BRPI0705591A2 - composição farmacêutica e método para o tratamento de lesões tumorais cutáneas e outras dermatoses de mamìferos por terapia fotodinámica - Google Patents

Abstract

COMPOSIçãO FARMACêUTICA E MéTODO PARA O TRATAMENTO DE LESõES TUMORAIS CUTáNEAS E OUTRAS DERMATOSES DE MAMIFEROS POR TERAPIA FOTODINáMICA. A presente invenção diz respeito ao desenvolvimento de uma composição farmacêutica que possui MEALA (éster metil do ácido aminolevulínico) como agente precursor de fotossensibilizador e DTPA (ácido dietilenotriaminopentaacético) como agente quelante de ferro e descreve um método que utiliza a referida composição farmacêutica para o tratamento de lesões tumorais e outras dermatoses em mamíferos através da terapia fotodinâmica.

Description

"COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO PARA O TRATAMENTO DELESÕES TUMORAIS CUTÂNEAS E OUTRAS DERMATOSES DE MAMÍFEROSPOR TERAPIA FOTODINÂMICA"

A presente invenção diz respeito ao desenvolvimento de uma composiçãofarmacêutica que possui MEALA (éster metil do ácido aminolevulínico) como agenteprecursor de fotossensibilizador e DTPA (ácido dietilenotriaminopentacético) comoagente quelante de ferro e descreve um método que utiliza a referida composiçãofarmacêutica para o tratamento de lesões tumorais e outras dermatoses em mamíferosatravés da terapia fotodinâmica.

Diversos estudos envolvendo a terapia fotodinâmica com o MEALA têm sidorealizados em pacientes humanos e pequenos mamíferos roedores para avaliar aeficácia da formulação tópica no tratamento de lesões cutâneas. Em um trabalhoenvolvendo pacientes transplantados, o uso do MEALA e uma fonte de luz nãocoerente resultou em remissão completa das lesões de queratose actínica em 13 de17 pacientes em um período de 16 semanas (DRAGIEVA G., PRINZ B.M., HAFNERJ., DUMMER R., BURG G., BINSWANGER U., KEMPF W. A randomized controlledclinicai trial of topical photodynamic therapy with methyl aminolevulinate in thetreatment of actinic keartoses in transplant recipients. British Journal of Dermatology,v.151, p.196-200, 2004). Outro estudo também realizado em queratose actínicacomparou a resposta ao tratamento em humanos submetidos à terapia fotodinâmicacom o MEALA ou com placebo. A taxa de resposta completa nas lesões tratadas foi de89% e 38%, respectivamente. O tratamento com MEALA foi considerado pelos autorescomo seguro e efetivo no tratamento das lesões de queratose actínica (PARISERD.M., LOWE N.J., STEWART D.M., JARRAT M.T., LUCKY A.W., PARISER R.J.,YAMAUCHI P.S. Photodynamic therapy with topical methyl aminolevulinate for actinickeratoses: results of a prospective randomized multicenter trial. Journal of theAmercian Academy of Dermatology, v.48, p.227-232, 2003).

Vinciullo et al. (2005) realizou um trabalho envolvendo um grande número depacientes com carcinoma de células basais (CBC) de difícil tratamento, onde cento equarenta e oito lesões foram acompanhadas após a realização da terapia fotodinâmicacom MEALA tópico. A porcentagem de resposta completa após três meses foi de 89%.O tratamento foi considerado uma boa opção para CBCs, com excelentes resultadosestéticos (VINCIULLO C, ELLIOT T., FRANCIS D., GEBAUER K., SPELMAN L,NGUYEN R., WEIGHTMAN W., SHERIDAN A., REID C, CZARNECKI D., MURRELLD. Photodynamic therapy with topical methyl aminolevulinate for 'difficult-to-treat' basalcell carcinoma. British Journal of Dermatologists, v.152, p. 765-772, 2005).

Horn et al. (2003) selecionaram pacientes com carcinoma de células basaissuperficiais ou nodulares, com risco de complicações se submetidos a tratamentosconvencionais, além da possibilidade de apresentarem resultados estéticos ruins e/ourecidiva devido à localização e tamanho do tumor. Foram realizados um ou dois ciclosde tratamento dentro de um período de três meses, cada ciclo com duas aplicações deterapia fotodinâmica com o MEALA tópico e uma semana de intervalo entre elas. Naavaliação clínica das lesões, a taxa de remissão após três meses do tratamento foi de92% (45 de 49) nos casos de carcinoma de células basais superficial, 87% (45 de 52)nos carcinomas de células basais nodulares e 57% (quatro de sete) para oscarcinomas mistos. Já na análise histológica, as taxas obtidas foram 85% (40 de 47),75% (38 de 51), e 43% (três de sete), respectivamente. No período de 24 meses apósa terapia fotodinâmica, a taxa de recidiva geral do tumor foi de 18% (12 de 66). Oresultado estético foi classificado como excelente ou bom em 76% dos casos após trêsmeses de acompanhamento, aumentando para 85% aos 12 meses e para 94% aos24 meses (HORN M., WOLF P., WULF H.C., WARLOE T., FRITSCH C, RHODESL.E., KAUFMANN R., DE RIE M., LEGAT F.J., STENDER I.M., SOLÉR A.M.,WENNBERG A.M., WONG G.A.E., LARKÕ O. Topical methyl aminolevulinatephotodynamic therapy in patients with basal cell carcinoma prone to complications andpoor cosmetic outcome with conventional treatment. British Journal of Dermatology, v.149, p. 1242-1249, 2003).

Com o aumento da expectativa de vida dos cães e gatos devido ao avanço damedicina veterinária nas duas últimas décadas, houve também um crescimento donúmero de casos de animais com câncer. Dessa forma, o clínico veterinário deve sercapaz de diagnosticar, tratar e prevenir o câncer nos animais de estimação(REZENDE B.C.G., DAGLI M.L.Z. Retinóides na quimioprevenção e tratamentocoadjuvante de neoplasias em cães: revisão. Revista Clínica Veterinária, v.45, p. 44-50, 2003).

O carcinoma espinocelular é a neoplasia cutânea mais comum em gatos egeralmente decorre da exposição crônica do animal à radiação ultravioleta(BIRCHARD, S.J., SHERDING R.G. Manual Saunders - Clínica de Pequenos Animais.2a. edição. São Paulo. Editora Roca Ltda., 2003. Cap. 28, p. 251-256), podendo serprecedido por queratose actínica. Porém, sua etiologia pode não ser clara em todos oscasos. Tais tumores raramente emergem de cicatrizes de queimaduras ou processosinfecciosos (SCOTT, D.W., MILLER, W.H.JR., GRIFFIN, CE. Dermatologia dePequenos Animais. 5a edição. Rio de Janeiro. Interlivros, 1996. Cap.19, p.935-937).Aparecem freqüentemente como lesões não-cicatrizáveis, erosivas ou ulcerativas. Aslesões proliferativas podem variar de uma placa firme, eritematosa, a uma lesão deforma semelhante a uma couve-flor, que freqüentemente se ulcera. Geralmente essaslesões são localmente invasivas e o tempo para ocorrência de metástase é longo.Ocorrem em uma idade média de nove anos, sem predileção por raça ou sexo(WITHROW, S.J., MACEWEN, E.G. Small Animal Clinicai Oncology. 2a edição.Filadélfia. W.B. Saunders Company, 1999. Cap.15, p. 173-176).

Os gatos brancos (de pêlo curto ou longo) apresentam o carcinomaespinocelular cerca de 13 vezes mais freqüentemente que outros gatos, devido àsusceptibilidade aumentada à lesão actínica, pois apresentam áreas hipopigmentadashabitualmente expostas à luz solar, como as pontas das orelhas e região nasal. Oslocais mais comuns de acometimento nos felinos incluem pavilhões auriculares, lábios,plano nasal e pálpebras. As lesões são múltiplas em cerca de 45% dos gatosacometidos (SCOTT, D.W., MILLER, W.H.JR., GRIFFIN, CE. Dermatologia dePequenos Animais. 5a edição. Rio de Janeiro. Interlivros, 1996. Cap.19, p.935-937).

Cerca de 20% de todos os blastomas nos felinos se originam na pele e notecido subcutâneo, representando o segundo local de origem mais comum.Aproximadamente 60-70% dos tumores orais felinos são representados pelosespinocelulares (BERGMAN P., CARMICHAEL D. T. Feline Oral Neoplasia.International Veterinary Information Service, 2003. Disponível em www.ivis.org. Acessoem 06 abril 2005).

Histologicamente, os carcinomas espinocelulares consistem em massasirregulares ou cordões de queratinócitos que se proliferam invadindo a derme.Freqüentemente incluem a formação de queratina, pérolas córneas, pontesintercelulares, mitoses e atipia. A elastose solar pode ocasionalmente ser vista. Amaioria dos carcinomas espinocelulares em cães e gatos é do subtipo bemdiferenciado histopatologicamente e células claras variadas podem ocorrer (SCOTT,D.W., MILLER, W.H.JR., GRIFFIN, CE. Dermatologia de Pequenos Animais. 5aedição. Rio de Janeiro. Interlivros, 1996. Cap.19, p.935-937).

A terapia fotodinâmica é uma técnica utilizada no tratamento localizado delesões tumorais (DOUGHERTY T.J., GOMER C.J., HENDERSON B.W., JORI G.,KESSEL D., KORBELIK M., MOAN J., PENG Q. Photodynamic Therapy. Journal of theNational Câncer Institute, v.90, n.12, p.889-905, 1998). Também tem sido empregadana fotoerradicação de vírus, bactérias e fungos, incluindo Cândida albicans(MARDEGAN D.A., LIMA L.D., ROCHA S.M.A., BALBI M.M.V., WERNECK, C.E.,ZÂNGARO R.A. Terapia fotodinâmica em cultura de Cândida albicans. TerapiaFotodinâmica: Complexos de moléculas fotoativas e suas aplicações, p. 143-144,2002); além de ser utilizada como método diagnóstico. A fluorescência óptica dederivados da hematoporfirina, previamente injetados em pacientes com suspeita deneoplasia, é um exemplo, bastante divulgado, de método diagnóstico óptico, poucoinvasivo, utilizado hoje em dia (NICOLA J.H. Técnicas ópticas em favor dediagnósticos e tratamentos em Medicina, Odontologia e Veterinária: conceituaçãobásica e algumas contribuições experimentais. Terapia fotodinâmica: complexos demoléculas fotoativas e suas aplicações, p.62-63, 2002).

A terapia fotodinâmica (PDT - photodynamic therapy, do inglês), tambémconhecida como quimioterapia ativada pela luz ou fotoquimioterapia, é um método detratamento de neoplasias que utiliza a interação entre um agente fotossensibilizador(que se acumula preferencialmente nas células tumorais), a luz (com comprimento deonda compatível com o espectro de absorção do fotossensibilizador) e o oxigêniomolecular (LUCROY M.D., EDWARDS B.F., MADEWELL B.R. Veterinaryphotodynamic therapy. Veterinary Medicine Today: Reference Point, v. 216, n.11,p. 1745-1751, 2000). O efeito fotodinâmico da conjunção destes três fatores -fotossensibilizador, luz e oxigênio - resulta de uma espécie fotoativada do oxigênioproduzida neste processo, denominada de oxigênio singlete, a qual é altamentereativa com proteínas, membranas biológicas e DNA. O agente fotossensibilizador éretido preferencialmente pelas células tumorais em maior concentração do que emcélulas de tecido normal que circundam o tumor, proporcionando uma toxicidadeseletiva (STELL A.J., DOBSON J.M., LANGMACK K. Photodynamic therapy of felinesuperficial squamous cell carcinoma using topical 5-aminolaevulinic acid. Journal ofSmall Animal Practice, v. 42, n.4, p. 164-169, 2001).

Os mecanismos pelos quais o agente fotossensibilizador se acumula na célulatumoral não são completamente conhecidos, mas as características do tumor, dopróprio fotossensibilizador e de seu veículo possivelmente contribuem para essaseletividade. Várias características tumorais já foram relacionadas aos diferentesníveis de incorporação e retenção dos fotossensibilizadores nas células, como ogrande número de receptores de lipoproteínas de baixa densidade, presença demacrófagos, baixo pH, grande espaço intersticial, alta permeabilidade vascular, grandequantidade de colágeno recém-sintetizado e de lipídios de alta densidade (LUCROYM.D., EDWARDS B.F., MADEWELL B.R. Veterinary photodynamic therapy. VeterinaryMedicine Today: Reference Point, v. 216, n.11, p.1745-1751, 2000). Além disso, amitocôndria, os lisossomos, a membrana plasmática e o núcleo das células tumoraistêm sido avaliados como alvos potenciais para a PDT, juntamente com avascularização tumoral (DOUGHERTY T.J., GOMER C.J., HENDERSON B.W., JORIG., KESSEL D., KORBELIK M., MOAN J., PENG Q. Photodynamic Therapy. Journal ofthe National Câncer Institute, v.90, n.12, p.889-905, 1998).

O fotossensibilizador ideal para a terapia fotodinâmica não deve causar efeitostóxicos sistêmicos, deve ser seletivamente captado e retido pelo tecido tumoral e deveproporcionar alto rendimento quântico de oxigênio singlete, o agente fototóxico daterapia fotodinâmica, e deve também ser passível de rápida remoção da pele(LUCROY M.D. Photodynamic therapy for companion animais with câncer. TheVeterinary Clinics of North America Small Animal Pract,. v.32, n.3, p. 693-702, 2002).

Uma vez que neoplasia é um termo que abrange um grande espectro dedoenças com padrões clínicos muito diferentes, não é de se esperar que apenas umfotossensibilizador possa ser eficiente em todos os casos. No caso da terapiafotodinâmica utilizando-se um fotossensibilizador injetável como a hematoporfirina, oefeito ocorre em tecido que normalmente encontra-se abaixo da superfície da pele,assim é necessário considerar a absorção do tecido que se interpõe entre a fonte deluz e o próprio tumor. Para isso, o conhecimento da absorção tecidual por diferentescomprimentos de onda se faz necessário (ZEZELL D.M. Processos para monitoraçãoe otimização da terapia fotodinâmica de tumores. Campinas, Instituto de Física GlebWataghin, Universidade Estadual de Campinas, Tese de Doutorado, p. 05-18, 1991).

Quanto ao uso de um agente tópico, como o ácido 5-aminolevulínico (ALA),precursor de fotossensibilizador; a sua absorção ocorre através da queratinadanificada que recobre o tumor, havendo, no entanto, pouca penetração através doepitélio normal intacto (STELL A.J., DOBSON J.M., LANGMACK K. Photodynamictherapy of feline superficial squamous cell carcinoma using topical 5-aminolaevulinicacid. Journal of Small Animal Practice, v. 42, n.4, p. 164-169, 2001). A vantagem daaplicação tópica da substância em relação à sua aplicação injetável é que ela é maisfacilmente eliminada, proporcionando maior conforto ao paciente que não precisaráser mantido protegido da luz após o tratamento.

O ALA é freqüentemente aplicado em PDT para tumores de pele e também emdiagnóstico de blastomas esplênicos, pulmonares e do trato gastrintestinal (ONUKI, J.,TEIXEIRA P.C., MEDEIROS M.H.G., MASCIO P. Toxicidade do ácido 5-aminolevulínico (ALA) na ausência de luz. Terapia Fotodinâmica: Complexos demoléculas fotoativas e suas aplicações, p. 171-172, 2002).

O ALA é o primeiro metabólito da via biossintética do grupo heme, formado apartir da glicina e da succinil CoA. O último passo desta via é a incorporação do ferro àprotoporfirina IX (PPIX), sob a ação da enzima ferroquelatase. A síntese da PPIX énormalmente regulada por um mecanismo de feed-back negativo. Porém, na presençade excesso de ALA, a PPIX se acumula. Além disso, a atividade da porfobilinogêniodesaminase, que catalisa a formação do uroporfirinogênio a partir do porfobilinogênio,é maior em alguns tumores, enquanto a da ferroquelatase é menor, resultando em ummaior acúmulo da PPIX nesses tumores (PENG, Q.; SOLER, A.M.; WARLOE, T.;NESLAND, J.M.; GIERCKSKY, K.E. Selective distribution o porphyrins in skin thickbasal cell carcinoma after topical application of methyl 5-aminolevulinate. Journal ofPhotochemistry and Photobiology B: Biology, v.62, p.140-145, 2001). A biossíntese dogrupo heme se inicia na matriz mitocondrial, onde se dá a produção de ALA. Estemetabólito se difunde para o citoplasma, onde ocorre sua dimerização aopolipropilenoglicol (PPG) e depois sua tetramerização às porfirinas. A última porfirinada via - a PPIX - migra então para dentro da mitocôndria, onde sofrerá inserção deferro catalisada pela ferroquelatase. Como a PPIX é o agente fotossensibilizador dooxigênio, pressupõe-se que a PDT com ALA/PPIX provoca efeitos danosos àintegridade das mitocôndrias, causando inibição da fosforilação oxidativa, e daí mortecelular por apoptose.

Dentre os benefícios da PDT com o ALA incluem-se: fácil administração, menorfotossensibilidade da pele e a opção de repetição do tratamento, se necessário.

Entretanto, devido à sua propriedade hidrofílica, o ALA não penetra na membranacelular facilmente e, portanto, altas concentrações e um longo tempo de aplicaçãodevem ser empregados para se atingir um nível terapêutico de porfirinas (LUKSIENE,Z.; EGGEN, I.; MOAN, J.; NESLAND, J.M.; PENG, Q. Evaluation of protoporphyrin IX,phototoxicity and cell death pathway induced by hexylester of 5-aminolevulinic acid inReh and HPB-ALL cells. Câncer Letters, v.169, p.33-39, 2001).

Com o objetivo de superar esse problema, um grande número de ésteres deALA, que são mais lipofílicos e penetram melhor na membrana biológica, têm sidosintetizados e testados em sistemas biológicos. Porém, o mecanismo de ação dosdanos celulares mediados pelo éster de ALA ainda não é totalmente compreendido.

Estudos prévios mostraram que vários derivados de ésteres de ALAproduziram mais protoporfirina IX do que o ALA sozinho em modelos in vitro e in vivo(LUKSIENE, Z.; EGGEN, I.; MOAN, J.; NESLAND, J.M.; PENG, Q. Evaluation ofprotoporphyrin IX, phototoxicity and cell death pathway induced by hexylester of 5-aminolevulinic acid in Reh and HPB-ALL cells. Câncer Letters, v.169, p.33-39, 2001).O metil éster de ALA, também conhecido como metil aminolevulinato (MEALA),é um novo fotossensibilizador tópico que pode oferecer vantagens em relação ao ALApor apresentar maior penetração na pele devido à sua maior lipofilicidade, além damelhor seletividade por células neoplásicas.(PARISER, D.M.; LOWE, N.J.; STEWART,D.M.; JARRAT, M.T.; LUCKY, A.W.; PARISER, R.J.; YAMAUCHI, P.S. Photodynamictherapy with topical methyl aminolevulinate for actinic keratosis: Results of aprospective randomized multicenter trial. J. Am. Acad. Dermatol., v.48, n.2, p.227-232,2003).

Em estudos comparativos utilizando-se a PDT com ALA e MEALA notratamento de carcinoma basocelular, porcentagens de cura de 84% com ALA e 94%com MEALA foram observadas em intervalos de 3 a 18 meses após o tratamento(MORTON, C.A., FRASER, C; LEMAN, J.A.; SMITH, B. Effects of protocol variation onresponse rate of superficial basal cell carcinoma to topical photodynamic therapy.British Journal of Dermatology, v.153, n.1, p.25-25, 2005). A dor também é umparâmetro considerado em estudos comparativos entre esses dois precursores, sendoque a utilização da PDT com ALA é mais dolorida do que com MEALA (MWIEGELL,S.R.; STENDER, I.M.; NA, R.; WULF, H.C. Photodynamic therapy with MAL or ALA ontape-stripped normal skin: na evaluation of patienfs pain. British Journal ofDermatology, n.153, n.1, p-28-28, 2005).

O ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), também chamado Edathamil, e oácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA ou DETAPAC), também chamado ácidopentético e Complexone V®, possuem as seguintes fórmulas químicas,respectivamente:

o [(H02CCH2)2NCH2CH2]2 NCH2C02H Peso Molecular = 393,35

o (H02CCH2)2NCH2CH2N(CH2C02H)2 Peso Molecular = 292,24

O EDTA e o DTPA são dois agentes pertencentes à família dos ácidospolietilenopoliaminopoliacéticos quelantes de vários íons metálicos di e trivalentes taiscomo Fe2+/Fe3+, Ca2+ e Zn2+

Em princípio, um quelante é utilizado em sistemas químicos e biológicos paracomplexar e inativar íons metálicos interferentes, principalmente metais de transiçãocom atividade redox, como são os casos de Fe2+/Fe3+, Co2+/Co3+, Mn2+/Mn4+ eCu2+/Cu1+. No entanto, as propriedades redox, ou seja, o potencial de redução de umíon metálico é profundamente alterado pelo seu ligante.

No caso da presente invenção, há uma diferença fundamental entre o uso deEDTA e DTPA em terapia fotodinânica (PDT), já que a morte celular em PDT envolvea liberação de ferro livre das ferroproteínas.

O EDTA é um excelente catalisador das reações de Fenton produtoras deradicais hidroxilas, indesejáveis para a morte apoptótica almejada na PDT, enquanto oDTPA é muito menos ativo como catalisador da reação de Fenton. Dessa forma, oDTPA inibe em grande escala esta reação deletéria indesejável. A explicação paraesta diferença de atividade entre EDTA e DTPA é dada a seguir:

A literatura sobre radicais livres, analisada e interpretada por Barry Halliwell eJohn M. C. Gutteridge (Free Radicais in Biology and Medicine, 4th Ed., Bioscineces,Oxford, UK), informa que a etapa chave para a reação de Fenton é a redução de íonsde Fe3+ a Fe2+ pelo radical ânion superóxido (02"). A constante de velocidade destareação com Fe3+EDTA é 1,3 x 106 M"1s"1 em pH 7, ou seja, a reação de Fenton é muitorápida, enquanto a reação com Fe3+DTPA é quinhentas vezes mais lenta, 6x103 M"1s"1.Esta diferença cinética toma o DTPA muito mais vantajoso que o EDTA em PDT comporfirinas como agentes fotossensibilizadores, como é o caso do MEALA, onde ointeresse central é a produção do agente tóxico - oxigênio singlete - e não de radicaishidroxila, que podem disparar morte celular por necrose e daí reações inflamatórias.

A terapia fotodinâmica depende da entrega localizada da luz, podendo serutilizada somente em tumores que possam ser irradiados diretamente ou por meio dealgum sistema de entrega de luz. A eficiência da PDT, portanto, é limitada pelapenetração luminosa dentro do tecido (BRANCALEON L, MOSELEY H. Laser andnon-laser light sources for photodynamic therapy. Lasers in Medicai Science, v.17, p.173-186, 2002). Historicamente, lasers de grandes dimensões e complexidade eramutilizados para a realização da PDT. Atualmente há uma série de fontes de luz quepodem ser usadas, podendo ser polarizadas ou não-polarizadas, de padrão plano ouesférico, coerentes ou não-coerentes, contínuas ou pulsáteis, não restritivas, como porexemplo, os lasers de corante bombeados por outros lasers, lasers de diodo, lasers devapor de metal, lasers de femtosegundos, etc. As fontes de luz não laser incluem ofilamento de tungstênio, o arco de xenônio, o haleto de metal, as lâmpadasfluorescentes e os diodos emissores de luz (LEDs) (MARMUR E.S., SCHMULTS C.D.,GOLDBERG D.J. A review of laser and photodynamic therapy for the treatment ofnonmelanoma skin câncer. Dermatologic Surgery, v.30, n.2, p. 264-271, 2004).Os lasers por definição são fontes de luz monocromática, direcional e coerente,sendo possível focalizá-lo em pequenas áreas com margens exatas e grandeprecisão, resultando em intensidades usualmente maiores do que as obtidas comLEDs (KORMELLI T., YAMAUCHI P.S., LOWE N.J. Topical photodynamic therapy inclinicai dermatology. British Journal of Dermatology, v.150, p. 1061-1069, 2004). Já osdiodos emissores de luz (LEDs) podem irradiar simultaneamente áreas maiores detecido e podem ser organizados em combinações geométricas diferentes para cobriráreas de difícil acesso devido a características anatômicas (BRANCALEON L,MOSELEY H. Laser and non-laser light sources for photodynamic therapy. Lasers inMedicai Science, v.17, p. 173-186, 2002). Os LEDs são geralmente compactos eleves, sendo fabricados com emissão em vários comprimentos de onda (MANG T.S.Lasers and light sources for PDT: past, present and future. Photodiagnosis andPhotodynamic Therapy, v.1, p. 43-48, 2004).

A eficiência da terapia fotodinâmica no tratamento de distintos tipos de tumoresno esôfago, próstata, na face, cavidade oral e cérebro já foi comprovada em animaisde laboratórios e em humanos, face aos resultados promissores dos casos publicados.Dentre os estudos divulgados, muitos descrevem o sucesso da terapia fotodinâmicano tratamento de neoplasias originárias de diferentes órgãos, como carcinoma dacamada espinhosa, adenocarcinoma, carcinoma de células basais e transicionais,adenoma cístico, bem como tumores malignos de origem não epitelial, como glioma,melanoma, retinoblastoma, lipossarcoma, condrossarcoma e sarcoma de Kaposi(ZEZELL D.M. Processos para monitoração e otimização da terapia fotodinâmica detumores. Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin, Universidade Estadual deCampinas, Tese de Doutorado, p. 05-18, 1991).

Tanto a quimioterapia quanto a radioterapia apresentam um sistema dose-limitante ou toxicidade sistêmica, sendo que os efeitos colaterais tendem a limitar otratamento em determinadas doses. A fragilidade de uma população de idadeavançada, assim como a condição de debilidade de um paciente podem limitar o usode métodos cirúrgicos para a exérese tumoral. Os métodos de terapia fotodinâmicatendem a resultar em excelente resposta sem toxicidades cumulativas. Em futuropróximo, a PDT poderá ser aplicada juntamente a outra modalidade de tratamento,como a cirurgia tradicional, quimioterapia ou radioterapia, pois as toxicidades não sãoaditivas ou sinérgicas a nenhuma outra modalidade de terapia (MARCUS S.L.,MCINTYRE W.R. Photodynamic therapy systems and applications. Expert OpinionEmerging Drugs, v.7, n.2, p. 318-331, 2002).Atualmente, a viabilidade do uso da PDT em Medicina Humana e Veterináriaainda está sob investigação, entretanto, há um potencial considerável para suaaplicação clínica. Com o desenvolvimento de novos fotossensibilizadores e fontes deirradiação, com custos bem mais viáveis, a terapia fotodinâmica certamente se tornaráuma ferramenta ainda mais importante para os veterinários dermatologistas eoncologistas (LUCROY M.D., EDWARDS B.F., MADEWELL B.R. Veterinaryphotodynamic therapy. Veterinary Medicine Today: Reference Point, v. 216, n.11,p. 1745-1751, 2000).

A patente EP0820432B1 descreve novos ésteres do ácido 5-aminolevulínicoque promovem a produção de protoporfirina IX e são úteis como agentes defotossensibilização para fotoquimioterapia.

A patente US6750212 descreve composições fotoquimioterapêuticas para otratamento de tumores. As composições contêm agentes fotoquimioterapêuticosprecursores da protoporfirina e um fotossensitizador localizador de estroma vascular.

A patente US5955490 descreve um método fotoquimioterapêutico que utiliza oácido 5-aminolevulínico e outros precursores de porfirinas endógenas para otratamento de células de crescimento rápido.

A patente US6723750 descreve um método para o tratamento de condiçõespré-melanóticas através da administração de um agente fotossensível seguida daativação do mesmo.

A patente US6622729 descreve um fototratamento seletivo de células anormaise de vasos sangüíneos adjacentes a elas através da administração de um agentefotossensibilizador susceptível a um fototratamento juntamente com um agente quepromove a formação de trombos vasculares.

A patente US6335465 descreve cristais coloridos do ácido 5-aminolevulínicoesterilizados por irradiação e que são úteis como agente fotossensibilizador para odiagnóstico e tratamento de infecções virais, bacterianas, fúngicas e parasitárias, bemcomo para o tratamento de câncer de bexiga.

O estado da técnica, contudo, não descreve uma composição farmacêutica quecontém MEALA e DTPA para uso em terapia fotodinâmica. A invenção permite obteras vantagens do uso do éster de ALA (MEALA) em comparação com o ALA na terapiafotodinâmica para o tratamento de lesões tumorais cutâneas e dermatoses e osbenefícios em seus efeitos quando utilizado junto ao agente quelante de ferro DTPA.A presente invenção descreve o desenvolvimento de uma composiçãofarmacêutica que contém MEALA e DTPA para utilização em terapia fotodinâmica comum sistema emissor de luz com LEDs ("Light Emitting Diode") de comprimento deonda de 630 nm e um método que utiliza a referida composição farmacêutica para otratamento de lesões tumorais cutâneas e dermatoses em mamíferos.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Para a síntese de éster metil do ácido aminolevulínico, 0,1 g de ALA foiacrescentado em 100 ml de diazometano. A solução foi agitada em baixa temperatura(banho-maria em gelo seco com álcool) durante 20 minutos. Após esse tempo, trocou-se o gelo seco com álcool por água com gelo por mais uma hora. Em seguida, asolução foi agitada à temperatura ambiente por mais uma hora. Desligou-se a agitaçãoe a solução foi bombeada com nitrogênio até perder a coloração amarelada.Utilizando-se o rotaevaporador (BÜCHI ROTAVAPOR R-114) e o banho-maria comágua quente (WATERBATH B-481), todo o éter restante foi evaporado sobrandosomente o éster metil de ácido aminolevulínico (MEALA).

A formulação a base de MEALA (éster metil do ácido aminolevulínico) foipreparada utilizando-se solução contendo 0,9% de cloreto de sódio e 4% de DTPA.Essa solução foi preparada sob aquecimento de 80°C até ficar transparente. Apósretornar à temperatura ambiente, 0,1 g de MEALA (éster de ALA) foi dissolvido em 0,6ml da solução preparada e, em seguida, foi adicionado 1,2 g de lanolina. Após ahomogeneização, a amostra foi deixada em repouso por 10 minutos para então seadicionar 0,2 g de vaselina e homogeneizá-la novamente. A pomada foi armazenadaem geladeira a uma temperatura próxima a 5°C.

Para o uso veterinário, os testes do método de tratamento proposto napresente invenção foram realizados em animais, de ambos os sexos, com ou sem raçadefinida, com idades variadas, acometidos por carcinoma espinocelular. O diagnósticofoi estabelecido histologicamente, sendo o estadiamento tumoral executado segundo oprotocolo preconizado pela Organização Mundial de Saúde (OMS).

Antes do tratamento, os animais foram submetidos ao exame físico completo,levando-se em consideração os seguintes parâmetros: freqüência cardíaca (FC),freqüência respiratória (FR), pulso, mucosas, palpação de linfonodos submandibularese temperatura.

Os animais receberam como medicação pré-anestésica a acepromazina nadose de 0,1 mg/kg administrada por via intramuscular (IM) e associada à meperidinana dose de 6mg/kg (IM). Foi realizada a anestesia geral inalatória com isoflurano paraa realização do procedimento fotodinâmico. A indução foi feita com propofol na dosede 5 mg/kg administrada por via intravenosa (IV). Para facilitar a entubaçãoendotraqueal, foi aplicada lidocaína (dose empírica) na epiglote do animal.Imediatamente antes do início da irradiação da lesão foi realizada a coleta de sanguedo animal para dosagem de ferro e ferritina.

A composição foi aplicada sobre as lesões com uma margem adicional de,aproximadamente 5mm, considerando o tecido aparentemente normal. A aplicaçãomanual da pomada foi feita mediante o uso de luvas de procedimento. Esta aplicaçãofoi realizada em intervalos de 30 minutos, totalizando 4 horas antes da irradiação. Osanimais foram mantidos em gaiolas individuais durante esse período, portaram colarelizabetano e foram monitorados para evitar que removessem, por lambedura oucoçadura, o produto aplicado na área.

Para a confirmação da absorção do composto e síntese de PPIX por toda aextensão tumoral, foi utilizada uma lâmpada ultravioleta (lâmpada de Wood). O localde penetração do creme fluoresce em vermelho. Essa emissão fluorescente foiavaliada, em vários intervalos de tempo, por meio de um espectrômetro compacto(Ocean Optics®) conectado a um computador portátil, para otimizar o momento dairradiação.

Para a realização da técnica foi utilizado um protótipo composto por um arrayde 30 LEDs desenvolvido para uso em Medicina Veterinária. Esse protótipo contém asseguintes especificações: potência de 180 mW, intensidade de 5 mW/cm2 ecomprimento de onda de 630nm. Os olhos dos animais foram protegidos comsuperfícies metálicas e compressas de gaze durante toda a exposição à terapia. Adose utilizada foi de 12 J/cm2, sendo o tempo de irradiação calculado para essa dosede 40 minutos.

A temperatura de superfície cutânea, gerada durante a irradiação, foimonitorada por meio de uma câmara termográfica ThermaCAM® (SC3000HS, FLIRSystems). As imagens térmicas, em 256 tons, foram armazenadas em umaworkstation e processadas em tempo real, para registro gráfico da evolução térmicaem pontos escolhidos da lesão.

Imediatamente após a realização da terapia fotodinâmica foi realizada outracoleta de sangue para nova dosagem de ferro e ferritina. Solicitou-se a observaçãodomiciliar pelos proprietários, que foram periodicamente contatados para se obtereminformações sobre a evolução do tratamento. O primeiro retorno para avaliação doaspecto da lesão tratada foi marcado 15 dias após o tratamento. O segundo retorno foimarcado 30 dias após a PDT para observação de eventual remissão do tumor, falhado procedimento e efeitos colaterais tardios. Repetiram-se, no segundo retorno, ohemograma e exames de funções renal e hepática

O resultado do tratamento foi avaliado após 90 dias pela observação visual efoi classificado em: resposta completa (desaparecimento total da lesão crostosa,reepitelização, caracterizando pele lúcida), resposta parcial (redução tumoral de maisde 50%), resposta mínima (redução tumoral menor do que 50%) ou ausência deresposta (nenhuma alteração das características e tamanho do tumor).

A presente invenção pode ser mais claramente explicada, de forma não-restritaou limitante, através dos exemplos a seguir:

EXEMPLO 01:

Foram tratados 05 animais, de ambos os sexos, todos sem raça definida (SRD)e com idades variando entre oito e treze anos (média de idade = 9,8 anos),acometidos por carcinoma espinocelular, trazidos para atendimento no HospitalVeterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de SãoPaulo. Os proprietários assinaram um termo de consentimento que continha todos osdetalhes do procedimento fotodinâmico, incluindo os possíveis efeitos colaterais. Odiagnóstico foi estabelecido histologicamente, sendo o estadiamento tumoralexecutado segundo o preconizado pela Organização Mundial de Saúde (OMS), talcomo o representado na tabela a seguir disposta. Os tumores classificados em Tis, 1^e T2 foram aqueles tratados pela técnica de terapia fotodinâmica.

Tabela 1 -Estágios clínicos dos tumores felinos de origem epidérmica, de acordo com aOrganização Mundial de Saúde (World Health Organization).

<table>table see original document page 14</column></row><table>

a) Características das lesões:Dos 05 animais tratados, quatro apresentavam lesão no nariz e um apresentavalesão no pavilhão auricular esquerdo, totalizando cinco lesões. As tabelas 2 e 3apresentam as características dessas lesões, incluindo sua localização, tamanho,tempo de evolução, aspecto macroscópico e diagnóstico histopatológico.

Tabela 2. Características das lesões quanto à localização, tamanho e tempo de evolução.

<table>table see original document page 15</column></row><table>

Tabela 3. Características das lesões quanto ao aspecto e laudo histopatológico.

<table>table see original document page 15</column></row><table>

b) Exame físico e exames complementares realizados antes da PDT

Antes do tratamento, os animais foram submetidos ao exame físico completo,levando-se em consideração os seguintes parâmetros: freqüência cardíaca (FC),freqüência respiratória (FR), pulso, mucosas, palpação de linfonodos submandibularese temperatura (tabela 4).

Tabela 4. Exame físico dos animais antes da PDT (N= normal).

<table>table see original document page 15</column></row><table>

Os exames complementares realizados antes da PDT foram os seguintes:- Hemograma Completo: Apenas dois animais apresentaram alterações nóeritrograma, como pequena diminuição da porcentagem de hematócrito e da taxa dehemoglobina. Nenhum desses parâmetros foram considerados limitantes para arealização do procedimento. A tabela 5 mostra os animais com alteração emeritrograma (V.C.M.= volume corpuscular médio; H.C.M.= hemoglobina corpuscularmédia; C.H.C.M.= concentração de hemoglobina corpuscular média).

Tabela 5. Eritrograma dos animais antes do tratamento.

<table>table see original document page 16</column></row><table>

N= normal, + = pequeno aumento, ++ = aumento moderado, +++ = aumento acentuado, 4- =pequena diminuição, 44=diminuição moderada, 444= diminuição acentuada.

Alterações pequenas a moderadas, tanto em número de leucócitos, como emalgumas de suas linhagens (eosinófilos, linfócitos e monócitos) foram observadas noleucograma dos felinos tratados (tabela 6). Nenhuma alteração foi consideradarelevante para exclusão de animais do procedimento.

Tabela 6. Leucograma dos animais antes do tratamento.

<table>table see original document page 16</column></row><table>

N= normal, + = pequeno aumento, ++ = aumento moderado, +++ = aumento acentuado, 4 =pequena diminuição, 44=diminuição moderada, 444= diminuição acentuada.

- Função Renal: Todos os animais apresentaram aumento na taxa de uréia e taxade creatinina dentro dos padrões de normalidade.

- Função Hepática: Todos os animais apresentaram alterações pequenas amoderadas no perfil hepático, sendo que apenas um gato apresentou aumentoacentuado em uma das enzimas hepáticas determinadas, como ilustrado na tabela 7(PT= proteína total; AST= aspartato-transaminase; ALT = alanina aminotransferase;

FA= fosfatase alcalina e GGT= gama-glutamil transferase).

Tabela 7. Perfil hepático dos animais antes do tratamento.

<table>table see original document page 16</column></row><table>

N= normal, + = pequeno aumento, ++ = aumento moderado, +++ = aumento acentuado- Ferro: A dosagem sérica de ferro foi realizada imediatamente antes doprocedimento fotodinâmico e imediatamente após. A tabela 8 apresenta os valoresobtidos nas duas dosagens.

Tabela 8. Dosagem sérica de ferro - antes e depois da PDT. OBS: Valor normal para a espéciefelina: 34 a 122 ng/dl.

<table>table see original document page 17</column></row><table>

- Ferritina: Da mesma maneira em que foi realizada a dosagem sérica do ferro, aferritina foi determinada imediatamente antes e imediatamente após o tratamento(tabela 9).

Tabela 9. Dosagem sérica de ferritina - antes e depois da PDT.

<table>table see original document page 17</column></row><table>

- Sorologia FIV/FelV: Todos os animais apresentaram resultados negativos no examesorológico.

c) Análise dos resultados

Após um período aproximado de 03 meses, o resultado do tratamento foiavaliado pela observação da lesão tratada, sendo classificado em: resposta completa(desaparecimento total da lesão crostosa, reepitelização, caracterizando pele lúcida),resposta parcial (redução tumoral de mais de 50%), resposta mínima (redução tumoralmenor do que 50%) ou ausência de resposta (nenhuma alteração das características etamanho do tumor).Foram tratados 05 animais acometidos por carcinoma espinocelular, ondequatro apresentavam uma única lesão no nariz e um apresentava lesão em pavilhãoauricular esquerdo. A tabela a seguir apresenta os resultados avaliados clinicamenteapós o tratamento.

Tabela 10. Resposta clínica dos animais aproximadamente 90 dias após o tratamento.

<table>table see original document page 18</column></row><table>

Após aproximadamente 5 meses, realizou-se, quando possível, a biópsia daregião tratada para repetição da análise histopatológica. A tabela abaixo mostra acomparação dessa análise antes e após a PDT.

Tabela 11. Comparação da análise histopatológica antes e após o tratamento.

<table>table see original document page 18</column></row><table>

EXEMPLO 02:

Utilizando os procedimentos do primeiro exemplo, um grupo com mais 5animais (numerados de 6 a 10) foi tratado. Havia animais de ambos os sexos, todossem raça definida (SRD) e com idades variando entre seis e doze anos (média deidade = 9,4 anos), sendo 2 com lesões em plano nasal, 2 com lesões em pavilhõesauriculares e 1 com lesão em região temporal.a) Características das lesões

As tabelas 12 e 13 apresentam a localização da lesão de carcinomaespinocelular, o tempo de evolução, a classificação clínica e o grau de diferenciaçãocelular.

Tabela 12. Características do carcinoma espinocelular quanto à localização etempo de evolução.

<table>table see original document page 19</column></row><table>

Tabela 13. Características das lesões quanto à classificação clínica e grau de diferenciação.

<table>table see original document page 19</column></row><table>

b) Exame físico e exames complementares realizados antes da PDT

Antes do tratamento, os animais foram submetidos ao exame físico completo,levando-se em consideração os seguintes parâmetros: freqüência cardíaca (FC),freqüência respiratória (FR), mucosas e palpação de linfonodos (tabela 14).

Tabela 14. Exame físico dos animais antes da PDT. N= normal

Os exames complementares realizados antes da PDT foram os seguintes:- Hemograma Completo: Nenhum animal apresentou alterações no eritrograma (tabela15). As siglas representam: V.C.M.= volume corpuscular médio; H.C.M.= hemoglobinacorpuscular média; C.H.C.M.= concentração de hemoglobina corpuscular média.

Tabela 15. Eritrograma dos animais antes do tratamento.

<table>table see original document page 20</column></row><table>

N= normal, + = pequeno aumento, ++ = aumento moderado, +++ = aumento acentuado, 4- =pequena diminuição, 44=diminuição moderada, 444= diminuição acentuada.

Alterações pequenas a moderadas, tanto em número de leucócitos, como emalgumas de suas linhagens (eosinofilos, basofilos e linfocitos) foram observadas noleucograma dos felinos tratados (tabela 16). Nenhuma alteração foi consideradarelevante para exclusão de animais do procedimento.

Tabela 16. Leucograma dos animais antes do tratamento.

<table>table see original document page 20</column></row><table>

N= normal, + = pequeno aumento, ++ = aumento moderado, +++ = aumento acentuado, 4- =pequena diminuição, 44-=diminuição moderada, 444= diminuição acentuada.

- Função Renal: Todos os animais apresentaram aumento na taxa de uréia e taxade creatinina dentro dos padrões de normalidade.

- Função Hepática: Todos os animais apresentaram alterações pequenas amoderadas no perfil hepático, como ilustrado na tabela 17 (PT= proteína total; AST=aspartato-transaminase; ALT = alanina aminotransferase; FA= fosfatase alcalina eGGT= gama-glutamil transferase).

Tabela 17. Perfil hepático dos animais antes do tratamento.

<table>table see original document page 20</column></row><table>

N= normal, + = pequeno aumento, ++ = aumento moderado, +++ = aumento acentuado- Ferro: A dosagem sérica de ferro foi realizada imediatamente antes doprocedimento fotodinâmico e imediatamente após. A tabela 18 apresenta os valoresobtidos nas duas dosagens.

Tabela 18. Dosagem sérica de ferro - antes e depois da PDT. OBS: Valor normal para aespécie felina: 34 a 122 ng/dl.

<table>table see original document page 21</column></row><table>

- Ferritina: Da mesma maneira em que foi realizada a dosagem sérica do ferro, aferritina foi determinada imediatamente antes e imediatamente após o tratamento(tabela 19).

Tabela 19. Dosagem sérica de ferritina - antes e depois da PDT.

<table>table see original document page 21</column></row><table>

- Sorologia FIV/FelV: Todos os animais apresentaram resultados negativos no examesorológico.

c) Análise dos resultados

Após um período aproximado de 03 meses, o resultado do tratamento foiavaliado pela observação da lesão tratada, sendo classificado em: resposta completa(desaparecimento total da lesão crostosa, reepitelização, caracterizando pele lúcida),resposta parcial (redução tumoral de mais de 50%), resposta mínima (redução tumoralmenor do que 50%) ou ausência de resposta (nenhuma alteração das características etamanho do tumor). A tabela a seguir apresenta os resultados avaliados clinicamenteapós o tratamento.Tabela 20. Resposta clínica dos animais aproximadamente 90 dias após o tratamento.

<table>table see original document page 22</column></row><table>

Após aproximadamente 5 meses, realizou-se, quando possível, a biópsia daregião tratada para repetição da análise histopatologica. A tabela abaixo mostra acomparação dessa análise antes e após a PDT.

Tabela 21. Comparação da análise histopatologica antes e após o tratamento.

<table>table see original document page 22</column></row><table>

Claims (8)

1. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA O TRATAMENTO DE LESÕESTUMORAIS CUTÂNEAS E OUTRAS DERMATOSES DE MAMÍFEROS PORTERAPIA FOTODINÂMICA, caracterizado pela composição farmacêuticacompreender o éster metil do ácido aminolevulínico (MEALA) como o agenteprecursor de fotossensibilizador e o ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA)como o agente quelante, utilizada juntamente com um sistema emissor de luz,baseado na técnica de terapia fotodinâmica.

2. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE LESÕES TUMORAIS CUTÂNEASE OUTRAS DERMATOSES DE MAMÍFEROS, caracterizado por ser baseadona técnica de terapia fotodinâmica, compreendendo a utilização da composiçãofarmacêutica preconizada na reivindicação 1 como agente precursor defotossensibilizador e uma fonte emissora de luz para irradiação.

3. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE LESÕES TUMORAIS CUTÂNEASE OUTRAS DERMATOSES DE MAMÍFEROS, de acordo com a reivindicação-2, caracterizado pela fonte luminosa poder ser polarizada ou não-polarizada,de padrão plano ou esférico, coerente ou não-coerente, contínua ou pulsátil,não restritiva.

4. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE LESÕES TUMORAIS CUTÂNEASE OUTRAS DERMATOSES DE MAMÍFEROS, de acordo com asreivindicações 2 e 3, caracterizado pela fonte emitir luz com comprimento deonda entre 350-800 nm, preferencialmente 630 nm.

5. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE LESÕES TUMORAIS CUTÂNEASE OUTRAS DERMATOSES DE MAMÍFEROS, de acordo com asreivindicações 2 a 4, caracterizado pela fonte de luz fornecer uma dose total deluz entre 0.5-500 J/cm2.

6. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE LESÕES TUMORAIS CUTÂNEASE OUTRAS DERMATOSES DE MAMÍFEROS, de acordo com asreivindicações 2 a 5, caracterizado pelo método compreender a aplicação dacomposição farmacêutica sobre a lesão de 15 minutos a 48 horas antes dairradiação de luz, para indução do acúmulo de PPIX pelas células a seremsubmetidas ao tratamento.

7. USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO DETRATAMENTO, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado por serna preparação de um medicamento para o tratamento fotodinamico de lesõestumorais e outras dermatoses em mamíferos, inclusive humanos.

8. USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO DETRATAMENTO, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado por serna preparação de um medicamento para o diagnóstico fotodinamico de lesõestumorais em mamíferos, inclusive humanos.