BRPI0618145A2

BRPI0618145A2 - goma de diutana, métodos para produzir uma goma de diutana e para produzir uma goma de esfingana, e, molécula de ácido nucleico isolado

Info

Publication number: BRPI0618145A2
Authority: BR
Inventors: Coleman Russell; Matzke Steven; N Patel Yamini
Original assignee: Cp Kelco Us Inc
Priority date: 2005-11-01
Filing date: 2006-10-31
Publication date: 2019-12-10
Also published as: ES2397094T3; PL1976996T3; DE11185331T1; ES2532831T3; DK2522739T3; AR058831A1; PL2522739T3; EP1976996B1; PE20070770A1; DE11185331T8; ES2397094T1; EP1976996A2; EP1976996A4; EP2522739A1; BRPI0618145B1; EP2522739B1; HK1178941A1

Abstract

goma de diutana, métodos para produzir uma goma de diutana e para produzir uma goma de esfingana, e, molécula de ácido nucleico isolado a presente invenção descreve a produção de um polissacarídeo de diutana demonstrando propriedades de viscosidade aumentadas como comparado com o polissacarídeo previamente produzido do mesmo tipo de unidades de repetição. este polissacarídeo de diutana melhorado é produzido através da geração de um derivado de sphingomonas sp. atcc 53159 que abriga um plasmídeo de faixa de hospedeiro ampla, de múltiplas cópias, em que os genes para a biossíntese de polissacarídeo de diutana foram clonados. o plasmídeo provê a capacidade dentro da cepa de sphingomonas hospedeiro de produzir cópias múltiplas de genes para tal síntese de polissacarídeo. em tal modo, um método de produção não apenas aumentada do polissacarídeo de diutana alvo, mas também a produção de um polissacarídeo de diutana de melhoradas propriedades físicas (da viscosidade maior acima mencionada) do mesmo é provido. este polissacarídeo de diutana demonstrou ser particularmente utilizável como um possível viscosificador em aplicações de campos de petróleo e dentro de materiais de cimento. os métodos inventivos de produção de tal polissacarídeo de diutana melhorado, assim como os novos genes clonados requeridos para produzir a diutana melhorada dentro de tal método são tal englobados por esta invenção. adicionalmente, a nova cepa de sphingomonas engenheirada incluindo a seqüência de dna necessária é englobada por esta invenção.

Description

“GOMA DE DIUTANA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA GOMA DE DIUTANA E PARA PRODUZIR UMA GOMA DE ESFINGANA, E, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO”

Campo da Invenção

A presente invenção descreve a produção de um polissacarídeo de diutana demonstrando propriedades aumentadas de viscosidade como comparado com polissacarídeo previamente produzido do mesmo tipo de unidades de repetição. Tal polissacarídeo de diutana melhorado é produzido através da geração de um derivado de Sphingomonas sp. ATCC 53159 que abriga um plasmídeo de faixa de hospedeiro amplo, de cópias múltiplas, em que genes para a biossíntese de polissacarídeos de diutana foram clonados. O plasmídeo provê a capacidade dentro da cepa de Sphingomonas hospedeiro de produzir cópias múltiplas de genes para esta síntese de polissacarídeo. Deste modo, provê-se um método de produção não apenas aumentada do polissacarídeo de diutana alvo, mas também de produção de um polissacarídeo de diutana de melhoradas propriedades físicas (da viscosidade maior acima mencionada) do mesmo. Tal polissacarídeo de diutana demonstrou ser particularmente utilizável como um possível viscosificador em aplicações de campos de petróleo e dentro de materiais de cimento. Os métodos da invenção de produção de tal polissacarídeo de diutana melhorado, bem como os novos genes clonados requeridos para produzir a diutana melhorada dentro de tal método são também englobados por esta invenção. Adicionalmente, a nova cepa de Sphingomonas engenheirada incluindo a seqüência de DNA necessária é englobada por esta invenção.

Antecedentes da Invenção

Polissacarídeos ou gomas são primariamente usados para espessar ou geleificar soluções aquosas e são freqüentemente classificados em dois grupos: agentes de espessamento e de geleificação. Agentes espessantes típicos incluem amidos, goma xantana, goma de diutana, goma welana, goma guar, carboximetilcelulose, alginato, metilcelulose, goma caraia e goma tragacanto. Agentes geleificantes comuns incluem gelatina, goma gelano, amido, alginato, pectina, carragenano, Agar e metilcelulose.

Alguns polissacarídeos, ou mais particularmente descrito, biogomas, como xantano, gelano, welano e diutana, foram produzidos via fermentação de micróbios durante muitos anos. Tais biogomas demonstram características variadas como capacidades de modificação de viscosidade que permitiram sua utilização em muitas aplicações diferentes. Incluídos em uma lista estão agentes geleificantes para alimentos, como gelatinas de confeitaria, geléias, géis de sobremesa, sorvetes e produtos dietéticos, bem como componentes de meios microbiológicos. Além disso, os agentes espessantes são utilizados para aplicações infinitas de uso final para modificar a viscosidade dos líquidos alvos. De particular interesse é a capacidade de tais gomas de conferirem modificação da viscosidade em líquidos de petróleo subterrâneo e/ou abaixo da linha d’água para facilitar a coleta dos mesmos, apesar de muitos usos finais possíveis diferentes existirem (incluindo produção de cimento, como um exemplo). Diferentes biogomas foram produzidas de diferentes fontes de bactérias, como goma xantano, de Xanthomonas campestris, goma de gelano, de Sphingomonas elodea, goma de welano de Sphingomonas sp. ATCC 31555, e goma de diutana (S-657) de Sphingomonas sp. ATCC 53159. As modificações genéticas destas cepas foram realizadas no passado para efetuar mudanças significativas nos materiais de goma resultantes produzidos através dos procedimentos de fermentação acima mencionados. Estas modificações permitiram mudanças como remoção do grupo acila para criar materiais de goma diferentes demonstrando propriedades físicas diferentes. Geralmente, estas modificações genéticas são do tipo para alterar tanto a composição da biogoma alvo por último através de expressão do gene alterada dentro do organismo hospedeiro, como aumentar o rendimento da biogoma alvo, através da introdução de um plasmídeo que demonstra amplificação de gene sozinha (como nas patentes U.S. 5.854.034, 5.985.623, e 6.284.516, para Pollock et al. e patente U.S. 6.709.845 para Pollock sozinho).

A goma de diutana (também conhecida como heteropolissacarídeo S-657) é preparada por fermentação da cepa Sphingomonas sp. ATCC 53159 e demonstra propriedades de espessamento, suspensão e estabilização em soluções aquosas. Diutana geralmente demonstra uma unidade de repetição hexamérica consistindo de quatro açúcares na estrutura dorsal (glicose-ácido glucurônico-glicose-rhamnose) e uma cadeia lateral de dois resíduos de rhamnose fixados a um dos resíduos de glicose. Detalhes da estrutura de goma de diutana podem ser encontrados em um artigo por Chowdhury, T. A., B. Lindberg, U. Lindquist e J. Baird, Carbohydrate Research 164 (1987) 117-122. A diutana mostrou ter dois substituintes acetila por unidade de repetição em Diltz et al., Carbohydrate Research 331 (2001) 265-270. Ambas estas referências são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Detalhes da preparação de goma de diutana podem ser encontrados na patente U.S. 5.175.278, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A diutana pode ser produzida da cepa de Sphingomonas utilizando técnicas de fermentação padrões como utilizar as fontes de carboidratos (glicose, maltose, e semelhantes, como exemplos não limitantes), uma fonte de nitrogênio, e outros sais.

As características físicas conferidas por esta biogoma de diutana em sua forma de tipo selvagem são desejadas por certas indústrias, particularmente em termos de suas propriedades de modificação de viscosidade e/ou características de retenção de água. Infelizmente, foi provado que é difícil produzir diutana de um modo custo efetivo. Além disso, tais questões de custo militam contra a utilização difundida de diutana atualmente, uma vez que o grau de viscosidade demonstrado por esta biogoma é insuficiente para suplantar outras biogomas menos caras, mas efetivas (como goma xantana, como um exemplo). Como tal, foi estabelecida a necessidade de prover um método para produzir uma diutana efetiva com um custo mais baixo, mínimo, e/ou prover um modo de produzir uma biogoma do tipo diutana que demonstre uma melhora significativa nas propriedades físicas também. Até agora, a única menção de produção de quaisquer tipos de esfinganas relacionados (sem quaisquer demonstrações para diutana especificamente) é em termos de rendimento maior (nas patentes de Pollock et al acima mencionadas). Não houve nenhuma discussão ou sugestão satisfatória de qualquer modo de prover um método para produzir uma goma de diutana melhorada, de peso molecular mais elevado, que demonstre qualquer melhora nas medições da viscosidade através deste método de produção.

Breve Descrição da Invenção

Compreendeu-se agora que a amplificação de determinadas seqüências de DNA isoladas, novas, para a biossíntese de diutana dentro de um organismo de Sphingomonas hospedeiro não somente permite a produção aumentada de goma de diutana a partir das mesmas, mas também produz uma goma de diutana que demonstra propriedades de viscosidade aumentadas. Esta nova seqüência de DNA (que é introduzida em um organismo hospedeiro via qualquer método bem conhecido, como, sem limitação, um plasmídeo) provê, assim, os resultados desejados que foram buscados após os métodos de síntese de diutana. Uma vantagem distinta da utilização destes genes amplificados em um plasmídeo é a natureza relativamente simples de incorporar uma seqüência de DNA isolada nos procedimentos de síntese de diutana. Uma outra vantagem é a capacidade de produzir tais propriedades de viscosidade maior para a goma de diutana alvo, enquanto aumentando potencialmente a eficiência da produção de fermentação, se necessário.

Consequentemente, esta invenção inclui uma goma de diutana demonstrando uma melhora em um número de diferentes medições de viscosidade. Dentre estas estão: i) uma viscosidade intrínseca maior do que 150, preferivelmente maior do que 155, mais preferivelmente maior do que 160 dL/g; ii) uma viscosidade em 3 rpm em água do mar maior do que 35, preferivelmente maior do que 37, mais preferivelmente maior do que 40, e o mais preferivelmente maior do que 42 na leitura do compensador; iii) viscosidade em 0,3 rpm em água do mar maior do que 35.000, preferivelmente maior do que 39.000, more preferivelmente maior do que 40.000, e o mais preferivelmente maior do que 41.000 centipoises (cP); e a PEG viscosidade de taxa de cisalhamento baixa maior do que 3500, preferivelmente maior do que 3700, mais preferivelmente maior do que 3900, e o mais preferivelmente maior do que 4.000 cP. Também, esta invenção engloba um método para produzir uma goma de diutana, como definido em qualquer um dos termos acima, através da introdução de um agrupamento específico de genes em um organismo de Sphingomonas hospedeiro e permitindo a fermentação de referido organismo para produzir uma goma de diutana resultante. Além disso, esta invenção engloba as seqüências de DNA específicas e qualquer vetor (como um plasmídeo) para prover cópias múltiplas dos genes ou expressão aumentada de genes pelo uso de um promotor mais forte, e outros. Além disso, é englobada a cepa geneticamente modificada de Sphingomonas contendo cópias múltiplas de genes biossintéticos de diutana definidos pelas seqüências de DNA isoladas únicas também.

Verificou-se que uma seqüência de DNA isolada única requer pelo menos uma enzima biossintética de diutana sendo uma DpsG polimerase. Em uma outra forma de realização possível, a enzima biossintética de diutana irá incluir uma DpsG polimerase e a glicose-1-fosfato timidililtransferase; uma dTDP-6-deoxi-D-glicose-3-5-epimerase; uma dTDP-D- glicose-4,6desidratase; e a dTDP-6-deoxi-L-manose-desidrogenase. Em ainda outra forma de realização possível, esta enzima biossintética de diutana irá incluir uma DpsG polimerase e uma ramnosil transferase IV; uma beta-1,4glucuronosil transferase II; uma glucosil isoprenil fosfato transferase I; e um glucosil transferase III. Em ainda outra forma de realização possível, esta a enzima biossintética de diutana compreende uma dpsG polimerase e proteínas de exportação de polissacarídeo dpsD, dpsC, e dpsE. Em ainda outra forma de realização possível, esta enzima biossintética de diutana irá incluir uma ramnosil transferase TV; uma beta-l,4-glucuronosil transferase II; uma glucosil isoprenil fosfato transferase I; glucosil transferase III; uma glicose-1fosfato timidililtransferase; uma dTDP-6-deoxi-D-glicose-3-5-epimerase; uma dTDP-D-glicose-4,6-desidratase; e a dTDP-6-deoxi-L-manose-desidrogenase. Geralmente, a enzima biossintética de diutana do método da invenção e dentro do produto da invenção pode ser selecionada dentre o grupo consistindo de polimerase; liase; ramnosil transferase IV; beta-1,4glucuronosil transferase II; glucosil transferase III; proteína de exportação de polissacarídeo; proteína de secreção; glucosil-isoprenilfosfato transferase I; glicose-1-fosfato timidililtransferase; dTDP-6- deoxi-D-glicose-3-5epimerase; dTDP-D-glicose-4,6-desidratase; dTDP-6-deoxi-L-manosedesidrogenase e combinações dos mesmos. Ainda englobados nesta invenção então é uma molécula de ácido nucleico isolada (além do DNA que pode estar presente no cromossomo alvo) que codifica pelo menos uma enzima biossintética de diutana biossintética como mostrado nas SEQ IDs NOs: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, TI, 29, 31, 33, 35. 37, 39, 41, e 43, ou uma enzima que é pelo menos 95 % idêntica às SEQ IDs NOs: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35. 37, 39, 41, e 43.

O método da invenção (bem como os produtos feitos através do mesmo) refere-se assim a gomas de esfingana, particularmente dos tipos diutana, incluindo sem limitação S88, S60 e S657.

Como notado acima, a presente invenção é a culminação do desenvolvimento e realização que as seqüências de DNA específicas, que são introduzidas em cópias múltiplas em determinadas cepas de Sphingomonas, podem prover uma produção biossintética aumentada de polissacarideo de diutana de viscosidade elevada. As bactérias engenheiradas contendo tais genes para a produção aumentada produzem quantidades significativamente maiores de polissacarideo de diutana comparadas a bactérias não engenheiradas e criam as propriedades de viscosidade elevada resultantes acima mencionadas.

As seqüências de DNA, que são introduzidas no organismo hospedeiro (em qualquer forma conhecida, como, novamente, um exemplo não limitante, um plasmídeo) para gerar as propriedades de viscosidade aumentada e produção aumentada acima mencionadas (através do que se acredita, sem se basear em qualquer teoria científica específica, um aumento nas propriedades de faixa de peso molecular) de acordo com a presente invenção podem ser isoladas, recuperadas e clonadas por técnicas que estão prontamente disponíveis na técnica. Após isto, o DNA é liberado em bactérias do gênero Sphingomonas em cópias múltiplas (via plasmídeo, outro modo conhecido) ou expressão aumentada dos genes via, por exemplo, um promotor mais forte apropriado. Após inserção nas bactérias alvo, a produção de diutana pode ser determinada fermentando as bactérias engenheiradas e comparando o rendimento em termos da quantidade produzida e qualidade produzida. A produção aumentada e os aumentos em viscosidade podem, ambos, ser determinados comparando a produção de diutana via o método da invenção em comparação com a cepa produzindo diutana do tipo selvagem (ATCC 53159).

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 é uma representação diagramática dos genes isolados para biossíntese de goma de diutana. Genes putativos ou conhecidos são indicados. Os segmentos inseridos em diferentes plasmídeos também são indicados.

A figura 2 é uma representação gráfica das melhoras em medições da viscosidade intrínseca obtidas por tais materiais de biogoma de diutana da invenção.

Descrição Detalhada da Invenção

Os seguintes termos poderão ser usados por todo o relatório em conexão com a presente invenção e têm o seguinte significado:

O termo “ Sphingomonas” é usado em todo relatório para referir-se a cepas de bactérias gram-negativas do gênero Sphingomonas.

O termo “produtor aumentado” ou “produção aumentada” é usado em todo relatório para descrever bactérias engenheiradas contendo cópias múltiplas de seqüências de DNA da mesma cepa que produz significativamente mais polissacarideo de diutana (pelo menos cerca de 5% mais em uma base de peso por peso) comparadas a bactérias do tipo selvagem da mesma cepa.

O termo “isolado” é usado para descrever DNA que foi removido de um microorganismo e submetido a pelo menos algum grau de purificação, isto é, uma ou mais etapas de purificação, e que pode ser clivado ou cortado por enzimas de restrição, clonado em cópias múltiplas ou inserido em vetores de plasmídeo ou de outro modo inserido ou incorporado em bactérias.

O termo “seqüência” é usado para descrever um segmento específico de DNA que é identificado por suas unidades de nucleotídeos. O termo “inserido” é usado em todo relatório para descrever o processo e resultado de transferir segmentos de DNA isolados do DNA cromossômico de uma cepa de Sphingomonas produzindo diutana na cepa de Sphingomonas (via um plasmídeo, como um exemplo não limitante). O DNA isolado pode ser introduzido primeiro, novamente como uma possibilidade não limitante, no plasmídeo desejado (aqui pLAFR3), por técnicas bem conhecidas na arte, e então transferido, por exemplo, por conjugação ou mobilização em uma bactérias Sphingomonas recipiente. Após inserção em uma bactéria Sphingomonas recipiente, o plasmídeo contendo a seqüência de DNA relevante irá replicar na célula recipiente para dar várias cópias (pelo menos duas e geralmente 4-10) do segmento de DNA necessário para a produção aumentada de polissacarídeo de diutana de viscosidade elevada (novamente, acredita-se estar na faixa de peso molecular alto). O uso de conjugação ou mobilização para transferir os vetores de plasmídeo em bactérias recipientes é geralmente efetivo. Eletroporação ou transformação química de células competentes com DNA purificado também pode ser usada. Outros vetores ou bacteriófagos podem ser usados para transferir DNA na célula hospedeira. Manter os segmentos de DNA em plasmídeos (ou outros vetores de liberação bem conhecidos) no recipiente Sphingomonas produzindo diutana não é necessário. E rotina introduzir cópias adicionais de um segmento de DNA no cromossomo bacteriano de modo que os segmentos são replicados em cada geração pelo mesmo mecanismo que replica o DNA bacteriano. Além disso, a expressão aumentada dos genes pode ser obtida usando elementos de promotores mais fortes.

O termo “amplificação de genes” é usado para referir-se tanto a cópias aumentadas de genes, por exemplo, clonando-se os genes alvo em um plasmídeo de cópias múltiplas (como de 4 a 10 cópias) como inserção de cópias múltiplas (como de 4 a 10) dos genes no genoma bacteriano, ou, altemativamente, expressão aumentada de genes por modificação dos elementos de promotores para aumentar a expressão de genes. Ambos estes métodos e outros podem resultar em quantidades aumentadas das proteínas codificadas.

O termo “biossíntese” é usado em todo relatório para descrever a produção biológica ou síntese de diutana por bactérias Sphingomonas. Polissacarídeo de diutana é sintetizado de unidades de carboidratos individuais em uma série de etapas controladas por um grande número de enzimas das bactérias.

A seqüência de DNA relevante que é incorporada nas bactérias recipientes em qualquer forma selecionada (como novamente, preferivelmente mas não necessariamente, na forma de plasmídeo) codifica informação genética são benéficas ou essenciais, como se sabe, para a biossíntese de polissacarídeo de diutana de produção aumentada e peso molecular aumentado. Além disso, no entanto, acredita-se que a seqüência de DNA particular da invenção (como no plasmídeo pS8) sem se basear em uma teoria científica específica, induz não apenas a produção aumentada, mas também um aumento no número de unidades de repetição polimerizadas nos polímeros individuais da diutana propriamente dita. Como um resultado, acredita-se que tal aumento nas unidades de repetição produz as propriedades de viscosidade elevada resultantes providas surpreendentemente pela goma de diutana. Concluiu-se, por hipótese, que um aumento no peso molecular devido a aumentos medidos na viscosidade intrínseca está relacionado ao peso molecular por uma potente relação de lei. Para um polímero linear (semelhante a goma de diutana), sabe-se, assim, que a viscosidade intrínseca é essencialmente proporcional ao peso molecular neste aspecto.

O isolamento de seqüências de DNA relevantes que são a base deste método inventivo e que geram o polissacarídeo de diutana de viscosidade aumentada é realizado via técnicas e métodos padrões. Estas seqüências podem assim ser geradas a partir de uma cepa de Sphingomonas produzindo diutana que foi cultivada usando procedimentos padrões. A extração de DNA pode então ser realizada, por exemplo, através de centrifugação inicial e re-colocação em suspensão de células bacterianas e então subseqüente eluição do DNA através de colunas de purificação. Após a purificação estar concluída, o DNA isolado pode ser digerido com endonucleases de restrição e clonado no plasmídeo desejado ou outro vetor de liberação e subseqüentemente transferido para uma cepa recipiente. Outras técnicas como conhecidas na arte podem ser usadas sem limitação.

A clonagem de DNA na presente invenção baseia-se em técnicas e métodos gerais que se tomaram padrões na técnica. Nota-s que qualquer número de métodos pode ser usado para clonar segmentos de DNA de acordo com a presente invenção e a presente invenção não está limitada, por exemplo, ao uso de vetores de clonagem de plasmídeo. Por exemplo, os fragmentos de DNA podem ser clonados por inserção em um vetor de bacteriófago.

As sequências de DNA clonadas podem ser então introduzidas em uma cepa de Sphingomonas via um plasmídeo ou outro vetor de liberação. A cepa de Sphingomonas geneticamente modificada pode então ser usada para produzir diutana por fermentação. Basicamente, um meio apropriado para fermentação em um meio aquoso que geralmente contém uma fonte de carbono como, por exemplo, carboidratos incluindo glicose, lactose, sacarose, maltose ou maltodextrinas, uma fonte de nitrogênio como, por exemplo, amônio inorgânico, nitrato inorgânico, aminoácidos orgânicos ou materiais proteináceos como levedura hidrolisada, farinha de soja ou caseína, solúveis destiladores ou licor de infusão de milho, e sais inorgânicos. Uma ampla variedade de meios de fermentação suportará a produção de diutanas de acordo com a presente invenção.

Os carboidratos podem ser incluídos no caldo de fermentação em quantidades variadas, mas geralmente entre cerca de 1 e 10% em peso (preferivelmente 2-8%) do meio de fermentação. Os carboidratos podem ser adicionados antes da fermentação ou, altemativamente, durante a fermentação. A quantidade de nitrogênio pode estar na faixa de cerca de 0,01% a cerca de 0,4% em peso do meio aquoso. Uma fonte de carbono única ou fonte de nitrogênio pode ser usada, bem como misturas destas fontes. Dentre os sais inorgânicos que encontram uso nas bactérias Sphingomonas em fermentação estão sais que contêm sódio, potássio, amônio, nitrato, cálcio, fosfato, sulfato, cloreto, carbonato e íons similares. Metais traço como magnésio, manganês, cobalto, ferro, zinco, cobre, molibdênio, iodeto e borato também podem ser vantajosamente incluídos.

A fermentação pode ser realizada em temperaturas entre cerca de 25° e 40°C, com uma faixa de temperatura de cerca de 27° e 35°C preferida. O inóculo pode ser preparado por métodos padrão de volume escalonado, incluindo culturas em frascos de agitação e fermentação agitada submersa em pequena escala. O meio para preparar o inóculo pode ser igual ao meio de produção ou pode ser qualquer um de vários meios padrão bem conhecidos na arte, como caldo Luria ou meio YM. Mais do que um estágio de semente pode ser usado para obter o volume desejado para inoculação. Os volumes de inoculação típicos estão na faixa de cerca de 0,5% a cerca de 10% do volume de fermentação final total.

O vaso de fermentação pode conter um agitador para agitar os conteúdos. O vaso também pode ter controles de formação de espuma e de pH automáticos. O meio de produção pode ser adicionado ao vaso e esterilizado no lugar por aquecimento. Além disso, a fonte de carboidrato ou de carbono pode ser esterilizada separadamente antes da adição. Uma cultura de semente previamente cultivada pode ser adicionada ao meio resfriado (geralmente, na temperatura de fermentação de cerca de 27°C a cerca de 3 5 °C) e a cultura agitada pode ser fermentada durante cerca de 48 a cerca de 110 horas, produzindo um caldo de viscosidade elevada. O polissacarideo de diutana pode ser recuperado do caldo pelo método de precipitação padrão com um álcool, geralmente isopropanol.

Formas de realização preferidas da invenção incluindo descrições detalhadas dos desenhos

Os seguintes exemplos são providos para ilustrar a presente invenção. A descrição dos exemplos não deve ser interpretada de modo errôneo para limitar o escopo da presente invenção de algum modo.

Isolamento de seqüências de DNA/Produção de plasmídeos

Para experimentar o isolamento inicial e determinar a seqüência apropriada para os resultados da invenção previamente descrita, uma biblioteca do organismo ATCC 53159 foi construída como a seguir: DNA cromossômico foi isolado de Sphingomonas sp. ATCC 53159 e parcialmente digerido com endonuclease de restrição SazóAL Os fragmentos de DNA na faixa de 15 a 50 kb foram purificados de um gel agarose e ligados em vetor de clonagem de cosmídeo PLAFR3 digerido por JtamHI (de acordo com Staskawicz, et al, Molecular characterization of cloned avirulence genes from race 0 e race 1 of Pseudomonas syrinae pv. Glycinea, J. Bacteriology. 1987. 169: 5789-94), isolado de Eschericia coli cepa JZ279 (de Harding, et al., Genetic and physical analysis of a cluster of genes essential for xanthan gum biosynthesis in Xanthomonas campestris, J. Bacteriology. 1987. 169: 2854-61). As reações de ligação foram envelopadas em partículas de fago λ (usando extrato de envelopar de tipo Gigapack III Gold, de Stratagene, La Jolla, CA) e transfectadas em células de E. coli DH5aMCR Library Efficiency (Life Technologies, Rockville, MD). Aproximadamente 10.000 colônias resistentes a tetraciclina foram reunidas para formar a biblioteca de genes. Desta biblioteca, seqüências individuais foram então isoladas. O trabalho realizado neste caso envolveu o isolamento de genes específicos para biossíntese de polissarídeos do organismo Sphingomonas ATCC 53159.

Estes genes para biossíntese de polissacarídeos são tipicamente identificados por complementação de mutantes defeituosos em síntese de polissacarídeos, particularmente os bloqueados na primeira etapa, glicosil transferase I. Uma vez que inicialmente nenhum mutante defeituoso de ATCC 53159 de transferase I estava disponível, a complementação de mutantes defeituosos de Sphingomonas elodea e Xanthomonas campestris de transferase I foi utilizada para identificar os genes para biossíntese de polissacarídeo de diutana. O plasmídeo pLAFR3 pode ser transferido de seu hospedeiro E. coli para outra bactéria gram-negativa por conjugação triparental usando um plasmídeo auxiliar que fornece funções de transferência de IncP ((de acordo com Ditta, et al., Broad host range DNA cloning system for gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti, Proc. Natl. Acad. Sci. 1980. 77:7347-51.). Plasmídeos do tipo RK2 têm um número de cópias estimado em E. coli de cinco a sete por cromossoma (Figurski et al., Suppression of CoIEl replication properties by the Inc P-I plasmid RK2 in hybrid plasmids constructed in vitro, J. Mol. Biol. 1979 133: 295-318.).

A biblioteca de genes de DNA cromossômico ATCC 53159 em E. coli foi transferida em um mutante não mucóide (GPS2) de S. elodea ATCC 31461, por conjugação triparental, selecionando para resistência a tetraciclina e estreptomicina. O plasmídeo auxiliar usado foi pRK2013 (na cepa JZ279 de E. coli), que contém uma origem de replicação na faixa estreita de hospedeiro, mas demonstra funções de trans-atuação necessárias para mobilizar pLAFR3. O plasmídeo pRK2013 não foi replicado em cepas de Sphingomonas. S. elodea ATCC 31461 produz o gelano de polissacarídeo. Tanto o gelano como os polissacarídeos de diutana têm a mesma unidade de repetição de tetrassacarídeo, compreendida de [-»4)-a-L-ramnose-(l-»3)-p-D-glicose-(l->4)-3-D-ácido glucurônico- (l->4)-3-D-glicose-(l-»]. Diutana, no entanto, também inclui uma cadeia lateral compreendida de duas moléculas de ramnose fixadas a um dos resíduos de glicose, e é modificada por acetila, enquanto gelano não tem nenhum açúcar na cadeia e é modificado com acetila e glicerila. O mutante GPS2 é defeituoso na primeira etapa da biossíntese de polissacarídeo. Isto é, a transferência de glicose-1-fosfato de UDP-D-glicose para o veículo lipídeo fosfato pela enzima glucosil transferase I. Das placas de seleção de tetraciclina, colônias (mucóides) produzindo polissacarídeo foram isoladas de um antecedente de colônias não mucóides. Os clones restaurando a produção de polissacarídeos provavelmente continham o gene ATCC 53159 codificando glucosil transferase I mais aproximadamente 20-25 kb de DNA adjacente. O DNA do plasmídeo foi isolado de oito trans-conjugadores de GPS2 mucóides e transferido para a cepa DH5cc de E. coli (Life Technologies) por eletroporação. Os plasmídeos foram isolados de E. coli para obter DNA suficiente para digestão dupla com endonucleases de restrição //zritZIII/EcoRI (que cortam qualquer lado do sítio de endonuclease de restrição no poli-ligador), para excisar o DNA do inserto do vetor. Os tamanhos do DNA do inserto nos clones foram determinados por eletroforese de gel. As seqüências terminais de vários plasmídeos foram determinadas seqüenciando iniciadores específicos em seqüências de plasmídeos flanqueando o sítio ZLzmHI do vetor. As seqüências foram analisadas por comparação a seqüências em bases de dados de computador usando BLASTX. Dois destes plasmídeos, pS8 e pS6, são apresentados na figura 1. Similarmente, a biblioteca de genes ATCC 53159 foi transferida em um mutante de X campes íris não mucóide resistente a rifampicina, defeituoso em transferase I (CXC109) (como na referência de Harding et al. indicada acima) através de conjugação triparental, selecionando resistência a tetraciclina e rifampicina. X. campestris produz polissacarídeo de xantano, cuja síntese também é iniciada por transferência de glicose-1-fosfato de UDP-D-glicose para o veículo lipídeo bactoprenil fosfato pela enzima transferase I (lelpi et al., “Sequential assembly and polimerization of the polyprenol-linked pentasaccharide repeating unit of the xanthan polysaccharide in Xanthomonas campestris, J. Bacteriology. 1993. 175: 2490500). Os plasmídeos foram purificados de trans-conjugador nas seqüências terminais determinadas como descrito acima. Dois destes plasmídeos, pX6 e pX4, são apresentados na figura 1.

O DNA S657 clonado nos plasmídeos pS8 e pX6 foi completamente seqüenciado por seqüenciamento de disparo de filamento duplo em Lark Technologies Inc., (Houston, TX). Estas seqüências foram analisadas para identificar os genes para biossíntese de diutana (apresentados na figura 1). As funções dos genes foram designadas com base em homologia a outros genes em bases de dados, em particular aos genes publicados para biossíntese de esfingana S-88 (como na patente ‘516 para Pollock et al. acima mencionada), número de acesso GenBank U51197 e gelano (GenBank AY 17008 e AY220099). Os genes foram identificados (figura 1) que codificaram as transferases para os quatro açúcares da estrutura dorsal e quatro genes para síntese de dTDP-ramnose. Os genes para secreção de polissarídeos foram baseados em homologia a genes para biossíntese de outros polissacarídeos. Dois genes codificam proteínas homólogas a proteínas envolvidas na secreção de proteína. Dois genes codificam putativamente uma polimerase e uma liase. O inserto no plasmídeo pX6 continha 17 genes incluindo o gene dpsB codificando transferase I (que inicia a primeira etapa na síntese de diutana), genes para secreção e quatro genes para síntese de dTDP-ramnose, mas faltam os genes para transferases II, III e IV e os genes putativos para polimerase e liase. O plasmídeo pS8 contém 20 genes do agrupamento de genes dps, incluindo genes para todos as quatro transferases de açúcar da estrutura dorsal, os quatro genes para síntese de dTDP-ramnose, e genes para secreção de polissacarideo, incluindo os genes putativos para polimerase e liase, mas faltam os genes de função desconhecida, orfó e orf7. O plasmídeo pS6 contém genes para secreção e as quatro transferases de açúcar mas não têm todos os genes para síntese de dTDP-ramnose ou o gene para polimerase. O plasmídeo pX4 contém somente uma pequena parte da região de dps mas inclui o gene codificando transferase I e os quatro genes para síntese de dTDP-ramnose que foram descritos por Pollock et al como sendo suficiente para resultar em um aumento na produção de polissacarideo nas cepas de Sphingomonas.

Produção das Cepas

Os quatro plasmídeos descritos acima foram então introduzidos na cepa ATCC No. 53159 de Sphingomonas por conjugação triparental, como descrito acima, para formar as novas cepas engenheiradas

S657 (S657/pS8, S657/pS6, S657/pX6 e S657/pX4. A fermentação foi seguida, como descrito acima, a seguir a fim de produzir um material de biogoma como indicado acima. Todos os quatro plasmídeos tiveram um efeito benéfico sobre a produtividade de diutana; no entanto o plasmídeo pS8, 5 surpreendentemente, também ocasionou aumentos extremamente elevados em viscosidade de diutana, e aumento no peso molecular. A seqüência de DNA de pS8 (26278 BPS) (seqüência No. 1 de DNA) é provida e os genes codificados são listados na tabela 1 abaixo, e na forma de diagrama na figura

1. O DNA do inserto no plasmídeo pS8 inclui genes dpsG através de rmTD e 10 uma porção de genes dpsS e orf7.

A seguinte tabela de genes é basicamente uma lista dos genes representados pela seqüência de DNA para inserto no plasmídeo pS8 como provido na figura 1.

TABELA 1

Genes em inserto de plasmídeo pS8

Partida	Término	Nome	Descrição
2*	1054	dpsS	homólogo a gelS (parcial)
2738	1113 C	dpsG	polimerase putativa
4895	2898 C	dpsR	Liase putativa
5093	6031	dpsQ	ramnosil transferase IV putativa
7082	6111 C	dpsl	desconhecido
7121	8167	dpsK	beta-l,4-glucuronosil transferase II
8164	9030	dpsL	glucosil transferase III
10467	9079 C	dpsJ	desconhecido
11076	12374	dpsF	desconhecido
12389	13306	dpsD	proteína de exportação polissacarideo putativa
13341	14687	dpsC	proteína de exportação polissacarideo putativa
14687	15394	dpsE	proteína de exportação polissacarideo putativa
15405	16286	dpsM	proteína de exportação polissacarideo putativa
16270	16968	dpsN	proteína de exportação polissacarideo putativa
18454	17060C	atrD	proteína de secreção putativa
20637	18451 C	atrB	proteína de secreção putativa
21229	22641	dpsB	glucosil-isoprenilfosfato transferase I
22757	23635	rmlA	glicose-1 -fosfato timidililtransferase
23632	24198	rmlC	dTDP-6-desoxi-D- glicose-3-5-epimerase
24202	25263	rmlB	dTDP-D- glicose-4,6-desidratase
25263	26129	rmlD	dTDP-6-deoxi-L-manose-desidrogenase
26277*	26146C	orf7	função desconhecida(parcial)

*Primeiro códon em armação, o códon de partida não está presente

Produção de diutana

Produção de diutana por cepas engenheiradas de Sphingomonas S657 contendo plasmídeo comparada com a cepa tipo selvagem S657 sem um plasmídeo foi determinada em três conjuntos de ciclos de fermentação no mesmo meio líquido em fermentadores Applikon 20L, com agitação e aeração. Para as cepas contendo plasmídeo, o antibiótico tetraciclina a 5 mg/L foi adicionado em toda a fermentação para assegura a retenção do plasmídeo. KOH foi adicionado como necessário para controlar o pH. Dois estágios de semente foram usados com 1% a 6% transferências de inoculo. Os meios usados para fermentação continham xarope de milho como fonte de carboidrato, uma fonte de nitrogênio assimilável e sais. Nutrientes que podem ser usados para fermentação são bem conhecidos na arte e incluem um carboidrato, por exemplo, glicose, sacarose, maltose ou maltodextrinas, uma fonte de nitrogênio, por exemplo, nitrogênio inorgânico como amônio ou nitrato, nitrogênio orgânico como aminoácidos, extrato de levedura hidrolisado, proteína de soja, ou licor de milho, e sais adicionais contendo, por exemplo, cloreto, fosfato, sulfato, cálcio, cobre, ferro, magnésio, potássio, sódio, ou zinco.

Como uma medida da produção de diutana resultante, viscosidade do caldo e fibras precipitadas foram determinadas. A viscosidade dos caldos de fermentação foi medida via um ciclo no viscosímetro Brookfield a 60 rpm com um fíiso #4, e os resultados são mostrados na tabela

2. No final da fermentação, os caldos foram tratados com a introdução bem conhecida de enzima glucoamilase para hidrolisar quaisquer oligossacarídeos restantes do xarope de milho. As gomas de diutana produzidas foram então precipitadas a partir de uma alíquota de caldo com dois volumes de álcool isopropílico. As fibras foram coletadas em um filtro e secadas. Na tabela 2, o termo DWY significa os rendimentos de peso seco precipitável total de biogomas após a hidrólise de oligossacarídeos em excesso dos xaropes de milho.

Claramente, o material resultante está em um rendimento maior com plasmídeos pX4, pX6, pS6 ou pS8 transportando cópias adicionais de genes para biossíntese de diutana presente ai. No entanto, com o plasmídeo 5 pS8, se notou um aumento elevado inesperado na viscosidade do caldo com relação ao aumento do rendimento de peso seco indicando que algum fator, além da quantidade aumentada de diutana produzida, estava afetando a viscosidade.

TABELA 2 _____________________Fermentação de cepas contendo plasmídeo_____________________ _____________________DWY_____________________ %

Cepa	Ciclo #1	Ciclo #2	Ciclo #3	média	Aumento
S657	34,3	32,2	33,9	33,5	—
S657/pS8	37,1	35,4	35,9	36,1	8,0%
S657/pX6	38,4	37,6	33,5	36,5	9,1%

S657/pS6 37,6 12,3%

S657/pX4 36,4 8,8%

Viscosidade do caldo

Cepa	Ciclo #1	Ciclo #2	Ciclo #3	média	% Aumento
S657	5150	4950	5550	5217	.—
S657/pS8	6650	6850	6850	6783	30,0%
S657/pX6	5400	6250	5125	5592	7,2%
S657/pS6			6675		28,0%
S657/pX4			5525		5,9

Claramente, notou-se um rendimento maior de material resultante com qualquer um dos quatro plasmídeos presentes ai, enquanto os plasmídeos pS8 e pS6 permitiram um aumento altamente inesperado na viscosidade do caldo, indicando assim uma qualidade de produto elevada também. A qualidade, isto é, a viscosidade, dos produtos de goma de diutana 15 resultantes foi então determinada.

Reologia de diutana em testes de aplicações

Estas amostras de goma de diutana foram então analisadas em termos usos benéficos em potencial dentro de duas áreas diferentes: aditivos para campos de petróleo para recuperação de óleo e aditivos para cimentos para a retenção de água e pega rápida.

A indústria de campos de petróleo se baixa no que é chamado teste de viscosidade da água do mar (SWV) como uma estimativa do desempenho aceitável para gomas para a recuperação de óleo. Este teste é basicamente um indicador da eficácia de uma goma para aumentar a viscosidade em condições muito salubres da água (para replicar a recuperação de leitos do mar, por exemplo).

A previsão da viabilidade de uma goma resultante como um modificador de viscosidade apropriado para fins de recuperação de óleo é geralmente aceita em termos de modificação de viscosidade de uma formulação de água do mar de tese. Esta formulação de água do mar sintética é produzida por mistura de 419,53 gramas de sal marinho (ASTM D-l 141-52) em 9800 gramas de água deionizada. Para o testes de viscosidade de água do mar, 0,86 grama da goma de amostra é adicionado a 307,0 g. A água do mar sintética é misturado a aproximadamente 11.500 rpm em um multimisturador Farm (modelo 9B5, número de peça N5020) durante 35 minutos. No final de 35 minutos, a solução é resfriada a aproximadamente 26°C antes da viscosidade ser medida. Para a leitura de 3 rpm, a amostra é colocada na plataforma de amostra Fann (Fann modelo 3 5A; mola de torção MOC 34/35 F0.2b; Bob Bl; rotor Rl) e a velocidade é ajustada a 3 rpm girando o motor em baixa velocidade e fixando a alavanca de câmbio na posição do meio. A leitura é então deixada estabilizar e o valor de estresse sob cisalhamento é lido do compensador e registrado como a leitura do compensador de 3 rpm SWV (DR). Para a leitura de 0,3 rpm, um viscosímetro de Brookfield é usado (Brookfield LV DV-II ou viscosímetro DV-II, com fuso LV-2C) para medir a viscosidade. A velocidade do fuso é fixada em 0,3 rpm e o fuso é deixado girar pelo menos 6 minutos antes da viscosidade ser registrada como a leitura SWV- 0,3 rpm e expressada em centipoises (cP). Para aplicações em cimento, o teste PEG LSRV (uma viscosidade de taxa de cisalhamento lenta usando etileno glicol como dispersante como descrito abaixo) provê uma indicação quanto à eficácia de desempenho de um modifícador de viscosidade para esta indústria. Este teste mede a viscosidade de uma solução a 0,25% de biogoma em uma água de bica padrão (STW). STW é preparada por adicionar 10,0 gramas de NaCl e 1,47 gramas de CaCl₂• 2H₂O a 10 litros de água deionizada. Para a viscosidade medida, 0,75 gramas de biogoma é adicionado a 4,5 gramas de polietileno glicol 200 (CAS 25322-68-3) em um béquer de 400 mL e completamente dispersa. Então, 299 gramas de STW são adicionados ao béquer e misturados durante aproximadamente 4 horas usando um agitador de tipo propulsor, de passo pequeno, a 800 ± 20 rmp. Após o tempo de mistura de 4 h, o béquer é colocado em um banho de água a 25 °C e deixado assentar sem perturbar durante aproximadamente 30 minutos. A viscosidade é então medida usando um viscosímetro de Brookfield LV equipado coma mola de torque 2,5+ (ou instrumento equivalente como modelo D VE 2.5+) a 3 rpm usando o fuso LV 1 após deixar o fuso girar durante 3 min e expressado em centipoises (cP).

As amostras de diutana produzidas acima foram testadas neste modo; os resultados foram como a seguir:

TABELA 3

Reologia de diutana de cepas contendo plasmídeo

Cepa	SWV 3 rpm DR	SWV-0,3 rpm cP	PEG LSRV cP
Ciclo #1	Ciclo #2	Ciclo #3	Ciclo #1	Ciclo #2	Ciclo #1	Ciclo #2	Ciclo #3
S657 tipo selvagem	25	26	22	24400	28600	2820	3150	2280
S657/pS8	42	43	47	41500	38800	4720	4980	4920
S657/pX6	25	29	26	25000	29100	2860	3400	3270
S657/pS6	—	—	22	—	—	—	—	2270
S657/pX4	---	—	24,5	—	—	—	—	2950

SWV - viscosidade em água do mar

LSRV = viscosidade de taxa de cisalhamento baixa

Inesperadamente, existem aumentos definidos em viscosidade demonstrados pelas gomas de diutana da invenção produzidas por algumas das células contendo plasmídeo engenheirado. Mais surpreendentemente, no entanto, é que o aumento na viscosidade para SWV a 3 rpm para a cepa pS8 é 80%, enquanto na mesma análise feita para a cepa pX6 é de apenas 9,6% com relação aos resultados do tipo selvagem. Plasmídeos pS6 e pX4 não tem um aumento significante. Do mesmo modo, o teste de rpm SWV menor revela um aumento de 51,5% sobre o tipo selvagem para o tipo pS8 versus apenas acima de 2% para o pX6. Finalmente, o teste LSRV com polietileno glicol mostrou que os resultados de pS8 estavam em excesso de 77% do aumento de viscosidade com relação à goma de tipo selvagem, como comparado com menos que 16% de aumento para a diutana pX6, e 7,2% de aumento para pX4 e nenhum aumento significante para plasmídeo pS6. Novamente, os resultados altamente inesperados nestes termos mostram as melhoras drásticas obtidas com a produção de goma de diutana via a utilização da sequência genética necessária exemplificada dentro do plasmídeo pS8, como um modo de introduzir esta seqüência dentro de uma bactéria produzindo diutana alvo.

Assim, a diutana inventiva produzida via a introdução de pS8 demonstrou medidas de viscosidade surpreendentemente aumentadas em todas as três contagens, particularmente como comparado com as variedades produzidas por plasmídeo de tipo selvagem e pX6. Assim, foi esperado que uma nova diutana poderia funcionar extremamente bem sob condições típicas de campos de petróleo e aplicações de cimento.

Explicação fundamental para melhora de reologia

Os exemplos anteriores demonstraram que diutana da cepa S657/pS8 mostrou um aumento significante nos parâmetros reológicos. Este aumento substancial nas medidas de viscosidade de água do mar e de taxa de cisalhamento baixa PEG não pode ser, assim, atribuído ao aumento na produtividade apenas, porque a cepa pX6 também demonstrou resultados de rendimento similares, se não maiores. De fato, no exemplo anterior ilustrado pela tabela 2, os rendimentos de peso seco (material precipitável por álcool) aumentaram em 8,0%, enquanto os parâmetros reológicos aumentar significantemente mais para a cepa S657/pS8 (52-80%). Um estudo fundamental foi seguido para explicar porque as melhoras reológicas são obtidas com cepa S657/pS8 sobre a cepa de tipo selvagem.

A viscosidade intrínseca é uma técnica bem conhecida na ciência de polímeros para inferir o peso molecular de macromoléculas (C. Tanford, 1961. Physical Chemistry of Macromolecules. John Wiley & Sons, New York). A viscosidade intrínseca é obtida por traçando um gráfico da viscosidade reduzida (viscosidade normalizada para concentração) versus a concentração de solução, e extrapolando a regressão linear dos dados a concentração zero (o intercepto y do gráfico). De modo surpreendente, as gomas resultantes demonstraram aumentos na viscosidade intrínseca como notado abaixo na seguinte tabela.

Cinco amostras de diutana, duas da cepa de tipo selvagem (controle 1, controle 2) e três da cepa S657/pS8 (amostra 1, amostra 2, amostra 3) foram avaliadas para análises de viscosidade intrínseca, açúcares neutros, e ácido orgânico. Estas amostras foram purificadas por precipitação de álcool, re-hidratadas, tratadas com hipoclorito, tratadas com glucoamilase, tratadas com lisozima, e finalmente tratadas com protease (nesta ordem seqüencial). Elas foram então recuperadas a uma relação de CBM: caldo 4:1, secadas e moídas. CBM é uma mistura de álcool isopropílico azeotrópico/água incluindo —82% em peso do álcool isopropílico.

As amostras foram testadas para teor de umidade realizando o seguinte: geralmente, duas alíquotas de 0,7 g de amostra foram testadas usando um equilíbrio de umidade de halogênio Mettler HB 43. Os resultados das duas tentativas foram então tirados em média e estes resultados foram usados para correção de umidade.

Após obter os dados de umidade, uma solução a 0,2% da goma foi preparada em 0,01M de NaCl em uma base corrigida na umidade. Para estas experiências, 200 g no total da solução a 0,2% foram preparados. A goma foi pesada em uma balança analítica na décima milésima parte e adicionada na água pesada na milésima parte mais próxima. As amostras foram agitadas durante duas horas usando um misturador propulsor de 6,35 cm de diâmetro a 1000 rpm em um béquer em forma alta de 400 ml.

Seguindo hidratação inicial, cada amostra foi diluída para 0,02% usando 0,01M de NaCl. Isto foi feito pesando 20 g da solução a 0,2% em um béquer de 400 ml, então adicionando de novo 180 ml do diluente. As amostras diluídas foram misturadas durante um adicional de 30 minutos. As diluições finais ultimamente usadas para determinar a viscosidade intrínseca foram preparadas a partir desta amostra. Cada amostra de diutana foi avaliada como as seguintes concentrações: 0,004%, 0,008%, 0,010%, e 0,012%.

As medidas de viscosidades foram realizadas usando o sistema Vilastic® VE. Antes das medidas, o Vilastic foi calibrado com água a menos de 2,0% de erro. As amostras foram medidas usando o programa Timer @ 2 Hz, uma cepa de 1 e uma taxa de cisalhamento de aproximadamente 12 1/s, todas em uma temperatura constante de 23 °C. Cinco medidas foram feitas para cada amostra e tirada a média. Os dados de viscosidade em média foram então usados para calcular a viscosidade intrínseca. Figura 2 e tabela 4 abaixo provêem os resultados finais destas experiências.

TABELA 4

Comparação de diutana com base em cálculos de viscosidade intrínseca

Amostra de diutana	Sólidos medidos	Viscosidade intrínseca
S657 controle 1	93,76	138,3
S657 controle 2	92,42	143
S657/pS8 amostra 1	91,7	170,7
S657/pS8 amostra 2	91,4	162,2
S657/pS8 amostra 3	91,94	162,8

Estes resultados indicam que a cepa S657/pS8 consistentemente produziu diutana com viscosidade intrínseca significantemente maior, de fato, a viscosidade reduzida média para as cepas inventivas foi de 165,2, enquanto o controle foi de 140,7, todos em níveis de sólidos medidos similares. Esta descoberta indica que a diutana produzida por S657/pS8 é de maior peso molecular do que o controle de tipo selvagem.

Figura 2 é a representação gráfica destas tendências mostrando a viscosidade intrínseca maior consistente medida em teor de sólidos similar entre as cepas de controle e inventiva.

Para determinar se a goma de diutana de viscosidade maior de S657/pS8 tem a mesma composição como diutana da cepa de tipo selvagem, a composição foi determinada por teste para açúcares neutros e ácidos orgânicos. A amostra purificada usada para medidas de viscosidade intrínseca foi usada para análise de açúcar neutro. Uma alíquota de cada amostra purificada foi hidrolisada para açúcares componentes por hidrólise com ácido trifluoroacético (100°C/~18h). Os açúcares neutros hidrolisados foram quantificados por cromatografia de mudança aniônica de desempenho elevado com detecção amperométrica pulsada. Os ácidos orgânicos hidrolisados foram quantificados por cromatografia de exclusão de íon de desempenho elevado com detecção de condutividade quimicamente suprimida. A tabela 5 resume os resultados da análise de açúcar neutro. Como mostrado, o perfil de açúcar neutro para a cepa S657/pS8 é quase idêntico com o perfil de açúcar neutro para a cepa de tipo selvagem S657. Apesar de ambos os resultados serem diferentes dos valores teóricos, estes resultados indicam que a estrutura da unidade de repetição da goma de diutana produzida usando pS8 é igual que a da de tipo selvagem e que qualquer aumento na viscosidade afetado pelo material pS8 é devido a cadeias mais longas, significando maior peso molecular.

TABELA 5

Açúcares neutros e análises de ácido orgânico para cepas de diutana pS8 e de tipo selvagem (controle)

	Cepa	% Ramnose	% Glicose	% Acetato
Amostra 1	S657/pS8	32	19	8,9
Amostra 2	S657/pS8	32	19	8,2
Amostra 3	S657/pS8	32	17	8,6
Controle 1	S657 tipo selvagem	30	18	8,6
Controle 1	S657 tipo selvagem	33	20	8,7
MÉDIA	S657/pS8	32	18,3	8,6
MÉDIA	S657 tipo selvagem	31,5	19	8,65
TEÓRICO	—	46	30	8

A viscosidade de água do mar muito melhorada e a viscosidade de taxa de cisalhamento baixa PEG da diutana produzida pela cepa engenheirada S657/pS8 são assim atribuíveis a um aumento no peso molecular ou comprimento da molécula de diutana, isto é, mais unidades de repetição por molécula e não devido a uma mudança em sua composição e assim não a mudanças na própria estrutura de repetição. Nem pode esta reologia aumentada ser devido apenas a aumento na quantidade de diutana produzida. Apesar de quatro plasmídeos, pS6, pS8, pX4, e pX6, com porções diferentes do agrupamento de genes para biossíntese de diutana clonada, serem avaliados, e todos mostrarem algum aumento em produtividade, somente o plasmídeo pS8 mostrou o aumento inesperado e muito elevado nos parâmetros reológicos do produto de diutana recuperado.

Uma comparação dos genes para biossíntese de diutana clonada nos plasmídeos testados sugere que o gene mais provável de ser responsável pelo aumento no peso molecular é o gene dpsG, porque este gene está presente em pS8 e não nos outros plasmídeos. Gene dpsG codifica uma proteína de membrana hidrofóbica com homologia forte para outras proteínas de membrana envolvidas em síntese de polissacarideo. Uma porção da proteína tem homologia para proteínas para polimerase, uma enzima que catalisa a ligação de unidades de repetição para formar o polissacarideo de peso molecular elevado. O gene gelG homólogo em S60 foi postulado como funcionando como uma polimerase para a síntese de gelano (Harding, N. E. et al. 2004. “Organization of genes required for gellan polysaccharide biosynthesis in Sphingomonas elodea ATCC31461”. J. Ind. Microbiol. Biotech. 31: 70 - 82. Sa-Correia, I. et al. 2002. “Gellan gum biosynthesis in Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461: Genes, enzymes and exopolysaccharide production engineering”. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 29: 170 - 176). Homólogos de dpsG também foram isolados de cepas ATCC 31554 e ATCC 21423 de Sphingomonas produzindo polissacarídeos S88 e S7 (Pollock et al. patente U.S. 5.854.034, 5.985.623 e 6.284.516, e Pollock, T. J. patente U.S. 6.709.845). Assim, é muito provável que as cópias adicionais do gene para polimerase podem ter um efeito no aumento do comprimento molecular da molécula de diutana. Não pode ser regrado que outros genes no agrupamento de genes biossintéticos de diutana podem ser requeridos em combinação com dpsG para obter o aumento observado em viscosidade. Candidatos prováveis podem ser os genes dpsB, dpsL, dpsK e dpsQ codificando açúcar transferases I, II, III, e IV, em particular o gene dpsB que codifica transferase I que adiciona o primeiro açúcar da unidade de repetição para o veículo lipídeo. Outros genes importantes podem ser dpsD, dpsC e dpsE, que são homólogos para genes gumB e gumC que foram demonstrados como aumentando o peso molecular de xantano quando amplificado em um plasmídeo de cópias múltiplas. É possível que todos os genes clonados em plasmídeo pS8 possam ser requeridos para obter o aumento dramático em viscosidade.

Apesar da invenção ter sido descrita e mostrada em conexão com algumas formas de realização preferidas e práticas, não é de nenhum modo pretendido limitar a invenção às formas de realização específicas, ao contrário pretende-se que cubra os equivalentes estruturais e todas as formas de realização alternativas e modificações como podem ser definidos pelo escopo das reivindicações anexas e equivalência às mesmas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Goma de diutana, caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade intrínseca maior do que 150 deciL/g.
2. Goma de diutana de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade intrínseca maior do que 155 deciL/g.
3. Goma de diutana de acordo com a reivindicação 2 caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade intrínseca maior do que 160 deciL/g.
4. Goma de diutana, caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade em 3 rpm em água do mar maior do que leitura de compensador 35.
5. Goma de diutana de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade em 3 rpm em água do mar maior do que leitura de compensador 37.
6. Goma de diutana de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade em 3 rpm em água do mar maior do que 40 na leitura do compensador.
7. Goma de diutana de acordo com a reivindicação 6 caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade em 3 rpm em água do mar maior do que leitura do compensador 42.
8. Goma de diutana, caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade da água do mar 0,3 rpm maior do que 35.000 cp.
9. Goma de diutana de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade em 0,3 rpm em água do mar maior do que 35.000 cp.
10. Goma de diutana de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade em 0,3 rpm em água do mar maior do que 38.000 cp.
11. Goma de diutana de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade em 0,3 rpm em água do mar maior do que 40.000 cp.
12. Goma de diutana de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade em 0,3 rpm em água do mar maior do que 41.000 cp.
13. Goma de diutana, caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade de taxa de cisalhamento baixa na presença de dispersante de polietileno glicol maior do que 3500 cp.
14. Goma de diutana de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade de taxa de cisalhamento baixa na presença de dispersante de polietileno glicol maior do que 3.700 cp.
15. Goma de diutana de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade de taxa de cisalhamento baixa na presença de dispersante de polietileno glicol maior do que 3.900 cp.
16. Goma de diutana de acordo com a reivindicação 15 caracterizada pelo fato de demonstrar uma viscosidade de taxa de cisalhamento baixa na presença de dispersante de polietileno glicol maior do que 4.000 cp.
17. Método para produzir uma goma de diutana, caracterizado pelo fato de compreender:

introduzir uma seqüência de codificação para pelo menos uma enzima biossintética de diutana em uma diutana hospedeira produzindo organismo de Sphingomonas’, cultivar o organismo hospedeiro sob condições de fermentação, pelo que o organismo hospedeiro produz uma goma de diutana que demonstra pelo menos uma das seguintes características:

a) uma viscosidade intrínseca maior do que 150 dL/g;

b) uma viscosidade em 3 rpm em água do mar maior do que leitura de compensador 35;

c) viscosidade em 0,3 rpm em água do mar maior do que 35.000 centipoise; e

d) uma viscosidade de taxa de cisalhamento baixa na presença de dispersante de polietileno glicol maior do que 3500 centipoise.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de pelo menos uma enzima biossintética de diutana é uma DpsG polimerase.
19. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma enzima biossintética de diutana compreende uma DpsG polimerase e uma glucose-1-fosfato timidililtransferase; uma dTDP-6-deoxi-D-glucose-3-5-epimerase; uma dTDP-D-glucose-4,6desidratase; e uma dTDP-6-deoxi-L-manose-desidrogenase.
20. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma enzima biossintética de diutana compreende uma DpsG polimerase e uma ramnosil transferase IV; uma glucosilisoprenilfosfato transferase I; uma beta-l,4-glucuronosil transferase II; e uma glucosil transferase III.
21. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma enzima biossintética de diutana compreende uma DpsG polimerase e proteínas de exportação de polissacarídeo DpsD, DpsC, e DpsE.
22. Método de acordo com a reivindicação 17 caracterizado pelo fato de que pelo menos uma enzima biossintética de diutana compreende uma ramnosil transferase IV; uma beta-l,4-glucuronosil transferase II; glucosil transferase III; uma glucose-1-fosfato timidililtransferase; uma glucosil-isoprenilfosfato transferase I; uma dTDP-6-deoxi-D-glucose-3-5epimerase; uma dTDP-D- glucose-4,6-desidratase; e a dTDP-6-deoxi-L- manose-desidrogenase.
23. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que pelo menos uma enzima biossintética de diutana é selecionada dentre o grupo consistindo de polimerase; liase; ramnosil transferase IV; beta-l,4-glucuronosil transferase II; glucosil transferase III; proteína de exportação de polissacarídeo; proteína de secreção; glucosilisoprenilfosfato transferase I; glucose-1-fosfato timidililtransferase; dTDP-6deoxi-D-glucose-3-5-epimerase; dTDP-D-glucose-4,6- desidratase; dTDP-6deoxi-L-manose-desidrogenase e combinações das mesmas.
24. Método para produzir uma goma de esfingana, que tem um comprimento de polímero médio mais longo, caracterizado pelo fato de compreender:

introduzir uma seqüência de codificação para pelo menos uma enzima esfingana polimerase em uma esfingana hospedeira produzindo um organismo de Sphingomonas', cultivar o organismo hospedeiro sob condições de fermentação, pelo que o organismo hospedeiro produz uma goma de esfingana que tem um comprimento de polímero médio mais longo do que o produzido pelo organismo Sphingomonas antes da introdução da seqüência de codificação.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a goma de esfingana é S88.
26. Método de acordo com a reivindicação 24 caracterizado pelo fato de que a goma de esfingana é S60.
27. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a goma de esfingana é S657.
28. Molécula de ácido nucleico isolado, caracterizada pelo fato de que codifica pelo menos uma pelo menos uma enzima biossintética de diutana como mostrado em SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25,

27, 29, 31, 33, 35. 37, 39, 41, e 43, ou uma enzima que é pelo menos 95 % idêntica a SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35. 37, 39, 41, e 43.
29. Molécula de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que codifica uma diutana polimerase.
30. Molécula de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que codifica uma diutana polimerase e uma proteína de exportação de polissacarídeo.
31. Molécula de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que codifica uma diutana polimerase e uma ramnosil transferase IV; uma glucosil-isoprenilfosfato transferase I; uma beta-l,4-glucuronosil transferase II; e uma glucosil transferase III.
32. Molécula de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que codifica uma diutana polimerase e uma glucose-1-fosfato trinidililtransferase; uma dTDP-6-deoxiD- glucose-3-5-epimerase; uma dTDP-D-glucose-4,6-desidratase; e uma dTDP-6-deoxi-L-manose-desidrogenase.
33. Molécula de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que codifica uma diutana polimerase; liase; ramnosil transferase IV; beta-l,4-glucuronosil transferase II; glucosil transferase III; proteína de exportação de polissacarídeo; proteína de secreção; glucosil-isoprenilfosfato transferase I; glucose-1-fosfato timidililtransferase; dTDP-6- deoxi-D-glucose-3-5-epimerase; dTDP-Dglucose-4,6-desidratase; e dTDP-6-deoxi-L-manose-desidrogenase.
34. Molécula de ácido nucleico isolado de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que compreende a seqüência de ácido nucleico de acordo com a SEQ ID NO: 1.