BRPI0707899A2 - mÉtodos para a detecÇço de proteÍnas prion patogÊnicas associadas com doenÇas priânicas, utilizando polieletràlitos conjugados - Google Patents

Abstract

METODOS PARA A DETECÇAO DE PROTEíNAS PRION PATOGENICAS SSOCIADAS COM DOENÇAS PRIONICAS, UTILIZANDO POLIELETROLITOS CONJUGADOS. A presente invenção se refere a um método para detectar a presença de uma espécie prion patogênica em uma amostra, compreendendo as etapas de colocar a amostra em contato com pelo menos um polieletrólito conjugado (CPE), irradiá-lo com radiação eletromagnética, medir a radiação emitida ou absorvida pelo CPE em pelo menos um comprimento de onda, e comparar a radiação emitida ou absorvida medida com pelo um valor de referência correspondente à interação do CPE com uma espécie prion conhecida. Opcionalmente, a radiação emitida ou absorvida é medida em pelo menos dois comprimentos de onda, produzindo-se razões dos valores de radiação medida. O método facilita a diferenciação entre linhagens distintas de espécie prion patogênica. A invenção também se refere a dispositivos para a execução do método.

Description

MÉTODOS PARA A DETECÇÃO DE PROTEÍNAS PRION PATOGÊNICASASSOCIADAS COM DOENÇAS PRIÔNICAS, UTILIZANDOPOLIELETRÓLITOS CONJUGADOS

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a método para adetecção de proteínas prion patogênicas associadas comdoenças priônicas, utilizando polieletrólitos conjugados.

Antecedentes da invenção

O desenvolvimento de materiais capazes de detectarseletivamente proteínas prion patogênicas recebeu crescenteatenção, devido ao grande potencial destes materiais emserem utilizados como ferramentas analíticas paradiagnóstico pré-clínico de doenças priônicas. As doençaspriônicas são normalmente diagnosticadas por técnicasimunohistológicas utilizando anticorpos, ou por métodos queutilizam pequenas moléculas corantes, tais como vermelho doCongo e tioflavina T, caso a proteína prion apresente umaestrutura semelhante a amilóide.

Biopolímeros naturais, tais como proteínas,freqüentemente apresentam conformações ordenadas, tais comoalfa-hél ices e folhas beta, que contribuem para a estruturaordenada tridimensional e para a função específica dobiopolímero. As proteínas freqüentemente alteram suasconformações devido a estímulos diferentes externos e aimportância de alterações conformacionais de proteínas quelevam a estados patogênicos foi bem documentada.Especialmente sob condições que desestabilizam o estadonativo, as proteínas podem se agregar em conjuntosfibrilares característicos, conhecidos como fibrilasamilóides. Estes conjuntos de proteínas ricas em folhabeta apresentam conformações distintivamente diferentes àsdo estado nativo. 0 depósito in vivo de fibrilas amilóidesestá associado com muitas doenças de conformação protéica,incluindo a doença de Alzheimer, doença de Huntington,amiloidoses sistêmicas, e as doenças priônicas. As doençaspriônicas em animais [por exemplo, encefalopatiaespongiforme bovina (BSE), scrapie e doença emagrecedoracrônica (CWD)] e em humanos [doença de Creutzfeldt Jakob(CJD), doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS),kuru] estão associadas com a conversão conformacional daproteína prion celular normal, (PrPc), para uma isoformaassociada a uma doença patogênica infecciosa denotada comoPrPsc. A infectividade da proteína prion enoveladaerradamente é codificada inteiramente no interior daconformação enovelada erradamente. 0 mecanismo subjacentedo enovelamento errado da proteína e subseqüente formaçãode amilóide, é pouco compreendido. Muitas linhas deevidência suportam a existência de espécies oligoméricasmenores como intermediários na rota de proteína enoveladaerradamente para amilóide. Estes oligômeros variam emmorfologia, e apenas um sub-conjunto destes pode serresponsável pela toxidez celular associada com a doençaamilóide. Além disto, uma única proteína solúvel podeproduzir diferentes "cepas" de produtos enoveladoserradamente, como evidenciado pelo prion de levedura Sup35.

Foi demonstrado que a infectividade de diferentes cepas deprion de levedura depende da conformação da proteínainfecciosa, e que uma proteína única pode adotarconformações múltiplas com capacidade de auto-propagação(infecciosas). Estas diferenças conformacionais são a basede diferenças herdáveis nas cepas de prions.

Adicionalmente, as cepas de prions devem representar tambémum papel importante na determinação da especificidade datransmissão priônica.

Desta forma, existe uma necessidade por ferramentassimples, sensíveis e versáteis que detectem a conformaçãode proteínas amiloidogênicas tais como proteínas prionenoveladas erradamente e diferentes cepas de proteínasprion.

Polieletrólitos conjugados têm sido utilizados parase detectar interações bioespecíficas, tais como interaçõesreceptor/analito e mais [Nilsson, K.P.R.; Inganás, O.Nature Materials 2003, 2, 419-424.; Ho, Η-A. et al. Angew.Chem. Int. Ed. 2002, 41, 1548.; Ho, H-A.; Leclerc, M.J. Am.Chem. Soe. 2004, 126, 1384.; Dore, K.; Dubus, S.; Ho, H-A.;Levesque, I.; Brunette, M.; Corbeil, G.; Boissinot, M. ;Boivin, G.; Bergeron, M.G.; Boudreau, D.; Leclerc, M. J.Am. Chem. Soe. 2004, 126, 4240.; Nilsson, K.P.R.; Rydberg,J.; Baltzer, L.; Inganás, O. Proc. Natl. Acad. Sei. USA2003, 100, 10170-10174.; Nilsson, K.P.R.; Rydberg, J.;Baltzer, L.; Inganás, O. Proe. Natl. Acad. Sei. USA 2004,101, 11197-11202.; Nilsson, K.P.R.; Inganás, O.Maeromoleeules 2004, 37, 419-424.; Nilsson, K.P.R.;Herland, A.; Hammarstrõm, P.; Inganás, O. Bioehemistry2005, 44, 3718-3724.; Herland, A.; Nilsson, K.P.R.; Olsson,J.M.D.; Hammarstrõm, P.; Konradsson, P.; Inganás, O. J. Am.Chem. Soe. 2005, 127, 2317-2323.; documentos WO 03/096016;WO 2005/109005; WO 2004/106544; US 2 004/171001],

Entretanto, a utilização de polieletrólitos conjugados comosondas para a detecção de espécies priônicas patogênicas oudoenças priônicas nunca foi reportada.

Sumário da invenção

Há uma necessidade por métodos mais simples e maissensíveis para a detecção de proteínas prion patogênicasassociadas com doenças priônicas. Métodos baseados empolieletrólitos conjugados que possam interagir comproteínas prion e transduzir a alteração conformacional daproteína prion patogênica em sinais óticos, seriam por estarazão desejáveis. A presente invenção, desta forma,procura prover tais ferramentas e métodos baseados empolieletrólitos conjugados para a detecção de proteínasprion patogênicas e especialmente para a diferenciaçãoentre diferentes cepas de proteínas prion patogênicas.

Sondas sensíveis a nível conformacional, tais comopolieletrólitos conjugados podem prover uma solução paraeste problema e facilitar u maior entendimento do fenótipoconformacional codificado em diferentes cepas de prions.Sondas selet ivas a nível conformacional teriam um enormeimpacto no diagnóstico de doenças de conformação protéica.

Atualmente, as intervenções terapêuticas em um estágioinicial das doenças de enovelamento errado estão limitadaspela ausência de testes de diagnóstico sensíveis para aproteína prion enovelada erradamente patogênica.

Polieletrólitos conjugados, tais como poli(tiofeno) epoli(pirrol) podem ser utilizados para registrar alteraçõesconformacionais de proteínas em respostas observáveis.

Sensores baseados em polieletrólitos conjugados sãosensíveis a perturbações muito pequenas, devido àamplificação por uma resposta do sistema coletivo e, destaforma, oferecem uma vantagem chave em comparação comsensores baseados em moléculas pequenas do estado datécnica e os polieletrólitos oferecem também uma detecçãodireta da proteína prion patogênica. Esta detecção diretada proteína prion é uma vantagem em comparação com astécnicas imunohistológicas na medida em que estes métodosfreqüentemente requerem a utilização de um segundoanticorpo para a visualização da proteína prion patogênica.A possibilidade de se utilizar polieletrólitos conjugadoscomo elementos de detecção para moléculas biológicas requerque os polímeros sejam compatíveis com um meio aquoso eisto deve ser alcançado obtendo-se polieletrólitosluminescentes conjugados.

Esta invenção inclui novos métodos para sediscriminar entre cepas de prions e ensaios de priondestas. De acordo com a hipótese de proteína apenas oprion é composto da proteína enovelada erradamente agregadachamada de PrPsc ou PrPres, Gajdusek fez a seguinte distinçãode amilóides regulares e prions patogênicos "Amiloidosestransmissíveis e não transmissíveis: conversão pós-traduçãoauto-catalítica de proteínas precursoras do hospedeiro paraconfigurações dobradas em folha beta." [J. Neuroimmunol.dezembro de 1988; 20(2-3):95-110]. 0 termo "cepas deprions" denota isolados de prion individuais produzindocaracterísticas de doença estáveis e distintas. Por estarazão, a discriminação das cepas é crucial para odiagnóstico de prion. Por exemplo, a encefalopatiaespongiforme bovina (BSE), um patógeno humano, deve tercruzado em ovelhas onde pode ser confundida como scrapienão zoonótica, mas ainda manter a infectividade. Várioscasos atípicos de BSE foram reportados e estes podem serassociados com a forma variante da doença de Creutzfeldts-Jakob humana (vCJD). A vCJD é também muito provavelmentetransmissível por produtos do sangue, por exemplo, emtransfusão de sangue. Ensaios de detecção de prion são degrande interesse comercial bem como ensaios sensíveis paraa detecção de prion no sangue (varredura de produtos dosangue).

Esta invenção descreve pela primeira vez um métodopara se distinguir e detectar diferentes cepas de prionsutilizando um polieletrólito conjugado. Desta forma, estainvenção descreve uma nova forma de distinguir cepas deprions utilizando sondas CPE (CPPs). É provido um métodopara se utilizar CPPs para marcar e caracterizar depósitosde prions em amostras de tecido. Os métodos utilizandoCPPs são mais sensíveis que outros corantesamiloidotróf icos tais como vermelho do Congo e ThT. Ummétodo utilizando CPPs para se obter mais informação quantoa morfologia e estrutura dos depósitos de prions é tambémprovido. CPPs são utilizadas para se distinguir entrecepas de prions pela capacidade de marcação ou sinal deespectro do CPP uma vez que as CPPs oferecem uma maneira dese obter assinaturas espectroscópicas específicas paradepósitos de cepas de prions individuais.

O objetivo da presente invenção é, desta forma,prover métodos que atendam estas e outras necessidades.Este objetivo é, em um primeiro aspecto, alcançado com umpolieletrólito conjugado, utilizável como sonda para adetecção de proteínas prion patogênicas associadas comdoenças priônicas.Em um aspecto adicional, a invenção provê métodospara a detecção de doenças priônicas, compreendendo aexposição de um polieletrólito conjugado tal como definidoacima, a uma amostra, detectando-se uma alteração de umapropriedade do dito polieletrólito em resposta à presençade proteínas prion patogênicas na amostra.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a ummétodo para a detecção da presença de uma espécie de prionpatogênico em uma amostra compreendendo as etapas de:

~ colocar a amostra em contato com pelo menos umpolieletrólito conjugado (CPE),

- irradiar o CPE com radiação eletromagnética,

- mensurar a radiação emitida ou absorvida pelo CPEem pelo menos um comprimento de onda, e

- comparar a radiação emitida ou absorvidamensurada com pelo menos um valor de referênciacorrespondendo à interação do CPE com uma espéciede prion conhecida.

Em uma realização da invenção, a espécie de prionpatogênica é específica para uma encefalopatia espongiformetransmissível, tal como BSE, CJD, CWD, scrapie, GSS e kuru.

Preferivelmente, o polieletrólito conjugadocompreende copolímeros ou homopolímeros de tiofeno, pirrol,anilina, furano, fenileno, vinileno, fluoreno ou suasformas substituídas, e preferivelmente o polieletrólitoconjugado apresenta uma ou mais funcionalidades iônicas decadeia lateral.

Em uma realização adicional da invenção, sãoadicionados agentes à solução para aumentar a diferenciaçãoda interação do CPE com o prion enovelado erradamente dainteração do CPE com prion normal. Tais agentes incluem,mas não se limitam a, detergentes, íons, sais, quelantes esolventes.

A irradiação utilizada no método da presente invençãoapresenta comprimentos de onda na faixa de cerca de 100 nraa cerca de 2000 nm. Em uma realização, é utilizada aradiação na faixa visível. É também possível se utilizarexcitação de fóton múltiplo, de tal forma que em vez deradiação por excitação de χ nm, uma radiação de 2x ou 3x(excitação de dois fótons e três fótons, respectivamente) éutilizada.

Em uma realização adicional da invenção, o método deacordo com o aspecto acima compreende adicionalmente amensuração da radiação emitida ou absorvida pelo CPE emdois ou mais comprimentos de onda, e

- cálculo de uma razão entre a radiação emitida ouabsorvida em pelo menos dois comprimentos deonda,

- comparação da dita razão com razões previamenteou simultaneamente determinadas para espécies deprion patogênicas.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a umdispositivo para a realização dos métodos de acordo com ainvenção. Tal dispositivo é equipado com meios parairradiar o CPE em contato com a amostra, meios para medir aradiação emitida ou absorvida pelo CPE e meios dearmazenamento em computador contendo armazenados valores dereferência para comparação com a radiação mensurada. Taldispositivo é esquematicamente mostrado na Figura 8a.Em uma realização adicional deste aspecto, odispositivo adicionalmente ou alternativamente incorporameios para calcular uma razão entre a radiação emitida ouabsorvida em pelo menos dois dos ditos comprimentos de ondamensurados e os meios de armazenamento em computadorcontendo valores armazenados de razões previamentedeterminadas para espécies de prions patogênicasespecíficas. Tal dispositivo é esquematicamente mostradona Figura 8b.

Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a ummétodo para se distinguir entre espécies de prionspatogênicas, compreendendo:

colocar as ditas espécies de prions patogênicasem contato com um CPE,

- detectar uma propriedade ótica do CPE,onde uma diferença na dita propriedade ótica indica umadiferença entre as ditas espécies de prions.

Em uma realização do segundo aspecto, a propriedadeótica detectada é a intensidade de luz emitida a dois oumais comprimentos de onda. Opcionalmente, é formada umarazão da intensidade da luz emitida a dois comprimentos deonda.

Em iima realização adicional deste aspecto, o CPEcompreende copolímeros ou homopolímeros de tiofeno, pirrol,anilina, furano, fenileno, vinileno, fluoreno ou suasformas substituídas. Os ditos CPEs podem conter uma oumais funcionalidades iônicas de cadeia lateral, tais comoaminoácidos, derivados de aminoácidos, neurotransmissores,monossacarídeos, ácidos nucléicos ou combinações ederivados quimicamente modificados destes. Asfuncionalidades iônicas podem compreender uma ou maisfuncionalidades aniônicas ou catiônicas de cadeia lateral.

A multiplicidade de doenças que se possa desejaridentificar implica também no fato da invenção, em ainda umaspecto adicional, poder ser implementada na forma de ummicro-arranjo, que requer a ancoragem e padronização dosistema de detecção em uma superfície, definido nasreivindicações anexas.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1: mostra a estrutura química de poli (3—[ (S)-5-amino-5-carboxil-3-oxapentil]-2,5-tiofenilenohidrocloreto) (POWT), um derivado zwiteriônico depolitiofeno, politiofeno ácido acético (PTAA), um derivadoaniônico de politiofeno, poli (3-[(S)-5-amino-5-metoxicarboxil-3-oxapentil]-2,5-tiofenileno hidrocloreto)(POMT), um derivado catiônico de politiofeno, poli((3,3M-di[(S)-5-amino-5-carbonil-3-oxapentil]-[2,2';5' , 2" ] ) -5, 5"-tertiofenileno hidrocloreto) (PONT), um derivadozwiteriônico de politiofeno com um comprimento de cadeiabem definido, e poli((1,4-di (3-[(S)-5-amino-5-carbonil-3-oxapentil]-tiofen-2-il)-benzeno) hidrocloreto) (f-PONT), umcopolímero zwiteriônico de tiofeno e fenileno com umcomprimento de cadeia bem definido.

A Figura 2: mostra desenhos esquemáticos demonstrandoum exemplo de como se utilizar os polieletrólitosconjugados para a detecção de proteína prion enoveladaerradamente em solução.

A Figura 3: mostra desenhos da utilização depolieletrólitos conjugados para a detecção de proteínaprion enovelada erradamente em uma superfície.A Figura 4: mostra desenhos esquemáticos dautili zaçao do polieletrólito conjugado para a marcaçãohistológica de proteína prion enovelada erradamente emamostras de tecido. Neste Exemplo a presença de PrPsc naamostra foi determinada utilizando-se um microscópio defluorescência. De acordo com a presente invenção, qualquerPrPsc presente será observado com uma cor, intensidade ouambas diferentes em comparação com o restante da amostra.

As imagens não estão desenhadas em escala. As imagensfluorescentes são de amostras reais, mas modificadas paraimpressão em escala de cinza.

A Figura 5: mostra a solução de detecção de PrP ePrP-amilóide utilizando-se o polieletrólito conjugado PTAA.PTAA puro em tampão (0), PrP 100% natural e PTAA em tampão(·), PrP 50% natural PrP/50% PrP-amilóide e PTAA em tampão(▲) e PrP-amilóide 100% e PTAA em tampão (■).

A Figura 6: mostra os dados de espectro de PTAAligado a placas de mCWD (■) , em. max. : 565 nm, e mPSS (♦) ,em. max.: 585 nm, depósitos. A emissão máxima (Emax) estádestacada por traços pretos (-), enquanto que as emissões a532 nm e a 639 nm estão destacadas por um asterisco (*) eum sinal de mais (+), respectivamente.

A Figura 7: mostra uma plotagem cartesiana das razões(R532/639 e R532/Emax). A intensidade da luz emitida peloPTAA sendo ligado às placas de PrP em três camundongosafetados por mPSS individuais (símbolos abertos) e quatrocamundongos afetados por mCWD individuais (símbolospretos).

A Figura 8: mostra um desenho esquemático dedispositivos para a realização do método de acordo com ainvenção. A Figura 8a mostra um dispositivo apresentandomeios (B) para a irradiação do CPE em contato com aamostra, meios (C) para a mensuração da radiação emitida ouabsorvida pelo CPE e meios (D) para armazenamento emcomputador contendo valores de referência armazenados paracomparação com a radiação mensurada. Os diferentes meiossão preferivelmente conectados a uma unidade deprocessamento central (A) . A Figura 8b mostra umarealização alternativa em que os meios (C') que medem aradiação emitida ou absorvida pelo CPE são adaptados paramensurar a radiação emitida ou absorvida pelo CPE a pelomenos dois comprimentos de onda e em que o dispositivocontém meios adicionais (E) para calcular a razão entre osvalores das radiações mensuradas. Nesta realização, osmeios de armazenamento em computador (D') contêmarmazenados valores de referência de razões previamentedeterminadas para espécies patogênicas especificas.

Descrição detalhada da invenção

Em termos gerais, a presente invenção refere-se anovos métodos para a detecção de proteínas prionpatogênicas associadas com doenças priônicas, utilizandopolieletrólitos conjugados. 0 polieletrólito conjugado éexposto a uma amostra pelo que o polieletrólito e aproteína prion patogênica de interesse interagem, e éobservada uma alteração de uma propriedade do ditopolieletrólito em resposta à ligação da proteína prion. aalteração detectada é utilizada para detectar a presença deproteínas prion patogênicas na amostra, confirmando asdoenças priônicas infecciosas.A invenção se baseia na interação de umpolieletrólito conjugado com a dita proteína prion. Ainteração ocorre sem ligação covalente e se baseia emligação de hidrogênio, interações eletrostáticas e nãopolares entre o polieletrólito conjugado e a proteínaprion, aqui chamadas de ligação não covalente, que incluiadicionalmente qualquer tipo de ligação que não sejacovalente em sua natureza.

Alguns aspectos da presente invenção podem proverfixações covalentes dos polieletrólitos conjugados a algumaentidade tal como proteínas, proteínas enoveladaserradamente, peptídeos, biomoléculas e outras moléculas.

A presente invenção utiliza interações ente umpolieletrólito conjugado e uma proteína prion, que induztransições conformacionais da estrutura do polieletrólitoconjugado, separação ou agregação das cadeias dopolieletrólito conjugado. Além disto, as transiçõesconformacionais da estrutura do polieletrólito conjugado,separação ou agregação de cadeias do polieletrólitoconjugado, alteram os processos óticos dos polieletrólitosconjugados. Estas alterações podem ser detectadas emsolução (ver Figura 2), em uma superfície (ver Figura 3) ouem uma amostra de tecido (ver Figura 4).

O polieletrólito conjugado é adequadamenteimplementado como uma parte ativa de um dispositivobiossensor, por exemplo, pela imobilização dopolieletrólito conjugado ou da proteína prion em umsubstrato em uma célula biossensora (ver Figura 3).Adequadamente, o dispositivo biossensor compreende umreceptáculo adequado para o dito substrato, e é formada umainteração entre o polieletrólito conjugado e a proteínaprion sobre o substrato. 0 polieletrólito conjugado podeser uma parte de um sistema que utiliza um anticorpo decaptura para a proteína prion e o polieletrólito conjugadocomo uma sonda ótica para detectar a proteína prion (verFigura 3). Entretanto, outras configurações são possíveis,por exemplo, o polieletrólito conjugado pode ser provido emsolução para marcação de uma amostra de tecido (verExemplos 1-4 e Figura 4).

Em particular a presente invenção possibilita adetecção da presença de proteínas prion patogênicas,associadas com doenças priônicas, devido a alterações naspropriedades, tais como propriedades óticas e eletrônicas,de um polieletrólito conjugado que interage com a proteínaprion. Estas alterações, e desta forma a presença daproteína prion patogênica nas amostras, pode ser monitoradapor várias técnicas analíticas.

Como um exemplo de polieletrólitos que exibem ascaracterísticas discutidas acima podem ser mencionados poli(3- [(S) -5-amino-5-carboxi 1 -3-oxapenti 1 ] -2 , 5-tiofenilenohidrocloreto) (POWT), politiofeno ácido acético (PTAA),poli (3-[(S)-5-amino-5-metoxicarboxil-3-oxapentil]-2,5-tiofenileno hidrocloreto) (POMT), poli((3,3"-di[(S)-5-amino-5-carboni1-3-oxapenti1]- [2,2' ; 5 ' , 2 " ] ) -5,5" -tertiofenileno hidrocloreto) (PONT) e poli ((1,4-di(3-[(S) -5- amino-5-carboni1-3 -oxapenti1]-tiofen-2-il)-benzenohidrocloreto) (f-PONT) (ver Figura 1). Estudos destespolímeros [ver Andersson, M.; Ekeblad, P.O.; Hjertberg, T.;Wennerstrõm, 0.; Inganãs, O. Polymer Commun. 1991, 32,546-548.; Berggren, M. ; Bergman, P.; Fagerstrõm, J.; Inganás,O.; Andersson, M.; Weman, H.; Granstrõm, M.; Stafstrõm, S.;Wennerstrõm, 0. ; Hjertberg, T. Chem. Phys. Lett. 1999,304,84-90.; Ding, L.; Jonforsen, M.; Roman, L.S.;Andersson, M.R.; Inganãs, 0. 2000, Synth. Met., 110, 133-140.; Nilsson, K.P.R.; Andersson, M.R.; Inganás, 0. Journalof Physics: Condensed Matter 2002, 14, 10011-10020.;Nilsson, K.P.R.; Inganás, 0. Nature Materials 2003, 2, 419-424.; Nilsson, K.P.R.; Rydberg, J.; Baltzer, L.; Inganãs,O. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2003, 100, 10170-10174.;Nilsson, K.P.R.; Rydberg, J.; Baltzer, L.; Inganás, O.Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2004, 101, 11197-11202.;Nilsson, K.P.R.; Inganás, O. Macromolecules 2004, 37, 419-424.; Nilsson, K.P.R.; Herland, A.; Hammarstrõm, P.;Inganás, O. Bioehemistry 2005, 44, 3718-3724.; Herland, A.;Nilsson, K.P.R.; Olsson, J.M.D.; Hammarstrõm, P.;Konrads son, P.; Inganás, O. J. Am. Chem. Soe. 2005, 127,2317-2323.], mostraram processos óticos e eletrônicosinteressantes devido a diferentes interações eletrostáticase padrões de ligação hidrogênio dentro de uma única cadeiado polieletrólito e entre cadeias adjacentes dopolieletrólito. As interações, devidas às cadeias lateraisiônicas, forçam as estruturas do polieletrólito a adotaremconformações, separação ou agregação das cadeias dopolieletrólito alternativas. Especialmente a separação eagregação das cadeias do polieletrólito induzem novosprocessos óticos. Os processos óticos estão relacionados aprocessos eletrônicos dentro de uma cadeia dopolieletrólito e processos eletrônicos entre cadeiasadjacentes do polieletrólito. Estes processos causam novaspropriedades de absorção e emissão óticas.Os grupos funcionais da cadeia lateral iônica,carregados de forma aniônica ou catiônica a diferentes pH,tornam estes derivados de politiofeno adequados para aformação de complexos polieletrólitos com oligômeros epolímeros carregados negativamente ou positivamente.Adicionalmente, os grupos iônicos criam padrões de ligaçãohidrogênio versáteis com diferentes moléculas.

É ainda possível se adicionar um ou mais agentescapazes de aumentar a diferenciação de CPE interagindo comprion enovelado erradamente de CPE interagindo com prionnormal.

Tais agentes incluem detergentes, tais como Triton-X,saponina, SDS, Sarkosyl, n-laurosilsarcosina, sarcosinas deácido graxo, CHAPS, Brij, octil-b-glicosídeo, Tween 20,Nonidet p-40 ou outras variantes, íons e sais, tais comoíons metálicos, íons moleculares e íons orgânicos,quelantes, tais como EDTA, EGTA, 2,2'-bipiridil,dimercaptopropanol, ionóforos, ácido nitrilotriacético,orto-fenantrolina, ácido salicílico e trietanolamina,solventes, tais como água, álcoois, solventes orgânicos,solventes clorados, solventes aminados e solventessulfonados, e outros agentes, tais como materiaispoliméricos, polieletrólitos (zwiteriônicos, aniônicos oucatiônicos), carboidratos (incluindo polissacarídeos),ácidos orgânicos com mais de um grupo de coordenação,lipídeos esteróides, aminoácidos e compostos relacionados,peptídeos, fosfatos, nucleotídeos, tetrapirróis,ferroxaminas, ionóforos, tais como gramicidina, monensina evalinomicina fenólica. Outros agentes incluem proteínas,tais como tripsina, proteinase K, anticorpos, albumina dosoro e outras.

A descrição detalhada da invenção que se segue faráreferência separadamente aos polieletrólitos conjugados,proteína prion, doenças priônicas, métodos de detecção,imobilização de polieletrólitos conjugados e proteínas, earranjos. A invenção é exemplificada finalmente por umnúmero de experimentos demonstrando sua utilidade.

I. Polieletrólitos conjugados

A presente invenção refere-se a uma variedade depolieletrólitos conjugados, com um mínimo de 5 meros,consistindo de meros derivados de monômeros de tiofeno,pirrol, anilina, furano, fenileno, vinileno, fluoreno ousuas formas substituídas, formando homopolímeros ecopolímeros destes. 0 polieletrólito conjugado pode sermono disperso, consistindo em cadeias polieletrolíticas comum comprimento de cadeia bem definido, ou poli disperso,compreendendo cadeias polieletrolíticas com diferentescomprimentos de cadeia. Além disto, estão incluídos noescopo da invenção, monômeros com funcionalidades de cadeialateral aniônica, catiônica ou zwiteriônica. Asfuncionalidades de cadeia lateral são derivadas de, mas nãose limitam a, aminoácidos, derivados de aminoácidos,neurotransmissores, monossacarídeos, ácidos nucléicos, oucombinações destes e derivados quimicamente modificadosdestes. Os polieletrólitos conjugados da presente invençãopodem conter uma única funcionalidade de cadeia lateral oupodem compreender duas ou mais funcionalidades de cadeialateral. Os grupos funcionais dos polieletrólitosconjugados, com carca aniônica ou cationia a pH diferente,tornam estes derivados polieletrólitos adequados para aformação de complexos de polieletrólitos fortes comoligômeros e polímeros carregados negativamente oupositivamente. Adicionalmente, os grupos iônicos criampadrões de ligação de hidrogênio versáteis com diferentesmoléculas.

Alguns aspectos da presente invenção podem proverfixações covalentes dos polieletrólitos conjugados a algumaentidade, tal como proteínas, proteínas enoveladaserradamente, peptídeos, biomoléculas ou outras moléculas.

II. Proteína prion

Os polieletrólitos conjugados da presente invençãointeragem com uma proteína prion de interesse. Estasinterações se formam sem ligação covalente e se baseiam emligação de hidrogênio, interações eletrostáticas e nãopolares entre os polieletrólitos conjugados e a proteína.O polieletrólito conjugado pode interagir tanto com aproteína prion celular normal (PrPc) quanto com a isoformapatogênica infecciosa associada a uma doença denotada porPrPsc. Os polieletrólitos conjugados podem interagir tambémcom PrP-amilóide, uma proteína prion enovelada erradamentesemelhante a PrPsc preparada in vitro. Sem se quererprender a uma teoria, é a presente hipótese de que pelainteração com diferentes isoformas da proteína prion, opolieletrólito conjugado irá adotar diferentes conformaçõesobservadas como diferentes propriedades óticas dopolieletrólito conjugado. Desta forma, as duas isoformasdiferentes podem ser facilmente distinguidas devido adiferentes propriedades de emissão do CPE. Além disto, aspropriedades óticas do polieletrólito conjugado podem sertambém utilizadas para se distinguir entre diferentesconformações de proteínas prion patogênicas, denotadas comodiferentes cepas. Este fenômeno de cepa pode influenciar ainfectividade da proteína prion diferente e depende daconformação da proteína infecciosa. Adicionalmente, ascepas de prions podem representar também um papelimportante na determinação da especificidade da transmissãopriônica.

A proteína prion pode ser modificada quimicamentepara interagir com o polieletrólito conjugado de interesse.Métodos de derivatização de uma ampla variedade deproteínas são bem conhecidos. Por exemplo, cadeiaslaterais de aminoácidos podem ser facilmente modificadaspara conter grupos polares e não polares ou grupos comcapacidade de ligação de hidrogênio. A proteína pode estarem solução ou em amostras de tecidos (ver exemplos) . Adetecção das proteínas prion pode ser realizada semsoluções aquosas, solventes orgânicos, fluidos corporais ouem amostras de tecido (marcação histológica, ver exemplos).

III. Doenças priônicas

As doenças priônicas [por exemplo, encefalopatiaespongiforme bovina (BSE), e a doença de Creutzfeldt-Jakob(CJD)], estão associadas com a conversão conformacional daproteína prion celular normal (PrPc) para uma isoformainfecciosa associada a uma doença denotada por PrPsc. Aforma infecciosa enovelada erradamente da proteína (PrPsc) éa causa de um grupo de doenças cerebrais raras e fataischamadas de doenças priônicas que afetam humanos emamíferos. As doenças priônicas são também conhecidas comoencefalopatias espongiformes transmissíveis (TSE) e incluema encefalopatia espongiforme bovina (BSE, ou doença da"vaca louca") em gado, scrapie em ovelhas; doençaemagrecedora crônica em veados e alces; e em humanos[doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), doença de Gerstmann-Strãussler-Scheinker (GSS), kuru]. Os polieletrólitosconjugados da presente invenção destinam-se a seremutilizados nos métodos para a detecção de prionspatogênicos associados a estas doenças.

IV. Métodos de detecção

Conforme já indicado, a presente invenção baseia-sena utilização de alterações dos processos óticos depolieletrólitos conjugados, devidas à interação comdiferentes isoformas da proteína prion, denotadas como PrPce PrPsc, respectivamente. Estas alterações podem serobservadas por fluorescência, transferência de energia deressonância de Fõrster (FRET), extinção de luz emitida,adsorção, ou outras propriedades físicas. Sem se quererficar preso por teoria, é a presente hipótese de quetransições conformacionais da estrutura do polieletrólitoconjugado, separação ou agregação das cadeias dopolieletrólito e/ou alterações no ambeinte local próximo aopolieletrólito conjugado irão alterar os processos óticosdo polieletrólito conjugado e podem, por exemplo, seremdetectadas como alteração na razão das intensidades da luzemitida a dois ou mais comprimentos de onda. Asintensidades de emissão podem ser registradas por umfluorômetro e a amplificação do fluxo de fótons no detectorpode aumentar a sensibilidade. Isto pode ser alcançadoutilizando-se um laser como fonte de excitação. Aalteração fluorométrica pode ser também detectada pelautilização de um microscópio fluorescente ou um microscópioconfocal. Uma combinação de filtro de excitação ou deemissão pode ser utilizada e a fotografia pode serregistrada por uma câmara CCD (ver exemplo 5), câmara devídeo, câmara comum ou por uma câmara Polaroid. Asfotografias podem ser então analisadas por um programa deprocessamento de imagens em um computador, porespectroscopia de correlação de imagem (ICS) ou por outrosmeios.

v. Imobilização dos polieletrólitos conjugados eproteínas

Os polieletrólitos conjugados ou as proteínas prionpodem ser imobilizados em uma variedade de suportessólidos, incluindo, mas não se limitando a, wafers desilício, vidro (por exemplo, lamínulas de vidro, pérolas devidro, vidro), borracha de silicone, poliestireno,polietileno, polipropileno, teflon, pérolas de sílica gel,ouro, óxido de índio estanho, papel de filtro (por exemplo,de nylon, celulose e nitrocelulose) , papel de cópia padrãoou variantes e meios de separação ou outros meioscromatográficos. A transferência do polieletrólitoconjugado para o suporte sólido pode ser realizadautilizando-se, mas não se limitando a, revestimento porimersão, revestimento por rotação, impressão por contato,"screenprinting", tecnologias de jato de tinta, aspersão,administração e "microfluidic printing" pela utilização delitografia branda ou pelo sistema BIACORE™ (Biacore,Uppsala, Suécia). A imobilização dos polieletrólitosconjugados é obtida por adesão física ou fixação covalenteao suporte sólido, e pode ser realizada a temperaturaselevadas ou por aprisionamento em uma matriz de hidrogel.A imobilização dos polieletrólitos conjugados da presenteinvenção pode ser desejável para se aumentar sua facilidadede utilização, montagem em dispositivos (por exemplo,arranjos), estabilidade, robustez, resposta fluorescente,para ajuste no processo de triagem de alto desempenho (HTS- "high-throughput-screening") utilizando placas de microtítulo e outros fornmatos desejados.

Os solventes para os polieletrólitos conjugados dapresente invenção e para as proteínas prion durante aimobilização ao suporte sólido podem ser, mas não selimitam a, água, soluções aquosas tamponadas, metanol,etanol e combinações destes. Polímeros de suporte deoutros tipos podem ser também adicionados nesta etapa. Asproteínas prion podem ser também imobilizadas em um suportesólido ou em poços micro título com um anticorpo de capturaou podem ser imobilizadas juntamente com o polieletrólitoconjugado (isto é, misturadas com a solução depolieletrólito) (ver figura 3). Quando as proteínas prionsão imobilizadas no suporte sólido juntamente com opolieletrólito conjugado da presente invenção, formam umcomplexo com o polieletrólito por meio de interações nãocovalentes. Este complexo é formado sem química covalentee baseia-se em ligação de hidrogênio, interaçõeseletrostáticas e não polares entre o polieletrólitoconjugado e a proteína.

VII. Arranjos

De acordo com a presente invenção a geração degrandes arranjos dos mesmos ou diferentes polieletrólitosconjugados em cada ponto ou linha pode superar falhas de umúnico sensor ou uma abordagem baseada em solução. Aabordagem de arranjo ou linha paralela abre a possibilidadede uma análise paralela de uma ou diferentes amostras deproteína prion para um ou diferentes polieletrólitosconjugados de maneira fácil. 0 principal propósito de seutilizar arranjos é o de ser aumentar a facilidade deutilização, portabilidade, quantificação, seletividadeentre outras qualidades e características. Com estaabordagem pode-se explorar a capacidade em se mensuraramostras muiti-componentes e se utilizar pontos sensoresseletivos. Isto oferece a oportunidade de se analisar duasou mais amostras de interesse ao mesmo tempo e se realizardeterminações "on-chip". Pela imobilização dopolieletrólito conjugado e/ou proteína prion em suportessólidos de qualquer tamanho e em quaisquer padrõesescolhidos (tais como arranjos, linhas, pontos, coluna)podem ser construídos dispositivos de interpretaçãopequenos, portáveis, de fácil leitura. A utilização dearranjos múltiplos requer que a detecção possa serrealizada para um grande número de amostras, mais ou menossimultaneamente. Isto é freqüentemente feito na forma deum micro-arranjo, onde vários elementos detectoresindividuais (ou sondas) são integrados em uma pequena áreasuperficial, para permitir um paralelismo maciço nadetecção. Foi demonstrado que o polieletrólito conjugado eo complexo polieletrólito conjugado/proteína podem serimpressos por impressão de micro-contato utilizando-secarimbos elastoméricos. A transferência para umasuperfície do micro-arranjo pode ser também realizada porgotejamento de soluções do polieletrólito conjugado, ou porjateamento de soluções do polieletrólito ou por outrosmétodos mencionados acima. Estas etapas são essenciaispara a preparação de um micro-arranjo multipixel.

Parte Experimental

Exemplo 1: Marcação histológica de tecido nervoso deovelha infectado por scrapie

Cortes (5 u.m) de tecidos contendo amilóide embebidoem parafina fixados em formaldeido foram dispostos sobrelâminas plus e desparafinizados com xileno (60 min), álcoolabsoluto (15 min), álcool 95% (15 min) e álcool 70% (10min) e, finalmente, enxaguados com água destilada por umpar de minutos. Os cortes foram equilibrados em soluçãotampão de incubação, 100 mM carbonato de Na pH 10, por 10minutos. PTAA foram misturados com o mesmo tampãoutilizado para o equilíbrio (5 μg de sonda em 100 μl) eadicionados aos cortes. A incubação ocorreu em uma câmarade umidade por 1 hora e a solução de sonda em excesso foidescartada com o tampão de incubação. Quando o PTAA se ligaou interage com a proteína prion dobrada de forma incorreta(PrPsc) , a proteína prion patogênica dobrada de formaincorreta é associada com o distúrbio scrapie observadonormalmente em ovelhas, ela pode ser detectada por radiaçãoou absorção eletromagnética, preferencialmente entre asfaixas do UV e do IV, ideal na região do visível. Naregião do visível é vista normalmente como uma mudança decoloração e de intensidade da luz emitida a partir do PTAAligado a ou que interage com PrPsc comparado ao PTAA livreou ligado a proteínas nativas. A fluorescência provenientedas amostras de tecidos pode ser registrada com ummicroscópio de epifluorescência (microscópio invertidoZeiss Axiovert, Α200 Mot) equipado com uma câmera CCD(Axiocam HR), utilizando um filtro passa-faixa 405/30 nm(LP450), um filtro passa-faixa 470/40 nm (LP515) e umfiltro passa-faixa 546/12 nm (LP590), as placas podem seridentificadas pela cor da emissão comparada ao tecido aoredor e ao tecido de referência.

Exemplo 2: Marcação histológica com PTAA de tecidonervoso não-infectado

Cortes (5 μm) de tecidos contendo amilóide embebidoem parafina fixados em formaldeido foram dispostos sobrelâminas plus e desparafinizados com xileno (60 min), álcoolabsoluto (15 min), álcool 95% (15 min) e álcool 70% (10min) e, finalmente, enxaguados com água destilada por umpar de minutos. Os cortes foram equilibrados em soluçãotampão de incubação, 100 mM carbonato de Na pH 10, por 10minutos. PTAA foram misturados com o mesmo tampãoutilizado para o equilíbrio (5 μg de sonda em 100 μl) eadicionados aos cortes. A incubação ocorreu em uma câmarade umidade por 1 hora e a solução de sonda em excesso foidescartada com o tampão de incubação. A fluorescênciaproveniente das amostras de tecidos pode ser registrada comum microscópio de epifluorescência (microscópio invertidoZeiss Axiovert, A200 Mot) equipado com uma câmera CCD(Axiocam HR) , utilizando um filtro passa-faixa 405/30 nm(LP450), um filtro passa-faixa 470/40 nm (LP515) e umfiltro passa-faixa 546/12 nm (LP590). O resultado damarcação destas amostras negativas é a ausência da emissãotípica oriunda do PTAA ligado ao PrPsc no tecido infectadopor scrapie.Exemplo 3: Marcação histológica com PTAA de tecido derato infectado pela Doença Emagrecedora Crônica (CWD)

Cortes congelados provenientes de cérebro de ratoinfectado por CWD foram mantidos em etanol resfriado comgelo por 10 minutos e lavados com solução tampão, 100 mMcarbonato de Na pH 10. Os cortes foram equilibrados emsolução tampão de incubação, 100 mM carbonato de Na pH 10,por 10 minutos. PTAA foram misturados com o mesmo tampãoutilizado para o equilíbrio (5 μg de sonda em 100 μΐ) eadicionados aos cortes. A incubação ocorreu em uma câmarade umidade por 1 hora e a solução de sonda em excesso foidescartada com o tampão de incubação. Quando o TPAA seliga ou interage com a proteína prion dobrada de formaincorreta (PrPsc), a proteína prion patogênica dobrada deforma incorreta é associada com a doença emagrecedoracrônica observada normalmente em cervos, ela pode serdetectada por radiação ou absorção eletromagnética,preferencialmente entre as faixas do UV e do IR, ótima naregião do visível. Na região do visível é vista normalmentecomo uma mudança da coloração e da intensidade da luzemitida a partir do PTAA ligado a ou que interage com PrPsccomparado ao PTAA livre ou ligado a proteínas nativas. Afluorescência proveniente das amostras de tecidos pode serregistrada com um microscópio de epifluorescência(microscópio invertido Zeiss Axiovert, A200 Mot) equipadocom uma câmera CCD (Axiocam HR), utilizando um filtropassa-faixa 405/30 nm (LP450), um filtro passa-faixa 470/40nm (LP515) e um filtro passa-faixa 546/12 nm (LP590), asplacas podem ser identificadas pela cor da emissãocomparada ao tecido ao redor e ao tecido de referência.Exemplo 4: Marcação histológica com PTAA de tecido derato não-infectado

Cortes congelados provenientes de cérebro de ratoforam mantidos em etanol resfriado com gelo por 10 minutose lavados com solução tampão, 100 mM carbonato de Na pH 10.Os cortes foram equilibrados em solução tampão deincubação, 100 mM carbonato de Na pH 10, por 10 minutos.PTAA foram misturados com o mesmo tampão utilizado para oequilíbrio (5 μg de sonda em 100 μΐ) e adicionados aoscortes. A incubação ocorreu em uma câmara de umidade por 1hora e a solução de sonda em excesso foi descartada com otampão de incubação. A fluorescência proveniente dasamostras de tecidos pode ser registrada com um microscópiode epifluorescência (microscópio invertido Zeiss Axiovert,A200 Mot) equipado com uma câmera CCD (Axiocam HR) ,utilizando um filtro passa-faixa 405/30 nm (LP450), umfiltro passa-faixa 470/40 nm (LP515) e um filtro passa-faixa 546/12 nm (LP590). 0 resultado da marcação destasamostras negativas é a ausência da emissão típica oriundado PTAA ligado ao PrPsc no tecido infectado por CWD.

Exemplo 5: Solução de detecção de PrP-amilóideutilizando polieletrólitos conjugados

No exemplo abaixo é demonstrada a detecção direta dePrP-amilóide em solução. Este exemplo compreende um métodopara detectar e quantificar o componente do PrP dobrado deforma incorreta utilizando CPEs (polieletrólitosconjugados). Em outra realização, ele compreende também ummétodo para capturar PrP dobrado de forma incorretaproveniente da solução utilizando CPEs. As condiçõesexperimentais para detectar PrP-amilóide e PrP em soluçãoincluem a diluição de PrP, PrP-amilóide e misturas de PrP ePrP-amilóide em um tampão (fosfato, Tris, acetato, HEPES,MES, carbonato, MBS, etc.), neste caso, 20 mM de fosfato apH 8. O CPE pode ser adicionado ou antes ou após adiluição e mistura. Em qualquer estágio um ou maisaditivos, tais como vários álcoois, detergentes, polímerosde sustentação, outros polieletrólitos, quelantes, íonsmetálicos, sais ou zeólitas, podem ser adicionados paraaumentar ou modificar as condições para detecção, medida,mistura, performance da análise, etc. Concentrações dasanálises para que o CPE e a proteína ou a proteína dobradade forma incorreta possam ser medidos podem estar na faixade valores superiores a alto μΜ a valores inferiores abaixo fM. Neste exemplo PTAA e PrP, PrP-amilóide ou umamistura de PrP e PrP-amilóide foi primeiramente misturada eentão diluída em tampão (20 mM de fosfato a pH 8) para amedida da concentração, 0,05 μΜ PTAA + 0,6 μΜ PrP, PrP-amilóide ou uma mistura de PrP e PrP-amilóide, e analisadaem triplicatas. Métodos para a detecção ou visualização deCPE/PrP-amilóide incluem, mas não são limitados, amicroscopia por fluorescência, detecção por fluorescênciaem leitoras de placas ou espectrofluorômetros, detecção porabsorção em leitoras de placas ou espectrômetros, leitor defluorescência de amostra, fotodiodos, polarização porfluorescência ou anisotropia, dicroísmo circular e outros.Neste exemplo utilizou-se uma leitora de placa porfluorescência Tecan Saphire2, a excitação mantida a 400 nm(vide Figura 5).

Métodos para calcular PrP e PrP-amilóide em soluçãoincluem análises de fluorescência, fluorescência máxima emínima, razões de intensidade por fluorescência,polarização por fluorescência ou anisotropia, dicroísmocircular e outros.

Mesmo pequenas frações de proteínas dobradas de formaincorreta em solução podem ser detectadas utilizando sondasde CPE. Isto é interessante uma vez que se deseje sercapaz de detectar os eventos de dobra incorreta o mais cedopossível. A detecção direta em solução é preferida emmuitos casos já que ela fornece um meio para analisar a PrPdobrada de forma incorreta sem a necessidade de captura,digestão utilizando proteinase K, sedimentação sobre asuperfície, etc.

Exemplo 6: Discriminação de linhagens de prions porsondas de polieletrólito conjugado em cortes de tecidos.

Quatro TSEs distintos foram propagados em ratostransgênicos tga2 0 com super-expressão de PrPc (4) . Grupos(n = 4-10) de ratos tga20 foram desafiadosintracerebralmente com homogenados de cérebro derivados deum veado de orelhas longas infectado por CWD (mCWD) , umcarneiro Suffolk infectado por scrapie (mPSS), uma vacainfectada por BSE (mBSE) , e uma linhagem de scrapie doRocky Mountain Laboratory para rato adaptado (RML), (umalinhagem de rocky mountain laboratory para rato adaptado).Cada doador de prion desenvolveu TSE terminal, comoconfirmado por "Western blotting" para PrPSc (dados nãomostrados). A referência genética é a mesma (tga20). Aúnica diferença é o inóculo infeccioso (infectiousinoculums) (a linhagem TSE) . Os agregados de prion foraminvestigados por todas as técnicas comuns e por umabiblioteca de sondas de polieletrólitos conjugados (sondasCPPs ou CPE).

No presente documento descreve-se um exemplo de comoexecutar a discriminação de linhagem sobre cortes decérebros marcados com a sonda de polieletrólito conjugadofluorescente, politiofeno ácido acético (PTAA). A limpeza,desparafinização ou fixação e marcação de cortes de tecidosprovenientes do cérebro, músculo, gordura, muco, nervo,vasos de sangue ou outros tecidos, podem ser realizadascomo nos exemplos anteriores e são descritas de forma geralabaixo.

Cortes (0,5 a 1000 |im, preferencialmente de 2-40 fimde espessura) provenientes de tecidos amilóide embebidos emparafina fixados em formaldeído foram dispostos sobrelâminas plus e desparafinizados com xileno (60 min), álcoolabsoluto (15 min), álcool 95% (15 min) e álcool 70% (10min) e, finalmente, enxaguados com água destilada por umpar de minutos. Cortes congelados provenientes de tecidoinfectado foram mantidos em etanol resfriado com gelo por10 minutos e lavados com solução tampão, por exemplo,(preferencialmente) 100 mM carbonato de Na pH 10, ou emvários pH utilizando Carbonato, Fosfato, Tris, Acetato,MÊS, HEPES OU MBS.

Os cortes foram equilibrados em solução tampão deincubação, preferencialmente 100 mM carbonato de Na pH 10,ou em vários pH utilizando Carbonato, Fosfato, Tris,Acetato, MES, HEPES ou MBS, por 10 minutos. PTAA forammisturados com o mesmo tampão utilizado para o equilíbrio(5 μg de sonda em 100 μΐ) e adicionados aos cortes. Aincubação ocorreu em uma câmara de umidade por 1 hora e asolução de sonda em excesso foi descartada com o tampão deincubação.

A limpeza, desparafinização ou fixação é possível deser realizada de acordo com a maioria dos métodos padrõesou variações dos mesmos. Em alguns casos a marcação decortes de tecidos pode ser realizada utilizando sondas dedois (2) ou mais polieletrólitos conjugados distintos,sondas de fluorescência, supressores de fluorescência, ondepelo menos um é um polieletrólito conjugado.

No presente documento, criocortes de cérebros sãoexpostos a uma sonda de polieletrólito conjugado aniônico,preferencialmente PTAA. Na marcação com PTAA, placas demCWD e mPSS fluoresceram muito claramente e as placasemitiram luz de diferentes tonalidades (não mostrado). OPTAA ligado ao PrPsc pode ser excitado utilizando radiaçãoeletromagnética. O comprimento de onda utilizado noexperimento específico é escolhido pela pessoa versada naarte, levando em consideração qual CPE é utilizado e anatureza da amostra, solventes, tampões, pH, temperatura,se em solução ou sobre uma lâmina do tecido. Comprimentosde onda de excitação incluem excitação de um únicocomprimento de onda, tal como por laser, ou utilizandocomprimentos de onda múltiplos, isto é, utilizando umafonte de luz e um ou mais filtros passa-faixa. A radiaçãopode estar na faixa de abaixo do ultra-violeta distante(FAR UV) a acima do infra-vermelho próximo (NIR) , dois oumais fótons de excitação, ou espectroscopia do UV. Nesteexemplo, placas de mCWD marcadas com PTAA excitadas a 488nm exibem um espetro esverdeado com um máximo (Emax) emtorno de 565 nm, enquanto placas de mPSS marcadas com PTAAemitiram um espectro deslocado para o vermelho (Emax: emtorno de 585 nm, Figura 6). Dados espectrais de PTAA ligadoa placas de mCWD (Emax: em torno de 565 nm), e mPSS (Emax: emtorno de 585 nm), depósitos foram registrados utilizando ummicroscópio de fluorescência que pode detectar umaintensidade de emissão relativa a diferentes comprimentosde onda. A intensidade da luz emitida a partir do PTAAligado a placas de PrP em 3 ratos individuais afetados commPSS e 4 ratos individuais afetados com mCWD foiregistrada. Neste caso os dados foram coletados a partir de3-5 placas distintas para cada amostra, 10 nspots" paracada placa. Utilizando estes dados de razões defluorescência (R) foi calculada e plotada a intensidade deluz emitida a certos comprimentos de onda (R532/639 eR532/ Emax). As razões registradas para placas mCWD foramR532/639 de 1,55±0,10 e R532/Emax de 0,92±0,03. Emcontrapartida, as razões observadas para as placas mPSSforam R532/639 de 1,15±0,11 e R532/Emax de 0,68±0,05. Asrazões entre as intensidades de emissão diferenciamclaramente as linhagens distintas marcadas por CPP, videFigura 7. A combinação destas duas razões diferencia semambigüidade entre as linhagens de prions mCWD e mPSS após atransmissão para ratos geneticamente similares.

Claims (21)

1. Método para detectar a presença de uma espécie prionpatogênica em uma amostra, caracterizado pelo fato decompreender as etapas de:colocar a amostra em contato com pelo menos umpolieletrólito conjugado (CPE)irradiar o CPE com radiação eletromagnéticamedir a radiação emitida ou absorvida pelo CPEem pelo menos um comprimento de onda, ecomparar a radiação emitida ou absorvida medidacom pelo um valor de referência correspondente àinteração do CPE com uma espécie prion conhecida.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a ditaespécie prion patogênica é um marcador de uma encefalopatiaespongiforme transmissível.

3. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato do CPE compreender copolímeros ouhomopolímeros de tiofeno, pirrol, anilina, furano,fenileno, vinileno, fluoreno, ou suas formas substituídas.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato do dito polieletrólitoconjugado possuir uma ou mais funcionalidades de cadeialateral iônica.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato das ditas funcionalidades de cadeia lateraliônica compreenderem aminoácidos, derivados de aminoácidos,neurotransmissores, monossacarídeos, ácidos nucléicos, oucombinações e derivados quimicamente modificados dosmesmos.

6. Método de acordo com as reivindicações 4 ou 5,caracterizado pelo fato das funcionalidades iônicascompreenderem uma ou mais funcionalidades de cadeia lateralzwitteriônica, aniônica e catiônica.

7. Um método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de compreenderainda a adição de um agente para aumentar a diferenciaçãodo CPE que interage com o prion dobrado de forma incorretaproveniente do CPE que interage com o prion normal.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-1-7, caracterizado pelo fato da radiação eletromagnéticautilizada para irradiar o CPE ser selecionada do grupo queconsiste de radiação de comprimento de onda único eradiação de comprimento de onda múltiplo, onde oscomprimentos de onda estão na faixa de 100 nm a 2000 nm, oumúltiplos de tais comprimentos de onda.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-1-8, caracterizado pelo fato da amostra estar na forma deima solução, suspensão ou amostra de tecido, ou a amostraestá imobilizada sobre uma fase sólida.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-1-9, caracterizado pelo fato da radiação emitida ouabsorvida pelo CPE ser medida em pelo menos doiscomprimentos de onda, dito método compreendendo ainda asetapas decalcular uma razão entre a radiação emitida ouabsorvida em pelo menos dois dos ditos comprimentosde ondacomparar a dita razão com razões previamente ousimultaneamente determinadas para uma espécie prionpatogênica.

11. Método de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de um dos pelo menos doiscomprimentos de onda ser a emissão máxima (Em^x) .

12. Método para distinguir entre espécies prionpatogênicas, caracterizado pelo fato de compreenderdetectar cada espécie prion pelo método de acordo comqualquer uma das reivindicações 1-11.

13. Dispositivo para a execução do método de acordo comqualquer uma das reivindicações 1-12, caracterizado pelofato de compreender:- meios para irradiar o CPE em contato com aamostrameios para medir a radiação emitida ouabsorvida pelo CPEmeios para salvar em computador possuindosalvos no mesmo valores de referência para comparaçãocom a radiação medida.

14. Dispositivo para a execução do método de acordo comqualquer uma das reivindicações 10-12, caracterizado pelofato de compreender:meios para irradiar o CPE em contato com aamostrameios para medir a radiação emitida ouabsorvida pelo CPEmeios para calcular uma razão entre a radiaçãoemitida ou absorvida em pelo menos dois dos ditoscomprimentos de onda medidosmeios para salvar em computador possuindosalvos no mesmo valores de razões previamentedeterminadas para espécies prion patogênicasespecíficas.

15. Método para distinguir entre espécies prionpatogênicas, caracterizado pelo fato de compreender:colocar a dita espécie prion patogênica emcontato com o CPEdetectar uma propriedade ótica do CPEonde uma diferença na dita propriedade ótica indicauma diferença entre as ditas espécies prion.

16. Método de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato da propriedade ótica detectada sera intensidade da luz emitida em dois ou mais comprimentosde onda.

17. Método de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de compreender ainda o cálculo darazão da intensidade de luz emitida em dois comprimentos deonda.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-15-17, caracterizado pelo fato do CPE compreendercopolímeros ou homopolímeros de tiofeno, pirrol, anilina,furano, fenileno, vinileno, fluoreno, ou suas formassubstituídas.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-15-18, caracterizado pelo fato do dito polieletrólitoconjugado possuir uma ou mais funcionalidades de cadeialateral iônica.

20. Método de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato das ditas funcionalidades de cadeialateral iônica compreenderem aminoácidos, derivados deaminoácidos, neurotransmissores, monossacarídeos, ácidosnucléicos, ou combinações e derivados quimicamentemodificados dos mesmos.

21. Método de acordo com as reivindicações 19 ou 20,caracterizado pelo fato das funcionalidades iônicascompreenderem uma ou mais funcionalidades de cadeia lateralaniônica e catiônica.