BRPI0617500A2 - imunoensaio para detecÇço de veneno incluindo uma coleta nço-invasiva de amostra - Google Patents

Abstract

<B>IMUNOENSAIO PARA DETECÇAO DE VENENO INCLUINDO UMA COLETA NçO-INVASIVA DE AMOSTRA.<D>Métodos e imunoensaios para diagnosticar uma mordida ou picada de um organismo venenoso em um paciente tendo sintomas consistentes com tais mordidas ou picada são providos. Uma amostra de veneno é coletada de uma área damordida ou picada suspeita usando um swab e então contatado com um anticorpo que especificainente se liga a um local antigênico no veneno presente na amostra. A ligação é então detectada. A invenção é ilustrada por exemplos mostrando o diagnóstico de mordida de da aranha marrom reclusa, distinguindo-o de outros diagnósticos com os quais é treqüentemente confundido. Este teste extremamente sensível pode detectar antigenos de veneno até aprox. 20 picogramas mesma após a amostra ter sido embarcada e armazenada por períodos de até três semanas durante o verão.

Description

IMUNOENSAIO PARA DETECÇÃO DE VENENO INCLUINDO UMA COLETANÃO-INVASIVA DE AMOSTRA.

Referência cruzada à pedidos relacionados

Este pedido reivindica prioridade ao pedido provisórionorte-americano no. Serial 60/727,300 depositado em 17 deoutubro de 2005, que é incorporado aqui como referência.Histórico

Envenenamentos pela aranha marrom reclusa, Loxoscelesreclusa, são uma fonte significativa de morbidade emregiões endêmicas dos Estados Unidos e diagnósticos falhossão comuns. Uma pesquisa de médicos em áreas endêmicasmostrou a viabilidade econômica de testes de diagnósticosprecisos para estas mordidas de aranha. Um ensaio de venenoLoxosceles ótimo compreende desafios significantes.Diferente da construção de rotina de ensaiosimunoabsorventes de enzimas (ELISAs) dedicados ãidentificação de uma única proteína, este ELISA detecta umaproteína ativa fisiologicamente única - esfingomielinase D(SMD) - abundantemente presente em um veneno contento umamiríade de proteínas em quantidades variantes compropriedades fisiológicas variantes. Algumas destasproteínas se assemelham muito a de outros artrópodes,tornando a reatividade cruzada de proteínas um desafio. Noentanto, o SMD, maior componente do veneno sentido por serresponsável pela necrose dermal nunca foi reportado emqualquer organismo diferente da aranha Loxosceles.

Loxosceles ("de perna comprida oblíqua") reclusa("tímida e reclusa") (Figura 1) e outras espéciespertencentes ao gênero Loxosceles são ocasionalmente causade morbidade e provavelmente causa rara de mortalidade emáreas endêmicas (Figura 2) [SamsOl, Cacy99]. Populaçõesreclusas se tornam esporádicas em qualquer um dos extremosdas faixas de fronteira (De R. Vetter: spiders.ucr.edu comnovos dados em 2002.)

Dados precisos quanto ao número de envenenamentosanuais da marrom reclusa não estão disponíveis. Dadoscoletados de centros de controle de envenenamento em toda anação (Nota do tradutor:[nação americana]) mostram 2.364mordidas da aranha marrom reclusa (BRSB) reportadas em2000, dos quais 582 tiveram uma conseqüência moderadamentesignificante e 21 tiveram uma conseqüência maior.[LitovitzOl]. Estes dados são incompletos e representam umafração de um número total de envenenamentos marrom reclusaprováveis, que podem ser estimados por outros dois métodos.Dados de nossa pesquisa com ;21 médicos de salas deemergências (ER) e 12 médicos não-ER (figura 3) dentro daárea central infestada (Missouri, Kansas, Kentucky,Tennessee, Oklahoma, e Arkansas) mostram uma média de 9,62BRSB prováveis por ano por médico ER. Para esta populaçãode médicos de sala de emergência de 3700, é obtida umaestimativa anual de BRSB de 35.594. Para estas áreasaltamente infestadas, a estimativa de médicos de sala deemergência compreende 0,4% de 7,5 milhões de visitas de ER,ou aproximadamente 30.000 prováveis BRSBs, um totalsimilar. Este total não inclui ^nenhuma visita não-ER, asquais são mais difíceis de estimar, e nenhuma das mordidasda área central infestada. O'·1'- número total de BRSBspossíveis reportado por médicos ER é maior, refletido nonúmero total de kits necessários por ano de 17,7 por médicode ER ou 65.490 testes na área central infestada, ummercado anual de $1,7 milhões em ERs da área centralinfestada.

Numa revisão de dezenove casos documentados [SamsOla],o sintoma mais comum apresentado foi dor no local da mordida (10 de 19 pacientes; 53%), o que é similar àfreqüência de dor em uma série incluindo casos nãodocumentados [Cacy99,Gross89] . Mais comum em mordidas nasextremidades, a dor começa após duas a oito horas e podeser severa suficiente para requerer narcóticos para alívio.A dor pode estar relatada à degradação de esfingomielinaseD do nervo mielínico de bainha [Clowers96] e pode serseguida de anestesia, hipoestesia ou hiperestesia[SamsOl,Clowers96]. Indisposição, cansaço e atordoamentoforam reportados em vários casos com efeitos sistêmicosmais comuns em crianças. Ansiedade comumente acompanha osprimeiros dias de envenenamento Loxosceles, com ameaça denecrose severa ou morte e preocupação sobre a ferida decicatrização lenta (figuras 4 e 5). Este é um tempo difícilpara o paciente e suas famílias e a incerteza dodiagnóstico é um peso adicional. O mais comum dos efeitossistêmicos severos é a anemia hemolítica, ambos Combs-positivo e Coombs-negativo, o que pode raramente causarIise de 7 0% da massa de células vermelhas de sangue emhoras [ouhsc96]. Raramente, pode ocorrer coagulaçãointravascular disseminada [Shenefelt97,Taylor66]. Oitomortes foram registradas na literatura médica em início de2001, todas faltando uma aranha acompanhando para adocumentação, com a maioria dos casos em crianças,geralmente seguindo hemólise severa, falha renal e falhamultisistêmica [SamsOl].Muitas condições médicas causam feridas necróticas etêm sido diagnosticadas erroneamente como .aracnidismonecrótico, levando a um atraso em tratamento apropriado[Vetter98, Stoecker96, Rosenstein87, Vetter03, Oaven99] .

Estas condições incluem: necrose de anticoagulante, mordidade artrópode, i.e. mosquitos, barbeiros, percevejos eescorpiões [SamsOl,Vetter98]; infecções microbacteriaisatípicas [Stoecker96]; celulite bacterial; queimadurasquímicas; vasculite cutânea [SamsOl]; ecthyma gangrenosum[SamsOl]; factícia; corpo estranho [SamsOl]; herpes simplescom imunossupressão; Loxoscelismo de outras espécies, taiscomo L. deserta, L. arizonica, L. rufescens [Shenefelt97];doença de Lyme [Rosenstein87]; papulose linfomatóide[Vetter03]; aracnidismo necrótico: outros gêneros comoEgenaria agrestis (aranha Hobo), Rabidosa (Lycosa)antelucana, punctulata (aranha Lycosidae), Dolomedesscriptus (dolomedes), Peucetia yiridans (aranha verde delynx) , Cheiracanthium mildei (aranha sac) [SamsOl] ;Fasciitis necrotizante [Maisel94]; pyoderma gangrenosumcomo visto na figura 6 (pyoderma gangrenosum pode serdistinguida de aracnidismo necrótico em casos com pústulasinflamatórias múltiplas ou nódulos hemorrágicos escuros,que se assemelham a um vulcão, mas uma úlcera isolada podeser sugestiva de uma mordida de aranha e envenenamentosLoxosceles podem ser seguidos de pyoderma gangrenosum[SamsOl,Hoover90]; syphilitic chancre [Cacy99]; Síndrome deSweet1S SamsOl]; sporotrichose [Oaven99]; tularemia[Stoecker96]; e úlceras, tanto diabético quanto estase.[Shenefelt97] . -l:Streptococci podem ser tomadas como protótipo para umnúmero de bactérias que podem causar necrose. Estas incluemClostridium difficile, Vibrio vulnificus, e Pseudomonasaeruginosa, (assim como outros bastonetes gram-negativosque causam ecthyma gangrenosum). Celulite bacterialextensiva, especialmente quando 1 a lesão está progredindo emtamanho e incha difusamente, -precisa de antibióticoespecífico e gerenciamento cirúrgico. Nas notícias em2002, houve um caso de antrax em uma criança na cidade deNova York, inicialmente mal diagnosticado como mordida dearanha. Casos de tilaremia, infecções microbacterianasatípicas e até casos múltiplos de Lymphomatoid papulosis[Vetter03] foram inicialmente mal diagnosticados comomordidas de aranha. Confundir estas lesões com mordidas dearanha pode ter conseqüências adversas para o paciente.

Até agora, sem testes clínicos para loxoscelismo, paracasos para os quais a aranha não foi recuperada, a ferida édiagnosticada baseado na presença de morfologia típica, umhistórico compatível (tal como mordida seguindo a colocaçãode roupas guardadas há muito tempo), e se a mordida ocorreudentro da faixa territorial esperada [SamsOl]. Comoexemplo, a ferida na figura 7, aparecendo em um email de ummédico para um dos inventores, vindo de uma área de paíscom nenhum caso documentado de loxoscelismo, bem pode tersido por conta de um trauma ou abuso ao invés de umenvenenamento Loxosceles, mas não podemos ter certeza.Infelizmente, nestes casos como em outros também, opotencial para litigação está presente e se isso ocorre, oresultado da litigação pode depender de um diagnósticoincerto.Um teste clínico sensível e específico foidesenvolvido para envenenamentos com Loxosceles reclusa. Umteste de inibição de hemaglutinação passiva (PHAI) foireportado como sendo bem sucedido identificando envenenamentos experimentais de Loxosceles reclusa emporquinhos da índia, com 90% de.sensibilidade até três diasapós a injeção de veneno, e 100% de especificidade quanto àfalsa identificação de outras espécies de aranha, mas oteste é difícil de ser realizado [SamsOl, Barrett93] . Um teste de transformação de linfócito também foidesenvolvido, mas é raramente usado por causa do custo e doaparecimento tardio de um resultado positivo de teste[Berger73]. Proteínas contidas no veneno Loxosceles sãoimunogênicas em dose significante de formação de anticorposanti-Loxosceles quando o veneno é inoculado várias vezes nomodelo de coelho [Gomez99]. No entanto, respostas deanticorpos em humanos na espécie Loxosceles aparentam serfracas. Apenas quatro de 20 pacientes mordidos com L.gaúcho e tratados com terapia de soro tinham anticorpos para o veneno da L. gaúcho [Barbaro92]. Em outro estudo nãohavia anticorpos ao veneno da Loxosceles nas medidasretiradas em 3 0 dias [GuilhermeOl]. Portanto vários métodosexperimentais foram desenvolvidos para detectar a presençade veneno de Loxosceles, mas nenhum é simples o suficiente para ser comercialmente disponível para confirmação deenvenenamento em pacientes com lesões induzidas porLoxosceles.

Métodos de imunoensaios e dispositivos compreendendoswabs para analisar amostras são conhecidos no estado da arte. A publicação da patente no. 2005/0136553 revela umdispositivo no qual um swab é contatado por um fluidocontido numa câmara de fluido através de um canal de fluxoe também contendo um ensaio . em comunicação fluida com oswab, a câmara de fluido e o canal de fluxo. A patentenorte-americana 6,248,294 descreve um teste diagnósticosubstancialmente auto-contido para coletar e analisar umespécime biológico tendo um corpo tubular definindo umacâmara de espécime para receber um espécime coletado de umswab. A patente norte-americana no. 4,582,699 revela um kitpara detecção de gonorréia no qual uma faixa inerte comanticorpo ao anticorpo a ser detectado imobilizado nesta éinserido na amostra e subseqüentemente exposto a umreagente para detecção de ligação. A patente norte-americana 4,916,057 descreve um procedimento de imunoensaiopara detecção de antigenos de Chlamydia trachomatis em umaamostrada coletada em um swab compreendendo extrair aamostra do swab com uma solução básica que ésubseqüentemente neutralizada antes de se conduzir oimunoensaio. As patentes norte-americanas 5,753,262 e4,943,522 revelam imunoensaios de. fluxo lateral usados comtestes de gravidez. A patente norte-americana no. 5,163,441descreve um swab para coletar culturas microbiológicascompreendendo uma ponta de swab feita com uma espuma depoliuretano não-tóxico tendo células abertas em suasuperfície exposta. A patente norte-americana 5,084,245revela um dispositivo e método envolvendo um líquidosobreprodutor do swab para análise.

Todas as patentes e publicações aqui referidas sãoincorporadas por referência em extensão não inconsistenteassim com o propósito de prover descrição escrita efactibilidade dos aspectos conhecidos no estado da arte

desta invenção.

Sumário

Um ensaio de veneno Loxosceles contém desafiossignificantes. Diferente da construção de rotina de ELISAsdedicados à detecção de uma proteína individual, este ELISAdetecta uma proteína fisiologicamente ativa únicaesfingomielinase D (SMD) abundantemente presente em umveneno contendo uma miríade . de proteínas em váriasquantidades com propriedades fisiológicas variantes.Algumas destas proteínas se assemelham muito àquelas deartrópodes tornando reatividade cruzada um desafio. Noentanto, o SMD, maior componente do veneno sentido por serresponsável pela necrose dermal nunca foi reportado emqualquer organismo diferente da aranha Loxosceles. Oslimites de sensibilidade eram desconhecidos previamente enossa pesquisa permitiu uma estimativa de ambos, a menorquantidade de veneno detectável bem como o tempo clínicolimite de ensaio e determinação preliminar de sensibilidadee controles biológicos específicos. Nós também comparamosanticorpos policlonais levantados em ovelhas e coelhos,ambos, via inoculação crua de veneno e esfingomielinase D,altamente purificada de venenos crus por afinidadecromatográfica. Determinamos que anticorpos policlonaislevantados em coelhos permitem maior sensibilidade noensaios ELISA policlonal do que aqueles levantados emovelhas. Aplicações clínicas de um ensaio otimizadoeconomizam a morbidade e despesa através de diagnoseinapropriada e tratamento de varias doenças de pele comapresentações similares a envenenamentos Loxosceles.Adicionalmente, técnicas usadas na detecção bem-sucedidadeste veneno de aranha podem ser aplicadas abrangentementee possibilitar a produção de ensaios para a detecção demarcadores de outras proteínas clinicamente relevantes paraoutros envenenamentos e outras proteínas estrangeiras.

Esta invenção provê um método de diagnosticar umamordida ou picada de um organismo venenoso em um pacientetendo sintomas consistentes com tal mordida ou picada. 0paciente pode ser um ser humano ou animal, como ummamífero. O método compreende coletar uma amostra contendoveneno de dito organismo venenos.o da área da mordida oupicada suspeita usando um swab; contatar a amostra com umanticorpo que especificamente se liga a um sítio antigênicono veneno presente na amostra; e detectar um complexoformado por fazer a ligação do anticorpo ao sítioantigênico. O veneno é uma secreção de um organismovenenoso tal como uma cobra, aranha, escorpião vespa,abelha ou água-viva, usualmente transmitido por uma mordidaou picada. 0 termo "diagnosticar" aqui usado significaidentificação do organismo que provocou a lesão. "Coletaruma amostra contendo o veneno" significa obter umaquantidade suficiente de material do local da mordida oupicada de forma a possibilitar diagnosticar a mordida oupicada. 0 material contendo o veneno pode ser o fluido debolha ou lenço e/ou líquido de uma lesão ou pele em volta.A "área da mordida" significa uma área em torno de um cm deferida visível, (acima de um diâmetro de 2 cm, com este nafaixa de 1-5 cm.)

Um swab é um pedaço de material absorvente ouadsorvente, o que significa um material capaz de retermaterial contendo veneno do local da mordida ou picada. Omaterial pode ser qualquer material conhecido no estado daarte, por exemplo, pano de materiais naturais ousintéticos, por exemplo, algodão, papel absorvente, Dacronrayon, ou nylon ou fibras feitas de tais materiais, porexemplo, bolas de algodão, gaze médica, papel, esponja,espuma polimérica tal como espuma de poliuretano, escovascom cerdas absorventes ou adsorventes que permitem a coletade células tal como escovas de nylon Cyttetedo BirchwoodLaboratories, Inc, Éden Prairie/"MN que são úteis para arotação dentro de uma abertura estreita ou a escova delimpeza do barbeador elétrico Panasonic, disponível atravésde totalac.com; e dispositivo do tipo Q-tipTM tal como osswabs de algodão feitos pela Unilever Company e os swabs derayon de ScopetteTM do Birchwood Laboratories, Inc.tipicamente modificados para ter uma cabeça mais larga.Cerdas que não são absorventes ou adsorventes tomadasindividualmente podem ser combinadas em "escovas" que sãoabsorventes ou adsorventes e capaz de levantar material deamostra. O material absorvente ou adsorvente pode seranexado a um palito o outro cabo ou pode ser manipulado àmão sem cabo. O swab pode ser seco, em qual caso fluido talcomo salino pode ser adicionado para carregar os antígenosno swab em contato com anticorpos no imunoensaio, ou o swabpode ser pré-umedecido com um fluido tal como o salinosuprido como parte do kit de imunoensaio, ou pode ser pré-umedecido pelo usuário na hora da colheita da amostra.

O método de coletar a amostra é não-invasivo e nãorequer cortar ou injetar agulhas em pacientes quetipicamente estão ansiosos e com dor, e que podem sercrianças ou idosos que não toleram bem a dor.

A detecção pode ser realizada por qualquer métodoconhecido no estado da arte, como mais bem descritoelétricos. Adicionalmente, outros meios de identificar apresença ou abstinência de uma proteína de venenoselecionada, por exemplo, realizar Western Blot, testes,testes de função de proteínas e outros ensaios conhecidosno estado da arte podem ser usados.

Em outra forma de execução, a detecção é realizadausando um dispositivo de imunoensaio "de campo", i.e., forado laboratório. Tais dispositivos incluem dispositivos detestes de cartucho e dispositivos de testes de indicadorimerso. 0 dispositivo compreende pelo menos um anticorpomonoclonal e/ou policlonal específico a uma proteína deveneno, um suporte para o primeiro anticorpo monoclonal oupoliclonal, meios de contatar o primeiro anticorpomonoclonal ou policlonal com a amostra e um indicador capazde detectar a ligação do primeiro anticorpo monoclonal oupoliclonal com a proteína do veneno. Em algumas formas deexecução, um ou mais anticorpos antivenenos monoclonais sãousados em adição a anticorpos policlonais. 0 swab pode terum anticorpo antiveneno ou anticorpos imobilizados neste, epode, portanto ser parte integral de um dispositivo deimunoensaio. Por exemplo, pode ser uma tira de papel que écontatada subseqüentemente com um traçador para detectar apresença de ligação entre antígenos de veneno e osanticorpos. 0 swab pode compreender um líquido paraauxiliar no levantamento de material do local. Em algumasformas de execução, após coletar o veneno do local damordida ou picada suspeita, o swab pode ser passado sobreum substrato tendo o anticorpo imobilizado no mesmo, ouexposto a um liquido que carrega os antígenos do veneno doswab a um local onde podem ser contatados com anticorpos deantivenenos. Ou liquido contendo veneno pode ser espremidoou extraído do swab para contatar o anticorpo deantiveneno. Em algumas formas de execução o swab édescartável.

Tipicamente a amostra é coletada por um leve passar ouabsorção na pele com o swab por ,aproximadamente de um a 360segundos, por exemplo, aproximadamente 3 0 segundos. 0 swabpode ser congelado de forma rápida para entender mais operíodo possível sem congelamento de sete dias a trêssemanas entre tomada a amostra e teste.

Quando células são incluídas na amostra a ser testada,o método e/ou dispositivo pode incluir uma etapa de Iise decélulas ou meios usando detergentes, punção ou outroprocesso físico ou químico conhecido no estado da arte.

Nos dispositivos desta invenção, qualquer meioindicador conhecido no estado da arte para detectar ligaçãoanticorpo/proteína pode ser usado. 0 meio indicador podeincluir um segundo anticorpo, rotulado, monoclonal oupoliclonal que liga-se à proteína selecionada, quepreferencialmente liga-se a um epítopo substancialmentediferente na proteína selecionada diferente desta, na qualo primeiro anticorpo monoclonal ou policlonal liga-se deforma que a ligação do primeiro anticorpo monoclonal oupoliclonal não irá bloquear a ligação do segundo anticorpoou vice-versa. 0 meio indicador também pode incluir umajanela de teste através da qual anticorpos rotulados podemser vistos. Qualquer rótulo (aqui também referido comomarcador) conhecido no estado da arte pode ser usado pararotular o segundo anticorpo. 0 segundo anticorpo pode sermonoclonal ou policlonal.

Quando a amostra a ser usada no ensaio é um líquido oué carreada por um líquido, e o dispositivo teste doimunoensaio é um dispositivo de fluxo lateral compreendendomeio de entrada para guiar o fluxo de uma amostra líquidaem contato com os anticorpo, o dispositivo teste podetambém incluir um meio de controle de fluxo para assegurarque o teste está operando apropriadamente. Tal meio decontrole de fluxo pode incluir- antígenos ligados a umsuporte que captura anticorpos de detecção como meio deconfirmar fluxo apropriado de fluido de amostra através dodispositivo de teste. Alternativamente, o meio de controlede fluxo pode incluir captura de anticorpos na região decontrole que captura os anticorpos de detecção, novamenteindicando que fluxo apropriado ocorre dentro dodispositivo. Em um dispositivo de fluxo lateral, no qual aamostra é colocada em um suporte absorvente compreendendo adetecção do anticorpo, a janela de amostra e o suporteabsorvente provêem meios para contatar os anticorpos com aamostra.

O método de ensaio pode também compreender coletar umaamostra de controle de um local separado no corpo dopaciente que não foi exposto ao veneno, que por exemplo,não mostre sinais de ter sido o local de mordida ou picadavenenosa, e o controle pode ser testado usando o mesmométodo de imunoensaio e dispositivos que a amostra do localda mordida ou picada.Muitos organismos conhecidos no estado da arte,incluindo aranhas tal como a marrom reclusa, a viúva negra,a teia de funil, a funil vermelha, a rabo branco, a aranharato, a aranha de casa a aranha lobo, a aranha alçapão, eas tarântula, assim como os escorpiões e cobras venenosas,tal como a cascavel-diamante-oriental(Crotalus adamanteus) ,a cascavel "timber"(Crotalus horridus) , a cascavel "duskypigmy" (Sistrurus miliarius barbouri) , a cascavel Mojave(Crotalus scutulatus) , a vipera comum (Vipera berus) , afer-de-lance (Bothrops atrox), a Florida cottonmouth(Agkistrodon piscivorus conanti), a cobra coral-oriental(Micrurius fulvius fulvius) , e outras cobras venenosasconhecidas no estado da arte. Organismos venenosos tambémincluem águas-vivas, tais como a,,água-viva caixa (Chironexfleckeri), a água-viva irukandji (Carukia barnesi); vespase abelhas. Aranhas venenosas do gênero Latrodectus,Tegeneria (incluindo Tegeneria agrestis) , Loxosceles, Atrax(incluindo Atrax robustus), Phoneutri, e hadronyche(incluindo a espécie Hadronyche formidabilis, H. infensa,H. valida, H. versuta, H. modesta, H. meridiana, H.adelaidiensis, H. eyrei, H. flindersi, H. venenata, H.pulvinator and H. cerberea) são incluídas dentro dosorganismos venenosos cujas picadas ou mordidas podem serdiagnosticadas pelos métodos e dispositivos desta invenção.

A invenção é ilustrada em relação ao diagnóstico demordidas da aranha marrom reclusa, Loxosceles Reclusa.Outras aranhas dentro deste gênero para o qual o método éaplicável incluem Loxosceles intermedia, Loxosceles laeta,Loxosceles gaúcho, e Loxosceles rufescens.

Esta invenção provê um método melhorado para adetecção de um veneno por meio de um ELISA modificado parareduzir bloqueamento de anticorpos usando sólidos de leitedesnatado e marcadores fosfatase^ alcalinos. Uma variedadede marcadores podem ser usados incluindo immunogold,fosfatase alcalina, beta-galactosidase, glucose oxidase,markers de peroxidase, e qualquer enzima que produz umproduto colorido ou fluorescente como é conhecido no estadoda arte em reações de monitoramento imunidade. Este ELISA éextremamente sensível e pode abaixo de 24 picogramas, porexemplo, em torno de 20 picogramas, de veneno em umaamostra, mesmo após a amostra ter sido exposta atemperatura ambiente de verão, por exemplo até IOO0F oumais por até três semanas antes da etapa de detecção. 0método pode distinguir o organismo que causou a mordida oupicada de outra espécie de organismos venenosos utilizandoanticorpos específicos a um particular veneno, seguindo osensinamentos aqui, usando combinações de imunoensaios devenenos com sintomas de identificação clínica previamenteconhecidos. Métodos de levantar anticorpos policlonaispodem ser otimizados sobre espécies hospedeiras. Umacomparação da espécie pode permitir otimização quando aespécie ótima é desconhecida, como os resultados da ovelhae coelho. Uma espécie adequada pode ser determinada porqualquer dado veneno por comparação de métodos conhecidos,por exemplo, a produção de anticorpos policlonais ao venenode escorpião em cavalos, a uma outra espécie, por exemploovelhas.

Esta invenção também compreende um kit de imunoensaiocompreendendo um anticorpo capaz de ligar-se a um antígenopresente em um veneno; um swab para coletar uma amostracompreendendo veneno da área de uma mordida ou picadavenenosa no corpo de um paciente; e um traçador paradetectar a ligação entre o anticorpo e o antígeno. Emalguns modos de execução o anticorpo é imobilizado em umsubstrato sólido, e o substrato sólido pode ser um swabcomo descrito acima.

Breve Descrição Das Figuras

A Figura 1 mostra a aranha Loxosceles reclusa, sealimentando em cima de um gafanhoto.

A Figura 2 é um mapa dos Estados Unidos mostrando adistribuição endêmica da marrom reclusa (área maior) ecinco espécies de Loxosceles relacionadas nos EstadosUnidos, baseado em Gertsch e Ennik.

A Figura 3 é um gráfico mostrando o resultado de umapesquisa telefônica e por e-mail de 33 médicos dentro daárea da L. reclusa mostrada na figura 2.

A Figura 4 mostra uma mordida severa da Loxoscelesreclusa, com uma certeza Sams-King de provável no oitavodia.

A Figura 5 mostra uma mordida severa da Loxoscelesreclusa, com uma certeza Sams-King de probabilidade, no28°. dia, ilustrando o caminho de cura tipicamente lentopara lesões grandes e ulceradas.

A Figura 6 mostra a Pyoderma gangrenosum ulcer. Note aúlcera tipicamente molhada de base limpa e borda violáceasobrependente.

A Figura 7 mostra uma ferida necrótica com diagnósticoincerto vindo de uma área na qual a Loxosceles reclusa éconhecidamente presente.

A Figura 8 mostra um fracionamento de veneno usandouma cromatografia de coluna de Sephadex GlOO. A primeirafração de pico (seta) foi encontrada contendo atividadedermonecrótica. Os picos 6 e 7 pode conter a proteína 5 kDamostrada na figura 9.

A Figura 9 mostra uma fração de gel SDS PAGE(eletroforese) de veneno cru de Loxosceles (VEN) e análisede veneno cru (vide linha marcada como "VEN"). As bandasmúltiplas de proteína percebidas nesta SDS PAGE demonstramas múltiplas proteínas contidas no veneno.

A Figura 10 mostra Western blots da L. deserta (LoxD)e L. reclusa (LoxR) usando aLoxRD como anticorpo primário.Ambos os venenos revelaram sinais proeminentes na faixa depeso molecular de 30KDa.

A Figura 11 mostra um ELISA com base policlonal dederme homogeneizada de uma biópsia de punção de uma vítimade L. deserta da Arizona (vide seta esquerda - resultadopositivo é mostrado em triplicata e sublinhado. Compare coma biópsia de punção de controle dermal de uma vítimatraumática de carro (seta direita).

A Figura 12 mostra resultados de um ELISA padrão adiluições de 1:100 em soros de pacientes com envenenamentosprováveis de Loxosceles, contra frações de 1-8 de veneno edois lotes de veneno cru e esfingomielinase, compreendendoa maioria da fração 1. Resultados preliminares mostraramuma resposta no paciente de 3 a 21 semanas de veneno totale outras frações. Note a resposta rápida mínima e respostamínima a esfingomielinase. Paciente 1, semana 1=primeirafila; Paciente 1, semana 5=segunda, fila; Paciente 2, semana1=terceira fila; Paciente 3, semana 21=última fila.

A Figura 13 mostra venenos de artrópodes que reagiramcruzadamente ao ELISA de espécie Loxosceles a 16,OOOng e2,000ng. Apenas o veneno de controle da L. reclusa reagiucom o ELISA à 4 0 ng. Por motivos gráficos, os valores doeixo y são reportados como dados de Iog. * Valoresreportados como fora da escala pelo ensaio. De [Gomez02].

A Figura 14 compara curvas padrão de veneno paraensaios monoclonais usando fosfatase alcalina (AP) eperoxidase de rábano (HRP). Limite de detecção épg/cavidade para AP e 49 pg/cavidade para HRP.

A Figura 15 apresenta resultados gráficos de ensaiospoliclonais de veneno de L. reclusa injetado, 3-semanasusando ng de veneno inteiro, recuperado de swabs de algodãono local da infecção.

A Figura 16 apresenta resultados gráficos (médiassobre todos os coelhos) de ensaios policlonais de veneno deL. reclusa injetado, 3-semanas usando ng de veneno inteiro,recuperado de swab de Dacron no local da infecção.

A Figura 17 apresenta resultados gráficos de ensaiospoliclonais de ng de um componente esfingomielinase doveneno de L. reclusa injetado, 3-semanas, recuperado deswab de Dacron.

A Figura 18 apresenta resultados gráficos de um swabde algodão de 3 semanas ng de veneno recuperado de animaiscom uma injeção salina. Cada linha representa um coelhoindividual, com um diamante, por exemplo, representando umcoelho individual e um quadrado representando um coelhodiferente.

A Figura 19 apresenta resultados gráficos de um swabde algodão de 3 semanas ng de veneno recuperado de animaiscom uma injeção salina. Como na figura 18, cada linharepresenta um coelho individual, com um diamante, porexemplo, representando um coelho individual e um quadradorepresentando um coelho diferente.

A Figura 20 mostra resultados de ensaios em seisespécimes com o eixo vertical mostrando pg/cavidade deveneno recuperado, com as absorções cruas corrigidas paracontrole de absorbâncias. Pacientes A, B e C todos julgaramclinicamente consistente com envenenamentos de Loxosceles,no entanto ELISAs negativos proveram providências fortescontra envenenamentos de Loxosceles. Concentrações devenenos em todos os três foram menores que 0,32 pg,mostrado no gráfico como 0,16 pg. Paciente D foiclinicamente avaliado como envenenamento de estafilococos ea cultura confirmou MRSA, no entanto o ELISA positivoestabeleceu loxoscelismo concomitante. Paciente T daTurquia e paciente S de St. Louis foram avaliados via gazee fluido de bolha, respectivamente, recebido através decorreio expresso. Dos seis casos uma aranha marrom reclusa

A Figura 21 mostra a aparência de pele do Caso B(figura 20), mostrando uma bolha ensangüentada em uma jovemmulher, que foi avaliado como envenenamento provável deLoxosceles, mas o nível de antigeno de veneno via swab dealgodão foi menor que 0,32 pg.

A Figura 22 mostra uma lesão tenra, inchada, doloridano pé de uma jovem mulher (caso D, figura 20) com umainfecção documentada de estafilococos no local com umhistórico de 5 dias. Isto foi considerado como sendo umainfecção de estafilococos apenas e não uma mordida dereclusa até que um ELISA mostrou antigeno de venenosignificante via swab de algodão: 1,2 picogramas.

A Figura 23 mostra uma lesão tenra na pálpebra em umpaciente turco (caso T, Figura 20) sob cuidados de umoftalmologista, apresentando inchaço considerável e lesãocom drenagem dolorosa na pálpebra com hemorragia e edemamassivo bilateral das pálpebras. Gazes foram usadas nasáreas afetadas e contralaterais, com envio à Missourilevando uma semana. ELISA mostrou antigenos de venenossignificantes quando comparado ao controle via método decoleta da gaze: 0,5 picogramas.

A Figura 24 mostra uma bolha hemorrágica no braço deuma criança (Caso S, figura 20) que estava brincando noquarto de costura de sua mãe, quando um brinquedo ficoupreso atrás de uma pilha de caixas e ele colocou seu braçoatrás da pilha para recuperá-lo. Sua mãe recuperou a aranhaidentificada como L. reclusa por médicos. Hematúria ehemólise marcaram seu curso hospitalar e morfina foinecessária para controle da dor. Fluido de bolha mostrouantigenos ao veneno significantes por ELISA: 0,6picogramas.

A Figura 25 mostra uma lesão dolorosa em uma menina de10 anos no Missouri causada pôr uma mordida de aranhaLoxoscele reclusa.

A Figura 26 mostra uma curva de sensibilidade dedetecção de fosfatase alcalina para detecção de veneno, compadrões de veneno mostrado como quadrados e quantidadedetectada para o paciente mostrada na figura 25 comodiamante.

A Figura 2 7 mostra o Paciente T, caso 1 do exemplo 8(vide também figuras 20 e 23) após a cura. Nenhum arranhãoou dano funcional foram vistos em sete meses.

A Figura 28 mostra o paciente do caso 2 do exemplo 8apresentado com uma lesão dolorosa na pálpebra com necroseprecoce e edemas bilaterais severos e faciais.

A Figura 29 mostra o paciente da figura 28 comarranhões e hiperpigmentação observado quatro meses após amordida de aranha.

A Figura 3 0 mostra curvas padrão da detecção defosfatase alcalina, para o caso 1, figura 27, mostrando ospadrões de veneno como quadrados pretos e quantidades deveneno recuperado por ELISA (4,50pg) como círculos.

A Figura 31 mostra uma curva padrão da detecção defosfatase alcalina para o caso 2, figura 28, mostrando ospadrões de veneno como quadrados pretos e quantidades deveneno recuperado por ELISA (8,2 pg) como círculos.

Descrição Detalhada

Loxosceles reclusa e espécies relacionadas dearacnídeos são aranha indígenas americanas que possuem umveneno capaz de causar úlceras dolorosas, desfigurantes,necrosas com inflamação da derme circundante e efeitossistemáticos severos [Atkins58, Wasserman83, SamsOl,Anderson97]. 0 diagnóstico de uma mordida de aranha marromreclusa é feita clinicamente individualmente na base daaparência morfológica da lesão cutânea [Atkins58,Wasserman83, SamsOl, Anderson97]. Diagnóstico definitivo éproblemático porque os pacientes geralmente não levam aaranha ofensora ao médico para identificação. A aparênciade envenenamento significante com necrose cutânea é a baseusual para o diagnóstico, mas não é especifica para oenvenenamento para a espécie Loxosceles [ SamsO1,Anderson97, Vetter98], com mímicas incluindo uma variedadede doenças tratáveis [Rosenstein87, Rees87, Moaven99].Quando uma necrose significante é ausente, os elementoscaracterísticos do envenenamento ficam faltando e odiagnóstico é mais difícil.

Médicos que trabalham dentro do habitat da Loxoscelesreclusa nas áreas centrais e do sul do meio-oeste dos EUArotineiramente vêem pacientes com mordidas de aranhasuspeitas. Infelizmente, observamos que menos que 10% dospacientes trazem a aranha suspeita para identificação. Aaranha pode ser achada após atrasos significantes, levandoa uma incerteza de que o aracnideo presente é o agenteofensor. Por isso o diagnóstico da maioria das mordidas dearanha geralmente depende de uma análise da morfológia damordida. Mordidas severas podem exibir o sinal "vermelho,branco e azul" descrito por Sams et al [Sams01} ou podemmostrar uma mancha afundada, azulada descrita por Anderson[Anderson97] . As pequenas mordidas como descritas aqui nãotêm estas características e não são bem caracterizadas. Sãobem mais freqüentes em ocorrência do que a literaturasugere. Pequenas mordidas não podem ser diagnosticadasdefinitivamente sem a aranha ou um teste que possademonstrar inequivocamente a prèsença do veneno da aranha.

Utilizando os testes diagnósticos desta invenção,mordidas venenosas podem ser diagnosticadas corretamente.Uma amostra compreendendo o veneno é coletada de uma áreaao redor da mordida usando um swab e o material no swab éanalisado imunologicamente em relação à presença de veneno.

Vários formatos podem ser usados para testar pelapresença ou ausência de um analito usando o ensaio, Porexemplo, em certas formas de execução é utilizado o formato"sanduíche". Exemplos de tal ensaios tipo sanduíche sãodescritos na patente norte-americana 4,168,146 de Grubb, etal. e na patente norte-americana 4,366,241 de Tom, et al.,que incorporadas aqui em sua íntegra por referência paratodos os propósitos. Adicionalmente, outros formatos, talcomo formatos "competitivos" podem ser usados. Em um ensaiocompetitivo a sonda rotulada é geralmente conjugada com umamolécula que é idêntica a ou análoga ao analito. Portanto,a sonda rotulada compete com o analito de interesse pormaterial receptivo disponível. Ensaios competitivos usadostipicamente para a detecção de analitos tal como haptenos,cada hapteno sendo monovalente e;capaz de ligar apenas umamolécula de anticorpo. Exemplos de dispositivos deimunoensaios competitivos são descritos no pedido depatentes norte-americano 4,235,601 de Deutsch, et al. e nopedido norte-americano 4,442,204 de Liotta, e na patentenorte-americana 5,208,535 de Buechler, et al., que são aquiincorporadas em sua íntegra por referências para todos ospropósitos. Vários outros dispositivos e/ou formatos deensaios também são descritos na patente norte-americana5,395,754 de Lambofte, et al. ; na patente norte-americana5,670,381 de Jou, et al. ; e na patente norte-americana6,194,220 de Malick, et al., as quais são incorporadas aquiem sua integra por referência pafci todos os propósitos.

Qualquer técnica de detecção conhecida pode serutilizada na presente invenção. Por exemplo, como é bemconhecido no estado da arte, o ensaio pode ser também umensaio de afinidade eletroquímica, que detecta as reaçõeseletroquímicas entre um analito (ou complexo deste) e umligante de captura em uma faixa, de eletrodo. Por exemplo,vários ensaios eletroquímicos são descritos na patentenorte-americana 5,508,171 de Waklinq, et al.; na patentenorte-americana 5,534,132 de Vreeke, et al.; na patentenorte-americana 6,241,863 de Monbouquette; na patentenorte-americana 6,270,637 de Crismore, et al.; na patentenorte-americana 6,281,006 de Heller, et al.; e na patentenorte-americana 6,461,496 de Feldman, et al., as quais sãoincorporadas aqui em sua íntegra por referência para todosos propósitos.

Uma preocupação ao se realizar ensaios de diagnósticoé separar imunoreagentes que não se ligam ao antígeno e,portanto não fazem parte do imiihocomplexo de reagentes deligação que formam o complexo. A presença de reagenteslivres pode aumentar o fundo do ensaio. Enquanto a lavagemdo imunocomplexo pode, e realmente remove a maior parte dosinal de fundo devido a reagentes livres, a maioria dosensaios emprega o que é chamado de etapa bloqueadora parareduzir ainda mais o fundo. A etapa bloqueadora envolverevestir o suporte sólido com substancias proteínicas apóster sido revestido com anticorpo. O material de bloqueio seliga a sítios na matriz sólida que não são cobertas comanticorpos e, portanto previnem ligações subseqüentes não-específicas de reagentes imunes que não são parte docomplexo imune. Geralmente a etapa bloqueadora é realizadaou, antes da condução do ipriunoensaio, necessitando,portanto uma etapa adicional de consumo de tempo ou aindacomo descrito na patente norte-americana 3,888,629, omaterial da matriz sólida é impregnado com o agentebloqueador, e então seco por congelamento e mantido nesteestado até utilização.

Dispositivos de imunoensaio apropriados para detectara presença de venenos podem ser na forma de dispositivos deensaio de passagem, tipicamente contido dentro de uma caixae adequado para coletar-se amostras fora de um laboratório.

Por exemplo, um imunoensaio de passagem compreende umamembrana porosa tendo um reagente de liga imobilizado namembrana. Um material absorvente é colocado em um lado damembrana. Quando a amostra contendo um analito é aplicada àmembrana, a amostra passa através da membrana por movimentocapilar. O analito é então ligado ao reagente de ligação. 0dispositivo de ensaio pode incluir um suporte absorvente noqual o anticorpo antiveneno está presente e no qualcomponentes da amostra de veneno são absorvidos diretamenteno contato com o swab ou por meiiòs de um líquido carreadorque carreia os componentes do veneno da amostra no swabpara dentro do suporte absorvente. 0 dispositivo podetambém compreender um poço receptor para receber amostrasou componentes de amostras, preferencialmente tendo ummaterial absorvente aqui para facilitar a transferência deantígenos na cavidade. A cavidade receptora pode incorporaranticorpos antivenenos.

Em uma forma de execução, o teste de imunoensaio é umteste colorimétrico que compreende uma caixa de plásticocom uma cavidade colocada em uma extremidade compreendendoum material absorvente; e uma tira de papel em comunicaçãofluida com a cavidade estendendo-se na direção da outraextremidade da caixa e tendo duas tiras de aproximadamente1,5 mm em largura correndo toda a largura da tira, uma paracontrole pré-pintada com antígenos de veneno e anticorposde antiveneno, assim como markers para indicar a ligação deantígenos e anticorpos e a outra para realizar o teste,pré-pintada apenas com os anticorpos antivenenos e markerspara indicar a ligação. Quando a amostra é adicionada àcavidade por fricção do swab com-j-um líquido carreador assimcomo uma solução salina normal, o fluido de carreamentopermite contato de ligação entre os antígenos pré-pintadose os anticorpos na tira de controle e carreia antígenos deveneno da amostra em contato de ligação com o anticorpoantiveneno na tira de teste. A caixa compreende uma janelaou janelas posicionadas acima das tiras e é marcado paraindicar o controle e teste (por exemplo, CeT). A tira decontrole sempre mostra a reação de cor, mas o teste não ofaz, a não ser que a amostra contenha antígenos de venenocom os quais o anticorpo antiveneno pré-pintado se liga.

Um imunoensaio de passagem compreende ainda aplicar umtraçador que é outro reagente de liga do analito com umrótulo para detectar a ligação com o analito. 0 reagente deligação da membrana e traçador são selecionados de um grupoconsistido de anticorpos, antígenos, proteínas receptoras,etc. 0 rótulo pode ser selecionado de um grupo desubstância detectáveis incluindo enzimas, isótoposradioativos, e particularmente partículas de cor. 0imunoensaio também pode compreender meios de detecçãoconhecidos no estado da arte por detectar a presença dorótulo ou mudanças no rótulo que indicam que a ligação doanticorpo traçador com o anticorpo de detecção ocorreu.Membranas apropriadas incluem fibras de vidro, difluoretode polivinilideno, policarbonato, nitrocelulose, nylon,papel etc., por exemplo, como descrito na patente norte-americana 5,155,022.

Como conhecido no estado da arte, anticorpos úteispara detectar veneno podem ser policlonais ou monoclonais,e anticorpos policlonais, monoclonais ou ambos podem serusados como traçadores. Anticorpos que se ligam apolipeptideos de veneno podem ser preparados usando umpolipeptídeo intacto ou fragmentos contendo pequenospeptídeos de interesse como o antigeno imunizante. Opolipeptídeo ou peptídeo usado para imunizar um animal podeser derivado de um cDNA traduzido ou de síntese química quepode ser conjugada a uma proteína carreadora, se desejado.

Tais carreadores, comumente usados que são quimicamenteassociados ao peptídeo incluindo keyhole limpet hemocyanin(KLH), tiroglobulina, albumina de soro bovino (BSA), etoxóide de tétano. O peptídeo associado é então usado paraimunizar o animal (por exemplo, um camundongo, um rato ouum coelho).

Se desejado, anticorpos policlonais ou monoclonaispodem ser adicionalmente purificados, por exemplo, por seligar e elucidar de uma matriz a qual o polipeptídeo ou umpolipeptídeo ao qual o anticorpo foi crescido é ligado.Aqueles de conhecimento no estado da arte saberão de váriastécnicas comuns na arte de imunologia para purificação e/ouconcentração de anticorpos policlonais assim comoanticorpos monoclonais. Vide, por exemplo, Coligan, et al.(current ed.) Current Protocols in Immunology, WileyInterscience.

É também possível usar tecnologia de anti- idiotipicospara produzir anticorpos monoclonais que se assemelham a umepítopo. Por exemplo, um anticorpo monoclonal anti-idiotipico feito para um primeiro anticorpo monoclonal terádomínio de ligação em uma região hipervariável que é aimagem de um epítopo ligado pelo primeiro anticorpomonoclonal.

A preparação de anticorpos policlonais é bem-conhecidaàqueles com conhecimento do estado da arte. Vide, porexemplo, Green, et al. "Produção de antisorospoliclonais"("Production of Polyclonal Antisera") páginas1-5 em Manson (ed.) Immunochemical Protocols Humana Press;Harlow and Lane; e Coligan, et al. Protocolos correntes emimunologia. (Current Protocols in Immunology).

A preparação de anticorpos monoclonais é igualmenteconvencional. Vide, por exemplo, Kohler e Milstein (1975)Nature 256:495 497; Coligan, et al., seções 2.5.1 2.6.7; eHarlow e Lane "Anticorpos: Um manual de laboratório"(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring HarborPress. Brevemente, anticorpos monoclonais podem ser obtidospor injetar camundongos com uma cpmposição compreendendo umantígeno, verificando a presença de produção de anticorpospor remover uma amostra de soro, remover o baço para obterlinfócitos B, fundir os linfócitos B com células de mielomapara produzir hibridiomas, clonar os hibridiomas,selecionar os clones positivos que produzem anticorpos aoantígeno e isolar os anticorpos das culturas dehibridiomas. Anticorpos monoclonais podem ser isolados epurificados das culturas de hibridiomas por uma variedadede técnicas bem-estabelecidas. Tais técnicas de isolamentoincluem cromatografia de afinidade com sefarose de proteínaA, cromatografia de exclusão de .tamanho, e cromatografia detroca iônica. Vide, por exemplo,"-,Coligan, et al. ; Barnes,et al. Purificação de Imunoglobulin G (IgG) ("Purificationof Immunoglobulin G (IgG)") em Methods in MolecularBiology, vol. 10, paginas 79 104 (Humana Press, ed.corrente) . Métodos in vitro e de multiplicação in vivo deanticorpos monoclonais são bem conhecidos àqueles treinadosno estado da arte. Multiplicação in vitro pode serexecutada em meios de cultura tais como Dulbecco's ModifiedEagle Médium ou em meio RPMI 164 0, opcionalmentereconstituído, por exemplo, por um soro mamífero tal comosoro fetal de vitela ou elementos traçadores e suplementosde sustância de crescimento tal como células normaisexsudadas peritoneais de camundongo, células de baço,macrófagos de medula óssea. A produção in vitro provêpreparações de anticorpos relativamente puras e permite oscale-up para obter largas quantidades dos anticorposdesejados. Cultivos de hibridiomas de larga escala podemser realizados por culturas de suspensão homogêneas em umreator de agitação pneumática, em um reator de agitaçãocontínua ou em uma cultura de células imobilizadas ouoclusas. Multiplicação in vivo pode ser realizada porinjetar clones de células em mamíferos histocompatíveis comcélulas parentes, por exemplo, camundongos singeneicos,para causar crescimento de tumores produtores deanticorpos. Opcionalmente, os animais são iniciados com umhidrocarboneto, especialmente óleos tal como o pristano(tetrametilpentadecano) antes da injeção. Após uma a trêssemanas o anticorpo monoclonal desejado é recuperado dofluido corpóreo do animal.

Exemplo 1. Fracionamento de VenenoVenenos de aranha Loxosceles sp. Comercialmentedisponíveis (SpiderPharm, Yarnell AZ) são preparaçõescruas, não-caracterizadas contendo múltiplos polipeptídeosna faixa de tamanho de 10-200 KDa. A purificação ecaracterização bioquímica dos componentes ativos nestas misturas é fundamental para entender o potente efeitoinflamatório e necrótico que este veneno tem na pele. Nóscompletamos o fracionamento de um veneno de aranhaLoxosceles usando uma cromatografia de troca aniônica.Veneno cru foi carregado em uma coluna HiTrap Q e elucidada com um gradiente de sal crescente de 20mM a IM NaCl em 25mMde um tampão TEA de pH 7.4. Enquanto dois estudosanteriores encontram três frações de veneno em aranhasLoxosceles usando uma coluna de cromatografia Sephadex G50e Sephadex Gl00, a maior resolução do método mais sensitivo usado em nossos estudos achou mais duas frações decomponentes de veneno. Portanto, cinco frações (à esquerdadas frações 6-7, Figura 8) foram separadas e ensaiadasusando o modelo de coelho de envenenamento de aracnídeo.Nós achamos usando o modelo dermatológico do coelho para envenenamento por Loxosceles que-a atividade dermonecróticafoi encontrada na primeira fração (passagem), o pico mais aesquerda.

A figura 9 mostra os resultados da análise SDS PAGE doveneno cru (vide linha marcada "VEM"). As faixas múltiplas de proteína anotadas na SDS PAGE demonstram as múltiplasproteínas contidas no veneno.

Exemplo 2. Caracterização de proteínas de veneno viaWestern Blot

Os venenos L. deserta, L. reclusa e o marcador de peso molecular Rainbow™ (Amersham International,Buckinghamshire, England, RPN 800) foram sujeitos àeletroforese em géis de 10% sódio dodecil sulfato (SDS) -poliacrylamida e transferidos para nitrocelulose[Osborn89]. Blots foram analisados por componentes deproteínas usando aLoxRD (policlonal de coelho) comoanticorpo primário em 2 ug/ml. 0 anticorpo reconheceupredominantemente a(s) proteína(s) que migravam perto de28 , 00 OMr. Vide figura 10. ;n„

Exemplo 3 . Detecção de soro Loxosceles Ag ou Ab vs ELISA deswab policlonal

Testes foram realizados para determinar se a detecçãode anticorpos de um ou mais componentes de venenoLoxosceles em soros humanos era uma via alternativa para odesenvolvimento de um teste clínico confiável, e se aproteína do veneno pode ser detectada no soro.

Dosagem ELISA de soros humanos de três pacientes comsuspeita de envenenamento por Loxosceles, com ambos, sorosagudos e convalescentes do paciente 3, foi realizado com oveneno inteiro (SpiderPharm, Yarnell AZ) e venenofracionado usando as oito fraçõés de proteínas mostradas nafigura 8. Todos os três pacientes tinham prováveisenvenenamento por Loxosceles por critérios de Sams[SamsOl]. Cavidades foram cobertas com IOOng de veneno crutamponado e frações de veneno 1-8, e densidadesopcionalmente tomadas com 30 minutos. Anticorpos dopaciente 1 foram obtidos 7 dias após a mordida de aranha,do paciente 2, 9 e 24 dias após a mordida da aranha e dopaciente 3, 150 dias após a mordida da aranha.

Leituras de soro de quatro pacientes foram comparadoscom soros humanos de controle. Um ELISA padrão com IgGsecundário anti-humano de cabra biotinilada em diluições de1:100 foi então realizado. Houve resposta pelo paciente 3em 21 semanas de veneno total com uma resposta significanteà fração 6 e outras frações, como mostrado na figura 11.

Nenhuma dose de anticorpos significante foi detectadaprecocemente.

Ensaios ELISA de soro para veneno também foramtentados. Quatro amostras de soro tomados a 6 horas decoelhos e 5 mais de humanos em diferentes horários,incluindo um envenenamento documentado, mostraram todosnenhum veneno detectado acima dos níveis de fundo. Dessaforma, titulações de anticorpos convalescentes e agudos eensaios de soros de veneno com o objetivo de confirmarenvenenamento de Loxosceles não aparentam ser uma opçãoclinicamente viável por causa de uma resposta de anticorposaparentemente fraca e devido à necessidade de umdiagnóstico imediato. Nós desenvolvemos de acordo com issoensaios com base em antígenos.

Exemplo 4. Ensaios policlonais

O primeiro ensaio policlonal tinha um limite dedetecção de aproximadamente IOpg por cavidade. Isso foiusado para detectar veneno Loxasceles em uma biópsia depunção de 4mm de uma vítima de mordida de aranha Loxoscelesdo Arizona [BoyerOO]. Vide figura 11. Um espécime de L.arizonica foi descoberto na cama da criança. 0 ensaiopoliclonal positivo juntamente com o encontro da aranhapermitiram um diagnóstico definitivo em uma criança commudanças hemodinâmicas assemelhando sepsia.

Após isso, um segundo ensaio policlonal foidesenvolvido. Este foi um imunoensaio competitivo de enzimapoliclonal de veneno de Loxosceles que foi empregado comsucesso para detectar veneno de loxosceles em tufos decabelo e amostras de pele obtidos de um paciente com umprovável envenenamento de Loxosceles. [MillerOO] .

Brevemente este paciente foi mordido por uma aranha apósremover materiais comprados de um show de armas na regiãosul dos EUA. Após o paciente ter apresentado evidênciasclinicas de mordidas de aranha, colhemos um pêlo da lesãodermal afetada e de um sitio de controle em sua extremidadeoposta. Usando técnicas policlonais competitivas desanduíche descritas em [MillerOO], nós comparamos a técnicamenos invasiva de coleta de pele* com as biópsias dermaisobtidas do sítio afetado. Usando a técnica de imunoensaiode enzima competitiva a presença de veneno Loxosceles foidetectada no tecido de biópsia de punção de pele lesionada(8.2 ±1.5 ng/ml contra 1.5 ± 0.7 ng/ml no tecido decontrole negativo contralateral) e em pêlos coletados dalesão (12.7 ± 3.1 ng/ml contra 1.4 ± 1.6 ng/ml em pêlos daperna contralateral) [MillerOO]. Este reporte mostrou que oveneno foi detectado por um meio relativamente não-invasivo(por exemplo, coleta de pêlo).

Nosso primeiro ensaio policlonal pôde detectar venenode Loxosceles com um limite de detecção de aproximadamente100pg. Dezessete venenos competidores (14 aracnídeos, 2escorpiões e um abelha de mel) requereram mais de 2000ng nomesmo ensaio para serem detectados (Figura 13) Apenas oveneno de controle L. reclusa reagiu com o ELISA em 4 0ng.

Várias modificações do primeiro ensaio policlonalpermitiram um novo limite de detecção, 24 ng vs 100 pgprévios. As mudanças incluíram adicionar sólidos de leitedesnatado ao tampão de bloqueio, aumentando assim aconcentração de outras proteínas de bloqueio, permitindo asolução de incubar por durante a noite e mudar o agente dedesenvolvimento a fosfatase alcalina. Curvas padrão deveneno são mostradas para o ensaio de fosfatase alcalina(AP) e o ensaio de peroxidase de rábano (HRP) na figura 14.

Uma cavidade de 24 pg de veneno produzconsistentemente um sinal de AP que é maior que o fundomais 3 desvios padrões. Três lesões necróticas einflamatórias (sem histórico ou exame confirmandoaracnidismo necrótico) tinham sinais em nível de fundo como segundo ensaio.

Exemplo 5. Estudo temporal de detecção de veneno em coelhosusando swabs de algodão e de Dacron

Este estudo foi realizado sob emenda no. 6 doprotocolo militar norte-americano FWH20020003, Efeitos deveneno da aranha marrom reclusa (Loxosceles reclusa) nomecanismo de coagulação em coelhos (Oryctolagus cunniculus)("Effects of Venom From the Brown Recluse Spider(Loxoceles reclusa) on the Coagulation Mechanism in Rabbits(Oryctolagus cunniculus)").

Neste protocolo emendado, FWH20020003A, a dose de 10.0μg/ml do veneno da aranha marrom reclusa foi encontradocomo sendo uma concentração maior do que uma dos de20.0μg/ml usada em estudos anteriores. Uma dose de 5 pgproduz um dano de tecido que aparenta se aproximar da"mordida" típica observada na mordida da aranha marromreclusa. É provável que a real mordida atinja uma dose deveneno que é um tanto variável.

Este protocolo foi aprovado pela Comissão ConsultivoAdministrativo de Cuidados e Uso de Animais (Animal Use andCare Administrative Advisory Comrriittee - AUCAC) para o usode 18 coelhos para o estudo completo. O objetivo era achara quantidade mínima de veneno detectada de um swab e operíodo mais longo após o qual a mordida pode serdetectada, i.e., o a maior quantidade de tempo que o venenoé viável na lesão do indivíduo. O número de sujeitos detestes foi determinado por significância estatística. Trêsanimais foram sujeitos ao controle salino. Coelhos foraminjetados na derme profunda no meio da dorsal posterior. Aprimeira fase do estudo era obter dados para determinar ocurso temporal da detecção do veneno do swab e da biopsia.

As lesões biopsadas foram examinadas histopatologicamentepara acessar a extensão e natureza do dano do tecido usandotécnicas padrões de estudos anteriores.

Tecidos de biópsia foram obtidos para "congelamentorápido" em nitrogênio líquido a 24 e 72 horas para exame deantígeno de veneno na Universidade do Missouri. Após oenvenenamento e coletas de swab e biópsia, todos os animaisforam eutanasiados seguindo procedimentos humanos aprovadospelo AUCAC. Na segunda fase do estudo foram dadas aosanimais quantidades decrescentes de veneno (N=2 animais portratamento): 2.5μg, 1.25 pg, 0.625 pg, 0.3125 pg, 0.1563 pgcontra o controle com solução salina com swabs e biópsiasdiárias como anotado acima.

Seis coelhos brancos da Nova Zelândia foram inoculadosna derme profunda com 5 pg de veneno Loxosceles(SpiderPharm, Yarnell, AZ). Quatro morreram brevemente apósisso com falha múltipla dos órgãos incluindo edema pulmonare necrose do fígado. Mais três foram inoculados com 4 µg deveneno Loxosceles e sobreviveram. Os coelhos injetados comsolução salina foram usados como controle. Swabs foramobtidos usando o swab padrão de 3 0 segundos com algodão eDacron diariamente por 21 dias e o material de biópsia foiobtido em uma área circular perto do local da infecção noprimeiro, terceiro, sétimo, e décimo-quarto dia.

Um estudo similar foi realizado com coelhos brancos daNova Zelândia usando o componente esfingomielinasepurificado do venenos de Loxosceles. Controle de injeçãosalina, swabs de algodão e Dacron, e a técnica de swabforam as mesmas como no experimento de veneno completoacima. Os resultados são mostrados nas figuras 15-19, comveneno detectado por um tempo de 3 semanas das doses de 4 e5 ug.

Os resultados mostram geralmente que swabs de algodãofuncionam melhor que Dacron; veneno pode ser detectado atétrês semanas e provavelmente mais; não há animalconsiderável em relação a variação de animal; a fração deveneno que é essencialmente esfingomielinase permiteetecção pelo menos tão boa quanto do veneno inteiro,apesar da proteína de veneno poder ser melhor representadapelo veneno (inteiro) da SpiderPharm; há oscilações nadetecção de veneno no dia a dia; há variações significantesde placa para placa. Curvas padrão são feitas para cadaensaio e as quantidades de veneno encontradas em diferentescorridas não são estritamente comparáveis, apesar de emtodas as corridas de ensaio para veneno no modelo de coelhopara algodão, as quantidades de veneno estarem acima dofundo para a maior parte do curso temporal estudado.

Exemplo 6. Uso de método de detecção de veneno parasuspeitas de envenenamento por Loxosceles

A figura 2 0 mostra resultados de ensaios de seisespécimes de suspeitas de envenenamento por Loxosceles. 0eixo vertical mostra pg/cavidáde de veneno recuperado, comabsorbâncias cruas corrigidas para o controle deabsorbâncias. Os pacientes A, B e C foram todos julgadosclinicamente consistentes com envenenamento com Loxosceles,no entanto ELISAs negativos proveram forte evidência contraenvenenamento por Loxosceles. A concentração de veneno emtodos os três paciente foi menor que 0,32 pg, mostrado nográfico como 0,16 pg. 0 paciente D foi clinicamenteestimado como envenenamento de estafilococos e a culturaconfirmou Staphylococcus Aureus resistente a meticilina(MRSA), no entanto, o ELISA notadamente positivoestabeleceu loxoscelismo concomitante. 0 paciente T daTurquia e o paciente S de St. Louis foram ensaiados viagaze e fluido de bolha, respectivamente, recebidos viacorreio expresso. Dos seis casos, uma aranha marrom reclusafoi encontrada apenas para o paciente S.

Exemplo 7. Diagnóstico de Loxoscelismo em uma criançaconfirmado com um ensaio imunabsorvente linkado a enzima eamostragem não invasiva de tecido

Uma menina de 10 anos do Centro-Sul de Missouriapresentada com um histórico de dois dias de uma lesãodolorosa na axila esquerda. A criança reportava que tinhanotado desconforto dérmico dois dias antes ao acordar.Durante este período inicial; a mãe da criança achou umaaranha morta (posteriormente identificada) na cama dacriança. No dia anterior à apresentação a criançadesenvolveu dor de cabeça, náusea severa e exantemamorbiliforme.

Quando necrose significante é ausente, como no casoapresentado aqui, as funcionalidades características doenvenenamento ficam faltando, e o diagnóstico fica maisdifícil. Para este caso nós utilizamos um sensitivo e ELISAdesenvolvido para detectar veneno Loxosceles [Gomez02]usando um espécime obtido por passar um swab na lesão.

0 exame nos mostrou uma menina quieta e um poucoapreensiva com pulso de 96, pressão sangüínea de 98/60 e temperatura de 37.1°C (98.7 F) . Uma vesícula na axilaesquerda foi envolvida por uma área tenra, eritematosa comestrias (Figura 25) . Um exantema fino, morbiliforme erapresente no abdômen e costas. A aranha morta tinha sidoguardada pela mãe da menina e foi posteriormenteidentificada por aracnologistas como membro da espécie deLoxosceles reclusa (Figura 1).

A lesão com ausência de necrose usual ou sinaisespecíficos foi confirmada por identificação do venenoLoxosceles e ainda confirmado por identificação da aranhaencontrada na cama da vitima, mostrando que o ELISAsensível e específico para esta ,invenção, desenvolvido paradetectar veneno Loxosceles usando um espécime obtido porpassar um swab na lesão pode ajudar no diagnóstico deLoxoscelismo.

Com o exame no dia após o exame original, os sinaisvitais ficaram iguais exceto pela temperatura 36.2 oC (97.2oF) . 0 exantema estava presente como no dia anterior. Sorofoi obtido e o espécime de swab de superfície foi obtidonão-invasivamente da área inflamada na axila, usando umswab umifiçado com solução salina normal, gentilmenteesfregando a área por 30 segundos.

Os espécimes foram congelados rapidamente usandonitrogênio liquido e mantidos durante a noite em um freezersem formação de gelo antes de.serem movidos para um freezerà -20°C. Os espécimes foram transportados sob gelo para aUniversidade de Missouri-Columbia. 0 swab foi descongelado,a extremidade absorvente foi removida do swab, misturadacom 0.05% v/v Tween 20 e foi colocada em um tubo de 1,5 mLde microcentrífuga e centrifugada à 10.OOOg por 10 minutospara remover a solução salina do material absorvente. Apresença de proteínas de veneno na solução foi detectadacom uma técnica ELISA para detecção de veneno Loxoscelesoriginalmente descrita por Gómez et al [Gomez02], commodificações anotada aqui.

Captura policlonal e detecção de anticorpos foiaumentada em coelho brancos da Nova Zelândia com venenonão-fracionado de L. reclusa. Os anticorpos forampurificados do soro por meio de cromatografia líquida decoluna da proteína A [Harlow8 8]. A concentração de agentesbloqueadores como notado em [GomezOl] foi aumentada esólidos de leite desnatado foram adicionados ao tampãobloqueador. O agente de detecção foi alterado da peroxidasede rábano (HRP) para fosfatase alcalina (AP) após curvaspadrões mostrarem maior sensibilidade com o AP nodesenvolvimento do ensaio anterior. A geração do produtofoi monitorado a 4 05nm em um modelo de leitor de microplacaELx8 08, BIO-TEK, Inc. Com a metodologia modificada, umpadrão de veneno de 24 pg consistentemente produziu umaabsorbância que foi maior que o fundo mais três desviospadrões, com a curva padrão como anotada na figura 26.Lesões necróticas e inflamatórias que foram testadas comELISA tinham absorbâncias no nível de fundo com esteensaio. A amostra de soro coletada por flebotomia tambémtinham uma absorbância no nível de fundo com este ensaio. 0material de swab deste caso foi testado a 34.4 ± 4.3 pg deproteína de veneno Loxosceles por cavidade (figura 26).

Existe uma variação placa a placa significante nadeterminação ELISA. Com alguns ensaios um padrão de venenode 0,5 pg pode ser distinguido acima dos níveis de fundo.

Funcionalidades dos casos apresentado aqui, incluindonáusea, vômitos, dor de cabeça e exantema, são vistos naminoria das mordidas. Experiência química sugere queachados sistêmicos significantes são mais comuns emcrianças e podem freqüentemente ser associada a lesõespequenas [Wasserman83, Anderson97]. Uma lesão dolorosa,mesmo quando muito pequena, quando em combinação com essessintomas sistêmicos pode trazer possibilidade deloxoscelismo à tona nas áreas endêmicas quando nenhumaaranha está disponível para exames. No entanto, para odiagnóstico definitivo em casos no qual não há nenhumaaranha disponível o teste desta invenção é necessário.

0 ensaio de swab policlonaí apresentado aqui permite aidentificação do veneno Loxosceles na pele três dias após amordida. 0 veneno pode ser detectado em um paciente por umperíodo posterior até maior, por exemplo, até pelo menossete dias após a mordida. Krywko and Gomez reportaramdetecção de veneno Loxosceles no tecido dermal sete diasapós envenenamento usando o modelo de coelho [Krywko02]. 0ensaio ELISA em conjunto com meios não-invasivos de coletade espécime permite confirmação de apresentações pequenas,precoces ou atípicas de envenenamento de Loxosceles assimcomo descrito neste caso.

Exemplo 8. Diagnóstico de loxoscelismo em dois pacientesturcos confirmado com um ELISA e uma amostragem não-invasiva de tecido.

Envenenamentos confirmados devido à Loxosceles reclusanão tinham sido documentados previamente na Turquia quefosse de nosso conhecimento. Este exemplo descreve doispacientes turcos com suspeita de envenenamento por mordidasde aranha Loxosceles nas pálpebras. Material obtido porpassagem de um swab na lesão com gaze foi testado usando umELISA veneno-específico. Ambos os pacientes testarampositivamente para a presença de veneno Loxosceles.

Loxosceles reclusa e espécies relacionadas dearacnídeos indígenas na Europa assim como na América doNorte, possuem um veneno capaz de causar úlceras dolorosas,necroticamente desfigurantes e, incomumente, efeitossistêmicos severos [Atkins58; Wasserman83; SamsOl;Anderson98]. O diagnóstico de uma mordida de aranha marromreclusa é individual clinicamente a base de aparênciamorfológica da lesão cutânea [Atkins58; Wasserman83;SamsOl; Anderson98]. Diagnóstico definitivo não é possívelusualmente porque os pacientes geralmente não levam aaranha ofensora para o médico, para identificação. Amorfologia da lesão é a base usual para diagnóstico, masnão é especifico para envenenamentos da espécie Loxosceles[SamsOl; Anderson98; Vetter98] , visto que há várias mímicasde mordidas de aranha [Rosenstein87; Rees87; Moaven99].Para confirmação diagnostica dos dois casos apresentadosaqui nós utilizamos um imunoensaio sensível e linkado aenzimas (ELISA) desenvolvido para detectar o venenoLoxosceles [Gomez02], usando -espécimes obtidos não-invasivamente por passar um swab na lesão com gaze dealgodão.

Caso 1: Uma mulher turca de 34 anos (Caso T, Exemplo 6acima) que tinha ido a uma viagem de venda de carneiros naárea rural de Siirt, Turquia, acordou em sua barraca compálpebras pruríticas dolorosas e inchadas. Ela reportou quetinha visto aranhas em sua barraca, mas que a espécie eradesconhecida. Dentro de três dias desenvolveu-se um edemafacial massivo, e uma lesão hemorrágica de 2 χ 3 cm napálpebra com necrose superficial, consistente comloxoscelismo (figura 23). Em sua admissão no hospital, elatinha uma temperatura de 38°C, com pulso de 80 e pressãosangüinea de 110/70 mm Hg. Os resultados dos testes delaboratórios, incluindo contagem sangüinea completa,funções químicas de fígado e renais, urinálise e funções decoagulações estavam todos dentro dos limites normais. Alesão foi administrada com compressas salinas elubrificação ocular. A lesão curou com visão resultantenormal, função normal de pálpebra e sem aranhão (Figura27) .

Caso 2: Uma menina de 7 anos, da área rural de Siirt,acordou com dor, prurido e leve inchaço das pálpebras.Dentro de três dias, edemas1:··!;, bilaterais severos daspálpebras foram apresentados. Nenhuma aranha foiidentificada. No terceiro dia ela foi admitida no hospital.Um diagnóstico presunçoso de envenenamento por aranhamarrom reclusa foi feito baseado na aparência da lesão. Umalesão dolorosa, tenra, hemorrágica mostrando necroseenvolvida por edema facial severo foi visto (figura 28). Naadmissão ela estava normotensiva com temperatura de 380C epulso de 100. Ela tinha uma contagem de células brancas de17,200 / pL com um deslocamento para a esquerdasignificante. Os níveis de hemoglobina e hematócritos,urinalise e outros índices sangüíneos estavam dentro doslimites normais. A lesão na pálpebra foi administradasuportadamente com compressas salinas e lubrificantesoculares. A lesão curou com arranhos e hiperpigmentaçãovisível (Figura 29) . A visão era normal e a pálpebra pôdeser aberta completamente. No entanto, leve epífora eepiteliopatia pontual da pálpebra afetada foram observadas.Os pais da criança observaram que a pálpebra direita estavaincompletamente fechada quando ela dormia.

Métodos: Todos os espécimes para determinação ELISAforam obtidos na Universidade de Dicle na Turquia. Esponjasde gaze molhadas em soluções salinas normais eram usadaspara obter o espécime da lesão afetada e sítioscontralaterais de controle em ambos os casos. Os espécimesforam coletados por passar gentilmente o swab na lesão e nositio de controle por 3 0 segundos. Os swabs eram tomados nosétimo dia da instalação da lesão no caso 1 e no quarto diada instalação da lesão no caso 2. Apesar do envio porcorreio expresso, a carga levou de 7 a 10 dias e foiestocada em trânsito a temperaturas ambientes de verão pordurações indeterminadas. Após ' o envio, as amostras dealgodão foram molhadas com 3 00 μΐ de Tris salina tamponadacontendo Tween-20 (20mM Tris pH8.0; 145 mM NaCl; 0.02%(v/v) Tween-20) e colocada em um tubo plástico decentrifuga de 0,5cm de diâmetro e centrifugado a 10.OOOgpor 10 minutos para remover a solução salina do materialabsorvente. Proteínas de veneno usadas foram detectadasusando uma técnica ELISA para detectar veneno de Loxoscelesreclusa, originalmente descrita' £>or et al. [Gomez02] , commodificações anotadas aqui.

Captura policlonal e detecção de anticorpos foramlevantadas em coelhos brancos da Nova Zelândia com venenoL. reclusa não-fracionado. Anticorpos foram purificados dosoro por meios de cromatografia líquida de coluna daproteína A [Harlow88]. A concentração de agentesbloqueadores anotada em [Gomez02] foi aumentada, sólidos deleite desnatado foram adicionadas ao tampão bloqueador,incubação durante a noite foi usada, e fosfatase alcalinafoi usada como agente de detecção. A geração de produto de paranitrofenol foi monitorado em 4 05nm em um modelo deleitor de microplaca ELx808, BIO-TEK, Inc. Curvas padrõesforam produzidas para cada paciente.

Resultados e discussões: 0 controle contralateral detodos os espécimes tinha absorbâncias em níveis de fundo. 0material de swab de ambos os casos mostraramimunoreatividade do veneno por três desvios padrões maiorque sinais de fundo, como mostrado nas figuras 30 e 31.Estes resultados são consistentes com a presença de venenode uma aranha dentro do gênero Loxosceles dentro dasamostras obtidas com gaze da lesão.

Mordidas da marrom reclusa na pálpebra são um tantoincomum [JarvisOO; Wesley85; Edwards97]. Edema severo éobservado geralmente. Complicações agudas incluem pressãointra-ocular elevada [12] e comprometimento das viasrespiratórias devido ao inchaço laringeal [Edwards97].Complicações de longo prazo incluem necrose e arranhões dapálpebra, o que pode levar a irritação córnea [Wesley85].Intervenções terapêuticas para mordidas de marrom reclusaincluem dapsone, corticóides sistêmicos, oxigêniohiperbárico [Jarvis00; Wesley85], e desbridamento do tecidonecrótico com reconstrução -V· de abas [Edwards97] .Cantarotomia e cantólise foram usadas para restaurar apressão normal em um caso com pressão intra-ocular elevada[Edwards97]. Terapia de suporte pode incluir antibióticostópicos e sistêmicos, preparações salinas e lubrificantesoculares. Uma lente de bandagem foi utilizada paraminimizar irritação córnea [Wesley85].

Ensaios humanos de controle suportando intervençõesespecíficas para mordida na pálpebra de marrom reclusa nãosão disponíveis. Um estudo mostrou benefícios de umacombinação de dapsona e antiveneno em lesões experimentaisde pálpebra em coelhos[Cole95]. No entanto, outro estudocom coelho reportou nenhum benefício da terapia de dapsonapara resultados clínicos em lesões de pele induzidas emcoelhos [Elston05]. Edwards et al. notaram que "cuidadodeve ser enfatizado para evitar desbridamento do tecido dapálpebra. Por causa do excelente provimento de sangue, aspálpebras [têm] uma propensão notável pelo auto-reparo nosmoldes de envolvimento das pálpebras gangrenosas"[Edwards97].

Apesar de lesões atribuídas a Loxosceles rufescensterem sido reportadas da Turquia [Atilla04] e áreasvizinhas em volta do mediterrâneo [Borkan95], nenhumadestas mordidas de aranha reportadas foram confirmadas poridentificação da aranha conhecida por ter causado amordida. Loxosceles rufescens (Dufour, 1820) é estabelecidana Turquia [l.gantep website] e conhecida por causar lesõesnecróticas [YoungOl].

O edema massivo de pálpebra e necrose precoceobservado nos dois casos apresentados aqui são consistentescom o loxoscelismo, mas não diagnóstico, como outrasdoenças, particularmente envenenamentos de outrosartrópodes podem ter tal apresentação. O ELISA de venenoproveu evidências de suporte para o diagnóstico.Gerenciamento conservativo ns dois casos reportados aquipermitiram ambos pacientes de sarar sem comprometimento davisão, apesar de um paciente ter tido comprometimentofuncional residual.

0 grau de sensibilidade e especificidade do ELISA parao veneno Loxosceles reportado aqui não foi estabelecido emcasos clínicos. In vitro, o ELISA foi encontrado sendoespecífico para a espécie Loxosceles em níveis de antígenorelevantes, reagindo a nenhum dos 17 outros venenos deartrópodes a 40 ng [Gomez02]. In vivo, lesões necróticasinflamatórias que foram testadas com o ELISA tinhamabsorbâncias no nível de fundo com este ensaio. Este ELISAnão é capaz de discriminar entre espécies de Loxosceles,que possuem várias faixas de proteínas comuns no WesternBlot e mostram reatividade cruzada as antígenos marcados[GomezOl] .

V.-'·'·

Em suma, o ensaio ELISA de swab policlonal realizado

no material obtido por gaze de algodão permitiu

7\i

identificação de veneno Loxosceles na pele 4-7 dias após oaparecimento de sintomas nas duas mordidas reportadas aqui,

3 0 suportando o diagnóstico de envenenamento por Loxoscelespor uma aranha do gênero Loxosceles em dois pacientesturcos.

Um ensaio de veneno sensível e específico para aespécie Loxosceles foi provido. Em adição a utilidade deconfirmação clínica rápida de loxoscelismo em áreasendêmicas, um ELISA com base no/'veneno é útil na exclusãode loxoscelismo no cenário de doença não-relacionada etratável em áreas não-endêmicas, em definir a lesãoquestionável e em conduzir desenvolvimento de tratamentoclinico apropriado.

Enquanto a invenção foi descrita em detalhe comrespeito aos modelos de execução específicos da mesma, seráapreciado que aqueles com conhecimento na área ao obter eentender do anterior, possam prontamente conceberalterações, variações e equivalentes a estes modos deexecução. De acordo com isso, o "escopo da presente invençãodeve ser estimado como sendo aquele das reivindicaçõesanexadas e quaisquer equivalentes deste.

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Claims (37)

1. Método de diagnóstico de uma mordida ou picada deorganismo venenoso em um paciente caracterizado pelo fatode compreender:(a) coletar uma amostra compreendendo veneno de talorganismo venenoso da área da mordida ou picada usando umswab;(b) contatar a amostra com um anticorpo que se ligaespecialmente a um local antigênico em veneno presente naamostra; e(c) detectar um complexo formado por ligação doanticorpo citado e do antigênico citado.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do swab citado compreender ummaterial absorvente ou adsorvente selecionado do grupoconstituído de algodão, dacron, rayon, espuma depoliuretano, escovas, papel e esponja.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato da detecção citada ser realizadapor um método selecionado do grupo constituído deimunoensaios sanduíche e imunoensaios eletroquímicos.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato da detecção citada ser realizadausando um dispositivo de imunoensaio fora de umlaboratório.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do swab também compreender ditoanticorpo.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do swab citado ser descartável.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato da amostra citada ser coletada porenxugamento ou absorção delicado-·, da pele com dito swab poraproximadamente 360 segundos.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de também compreender coletar umaamostra de controle de um local separado no corpo dopaciente que não foi exposto ao referido veneno.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato da amostra citada compreenderfluido de bolha.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do citado organismo venenoso serselecionado de um grupo constituído de aranhas venenosas,escorpiões venenosos, cobras venenosas, vespas venenosas,abelhas venenosas e águas-vivas venenosas.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do citado organismo venenoso serselecionado do gênero Latrodectus, Loxosceles, Atrax,Hadronyche, Tegenaria e Phoneutria ou da famíliaTheraphosidae.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do citado organismo venenoso ser aLoxosceles Reclusa.

13. Método, de acordo ' com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do citado organismo venenoso seruma água-viva.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do citado organismo venenoso ser umescorpião.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato do citado organismo venenoso seruma cobra.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato da detecção citada ser realizadausando um ELISA modificado para reduzir anticorposbloqueadores utilizando sólidos de leite desnatado emarcadores alcalino fosfatase.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato do ELISA citado ser capaz deidentificar abaixo de 24 picogramas de veneno em umaamostra.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato da amostra citada ser exposta a umambiente de temperatura de época de verão por atéaproximadamente três semanas antes da detecção citada.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato da detecção citada distinguir ditoorganismo de outras espécies de organismos venenosos.

20. Kit de imunoensaio caracterizado pelo fato decompreendender:(a) pelo menos um anticorpo antiveneno capaz de seligar a um antígeno presente em um veneno;(b) um swab para coletar uma amostra compreendendoveneno da área de uma mordida ou picada venenosa no corpode um paciente;(c) um tracer para detectar a ligação entre ditoanticorpo e dito antigeno.

21. Kit de imunoensaio, de acordo com a reivindicação-20, caracterizado pelo fato do dito anticorpo serimobilizado em um substrato sólido.

22. Kit de imunoensaio, de acordo com a reivindicação-21, caracterizado pelo fato do substrato sólido citado sero swab citado.

23. Kit de imunoensaio, de acordo com a reivindicação-20, caracterizado pelo fato do swab citado compreender ummaterial absorvente ou adsorvente selecionado do grupoconstituído de algodão, rayon, dacon, ou fibras de nylon,espuma de poliuretano, papel e escovas absorvente ouadsorventes.

24. Kit de imunoensaio, de acordo com a reivindicação-20, caracterizado pelo fato do swab citado ser anexado a umcabo.

25. Kit de imunoensaio,de acordo com a reivindicação-20, caracterizado pelo fato do swab citado compreenderfibras naturais ou sintéticas.

26. Kit de imunoensaio, de acordo com a reivindicação-20, caracterizado pelo fato do swab citado compreendercerdas.

27. Kit de imunoensaio, de acordo com a reivindicação-20, caracterizado pelo fato de pelo menos um anticorpoantiveneno ser um anticorpo policlonal.

28. Kit de imunoensaio, de acordo com a reivindicação-20, caracterizado pelo fato do anticorpo policlonal tersido criado em um coelho.

29. Kit de imunoensaio, de ...acordo com a reivindicação-20, caracterizado pelo fato do traçador citado compreenderum anticorpo monoclonal capaz de.se ligar ao anticorpo deantiveneno citado.

30. Kit de imunoensaio, de acordo com a reivindicação- 20, caracterizado pelo fato do imunoensaio citado ser umensaio colorimétrico portável.

31. Kit de imunoensaio, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato do anticorpo do antiveneno serimobilizado em um suporte absorvente.

32. Kit de imunoensaio, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de compreender um rótulo anexoao traçador citado que indica a ligação do anticorpo doantiveneno citado à proteína do veneno citada no que orótulo citado é selecionado do grupo constituído deenzimas, isótopos radioativos e partículas coloridas.

33. Kit de imunoensaio,de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de compreender também meios dedetectar a presença do rótulo citado ou mudanças no rótulocitado que indica que o traçador se ligou ao anticorpo doantiveneno.

34. Kit de imunoensaio, de sacordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de compreender também meiospara células sofrendo Iise presentes na amostra.

35. Kit de imunoensaio, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato do anticorpo de antivenenocitado ser um anticorpo contra um componente de proteína doveneno da Loxosceles reclusa.

36. Kit de imunoensaio, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato do anticorpo de antivenenocitado ser um anticorpo contra esfingomielinase.

37. Kit de imunoensaio, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de compreender tambéminstruções para o mesmo.