por meio de umligante de pirrolidina, por exemplo, também confereestabilidade a um siRNA.

Outras modificações incluem uma molécula terminalde biotina 31 , um peptídeo que é conhecido como dotado depropriedades de penetração de célula, uma nanopartícula, umpeptidomimético, um corante fluorescente, ou um dendrímero,por exemplo.

Os nucleotídeos podem ser modificados em sua porçãobase, em sua porção de açúcar, ou na porção de fosfato damolécula e funcionar nas realizações da presente invenção. Asmodificações incluem substituições com grupos alquila,alcóxi, amino, deaza, halo, hidroxila, tiol, ou umacombinação destes, por exemplo. Os nucleotídeos podem sersubstituídos por análogos com maior estabilidade, tal como asubstituição de um ribonucleotídeo por umdesoxiribonucleotídeo, ou ter modificações de açúcar taiscomo grupos 21 OH substituídos por grupos 2' amino, grupos 2'0-metila, grupos 2' metóxi etila, ou uma ponte de 2'-0,4'Cmetileno, por exemplo. Os exemplos de um análogo de purina oude pirimidina dos nucleotídeos incluem uma xantina, umahipoxantina, uma azapurina, uma metiltioadenina, uma 7-deaza-adenosina e nucleotídeos 0- e N-modifiçados. 0 grupo fosfatedo nucleotídeo pode ser modificado ao substituir um ou maisdos oxigênios do grupo fosfato por nitrogênio ou enxofre(fosforotioatos). As modificações são úteis, por exemplo,para intensificar a função, melhorar a estabilidade ou apermeabilidade, ou para dirigir a localização ou afocalização.

Pode haver uma região ou regiões do cordão de RNAde interferência de anti-sentido que seja(m) nãocomplementar(es) a uma porção da SEQ ID N0:1. As regiões não-complementares podem estar na extremidade 31, 5' ou em ambasde uma região complementar ou entre duas regiõescomplementares.

Os RNAs de interferência podem ser geradosexogenamente por síntese química, pela transcrição in vitro,ou pela clivagem de um RNA de cordão duplo mais longo comdicer ou uma outra nuclease apropriada com atividade similar.Os RNAs de interferência quimicamente sintetizados,produzidos a partir de fosforamiditas de ribonucleosideoprotegido utilizando um sintetizador convencional de DNA/ENA,podem ser obtidos junto a fornecedores comerciais tais como Ambion Inc. (Austin, TX), Invitrogen (Carlsbad, CA), ouDharmacon (Lafayette, CO) . Os RNAs de interferência sãopurificados pela extração com um solvente ou resina, aprecipitação, a eletroforese, a cromatografia, ou umacombinação destas, por exemplo. Alternativamente, o RNA de interferência pode ser utilizado com pouca purificação, casohaja alguma, para evitar as perdas devidas ao processamentode amostras.

Os RNAs de interferência também podem ser expressosendogenamente a partir de vetores de expressão de plasmídioou viral ou de cassetes de expressão mínima, por exemplo, osfragmentos gerados de PCR que compreendem um ou maispromotores e um molde ou moldes apropriados para o RNA deinterferência. Os exemplos de vetores de expressão à base deplasmídio comercialmente disponíveis para o shRNA incluemmembros a série pSilencer (Ambion, Austin, TX) e pCpG-siRNA(InvivoGen, San Diego, CA). Os vetores virais para aexpressão do RNA de interferência podem ser derivados de umavariedade de vírus, incluindo adenovírus, vírus adeno-associado, lentivirus (por exemplo, HIV, FIV e EIAV), e vírus de herpes. Os exemplos de vetores virais comercialmentedisponíveis para a expressão do shRNA incluem o adeno depSilencer (Ambion, Austin, TX) e o pLenti6BL0CK-iTTM-DEST(Invitrogen, Carlsbad, CA). A seleção de vetores virais,métodos para expressar o RNA de interferência do vetor e métodos para aplicar o vetor viral está dentro da capacidadecomum de um elemento versado na técnica. Os exemplos de kitspara a produção de cassetes de expressão de shRNA gerados porPCR incluem o Silence Express (Ambion, Austin, TX) e osiXpress (Mirus, Madison, WI). Um primeiro RNA deinterferência pode ser administrado através de uma expressãoin vivo de um primeiro vetor de expressão com capacidade deexpressar o primeiro RNA de interferência, e um segundo RNAde interferência pode ser administrado através de umaexpressão in vivo de um segundo vetor de expressão comcapacidade de expressar o segundo RNA de interferência, ouambos os RNAs de interferência podem ser administradosatravés de uma expressão in vivo de um único vetor deexpressão com capacidade de expressar ambos os RNAs deinterferência.

Os RNAs de interferência podem ser expressos apartir de uma variedade de promotores eucarióticos conhecidosdos elementos versados na técnica, incluindo promotores polIII, tais como os promotores U6 ou Hl, ou promotores pol II,tal como o promotor de citomegalovirus. Os elementos versadosna técnica irão reconhecer que estes promotores também podemser adaptados para permitir a expressão induzível do RNA deinterferência.

Hibridização sob Condições Fisiológicas: Emdeterminadas realizações da presente invenção, um cordão deanti-sentido de um RNA de interferência hibridiza com um mRNAin vivo como parte do complexo de RISC.

0 ensaio de hibridização in vitro descrito acimaprovê um método de predizer se a ligação entre um siRNAcandidato e um alvo terá especificidade. No entanto, nocontexto do complexo de RISC, a clivagem específica de umalvo também pode ocorrer com um cordão de anti-sentido quenão demonstre uma estringência elevada para a hibridização invitro.

RNA de interferência de um único cordão: Tal comocitado acima, os RNAs de interferência funcionam finalmentecomo cordões individuais. Foi verificado que o RNA deinterferência de um único cordão (ss) efetua osilencionamento de mRNA, muito embora menos eficientemente doque o RNA de cordão duplo. Portanto, as realizações dapresente invenção também provêm a administração de um RNA deinterferência ss que hibridiza sob condições fisiológicas auma porção de SEQ ID NO :1 e tem uma região decomplementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelomenos dezenove nucleotídeos com a porção de hibridização daSEQ ID N0:1. 0 RNA de interferência ss da Tabela 1 tem umcomprimento de 19 a 4 9 nucleotídeos tal como para o RNA deinterferência do citado acima. 0 RNA de interferência ss temum fosfato 5' ou é fosforilado in situ ou in vivo na posição5'. A expressão "5' fosforilado" é utilizada para descrever,por exemplo, polinucleotídeos ou oligonucleotídeos que têm umgrupo fosfato unido através da ligação de éster à hidroxilaC5 do açúcar (por exemplo, ribose, desoxiribose ou um análogodas mesmas) na extremidade 5' do polinucleotídeo ouoligonucleotídeo.

Os RNAs de interferência ss são sintetizadosquimicamente pela transcrição in vitro ou então sãoexpressados endogenamente de vetores ou cassetes de expressãotal como para os RNAs de interferência ds. Os grupos fosfato5' podem ser adicionados através de uma quinase, ou umfosfato 5' pode ser o resultado da clivagem da nuclease de umRNA. A aplicação é tal como para os RNAs de interferência de.Em uma realização, os RNAs de interferência ss que têmextremidades protegidas e modificações resistentes denuclease são administrados para o silenciamento. Os RNAs deinterferência de podem ser secados para a armazenagem oupodem ser dissolvidos em uma solução aquosa. A solução podeconter tampões ou sais para inibir o anelamento ou para aestabilização.

RNA de interferência de pino fino: Um RNA deinterferência de pino fino é uma molécula individual (porexemplo, uma única cadeia de oligonucleotídeo) que compreendeas cordões de sentido e de anti-sentido de um RNA deinterferência em uma estrutura de haste-laço ou de pino fino(por exemplo, um shRNA). Por exemplo, os shRNAs podem serexpressos a partir de vetores de DNA em que osoligonucleotideos do DNA que codificam um cordão RNA deinterferência de sentido são ligados aos oligonucleotideos doDNA que codificam o cordão de RNA de interferência de anti-sentido complementar reverso por um espaçador curto. Se fornecessário para o vetor de expressão escolhido, Ts doterminal 31 e nucleotídeos que formam sítios de restriçãopodem ser adicionados. O transcrito de DNA resultante édobrado de volta em si mesmo para formar uma estrutura dehaste-laço.

Modo de administração: O RNA de interferência podeser aplicado através da administração em aerossol, oral,dermal, intradermal, inalação, intramuscular, intranasal,intraocular, intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal,nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, emplastro,subcutânea, sublingual, tópica, ou transdermal, por exemplo.

A administração pode ser diretamente aplicada aoolho pela administração ao tecido ocular tal como aadministração periocular, conjuntival, de subtenon,intracameral, intravitreal, intraocular, subretinal,subconjuntival, retrobulbar, intracanalicular, ousupracoroidal; pela injeção, pela aplicação direta ao olhoutilizando um cateter ou um outro dispositivo de colocaçãotal como uma pelota, inserção intraocular, um supositórioretinal ou um implante que compreende um material poroso,não-poroso ou gelatinoso; colírios ou pomadas ocularestópicos; ou por um dispositivo de liberação lenta no cul-de-sac ou implantado adjacente à esclera (transcleral) ou dentrodo olho. A injeção intracameral pode ser através da córnea nacâmara anterior para permitir que o agente alcance a malhatrabecular. A injeção intracanalicular pode ser nos canaiscoletores venosos que drenam o canal de Schlemm ou rumo aocanal de Schlemm. Outros modos de administração incluemcomprimidos, pílulas e cápsulas.

A administração pode ser aplicada diretamente aoouvido através, por exemplo, de gotas ou pomadas óticastópicas, dispositivos de liberação lenta no ouvido ouimplantados adjacentes à orelha. A administração local incluivias de administração de injeção intramuscular ótica, nacavidade intratimpânica e intracoclear. Além disso, osagentes podem ser administrados no ouvido interno mediante acolocação de uma espuma de gel, ou um produto absorvente eaderente similar, embebido com o RNA de interferência contraa membrana da janela do ouvido médio/interno ou uma estruturaadj acente.

A administração pode ser diretamente aplicada aospulmões, através, por exemplo, de um preparado em aerossol, epela inalação através de um inalador ou um nebulizador, porexemplo.

Indivíduo: Um indivíduo com necessidade dotratamento para uma condição inflamatória relacionada com aSyk ou correndo o risco de desenvolver uma condiçãoinflamatória relacionada com a Syk é um ser humano ou umoutro mamífero que tem uma condição inflamatória relacionadacom a Syk ou correndo o risco de desenvolver uma condiçãoinflamatória relacionada com a Syk, tal como conjuntivitealérgica, inflamação ocular, dermatite, rinite, asma,alergia, ou doença de células mastóideas, por exemplo,associadas com a expressão ou a atividade indesejada ouadequada de Syk tal como aqui citado.

As estruturas oculares associadas com taisdistúrbios podem incluir o olho, a retina, o coróide, alente, a córnea, a malha trabecular, a íris, o nervo óptico,a cabeça do nervo óptico, a esclera, a câmara aquosa, acâmara vítrea, o corpo ciliar, ou o segmento posterior, porexemplo.

As estruturas óticas associadas com tais distúrbiospodem incluir o ouvido interno, o ouvido médio, o ouvidoexterno, a cavidade ou membrana timpânica, a cóclea, ou atrompa de Eustáquio, por exemplo.

As estruturas pulmonares associadas com taisdistúrbios podem incluir o nariz, a boca, a faringe, alaringe, os tubos bronquiais, a traquéia, a carina (a nervuraque separa a abertura dos brônquios principais direito eesquerdo), e os pulmões, particularmente a parte inferior dospulmões, tais como os bronquíolos e os alvéolos.

Um indivíduo também ser uma célula ótica, umacélula do pulmão, uma célula ocular, uma cultura de células,um órgão ou um órgão ou tecido ex vivo.

Formulação e dosagem: As formulações farmacêuticascompreendem RNAs de interferência, ou sais destes, dainvenção em até 99% em peso misturados com um meio carreadorfisiologicamente aceitável tal como a água, tampão, soluçãosalina, glicina, ácido hialurônico, manitol, e outros ainda.

Os RNAs de interferência da presente invenção sãoadministrados como sólidos, soluções, suspensões, ouemulsões. O que segue são exemplos das formulações possíveisenglobadas pela presente invenção.

<table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table>

Geralmente, uma quantidade eficaz dos RNAs deinterferência das realizações da invenção resulta em umaconcentração extracelular na superfície da célula alvo de 100pM a 100 nM, ou de 1 nM a 50 nM, ou de 5 nMa aproximadamente 10 nM, ou de aproximadamente 25 nM. a dose requerida paraconseguir esta concentração local irá variar dependendo deuma série de fatores incluindo o método de aplicação, o localda aplicação, o número de camadas de células entre o local daaplicação e a célula ou tecido alco, se a aplicação é localou sistêmica, etc. A concentração no local de aplicação podeser consideravelmente mais elevada do que na superfície dacélula ou tecido alvo. As composições tópicas são aplicadas àsuperfície do órgão alvo uma a quatro vezes por dia, ou emuma programação de aplicação prolongada tal como diária,semanal, bi-semanal, mensalmente, ou mais longa, de acordocom a discreção rotineira de um clínico habilitado. 0 pH daformulação é de aproximadamente pH 4-9, ou pH 4,5 a pH 7,4.

0 tratamento terapêutico dos pacientes com siRNAsdirigidos contra o mRNA de Syk deve ser benéfico em relaçãoaos tratamentos com moléculas pequenas mediante o aumento daduração da ação, desse modo permitindo uma dosagem menosfreqüente e uma maior conformidade com o paciente.

Uma quantidade eficaz de uma formulação podedepender de fatores tais como a idade, a raça e o sexo doindivíduo, da gravidade da condição inflamatória relacionadacom a Syk, da taxa de turnover de transcrito/proteína do genealvo, da potência do RNA de interferência, e da estabilidade do RNA de interferência, por exemplo. Em uma realização, oRNA de interferência é aplicado topicamente a um órgão alvo ealcança o tecido contendo tirosina quinase do baço a uma doseterapêutica, melhorando desse modo um processo relacionadocom a Syk.

Veículos aceitáveis: Um veículo aceitável refere-seaos veículos que causam no máximo de pouca a nenhumairritação ocular, provêm uma preservação apropriada casonecessário, e aplicam um ou mais RNAs de interferência dapresente invenção em uma dosagem homogênea. Um veículo aceitável para a administração do RNA de interferência dasrealizações da presente invenção inclui reagentes detransfecção à base de lipídios catiônicos TranslT®-TKO (MirusCorporation, Madison, WI) , LIPOFECTIN®, Lipofectamine,OLIGOFECTAMINETM (Invitrogen, Carlsbad, CA), ou DHARMAFECTTM (Dharmacon, Lafayette, CO) ; policátions tais comopolietilenoimina; peptídios catiônicos tais como Tat,poliarginina, ou Penetratin (peptídio Antp); ou lipossomas.Os lipossomas são formados a partir de lipídios formadores devesículas padrão e um esterol, tal como o colesterol, eincluem uma molécula de focalização tal como um anticorpomonoclonal que tem afinidade de ligação para antigenos desuperfície de célula epitelial, por exemplo. Além disso, oslipossomas podem ser lipossomas PEGilados.

Os RNAs de interferência podem ser aplicados emsolução, suspensão, ou em dispositivos de aplicaçãobioerodíveis ou não-bioerodíveis. Os RNAs de interferênciapodem ser aplicados sozinhos ou como componentes deconjugados covalentes definidos. Os RNAs de interferênciatambém podem ser complexados com lipídios catiônicos,peptídios catiônicos, ou polímeros catiônicos; complexadoscom proteínas, proteínas de fusão, ou domínios de proteínascom propriedades de ligação de ácido nucléico (por exemplo,protamina); ou encapsulados em nanopartículas. A aplicaçãoespecífica de tecido ou de célula pode ser realizada pelainclusão de uma porção de focalização apropriada tal como umanticorpo ou um fragmento de anticorpo.

Para a aplicação oftálmica, ótica ou pulmonar, umRNA de interferência pode ser combinado com conservantesoftalmológica, ótica, ou pulmonarmente aceitáveis, co-solventes, tensoativos, intensificadores de viscosidade,intensificadores de penetração, tampões, cloreto de sódio, ouágua, para formar uma suspensão ou uma solução estérilaquosa. As formulações da solução podem ser preparadas aodissolver o RNA de interferência em um tampão aquosoisotônico fisiologicamente aceitável. Além disso, as soluçõespodem incluir um tensoativo aceitável para ajudar a dissolvero inibidor. Agentes formadores de viscosidade, tais comohidróxi metil celulose, hidróxi etil celulose, metilcelulose, polivinilpirrolidona, ou outros ainda, podem seradicionados às composições da presente invenção para melhorara retenção do composto.A fim de preparar uma formulação de pomada estéril,o RNA de interferência é combinado com um conservante em umveículo apropriado, tal comoóleo mineral, lanolina líquida,ou petrolato branco. As formulações em gel estéril podem serpreparadas ao suspender o RNA de interferência em uma basehidrofílica preparada a partir da combinação, por exemplo, deCarbopol®-940 (BF Goodrich, Charlotte, NC), ou algo dogênero, de acordo com os métodos conhecidos no estado datécnica. VISCOAT® (Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX)pode ser utilizado para a injeção intraocular, por exemplo.Outras composições da presente invenção podem conter agentesintensificadores de penetração, tais como cremephor e TWEEN®80 (monolaureato de polioxietileno sorbitan, Sigma Aldrich,St. Louis, MO), na eventualidade do RNA de interferência sermenos penetrante no órgão ou tecido de interesse.

Kits: As realizações da presente invenção provêm umkit que inclui reagentes para atenuar a expressão de um mRNAtal como aqui citado em uma célula. 0 kit contém um vetor deexpressão de siRNA ou shRNA. Para os SiRNAs e os vetores deexpressão de shRNA não-virais, o kit também pode conter umreagente de transfecção ou um outro veículo de aplicaçãoapropriado. Para vetores de expressão de shRNA virais, o kitpode conter o vetor viral e/ou os componentes necessáriospara a produção do vetor viral (por exemplo, uma linhagem decélulas de acondicionamento bem como um vetor que compreendeo molde de vetor viral e vetores auciliares adicionais para ocondicionamento). O kit também pode conter siRNAs de controleou vetores positivos e negativos de expressão de shRNA (porexemplo, um siRNA de focaiização de controle ou um siRNA quefocalize um mRNA não-relacionado) . O kit também pode conterreagentes para avaliar o knockdown do gene alvo pretendido(por exemplo, primers e sondas para PCR quantitativa paradetectar o mRNA alvo e/ou anticorpos contra a proteínacorrespondente para transferência de Western).Alternativamente, o kit pode compreender uma seqüência desiRNA ou uma seqüência de shRNA e as instruções e osmateriais necessários para gerar o SiRNA pela transcrição invitro ou para construir um vetor de expressão de shRNA.

Uma combinação farmacêutica na forma de um kittambém é provida, a qual inclui, na combinação acondicionada,um meios carreador adaptado para receber um recipiente emconfinamento próximo com o mesmo e um primeiro recipiente queinclui uma composição de RNA de interferência e um veiculoaceitável. Tais kits também podem incluir, caso desejado, umou mais vários componentes de kits farmacêuticosconvencionais tais como, por exemplo, recipientes com um oumais veículos farmaceuticamente aceitáveis, recipientesadicionais, etc., tal como deve ser imediatamente aparenteaos elementos versados na técnica. Instruções impressas,tanto como inserções quanto como etiquetas, indicando asquantidades dos componentes a ser administradas, diretrizespara a administração, e/ou diretrizes para misturar oscomponentes, também podem ser incluídas no kit.

A capacidade do RNA de interferência de Syk deefetuar o knock-down ods níveis da expressão de Syk endógena,por exemplo, nas células epiteliais da córnea humana, éavaliada in vitro tal como segue. Células epiteliais dacórnea humana transformadas, por exemplo, a linhagem decélulas CEPI-17 (Offord et al. (1999) Invest Ophthalmol VisSci.40:1091-1101), são chapeadas 24 horas antes datransfecção no meio de queratinócitos KGM (Cambrex, EastRutherford, NJ). A transfecção é executada ao utilizar DharmaFECTTM 1 (Dharmacon, Lafayette, CO) de acordo com asinstruções do fabricante às concentrações do RNA deinterferência de Sky que variam de 0,1 nM - 100 nM. 0 RNA deinterferência de controle sem focalização e o RNA deinterferência de lamin A/C (Dharmacon) são utilizados comocontroles. Os níveis do mRNA alvo são avaliados por qPCR 24horas após a transfecção ao utilizar, por exemplo, primers deavanço e reverso TAQMAN® e um conjunto de sondas que abrangeo sítio alvo (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os níveisde proteína alvo podem ser avaliados aproximadamente 72 horasapós a transfecção (tempo real dependente real da taxa deturnover da proteína) por transferência de Western, porexemplo. As técnicas padrão para o isolamento do RNA e/ou daproteína das célula cultivadas são bem conhecidas doselementos versados na técnica. Para reduzir a possibilidadede efeitos desfocalizados não-específicos, a concentraçãomais baixa possível do RNA de interferência de Syk éutilizada, o que produz o nível desejado de knock-down naexpressão do gene alvo.

As referências aqui citadas, até a extensão em quefornecem procedimentos exemplificadores ou outros detalhessuplementar àqueles aqui apresentados, são incorporadasespecificamente a título de referência.

Os elementos versados na técnica, à luz da presentedescrição, irão apreciar que modificações óbvias dasrealizações aqui apresentadas podem ser feitas sem que sedesvie do caráter e âmbito da invenção. Todas as realizaçõesaqui apresentadas podem ser feitas e executadas semexperimentação inadequada à luz da presente descrição. Oâmbito amplo da invenção é indicado na descrição e suasrealizações equivalentes. O relatório descritivo não deve serinterpretado como estreitando inadequadamente o âmbitocompleto de proteção a que a presente invenção é designada.

RNA de interferência para silenciar especificamentesilenciar SYK em Células 293FT

O presente estudo examina a capacidade do RNA deinterferência de SKY de aplicar knock down aos níveis deexpressão de proteína de SYK endógena em células 293FTcultivadas.

A transfecção das células 293FT (Invitrogen,Carlsbad, CA) foi realizada ao utilizar concentrações invitro padrão (0,1 - 10 nM) de siRNAs de SYK, siRNA semsiCONTROL RISC #1, ou siRNA siCONTROL # 2 sem focalização(NTC2) e reagente de transfecção DHARMAFECT® # 1 (Dharmacon,Lafayette, CO). Todos os siRNAs foram dissolvidos no tampãode siRNA uma vez, uma solução aquosa de 20 mM de KCl, 6 mM deHEPES (pH 7,5), 0,2 mM de MgC12. As amostras de controleincluíam um controle de tampão em que o volume de siRNA foisubstituído por um volume igual do tampão de siRNA uma vez (-siRNA). As transferências de Western utilizando um anticorpoanti-SYK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foramexecutadas para avaliar a expressão da proteína de SYK. OssiRNAs de SYK são RNAs de interferência de cordão duplo quetem especificidade para os seguintes alvos: siSYK # 2 quefocaliza a seqüência AAUGCCUUGGUUCCAUGGA (SEQ ID NO:44);siSYK # 5 que focaliza a seqüência GGAAUAAUCUCAAGAAUCA (SEQID NO: 45) ; siSYK # 6 que focaliza a seqüênciaGAACUGGGCUCUGGUAAUU (SEQ ID NO:46); siSYK # 8 que focaliza aseqüência GAACAGACAUGUCAAGGAU (SEQ ID NO: 47) . Tal comomostrado pelos dados da FIGURA 1, os siRNAs de siSYK # 5,siSYK # 6 e siSYK # 8 reduziram a expressão da proteína deSYK significativamente de 1 nM às concentrações de 10 nM e 1nM em relação aos siRNAs de controle, mas exibiram umaeficácia reduzida a 0,1 nM. Os siRNAs de siSYK # 6 e siSYK #8 eram particularmente eficazes. O siRNA de siSYK # 2 eraineficaz em todas as três concentrações.

Claims (39)

1. Uso de uma composição que compreende umaquantidade eficaz de um RNA de interferência (iRNA) que temum comprimento de 19 a 49 nucleotídeos, caracterizado por serna preparação de um medicamento para atenuar a expressão domRNA de Syk de um indivíduo, tratamento este que consiste naadministração ao indivíduo da dita composição e um veículof armaceuticamente aceitável, em que o dito RNA deinterferência compreende uma região selecionada do grupo queconsiste em:uma região de pelo menos treze nucleotídeoscontíguos que têm uma complementaridade de seqüência de pelomenos 90%, ou uma identidade de seqüência de pelo menos 90%com os penúltimos treze nucleotídeos da extremidade 31 de ummRNA que corresponde a qualquer uma dentre a SEQ ID NO:2, SEQID NO:13 - SEQ ID NO:40, e SEQ ID NO:44 - SEQ ID NO:47;uma região de pelo menos catorze nucleotídeoscontíguos que têm uma complementaridade de seqüência de pelomenos 85%, ou uma identidade de seqüência de pelo menos 85%com os penúltimos catorze nucleotídeos da extremidade 3' deum mRNA que corresponde a qualquer uma dentre a SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:13 - SEQ ID N0:40, e SEQ ID NO:44 - SEQ ID NO:47; euma região de pelo menos 15, 16, 17, ou 18nucleotídeos contíguos que têm uma complementaridade deseqüência de pelo menos 8 0%, ou uma identidade de seqüênciade pelo menos 80% com os penúltimos 15, 16, 17 ou 18nucleotídeos, respectivamente, da extremidade 3' de um mRNAque corresponde a qualquer uma dentre a SEQ ID NO: 2, SEQ IDNO:13 - SEQ ID NO:40, e SEQ ID NO:44 - SEQ ID NO:47,em que a expressão do mRNA de Syk é desse modoatenuada.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a composição compreendeadicionalmente um segundo RNA de interferência que tem umcomprimento de 19 a 49 nucleotídeos e que compreende umaregião de pelo menos treze nucleotídeos contíguos que têm umacomplementaridade de seqüência de pelo menos 90%, ou umaidentidade de seqüência de pelo menos 90% com os penúltimostreze nucleotídeos da extremidade 31 de um segundo mRNA quecorresponde a qualquer uma dentre a SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 13- SEQ ID NO:40, e SEQ ID NO:44 - SEQ ID NO:47.

3. USO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o RNA de interferência é umshRNA.

4. USO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a composição é administradaatravés de uma via de aerossol, oral, dermal, intradermal,inalação, intramuscular, intranasal, intraocular,intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular,oral, ótica, parenteral, emplastro, subcutânea, sublingual,tópica, ou transdermal.

5. USO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o RNA de interferência éadministrado através de uma expressão in vivo de um vetor deexpressão com capacidade de expressar o RNA de interferência.

6. USO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o RNA de interferência é pelomenos um dentre um miRNA ou um siRNA.

7. USO de uma composição que compreende umaquantidade eficaz de um RNA de interferência que tem umcomprimento de 19 a 49 nucleotídeos, caracterizado por ser napreparação de um medicamento para o tratamento de umacondição inflamatória relacionada com a Syk em um indivíduocom necessidade do mesmo, tratamento este que consiste naadministração ao indivíduo da dita composição e um veículofarmaceuticamente aceitável, em que o RNA de interferênciacompreende uma região selecionada do grupo que consiste emuma região de pelo menos treze nucleotídeoscontíguos que têm uma complementaridade de seqüência de pelomenos 90%, ou uma identidade de seqüência de pelo menos 90%com os penúltimos treze nucleotídeos da extremidade 31 de ummRNA que corresponde a qualquer dentre a SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:13 - SEQ ID NO:40, e SEQ ID NO:44 - SEQ ID NO:47;uma região de pelo menos catorze nucleotídeoscontíguos que têm uma complementaridade de seqüência de pelomenos 85%, ou uma identidade de seqüência de pelo menos 85%com os penúltimos catorze nucleotídeos da extremidade 3' deum mRNA que corresponde a qualquer uma dentre a SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:13 - SEQ ID NO:40, e SEQ ID NO:44 - SEQ ID NO:47; euma região de pelo menos 15, 16, 17, ou 18nucleotídeos contíguos que têm uma complementaridade deseqüência de pelo menos 80%, ou uma identidade de seqüênciade pelo menos 80% com os penúltimos 15, 16, 17 ou 18nucleotídeos, respectivamente, da extremidade 3' de um mRNAque corresponde a qualquer uma dentre a SEQ ID NO: 2, SEQ IDNO:13 - SEQ ID NO:40, e SEQ ID NO:44 - SEQ ID NO:47,em que a condição inflamatório relacionada com aSyk é desse modo tratada.

8. USO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que a composição compreendeadicional um segundo RNA de interferência que tem umcomprimento de 19 a 4 9 nucleotídeos e que compreende umaregião de pelo menos treze nucleotídeos contíguos que têm umacomplementaridade de seqüência de pelo menos 90%, ou umaidentidade de seqüência de pelo menos 90% com os penúltimostreze nucleotídeos da extremidade 3' de um segundo mRNA quecorresponde a qualquer uma dentre a SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:13- SEQ ID NO:40, e SEQ ID NO:44 - SEQ ID NO:47.

9. USO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o RNA de interferência é umShRNA.

10. USO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que a composição é administradaatravés de uma via de aerossol, oral, dermal, intradermal,inalação, intramuscular, intranasal, intraocular,intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular,oral, ótica, parenteral, emplastro, subcutânea, sublingual,tópica, ou transdermal.

11. USO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o RNA de interferência éadministrado através de uma expressão in vivo de um vetor deexpressão com capacidade de expressar o RNA de interferência.

12. USO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o RNA de interferência é pelomenos um dentre um miRNA ou um siRNA.

13. USO, de acordo com a reivindicação 7, em que oindivíduo é um ser humano e o ser humano tem uma condiçãoinflamatória relacionada com a Syk ou está correndo o risco de desenvolver uma condição inflamatória relacionada com aSyk.

14. USO de uma composição que compreende umaquantidade eficaz de um RNA de interferência que tem umcomprimento de 19 a 49 nucleotídeos, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para atenuar a expressão do mRNAde Syk de um indivíduo, tratamento este que consiste naadministração ao indivíduo da dita composição e um veículofarmaceuticamente aceitável, em que o RNA de interferênciacompreende:um cordão de nucleotídeo de sentido, um cordão denucleotídeo de anti-sentido, e uma região decomplementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelomenos dezenove nucleotídeos;em que o cordão de anti-sentido hibridiza sobcondições fisiológicas a uma porção do mRNA selecionada dogrupo que consiste emmRNA que corresponde à SEQ ID NO:1 que compreende onucleotídeo 642, 789, 791, 860, 861, 862, 867, 868, 1009,- 1273, 1394, 1436, 1471, 1472, 1533, 1535, 1547, 1680, 1738,- 1739, 1766, 1880, 1947, 2022, 2036, 2328, 2329, 2473, 2509,- 2520,02524,02558 ou 2613, emRNA que corresponde à SEQ ID NO:1 que compreende onucleotídeo 1007, 1698, ou 1769,em que a expressão do mRNA de Syk é desse modoatenuada.

15. USO, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano eo ser humano tem uma condição inflamatória relacionada com aSyk ou está correndo o risco de desenvolver uma condiçãoinflamatória relacionada com a Syk.

16. USO, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano eo ser humano tem uma condição inflamatória relacionada com aSyk ou está correndo o risco de desenvolver uma condiçãoinflamatória relacionada com a Syk.

17. USO, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente aadministração ao indivíduo de um segundo RNA de interferênciaque tem um comprimento de 19 a 4 9 nucleotídeos e quecompreende:um cordão de nucleotídeo de sentido, um cordão denucleotídeo de anti-sentido, e uma região decomplementaridade pelo menos quase perfeita de pelo menosdezenove nucleotídeos;em que o cordão de anti-sentido do segundo RNA deinterferência hibridiza sob condições fisiológicas a umasegunda porção do mRNA selecionado do grupo que consiste emmRJSIA que corresponde à SEQ ID NO :1 que compreende onucleotídeo 642, 789, 791, 860, 861, 862, 867, 868, 1009,-1273, 1394, 1436, 1471, 1472, 1533, 1535, 1547, 1680, 1738,-1739, 1766, 1880, 1947, 2022, 2036, 2328, 2329, 2473, 2509,-2520, 2524, 2558, ou 2613, emRNA que corresponde à SEQ ID NO:1 que compreende onucleotídeo 1007, 1698, ou 1769.

18. USO, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que o cordão de nucleotídeo desentido e o cordão de nucleotídeo de anti-sentido sãoconectados por um cordão de nucleotídeo de laço.

19. USO, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a composição é administradaatravés de uma via de aerossol, oral, dermal, intradermal,inalação, intramuscular, intranasal, intraocular,intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular,oral, ótica, parenteral, emplastro, subcutânea, sublingual,tópica, ou transdermal.

20. USO, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que o RNA de interferência éadministrado através de uma expressão in vivo de um vetor deexpressão com capacidade de expressar o RNA de interferência.

21. USO de uma composição que compreende umaquantidade eficaz de um RNA de interferência que tem umcomprimento de 19 a 49 nucleotídeos, caracterizado por ser napreparação de um medicamento para o tratamento de umacondição inflamatória relacionada com a Syk em um indivíduocom necessidade do mesmo, tratamento este que consiste naadministração ao indivíduo da dita composição e um veículofarmaceuticamente aceitável, em que o RNA de interferênciacompreende um cordão de nucleotídeo de sentido, um cordão denucleotídeo de anti-sentido, e uma região decomplementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelomenos dezenove nucleotídeos;em que o cordão de anti-sentido hibridiza sobcondições fisiológicas a uma porção do mRNA selecionada dogrupo que consiste emmRNA que corresponde à SEQ ID NO :1 que compreendedo nucleotídeo 642, 789, 791, 860, 861, 862, 868, 1009, 1273,-1394, 1436, 1471, 1472, 1533, 1535, 1547, 1680, 1738, 1739,-1766, 1880, 1947, 2022, 2036, 2328, 2329, 2473, 2509, 2520,-2524, 2558, ou 2613, emRNA que corresponde à SEQ ID NO:1 que compreende onucleotídeo 1007, 1698, ou 1769,em que a condição inflamatório relacionada com aSyk é desse modo tratada.

22. USO, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano e oser humano tem uma condição inflamatória relacionada com aSyk ou está correndo o risco de desenvolver uma condiçãoinflamatória relacionada com a Syk.

23. USO, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente aadministração ao indivíduo de um segundo RNA de interferênciaque tem um comprimento de 19 a 4 9 nucleotídeos e quecompreende:um cordão de nucleotídeo de sentido, um cordão denucleotídeo de anti-sentido, e uma região decomplementaridade pelo menos quase perfeita de pelo menosdezenove nucleotídeos;em que o cordão de anti-sentido do segundo RNA deinterferência hibridiza sob condições fisiológicas a umasegunda porção do mRNA selecionado do grupo que consiste emmRNA que corresponde à SEQ ID NO:1 que compreende onucleotídeo 642, 789, 791, 860, 861, 862, 868, 1009, 1273,- 1394, 1436, 1471, 1472, 1533, 1535, 1547, 1680, 1738, 1739,- 1766, 1880, 1947, 2022, 2036, 2328, 2329, 2473, 2509, 2520,- 2524, 2558, ou 2613, emRNA que corresponde à SEQ ID NO:1 que compreende onucleotídeo 1007, 1698, ou 1769.

24. USO, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que o cordão do nucleotídeo desentido e o cordão de nucleotídeo de anti-sentido sãoconectados por um cordão de nucleotídeo de laço.

25. USO, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de a composição é administradaatravés de uma via de aerossol, oral, dermal, intradermal,inalação, intramuscular, intranasal, intraocular,intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular,oral, ótica, parenteral, emplastro, subcutânea, sublingual,tópica, ou transdermal.

26. USO, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que o RNA de interferência éadministrado através de uma expressão in vivo de um vetor deexpressão com capacidade de expressar o RNA de interferência.

27. USO DE UMA COMPOSIÇÃO QUE COMPREENDE UMAQUANTIDADE EFICAZ DE UM RNA DE INTERFERÊNCIA DE UM ÚNICOCORDÃO QUE TEM UM COMPRIMENTO DE 19 A 4 9 NUCLEOTÍDEOS,caracterizado por ser na preparação de um medicamento paraatenuar a expressão do mRNA de Syk de um indivíduo,tratamento este que consiste na administração ao indivíduo dadita composição e um veículo farmaceuticamente aceitável,em que o RNA de interferência de um único cordãohibridiza sob condições fisiológicas a uma porção do mRNAselecionado do grupo que consiste emmRNA que correspondem à SEQ ID NO :1 que compreendeo nucleotídeo 642, 789, 791, 860, 861, 862, 868, 1009, 1273,- 1394, 1436, 1471, 1472, 1533, 1535, 1547, 1680, 1738, 1739,-1766, 1880, 1947, 2022, 2036, 2328, 2329, 2473, 2509, 2520,-2524, 2558, ou 2613, emRNA que corresponde À SEQ ID NO:1 que compreende onucleotídeo 1007, 1698, ou 1769, eo RNA de interferência tem uma região docomplementaridade contígua pelo menos quase perfeita com aporção de hibridização do mRNA que corresponde à SEQ ID N0:1,em que a expressão do mRNA de Syk é desse modoatenuada.

28. USO, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que a composição é administradaatravés de uma via de aerossol, oral, dermal, intradermal,inalação, intramuscular, intranasal, intraocular,intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular,oral, ótica, parenteral, emplastro, subcutânea, sublingual,tópica, ou transdermal.

29. USO, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que o RNA de interferência éadministrado através de uma expressão in vivo de um vetor de expressão com capacidade de expressar o RNA de interferência.

30. USO, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que o RNA de interferência é pelomenos um dentre um miRNA ou um siRNA.

31. uso de uma composição que compreende umamolécula de siRNA de cordão duplo que regula para baixo aexpressão de um gene de Syk através da interferência do RNA,caracterizado por ser na preparação de um medicamento para ainflamação ocular ou conjuntivite em um indivíduo comnecessidade do mesmo, tratamento este que consiste naadministração ao indivíduo da dita composição, em que:cada cordão da molécula de siRNA temindependentemente aproximadamente 19 a aproximadamente 27nucleotídeos de comprimento; eum cordão da molécula de siRNA compreende umaseqüência de nucleotídeo que tem uma complementaridadesubstancial a um mRNA que corresponde ao gene de Syk de modoque a molécula do siRNA dirige a clivagem do mRNA através dainterferência do RNA.

32. USO, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a composição é administradaatravés de uma via de aerossol, oral, dermal, intradermal,inalação, intramuscular, intranasal, intraocular,intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular,oral, ótica, parenteral, emplastro, subcutânea, sublingual,tópica, ou transdermal.

33. USO, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que o RNA de interferência éadministrado através de uma expressão in vivo de um vetor deexpressão com capacidade de expressar o RNA de interferência.

34. USO, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que o RNA de interferência é ummiRNA.

35. USO, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que cada cordão da molécula dosiRNA tem independentemente de aproximadamente 19nucleotídeos a aproximadamente 25 nucleotídeos decomprimento, ou independentemente de aproximadamente 19nucleotídeos a aproximadamente 21 nucleotídeos decomprimento.

36. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato decompreender um RNA de interferência que tem um comprimento de-19 a 4 9 nucleotídeos, e compreende uma seqüência denucleotídeo que corresponde a qualquer uma dentre a SEQ IDNO: 2, SEQ ID NO: 13 - SEQ ID NO: 40, e SEQ ID NO: 44 - SEQ IDNO:47, ou um complemento das mesmas; e um veículofarmaceuticamente aceitável.

37. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato decompreender um RNA de interferência que tem um comprimento de19 a 49 nucleotídeos, e consiste essencialmente em umaseqüência de nucleotídeo que corresponde a qualquer umadentre a SEQ ID NO: 41 - SEQ ID NO: 47, ou um complemento dasmesmas; e um veículo farmaceuticamente aceitável.

38. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 36,caracterizada pelo fato de que o RNA de interferência é pelomenos um dentre um shRNA, um siRNA ou um miRNA.

39. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 37,caracterizada pelo fato de que o RNA de interferência é pelomenos um dentre um shRNA, um siRNA ou um miRNA.